CN111154000A - 一种抗西马特罗单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗西马特罗单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗西马特罗单克隆抗体及其应用，包括一种制备抗西马特罗单克隆抗体的方法，还包括制备西马特罗抗原工作液和制备西马特罗单克隆抗体两个内容，还提供抗西马特罗单克隆抗体的具体应用，包括制备ELISA试剂盒或胶体金层析试纸条。本发明制备的完全抗原具有很好的免疫原性，制备高效稳定的单克隆抗体，获得通过检测系列稀释的标准溶液将单抗的高度特异性和方法的高度敏感性有机地结合起来，达到抗原快速检测，适宜于短时间内检测大量样品，为样品中西马特罗残留的检测奠定了基础。

Description

一种抗西马特罗单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体属于一种抗西马特罗单克隆抗体及其应用。
背景技术
西马特罗是小分子半抗原(分子量为219.28Da)，必须和载体蛋白偶联成为完全抗原，才能刺激机体产生免疫反应，诱导机体产生抗体。常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)、人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等，目前常用的偶联方法有很多种，偶联方法的选择受很多方面的影响，例如半抗原的活性基团，抗原与抗体的结合位点，合成的成本等。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗西马特罗单克隆抗体及其应用，要解决现有技术西马特罗药物残留物检测较慢的技术问题；并解决现有技术制备的抗体不纯的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种抗西马特罗单克隆抗体，其特征在于：所述抗体效价为1:64000，亚型为IgG1，对西马特罗抑制率IC50为0.3ng/mL，最低检测限为0.001ng/mL，与盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸多巴胺、溴布特罗、班布特罗、齐帕特罗、特布他林、达氟沙星、泰乐菌素无交叉反应。
一种制备抗西马特罗单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备西马特罗抗原工作液：
(a)西马特罗重氮化：浓盐酸溶液提前放置冰上预冷30分钟后，将4mg西马特罗标准品溶于0.1mol/L PH＝2的浓盐酸溶液中混匀，向上述溶液匀速逐滴加入预冷的0.15mol/L 的NaNO2溶液，在冰上避光操作，同时使用淀粉淀化钾试纸监控，直至试纸变成蓝紫色时停止加入，之后避光低温低速搅拌4～4.5h，得到西马特罗反应液；
(b)调西马特罗反应液PH：用1mol/L的NaOH溶液调步骤(a)西马特罗反应液PH，至PH＝7.4时停止，用尿素用来中和过量的NaNO2，用淀粉淀化钾试纸检测，试纸由深蓝变为浅蓝，即停止，低温备用；
(c)制备西马特罗人工完全抗原：称取17mg BSA粉末溶于1mL PH＝8.6的硼酸缓冲液得到蛋白溶液，将步骤(b)所得混合液逐滴加入到蛋白溶液中，放于4℃避光低速搅拌 24小时后，将反应得到的亮黄色偶联产物在处理好的透析袋中放置PBS中，每间隔8小时换一次透析液，透析3天，得到西马特罗人工完全抗原，标记为CIM-BSA；
(d)制备西马特罗包被原：称取17mg OVA粉末溶于1mL PH＝8.6的硼酸缓冲液得到蛋白溶液，将步骤(b)所得混合液逐滴加入到蛋白溶液中，放于4℃避光低速搅拌24小时后，将反应得到的亮黄色偶联产物在处理好的透析袋中放置OVA中，每间隔8小时换一次透析液，透析3天，得到西马特罗人工完全抗原，标记为CIM-OVA；
(2)制备西马特罗单克隆抗体：
(e)动物免疫：免疫原选用CIM-BSA，CIM-BSA与弗氏完全佐剂充分乳化后形成免疫剂，取4-6周龄雌性BALB/c小鼠6只，每只每次采用免疫剂量为50ug，间隔2周免疫1 次，3次免疫后断尾取血测定效价和抑制率，选择血清效价高且具有CIM抑制作用强的小鼠进行细胞融合；
(f)饲养细胞、SP2/0细胞及脾细胞准备：融合前一天，选用健康状况良好的5-6周龄的BALB/c小鼠，小鼠脱颈处死，无菌条件下取小鼠腹腔细胞作为饲养细胞；融合前一周复苏SP2/0细胞；无菌手术开腹经加强免疫的BALB/c小鼠，并取出脾脏，经研磨棒挤压、培养基冲洗、离心、重悬、计数，备用；
(g)细胞融合：取步骤(f)选定的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞和小鼠的脾细胞按1：5-1：10的比例进行融合，间接ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直到每个克隆孔上清均为阳性时定株；
(h)单克隆抗体腹水纯化：选取个体较大的雌性BALB/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20℃保存，获得西马特罗单克隆抗体。
抗西马特罗单克隆抗体用于配制检测生物样品中的西马特罗的非诊断目的检测产品中的应用。
进一步优选地，所述非诊断目的检测产品为ELISA试剂盒或胶体金层析试纸条。
一种检测西马特罗的ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有如权利要求1或2所述的抗福莫特罗的单克隆抗体。
一种检测西马特罗的胶体金层析试纸条，其特征在于：该胶体金层析试纸条中含有如权利要求1或2所述的抗西马特罗的单克隆抗体。
一种检测西马特罗的ELISA试剂盒，其特征在于，包括下述各组分：
(a)包被有所述西马特罗人工完全抗原的酶标板，包被液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液；
(b)含所述西马特罗药物单克隆抗体的工作液；
(c)酶标记物工作液：辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗抗体；
(d)西马特罗标准品溶液：采用梯度稀释法配制0、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL、24.3ng/mL的西马特罗小分子标准品；
(e)底物显色液A液为过氧化脲溶液，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液；
(f)终止液为2mol/L的硫酸溶液；
(g)洗涤液为磷酸吐温缓冲液；
(h)样本稀释液为含有5％脱脂奶粉的0.01mol/L pH 7.4的磷酸缓冲液。
一种检测西马特罗的ELISA试剂盒的用于检测西马特罗药物残留中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(a)样品前处理：对猪尿样品15000rpm，离心10min，去除沉淀和杂质颗粒，抽取上清用于检测；
(b)取添加值及利用本试剂盒计算检测值：取三个间接竞争ELISA实验中小分子标准品的浓度，即为添加值，同一份样品做三次重复实验，将得到的吸光值取平均数带入标准曲线中计算小分子的含量，即为检测值；
(c)计算试剂盒回收率：检测值与添加量的比值为回收率，三次实验回收率的平均值为试剂盒平均回收率，样品回收率为108.6％。
与现有技术相比本发明具有以下特点和有益效果：
酶联免疫吸附试验具有敏感、准确、快速、简单等其它方法无法比拟的优点，结合多抗应用使其具有更大的优势。
本发明中西马特罗其分子量为219.28Da，其分子量较小，在用传统的方法筛选单克隆抗体时，首先要制备完全抗原，完全抗原因为偶联了大分子载体蛋白，既有免疫原性又具有反应原性，用重氮化法制备小分子西马特罗免疫原和包被原，重氮化法针对西马特罗的特殊结构(苯氨基)在强酸介质下加入适量的亚硝酸盐，可以生成重氮盐，随后与载体蛋白的酪氨酸的酚羟基的邻位相连，生成偶氮键，具体地，载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)，该载体具备一定的容量，可以偶联足够的小分子，并且是稳定的惰性蛋白，不会干扰偶联分子的功能，西马特罗小分子化合物，结构简单，分子量小，存在活性基团伯氨基，通过重氮化反应引入偶氮键(—N＝N—)作间隔臂，长度适宜，既产生了针对CIM的特异性抗体，又避免了“桥抗体”的出现，据此，以活性基团氨基作为间隔臂，经重氮化合成人工抗原CIM-BSA，CIM-OVA。
本发明将高度特异性抗体吸附于固体载体上，使游离的西马特罗与化学合成的克伦特罗偶联物顺次竞争抗体的结合位点，当吸附的抗体量和克伦特罗偶联物的量固定时，待测样品中游离的量愈多，结合于抗体上的偶联物愈少，从而使底物显色愈浅，使待检的量与值成反比关系，用成功制备的完全抗原免疫小鼠制备多抗血清，其制备的小鼠多抗血清抗CIM的 IC500.3ng/mL。
本发明制备的完全抗原具有很好的免疫原性，制备高效稳定的单克隆抗体，获得通过检测系列稀释的标准溶液，绘出标准曲线为y＝-0.104x+0.4467R2＝0.9837，通过建立的方法计算得出单抗的半数抑制浓度为0.3ng/mL，最低检测限为0.001ng/mL，用于定量测定。这种将单抗的高度特异性和方法的高度敏感性有机地结合起来，达到抗原快速检测，适宜于短时间内检测大量样品，为样品中西马特罗残留的检测奠定了基础。
附图说明
图1：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；M:蛋白电泳彩虹Maker；1：CIM-BSA；2：BSA；
图2： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；M:蛋白电泳彩虹Maker；1：CIM-OVA；2：OVA；
图3：西马特罗免疫原紫外扫描结果；
图4：西马特罗包被原紫外扫描结果；
图5：西马特罗免疫原质谱鉴定图；
图6：西马特罗包被原高分辨质谱鉴定；
图7：西马特罗鼠源抗体血清吸光值测定；
图8：抗西马特罗杂交瘤细胞株的稳定性测定(OD450(*)值表示第*代杂交瘤细胞的吸光值，OD450(0)表示第一代杂交瘤细胞的吸光值)；
图9：为间接竞争ELISA测血清灵敏度测试图表。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创新特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明进一步说明。
在此记载的实施例为本发明的特定的具体实施方式，用于说明本发明的构思，均是解释性和示例性的，不应解释为对本发明实施方式及本发明范围的限制。除在此记载的实施例外，本领域技术人员还能够基于本申请权利要求书和说明书所公开的内容采用显而易见的其它技术方案，这些技术方案包括采用对在此记载的实施例的做出任何显而易见的替换和修改的技术方案。
一、研究背景，
西马特罗人工完全抗原的制备及鉴定
西马特罗是小分子半抗原(分子量为219.28Da)，必须和载体蛋白偶联成为完全抗原，才能刺激机体产生免疫反应，诱导机体产生抗体。常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)、人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。本研究使用的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)。该载体具备一定的容量，可以偶联足够的小分子，并且是稳定的惰性蛋白，不会干扰偶联分子的功能。
目前常用的偶联方法有很多种，偶联方法的选择受很多方面的影响，例如半抗原的活性基团，抗原与抗体的结合位点，合成的成本等。西马特罗小分子化合物,结构简单,分子量小,存在活性基团伯氨基,通过重氮化反应引入偶氮键(—N＝N—)作间隔臂，长度适宜, 既产生了针对CIM的特异性抗体,又避免了“桥抗体”的出现。据此，以活性基团氨基作为间隔臂，经重氮化合成人工抗原CIM-BSA，CIM-OVA。
1.材料
1.1试剂与仪器西马特罗标准品(CIMATEROL)、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)均购自SIGMA-ALORICH公司，透析袋，过硫酸胺，N,N,N,N四甲基乙烯二胺(TEMED)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，十二烷基磺酸钠(SDS)，30％聚丙烯酰胶贮液均购自solarbio生物试剂公司，淀粉碘化钾试纸，电子天平，磁力搅拌器，低温培养箱，台式PH计，酶标仪，紫外分光光度计，
1.2溶液体系
0.01M、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)：40.24g KH2PO，1.44g Na2HPO4，8g NaCl，0.2g KCl，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，常温保存
0.15mol/L NaNO2溶液：0.35mg NaNO2固体粉末溶于1mL去离子水，避光4℃保存，硼酸缓冲液(PH＝8.6)：0.29Na2HPO4.12H2O，0.026g NaH2PO4.H2O，溶于10mL去离子水，调PH＝8.6后高压灭菌
1.5molL，pH＝8.8Tris-HCL分离胶缓冲液：18.15g Tris用1mol/L HC1定容至100mL，棕色瓶避光4℃保存
1.0mol/L，pH＝6.8Tris-HCL分离缓冲液：12g Tris用1mol/l调pH至100mL，棕色瓶避光4℃保存
10％SDS溶液：10g SDS加水定容至100mL，完全溶解室温保存；
10％APS溶液：0.1g APS(过硫酸铵)加水定容至1mL，用前新鲜配制；
1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris(3.0285g/L)，192mM甘氨酸(14.41g/L)，0.1％SDS(1g/L)，pH＝8.3
染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250溶解于45mL甲醇，45mL水，10mL冰醋酸，过滤除去杂质脱色液：45mL甲醇，45mL水，10mL冰醋酸
2.方法
2.1西马特罗完全抗原的制备
(1)将4mg西马特罗标准品溶于0.1mol/L浓盐酸溶液(PH＝2)中混匀，浓盐酸溶液需要提前放置冰上预冷30分钟。
(2)向上述溶液匀速逐滴加入预冷的0.15mol/L的NaNO2溶液，在冰上避光操作，同时使用淀粉淀化钾试纸监控，直至试纸变成蓝紫色时停止加入。
(3)避光低温低速搅拌4～4.5h。
(4)用1mol/L的NaOH溶液调反应液PH，至PH＝7.4时停止，可用尿素用来中和过量的NaNO2，用淀粉淀化钾试纸检测，试纸由深蓝变为浅蓝，即停止，低温备用。
(5)称取17mg BSA粉末溶于1mL硼酸缓冲液(PH＝8.6)，将第4步所得混合液逐滴加入到蛋白溶液中，放于4℃避光低速搅拌24小时。
(6)将反应得到的亮黄色偶联产物在处理好的透析袋中放置PBS中，每间隔8小时换一次透析液，透析3天左右。即得西马特罗人工完全抗原(CIM-BSA)，分装，-20℃保存。
2.2包被原的制备
包被原的载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)，分子量约45kDa。OVA和BSA一样具有大量的反应基团，如氨基、羧基等，且能在水相或某些有机溶剂的混合物中充分溶解，使偶联反应可在较高浓度的反应物存在条件下进行。西马特罗与OVA的偶联方法和CIM-BSA 偶联方法一致。
3.抗原的表征与鉴定
3.1聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-PAGE凝胶电泳分离胶和浓缩胶的浓度与目的蛋白的分子量有关。本试验选用的载体蛋白BSA、OVA的相对分子质量分别为66.43kDa、45.7kDa。目的蛋白分子量在30～100kDa，使用的分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，凝胶配制如表2-1，浓缩胶电压120V，分离胶电压80V，凝胶厚度1.5mm，上样量为2ug，考马斯亮蓝染色3～4h后，置脱色液中过夜脱色。根据条带分子量的大小变化判断偶联效果。
表2-1 SDS-PAGE凝胶电泳配制
Figure BDA0002370096200000091
Figure BDA0002370096200000101
3.2紫外全波长扫描
载体蛋白具有吸光基团如吲哚基、苯环含共轭双键的芳香族氨基等，所以其在紫外全波长扫描时会出现特异的吸收峰，一般波长在280nm。通常载体蛋白偶联小分子后其最大吸收峰会发生偏移，或产生新的吸收峰。用紫外吸收法测定其蛋白质的浓度和特征峰，在波长 200～500nm范围内进行紫外扫描，根据吸收峰的变化判断偶联是否成功。
3.3 Maldi-tof-MS及ESI-MS
利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorptionlionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术测定西马特罗与载体蛋白的偶联比， MALDI-TOF-MS的原理是用激光照射样品与基质，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子。然后离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比。根据MALDI-TOF-MS的相对分子质量可以更加精确的得知载体蛋白上面偶联小分子的数目。本研究采用MALDI-TOF-MS和ESI-MS高分辨率质谱同时进行的策略，目的在于有效消除实验及测量过程中的误差。
4.人工抗原的鉴定结果分析
4.1 SDS-PAGE鉴定
载体蛋白偶联半抗原后会导致在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中泳动速度变慢。SDS-PAGE 鉴定结果表明，BSA和0VA的泳动速度均大于CIM-BSA和CIM-OVA(图1、图2)，证明CIM与BSA和OVA偶联成功。
4.2 UV鉴定
用PBS配制CIM-BSA、CIM-OVA、BSA、OVA的溶液浓度为1mg/mL的标准溶液，分别扫描缓冲溶液PBS、载体蛋白、载体蛋白偶联物，用缓冲溶液校准去除基质的干扰，比较载体蛋白和偶联物的最大吸收峰波长，由图3、4所示，CIM-BSA和CIM-OVA的吸收峰均右移，且吸光值降低，表明人工完全抗原偶联成功。
4.3MALDI-TOF-MS鉴定及高分辨质谱鉴定
通过质谱图(图5和6)显示，最高峰即为其特异峰，反应了蛋白的相对分子质量。单个 CIM的相对分子质量为219.28Da，载体蛋白BSA、OVA的相对分子质量分别为66.43kDa、42.7kDa。通过质谱分子量测定计算偶联比，测试品CIM-BSA的相对分子质量为：68156.88Da说明CIM-BSA完全抗原偶联成功，偶联比约为8：1:；测试品CIM-OVA的相对分子质量为：44382.2Da,说明CIM-OVA完全抗原偶联成功，偶联比约为7.6：1。
5.分析与讨论
CIM分子量只有219.28Da，为半抗原，本身没有免疫原性，不会激发动物免疫系统产生抗体，需要和载体蛋白连接起来合成人工免疫原，才具备免疫原性。对于带有氨基的半抗原与载体蛋白的偶联一般采用重氮化法、戊二醛和EDC法，有研究证实，重氮化法适用于芳香胺，影响人工抗原免疫原性的主要因素包括载体蛋白的性质、半抗原的分子空间结构、间隔臂的长度和分子结合比等。由于BSA理化性质稳定，不易变性，价廉易得，分子内含自由氨基和羧基多，在较大pH值范围和不同离子强度下均能保持较大的溶解度，更有利于偶联反应的进行，本试验选用BSA作为免疫原的蛋白载体。载体蛋白与半抗原中间加入一定长度的间隔臂，有助于半抗原结构的暴露，有利于特异性抗体的产生，间隔臂过长可形成新的抗原表位，易被细胞识别而产生“桥抗体”，间隔臂过短则载体蛋白的空间位阻将影响细胞对半抗原的识别，不易产生特异性抗体。以-N＝N-作间隔臂，长度适宜，既可产生针对目标抗原的特异性抗体，又避免了桥抗体的出现。故本试验选用氮化法偶联CIM与载体蛋白BSA和OVA，分别制备人工抗原和包被原，经紫外扫描、SDS-PAGE及质谱检测鉴定，人工完全抗原偶联的效果良好。
三、西马特罗人工完全抗原单克隆抗体的制备及免疫学检测方法初步应用
随着分子生物学技术的迅速发展，出现了几种新的抗体制备方法，如嵌合单克隆抗体制备技术，转基因小鼠制备单克隆抗体，噬菌体展示技术制备单克隆抗体等新技术，本研究我们仍然选择了传统的杂交瘤技术。杂交瘤技术通过将杂交瘤细胞注射到小鼠体内来制造大量的单克隆抗体，它产生具有特异性和可持续性的高亲和力抗体。
竞争性酶联免疫吸附试验((icELISA)；也称为抑制ELISA)使纯化的抗原与测试样品中的抗原竞争，与固定在微滴定板井中的抗体结合。如果固定化分子是抗原，并且竞争分子在测试样品中被纯化标记抗体对抗体也适用。icELISA对于测定复杂样品混合物中小分子抗原的浓度非常有用。在直接ELISA中，抗原特异性捕获抗体在与已知标准或未知测试样品孵育之前被吸附在微滴定板上。也加入酶联抗原(即标记抗原)，只有当抗体的结合位点未被测试样品中的抗原标准或抗原占据时，才能与捕获抗体结合。未结合的标记和未标记的抗原被冲走并添加底物。标准或测试样品中的抗原量决定了与抗体结合的报告标记抗原的量，产生的信号与样品中的抗原浓度成反比。因此，测试样品中的抗原浓度越高，与捕获抗体结合的标记抗原就越少，因此结果信号就越弱。本研究采用动物体内诱生腹水方法制备出抗CIM 单抗，并鉴定单抗的各种性能，初步建立了CIM免疫学检测方法。
1试剂与材料
1.1试剂经辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG购自索莱宝生物科技；弗氏完全佐剂(Freund`s complete Adjuvant,FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund`s incompleteAdjuvant,FIA)均购自Sigma公司；TMB单组份显色液购自宝生物科技公司。
1.2 ELISA工作液
缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，0.01mo/L):称取3.625g Na2HPO4·12H20，10g NaCl，0.25g KH2PO4·2H2O，0.25g KC1，用1.25L超纯水混合溶解之，调溶液pH值至7.2～7.4 0。
包被液：碳酸盐缓冲液(CBS，0.05mol/L):称取Na2HCO3·10H2O：1.144g，NaHCO3：0.2856g，加入250mL蒸馏水中充分溶解至混匀，调溶液pH值至9.6。
洗涤液：磷酸盐吐温缓冲液((PBST，0.5‰):吸取(吐温-20)0.6mL至移液枪中，加到1 L的PBS溶液中，待溶液充分混匀后调pH值至7.0～7.2。
终止液：2mo/L H2SO4:量取98％浓硫酸21.7mL，缓慢滴加到178.3mL的超纯水中，待混合液冷却，转移到棕色瓶中室温保存。
1.3材料普通冰箱(青岛海尔)；可调微量系列加样器(上海求精生化仪器厂)；常速离心机(Jouan公司，法国)；酶标仪(PERKINELMER公司，美国)，移液枪。CO2细胞培养箱(美国Thermofisher公司)。
实验动物健康洁净级BALB/c小鼠(约5-6周龄)购自郑州大学实验动物中心。
2实验方法
2.1动物免疫
取4-6周龄雌性BALB/c小鼠6只，首免用免疫原CIM-BSA与弗氏完全佐剂充分乳化，免疫剂量为50ug每只，背部皮下多点注射，二免、三免均用弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔14天。三免后第10天尾部采血，测定血清效价，选择血清效价高且具有CIM抑制作用强的小鼠进行细胞融合。细胞融合前3～5天加强免疫，用纯完全抗原每只腹腔注射50ug。
表1免疫方式及剂量
Figure BDA0002370096200000141
2.2细胞融合
2.2.1饲养细胞的准备及SP2/0细胞的准备融合前一天，选用健康状况良好的5-6周龄的BALB/c小鼠，小鼠脱颈处死，无菌条件下取小鼠腹腔细胞作为饲养细胞。融合前一周复苏SP2/0细胞，方法如下：从液氮中取出冻存的SP2/0细胞，迅速转移至37℃水浴锅内，不断轻轻晃动使其快速融化，1000r/min离心5min，弃去上清，加入5mL含有10％FBS的 DMEM培养基并轻轻悬起细胞，转移至细胞瓶中，37℃，5％CO2培养箱中培养。当细胞状态较好且处于生长对数期时，即可进行细胞融合。
2.2.2脾细胞的准备(1)经加强免疫的BALB/c小鼠3天后摘除眼球放血致死，浸泡于75％乙醇中5min消毒体表，放入解剖台板上固定四肢。(2)无菌手术开腹取出脾脏，除去被膜并用培养基冲洗。(3)将脾脏置于200目带柄不锈钢细胞筛网中，将筛网置于加有DMEM基础培养基的10cm培养皿中，用研磨棒轻轻挤压脾脏，并用少量培养基冲洗筛网。(4)用滴管将脾细胞移入离心管中，1000r/min，离心10min，用DMEM基础培养基重悬、计数，备用。
2.2.3细胞融合取对数生长期的SP2/0细胞与脾淋巴细胞按1：5-1：10的比例混合于 50mL离心管中，充分混匀，1000r/min离心10min，弃上清。用手掌轻击离心管底，将沉淀的细胞打散。将离心管底部放入37℃水浴中，在1min内边摇动边加入融合用的PEG 1mL，然后继续摇动并加入DMEM基础培养基15mL，在90s内加完，由慢到快，前5s加 1mL。室温静置10min后，1000r/min离心10min，弃上清，将HAT选择培养液加入到细胞中，悬浮细胞，分配到已加有饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，5d后用新鲜预热的HAT培养基半量换液，7d后用完全换为HT培养基。
2.2.4阳性杂交瘤细胞的亚克隆首先制备饲养细胞，分装到96孔细胞培养板中，每孔 100uL，用新鲜HT培养基将阳性孔中的杂交瘤细胞吹下，吸取混合液加入1.5mL离心管内，将细胞在1.5mL离心管内进行倍比稀释。约5min后，在显微镜下观察计数，吸取大约含有100个细胞的培养基，加入含有10mL HT的离心管中，轻轻吹匀离心管中的细胞悬液，加入96孔细胞培养板，0.1mL/孔，将其放入37℃，5％CO2培养箱培养，待上清变黄后或细胞长满孔底1/3开始检测，用ELISA方法进行检测，并再次亚克隆，直到每个克隆孔上清均为阳性时可以定株。
2.2.5单抗腹水的制备及效价的测定提前7-10天，将无菌的液体石蜡腹腔注射进8周龄以上的BALB/c小鼠腹腔，注射剂量为0.5mL/只。将阳性的单克隆抗体细胞株用无菌PBS悬浮，1000rpm离心5min，弃上清，再用无菌PBS重悬，每只鼠腹腔的注射剂量为 0.5-1.0×107个细胞，每日观察小鼠的精神状态及产腹水情况，大约7-10天能明显观察小鼠腹部皮肤紧绷，即可采腹水。将收集的腹水，5000rpm离心5min，将上清中的脂类杂质弃掉，再吸取上清，免疫染色检测腹水效价，收集腹水冻存于-80℃冰箱备用。
2.2.6单克隆抗体亚型的鉴定利用五株杂交瘤上清作为样品，参照小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书的步骤，进行亚型的分析。(1)从4℃取出小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，室温平衡30min。(按照要求将适量的20x PBST用超纯水稀释成1×PBST，100×羊抗鼠IgM+IgG-HRP用1×PBST稀释成1×羊抗鼠IgM+1gG-HRP)。(2)将杂交瘤上清用 1×PBST1：20稀释，加入板条中(一个样品需用一个板条)，50uL/孔。(3)无需孵育，将1×羊抗鼠IgM+IgG-HRP加入样品孔，50uL/孔，混匀器上轻轻混匀。(4)盖上封板膜，室温孵育1h。(5)弃去孔内液体，1×PBST洗板3次，吸水纸拍干。(6)将现配的显色液加入孔中(显色液配方A液：B液＝1：100，即1mL A液与1mL B液混匀，立即使用)。 (7)室温避光显色10-20min，加入终止液，100uL/孔。(8)结果依据说明书，通过肉眼观察或者通过酶标仪读取OD450mm，颜色最深或OD450nm值最高即为相应亚型。
2.2.7单克隆抗体腹水的纯化采用饱和硫酸铵沉淀法，具体方法如下所示：吸取2mL 腹水加入离心管中，向腹水中加入2mL的生理盐水，用玻璃棒轻轻的不断搅拌，向离心管中缓慢逐滴加入4℃预冷的饱和硫酸铵溶液(SAS)4mL，将离心管放在4℃冰箱中静置一夜；4℃，3000rpm离心30min，弃去上清，留下沉淀；向离心管中加入适量的生理盐水直至离心管中的沉淀物溶解，继续向离心管中逐滴缓慢的加入与生理盐水体积一半的 SAS溶液，将离心管放入4℃冰箱静置3h，再对以上步骤重复2次后离心，3000rpm离心30min，用pH7.4的PBS将沉淀物溶解，吸取50uL，用于SDS-PAGE分析，剩余溶液装入透析袋，在4℃冰箱中，20倍PBS透析，中间换液数次，透析完毕后，将透析袋中的溶液收集放入-20℃的冰箱中冻存备用，将获得的腹水混合并混匀，此为抗西马特罗单克隆抗体。
2.3单克隆抗体的质量检测
2.3.1西马特罗单克隆抗体效价测定尾部采血用间接ELISA检测效价。实验操作过程如下：包被：以CIM-OVA偶联物为免疫原分别加入至96孔ELISA反应板，每孔加入50ul 浓度稀释后至2ug/mL的蛋白液，4℃包被过夜。封闭：弃去包被液，以PBST连续洗板5 次后，最后一次间隔5min，于干净的吸水纸上轻拍至没有明显水珠，每个孔加入200ul 5％牛血清-PBST作为封闭液，37℃温度下封闭1h。加一抗：用洗涤液PBST洗板5次，拍干，以经封闭液稀释后的鼠源多抗血清为一抗(稀释范围1:1000～1:128000)，每孔加入50ul， 37℃环境下孵育30min。加二抗：用洗涤液PBST洗板5次，拍干，以HRP标记羊抗鼠1:5000 稀释倍数的作为二抗，每孔加入50ul，37℃环境下反应30min。中止及显色：洗涤液PBST 连续洗板5次，拍干后每孔加入50ul TMB显色液室温避光条件下反应10min，之后加入 25ul 2M的H2SO4终止液中止显色。读数：用全波长的酶标仪在λ＝450nm处测定光密度的吸光值。
2.3.2西马特罗单克隆抗体稳定性分析继续传代培养IgG杂交瘤细胞并每隔5代收集培养上清，利用间接ELISA测定其抗体效价，记录其OD450值。若吸光值没有明显降低说明该杂交瘤细胞株能稳定的分泌抗体。
2.3.3西马特罗单克隆抗体灵敏度测定西马特罗兔源多抗血清灵敏度测定采用的是间接竞争ELISA。将2.3.1中间接ELISA操作中的一抗换成最佳稀释度的血清及浓度分别为0、 0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、2.7ng/mL、8.1ng/mL、24.3ng/mL的西马特罗小分子标准品，其他操作与2.3.1中间接ELISA操作步骤相同。以标准品对抗原50％抑制浓度作为半数抑制浓度(IC50)，IC50值越低说明抑制作用越低，则灵敏度越高。灵敏度越低说明检测方法越可靠。
2.3.4西马特罗单克隆抗体特异性测定将2.3.1方法中的小分子标准品换成特布他林、莱克多巴胺、沙丁胺醇、齐帕特罗、溴布特罗、西布特罗、达氟沙星、盐酸多巴胺等小分子标准品不同浓度的溶液。然后通过icELISA绘制出多克隆抗体对各小分子标准品的标准抑制曲线，求出各个小分子的半数抑制浓度，判断多抗的特异性。
交叉反应率(CR)100％＝IC50(CIM)/IC50(竞争物)*100％
2.3.5西马特罗单克隆抗体最低检测限采取常规的定义方式，与零标准品的吸光值读数作为基数，吸光值抑制达到10％时候对应的竞争品浓度为最低检测限。在建立的标准曲线上对应B/B0＝10％的标准品浓度即为此方法的最低检测限，反应了该检测方法的灵敏度。当抑制约达到百分之百的时候对应的小分子浓度为完全抑制浓度。最低检测限到完全抑制浓度之间即为本研究建立的检测范围。若有检测样品，则检测样品最低检测限的定义为20份零标准品空白样品的吸光值的测定平均值加3倍标准差(xo+3SD)计算最低检测限。
2.3.6猪尿样品添加回收实验测定本研究用猪尿液进行了样品的添加回收实验，猪尿取自新乡县养殖场，猪尿仅进行离心去除杂质。参照间接竞争ELISA方法，向预处理之后的阴性猪尿样品添加0.01ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL的小分子标准品，同时设置阴性对照孔。按照上述ELISA最佳条件操作，重复试验三次，计算OD450平均值，带入标准曲线中计算样品的含量。
3结果分析
3.1西马特罗鼠源多抗效价测定
采用相同方式同时免疫6只小鼠，在每次免疫后第十天尾部小剂量采血并用PBS缓冲液(0.01M，ph＝7.4)1：100稀释，采用间接ELISA方式检测小鼠产生抗体的效价。通过450nm 波长的吸光值判断单克隆抗体的效价，从而评估人工抗原免疫原性的好坏。结果见图7，由数据可知，制备的完全抗原免疫效果良好，其中3号、5号、6号鼠在第三次免疫后效价最高，因而选择3号和6号进行加强免疫。。
3.2抗西马特罗阳性杂交瘤细胞的筛选
利用间接ELISA方法筛选出8株阳性杂交瘤细胞，经三次亚克隆之后，获得7株可以稳定分泌西马特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，按照细胞培养孔分别命名为3-B5、3-E3、6-H11、 6-D6、6-F2、6-C2、6-F8。
3.3西马特罗单克隆抗体稳定性
将6株阳性细胞株进行连续20次的传代培养，每隔5代检测一次细胞的抗体分泌情况。如图8所示，结果显示有一株杂交瘤细胞株分泌抗体的水平较稳定，为6-H11。
3.4西马特罗单克隆抗体腹水效价的鉴定
选取能稳定分泌西马特罗抗体的杂交瘤细胞株6-H11，进行单克隆抗体腹水的制备，用间接ELISA检测混合腹水的效价。如表2，西马特罗单克隆抗体腹水的效价达到1:64000。
表2间接ELISA测西马特罗单克隆抗体腹水效价
Figure BDA0002370096200000191
3.5单克隆抗体亚型的鉴定
参照Proteintech公司的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书的步骤，对单克隆抗体上清进行亚型的分析。表明单克隆上清的轻链亚型均为Kappa，重链均为1gG1。
3.6西马特罗单克隆抗体灵敏度测定
零竞争品的对照孔OD450值为1.102(如表3)。根据此检测方法建立的标准曲线如图 9。当对零标准品一半抑制时，对应的小分子竞争品浓度为0.3ng/mL,曲线的拟合度为0.9837，曲线拟合度良好，说明测量中数值误差较小，曲线的拟合效果良好。
表3 CIM间接抑制ELISA检测结果
Figure BDA0002370096200000201
3.7西马特罗单克隆抗体特异性测定
用于抗体交叉反应性研究的竞争物为其他β2激动剂与药物如盐酸克伦特罗(CL)、莱克多巴胺(RAC)、沙丁胺醇(SAL)、盐酸多巴胺(DH)、溴布特罗(BRO)、班布特罗(BAM)、齐帕特罗(ZIL)、特布他林(TBL)、达氟沙星(DAN)、泰乐菌素(TYL)。检测结果如表 4。表中结果显示该单克隆抗体与其他兴奋剂小分子或药物的交叉反应率均小于0.01％，说明获得的西马特罗单克隆抗体的特异性良好。
表4单克隆抗体与其他药物的交叉反应率检测结果
Figure BDA0002370096200000202
Figure BDA0002370096200000211
3.8最低检测限测定
选择抑制率为10％的竞争品浓度为该ELISA方法学的最低检测限，带入标准曲线可求得竞争品浓度为0.001ng/mL，即该方法建立的最低检测限为0.001ng/mL。
3.9回收率
由于猪尿中含有脂类、蛋白等多种杂质，其对ELISA检测过程存在严重影响，因此在检测猪尿中的西马特罗时必需经过离心处理。猪尿样品15000rpm，离心10min，去除沉淀和杂质颗粒，抽取上清用于检测。取三个间接竞争ELISA实验中小分子标准品的浓度，即为添加值。同一份样品做三次重复实验，将得到的吸光值取平均数带入标准曲线中计算小分子的含量，即为检测值。检测值与添加量的比值为回收率，三次实验回收率的平均值为平均回收率。同时利用软件计算变异系数。同时参照国标用液相色谱质谱联用测样品的小分子添加量，重复试验三次取平均值。结果：在0.01μg/L浓度的回收率范围为74％-122％(编号1)，在0.1μg/L浓度处的回收率范围为76％-125％(编号2)，在1μg/L浓度处的回收率范围为91％-108％(编号3)，批内变异系数<11％，批间变异系数<10％(如表5)。
表5样品添加回收实验检测结果
Figure BDA0002370096200000212
4.分析与讨论
本研究小分子半抗原为西马特罗，西马特罗作为β2型受体激动剂，被归类到治疗呼吸系统疾病的药品列表。可以治疗哮喘等呼吸疾病。但在畜牧业中被非法作为瘦肉精使用，可以提高禽畜的酮体含量，促进生长，减少脂肪含量，从而提高商业价值，谋取商业利润。检测兽药残留通常需要质谱方法，这种方法灵敏可靠，结果准确，但是其价格昂贵，所以亟需建立一种简便快速准确的药残监测系统，首要问题就是人工抗原的制备。西马特罗其分子量为219.28Da，因其分子量较小，所以在用传统的方法筛选单克隆抗体时首先要制备完全抗原。根据不同小分子半抗原的结构，采用不同的方法，在保证其反应原性的同时改变或利用某些基团，与载体蛋白的氨基活化羧基反应，形成半抗原-载体蛋白化合物，即为完全抗原，完全抗原因为偶联了大分子载体蛋白，所以既有免疫原性又具有反应原性。本文讲述了用重氮化法制备小分子西马特罗免疫原和包被原。重氮化法针对西马特罗的特殊结构(苯氨基) 在强酸介质下加入适量的亚硝酸盐，可以生成重氮盐，随后与载体蛋白的酪氨酸的酚羟基的邻位相连，生成偶氮键。通过紫外扫描，SDS-PAGE凝胶电泳初步评估偶联效果，这两种方法直接测量了原始蛋白质性质的变化，如紫外吸收、荧光和质量。如果半抗原是比蛋白质的芳香族残基更强的生色团，则半抗原的数量可以通过吸光度/荧光的变化来测量。由于这些分光光度技术没有考虑半抗原与蛋白质的非共价结合，吸光度/荧光测量可能高估半抗原的密度。凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)及高分辨质谱(ESI-MS)是评估半抗原密度的准确方法，因为它们测量结合前后质量的变化。与MALDI-TOF-MS及高分辨质谱 (ESI-MS)相比，凝胶电泳不能区分质量上的细微差别。通过直接方法来定量连接到复杂蛋白质上的半抗原的数量是一项具有挑战性的任务。将成功制备的完全抗原注射至BALB/C小鼠体内，使其产生免疫反应，建立西马特罗酶联免疫附的检测方法。
酶联免疫吸附试验具有敏感、准确、快速、简单等其它方法无法比拟的优点,结合多抗应用使其具有更大的优势。本试验竞争是将高度特异性抗体吸附于固体载体上，使游离的西马特罗与化学合成的克伦特罗偶联物顺次竞争抗体的结合位点，当吸附的抗体量和克伦特罗偶联物的量固定时，待测样品中游离的量愈多，结合于抗体上的偶联物愈少，从而使底物显色愈浅，使待检的量与值成反比关系。最近的研究中有职爱民等人利用这种方法，用成功制备的完全抗原免疫小鼠制备多抗血清，其制备的小鼠多抗血清抗CIM的IC5086.9ng/mL。本次动物免疫实验显示，研究制备的完全抗原具有很好的免疫原性，制备高效稳定的单克隆抗体，获得通过检测系列稀释的标准溶液，绘出标准曲线为y＝-0.104x+0.4565R2＝0.9943 ，通过建立的方法计算得出单抗的半数抑制浓度为0.3ng/mL，最低检测限为0.001ng/mL。用于定量测定。这种将单抗的高度特异性和方法的高度敏感性有机地结合起来，达到抗原快速检测，适宜于短时间内检测大量样品，为样品中西马特罗残留的检测奠定了基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗西马特罗单克隆抗体，其特征在于：所述抗体效价为1:64000，亚型为IgG1，对西马特罗的半数抑制浓度IC50为0.3ng/mL ，最低检测限为0.001ng/mL，与盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、盐酸多巴胺、溴布特罗、班布特罗、齐帕特罗、特布他林、达氟沙星、泰乐菌素无交叉反应。
2.一种制备如权利要求1所述的一种抗西马特罗单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
（1）制备西马特罗抗原工作液：
（a）西马特罗重氮化：浓盐酸溶液提前放置冰上预冷30分钟后，将4mg西马特罗标准品溶于0.1mol/L PH=2的浓盐酸溶液中混匀，向上述溶液匀速逐滴加入预冷的0.15mol/L的NaNO2溶液，在冰上避光操作，同时使用淀粉淀化钾试纸监控，直至试纸变成蓝紫色时停止加入，之后避光低温低速搅拌4~4.5 h，得到西马特罗反应液；
（b）调西马特罗反应液PH：用1 mol/L 的NaOH溶液调步骤（a）西马特罗反应液PH，至PH=7.4 时停止，用尿素用来中和过量的NaNO2 ，用淀粉淀化钾试纸检测，试纸由深蓝变为浅蓝，即停止，低温备用;
（c）制备西马特罗人工完全抗原：称取17mg BSA粉末溶于1mL PH=8.6的硼酸缓冲液得到蛋白溶液，将步骤（b）所得混合液逐滴加入到蛋白溶液中，放于4℃避光低速搅拌24小时后，将反应得到的亮黄色偶联产物在处理好的透析袋中放置PBS中，每间隔8小时换一次透析液，透析3天，得到西马特罗人工完全抗原，标记为CIM-BSA；
（d）制备西马特罗包被原：称取17mg OVA粉末溶于1mL PH=8.6的硼酸缓冲液得到蛋白溶液，将步骤 (b) 所得混合液逐滴加入到蛋白溶液中，放于4℃避光低速搅拌24小时后，将反应得到的亮黄色偶联产物在处理好的透析袋中放置OVA中，每间隔8小时换一次透析液，透析3天，得到西马特罗人工完全抗原，标记为CIM-OVA；
（2）制备西马特罗单克隆抗体：
（e）动物免疫：免疫原选用CIM-BSA，CIM-BSA与弗氏完全佐剂充分乳化后形成免疫剂，取4-6周龄雌性BALB/c小鼠6只，每只每次采用免疫剂量为50ug，间隔2周免疫1次，3次免疫后断尾取血测定效价和抑制率，选择血清效价高且具有CIM抑制作用强的小鼠进行细胞融合；
（f）饲养细胞、SP2/0细胞及脾细胞准备：融合前一天，选用健康状况良好的 5-6 周龄的BALB/c小鼠，小鼠脱颈处死，无菌条件下取小鼠腹腔细胞作为饲养细胞；融合前一周复苏SP2/0细胞；无菌手术开腹经加强免疫的 BALB/c小鼠，并取出脾脏，经研磨棒挤压、培养基冲洗、离心、重悬、计数，备用；
（g）细胞融合：取步骤（f）选定的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞和小鼠的脾细胞按1：5-1：10的比例进行融合，间接ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直到每个克隆孔上清均为阳性时定株；
（h）单克隆抗体腹水纯化：选取个体较大的雌性BALB/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20℃保存，获得西马特罗单克隆抗体。
3.如权利要求1或2所述的抗西马特罗单克隆抗体用于配制检测生物样品中的西马特罗的非诊断目的检测产品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述非诊断目的检测产品为ELISA试剂盒或胶体金层析试纸条。
5.一种检测西马特罗的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有如权利要求1或2所述的抗西马特罗的单克隆抗体。
6.一种检测西马特罗的胶体金层析试纸条，其特征在于：所述胶体金层析试纸条中含有如权利要求1或2所述的抗西马特罗的单克隆抗体。
7.如权利要求5所述的一种检测西马特罗的ELISA试剂盒，其特征在于，包括下述各组分：
（a）包被有所述西马特罗人工完全抗原的酶标板，包被液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液；
（b）含有所述西马特罗药物单克隆抗体的工作液；
（c）酶标记物工作液：辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗抗体；
（d）西马特罗标准品溶液：采用梯度稀释法配制0、0.1 ng/mL 、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL、2.7 ng/mL、8.1ng/mL、24.3ng/mL的西马特罗小分子标准品；
（e）底物显色液A 液为过氧化脲溶液，底物显色液B 液为四甲基联苯胺溶液；
（f）终止液为2mol/L 的硫酸溶液；
（g）洗涤液为磷酸吐温缓冲液；
（h）样本稀释液为含有5％脱脂奶粉的0.01mol/L pH 7.4 的磷酸缓冲液。
8.权利要求7所述的检测西马特罗的ELISA试剂盒的用于检测西马特罗药物残留中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（a）样品前处理：对猪尿样品15000rpm，离心 10min，去除沉淀和杂质颗粒，抽取上清用于检测；
（b）取样品添加值及利用本试剂盒计算检测值：取三个间接竞争ELISA实验中小分子标准品的浓度，即为样品添加值，同一份样品做三次重复实验，将得到的吸光值取平均数带入标准曲线中计算小分子的含量，即为检测值；
（c）计算样品添加回收率：检测值与样品添加量的比值为回收率，三次实验回收率的平均值为试剂盒平均回收率，样品回收率为108.6%。
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