CN109517802B

CN109517802B - 分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN109517802B
Application number: CN201811381001.XA
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 李求春; 尹克全; 朱悦; 徐黎娟; 王鑫; 李扬
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2038-11-20
Also published as: CN109517802A

Abstract

本发明提供了一种分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用。本发明的分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心。本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，基于此建立的鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体竞争ELISA检测方法具有较好的灵敏度和特异性，用作鸡机体免疫状态的评价及感染性疾病相关的研究。

Description

分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其在免疫检测领域的应用。

背景技术

鸡白痢沙门菌是一种重要的宿主特异性沙门菌，感染雏鸡可引起鸡白痢，对家禽养殖产业造成严重的经济损失。该病原菌的特点是在雏鸡中死亡率最高，而被感染的成年鸡虽不表现出明显的临床症状，但可表现出体重减轻、产蛋量下降、痢疾、生殖系统损伤和畸形等，且细菌可长期持续存在于康复的宿主体内。截止目前，尚无简单、快速、特异性强和低成本检测鸡白痢沙门菌的有效方法。

酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，简称ELISA)技术具有高度的敏感性和应用广泛性，已成为近年来最吸引人的免疫检测方法之一，在疫苗的研发、临床诊断以及基础研究等方面得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。

本发明一方面提供了一种分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于2018.6.13保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:C2018145，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类命名为：杂交瘤细胞株SP-4G6。

本发明第二方面提供了一种鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体，由前述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

一种鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体，包括抗体重链和抗体轻链；抗体重链中，HCDR1氨基酸序列为：GYYIH(SEQ ID NO.5)，HCDR2氨基酸序列为：WIVPENGDTEYAPKFQG(SEQID NO.6)，HCDR3氨基酸序列为：YGRGYAL(SEQ ID NO.7)；抗体轻链中，LCDR1氨基酸序列为：RSSQSIVHSNGNTYLQ(SEQ ID NO.8)，LCDR2氨基酸序列为：KVSNRFS(SEQ ID NO.9)，LCDR3氨基酸序列为：FQGSHVPRT(SEQ ID NO.10)。

本发明第三方面提供了前述分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株及前述鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体在制备鸡机体免疫状态的检测试剂中的应用。

本发明第四方面提供了一种鸡白痢沙门菌IpaJ的竞争ELISA检测试剂，所述试剂包括：

1、酶标板、酶标抗体、包被抗原和鸡血清；所述竞争抗体杂交瘤细胞株

SP-4G6或其传代细胞株分泌产生。

2、生物素标记鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体

所述检测方法中，酶标板可以预先包被有检测抗原，也可以提供空白酶标板与检测抗原，在检测前由操作者自行采用常规方法在酶标板上包被检测抗原。

所述酶标板可为各种常见规格的酶标板，如96孔酶标板。

所述生物素标记鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体中的鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体可以不同于前述竞争抗体。生物素标记鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的制备方法采用常规技术。

进一步优选的，所述生物素标记鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体中的鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体由杂交瘤细胞株SP-4G6或其传代细胞株分泌产生。

进一步的，所述试剂还包括下列试剂中的一种或多种：

1)亲和素-辣根过氧化物酶结合物；

2)显色底物液；

3)洗涤液。

上述试剂均为ELISA检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地选用。

所述底物液可为ELISA检测试剂盒中常用的通用底物液，如3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物液。

所述洗涤液可为ELISA检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。

所述封闭液可为包被酶标板常用的封闭液，如FBS、BSA等。

通常情况下，本发明的试剂中，各试剂分别隔离储存。

本发明进一步基于上述鸡白痢沙门菌IpaJ ELISA检测方法，建立了具有较好特异性和灵敏度的鸡白痢沙门菌IpaJ的ELISA检测方法，用于检测感染鸡体内鸡白痢沙门菌的IpaJ含量，从而进行机体免疫状态评价。

利用本发明的检测方法检测鸡血清中IpaJ抗体的检测方法包括以下步骤：

1)检测抗原包被酶标板；

①PBST洗涤酶标板3次，3-5min/次；

②2％BSA 200μL/孔，37℃孵育2h；

③PBST洗涤酶标板3次，3-5min/次；

2)样品孵育及检测

①在上述检测抗原包被的酶标板中加入HRP酶标抗体和鸡血清，各100μL/孔，37℃孵育2h；

②弃去样品反应液，PBST洗涤7次，每次30s-1min，

③加入显色底物TMB，100μL/孔，37℃孵育10min。

④加入终止液2M H₂SO₄，50μL/孔，使用酶标仪于OD₄₅₀波长下测定吸光值。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力较强的优势，基于此建立的鸡白痢沙门菌IpaJ单抗竞争ELISA检测方法，在检测鸡白痢沙门菌接种的鸡血清时，阳性样品的OD值显著低于对照样品，表明该检测方法可以有效检测到天然鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体，具有较好的灵敏度和特异性。此外，基于此建立鸡白痢沙门菌IpaJ单抗检测方法，在检测鸡血清时，鸡白痢沙门菌阳性样品孔OD值显著低于其他血清沙门菌，表明该检测方法具有较好的灵敏度和特异性。本发明的检测方法操作简便，极大缩短了检测时间，可以应用于免疫学研究，用作鸡机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究。Western blot分析单克隆抗体分析表明单克隆抗体与天然抗原具有良好特异性和性反应，而与其他血清型沙门菌和大肠杆菌无交叉反应。

附图说明

图1单克隆抗体的Western Blot分析图；

图2方阵实验确定抗原及SP-4G6抗体最佳工作浓度；

图3血清最佳工作浓度的确定(SP-4G6)；

图4ROC曲线(SP-4G6)；

菌种保藏信息：泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株SP-4G6，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:C2018145，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，分类命名为：杂交瘤细胞株SP-4G6，保藏日期2018.6.13。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1:杂交瘤细胞株SP-4G6的获得

保藏号为CCTCC NO：C2018145。

1.动物免疫

具体免疫程序如下：首次免疫，腹腔注射割胶纯化蛋白，且以适量胶沫作为佐剂与100μg重组rHis-SP-IpaJ蛋白混匀免疫小鼠，2周后腹腔注射割胶纯化蛋白，且以适量胶沫作为佐剂与100μg蛋白混匀进行二次免疫，间隔2周后腹腔注射100μg不加佐剂的纯化蛋白进行第三次免疫，第二次免疫7天后眼眶采血测定血清抗体效价，选取效价较高的小鼠进行细胞融合。

2.细胞融合

具体步骤如下：尾静脉加强免疫3d后，采集少量血液，分离血清-20℃冻存，作为筛选时的阳性对照。按生物安全方法处死免疫鼠，75％酒精浸泡消毒5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG(MW1450)作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、5％CO₂培养箱中培养。5d后加入新鲜HAT培养基，10d后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。

3.间接ELISA检测方法的建立

采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。方阵试验确定检测抗原rMBP-SP-IpaJ的包被浓度。

检测抗原用包被缓冲液横向梯度稀释，每孔50μL包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔50μL，正常小鼠血清同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μL，37℃孵育1h；PBST洗涤后，TMB显色，酶联检测仪测定OD₄₅₀的值，判定检测抗原的最佳包被浓度。

根据方阵试验确定的检测抗原的包被浓度，将稀释后的检测抗原50μL/孔加入酶标板中，4℃过夜，PBST洗液洗涤3次，5min/次，用含有2％牛血清白蛋白的PBS缓冲液4℃封闭过夜，洗涤，-20℃保存，用于筛选阳性细胞克隆。

4.筛选阳性克隆

采用建立好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌抗体的情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞培养上清加入预先包被好的ELISA板中，100μL/孔，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫鼠多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，100μL/孔，37℃水浴1h；洗涤后，TMB显色10min，显色终止后酶标仪测定OD₄₅₀读数。被测孔OD₄₅₀读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。将筛选到的8株阳性克隆分别命名为SP-1C3、SP-1F3、SP-2D9、SP-3B5、SP-3D8、SP-4D5、SP-4G6和SP-5D1。

5.阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆SP-1C3、SP-1F3、SP-2D9、SP-3B5、SP-3D8、SP-4D5、SP-4G6和SP-5D1进行2～3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆SP-1C3、SP-1F3、SP-2D9、SP-3B5、SP-3D8、SP-4D5、SP-4G6和SP-5D1等杂交瘤细胞株由本实验室保藏。

实施例2:鸡白痢沙门菌IpaJ单抗的制备

1.腹水制备

采用体内诱生腹水法，按常规方法进行。10～12周龄健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3～0.5mL/只，7～10d后，分别腹腔接种经PBS稀释的培养至对数生长期的杂交瘤细胞SP-1C3、SP-1F3、SP-2D9、SP-3B5、SP-3D8、SP-4D5、SP-4G6和SP-5D1，5×10⁵个细胞/只；10d后收集腹水，离心去除沉淀，收集上清，间接ELISA法测定抗体效价，分装，-70℃保存。杂交瘤细胞株SP-1C3、SP-1F3、SP-2D9、SP-3B5、SP-3D8、SP-4D5、SP-4G6和SP-5D1。

2.抗体纯化标记

将制备的SP-3D8、SP-4G6和SP-5D1腹水使用Protein G亲和层析方法进行纯化。

将纯化SP-3D8、SP-4G6和SP-5D1单抗进行辣根过氧化物酶标记。

实施例3:单克隆抗体特性检测

3.单抗亚类的鉴定

按Sigma公司的单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的简介ELISA法。在已包被的酶标板内分别加入细胞培养上清100μL/孔，37℃1h，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入1:1000稀释的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM亚类抗体50μL/孔，37℃0.5h，每株单抗加每种亚类两孔，PBST洗涤3次每次5min；加入1:5000稀释的兔抗羊酶标二抗50μL/孔，37℃15min，PBST洗涤3次；加显色液四甲基联苯胺(TMB)溶液50μL/孔，37℃避光显色10min，2M H₂SO₄ 50μL/孔终止反应，以肉眼观察颜色明显高于其它孔者所加亚类抗体为单抗亚类。

结果显示，单抗SP-1C3、SP-2D9、SP-4G6和SP-5D1亚类均为IgG1；SP-3B5、SP-4D5亚类均为IgM；SP-1F3、SP-3D8亚类均为IgG2b。

4.单抗腹水效价的测定

使用包被缓冲液将检测抗原稀释至一定浓度，每孔100μL包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；将单抗腹水倍比稀释，每孔100μL，同样倍数稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔100μL，37℃孵育1h；PBST洗涤后，TMB显色，酶联检测仪测定OD₄₅₀的值，以P/N值≥2.1为判定标准，测定单抗腹水效价。

结果显示，单抗SP-1C3的效价达到1：2000；单抗SP-1F3的效价达到1：256000；单抗2D9的效价达到1：1000；单抗SP-3B5的效价达到1：4000；单抗SP-3D8和SP-4D5的效价达到1：128000；单抗SP-4G6的效价达到1：2048000；单抗SP-5D1的效价达到1：4096000。

5.单抗特异性的鉴定

应用间接ELISA方法对单克隆抗体的特异性进行鉴定。将相同浓度的rHis-SP-IpaJ(Salmonella Pullorum)、rMBP-SP-IpaJ(Salmonella Pullorum)、rHis、rMBP、rHis-nmpC、rMBP-nmpC和rMBP-SF-IpaJ(Shigella flexneri)进行4℃冰箱过夜包被；次日，PBST洗涤3次，3-5min/次，尽量拍干残留液体，加入1％BSA，100μL/孔，37℃封闭2h；PBST洗涤3次，3-5min/次，尽量拍净残留液体，加入杂交瘤细胞培养上清和小鼠腹水，以SP2/0作为阴性对照，PBS作为空白对照，100μL/孔，37℃孵育2h；PBST洗涤5次，30s-1min/次，尽量拍干残留液体，加入PBS稀释至工作浓度的羊抗鼠酶标二抗，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤7次，30s-1min/次，尽量拍干残留的洗涤液，加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光孵育10min，加入2M H₂SO₄终止液，50μL/孔，酶标仪读取OD₄₅₀处吸光度值。

以Western Blot鉴定单抗的特异性，具体步骤如下：将纯化后的蛋白rHis-SP-IpaJ、rMBP-SP-IpaJ、重组菌BL21(DE3)-pCold I及ER2523-pMAL-c5X和rMBP-SF-IpaJ分别加入适量的5×Loading Buffer沸水浴10min，120V进行SDS-PAGE电泳。

同样采用Western Blot方法对单克隆抗体特异性进行鉴定，分别取SalmonellaPullorum、Salmonella Gallinarum、Salmonella Enteritidis、Salmonella Dublin、Salmonella Typhimurium、Salmonella Derby、Salmonella Indiana、Escherichia coli和Shigella flexneri进行特异性鉴定。

使用Pyxis^TM Gel Processor快速转印仪及其附属配备使用的Pyxis^TM ProteinTransfer Stack试剂盒，快速转印11min，用5％BSA室温封闭摇床1h；TBST洗涤3次，5min/次，加入TBST溶解的2％BSA溶液稀释杂交瘤细胞培养上清和小鼠腹水至工作浓度，室温摇床孵育2h；TBST洗涤4次，5min/次，加入TBST溶解的2％BSA溶液稀释HRP-羊抗鼠IgG至工作浓度，室温摇床孵育1h；TBST洗涤5次，5min/次，避光显色2-3min，终止显色反应，使用GEAmersham Image 600超灵敏多功能成像仪进行扫描拍照。结果表明IpaJ单克隆抗体具有良好的反应性和特异性(图1)。

实施例4:单抗竞争ELISA方法的建立

1.方阵实验确定抗原包被浓度和HRP酶标抗体SP-4G6的工作浓度

根据竞争ELISA方阵实验确定抗原蛋白rMBP-SP-IpaJ的最佳包被浓度和HRP酶标抗体最佳工作浓度，结果如图2所示，方阵实验结果确定抗原蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL，HRP酶标抗体最佳工作浓度为1:16000。

2.血清最佳工作浓度的确定

依据竞争ELISA血清工作浓度梯度实验选择血清最佳工作浓度。结果如图3所示，随着血清浓度降低其对酶标抗体的抑制率也呈现逐渐下降的趋势；当血清按1:2稀释时，其对酶标抗体抑制率最高，因此确定血清最佳工作浓度为1:2。3.绘制ROC曲线及确定Cut-off值

用SPSS Statistics 17.0处理分析实验数据，绘制ROC(受试者工作曲线)曲线。结果如图4所示，对角线为参考线，ROC曲线与对角线面积为0.914，对ROC曲线下面积进行检验，p＝0.041<0.05有统计学意义表明竞争ELISA对鸡白痢沙门菌诊断有意义。由表1可知灵敏度为0.906，特异性为0.762，Cut-off值为40.5，以Cut-off值判断阴阳性，血清抑制率大于Cut-off值为阳性，小于Cut-off值为阴性。

表1曲线坐标

实施例5:鸡血清样品的检测

竞争ELISA检测鸡血清中的IpaJ抗体

采用单抗竞争ELISA方法诊断某鸡场临床血清样品，共检测200份血清样品，检测结果表明阳性率为2％。将单抗竞争ELISA检测为阳性的4份临床血清样品进行染色抗原玻板凝集试验(PAT)，检测结果表明4份临床血清样品均为阳性。

SP-4G6抗体序列为：

重链:DNA序列(405bp)

前导序列-FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4(其中加粗序列为CDR区，以下同)

重链:氨基酸序列(135aa)

前导序列-FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4

轻链:DNA序列(393bp)

前导序列FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4

轻链:氨基酸序列(131aa)

Leader sequence-FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4

表2V(D)J功能的IMGT分析

将SP-4G6的抗体序列和DNA序列与NCBI数据库中同源性最高的序列比对，SP-4G6的抗体序列和DNA序列均与数据库中的同源性序列不同，不同的序列位于轻链和重链的CDR区，SP-4G6的抗体序列的V(D)J功能的IMGT分析如表2所示。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 分泌鸡白痢沙门菌 IpaJ 单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用

<130> xhx2018112002

<141> 2018-11-20

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 405

<212> DNA

<213> salmonella spp

<400> 1

atgaaatgca gctgggtcat cttcttcctg atggcagtgg ttataggaat caattcagag 60

gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaggtcag gggcctcagt caagttgtcc 120

tgcacagctt ctggcttcaa cattaaaggc tactatatac actgggtgaa gcagaggcct 180

gaacagggcc tggagtggat tggatggatt gttcctgaga atggtgatac tgaatatgcc 240

ccgaagttcc agggcaaggc cactatgact gcagacacct cctccaatac agcctacctg 300

cacctcacca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtaatgc ctacggtcgt 360

ggctacgctc tttggggcca ggggactctg gtcactgtct ctgca 405

<210> 2

<211> 135

<212> PRT

<213> salmonella spp

<400> 2

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Ile Gly

1 5 10 15

Ile Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Lys Gly Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Val Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala

65 70 75 80

Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu His Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Asn Ala Tyr Gly Arg Gly Tyr Ala Leu Trp Gly Gln Gly

115 120 125

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 3

<211> 393

<212> DNA

<213> salmonella spp

<400> 3

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60

gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120

tcttgcagat ctagtcagag tattgtacat agtaatggaa acacctattt acaatggtac 180

ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240

ggggtcccag acaggtttag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300

agagtggagg ctgaagatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttcctcgg 360

acgttcggtg gaggcactaa gctggaaatc aaa 393

<210> 4

<211> 131

<212> PRT

<213> salmonella spp

<400> 4

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile

35 40 45

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys

130

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> salmonella spp

<400> 5

Gly Tyr Tyr Ile His

1 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> salmonella spp

<400> 6

Trp Ile Val Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> salmonella spp

<400> 7

Tyr Gly Arg Gly Tyr Ala Leu

1 5

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> salmonella spp

<400> 8

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> salmonella spp

<400> 9

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> salmonella spp

<400> 10

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Arg Thr

1 5

Claims

1.一种鸡白痢沙门菌IpaJ的竞争ELISA检测试剂，其特征在于，包括：

酶标板以及鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体；

生物素标记鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体；

亲和素-辣根过氧化物酶结合物；

底物液TMB；

洗涤液；

所述鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体是由分泌鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体的杂交瘤细胞株分泌的；

所述杂交瘤细胞株保藏编号为CCTCC NO:C2018145；所述鸡白痢沙门菌IpaJ单克隆抗体包括抗体重链和抗体轻链；抗体重链中，HCDR1氨基酸序列为：GYYIH，HCDR2氨基酸序列为：WIVPENGDTEYAPKFQG，HCDR3氨基酸序列为：YGRGYAL；抗体轻链中，LCDR1氨基酸序列为：RSSQSIVHSNGNTYLQ，LCDR2氨基酸序列为：KVSNRFS，LCDR3氨基酸序列为：FQGSHVPRT。