CN116640076A - 一种甲砜霉素半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用 - Google Patents

一种甲砜霉素半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种甲砜霉素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。所述甲砜霉素半抗原结构式如式(I)所示，基于该半抗原制备人工抗原免疫动物得到单克隆抗体；基于该抗体制备甲砜霉素胶体金免疫层析试纸条，对甲砜霉素的IC50为0.70ng/mL，线性范围为0.16‑3.17ng/mL，最低检测限为0.06ng/mL，满足GB 31650‑2019中甲砜霉素的限量规定。表明本发明制备的人工抗原具有良好的免疫原性，可以用于制备甲砜霉素单克隆抗体并建立相应的免疫分析方法，适用于食品中甲砜霉素的现场高通量快速检测。本发明的抗原、抗体制备过程简单，成本较低，灵敏度高，且检测限较低，具有良好的应用前景。

Description

一种甲砜霉素半抗原、人工抗原、抗体及其制备和应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种甲砜霉素半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。
背景技术
甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)是第二代氯霉素类广谱抗菌药物，属于酰胺醇类抗生素，作为代替氯霉素的抗菌药物，甲砜霉素克服了氯霉素的潜在致命副作用，如骨髓抑制、再生障碍性贫血、灰婴综合征等，在动物养殖中常用于治疗和预防细菌感染，促进动物生长。但甲砜霉素仍具有较强的血液毒性、胚胎毒性以及免疫毒性，可抑制体内免疫球蛋白合成和抗体的生成，损害人体免疫功能。我国GB 31650-2019《食品中兽药最大残留限量的国家标准》甲砜霉素属于限用药物且禁止在产蛋期使用。
为了保障环境安全和人类生命健康，建立快速高效的甲砜霉素检测方法亟待解决。
目前，甲砜霉素的检测方法主要为仪器分析方法，包括：气相色谱、液相色谱串联质谱法、色谱-质谱联用法以及表面增强拉曼光谱技术等。此类方法仪器昂贵，操作繁琐，限制了其在现场中高通量筛查的使用。免疫分析方法具有低成本、高通量的优点，与大型仪器确证方法优势互补，逐渐成为检测兽药残留的主流技术。对于免疫分析法而言，抗体作为核心原材料，抗体的效果很大程度是取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。只有合成、制备出合适的甲砜霉素半抗原，才能够获得特异性强、灵敏度高的抗体。虽然中国专利CN 111592476 A已经公开了一种甲砜霉素半抗原及甲砜霉素人工抗原，并通过动物免疫获得了单克隆抗体，并采用化学发光酶联免疫方法，测定抗体的IC50值为0.26ng/mL，最低检测限为0.1ng/mL，但该半抗原通过三步制备得到，且检测全程约50min，不适用于现场的高通量快速检测。同时，现有用于甲砜霉素检测的人工抗原、抗体数量较少，因此需要提供更多可用于甲砜霉素免疫检测的半抗原、抗原和应用抗体的快速检测方法，对能够快速、灵敏、高通量的检测甲砜霉素具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种甲砜霉素半抗原。
本发明的第二个目的在于提供所述甲砜霉素半抗原的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述甲砜霉素半抗原的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种甲砜霉素人工抗原。
本发明的第五个目的在于提供所述甲砜霉素人工抗原的应用。
本发明的第六个目的在于提供一种甲砜霉素抗体。
本发明的第七个目的在于提供所述甲砜霉素抗体的应用。
本发明的第八个目的在于提供一种检测甲砜霉素的快速免疫分析方法及胶体金免疫层析试纸条。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种甲砜霉素半抗原，其结构式如式(I)所示：
本发明甲砜霉素半抗原在甲砜霉素分子基础上引入极性基团并延长间隔臂，通过氢氧化钾水解甲砜霉素的酰胺键生成氨基，然后再与丁二酸酐进行酰胺缩合反应，引入4个碳的间隔臂以及羧基，从而得到所设计的半抗原。
本发明所述甲砜霉素半抗原的制备方法，包括以下步骤：
S1.将甲砜霉素与氢氧化钾加入有机溶液中，加热进行回流反应，除去有机溶剂后得到产物I；
S2.将产物I溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入丁二酸酐进行搅拌反应，反应结束后，分离，除去有机溶剂后得到白色粉末状产物II，即甲砜霉素半抗原。
优选地，步骤S1中，所述有机溶剂为含50％甲醇的水溶液。
优选地，步骤S1中，所述甲砜霉素与氢氧化钾的摩尔比为1:1～1.2。
优选地，步骤S1中，所述反应条件为70～90℃反应1-2h。
优选地，步骤S2中，所述甲砜霉素与丁二酸酐的摩尔比为1:1.1～1.5。
优选地，步骤S2中，所述反应条件为20～25℃，反应12-24h。
优选地，步骤S2中，所述分离为采用200～300目硅胶柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)
优选地，步骤S1和S2中，为采用旋蒸法除去有机溶剂。
作为一种优选的可实施方案，所述甲砜霉素半抗原制备方法，具体包括如下步骤：称取甲砜霉素(710mg，2mmol)，氢氧化钾(112mg，2mmol)溶于6mL甲醇/水(1:1)混合溶液中，在80℃条件下反应2h。反应结束后用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，蒸干溶剂后得到淡黄色粉末，即产物Ⅰ。将产物Ⅰ(245mg，1mmol)、丁二酸酐(120mg，1.2mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下搅拌反应24h。反应结束后用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，蒸干溶剂后，经200-300目硅胶柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚＝1:1)分离得到白色粉末状产物，即制得所述甲砜霉素半抗原。
本发明还提供式(I)所述甲砜霉素半抗原在制备甲砜霉素人工抗原中的应用。
一种甲砜霉素人工抗原，由式(I)所述甲砜霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述甲砜霉素人工抗原结构式如式(II)所示：
优选地，载体蛋白为乳铁蛋白(LF)或鸡卵清白蛋白(OVA)，LF用于制备免疫原，OVA用于制备包被原。
优选地，所述偶联的方式为活泼酯法。
作为一种优选地可实施方式，所述甲砜霉素人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将甲砜霉素半抗原5mg与10mg EDC、5mg NHS溶于200μL的DMF中，4℃下搅拌过夜，离心后取上清为A液。称取载体蛋白10mg，将溶解于2mL的包被缓冲溶液中，为B液。磁力搅拌下，吸取A液逐滴缓慢加入到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后取上清液，装入透析袋中，4℃下用PBS(0.01M，pH7.4)透析3天，每天换3次透析液，得到人工抗原，于-20℃保存备用。
本发明还提供一种甲砜霉素抗体，是以式(II)所述甲砜霉素人工抗原为免疫原制备得到。所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体等。
优选地，所述抗体为甲砜霉素单克隆抗体，是以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的甲砜霉素人工抗原为免疫原；选取适龄雌性Balb/C小鼠进行免疫，第4次免疫和第5次免疫后测定抗血淸的效价和抑制率，在细胞融合前3天冲击免疫；取冲击免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，扩大培养；将扩大培养的杂交瘤细胞注入己提前注射石蜡的小鼠体内，收集腹水，纯化，得到单克隆抗体。
本发明还提供所述甲砜霉素人工抗原及甲砜霉素抗体在免疫法检测甲砜霉素中的应用。
本发明还提供一种检测甲砜霉素的快速免疫分析方法，是以上述载体蛋白为鸡卵清白蛋白的甲砜霉素人工抗原作为包被原，以上述载体蛋白为乳铁蛋白的甲砜霉素人工抗原作为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
本发明还提供一种检测甲砜霉素的胶体金免疫层析试纸条，是以上述载体蛋白为鸡卵清白蛋白的甲砜霉素人工抗原为包被原，以上述载体蛋白为乳铁蛋白的甲砜霉素人工抗原作为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首先提供了一种甲砜霉素半抗原，其结构式如式(I)所示，基于该半抗原制备人工抗原，再以人工抗原免疫动物并结合杂交瘤技术制备获得针对甲砜霉素的单克隆抗体，基于该抗体所建立的检测甲砜霉素的胶体金免疫层析方法，对甲砜霉素的IC50为0.70ng/mL，线性范围为0.16～3.17ng/mL，最低检测限为0.06ng/mL，检测全程仅需10min，也表明本发明制备的人工抗原具有良好的免疫原性，可以用于制备甲砜霉素单克隆抗体并建立相对应的免疫分析方法，适用于食品中甲砜霉素的现场高通量快速测定。本发明的抗原、抗体制备过程简单、成本较低，且检测限更低，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明甲砜霉素式(Ⅰ)半抗原质谱鉴定图；
图2为本发明半抗原、载体蛋白及人工抗原紫外扫描图；
图3为本发明甲砜霉素单克隆抗体间接竞争ELISA的标准曲线图。
图4为本发明甲砜霉素胶体金免疫层析试纸条的标准曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1甲砜霉素半抗原的制备
(1)称取甲砜霉素(710mg，2mmol)，氢氧化钾(112mg，2mmol)溶于6mL甲醇/水(1:1)混合溶液中，在80℃条件下反应2h。反应结束后用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，蒸干溶剂后得到淡黄色粉末，即产物Ⅰ。
(2)称取产物Ⅰ(245mg，1mmol)、丁二酸酐(120mg，1.2mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下搅拌反应24h。反应结束后蒸干溶剂，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，蒸干溶剂后，经200-300目硅胶柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚＝2:1)分离得到白色固体，即产物II。
上述化学反应方程式如下所示：
产物2的ESI-MS图谱如图1所示,ESI-MS analysis(negative)m/z 344.4；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.97(d,J＝0.6Hz,1H),7.75(m,2H),7.37(m,2H),5.81(d,J＝5.0Hz,1H),5.14(dt,J＝4.9,1.0,1.0Hz,1H),4.83(t,J＝5.5,5.5Hz,1H),4.60(d,J＝0.6Hz,1H),3.81(dd,J＝12.4,5.5Hz,1H),3.31(dd,J＝12.5,5.6Hz,1H),3.28(s,3H),2.49(m,4H)，表明成功制得式(Ⅰ)所示甲砜霉素半抗原。
实施例2甲砜霉素人工抗原的制备及鉴定
(1)免疫原制备
将5mg式Ⅰ半抗原与10mg EDC、5mg NHS溶于200μL的DMF中，4℃下搅拌过夜，离心后取上清为A液。称取乳铁蛋白(LF)10mg，将溶解于2mL的包被缓冲溶液中，为B液。磁力搅拌下，吸取A液逐滴缓慢加入到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后取上清液，装入透析袋中，4℃下用PBS(0.01M，pH7.4)透析3天，每天换3次透析液，得到免疫原。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于1.5mL离心管中，-20℃保存备用。
(2)包被原制备
分别将5mg式Ⅰ半抗原与10mg EDC、5mg NHS溶于200μL的DMF中，4℃下搅拌过夜，离心后取上清为A液。称取鸡卵清白蛋白(OVA)10mg，将其分别溶解于2mL的包被缓冲溶液中，为B液。磁力搅拌下，吸取A液逐滴缓慢加入到B液中，4℃下搅拌反应12h。离心后取上清液，装入透析袋中，4℃下用PBS(0.01M，pH 7.4)透析3天，每天换3次透析液，得到包被原。用PBS调整浓度为1mg/mL，每管500μL分装于1.5mL离心管中，-20℃保存备用。
取实施例1制备的半抗原和实施例2制备的人工抗原分别进行紫外波长扫描(150～400nm)进行鉴定。结果如图2所示，偶联物甲砜霉素半抗原-载体蛋白的最大吸收峰与甲砜霉素半抗原、载体蛋白的最大吸收峰的位置及特征峰相比发生了变化，表明甲砜霉素半抗原-载体蛋白的合成是成功的。
实施例3甲砜霉素人工抗原单克隆抗体的制备
动物免疫：将制备的免疫原与等量的弗氏完全佐剂充分乳化，腹部皮下注射5周龄的BALB/c小鼠，每只0.20mL；从首次免疫开始，第2，4和6周加强免疫，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法和剂量同首次免疫。
细胞融合：取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0混合，在1min内均速滴加1mL温浴好的PEG2000进行融合，加入HAT培养液摇晃均匀，然后加入到提前准备的8块含有饲养层细胞的96孔培养板中，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养。第5天用HT培养基半换液一次，第8天用完全培养基全换液，第十天每孔取120μL细胞上清采用间接竞争酶联免疫分析方法检测，具体操作步骤如下：
(1)包板：用包被缓冲液将被包被原稀释成1000ng/mL，以每孔100μL加入96孔酶标板的微孔中，37℃水浴孵育过夜。倾倒孔内液孔，每孔加PBST 300μL，洗涤2次，甩干。每孔加入120μL封闭液，37℃水浴封闭3h，甩干孔内液体，于37℃烘箱烘干，1h后取出放4℃备用。
(2)细胞上清效价与抑制测定：将步骤(1)包好的酶标板，效价列：每孔分别加入50μL PBS和50μL细胞上清；抑制列：每孔加入50μL稀释好的1000ng/mL药物(甲砜霉素)和50μL细胞上清。37℃孵育40min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育30min，用PBST洗五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(10％H2 SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸光值。
包被缓冲液：pH 9.6，0.1M的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：Na2CO3 1.65g/L和NaHCO3 2.65g/L)。
PBST：0.01M PBS和0.06％ Tween-20(v/v)(溶剂为蒸馏水)
封闭液：含有1％(体积百分含量)脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，pH 7.4。
(3)阳性杂交瘤的筛选：选择效价高、药物抑制强的阳性杂交瘤细胞进行下一步有限稀释。无菌条件下，用显微镜挑取阳性孔中团簇生长的细胞，移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2～1/3孔底后，取上清液，icELISA检测,同样以效价和抑制率做为衡量指标，取呈阳性强者利用有限稀释法进行亚克隆，如此反复3-4轮，直至每板每个孔都为阳性且经检测效价/抑制相近，至此杂交瘤细胞系建立成功，得到能稳定分泌均一抗体的杂交瘤细胞系。挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或细胞培养皿中扩大培养，及时冻存。
(4)单克隆抗体的大量制备：用采用间接竞争酶联免疫分析方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，筛选出能稳定分泌均一抗体单个细胞，扩大培养，具体步骤如下：
向8周龄以上的Balb/c小鼠腹腔内注射500μL液体石蜡，7-10天后将扩大培养的杂交瘤细胞转移至2mL培养基中，稀释细胞数目为2×106个/mL，取0.5mL细胞悬液注射到小鼠的腹腔，至其腹腔胀大、鼠毛毛躁并失去光泽、精神不佳时断颈处死小鼠，收集腹水。于4℃，12000r/min离心15min，除去上层脂肪和下层杂质，收集中间淡黄色澄清的液体，用icELlSA法测定其效价和抑制率，经纯化后在-20℃保存备用。
实施例4甲砜霉素单克隆抗体的灵敏度测定
(1)实验方法
将实施例3步骤(1)中包好的酶标板，每孔加入一系列不同浓度的50μL的甲砜霉素标准品和50μL甲砜霉素单克隆抗体(5.86ng/mL)，37℃孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入1:5000稀释的酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育40min，用PBST洗涤五次，拍干孔内液体，加入100μL TMB底物液，37℃避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。以甲砜霉素准品浓度对横坐标，B/B0(加入甲砜霉素的孔的OD450/未加入甲砜霉素的孔的OD450)为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
(2)实验结果
基于单克隆抗体建立的间接竞争ELISA标准曲线图如图3所示，可以看出，标准曲线呈S型，线性相关性较好，对甲砜霉素的IC50为0.70ng/mL，最低检测限为0.1ng/mL，线性范围为0.20-2.42ng/mL，检测灵敏度较高。
实施例5甲砜霉素单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备
(1)胶体金溶液的制备
取500mL双蒸去离子水置于圆底烧瓶中，使用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，快速加入5mL 1％氯金酸溶液，待再次沸腾后分别加入20mL 1％柠檬酸三钠溶液，保持沸腾状态15min，观察颜色从紫色到澄清透明的酒红色并且颜色不再发生变化后停止加热，冷却至室温，得到胶体金溶液，置于4℃保存。
(2)甲砜霉素单克隆抗体-胶体金探针的制备
磁力搅拌下，1mL胶体金溶液加入适量0.2mol/L K2CO3溶液，调节pH至7.4，加入3-5μg实施例3步骤(4)制备得到的甲砜霉素单克隆抗体，搅拌混匀5min，再加入10μL 10％牛血清白蛋白(BSA)，搅拌混匀5min。以12000rpm，在4℃下离心10min，弃上清液，加入200μL复溶缓冲液重悬，制备得到甲砜霉素单克隆抗体-胶体金探针，置于4℃备用。
复溶缓冲液：pH 7.4，0.01M PB(溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度如下：BSA 5g/L，蔗糖25g/L，Tween-20 1g/L)
(3)样品垫的制备
将样品垫置于pH为7.4的含0.5％ Tween-20的0.01M PB溶液中浸泡30min，后置于37℃烘箱烘干6h备用。
(4)反应膜的制备
采用金标划膜仪将实施例2步骤(2)制备得到的包被原喷涂于硝酸纤维素膜的T区检测线(T线)，将10mg/mL羊抗鼠抗体喷涂于硝酸纤维素膜的C区检测线(C线)，将喷涂好的反应膜置于45℃烘箱干燥6h。
(5)试纸条组装
将样品垫和吸水滤纸分别在反应膜两边各重叠2mm，粘贴至PVC底板上，切割试纸条宽度为3.5mm。
实施例6甲砜霉素胶体金免疫层析试纸条的应用
(1)检测步骤
取10μL实施例5步骤(2)制备的甲砜霉素单克隆抗体-胶体金探针于微孔中，随后加入100μL 0.01M PB或100μL一系列不同浓度的50μL的甲砜霉素标准品混合均匀，室温静置5min后，插入组装好的胶体金试纸条，室温反应5min。取出试纸条，除去样品垫端，采用免疫层析读数仪进行结果判读。
(2)检测结果分析
使用免疫层析读数仪读取各试纸条的T/C值，具体采用四参数S函数拟合并绘制标准曲线，以待测药物浓度的对数值为横坐标，以B/B0为纵坐标拟合标准曲线(B0为不添加药物时的T/C值，B为添加药物浓度的T/C值)，定义B/B0为90％时为仪器检测的检测限。
(3)标准曲线
通过对标准溶液的检测结果分析得到甲砜霉素的标准曲线图，如图4所示，本发明胶体金免疫层析试纸条对甲砜霉素的IC50为0.70ng/mL，线性范围为0.16-3.17ng/mL，最低检测限为0.06ng/mL，检测限低，灵敏度较高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甲砜霉素半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示：
2.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，先将甲砜霉素在碱性条件下进行水解反应衍生出氨基，再与丁二酸酐发生酰胺缩合反应得到白色粉末状产物，即为式(I)所示甲砜霉素半抗原。
3.权利要求1所述甲砜霉素半抗原在制备甲砜霉素人工抗原中的应用。
4.一种甲砜霉素人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述甲砜霉素半抗原偶联载体蛋白得到，其结构式如式(II)所示：
5.根据权利要求4所述甲砜霉素人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为乳铁蛋白或鸡卵清白蛋白。
6.根据权利要求4所述甲砜霉素人工抗原，其特征在于，所述偶联的方式为活泼酯法。
7.权利要求4～6任一所述甲砜霉素人工抗原在制备甲砜霉素抗体中的应用。
8.一种甲砜霉素抗体，其特征在于，是以权利要求4～6任一所述甲砜霉素人工抗原为免疫原免疫动物制备得到。
9.权利要求4～6任一所述甲砜霉素人工抗原或权利8所述甲砜霉素抗体在免疫法检测甲砜霉素或在制备甲砜霉素免疫检测产品中的应用。
10.一种检测甲砜霉素的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，是以权利要求4中载体蛋白为鸡卵清白蛋白的人工抗原为包被原，以权利要求4中载体蛋白为牛血清蛋白的人工抗原作为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体。
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