CN109320610B - 抗人cd83单克隆抗体及其制备、鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗人CD83单克隆抗体，其特异性针对人CD83胞外段第20至145位的氨基酸序列。本发明还公开了生产该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明还公开了该单克隆抗体的制备方法及鉴定方法。本发明还公开了该单克隆抗体的应用及其检测试剂盒的开发，本发明的抗人CD83单克隆抗体可以用于免疫印迹、免疫沉淀、免疫组化、ELISA和流式细胞术等免疫学实验，对包括人血清、人组织细胞、人组织标本、人体分泌物和人细胞培养物中CD83或sCD83的定量和定性检测，也可用于表达CD83的人组织细胞的激活或抑制及用于拮抗和阻断CD83的作用。

Description

抗人CD83单克隆抗体及其制备、鉴定和应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及抗人CD83单克隆抗体，具体地说，针对人CD83胞外段的第20至145位氨基酸序列有反应性的单克隆抗体。本发明还涉及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明还涉及该单克隆抗体的制备方法及鉴定方法。本发明还涉及该单克隆抗体的应用及其试剂盒。

背景技术

CD83是一种分子量为45kDa的表面糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。CD83存在两种分子形式，膜结合的(membrane CD83，mCD83)和可溶性的(soluble CD83，sCD83)，两者具有不同的生物学功能。sCD83仅包含mCD83的胞外区段，具有免疫抑制功能。大量体外实验证实从细胞表面脱落或体外重组的sCD83对DC介导的T细胞增殖具有明显的免疫抑制作用，动物体内实验也发现重组sCD83蛋白对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)以及同种异型皮肤移植急性排斥反应具有很好的预防或治疗作用。这些结果提示，重组sCD83很可能在器官移植手术中发挥重要的抗免疫排斥的作用。此外，在血液系统恶性肿瘤和风湿性关节炎患者中，发现了高水平的sCD83。然而，sCD83释放背后的机制仍然未被阐明。

为了更加详尽的研究mCD83和sCD83的功能，开发出准确快速检测血液或组织局部mCD83和sCD83的蛋白表达的工具以及进一步开发以CD83为靶点的生物治疗具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供抗人CD83单克隆抗体，具体地说，针对人CD83胞外段的第20至145位氨基酸序列有反应性的单克隆抗体。

本发明的再一个目的是提供产生上述抗人CD83单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的又一个目的是提供上述抗人CD83单克隆抗体的制备方法及鉴定方法。

本发明的又一个目的是提供上述抗人CD83单克隆抗体在免疫印迹、免疫沉淀、免疫组化、ELISA或流式细胞术的试验中检测CD83的应用。

为此，本发明利用毕赤酵母表达CD83胞外段重组蛋白免疫8-10周龄的BALB/c雌性小鼠后，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合，通过有限稀释法和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水，用MabSelect亲和层析纯化抗体。并且对抗人CD83单克隆抗体进行效价测定、亲和常数的测定、Ig亚类的测定和特异性的鉴定。抗人CD83单克隆抗体的制备，为CD83分子的检测以及CD83功能的研究提供了基础，抗人CD83单克隆抗体可以广泛用于分子免疫学的研究中。

本发明为了解决上述技术问题，提供以下各项：

本发明提供了抗人CD83单克隆抗体，其针对人CD83胞外段的第20至145位氨基酸序列有反应性。

具体地，抗人CD83单克隆抗体为IgG1,κ亚类。

具体地，抗人CD83单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO：C2014186的杂交瘤细胞株1H10分泌产生的单克隆抗体CD83-1H10。

具体地，抗人CD83单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO：C2014187的杂交瘤细胞株11A7分泌产生的单克隆抗体CD83-11A7。

具体地，抗人CD83单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO：C2014188的杂交瘤细胞株14E4分泌产生的单克隆抗体CD83-14E4。

本发明还提供了小鼠杂交瘤细胞株1H10，保藏号为CCTCC NO：C2014186。

本发明又提供了小鼠杂交瘤细胞株11A7，保藏号为CCTCC NO：C2014187。

本发明又提供了小鼠杂交瘤细胞株14E4，保藏号为CCTCC NO：C2014188。

本发明又提供了上述抗人CD83单克隆抗体在检测CD83中的应用，其中所述检测是通过免疫印迹、免疫沉淀、免疫组化、ELISA或流式细胞术来进行的。

本发明又提供了用于检测CD83的试剂盒，其包含以上所述的抗人CD83单克隆抗体。

具体地，上述试剂盒用于检测免疫细胞上的CD83或血液样品中的sCD83。

本发明又提供了一种检测细胞上的CD83的方法，该方法包括：(1)将以上所述的抗人CD83单克隆抗体与待检测的分离的细胞或该细胞的裂解液进行接触；和(2)判断是否有阳性反应。

具体地，上述阳性反应是通过免疫印迹、免疫沉淀、ELISA或流式细胞术检测进行判断的。

本发明又提供了一种检测液体样品中的sCD83的方法，该方法包括：(1)将以上所述的抗人CD83单克隆抗体与待检测血液样品进行接触；和(2)判断是否有阳性反应。

具体地，上述阳性反应是通过免疫印迹、免疫沉淀、ELISA或流式细胞术检测进行判断的。

对发明内容进行详述：

本发明的一个方面涉及对人CD83有特异性的单克隆抗体，所述抗人CD83单克隆抗体针对CD83(Genbank登记号CAG33300.1)第20位至145位氨基酸中的序列有反应性；优选地，所述抗人CD83单克隆抗体为CD83-1H10、CD83-11A7和CD83-14E4。

本发明的另外一个方面涉及稳定分泌抗人CD83单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株1H10、11A7和14E4，保藏号依次为CCTCC NO：C2014186、CCTCC NO：C2014187和CCTCC NO：C2014188。

本发明的另一个方面涉及所述抗人CD83单克隆抗体的制备方法，利用毕赤酵母表达的重组CD83蛋白免疫8-10周龄的BALB/c雌性小鼠后，取小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤SP2/0细胞在聚乙二醇作用下进行体外融合，通过有限稀释法和间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株。常规制备腹水，用MabSelect亲和层析纯化抗体。

本发明的另一个方面涉及所述抗人CD83单克隆抗体的鉴定方法，包括：效价的测定、亲和常数的测定、抗体亚类的测定和特异性的鉴定。

本发明的另一方面涉及抗人CD83单克隆抗体在免疫印迹检测CD83试验中应用。用本发明的抗人CD83单克隆抗体用于免疫印迹试验检测CD83，结果显示，抗人CD83单克隆抗体能用于免疫印迹试验中检测重组CD83蛋白和细胞内源表达CD83蛋白。

本发明的另一方面涉及抗人CD83单克隆抗体在ELISA检测CD83试验中的应用。用本发明的抗人CD83单克隆抗体检测不同浓度的CD83，结果显示，抗人CD83单克隆抗体能用于ELISA检测CD83，并可用于检测肿瘤患者血液样品的中sCD83。

本发明的另一方面涉及抗人CD83单克隆抗体在流式细胞术检测CD83试验中的应用。用本发明的抗人CD83单克隆抗体可以和CD83阳性细胞结合，而不和CD83阴性细胞结合。表明抗人CD83单克隆抗体能用于流式细胞术检测细胞表面CD83。

本发明中，术语“单克隆抗体的特异性”是指单克隆抗体识别抗原上的特定表位或者抗原决定簇并与之结合的性质。

术语“单克隆抗体的反应性”是指在合适的反应条件下，单克隆抗体与抗原结合的能力。

术语“细胞株”是指通过筛选或者有限稀释方法，从原代培养物或者细胞系获得的单细胞培养物。

本发明提供了抗人CD83单克隆抗体及其制备、鉴定、应用。该单克隆抗体具有效价高、特异性高等特点，应用也较为广泛。克隆号为1H10、11A7和14E4的单克隆抗体针对的表位是CD83的空间构象，可以很好用于流式细胞术和ELISA的检测。特别是克隆号为11A7的单克隆抗体可以识别sCD83，但不能识别mCD83，因此可以用于流式检测时区分两种不同类型的CD83。

与已有的单克隆抗体不同，本发明制备的抗人CD83单克隆抗体所用的免疫原是毕赤酵母表达的CD83重组蛋白，其针对的是包含完整功能区域的CD83胞外段即CD83第20位至第145位氨基酸序列，通过ELISA筛选对CD83重组蛋白高反应性的杂交瘤细胞株。

本发明的抗人CD83单克隆抗体与已有的抗体针对的CD83区域或位点不同，其效价、特异性和应用随之发生变化。

本发明所得的抗人CD83单克隆抗体具有效价高、特异性高和适用范围广等优点，本发明提供的抗人CD83单克隆抗体可以广用于免疫印迹、免疫沉淀、ELISA、流式细胞术等不同手段检测CD83蛋白，为研究CD83的功能提供了基础。

附图说明

图1为本发明提出的抗人CD83单克隆抗体纯化过程中典型的层析峰型图。

图2为本发明提出的抗人CD83单克隆抗体纯度鉴定结果。

图3-A和图3-B为本发明提出的抗人CD83单克隆抗体特异性鉴定结果。

图4为本发明提出的抗人CD83单克隆抗体检测发酵液中的sCD83。

图5-A和图5-B为本发明提出的抗人CD83单克隆抗体检测IM9细胞膜表面CD83。

图6-A和图6-B为本发明提出的抗人CD83单克隆抗体和多克隆抗体组装ELISA试剂盒优化实验。

图7为本发明提出的两个抗人CD83单克隆抗体组装ELISA试剂盒抗体组合优化。

图8-A和图8-B为高灵敏度ELISA试剂盒抗体浓度优化。

图9-A和图9-B为低灵敏度ELISA试剂盒抗体浓度优化。

图10-A和图10-B为CD83 ELISA试剂盒检测肿瘤患者血清中sCD83含量。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1sCD83重组蛋白的制备

本发明实施例中关于sCD83重组蛋白的制备，具体请参见中国发明专利《可溶性CD83的表达和制备方法》，申请号为201310187915.3，公开日为2013年8月14日，公开号为103243119A；或参考研究论文：Yugang Guo et al.，The expression andcharacterization of functionally active soluble CD83 by Pichia pastoris usinghigh-density fermentation，PLOS ONE 9(2):e89264，2014.

实施例2抗人CD83单克隆抗体的制备

抗人CD83单克隆抗体杂交瘤的具体实施委托北京爱博生生物技术有限公司(中国北京，邮编100085)完成。实施过程一般性描述可参见中国发明专利《抗人NKp30单克隆抗体的制备、鉴定及应用》，申请号为201010531489.7，公开日为2011年3月16日，公开号为101985476A。

简述如下：

1、细胞融合前准备

将纯化的sCD83重组蛋白与等体积完全弗氏佐剂混合，免疫8-10周龄的BALB/c雌鼠。以后每间隔2周加强免疫一次，共免疫5次后，ELISA检测小鼠的血清效价达到1：10⁵时，对小鼠进行冲击免疫一次，3天后将上述冲击免疫后小鼠眼眶采血后脱臼处死，75％酒精消毒，取脾脏，去除结缔组织，收集脾细胞悬液，制备成脾单个细胞悬液备用。在细胞融合前一天，制备小鼠腹腔巨噬细胞，作为饲养细胞，放入细胞培养箱，37℃、5％C02条件下培养。复苏SP2/0骨髓瘤细胞(ATCC编号CRL-1581)，保证融合时细胞处于对数生长期。在细胞融合前，SP2/0细胞用30-40ml不完全RPMI-1640培养基洗涤2次。细胞用不完全RPMI-1640培养基重悬备用。

2、细胞融合及杂交瘤细胞的制备

将上述脾细胞悬液和SP2/0细胞，使用50％PEG4000(pH＝8.0-8.2)诱导融合。融合细胞在HAT培养液培养1周，吸取上清液，间接ELISA法检测抗体。筛选阳性杂交瘤细胞株，采用有限稀释方法进行亚克隆化。多次筛选后得到杂交瘤细胞株1H10、11A7和14E4，连续体外培养2个月以上或者液氮冻存6个月之后，该细胞株仍能稳定和大量分泌抗人CD83的抗体，该单抗被命名为CD83-1H10、CD83-11A7和CD83-14E4。

杂交瘤细胞株1H10、11A7和14E4已经于2014年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏号分别为CCTCC NO：C2014186、CCTCC NO：C2014187和CCTCC NO：C2014188。

3、抗人CD83单克隆抗体的大量制备

制备抗人CD83单克隆抗体可采用两种方法，增量培养法和小鼠腹腔接种法。增量培养法是将克隆化的细胞在体外低血清浓度培养基进行大量培养，细胞培养2-3天，收集上清液而获得大量的单一的克隆化抗体。小鼠腹腔接种法是选用8-10周龄的BALB/c雌鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，不完全弗氏佐剂预处理一周后，每只小鼠腹腔注射2×10⁶个细胞(500μl PBS重悬)，7-10天左右产生腹水，收集小鼠腹水，4℃、12000g离心10min，收上清液保存或者进行下一步纯化。通过上述方法获得的抗体，可以用硫酸铵沉淀、MabSelect亲和层析和分子筛方法纯化(如图1所示)，抗体的纯度用SDS-PAGE鉴定。如图2所示，经过纯化的抗人CD83单克隆抗体CD83-1H10、CD83-11A7和CD83-14E4的纯度达到95％以上，抗人CD83单克隆抗体(Ig(H+L))的分子量约160kDa，其中重链Ig(H)约55kDa，轻链Ig(L)约25kDa。

上述PBS，全称Phosphate Buffered Saline。在医学词汇中表示磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养，pH＝7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。

重悬是指“重新悬浮”，即适当的缓冲液或培养液将离心或沉降等方法得到的固体(沉淀、细胞、活性物质等)重新悬浮。

实施例3抗人CD83单克隆抗体的鉴定

1、间接ELISA测定抗人CD83单克隆抗体的亲和常数。

包被液稀释重组sCD83蛋白至2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml和0.25μg/ml，100μl/孔，分别包被96孔ELISA板，4℃过夜。将S3、S5、S7(相对应的单克隆抗体见表1)由2倍梯度稀释为16个浓度(2000ng/ml-0ng/ml)，与铺板的sCD83反应。用HRP标记的羊抗鼠IgG Fc作为二抗后显色。用间接ELISA法测定二者的绝对亲和常数。

以OD 450nm对抗体的浓度作图，采用J.David Beatty(1987)等提出的计算亲合常数的公式计算二者的绝对亲和常数(Kaff)：

Kaff(M^-1)＝1/2(2[单抗’]t－[单抗]t)

[单抗]t表示以一定量的sCD83(抗原)铺板，当OD 450nm达到半数吸收值时，单抗的总浓度；

[单抗’]t表示以(抗原)/2的量的抗原铺板，当OD 450nm达到半数吸收值时，抗体的的总浓度。

每两个相邻的sCD83浓度之间可计算出一个Kaff，四个浓度共可以计算得到3个Kaff值，求平均值，将平均值求倒数即为sCD83与单抗的绝对亲和常数KD。

2、抗人CD83单克隆抗体的亚类测定

采用Sigma-Aldrich提供的小鼠单克隆类型鉴定快速检测试剂盒IsoQuickTM KitforMouse Monoclonal Isotyping IS0Q5中的亚类检测试纸进行测定。对三种抗人CD83单克隆抗体进行编号，即抗人CD83单克隆抗体CD83-1H10编号为S3，抗人CD83单克隆抗体CD83-11A7编号为S5，抗人CD83单克隆抗体CD83-14E4编号为S7。上述S3、S5、S7的单克隆抗体亚类和亲和力常数如表1所示。

表1抗人CD83单克隆抗体亚类鉴定及亲和力常数

3、抗人CD83单克隆抗体的特异性鉴定

鉴定抗人CD83单克隆抗体的特异性采用两种方法：免疫印迹法和ELISA法。

免疫印迹的实验流程：分别取20μl酵母培养液(阴性对照1，未转化酵母GS115在相同培养条件下的培养上清液)、1μg的重组IL-33-His(阴性对照2，(详细制备方法参见Lingel，A，et al.，Structure ofIL-33and its interaction with the ST2 and IL-1RAcP receptors--insight into heterotrimeric IL-1signalingcomplexes.Structure 17:1398-1410，2009))和重组15kDa GNLY-His蛋白(阴性对照3，详细制备方法可参见中国发明专利《颗粒溶解素的表达和制备方法》，申请号为201210250501.6，公开日为2012年10月31日，公开号为102757977A；或参见研究论文YugangGuo，et al.，Production and characterization of recombinant 9and 15kDagranulysin by fed-batch fermentation in Pichia pastoris.Appl MicrobiolBiotechnol 97(17):7669-7677，2013)和重组sCD83-His蛋白作为检测样品，SDS-PAGE电泳分离蛋白。采用半干转膜仪将目的蛋白转移至PVDF膜(BioRad公司)。PVDF膜放入5％脱脂牛奶室温封闭lh。lmg/ml的抗人CD83单克隆抗体(1:5000稀释)室温孵育2-3h，TBST(50mMTris，0.9％NaCl，0.1％Tween 20，pH＝7.4)洗3次。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(1:5000稀释)室温孵育lh，TBST洗3次。化学发光显色(Thermo scientific公司，货号34080)检测。经免疫印迹鉴定，结果如图3-A所示，在相对分子质量20kDa(sCD83-His)处有一特异条带，而在18kDa(重组IL-33-His)和15kDa(15kDa GNLY-his)处没有特异性条带。证明S3和S7是特异性针对CD83的，而对His-Tag没有反应性。S5不能有效识别变性的重组sCD83，但是能够识别未变性的sCD83(见下ELISA法检测)，提示，S5可能识别的是sCD83的空间构型。

用于ELISA法测定S3、S5和S7的特异性实验步骤如下：包被液稀释重组IL-33-His、重组15kDa GNLY-His(阴性对照2)和重组sCD83-His蛋白至2μg/ml，100μl/孔，包被96孔ELISA板，4℃过夜。第二天弃上清液，PBST洗2遍，1％BSA封闭，37℃孵育2h。制备各抗人CD83单克隆抗体稀释液(浓度为1μg/ml)，PBST洗2遍后加入100μl抗人CD83单克隆抗体稀释液于96孔板中，设PBS为调零孔，37℃孵育2h。PBST洗5遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(1:10000稀释)，37℃孵育lh。PBST洗5遍，加入TMB底物液，100μl/孔，避光显色10-15min，加入终止液(1M硫酸)100μ1/孔，立即用酶标仪进行测定，读取波长450nm的吸光值(OD 450nm)。结果如图3-B所示，S3、S5和S7均对sCD83有特异性结合，而对重组IL-33-His和重组15kDa GNLY-His无结合，说明S3、S5和S7对CD83有很好的特异性。

实施例4抗人CD83单克隆抗体的应用

1、用于免疫印迹检测sCD83和免疫沉淀检测sCD83

实验流程同上述抗人CD83单克隆抗体的特异性鉴定中的免疫印迹流程。如图3-A所示，S3和S7能够特异地检测重组sCD83蛋白，S5不能有效识别变性的重组sCD83，但是能够识别未变性的sCD83，提示，S5可能识别的是sCD83的空间构型。在另一免疫印迹应用案例中，所述S3和S7够用于sCD83的发酵表达检测。如图4-A所示，S3和S7能够特异地检测重组sCD83蛋白，S5不能有效识别变性的重组sCD83，与上述结果基本一致。本领域技术人员易于联想到的，所述抗人CD83单克隆抗体还可以应用于细胞内源性的CD83的免疫印迹检测。

本发明所述抗人CD83单克隆抗体除了可以使用免疫印迹检测发酵液中的sCD83,还可以用于免疫沉淀检测出来。取4ml sCD83发酵上清,调节pH至弱碱性(pH 7.5)，加入20μg S3、S5、S7以及对照抗体小鼠正常IgG(mIgG),4℃摇床上温和摇2小时，加入50μlproteinA/G Plus-Agarose摇2小时，10000g,4℃离心10分钟，弃上清，PBST洗涤三次，每次10000g,4℃离心10分钟，弃上清。用50μlPBS重悬，加入蛋白电泳上样缓冲液，沸煮10分钟，10000g,4℃离心10分钟，取上清进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹鉴定。如图4-B所示，S3、S5和S7均可以特异性地将sCD83从发酵液中免疫沉淀出来，而阴性对照抗体mIgG则不能。证明S3、S5和S7可以用于sCD83的免疫沉淀。由于S3和S7可以识别膜型的CD83，因此本领域技术人员易于联想到的，本发明的S3和S7还可以用于细胞裂解液中的CD83的免疫沉淀。

此外，由于本发明所述抗体可以在免疫印迹中识别变性抗原和ELISA中识别非变性抗原，因此本领域技术人员易于联想到的，本发明所述抗人CD83单克隆抗体还可以用于免疫组化、免疫荧光等实验中检测组织、细胞等样品中的mCD83和sCD83，本说明书不再一一举例。

2、用于流式细胞术检测细胞膜表面CD83

用流式细胞术检测细胞膜表面的CD83和抗体竞争实验的具体方法可以参见中国发明专利《可溶性CD83的表达和制备方法》，申请号为201310187915.3，公开日为2013年8月14日，公开号为103243119A；或参考研究论文：Yugang Guo，et al.，The expression andcharacterization of functionally active soluble CD83 by Pichia pastoris usinghigh-density fermentation，PLOS ONE 9(2):e89264，2014。

如图5-A所示，S3和S7同细胞膜表面mCD83蛋白结合效果较好，与商品化抗体基本相当，但S5无显著的结合能力，提示S5的结合部位靠近CD83的跨膜区，由于空间位阻结合不上去。但是由于S5可以与游离的sCD83结合(ELISA检测中证实)，因此，使用S5区分待检样品中的膜型mCD83和可溶性的sCD83。

如图5-B所示，在本发明所述三个抗体中，S3和S7对商品化抗体有着明显的竞争效果，提示S3和S7可以特异性识别细胞膜型CD83，且与商品化抗体识别的抗原表位较为接近。

3、用于制备检测CD83的ELISA试剂盒

双抗夹心ELISA(Sandwich ELISA)是一种高度灵敏、特异的免疫检测技术。本发明应用抗人CD83单克隆抗体和多克隆抗体、两个不同的抗人CD83单克隆抗体分别组装用于检测CD83的ELISA试剂盒。

1)抗人CD83单克隆抗体和多克隆抗体组装ELISA试剂盒

实验流程：按表2和表3的设计浓度将相应的抗人CD83单克隆抗体包被96孔ELISA板，4℃过夜。PBST洗2遍，1％BSA封闭，37℃孵育1h。PBST洗3遍，每孔分别加入100μl表格设计浓度的sCD83标准品，设标准品稀释液为调零孔，37℃孵育lh。PBST洗3遍，每孔加入100μl表格设计浓度的兔抗sCD83多克隆抗体(多克隆抗体的具体制备方法可以参见中国发明专利《可溶性CD83的表达和制备方法》，申请号为201310187915.3，公开日为2013年8月14日，公开号为103243119A；或参考研究论文：Yugang Guo，et al.，The expression andcharacterization of functionally active soluble CD83 by Pichia pastoris usinghigh-density fermentation，PLOS ONE 9(2):e89264，2014)，37℃孵育lh。PBST洗3遍，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体(1:10000稀释)，37℃孵育lh。PBST洗5遍，加入TMB底物液，100μl/孔，避光显色10-15min，加入终止液(1M硫酸)100μ1/孔，立即用酶标仪进行测定，读取波长450nm的吸光值(OD 450nm)。

表2抗人CD83单克隆抗体和多克隆抗体组装ELISA试剂盒的包被抗体种类优化信息表

表3抗人CD83单克隆抗体和多克隆抗体组装ELISA试剂盒的包被抗体种类优化信息表

一抗类型	S7
		一抗稀释浓度	抗体浓度1mg/ml,按1:500-1:160002倍梯度稀释,共6个梯度
sCD83样品稀释浓度	400ng/ml-25pg/ml，2倍梯度稀释，共15个梯度
		二抗稀释浓度	Rabbit anti CD83多克隆抗体10μg/ml
HRP抗体稀释浓度	Goat anti rabbit-HRP 0.75μg/ml

如图6-A所示，S3和S7可以与多克隆抗体组装成灵敏度相对较高的ELISA试剂盒，灵敏度达到0.5ng/ml，线性范围为0.5ng/ml-50ng/ml，适用于细胞培养上清液、患者血清中检测CD83含量。S5可以与多克隆抗体组装成灵敏度相对较低的ELISA试剂盒，灵敏度达到10ng/ml，线性范围为10ng/ml-1000ng/ml，适合于sCD83制备过程中浓度检测。

进一步优化包被抗体浓度，如图6-B所示，发现随着包被抗体浓度的增加，检测信号逐渐增强，灵敏度也有所增加，然而线性范围相对变小，因此综合考虑检测信号强弱、灵敏度和线性范围等因素，5μg/ml是较优的包被浓度。

2)两个抗人CD83单克隆抗体组装ELISA试剂盒

实验流程：根据生物素标记试剂盒(Thermo Scientific，货号：21435EZ-Link)操作手册对S3、S5和S7进行生物素化标记，并检测生物素化标记效率。经计算如表4所示，三个抗体的生物素标记率均在3-7之间，可以正常使用。

表4抗人CD83单克隆抗体泛素化标记质量控制

	S3	S5	S7
				标记后的单克隆抗体浓度(mg/mL)	1.609	1.116	0.764
生物素化的单克隆抗体浓度(mmol/mL)	1.07E-05	7.44E-06	5.09E-06
				分析混合物中生物素的浓度(mmol/mL)	5.82E-06	4.35E-06	1.82E-06
单克隆抗体中生物素的浓度(mmol/mL)	5.82E-05	4.35E-05	1.82E-05
				生物素标记率(每个抗体分子上的生物素个数)	5.43	5.85	3.58

接下来按表5的设计浓度将相应的抗人CD83单克隆抗体包被96孔ELISA板，4℃过夜。PBST洗2遍，1％BSA封闭，37℃孵育1h。PBST洗3遍，每孔分别加入100μl表格设计浓度的sCD83标准品，设标准品稀释液为调零孔，37℃孵育lh。PBST洗3遍，每孔加入相应100μl表格设计浓度的生物素化抗人CD83单克隆抗体，37℃孵育lh。PBST洗3遍，每孔加入亲和素标记的辣根过氧化物酶(R&D，货号：AEM771012，PartNo.890803)，37℃孵育lh。PBST洗5遍，加入TMB底物液，100μl/孔，避光显色10-15min，加入终止液(1M硫酸)100μ1/孔，立即用酶标仪进行测定，读取波长450nm的吸光值(OD 450nm)。

表5两个抗人CD83单克隆抗体组装ELISA试剂盒抗体组合优化

如图7所示，S3作为包被抗体、S7作为检测抗体的组合(S3/S7)检测信号最强，灵敏度最高，S7作为包被抗体、S3作为检测抗体的组合(S7/S3)次之，S5作为包被抗体、S3作为检测抗体的组合(S5/S3)最弱。然而S7/S3是这些组合中线性范围最广(0.5ng/ml-25ng/ml)的一组。

接下来分别按表6、7对高灵敏度ELISA试剂盒和表8对低灵敏度ELISA试剂盒的抗体的浓度进行优化。结果如图8-A、图8-B、图9-A和图9-B所示，低浓度(5μg/ml)的抗体组合即已达到良好的检测效果，提供浓度并不会提升检测效果，有时反而有所降低。

表6高灵敏度ELISA试剂盒一抗浓度优化

表7高灵敏度ELISA试剂盒二抗浓度优化

表8低灵敏度ELISA试剂盒二抗浓度优化

3)使用上述组装ELISA试剂盒检测患者血清中的sCD83含量

利用上述S3/S7组合的高灵敏度ELISA试剂盒检测临床肿瘤患者血清中sCD83的含量，标准曲线结果如图10-A所示，待测样品(其中1号为健康志愿者血清样品，2-47号为肿瘤患者血清样品)结果如图10-B所示，部分肿瘤患者血清中检测出sCD83含量较高(肿瘤患者血清样品共计46例)，而健康志愿者血清样品中几乎全部不含有sCD83(健康志愿者共计检测40例，其中1号是代表样品),目前sCD83含量与肿瘤发生发展相关性正在分析之中。本实验表明，上述组装ELISA试剂盒可以用于肿瘤患者血清中的sCD83含量检测。

序列表描述

SEQ ID No:1人全长CD83的氨基酸序列(GenBank Accession No.:CAG33300.1)；

SEQ ID No:2毕赤酵母重组表达的sCD83氨基酸序列。

上述1M盐酸为1mol/L盐酸，1M硫酸为1mol/L硫酸，50mM Tris为50mmol/L的Tris溶液。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学技术大学先进技术研究院

<120> 抗人CD83单克隆抗体及其制备、鉴定和应用

<130> ZL201310187915

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 205

<212> PRT

<213> 人全长CD83的氨基酸序列(1)

<400> 1

Met Ser Arg Gly Leu Gln Leu Leu Leu Leu Ser Cys Ala Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Ala Pro Ala Thr Pro Glu Val Lys Val Ala Cys Ser Glu Asp Val Asp

20 25 30

Leu Pro Cys Thr Ala Pro Trp Asp Pro Gln Val Pro Tyr Thr Val Ser

35 40 45

Trp Val Lys Leu Leu Glu Gly Gly Glu Glu Arg Met Glu Thr Pro Gln

50 55 60

Glu Asp His Leu Arg Gly Gln His Tyr His Gln Lys Gly Gln Asn Gly

65 70 75 80

Ser Phe Asp Ala Pro Asn Glu Arg Pro Tyr Ser Leu Lys Ile Arg Asn

85 90 95

Thr Thr Ser Cys Asn Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Leu Gln Asp Pro

100 105 110

Asp Gly Gln Arg Asn Leu Ser Gly Lys Val Ile Leu Arg Val Thr Gly

115 120 125

Cys Pro Ala Gln Arg Lys Glu Glu Thr Phe Lys Lys Tyr Arg Ala Glu

130 135 140

Ile Val Leu Leu Leu Ala Leu Val Ile Phe Tyr Leu Thr Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Thr Cys Lys Phe Ala Arg Leu Gln Ser Ile Phe Pro Asp Phe Ser

165 170 175

Lys Ala Gly Met Glu Arg Ala Phe Leu Pro Val Thr Ser Pro Asn Lys

180 185 190

His Leu Gly Leu Val Thr Pro His Lys Thr Glu Leu Val

195 200 205

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 毕赤酵母重组表达的sCD83氨基酸序列(2)

<400> 2

Thr Pro Glu Val Lys Val Ala Cys Ser Glu Asp Val Asp Leu Pro Cys

1 5 10 15

Thr Ala Pro Trp Asp Pro Gln Val Pro Tyr Thr Val Ser Trp Val Lys

20 25 30

Leu Leu Glu Gly Gly Glu Glu Arg Met Glu Thr Pro Gln Glu Asp His

35 40 45

Leu Arg Gly Gln His Tyr His Gln Lys Gly Gln Asn Gly Ser Phe Asp

50 55 60

Ala Pro Asn Glu Arg Pro Tyr Ser Leu Lys Ile Arg Asn Thr Thr Ser

65 70 75 80

Cys Asn Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Leu Gln Asp Pro Asp Gly Gln

85 90 95

Arg Asn Leu Ser Gly Lys Val Ile Leu Arg Val Thr Gly Cys Pro Ala

100 105 110

Gln Arg Lys Glu Glu Thr Phe Lys Lys Tyr Arg Ala Glu Ile

115 120 125

Claims (5)

1.抗人CD83单克隆抗体，其针对人CD83胞外段的第20至145位氨基酸序列有反应性；所述的抗人CD83单克隆抗体，为IgG1,κ亚类；所述的抗人CD83单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC NO：C2014188的杂交瘤细胞株14E4分泌产生的单克隆抗体。

2.分泌如权利要求1所述的抗人CD83单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株14E4，保藏号为CCTCC NO：C2014188。

3.根据权利要求1所述的抗人CD83单克隆抗体在制备检测CD83试剂盒中的应用，其中所述检测是通过免疫印迹、免疫沉淀、免疫组化、ELISA或流式细胞术来进行的。

4.用于检测CD83的试剂盒，其包含权利要求1所述的抗人CD83单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的用于检测CD83的试剂盒，所述试剂盒用于检测免疫细胞上的CD83或血液样品中的sCD83。

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