CN112939875B - 一种甲氧苄啶半抗原tmpo、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种甲氧苄啶半抗原tmpo、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲氧苄啶半抗原TMPO、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种甲氧苄啶半抗原TMPO，进一步利用该甲氧苄啶半抗原TMPO与载体蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫小鼠，制备得到甲氧苄啶单克隆抗体。本发明制备得到的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，其对甲氧苄啶的最低检测限为0.064ng/mL，IC50为1.84ng/mL，线性范围为0.27～12.79ng/mL，具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点，在甲氧苄啶的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

Description

一种甲氧苄啶半抗原TMPO、人工抗原、抗体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种甲氧苄啶半抗原TMPO、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
甲氧苄啶(Trimethoprim，TMP)属于二氨嘧啶类化合物，自1969年抗菌增效剂-甲氧苄啶(TMP)发现以后，将甲氧苄啶与磺胺类药物组成复方制剂，可使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，使抗菌谱扩大、抗菌活性增强，从抑菌作用变为杀菌作用，对多数革兰氏阳性菌和阴性菌有效，在兽医临床上应用十分广泛。磺胺增效剂可发生瘙痒、皮疹，临床也有发现服用头孢羟氨苄/TMP致过敏性休克的报道，也有发生恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应。磺胺增效剂对小白鼠的半数致死量(LD50)为2500mg/kg体重。大剂量使用时，可影响叶酸代谢和作用，可致白细胞减少和血小板减少，故长期使用时必须注意。
为了保护人类健康，控制磺胺类药物和甲氧苄啶的使用，中国、欧盟等国家和组织对它们的最高残留限量做出了规定，我国农业农村部2019年颁布的 GB31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》，对磺胺类药物的规定是所有食品动物中脂肪的最大残留限量100μg/kg，对甲氧苄啶的规定是禽的肌肉、皮脂、肝脏、肾脏中的最大残留限量50μg/kg，并且规定日允许量为0～ 4.2μg/kg。同时，我国农业行业标准《无公害食品水产品中渔药残留限量》(NY5070 —2002)中规定了以磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑4 种药物按总量计最大残留限量为100μg/kg，甲氧苄啶最大残留限量为50μg/kg。目前磺胺类及其增效剂残留的测定方法有高效液相色谱法配合紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，但是仪器分析法由于其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员操作，不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于市场监测和现场监控。
基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，具有样本前处理简便、操作简单、快速、灵敏和高通量等特点，被誉为是 21世纪最具有竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景，同时，近年来单链抗体与纳米抗体因具有稳定性高和可大量表达的优点，亦受到学者们的青睐。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。公开号为 CN104341357A和CN108059620A的专利公开了一种甲氧苄啶半抗原、抗体，但这些抗原或抗体的检测限都比较高，检测灵敏度较低，难以用于快速准确地检测出食品中的甲氧苄啶残留。因此，提供一种抗原结构稳定、特异性高的抗体以及能够用于快速、灵敏、准确的检测甲氧苄啶的方法具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有甲氧苄啶检测方法的缺陷和不足，提供一种甲氧苄啶半抗原TMPO、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。本发明制备出的甲氧苄啶半抗原TMPO的合成方法新颖，利用甲氧苄啶原药苯环上的分子结构式进行修饰改造，通过甲酰化反应引入醛后再与羧甲基羟胺半盐酸盐的缩合反应生成，使其末端具有活性基团-羧基。
本发明的第一个目的是提供一种甲氧苄啶半抗原TMPO。
本发明的第二个目的是提供所述甲氧苄啶半抗原TMPO的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述甲氧苄啶半抗原TMPO在制备甲氧苄啶人工抗原或抗体中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种甲氧苄啶人工抗原。
本发明的第五个目的是提供所述甲氧苄啶人工抗原在制备甲氧苄啶抗体中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种甲氧苄啶抗体。
本发明的第七个目的是提供一种酶联免疫检测甲氧苄啶的免疫原与包被原的组合物。
本发明的第八个目的是提供所述甲氧苄啶半抗原TMPO、所述甲氧苄啶人工抗原或所述免疫原与包被原的组合物在检测甲氧苄啶或制备甲氧苄啶检测试剂盒中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种甲氧苄啶半抗原TMPO，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002941945780000031
所述甲氧苄啶半抗原TMPO与甲氧苄啶保持相同的分子骨架结构，有利于进行免疫诱导，有效地提高了甲氧苄啶半抗原TMPO的免疫原性。
所述甲氧苄啶半抗原TMPO的制备方法，包括以下步骤：
S1.将甲氧苄啶的嘧啶环上的两个氨基用Boc酸酐进行保护，生成中间产物 A；
S2.将中间产物A通过甲酰化反应在苯环上引入一个醛基，生成中间产物B；
S3.将中间产物B与羧甲基羟胺半盐酸盐进行缩合反应，在中间产物B的苯环的醛基上生成一个连接臂末端为羧基的中间产物C；
S4.将中间产物C在三氟乙酸的作用下脱去步骤S1中保护两个氨基的Boc酸酐保护基，即得半抗原TMPO。
优选地，所述甲氧苄啶半抗原TMPO的制备方法的具体步骤如下：
S11.将甲氧苄啶溶解于N,N-二甲基甲酰胺后，与三乙胺和Boc酸酐混合进行反应，得中间产物A；
S12.将中间产物A溶于N,N-二甲基甲酰胺中，并在0～5℃下加入三氯氧磷，然后在85～95℃下进行反应，反应结束后调节反应液pH至7.8～9.0，固液分离后将所得固体用有机溶剂复溶后再用柱层析法进行分离，得中间产物B；
S13.用有机溶剂溶解中间产物B，并加入吡咯烷和羧甲基羟胺半盐酸盐的甲醇溶液进行反应，调节反应液pH至2.8～3.5，用乙酸乙酯和饱和食盐水溶液进行萃取，收集有机相，去除溶剂后得中间产物C；
S14.将中间产物C溶于二氯甲烷后加入三氟乙酸进行反应，去除溶剂，用二氯甲烷萃取，再用碳酸氢钠溶液洗涤，合并有机层，去除溶剂后进行柱层析纯化，即得甲氧苄啶半抗原TMPO。
优选地，S11所述固液分离的方法为过滤。
优选地，S11所述甲氧苄啶、Boc酸酐和三乙胺的摩尔比为1：1～2：2～3。
更优选地，S11所述甲氧苄啶、Boc酸酐和三乙胺的摩尔比为1：1.2：2。
优选地，S11中反应的条件为在室温条件下搅拌2h。
优选地：S12所述中间产物A、DMF和三氯氧磷的摩尔比为1：1～2：5～ 10。
更优选地：S12所述中间产物A、DMF和三氯氧磷的摩尔比为1：2：10。
优选地，S13所述中间产物B、吡咯烷和羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔比为1： 2～4：1～2。
更优选地：S13所述中间产物B、吡咯烷和羧甲基羟胺半盐酸盐的摩尔比为 1：2.6：1.3。
优选地，S14所述中间产物C、三氟乙酸和二氯甲烷的摩尔比为1：1～3：1～ 3。
更优选地，S14所述中间产物C、三氟乙酸和二氯甲烷的摩尔比为1：1：3。
优选地，S12的具体步骤为：将中间产物A溶于N,N-二甲基甲酰胺中，用冰盐浴冷却至0℃，逐滴地加入三氯氧磷，控制滴加速度使反应温度低于5℃，滴加完后，在0～5℃之间搅拌0.5h；然后用水浴加热至90℃，反应1.5h后，将反应物倒入冰水混合物中，用氢氧化钠溶液调节pH＝8，过滤，滤饼干燥后进行柱层析纯化得到固体中间产物B。
优选地，S13的具体步骤为：用甲醇溶解中间产物B，随后加入吡咯烷，反应15min后，逐滴加入羧甲基羟胺半盐酸盐的甲醇溶液，室温反应8h，反应液用盐酸调节pH＝3.0，用乙酸乙酯和饱和食盐水溶液进行萃取，收集有机相，减压蒸馏后得白色固体，即为中间产物C。
优选地，S14的具体步骤为：将中间产物C溶于二氯甲烷的0℃低温溶液中，并加入三氟乙酸在室温下搅拌反应1～3h后，减压蒸馏溶剂，加入冰水混合物，用二氯甲烷萃取，再用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，合并有机层，减压蒸馏后残余物进行柱层析纯化得到甲氧苄啶半抗原TMPO。
本发明还提供了一种甲氧苄啶人工抗原，由所述甲氧苄啶半抗原TMPO与载体蛋白偶联得到，其结构式如式(II)所示：
Figure BDA0002941945780000051
优选地，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白、血蓝蛋白、牛血清白蛋白、乳铁蛋白或刀豆球蛋白。
所述甲氧苄啶半抗原TMPO与载体蛋白偶联时，甲氧苄啶半抗原TMPO的特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，为得到特异性高、质量高的抗体奠定了基础。
本发明要求保护所述甲氧苄啶人工抗原在制备甲氧苄啶抗体中的应用。
优选地，所述甲氧苄啶抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或纳米抗体。
本发明还要求保护一种甲氧苄啶抗体，是以所述甲氧苄啶人工抗原为免疫原制备得到。
优选地，所述甲氧苄啶抗体为单克隆抗体。
优选地，所述免疫原为半抗原TMPO与血蓝蛋白KLH、牛血清白蛋白BSA、乳铁蛋白LF或刀豆球蛋白ConA其中一种偶联得到的人工抗原。
优选地，所述甲氧苄啶单克隆抗体的制备方法如下：
所述的甲氧苄啶单克隆抗体的制备方法如下：
将上述甲氧苄啶抗原TMPO-KLH、TMPO-BSA、TMPO-LF、TMPO-ConA作免疫原免疫小鼠，用小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，获得杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞置于雌性Balb/c小鼠体内培养，获得含高浓度单克隆抗体的腹水，并对腹水纯化得到高特异性抗甲氧苄啶单克隆抗体。
本发明要求保护一种酶联免疫检测甲氧苄啶的免疫原与包被原的组合物，所述免疫原和包被原为以上所述人工抗原；所述免疫原上的载体蛋白为乳铁蛋白，所述包被原上的载体蛋白为鸡卵清白蛋白。
所述甲氧苄啶半抗原TMPO、所述甲氧苄啶人工抗原或所述免疫原与包被原的组合物在检测甲氧苄啶或制备甲氧苄啶检测试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明具有以下有益效果：
本发明首先提供了一种甲氧苄啶半抗原TMPO，该甲氧苄啶半抗原TMPO 与待测物甲氧苄啶保持相同的骨架结构，有效地提高了甲氧苄啶半抗原TMPO 的免疫原性；本发明进一步利用该甲氧苄啶半抗原TMPO与KLH、BSA、LF、ConA偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫小鼠，通过细胞融合得到杂交瘤细胞，通过体内接种杂交瘤细胞制备腹水，纯化后制备得到甲氧苄啶单克隆抗体。本发明制备得到的抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，其对甲氧苄啶的最低检测限为0.064ng/mL，IC50为1.84ng/mL，线性范围为0.27～12.79ng/mL，检测灵敏度高；具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点，在甲氧苄啶的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
附图说明
图1是甲氧苄啶半抗原TMPO的合成步骤图；其中，DMF为N,N-二甲基甲酰胺，MeOH为甲醇，RT为搅拌。
图2是基于单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1甲氧苄啶半抗原TMPO的制备
一、实验方法
(1)在圆底烧瓶中加入12mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解的5mmol甲氧苄啶，随即加入10mmol三乙胺和6mmol Boc酸酐，在室温条件下搅拌2h，经柱层析纯化得到中间产物A。
(2)在一个装有磁力搅拌器的圆底三颈瓶中，加入3mmol中间产物A溶于 15mLDMF溶液中，用冰盐浴冷却至0℃，一滴一滴地加入30mmol三氯氧磷，控制滴加速度使反应温度低于5℃，加完后，在0～5℃之间搅拌0.5h。然后用水浴加热至90℃，反应1.5h，停止反应，将反应物倒入冰水混合物中，在搅拌下滴加5mol/L氢氧化钠溶液至呈碱性(pH＝8)，过滤，滤饼干燥后进行柱层析纯化得到中间产物B。
(3)在圆底烧瓶中，加入溶于甲醇的2mmol中间产物B，随后加入5.2mmol 吡咯烷，反应15min后，逐滴加入2.6mmol羧甲基羟胺半盐酸盐的甲醇溶液。室温反应8h，反应液先用盐酸调节pH到3.0，用乙酸乙酯和饱和食盐水溶液进行萃取，收集有机相，减压蒸馏后得白色固体即为中间产物C。
(4)将1.5mmol中间产物C溶于4.5mmol二氯甲烷的0℃低温溶液中，滴加1.5mmol三氟乙酸，室温搅拌1～3h后，减压蒸馏溶剂，加入冰水混合物，用二氯甲烷萃取，再用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，合并有机层，减压蒸馏后用 200-400目的硅胶粉进行纯化得到TMPO。
具体合成步骤如图1所示。
二、实验结果
甲氧苄啶半抗原TMPO的质谱与NMR波谱数据如下：ESI-MS(m/z)： 392.14[M+H]+；1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.22(s,1H),7.42(s,1H),6.56(t,J＝1.0Hz,1H),4.80(s,2H),3.87(d,J＝1.1Hz,2H),3.83(d,J＝4.6Hz,6H),3.79(s, 3H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ171.36,161.96,159.90,155.51,153.81, 148.65,144.69,140.47,130.16,122.37,107.59,106.80,67.81,61.21,60.82,56.23, 30.78。由质谱可以看出，392.14为半抗原TMPO的正离子分子峰，与实际的相对分子质量相符。另外，NMR波谱峰位移与分裂均能与结构对应一一归属，说明成功制备得到了甲氧苄啶半抗原TMPO。甲氧苄啶半抗原TMPO的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002941945780000071
实施例2甲氧苄啶人工抗原的制备
将实施例1制备得到的甲氧苄啶半抗原TMPO，通过活泼酯法偶联鸡卵清白蛋白OVA(albumin)、血蓝蛋白KLH(keyhole limpet hemocyanin)、牛血清白蛋白 BSA(Bovinealbumin)、乳铁蛋白LF(lactoferrin)和刀豆球蛋白ConA(concanavalin A)，具体如下：
将甲氧苄啶半抗原TMPO溶于DMF中，添加1.5倍(摩尔比)的NHS和 EDC(摩尔比TMPO：NHS：EDC＝1：1.5：1.5)于溶液中在4℃反应过夜，记为A液；将A液逐滴加入到载体蛋白的PBS缓冲溶液中，于4℃下继续反应8h；将反应液于4℃下透析3天，每天换两次透析液，共透析6次，收集透析袋中的溶液，即得甲氧苄啶人工抗原(甲氧苄啶完全抗原TMPO-OVA、TMPO-KLH、 TMPO-BSA、TMPO-LF、TMPO-ConA。其甲氧苄啶人工抗原的结构式如式(Ⅱ) 所示：
Figure BDA0002941945780000081
其中，载体蛋白为血蓝蛋白KLH、牛血清白蛋白BSA、乳铁蛋白LF、刀豆球蛋白ConA或鸡卵清白蛋白OVA。
实施例3甲氧苄啶人工抗原免疫及抗血清效果评价
一、实验方法
1、动物免疫
用健康的6周龄的Balb/c雌鼠作为实验动物，以完全抗原TMPO-KLH、 TMPO-BSA、TMPO-LF、TMPO-ConA作为免疫原，在小鼠颈背部和腹腔进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5mL(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5mL 完全弗氏佐剂与抗原乳化后用于免疫，4周后用0.5mL不完全弗氏佐剂与抗原乳化后加强免疫，之后每隔2周免疫一次，期间尾巴静脉取少量血进行抗体质量鉴定，待抗体稳定后，选择性能最佳的老鼠进行细胞融合，细胞融合前3天，直接注射0.5mg免疫原小鼠腹腔内追加免疫一次。
2、抗血清效果评价
以实施例2制备得到的甲氧苄啶完全抗原TMPO-OVA作为包被原，取上述采集的的小鼠血清为检测抗体，采用间接竞争ELISA法测定小鼠血清的抗血清效价与抑制率，综合考虑各抗血清的效价、抑制率，对其进行评价。具体操作步骤如下：
(1)包板：将甲氧苄啶完全抗原TMPO-OVA用0.05M碳酸盐buffer(pH9.6) 稀释至1000ng/mL，按100μL/well，4℃包被过夜；弃包被液，PBST洗涤2次，每孔加入120μL封闭液(5％脱脂牛奶)，37℃封闭3h；弃封闭液，37℃烘干 60min，用密封袋装于4℃待用，得到包好的酶标板。
(2)血清效价与抑制检测：将步骤1)包好的酶标板，效价列：每孔分别加入50μLPBS和50μL按梯度倍数稀释(1K、2K、4K、8K、16K、32K、64K、 128K)的血清；抑制列：每孔加入50μL稀释好的1000ng/mL药物(甲氧苄啶) 和50μL按梯度倍数稀释(1K、2K、4K、8K、16K、32K、64K、128K)的血清，做2组平行。37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸光值。
二、实验结果
免疫Balb/c雌鼠所获得的抗血清均产生免疫应答反应，但TMPO-KLH、 TMPO-BSA、TMPO-ConA的效价均未超过10K，效果较差，不适合用于进一步制备抗体，而TMPO-LF的5个平行动物免疫均具有良好的免疫应答效果，其中1 号小鼠抗血清效价和抑制率最佳(表1)，说明抗原TMPO-LF免疫应答有效性良好，可被用于后续甲氧苄啶单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体等抗体的制备以及免疫检测方法的建立。
表1抗血清的效价与抑制率
Figure BDA0002941945780000091
实施例4甲氧苄啶单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体和纳米抗体的制备
1、单克隆抗体的制备
(1)细胞融合：优选实施例3免疫的1号小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂 (PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，在37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液， 9天后进行全换液。
(2)阳性杂交瘤的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞；初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP，加入TMB底物液进行显色反应；筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与1000ng/mL的甲氧苄啶等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中；同时用PBS取代甲氧苄啶作对照，其余步骤同上；若经甲氧苄啶阻断后的OD450nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2、3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化；
(3)杂交瘤细胞的扩大培养：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄的Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10天后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×106/只，7～ 10天后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，冻存备用。
2、多克隆抗体的制备
将实施例2制备的免疫原TMPO-LF与等量的佐剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂)混合乳化，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫体重为2.5～3kg的新西兰大白兔，每种免疫原对应注射两只。第一次免疫间隔四周后每三周加强免疫一次。第三次加强免疫一周后耳缘静脉取血，并利用间接ELISA测定血清效价，当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。两天后心脏采血，室温静置0.5～1h，于4℃，12000r/min下离心10min，取上清分装于离心管中，于-20℃下保存使用。
3、单链抗体的制备
提取TMPO单克隆细胞或经TMPO免疫原免疫后的小鼠脾脏细胞的RNA，反转录为cDNA，设计抗体轻重链扩增引物，利用PCR技术扩增出抗体的轻重链基因，插入表达质粒TCI菌株，在大肠杆菌中表达，利用免疫亲和方法进行纯化得到基因工程抗体，纯度由SDS-PAGE电泳鉴定，小瓶分装，-20℃保存。
4、纳米抗体的制备
动物免疫：将实例3制备的四种免疫原分别与等量的佐剂(第一次用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂)混合乳化，对骆驼进行间隔免疫，间隔免疫分析检测并得到骆驼的外周血用于后续构建纳米抗体文库。
纳米抗体的制备与纯化：从外周血分离出淋巴细胞，提取出RNA,反转录为cDNA,利用nested-PCR技术对VHH基因进行扩增，与pComb3XSS载体连接后转入电转感受态Ecoli.TG1构建VHH基因文库，经辅助噬菌体M13K07救援后得到噬菌体展示纳米抗体文库，利用固相亲和淘筛得到抗甲氧苄啶的纳米抗体。
实施例5基于单克隆抗体的间接竞争ELISA标准曲线的建立
1、确定包被原浓度及抗体稀释倍数
以实施例2中制备的TMPO-OVA人工抗原为包被原，通过棋盘滴定法确定合适的包被原浓度和抗体稀释倍数。将包被原稀释成不同浓度包板，抗体呈梯度稀释，按照实施例3中2的步骤测定，选择A450nm在1.0～1.5之间的包被原浓度和抗体稀释倍数组合作下一步的抑制曲线绘制，最终确定包被原浓度为 62.5ng/mL，抗体浓度为2μg/mL。
2、标准曲线的建立
(1)实验方法
向包被原浓度为62.5ng/mL的酶标板中，每孔加入50μL(2μg/mL)的抗甲氧苄啶单克隆抗体和一系列不同浓度的50μL的甲氧苄啶标准品，37℃孵育 40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入 100μLTMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2MH2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以甲氧苄啶标准品浓度对横坐标，B/B0(加入甲氧苄啶的孔的OD450/未加入甲氧苄啶的孔的OD450)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
(2)实验结果
基于单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图1所示，可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，对甲氧苄啶的最低检测限为0.064ng/mL，IC50为1.84ng/mL，线性范围为0.27～12.79ng/mL，检测灵敏度高。
实施例6甲氧苄啶单克隆抗体的特异性检测
1、实验方法
采用实施例4制备的甲氧苄啶单克隆抗体对磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲基嘧啶、氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素、恩诺沙星、西诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃唑酮和四环素等可能同时残留的兽药进行交叉反应率的检测，具体方法同实施例5。
2、实验结果
具体实验结果如下表2所示，结果表明采用实施例4制备的甲氧苄啶单克隆抗体对磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺二甲基嘧啶、氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素、恩诺沙星、西诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃唑酮和四环素等均无交叉(小于0.5％)，说明采用实施例4制备的甲氧苄啶单克隆抗体特异性良好，不易造成假阳性。
表2甲氧苄啶结构及功能类似物交叉反应结果
Figure BDA0002941945780000121
Figure BDA0002941945780000131
Figure BDA0002941945780000141
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种甲氧苄啶半抗原TMPO，其特征在于，其结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003513904360000011
2.权利要求1所述甲氧苄啶半抗原TMPO的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将甲氧苄啶的嘧啶环上的两个氨基用Boc酸酐进行保护，生成中间产物A；
S2.将中间产物A通过甲酰化反应在苯环上引入一个醛基，生成中间产物B；
S3.将中间产物B与羧甲基羟胺半盐酸盐进行缩合反应，在中间产物B的苯环的醛基上生成一个连接臂末端为羧基的中间产物C；
S4.将中间产物C在三氟乙酸的作用下脱去步骤S1中保护两个氨基的Boc酸酐保护基，即得半抗原TMPO。
3.权利要求1所述甲氧苄啶半抗原TMPO在制备甲氧苄啶人工抗原或抗体中的应用。
4.一种甲氧苄啶人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述甲氧苄啶半抗原TMPO与载体蛋白偶联得到，其结构式如式(II)所示：
Figure FDA0003513904360000012
所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白或乳铁蛋白。
5.权利要求4所述甲氧苄啶人工抗原在制备甲氧苄啶抗体中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或纳米抗体。
7.一种酶联免疫检测甲氧苄啶的免疫原与包被原的组合物，其特征在于，所述免疫原和包被原为权利要求4所述人工抗原；所述免疫原上的载体蛋白为乳铁蛋白，所述包被原上的载体蛋白为鸡卵清白蛋白。
8.权利要求1所述甲氧苄啶半抗原TMPO、权利要求4所述甲氧苄啶人工抗原或权利要求7所述免疫原与包被原的组合物在检测甲氧苄啶或制备甲氧苄啶检测试剂盒中的应用。
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