CN114315722B - 唑虫酰胺人工半抗原及其抗体的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了唑虫酰胺的半抗原设计与合成，以及唑虫酰胺人工抗原和抗体的制备与应用。通过唑虫酰胺半抗原设计、连接臂引入、载体引入、合成、纯化等步骤制备出具有免疫原性的人工抗原，获得氨基戊酸修饰或巯基丙酸的唑虫酰胺半抗原产物。该结构的唑虫酰胺半抗原分别与牛血清蛋白和鸡卵清蛋白偶联合成免疫原和包被原，具备较高的免疫活性，可刺激动物免疫系统产生抗唑虫酰胺抗体，填补了当前唑虫酰胺没有合适的人工抗原用于制备特异性、高灵敏抗体的空缺。采用该单克隆抗体建立的酶联免疫分析方法，具有良好的特异性和灵敏度，IC50为0.008mg/L，胶体金试纸条的检出限为0.05mg/L，唑虫酰胺检测灵敏度符合国家标准要求。还可用于环境中唑虫酰胺残留的快速检测。

Description

唑虫酰胺人工半抗原及其抗体的制备与应用

技术领域

本发明属于小分子化合物的免疫分析检测领域，具体涉及有机合成，免疫化学，生物化学，物理化学测定等技术。特别涉及具有氨基戊酸分子结构的环境污染物唑虫酰胺小分子化合物半抗原、人工抗原的设计合成，小鼠免疫，杂交瘤细胞筛选，特异性单克隆抗体的制备及其免疫分析方法的建立。

背景技术

唑虫酰胺是原日本三菱化学公司开发的新型吡唑杂环类杀虫杀螨剂，其作用机理为阻碍线粒体的代谢系统中的电子传达系统复合体I，从而使电子传达受到阻碍，使昆虫不能提供和贮存能量，被称为线粒体电子传达复合体阻碍剂(METI)。唑虫酰胺杀虫谱广，具有触杀作用，对鳞翅目幼虫小菜蛾、缨翅目害虫蓟马，同翅目茶叶小绿叶蝉有特效，还具有杀卵、抑食、抑制产卵及杀菌作用。据相关资料报道，11.8％甲维盐·唑虫酰胺悬浮剂30-50毫升/亩，兑水15～30公斤均匀喷雾，可快速防治小菜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫等高抗性害虫，持效期可达30天。经各种生物药效试验、安全性试验，确认了唑虫酰胺的高效性和安全性，由此可见其市场应用潜力巨大。随着唑虫酰胺的广泛使用，其在农田生态环境中的暴露水平势必上升，有必要对其残留量进行监测评价。

常规的唑虫酰胺检测仪器分析方法，如紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱质谱联用法，其操作复杂、成本较高、分析时间长、难以满足大量样品在较短时间内完成快速筛查的需求。因此，开发一种简便、快速、灵敏的唑虫酰胺检测技术，能在现场和实验室内进行大批量的快速筛查试验。近些年来，基于抗原-抗体特异性反应的免疫化学分析法是小分子化合物快速检测技术的研究热点之一，其中研究报道最多的是酶联免疫吸附法(ELISA)，已研制出多类小分子化合物ELISA试剂盒，具有潜在应用价值。

小分子化合物免疫分析比大分子难度更大，由于其分子结构不具备免疫原性，需要进行结构改造获得半抗原，并与蛋白载体连接后用于动物免疫。本研究的关键技术是唑虫酰胺半抗原的设计、合成，唑虫酰胺人工抗原和抗体的制备，以及唑虫酰胺免疫分析方法的建立。唑虫酰胺人工抗原和特异性单克隆抗体以及以此为基础建立的免疫分析方法尚未见报道。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是唑虫酰胺半抗原的设计、合成，唑虫酰胺人工抗原和抗体的制备。其目的是为了提供唑虫酰胺半抗原和相应人工抗原和抗体的制备方法，并应用于样品中唑虫酰胺的免疫检测分析。

本发明选择唑虫酰胺为代表的新型吡唑杂环类化合物，将其进行半抗原设计和结构改造，获得含氨基戊酸基团的唑虫酰胺半抗原分子，再连接蛋白分子分别获得包被原和免疫原。

本发明独特之处在于克服了唑虫酰胺半抗原化学合成困难，形成了一条唑虫酰胺半抗原合成技术路线。用于免疫动物时，可产生亲和力很高的特异性抗体，并以此建立了ELISA方法即酶联免疫分析方法，可准确检测唑虫酰胺含量。

本发明的另一个独特之处在于选用钥孔血蓝蛋白偶联小分子作为免疫原，在偶联反应中提高溶剂比例，很大程度上克服了唑虫酰胺半抗原难溶于水的问题，提高了半抗原分子与蛋白分子的偶联比，增强其免疫原性。

唑虫酰胺的结构如下所示：

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：唑虫酰胺半抗原Hapten1系列为苯环上R1位点取代羧酸基团，R1可以是丁酸、戊酸、己酸、氨基丁酸、氨基戊酸、氨基己酸、酰胺丁酸、酰胺戊酸、酰胺己酸中的一种或多种衍生基团。唑虫酰胺人工半抗原Hapten2系列为五元杂环上R2位点取代羧酸基团，R2可以是巯基丙酸、巯基丁酸、巯基己酸、氨基丁酸、氨基戊酸、氨基己酸、酰胺丁酸、酰胺戊酸、酰胺己酸中的一种或多种衍生基团。其特征在于分子结构式为：

唑虫酰胺免疫原，是由唑虫酰胺半抗原与钥孔血蓝蛋白(BCP)偶联合成，其特征在于，所述唑虫酰胺免疫原分子结构式为：

唑虫酰胺包被原，是由要唑虫酰胺半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联合成，其特征在于，所述唑虫酰胺包被原分子结构式为：

抗唑虫酰胺单克隆抗体，是能与唑虫酰胺免疫原(ZCXA-BCP)或唑虫酰胺包被原(ZCXA-BSA)、以及唑虫酰胺化合物发生特异性免疫反应的单克隆抗体。

唑虫酰胺经硝基化、氨基化、戊二酸酐酰化等一系列反应制备获得，合成路线如下：

唑虫酰胺半抗原Hapten 1的制备方法，包括以下步骤：

(1)将唑虫酰胺溶于5-10倍体积的硝酸中，升温60-80℃搅拌反应得到硝基唑虫酰胺；

(2)加入氯化铵和铁进行催化反应，得到氨基唑虫酰胺；

(3)将1-2倍体积的氯化戊二酸酐和2-3倍当量的氢氧化钠溶液，滴加到氨基唑虫酰胺溶液中；

(4)搅拌反应4-6h，然后冷却至5-10℃，抽滤，过滤得到的固体样品用1,4-二氧六环重结晶，烘干，得到唑虫酰胺半抗原Hapten 1晶体。

(5)唑虫酰胺半抗原Hapten 1结构采用HPLC-MS和¹H-NMR进行表征。

唑虫酰胺半抗原Hapten 2的制备方法，包括以下步骤：

(1)将唑虫酰胺溶于5-10倍当量的乙醇溶液中，搅拌升温至60-80℃；

(2)将2-3倍当量的氢氧化钾溶液，滴加到上述唑虫酰胺溶液中进行催化反应，再逐滴加入1-2倍体积的巯基丙酸。

(3)搅拌反应4-6h，然后冷却至5-10℃，抽滤，过滤得到的固体样品用1,4-二氧六环重结晶，烘干，得到唑虫酰胺半抗原Hapten 2晶体。

唑虫酰胺免疫原和包被原的制备方法为碳二亚胺法，包括以下步骤：

(1)称0.01mmoL唑虫酰胺半抗原溶于1.6mL DMF中，加入含0.03mmoL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.2mL DMF溶液，搅拌反应15min，再加入含0.02mmoL二环己基碳二亚胺(DCC)的0.2mL DMF溶液，室温搅拌反应过夜。

(2)反应完成后，取反应液至离心管中，在4℃条件下4000r/min离心10min，取上清液弃黄色沉淀，上清液即为唑虫酰胺半抗原活化液。

(3)取步骤(2)中0.8mL反应活化液，逐滴加入到含5mg BCP的2mL 0.05M碳酸缓冲液(pH 9.5)。另外，取步骤(2)中1mL反应活化液，逐滴加入到含10mg BSA的2mL 0.05mol/L碳酸缓冲液(pH 9.5)。室温下，先快速磁力搅拌反应0.5h，再改为缓慢磁力搅拌反应3.5h。

(4)将步骤(3)反应完成后的溶液装入到预处理好的透析袋中，在4℃条件下，先用5％甲醇-超纯水透析1次，再改用0.01M硼酸缓冲液(pH 7.4)透析，每天换液3次，共透析3天。

(5)透析结束后将透析液取出，混匀后分装至无吸附性的1.5mL离心管中，得到唑虫酰胺-BCP和唑虫酰胺-BSA，并于-20℃条件下保存。

抗唑虫酰胺单克隆抗体的制备方法包括动物免疫、杂交瘤细胞筛选、腹水制备，包括以下步骤：

(1)免疫：免疫动物选用6周龄的BALB/c雌性小鼠，免疫方法采用皮下多点弗氏佐剂注射方式，初次免疫后21天进行加强免疫，每隔14天进行一次加强免疫，共进行4次加强免疫以及1次末次免疫，具体试验方法如下：

初次免疫：取0.1mg ZCXA-BCP溶于0.9％生理盐水，取等体积的弗氏完全佐剂，分别将ZCXA-BCP溶液和弗氏完全佐剂吸入注射器，并将两支注射器用透明软管对接。快速将免疫原注射器一端的溶液推向佐剂注射器一端的液体中，再快速来回推动300次左右，使ZCXA-BCP充分乳化。进行小鼠皮下7个点注射，分别为颈部、背部、四肢、腹部皮下注射免疫。

加强免疫：取0.05mg ZCXA-BCP溶于0.9％生理盐水，取等体积的弗氏不完全佐剂，分别将ZCXA-BCP溶液和弗氏完全佐剂吸入注射器，并将两支注射器用透明软管对接。快速将免疫原注射器一端的溶液推向佐剂注射器一端的液体中，再快速来回推动300次左右，使ZCXA-BCP充分乳化。进行小鼠腹腔注射免疫。

末次免疫：取0.05mg ZCXA-BCP溶于0.9％生理盐水，直接进行腹腔注射免疫。

(2)杂交瘤细胞筛选：定期监测小鼠抗体效价，加强免疫2次后每隔一周测定小鼠尾血效价，以吸光度度值OD_450nm≥1为阳性。以ZCXA-BSA作为包被原，测试小鼠尾血效价达到1:10000－1:20000时，进行末次免疫，待末次免疫3d后断颈取脾，进行杂交瘤细胞融合，筛选单克隆杂交瘤细胞。采用同源间接ELISA，包被5μg/mL ZCXA-BSA，以唑虫酰胺标准溶液100ng/mL作为竞争药物，挑出强阳性OD_450nm≥0.5且抑制率≥50％的细胞株，连续亚克隆3-4次，获得稳定的单克隆杂交瘤细胞株。

(3)抗体制备：选用7周龄F1代小鼠，先用降脂烷500μL/只进行腹腔注射。7天后，将步骤(2)筛选获得的稳定单克隆杂交瘤细胞株(细胞密度约2×10⁶/mL)500μL/只接种至小鼠腹腔。7～10天后，小鼠腹腔膨胀，收集腹水，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化。纯化后的腹水以ZCXA-BSA包被，间接法测定抗体的效价和对唑虫酰胺的抑制率。

所述的唑虫酰胺单克隆抗体应用于食品和环境样品中唑虫酰胺含量的免疫检测，所述的免疫检测为酶联免疫快速测定(ELISA)。唑虫酰胺抗体的应用于唑虫酰胺含量的免疫检测，包括以下步骤：

(1)包被：将ZCXA-BSA溶于0.05mol/L碳酸缓冲液(pH 9.6)，以100μl/孔包被于酶标板，于4℃冷藏环境包被过夜，取出后用0.01M PBST洗涤3次。

(2)封闭：包被完成后，用0.01mol/L PBS(pH 7.4)配置2％脱脂奶粉，以300μl/孔封闭酶标板，于37℃培养箱封闭30分钟，取出后用0.01mol/L PBST洗涤2次。

(3)竞争反应：将待测样品溶解于30％甲醇的0.01mol/L PBS溶液，以50μl/孔加入酶标板，再加入唑虫酰胺抗体溶液50μl/孔，于37℃培养箱反应1小时，取出后洗板3次。

(4)酶标二抗反应：将兔抗鼠酶标二抗用0.01mol/L PBS(pH 7.4)稀释20000倍，加入100μl/孔，于37℃培养箱反应1小时，取出后洗板4次。

(5)显色与终止：显色底物为四甲基联苯胺(TMB)溶液，显色时加入100μl/孔，显色15分钟后加入2mol/L H₂SO₄ 50μl/孔终止。

(6)显色终止后，将酶标板置于酶标仪上读数，读取OD_450nm数值，计算和分析数据。

本发明相对于现有分析技术具有如下的优点及效果：

(1)该设计、合成的唑虫酰胺半抗原与目标待测物相似度高，对唑虫酰胺的特征结构保留完整，为制备特异性良好的唑虫酰胺抗体奠定了基础；

(2)唑虫酰胺抗体具有良好的特异性和灵敏度，IC₅₀达到0.01mg/L，而且抗体的稀释倍数达到64000。

(3)经试验验证，上述半抗原其合成方法简便，合成效率高，反应步骤少，半抗原只需要3步反应即可合成，从而提高了反应的可控性和时效性。

因此，本发明合成半抗原的方法与其他方法相比较，更加易于推广普及。本发明涉及的抗体活性高，并成功应用于酶联免疫快速检测方法，其操作简便快速，检测过程只需要2小时15分钟，而且检测的精确度可达到90％以上。因此，本发明不仅在实验室环境下呈现良好的检测效果，并为开发出成本低、效率高、操作快的免疫快速检测胶体金试纸条工具奠定了基础，适合现场快速检测需求，具备良好的应用前景，既有经济效益又有社会效益。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为唑虫酰胺人工半抗原Hapten 1的质谱图

图2为唑虫酰胺人工半抗原Hapten 1的核磁氢谱图

图3为本发明的唑虫酰胺酶联免疫分析标准曲线图

具体实施方式

本发明的以下实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。现通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)唑虫酰胺人工半抗原的合成

在动物免疫系统中，要获得抗体，抗原必须具备免疫原性。唑虫酰胺作为小分子化合物，其不具备天然免疫原性，也就是说不能刺激动物免疫系统产生抗体。我们需要人为将其进行结构改造，并与蛋白偶联，使其具备免疫原性。蛋白偶联方法中的主要活泼基团有羧基、氨基、羟基、巯基，本发明中在唑虫酰胺结构上引入了羧酸基团，使其能与蛋白缩合偶联。

唑虫酰胺Hapten 1合成方法：称取2g唑虫酰胺溶于10倍体积的硝酸中，升温80℃搅拌反应得到硝基唑虫酰胺。加入氯化铵和铁进校催化反应，得到氨基唑虫酰胺。将1-2倍体积的氯化戊二酸酐和2-3倍当量的氢氧化钠溶液，滴加到氨基唑虫酰胺溶液中。搅拌反应5h，然后冷却至10℃，抽滤，将得到的固体干燥后，用1，4-二氧六环重结晶。重结晶后有白色固体析出，过滤干燥后得到固体结晶0.583g，纯度为96％。¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.19(br s,1H),7.80(br s,1H),7.30-6.77(m,7H),4.59(br s,2H),4.10(br s,3H),2.62(d,J＝7.6Hz,2H),2.47-2.26(m,7H),1.94-2.00(m,2H),1.20-1.28(m,3H).ESI-MS m/z:calculated for C₂₆H₂₉ClN₄O₅[M-H]⁺:511.18,found:511.39；[M-H+2]⁺:513.13.[M+Na]⁺:535.39,found:535.24；[M+Na+2]⁺:537.21.

唑虫酰胺Hapten 2合成方法：称取2唑虫酰胺溶于10倍当量的乙醇溶液中，搅拌升温至80℃。将2-3倍当量的氢氧化钾溶液，滴加到上述唑虫酰胺溶液中进行催化反应，再逐滴加入2倍体积的巯基丙酸。搅拌反应5h，然后冷却至10℃，抽滤，过滤得到的固体样品用1,4-二氧六环重结晶，烘干，得到唑虫酰胺半抗原晶体0.731g，纯度为95％。

(2)唑虫酰胺人工抗原(免疫原和包被原)的制备

称0.01mmoL唑虫酰胺半抗原溶于1mL DMF中，加入含0.03mmoL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.2mL DMF溶液，搅拌反应15min，再加入含0.03mmoL二环己基碳二亚胺(DCC)的0.2mL DMF溶液，室温搅拌反应过夜。反应完成后，取反应液至离心管中，在4℃条件下4000r/min离心10min，取上清液弃黄色沉淀，上清液即为唑虫酰胺半抗原活化液。取0.8mL半抗原活化液，逐滴加入到含12mg BCP的2mL 0.01M碳酸缓冲液(pH 9.0)。另外，取1mL半抗原活化液，逐滴加入到含15mg OVA的2mL 0.01mol/L碳酸缓冲液(pH 9.0)。室温下，先快速磁力搅拌反应0.5h，再改为缓慢磁力搅拌反应3.5h。反应完成后的溶液装入到预处理好的透析袋中，在4℃条件下，先用5％甲醇-超纯水透析1次，再改用0.01M硼酸缓冲液(pH 7.4)透析5次，每12h换液一次，共透析3天。透析结束后将透析液取出，混匀后分装至无吸附性的1.5mL离心管中，得到唑虫酰胺-BCP和唑虫酰胺-OVA，并于－20℃条件下保存。

(3)唑虫酰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备

免疫动物选用6周龄的BALB/c雌性小鼠，免疫方法采用皮下多点弗氏佐剂注射方式，初次免疫后21天进行加强免疫，每隔14天进行一次加强免疫，共进行4次加强免疫以及1次末次免疫。具体步骤为，初次免疫：取0.1mg唑虫酰胺免疫原溶于0.9％生理盐水，取等体积的弗氏完全佐剂，分别将唑虫酰胺免疫原溶液和弗氏完全佐剂吸入注射器，并将两支注射器用透明软管对接。快速将免疫原注射器一端的溶液推向佐剂注射器一端的液体中，再快速来回推动300次左右，使唑虫酰胺免疫原充分乳化，进行小鼠皮下7个点注射，分别为颈部、背部、四肢、腹部皮下注射免疫。加强免疫：取0.05mg唑虫酰胺免疫原溶于0.9％生理盐水，取等体积的弗氏不完全佐剂，分别将唑虫酰胺免疫原溶液和弗氏完全佐剂吸入注射器，并将两支注射器用透明软管对接，乳化方法同初次免疫，乳化后进行小鼠腹腔注射免疫。加强免疫分别于初次免疫后每隔2周进行一次，共加强免疫4次。分别于第二次、第三次、第四次加强免疫后一周测定效价，第三次加强免疫后效价达到1:12800。末次免疫：取0.05mg唑虫酰胺免疫原溶于0.9％生理盐水，直接进行腹腔注射免疫。

杂交瘤细胞融合和筛选：

(1)准备SP2/0骨髓瘤细胞，待SP2/0细胞处在最佳状态时，进行融合实验；

(2)小鼠脾细胞制备，取末免3天后的小鼠，拉颈处死置于75％酒精消毒3min，放置于无菌板上，无菌取脾脏；

(3)用DMEM基础培养液注射入脾脏，直到撑破脾脏，DMEM基础培养液反复冲洗，多次挤压，收集脾脏细胞在50ml离心管内；将SP2/0细胞收集在50ml离心管内；

(4)细胞融合过程，将离心好的脾细胞和SP2/0细胞用DMEM基础培养液吹打后混合后，离心后弃上清；边搅拌边加入50％PEG，1min，静置1min；缓慢加入DMEM基础培养液，离心后弃上清，重复两次；

(5)铺96孔细胞板，用配制的培养液(2％HAT选择性培养基+5％CE细胞生长因子+20％胎牛血清+DMEM基础培养液)轻轻吹打沉淀，铺96孔细胞板。

(6)细胞融合铺板后4-5天换HAT培养液，8-9天换HT培养液；

(7)根据融合细胞生长状态，选择合适的时期做阳性筛选(ELISA)，采用同源ic-ELISA，包被5μg/mL唑虫酰胺-BSA进行测试；

(8)阳性筛选得到阳性细胞孔，间隔2天做单点竞争(ELISA)，以唑虫酰胺标准溶液100ng/mL作为竞争药物，挑出强阳性OD_450nm≥0.5且抑制率≥50％的细胞株；

(9)筛选阳性高且竞争效果好的细胞孔扩24孔细胞板，根据融合细胞生长状态选择合适的时期做标线(ELISA)，细胞冻存；

(10)挑选最优细胞孔进行有限稀释，3天后单克隆细胞计数，再2天后补液，再4-6天后阳性筛选(ELISA)，再1天后单点竞争(ELISA)，扩24孔，测标线(ELISA)，获得稳定单克隆细胞株，冻存。

抗体制备：选用7周龄F1代小鼠，先用降脂烷500μL/只进行腹腔注射。7天后，将筛选获得的稳定单克隆杂交瘤细胞株(细胞密度约2×10⁶/mL)500μL/只接种至小鼠腹腔。7～10天后，小鼠腹腔膨胀，收集腹水，采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化。纯化后的腹水以唑虫酰胺-BSA包被，间接法测定抗体的效价和对唑虫酰胺的抑制率。

实施例2

使用实施例1得到的唑虫酰胺单克隆抗体进行免疫检测。

(1)包被：将唑虫酰胺-OVA溶于0.05mol/L碳酸缓冲液(pH 9.6)，以100μl/孔包被于酶标板，于4℃冷藏环境包被过夜，取出后用0.01M PBST洗涤3次。

(2)封闭：包被完成后，用0.01mol/L PBS(pH 7.4)配置2％脱脂奶粉，以300μl/孔封闭酶标板，于37℃培养箱封闭30分钟，取出后用0.01mol/L PBST洗涤2次。

(3)竞争反应：将待测样品溶解于30％甲醇的0.01mol/L PBS溶液，以50μl/孔加入酶标板，再加入唑虫酰胺抗体溶液50μl/孔，于37℃培养箱反应1小时，取出后洗板3次。

(4)酶标二抗反应：将兔抗鼠酶标二抗(甘油稀释1倍保存)用0.01mol/L PBS(pH7.4)稀释20000倍，加入100μl/孔，于37℃培养箱反应1小时，取出后洗板4次。

(5)显色与终止：显色底物为四甲基联苯胺(TMB)溶液，使用时A液和B液等体积混合，现配现用，显色时加入100μl/孔，显色15分钟后加入2mol/L H₂SO₄ 50μl/孔终止。

(6)显色终止后，将酶标板置于酶标仪上读数，读取OD_450nm数值，计算和分析数据。

目标分析物浓度对抗体的抑制率I＝(Amax－Amin)－(Ai－Amin)/(Amax－Amin)×100，抗体与抗原的结合率B/B0＝(Ai－Amin)/(Amax－Amin)，式中：Amax为空白孔平均吸光度值；Amin为免疫前BLAB/c小鼠血清对照孔平均吸光度值；Ai为加样孔平均吸光度值。以抑制率I或结合率B/B0为纵坐标、分析物浓度C为横坐标绘制标准曲线，如图1，检测限可以稳定达到0.02mg/L，分别以5％和95％抑制率对应的目标分析物浓度作为最小检测浓度和最大检测浓度，则检测范围为0.02mg/kg～56.94mg/kg。

实施例3

使用实施例1得到的唑虫酰胺抗体进行交叉反应测定。

利用棋盘试验方法确定包被原的包被浓度为5μg/L，包被体积为100μL每孔，抗体反应浓度为1μg/L，兔抗鼠酶标二抗稀释倍数为1:40000，在此条件下测定抗体特异性。以抗体与唑虫酰胺类化合物的交叉反应程度，以抑制抗体50％(IC₅₀)所需目标分析物的浓度与近似目标分析物IC₅₀的浓度之比的百分数表示，即交叉反应率C.R(％)。C.R(％)＝S＝Y/Z×100％，Y：IC₅₀时目标分析物的浓度，Z：IC₅₀时近似目标分析物的浓度。交叉反应率越小，抗体特异性越高；交叉反应率越大，抗体识别唑虫酰胺类化合物广谱性越高。具体内容见表1。

表1唑虫酰胺抗体对唑虫酰胺及其他新型吡唑杂环类化合物的交叉反应率

实施例4

使用实施例1得到的唑虫酰胺抗体制备成胶体金试纸条，采用胶体金试纸条和ELISA法进行实际样品检测。

实际样品检测采用了大白菜、茄子、茶叶、马铃薯、水样、土样，分别设置阴性样本和唑虫酰胺阳性添加样本，采用提取液进行样品残留提取。阴性样本的试纸条检测结果呈阴性，唑虫酰胺阳性添加样本的试纸条结果呈阳性。具体数据结果见表2。

表2实际样品中唑虫酰胺检测结果

最后，需要声明的是，本发明并不限于以上4种实施例，还可以有其他衍生用途。本领域的技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的其他变化模式，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.唑虫酰胺人工半抗原，其特征在于，分子结构式为：

2.一种如权利要求1所述的唑虫酰胺人工半抗原的制备方法，其特征在于：唑虫酰胺由唑虫酰胺经硝基化、氨基化、戊二酸酐酰化反应制备获得，合成路线如下：

3.唑虫酰胺免疫原，其特征在于：由权利要求1中所述的唑虫酰胺人工半抗原与钥孔血蓝蛋白偶联合成，分子结构式为：

4.唑虫酰胺人工包被抗原，其特征在于：是由权利要求1所述的唑虫酰胺人工半抗原与牛血清白蛋白偶联合成，分子结构式为：