CN109354626B

CN109354626B - 抗MyoD1蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109354626B
Application number: CN201811364634.XA
Authority: CN
Inventors: 李恢波; 王小亚; 杨清海; 彭永辉; 吴茂
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2018-11-16
Filing date: 2018-11-16
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2038-11-16
Also published as: CN109354626A

Abstract

本发明涉及一种抗MyoD1单克隆抗体、细胞株及其制备方法、用途，得到的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。其制备中，用于免疫小鼠的抗原为重组蛋白，重组蛋白由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码，经由大肠杆菌重组表达。一株分泌抗MyoD1蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系6F4‑2D7，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.16207。最后提供了所述抗体在免疫检测中的用途。

Description

抗MyoD1蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种抗MyoD1蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

生肌调节因子家族(myogenic regulatory factors，MRFs)，又称生肌决定因子家族(myogenic determining factors，MDFs)，在骨骼肌表达的生肌调节因子称为MyoD基因家族。MyoD基因家族包括四种结构上相关的基因：肌分化因子：MyoD1；肌细胞生成素：MyoG；生肌因子5：Myf5和生肌调节因子 6：Myf6。其中肌分化因子MyoD1负责早期配套成肌细胞的激活并参与胚后骨骼肌的生长、发育和修复等方面的调节，以维持个体骨骼肌的相对稳定；是调控脊椎动物胚胎期肌肉发育调控的基因之一，对骨骼肌的形成和分化发挥主要作用，通过很多途径激活肌肉基因的转录，促进肌细胞的分化。MyoD1基因编码的蛋白-肌调节蛋白对靶基因调控是依赖其碱性螺旋环，螺旋结构与具有bHLH结构的E蛋白结合启动肌特异基因转录表达。

早在1989年Serable已开始将检测肌调节蛋白MyoDl应用于诊断横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)。横纹肌肉瘤是一组具有骨骼肌发生特征的异质性软组织恶性肿瘤，是儿童和青少年最常见的软组织肉瘤，其组织学形态多种多样且在发病部位和预后上有着很大的差异，临床上仅仅凭借患者症状、体征以及在镜下的形态易与其他小细胞恶性肿瘤和神经母细胞瘤混淆，难于确诊。在病理常规工作中多使用IHC检测肌源性分化标志物如：肌红蛋白、波型蛋白、肌钙蛋白、肌纤蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白等来辅助诊断RMS。但这些蛋白的特异性及敏感性不高，使得其对确定RMS的诊断意义不大，故需要找寻其他特异性标志物来帮助诊断及鉴别诊断RMS。

研究已表明MyoDl具有高度的横纹肌肉瘤特异性，可明确定位于横纹肌肉瘤细胞的细胞核中(Zingg JM,Pedraza AG,Jost JP,et al.MyoD1 promoter autoregulation ismediated by two proximal E-boxes.Nucleic Acids Res,1994；22(12):2234-2241)。另有学者研究证实,MyoD1除具有上述良好的组织特异性外,还具有较高的敏感性(EngelME,Mouton SC,Emms M.Paediatric rhabdomyosarcoma:MyoD1demonstration inroutinely processed tissue sections using wet heat pretreatment(pressurecooking)for antigen retrieval.J Clin Pathol,1997；50(1):37-39)。从而在一定程度上表明,MyoD1对于横纹肌肉瘤的不同病理分型,都具有较高的、较为均衡和一致的敏感性。

MyoDl蛋白在正常成熟的骨骼肌中无表达，而在横纹肌肉瘤中具有高表达，MyoD1的检测不仅有益于明确低分化瘤细胞的组织起源,更为明确横纹肌肉瘤与多种MSRCT之间的鉴别诊断提供了有利的依据。但目前高质量的MyoDl 单抗大多依赖于国外进口，检测成本较高。

发明内容

为此，需要提供一种适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测的，具有强特异性和敏感性的抗MyoD1蛋白单克隆抗体。

为实现上述目的，发明人提供了一种抗MyoD1蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列所编码。

进一步地，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

进一步地，所述蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO.16207的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系6F4-2D7，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2018年7月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别MyoD1蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG_2a亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一株分泌抗MyoD1蛋白的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系6F4-2D7，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.16207。

发明人还提供了上述抗MyoD1蛋白单克隆抗体在Myod1蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，上述技术方案选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的 MyoD1第1位至第259位氨基酸区域用于重组表达，并通过同源重组的方法与 petβ2M载体连接，其中β2M为I类主要组织相容性复合物(MHC)的组分，参与肽抗原向免疫系统的呈递。6个His的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。最后经细胞融合、筛选和亚克隆，获得能高效分泌抗MyoD1抗体的单克隆细胞系6F4-2D7。同时，由该细胞系所分泌的MyoD1抗体具有高特异性，可以特异性识别表达MyoD1蛋白的细胞核，降低误读，提高诊断的准确性。

附图说明

图1为MyoD1抗原蛋白溶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图2为纯化后MyoD1单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图3为横纹肌肉瘤免疫组化染色结果图，左为对照抗体5.8A和右为 6F4-2D7抗体。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1重组MyoD1蛋白片段的制备

一、基因克隆

本发明选取人MyoD1第1位至第259位氨基酸片段(SEQ ID No.2)作为免疫原,根据其所对应的碱基序列(SEQ ID No.7)，用软件Primer 5.0设计特异性上游引物：5’TCCACTGGGTTCTCGGACTATGGAACTGCTGAGCCCTCC3’和下游引物：5’GTGGTGCTCGAGTGCGGCCTTATTACAGAACCTGATAAATCG3’，进行PCR扩增。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，对质粒载体petβ2M(petβ2M载体采购自武汉金开瑞生物工程有限公司，内含β2M蛋白序列及His标签)进行NotI单酶切，后将载体与PCR产物用同源重组酶体外连接，转化至大肠杆菌感受态细胞TOP10中，挑取平板上的克隆接种扩培，提取质粒DNA，进行 PCR鉴定。将PCR显示目的基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于进行下一步实验。

β2M为I类主要组织相容性复合物(MHC)的组分，参与抗原肽向免疫系统的呈递，促进抗体的生成。6-His的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。

二、蛋白表达与纯化

将测序鉴定正确的重组质粒转化表达宿主，挑取阳性单克隆菌落，接种于4mL含卡那霉素的试管LB培养基中，37℃培养过夜后将此培养液接种于 1000mL含卡那霉素的三角瓶LB培养基中扩培，37℃，200rpm/min培养至菌液OD值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃继续培养3h，离心收集菌体超声破碎。将破碎溶液离心后沉淀溶于包涵体洗涤液(100mM Tris、2M脲素、1mM EDTA、0.5％吐温-20，pH8.0，每500mL菌液沉淀加10mL)洗涤两次，然后加入10mL含8M脲素镍柱平衡缓冲液(20mM磷酸钠、500mM 氯化钠、5mM咪唑、8M脲素，pH8.0)混匀4℃过夜，12000g、10min离心收集上清，最后再利用Ni-NTA柱对收集的上清进一步纯化，获得高纯度，构象均一性的MyoD1抗原蛋白溶液(融合有β2M和组氨酸标签)。对所得到的MyoD1 抗原蛋白溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图1所示。

实施例26F4-2D7杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中获得的MyoD1蛋白稀释至1mg/mL，然后与等体积的完全弗氏佐剂(CFA,Sigma公司)混合乳化，对18-20g的Balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹腔注射免疫，注射剂量为50μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏不完全佐剂(IFA,Sigma公司)乳化，剂量为50μg/ 只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价；检验结果表明效价不高，因此进行第四次免疫，抗原使用弗氏不完全佐剂乳化，剂量为50μg/只，14天后以间接ELISA(波长450nm) 检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC) 以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1mL预热至37℃的PEG(Sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与PEG充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4mL预热至37℃的无血清DMEM(Hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10mL 预热无血清DMEM培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清DMEM培养基，定容至50mL，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10～20mL HAT(Sigma公司)培养基重悬细胞，并用HAT培养基稀释至终浓度为0.5×10⁶ cells/mL，所有溶液转移至96孔板中，200μL/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％CO₂培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加HAT培养基，50μL/孔。

三、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

当融合细胞直径为1～2mm时，吸取50～100μL培养液上清进行首次细胞筛选(ELISA、IHC-P及其他方法检测)。ELISA检测该培养液上清，将检测得到MyoD1阳性结果的培养孔内细胞全部转移至24孔培养板，补加HT培养基，2mL/孔，培养3天。

重复筛选24孔板中各细胞株，设置β2M阳性对照孔，剔除MyoD1阴性或 β2M阳性结果的培养孔细胞，获得MyoD1阳性结果较好且为β2M阴性的培养孔细胞。并进行IHC筛选。

根据IHC筛查结果进一步进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至CO₂培养箱培养，待克隆细胞直径为1～2mm时，重复进行细胞筛选。

根据检测结果，每个母克隆细胞株，选取2-4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养；一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，并进行IHC筛选；得到分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞系6F4-2D7。将此细胞系6F4-2D7转入T-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

将细胞株培养至对数生长期后用无血清培养基洗涤并重悬，计数2×10⁶个/mL。悬浮的细胞溶液腹腔注射事先用石蜡油致敏10天的F1小鼠，每只小鼠注射0.5mL。饲养小鼠6-7天后开始采集腹水。收集的腹水于4℃、8000rpm 离心10min，吸取上清溶液收集于离心管中，即为腹水，4℃或-20℃保存。二、单克隆抗体的纯化

用Protein G亲和层析柱从腹水中纯化抗体，主要步骤为：①装柱，将购买的ProteinG填料适量装于重力层析柱中用10倍柱体积去离子水冲洗；再用10倍柱体积的1％NaAc冲洗；②上样，10ml抗血清，经过0.22μm滤膜过滤后加入40ml 1％NaAc控制流速0.5ml/min；③平衡，上完样液后使用1％NaAc 冲洗至平衡；④洗脱，3.5％冰乙酸冲洗，收集洗脱产物至无蛋白流出；⑤pH 值调节，饱和碳酸钠调节洗脱产物pH至中性；⑥样品浓缩，10kDa超滤管，超滤浓缩至10ml左右；⑦透析，5L，1*PBS透析过夜，第二天换液一次；⑧ 去离子水冲洗柱子至中性⑨5倍柱体积的20％乙醇冲洗后，置于4℃封存。

最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度。SDS结果见图2,纯化后MyoD1单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。测定结果为：抗体纯度约90％，抗体浓度5.1mg/ml。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

将免疫原溶液稀释成1μg/mL包被酶标板,每孔加100μL，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗板3次，每孔加入200μL封闭液(含2％BSA的PBS-T溶液)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1mL杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。用封闭液1：400稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ， IgM，IgG1，IgG_2a，IgG_2b，IgG₃，IgA)抗体(Southern Biotech公司)，每孔分别加入0.1mL，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加100μL TMB(湖州英创生物科技有限公司)底物(A、B等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μL 1N HCl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定 450nm波长下的OD值。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG_2a亚型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组MyoD-1蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜， PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，PBS-T洗3次。实施例4 中纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/mL)：2000、500、125、 62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl TMB(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl 1.0N盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台OD值”对应的抗体浓度A。利用下列公式计算出亲和常数为6.99×10⁹L×mol^-1。

三、单抗反应特异性和应用效果

选择免疫原溶液，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，对纯化得到的MyoD 1蛋白进行15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。用常规湿转法将凝胶蛋白转移到PVDF膜。将膜置于5％BSA-TBST溶液中(蛋白面朝下)，于37℃摇床封闭1h，以消除非特异性背景。封闭结束后用TBST洗掉5％ BSA-TBST，加入本发明制备的MyoD1(6F4-2D7)的单克隆抗体，于脱色摇床摇荡孵育1h。用TBST洗膜后，加入二抗，于脱色摇床孵育1h，使二抗与一抗充分结合。再次用TBST洗膜，加入ECL显色试剂盒。最后进行化学发光图像数据采集。结果条带单一且颜色较深，说明抗体与抗原的特异性反应明显。

实施例5组织芯片染色和鉴定

一.组织蜡块制备过程

对血管样本进行HE切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在 56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃) 孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20 秒，PBS返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3 分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性(+)和阴性(-)。

三、样本IHC检测及结果分析：

1、病例组样本的对比检测

用抗MyoD1蛋白单克隆抗体(6F4-2D7)和对照抗体：市售抗MyoD1蛋白单克隆抗体(鼠单抗5.8A)在30例病例组样本横纹肌肉瘤上进行同步检测，统计结果如下表所示。

本抗体(6F4-2D7)与市售抗MyoD1蛋白单克隆抗体(鼠单抗5.8A) 在肿瘤细胞的阳性率一致。图3为横纹肌肉瘤免疫组化染色结果图，左为对照抗体5.8A和右为6F4-2D7抗体。

2、多组织样本的IHC试验：

用抗MyoD1蛋白单克隆抗体(6F4-2D7)和市售抗MyoD1蛋白单克隆抗体(鼠单抗5.8A)在多组织芯片上进行同步检测，记录检测结果。多组织芯片包括84个肿瘤组织和4个正常组织，多组织芯片中组织如下表所示：

本抗体(6F4-2D7)与市售抗MyoD1蛋白单克隆抗体(鼠单抗5.8A)在多组织芯片中的检测结果一致。

在以上试验中，MyoD1(5.8A)的免疫组化染色，在细胞质上常常会出现非特异性染色；而测试抗体(6F4-2D7)可准确定位胞核，细胞质没有出现非特异性染色。同时，测试抗体(6F4-2D7)细胞核的染色强度也大于对照抗体 (5.8A)。说明测试抗体抗MyoD1蛋白单克隆抗体(6F4-2D7)的特异性优于市售抗体MyoD1(5.8A),具有膜定位精确、高特异性的优点，可提高诊断的准确性。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗MyoD1蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

<130> 2010

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1343

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

atgggccatc atcatcatca tcatatccag cgtactccaa agattcaggt ttactcacgt 60

catccagcag agaatggaaa gtcaaatttc ctgaattgct atgtgtctgg gtttcatcca 120

tccgacattg aagttgactt actgaagaat ggagagagaa ttgaaaaagt ggagcattca 180

gacttgtctt tcagcaagga ctggtctttc tatctcttgt actacactga attcaccccc 240

actgaaaaag atgagtatgc ctgccgtgtg aaccatgtga ctttgtcaca gcccaagata 300

gttaagtggg atcgagacat gccaaagtct gatctggaag ttctgtttca aggtccactg 360

ggttctcgga ctatggaact gctgagccct ccgctgcgtg atgttgatct gaccgcaccg 420

gatggtagcc tgtgtagctt tgcaaccacc gatgattttt atgatgatcc gtgttttgat 480

agtccggatc tgcgtttttt tgaagatctg gatccgcgtc tgatgcatgt tggtgcactg 540

ctgaaaccgg aagaacatag ccattttccg gcagcagttc atccggcacc gggtgcacgt 600

gaagatgaac atgtgcgtgc accgagcggt catcatcagg caggtcgttg tctgctgtgg 660

gcatgtaaag cctgtaaacg taaaaccacc aatgcagatc gtcgtaaagc agcaaccatg 720

cgtgaacgtc gtcgtctgag caaagttaat gaagcatttg aaaccctgaa acgttgtacc 780

agcagcaatc cgaatcagcg tctgccgaaa gttgaaattc tgcgtaatgc cattcgctat 840

attgaaggtc tgcaggcact gctgcgcgat caggatgcag caccgcctgg tgcagcagca 900

gcattttatg caccgggtcc gctgcctcca ggtcgtggtg gtgaacatta tagcggtgat 960

agtgatgcaa gcagtccgcg tagcaattgt agtgatggta tgatggatta tagtggtccg 1020

cctagcggtg cccgtcgtcg taattgttat gaaggtgcct attataacga agcaccgagt 1080

gaaccgcgtc cgggtaaaag cgcagccgtt agcagcctgg attgtctgag cagcattgtt 1140

gaacgtatta gcaccgaatc accggcagca ccggctctgc tgctggcaga tgttccgagc 1200

gaaagcccac cgcgtcgtca agaagcagcc gcacctagcg aaggtgaaag cagcggtgat 1260

ccgacacaga gtccggatgc agcccctcag tgtccggcag gcgcaaaccc gaatccgatt 1320

tatcaggttc tgtaataagg ccg 1343

<210> 2

<211> 259

<212> PRT

<213> 智人(Homo sp)

<400> 2

Met Glu Leu Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asp Val Asp Leu Thr Ala Pro

1 5 10 15

Asp Gly Ser Leu Cys Ser Phe Ala Thr Thr Asp Asp Phe Tyr Asp Asp

20 25 30

Pro Cys Phe Asp Ser Pro Asp Leu Arg Phe Phe Glu Asp Leu Asp Pro

35 40 45

Arg Leu Met His Val Gly Ala Leu Leu Lys Pro Glu Glu His Ser His

50 55 60

Phe Pro Ala Ala Val His Pro Ala Pro Gly Ala Arg Glu Asp Glu His

65 70 75 80

Val Arg Ala Pro Ser Gly His His Gln Ala Gly Arg Cys Leu Leu Trp

85 90 95

Ala Cys Lys Ala Cys Lys Arg Lys Thr Thr Asn Ala Asp Arg Arg Lys

100 105 110

Ala Ala Thr Met Arg Glu Arg Arg Arg Leu Ser Lys Val Asn Glu Ala

115 120 125

Phe Glu Thr Leu Lys Arg Cys Thr Ser Ser Asn Pro Asn Gln Arg Leu

130 135 140

Pro Lys Val Glu Ile Leu Arg Asn Ala Ile Arg Tyr Ile Glu Gly Leu

145 150 155 160

Gln Ala Leu Leu Arg Asp Gln Asp Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala

165 170 175

Ala Phe Tyr Ala Pro Gly Pro Leu Pro Pro Gly Arg Gly Gly Glu His

180 185 190

Tyr Ser Gly Asp Ser Asp Ala Ser Ser Pro Arg Ser Asn Cys Ser Asp

195 200 205

Gly Met Met Asp Tyr Ser Gly Pro Pro Ser Gly Ala Arg Arg Arg Asn

210 215 220

Cys Tyr Glu Gly Ala Tyr Tyr Asn Glu Ala Pro Ser Glu Pro Arg Pro

225 230 235 240

Gly Lys Ser Ala Ala Val Ser Ser Leu Asp Cys Leu Ser Ser Ile Val

245 250 255

Glu Arg Ile

<210> 3

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

caggtcaagc tgcagcagtc agggggaggc ttagtgcagc ctggggggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag ccgctggatt caatttcagt atatatggca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attaatagta atggtgttag cacccattat 180

ccagacaatg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgt aagaggtccc 300

gcctactata ggtacgaggt tccctttgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 4

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gacattgagc tcacccagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60

atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtaaca atcaaaagaa ctacttggcc 120

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336

<210> 5

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Asn Phe Ser Ile Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Val Ser Thr His Tyr Pro Asp Asn Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Pro Ala Tyr Tyr Arg Tyr Glu Val Pro Phe Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 777

<212> DNA

<213> 智人(Homo sp)

<400> 7

atggaactgc tgagccctcc gctgcgtgat gttgatctga ccgcaccgga tggtagcctg 60

tgtagctttg caaccaccga tgatttttat gatgatccgt gttttgatag tccggatctg 120

cgtttttttg aagatctgga tccgcgtctg atgcatgttg gtgcactgct gaaaccggaa 180

gaacatagcc attttccggc agcagttcat ccggcaccgg gtgcacgtga agatgaacat 240

gtgcgtgcac cgagcggtca tcatcaggca ggtcgttgtc tgctgtgggc atgtaaagcc 300

tgtaaacgta aaaccaccaa tgcagatcgt cgtaaagcag caaccatgcg tgaacgtcgt 360

cgtctgagca aagttaatga agcatttgaa accctgaaac gttgtaccag cagcaatccg 420

aatcagcgtc tgccgaaagt tgaaattctg cgtaatgcca ttcgctatat tgaaggtctg 480

caggcactgc tgcgcgatca ggatgcagca ccgcctggtg cagcagcagc attttatgca 540

ccgggtccgc tgcctccagg tcgtggtggt gaacattata gcggtgatag tgatgcaagc 600

agtccgcgta gcaattgtag tgatggtatg atggattata gtggtccgcc tagcggtgcc 660

cgtcgtcgta attgttatga aggtgcctat tataacgaag caccgagtga accgcgtccg 720

ggtaaaagcg cagccgttag cagcctggat tgtctgagca gcattgttga acgtatt 777

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

tccactgggt tctcggacta tggaactgct gagccctcc 39

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

gtggtgctcg agtgcggcct tattacagaa cctgataaat cg 42

Claims

1.一种抗MyoD1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗MyoD1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列所编码。

3.根据权利要求1所述的抗MyoD1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.16207的杂交瘤细胞系产生。

4.根据权利要求1所述的抗MyoD1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别MyoD1蛋白。

5.根据权利要求1所述的抗MyoD1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG_2a亚型单克隆抗体。

6.一株分泌抗MyoD1蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系6F4-2D7，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.16207。