JPWO2003029475A1 - エピトープ結合β２ｍをコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターおよびその利用 - Google Patents

Abstract

エピトープ結合β２ｍをコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを構築し、哺乳動物細胞で該エピトープ結合β２ｍを大量に発現させることに成功した。本発明は、エピトープ結合β２ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターおよびその利用を提供する。また、本発明は、該ベクターを用いたＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の製造方法を提供する。特に４量体化したＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体は、エピトープ特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の検出に有用である。また本発明は、該ベクターが導入された細胞を提供する。また、本発明のベクターにより産生したエピトープ結合β２ｍを添加した標的細胞を提供する。これらの細胞は、抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）により認識された。本発明のベクターおよび該ベクターの発現により得られるポリペプチドは、感染症や癌などにおける免疫治療のために、また抗原特異的ＣＴＬの検出および定量のために有用である。

Description

技術分野
本発明は、エピトープ結合β２ｍをコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターおよびその利用に関する。
背景技術
ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）ｃｌａｓｓ Ｉ分子は重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；ＨＣ）とβ２ミクログロブリン（β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ；β２ｍ）からなるヘテロダイマーであり、体内にあるほとんどの細胞がその細胞膜表面上に持つ。ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子はその重鎖によって作られるペプチド収容溝に１０アミノ酸前後からなるペプチドを収容することができ、そのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体が細胞性免疫の担い手である細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）上のＴ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ）によって認識されることから、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子によって提示されるペプチドは「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ；抗原決定基）」と呼ばれる。
細胞質内で作られた自己抗原、あるいはウイルス抗原、腫瘍抗原などに由来するペプチド断片はＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）と呼ばれる粗面小胞体上にあるトランスポーターを介して粗面小胞体へと運ばれ、そこでＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖およびβ２ｍとともに安定なＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を形成する。β２−ミクログロブリン分子はＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉの立体構造の安定性の確保とＨ鎖の細胞表面への輸送に役割を果たしている（日本分子生物学会編「免疫系：認識・分化・増殖」本庶 佑、渡邊 武 編集、丸善株式会社、１１７−１１８ページ）。ペプチドを結合していない空のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子は３７℃の培養条件では非常に不安定であることが知られている。
ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子によって提示されるペプチドであるエピトープは、ある抗原に対する特異的な細胞性免疫を誘導するのに非常に重要な分子であり、ＨＩＶをはじめとするウイルス感染や、癌に対する免疫治療としてペプチドワクチンの開発が試みられている。しかしながら多くのウイルス抗原や腫瘍抗原由来の主要なエピトープは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子とペプチドとの結合は弱く、ペプチドのみをワクチンとして使用してもその安定性の低さから一般に効果が期待できない。１９９８年に抗原性を損なわずＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子との結合を高めるアミノ酸置換を行った人工のエピトープを用いた、メラノーマ患者に対する臨床研究では効果が認められているが、このような安定性、抗原性に優れたエピトープを同定、開発することは煩雑で困難であり、必ずしも目的のものが得られるわけではない。
また一方でβ２ｍによるＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子上のペプチドの安定性の増加という現象が知られており、そのβ２ｍのアジュバント効果を利用した系の開発も行われている。
ところで近年、エピトープペプチドをＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩおよびＩＩ分子あるいはβ２ｍに融合させたＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体等の発現が試みられている（Ｕｇｅｒ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｂａｒｂｅｒ，Ｂ．Ｈ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１５９８−１６０５；Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２６７１−２６７６；Ｋａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２０２−２０５；Ｕｇｅｒ，Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１６２：６０２４−６０２８；米国特許第５，８６９，２７０号）。これらの系では、β２ｍのＮ末端にリンカーを介してエピトープのペプチド配列を融合させること（エピトープ結合β２ｍ；ｅｐｉｔｏｐｅ−ｌｉｎｋｅｄ−β２ｍ）（”ｅ／β２ｍ”とも表記する）によって、特にＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子との結合力の弱いエピトープに関してペプチド単独に比して安定性が増加しＣＴＬによる認識も高まることが報告されている。しかし、これらの報告では主として大腸菌発現ベクターが用いられており、哺乳動物細胞感染性のウイルスベクターを用いた例は知られていない。大腸菌において外来蛋白質を大量発現させると、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）を形成し不溶化する場合がしばしば認められる。不溶化した蛋白質は尿素などの変性剤で可溶化し、蛋白質の再フォールディングが行われるが、必ずしも全ての蛋白質が可溶化するわけではなく、操作も煩雑である。また、大腸菌由来の煩雑物の混入も懸念される。
また、哺乳動物発現プラスミドを用いた遺伝子導入は効率が悪く十分な発現が期待できない。さらにプラスミドベクターの発現のためには、プラスミドが核に移行することが必要であるため、核膜の消失する細胞が分裂しているタイミングでなければベクターを発現させることができない欠点を持っている。
ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体は、抗原特異的ＣＴＬのアッセイにも有用である。個体内での抗原特異的ＣＴＬの頻度の定量には従来、限界希釈アッセイ（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）という方法が用いられてきたが、これはインビトロでの長期の培養が必要であることと、感度が悪いことから、１９９６年に簡便で感度のよい”ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド・テトラメリック複合体（テトラマー）”〔ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ（ｔｅｔｒａｍｅｒ）〕が開発された（Ａｌｔｍａｎ Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６（１９９６））。これはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体をｂｉｏｔｉｎ−ａｖｉｄｉｎの結合を用いて４量体化し、さらに蛍光標識を付加したもので、ＦＡＣＳによる解析に利用される。この方法は個体から分離した末梢血単核球をそのまま用いて測定することができるため、簡便で個体内の頻度を直接反映する上、非常に感度がよく、さらに特異性も高いことが確認されている（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：７８５−７９０（１９９８）；Ｋｕｒｏｄａ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１３７３−１３８１（１９９８））。現在ヒトのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子について用いられているＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体は、大腸菌にて重鎖（ＨＣ）およびβ２ｍ蛋白質を別々に発現させ、精製し、さらに合成ペプチドを用いた３者によるインビトロフォールディングにてＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を作製している。
それに対してマウスのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子についてバキュロウイルスベクターを用い、昆虫細胞由来のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の作製が報告されている（Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２６７１−２６７６）。この系ではＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖、エピトープ結合β２ｍを各々発現するバキュロウイルスを重感染させることによって、その細胞内でＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体が作られる。しかし、哺乳動物細胞感染性のウイルスベクターを用いた例は知られていない。バキュウロウイルスベクターは昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）で有効なプロモーターの下流で外来遺伝子を発現するシステムで（特表平６−５０２９９０）あるため、哺乳類由来の細胞を利用することができない。また、ＰｕｎｎｏｎｅｎらはＤＮＡシャッフリングに用いる遺伝子ワクチンベクターを開示しているが、エピトープ結合β２ｍをコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターについては知られていない（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ｊ．他、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、米国特許出願第２００１０００６９５０号）。
発明の開示
本発明は、エピトープ結合β２ｍをコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターおよびその利用を提供する。
本発明者らは、エピトープ結合β２ｍおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を哺乳動物細胞で大量発現させる系を確立するため、哺乳動物細胞感染性のウイルスベクターを用いた発現系の構築を試みた。この目的のために、広い哺乳動物種に感染可能であり、導入遺伝子の極めて高い発現を得ることができる組み換えセンダイウイルス（ｒＳｅＶ）を用いて、ＳｅＶによるＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体、及びエピトープ結合β２ｍの発現系を構築した。
本発明者らは、ＨＩＶ−１ ＮｅｆおよびＥｎｖタンパク由来のエピトープを例に、エピトープ結合β２ｍを発現するＳｅＶベクターを構築した。これを哺乳動物に導入し、分泌型蛋白質の形でエピトープ結合β２ｍを大量に回収することに成功した。回収されたエピトープ結合β２ｍは、細胞表面上のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖と結合してＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を形成し、ＣＴＬに効率良く抗原を提示できることが判明した。このことから動物感染性ウイルスベクターにより産生されるエピトープ結合β２ｍは、タンパク製剤として有用であることが示された。ベクター導入細胞から産生されたエピトープ結合β２ｍを回収・精製すれば、臨床応用に有用な抗原特異的細胞性免疫誘導剤を得ることが可能である。
また、本発明者らは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を発現するＳｅＶベクターを構築し、これとエピトープ結合β２ｍ発現ＳｅＶベクターを哺乳動物細胞に重感染させてＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を回収・精製した。さらに、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖の膜結合領域を欠失させた分泌型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖にビオチン化基質ペプチドを付加した分子をＳｅＶベクターにより発現させ、得られたＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体をビオチン化した後、ＲＰＥ標識アビジンを介して結合させ、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチドテトラマーを製造した。このＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチドテトラマーは、ＣＴＬの検出および定量に好適に用いられる。このテトラマーは動物細胞由来であるため糖鎖が付加され、大腸菌由来のテトラマーに比して感度の向上などが期待される。
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２を発現するＳｅＶとＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク由来のエピトープが結合しているβ２ｍを発現するＳｅＶベクターを共導入した細胞は、ＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク由来の合成エピトープペプチドをパルス投与した場合と同等またはそれ以上の効率で抗原特異的ＣＴＬに認識されることが判明した。また、ＳｅＶベクター導入細胞から回収したエピトープ結合β２ｍの効果を調べたところ、エピトープ結合β２ｍを標的細胞の培養液に添加することによって、標的細胞に対する抗原特異的ＣＴＬの反応を誘導することに成功した。これらの知見は、エピトープ結合β２ｍをコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターが、抗原特異的な免疫反応を誘導するためのインビボまたはエクスビボにおける遺伝子治療に有用であることを示している。目的のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を個体内で産生させることができれば、単なるペプチドワクチンなどに比して効果の高い免疫治療を実現することが可能と考えられる。
このように本発明者らは、哺乳動物細胞において効率的にエピトープ結合β２ｍを産生させる方法を確立し、このエピトープ結合β２ｍを含む分泌型および膜結合型のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を製造した。さらに本発明者らは、個体内での抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の検出および定量に有用なＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチドテトラマーの作製において新しいシステムを開発した。また本発明者らは、上記の生産系を用いて調製したエピトープ結合β２ｍ蛋白質を細胞表面のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉと結合させ抗原特異的ＣＴＬへの抗原提示を行った。さらに、エピトープ結合β２ｍ発現ウイルスベクターおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖発現ウイルスベクターを標的細胞に重感染させ、抗原特異的ＣＴＬによる認識を誘導する系を確立した。
本発明において提供されるベクターを使用すれば、哺乳動物細胞で所望のエピトープ結合β２ｍを大量に発現させることが可能であり、得られるエピトープ結合β２ｍおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体は、抗原特異的ＣＴＬの検出および定量のために、またエピトープ結合β２ｍ精製蛋白質を用いたＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉによる抗原提示のために、さらにはインビボおよびエクスビボでのベクター導入を介して、抗原特異的細胞性免疫を誘導するために極めて有用である。特に本発明のベクターは、ウイルスやバクテリア等の感染症に対する防御免疫の誘導、および癌に対する免疫療法などに好適に用いられる。
本発明は、エピトープ結合β２ｍをコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターおよびその利用に関し、より具体的には、
（１）エピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクター、
（２）哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、（１）に記載のウイルスベクター、
（３）パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、（２）に記載のウイルスベクター、
（４）エピトープが抗原提示細胞により提示されたエピトープペプチドのアミノ酸配列またはその部分を含む、（１）から（３）のいずれかに記載のウイルスベクター、
（５）エピトープがＨＩＶ−１のウイルス蛋白質の部分ペプチドである、（１）から（４）のいずれかに記載のウイルスベクター、
（６）エピトープが配列番号：２４または２６に記載のアミノ酸配列またはその部分を含む、（５）に記載のウイルスベクター、
（７）エピトープが癌抗原の部分ペプチドである、（１）から（４）のいずれかに記載のウイルスベクター、
（８）エピトープとβ２ｍの間に配列番号：１３に記載のアミノ酸配列またはその繰返しを含む、（１）から（７）のいずれかに記載のウイルスベクター、
（９）エピトープ結合β２ｍの生産方法であって、
（ａ）（１）から（８）のいずれかに記載のウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、
（ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、エピトープ結合β２ｍを回収する工程、を含む方法、
（１０）（９）に記載の方法により生産されたエピトープ結合β２ｍ、
（１１）エピトープ結合β２ｍを含む、ヘテロダイマーの生産方法であって、
（ａ）（１）から（８）のいずれかに記載のウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、
（ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、生成したヘテロダイマーを回収する工程、を含む方法、
（１２）ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖、およびエピトープ結合β２ｍを含む、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の生産方法であって、
（ａ）（１）から（８）のいずれかに記載のウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、
（ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、生成したＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を回収する工程、を含む方法、
（１３）前記哺乳動物細胞に、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を発現するウイルスベクターを導入する工程をさらに含む、（１２）に記載の方法、
（１４）ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖が分泌型である、（１３）に記載の方法、
（１５）ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖がビオチン化基質ペプチドを含む、（１４）に記載の方法、
（１６）ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖がＡ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖である、（１３）から（１５）のいずれかに記載の方法、
（１７）Ａ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖がＡ＊２４０２由来である、（１６）に記載の方法、
（１８）ビオチン化基質ペプチドを含むＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をビオチン化する工程、およびビオチン化ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をアビジンの存在下で会合させる工程をさらに含む、（１５）に記載の方法、
（１９）（１２）から（１８）のいずれかに記載の方法により生産されたＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体、
（２０）４量体である、（１９）に記載のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体、
（２１）（１）から（８）のいずれかに記載のウイルスベクター、（１０）に記載のエピトープ結合β２ｍ、あるいは（１９）または（２０）に記載のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む、抗原特異的細胞性免疫の誘導剤、
（２２）（１）から（８）のいずれかに記載のウイルスベクター、（１０）に記載のエピトープ結合β２ｍ、あるいは（１９）または（２０）に記載のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む医薬組成物、
（２３）（１）から（８）のいずれかに記載のウイルスベクターが導入された哺乳動物細胞、
（２４）（１０）に記載のエピトープ結合β２ｍを細胞表面に有する細胞、
（２５）ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をコードする遺伝子が外来的に導入されている、（２３）または（２４）に記載の細胞、
（２６）ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖が膜結合型である、（２５）に記載の細胞、
（２７）ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖が分泌型である、（２５）に記載の細胞、
（２８）細胞が樹状細胞である、（２３）から（２７）のいずれかに記載の細胞。
（２９）（２３）から（２８）のいずれかに記載の細胞を含む、抗原特異的細胞性免疫の誘導剤、
（３０）（２３）から（２８）のいずれかに記載の細胞を含む医薬組成物、
（３１）（１９）または（２０）に記載のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む、抗原特異的Ｔリンパ球の検出薬、に関する。
本発明において「エピトープ」とは、免疫細胞により認識され得るペプチドを言う。免疫細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞などが挙げられる。本発明において好ましいエピトープは、Ｔ細胞により認識されるペプチドである。エピトープは、抗原提示細胞により提示されたペプチドのみならず、免疫細胞により認識され得る限り所望のペプチドであってよく、例えば、人工的に作製したアミノ酸配列からなるペプチドをエピトープとして用いることもできる。より好ましくは、エピトープは抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示されたペプチドまたはその部分を含むペプチドである。本発明においてエピトープとなる蛋白質またはペプチドの「部分」は、通常、連続した８アミノ酸以上を含む部分である。好ましくは、連続した９アミノ酸以上、より好ましくは連続した１０以上、１２以上、または１５以上のアミノ酸を含む部分である。
本発明は、エピトープ結合β２ｍをコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを提供する。哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターとしては特に制限はなく、所望のウイルスベクターを利用することができる。本発明の哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターは、哺乳動物細胞以外の細胞に感染する能力を有していてもよい。ベクターとしては、宿主に対する毒性が低く、導入遺伝子の高い発現が得られるものが好ましい。本発明のベクターとして用いられ得るウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、フォウルポックスウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられるがこれらに制限されない。これらのベクター系を用いて、エピトープ結合β２ｍを発現する組み換えウイルスベクターを構築することができる。なお、本明細書において、「組み換え」ウイルスベクターとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルスベクターを言う。組み換えポリヌクレオチドとは、自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。より具体的には、例えば人為的にポリヌクレオチド鎖が繋ぎ替えられたり、あるいは新たに生成されたポリヌクレオチドである。「組み換え」ウイルスベクターは、例えば遺伝子操作により構築されたウイルスベクターまたはそれを増幅して得られるウイルスベクターが含まれる。組み換えウイルスベクターは、例えば、組み換えウイルスｃＤＮＡを宿主細胞で発現させ、ウイルス粒子を再構成して生成することができる。
組み換えウイルスベクターは当業者に周知の方法に従って調製することができる。例えば、遺伝子治療などに最も普通に利用されるアデノウィルスベクターの作製は、斎藤らの方法（Ｍｉｙａｋｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、１３２０−２４頁；鐘ヶ江ら、バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法、１９９４、４３−５８頁、羊土社）に従い、例えばアデノウィルス（Ａｄ）５型ゲノムのほぼ全長からＥ１及びＥ３領域を除く３１ｋｂのＡｄＤＮＡを持つ４２ＫｂのコスミドｐＡｄｅｘ１ｃｗ（鐘ヶ江ら、１９９４、細胞工学、１３巻、８号、７５７−７６３頁）を、適当な制限酵素例えばＳｗａＩ等で切断し、ゲル濾過等にて適宜脱塩精製し、外来遺伝子発現ユニットをＴ４リガーゼ等による連結反応に供した後、酵素を熱失活し、ゲル濾過にて脱塩し、ＳｗａＩによる切断反応を行う。切断産物はフェノールによる酵素失活処理後脱塩し、再びＳｗａＩで切断する。その一部についてギガパックＸＬキット（ストラタジーン社、米国）等によるインビトロ・パッケージングを行い、連結産物を大腸菌に導入し得られたアンピシリン耐性形質転換株のいくつかについてコスミドを調製し、制限酵素消化によりその構造を調べ、外来遺伝子発現ユニットが目的の方向（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂの転写と逆方向）に挿入された組換えコスミドを単離する。一方で、Ｅ１及びＥ３領域を欠くアデノウィルス５型（Ａｄ５ ｄｌＸ株）のＤＮＡ−末端蛋白質複合体（ＤＮＡ−ＴＰＣ）を斎藤らの方法（鐘ヶ江ら、１９９４、バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法、４３−５８頁、羊土社）により調製する。これを例えば、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、ついでゲル濾過等により脱塩精製する。該コスミドとＥｃｏＴ２２Ｉ消化断片を混合し、セルフェクトキット（ファルマシア社、スウェーデン）等を用いて、２９３細胞に導入する。翌日、トランスフェクションした２９３細胞を懸濁し、その懸濁液、および１０倍ないし１００倍希釈液（２９３細胞懸濁液にて希釈）を９６穴プレートに撒く。約２週間後に、２９３細胞内での組換えによって生じた組換えアデノウィルスの増殖が見られたウェルから、死滅細胞を含む培養液を取り出す。それを数回凍結融解し、アデノウィルス粒子を細胞から放出させる。その遠心上清液（１次ウィルス液）を、２４穴プレートにまいた２９３細胞に感染させる。３日後に死細胞を含む培養液を取り出し、一部は１次ウィルス液作成の要領で凍結融解し、遠心上清液を得る（２次ウィルス液）。残りの培養液を遠心し、細胞を得る。それよりＤＮＡを調製し、制限酵素切断によって組換えアデノウィルスＤＮＡの構造を検討し、目的の構造が確認されたクローンを選択する。その２次ウィルス液を用いて、より多量の２９３細胞に感染させ、その培養液を同様に凍結融解、遠心し、３次ウィルス液を得る。３次ウィルス液について、斎藤らの方法（鐘ヶ江ら、１９９４、バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法、４３−５８頁、羊土社）により、力価を測定し、ベクターとして利用できる（Ｍｉｙａｋｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、９３巻、１３２０−１３２４頁；Ｋａｎｅｇａｅら、１９９６、Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｊｐｎ、３８巻、１８２−１８８頁）。
他にも、例えばレトロウィルスベクター（脇本ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５０８−２５１３頁）、アデノ随伴ウィルスベクター（玉寄ら、１９９５、蛋白質核酸酵素、４０巻、２５３２−２５３８頁）などを用いることができる。これらは既に確立された方法で、効率的にベクターを生産できることが公知となっている。
哺乳動物に遺伝子導入可能なその他のベクターを製造するための詳細は、組換えワクシニアウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０２０６９、特公平６−９５９３７、特公平６−７１４２９が知られている。組換えパピローマウイルスを製造する方法としては特公平６−３４７２７、特表平６−５０５６２６が知られている。組換えアデノ随伴ウイルスを製造する方法としては、特開平５−３０８９７５が知られている。組換えアデノウイルスを製造する方法としては、特表平６−５０８０３９が知られている。
得られたウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入することにより、エピトープ結合β２ｍが発現し、この細胞または培養上清から目的のエピトープ結合β２ｍを得ることができる。回収されたエピトープ結合β２ｍは、抗原特異的細胞性免疫を誘導するために有用である。例えば、エピトープ結合β２ｍを抗原提示細胞に添加し、このエピトープを提示させることができる。また、抗原提示細胞にエピトープ結合β２ｍ発現ウイルスベクターを導入すれば、効率的に所望のエピトープを提示させることができる。エピトープはβ２ｍの所望の部位に結合させてよいが、例えば分泌後のβ２ｍ分子のＮ末端となるようにエピトープを結合させることが好ましい。このためには、β２ｍの分泌シグナル配列に続いてエピトープを結合し、場合によりスペーサー配列を介して、β２ｍ蛋白質を連結した融合蛋白質を製造すればよい。用いられるβ２ｍとしては特に制限はなく、所望の哺乳動物のβ２ｍ分子を用いることができる。ヒトへの適用のためにはヒトβ２ｍが好ましい。ヒトβ２ｍ遺伝子は例えば実施例に記載したようにして単離することができる。
また、哺乳動物細胞にエピトープ結合β２ｍと分泌型（または可溶型とも言う）のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖の両者の遺伝子を導入すれば、培養上清にＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体が分泌され容易に回収することができる。分泌型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入してもよいし、細胞の染色体ＤＮＡにこれをコードする遺伝子を組み込んだ上で発現させてもよい。分泌型のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖にビオチン化基質ペプチドを付加しておけば、ビオチン化したＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を、アビジンを用いて４量体化することが可能である。このようなテトラマーは、特にＣＴＬの検出および定量に有用である。
エピトープ結合β２ｍと膜結合型のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖の両者の遺伝子を導入すれば、細胞表面上に大量のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体が発現される。この細胞は、エピトープ特異的ＣＴＬに対し、優れた抗原提示能を有している。
ウイルスベクターを用いてＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を発現させる場合、用いるベクターとしては、上記のエピトープ結合β２ｍを発現するウイルスベクターと同様、特に制限はなく、所望のウイルスベクターを用いることができる。また、エピトープ結合β２ｍを発現するウイルスベクターにＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をコードする遺伝子を組み込み、同一のベクターからエピトープ結合β２ｍとＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を共発現させることもできる。本発明のベクターには、エピトープ結合β２ｍに加え他の外来遺伝子を発現する共発現ベクターも含まれる。ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖としては、特に制限はないが、ヒトへの適用のためにはヒトのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子（ＨＬＡ）が好ましい。実施例において本発明者らは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子としてＡ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を用い、エピトープとしては、Ａ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ分子によって提示されるＨＩＶ−１由来のエピトープを用いた。ヒトのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子はヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）と呼ばれ、非常に多様性に富んでいる。その中でＨＬＡ−Ａ＊２４０２という遺伝子型は日本人の約７割が持つ。本発明において用いられるＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖としては、Ａ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖、特にＨＬＡ−Ａ＊２４０２が、日本人への適用を考えた場合に好ましい。患者のＭＨＣ型に合わせてβ２ｍに融合させるエピトープおよび／またはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子を選択することにより、テーラーメイドの医療が可能となると考えられる。
本発明者らは、また、哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを用いると、細胞において所望の分泌型のマルチマー（多量体）蛋白質複合体を極めて効率的に製造することが可能であることを見出した。特に、本発明に従い哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを用いて、分泌型のホモまたはヘテロダイマーおよびホモまたはヘテロトライマーを高い効率で製造することが可能である。例えば内因的には細胞膜上に存在するヘテロマー蛋白質であっても、実施例で行ったように、その膜貫通領域を欠失させた蛋白質を該ウイルスベクターで発現させることにより、細胞外に分泌させることが可能である。本発明に従ってダイマーまたはトライマー等の分泌型マルチマーの製造を行う場合には、マルチマーの成分となる蛋白質を、哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを用いて発現させる。これらの成分蛋白質は全てを哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターで発現させてもよいし、細胞において内因性に幾つかの成分が十分量発現している場合などにおいては、発現量の少ない成分など一部の成分蛋白質のみを哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを用いて発現させてもよい。この方法を用いて製造する分泌性マルチマーとして最も好ましいものの１つはＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体である。これは、αおよびβの２本鎖の重鎖からなるヘテロダイマーで、α鎖またはβ鎖のどちらかに、上記のエピトープ結合β２ｍまたはエピトープ結合ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖と同様にエピトープを融合させ、エピトープ結合β２ｍまたはエピトープ結合ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖の場合と同様の方法に従って複合体を製造することが可能である。また、本方法を用いて製造する分泌性マルチマーとしてはＴ細胞受容体なども好ましい。これらの他には、例えばヘテロまたはホモダイマーあるいはヘテロまたはホモトライマーの形態をとる種々のサイトカインおよびケモカイン等が挙げられる。具体的には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−３、ＩＬ−５、およびＧＭ−ＣＳＦなどのヘテロダイマーまたはヘテロトライマー、およびＮＫ受容体のようなホモダイマーなどが挙げられるが、これらに制限されない。すなわち本発明は以下の発明も提供する。
〈１〉分泌性マルチマーの成分を発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクター。
〈２〉哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、〈１〉に記載のウイルスベクター。
〈３〉パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〈２〉に記載のウイルスベクター。
〈４〉分泌性マルチマーが、分泌性ホモまたはヘテロダイマーまたは分泌性ホモまたはヘテロトライマーである、〈１〉から〈３〉のいずれかに記載のウイルスベクター。
〈５〉分泌性マルチマーが、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体、Ｔ細胞受容体、ＮＫ受容体、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−３、ＩＬ−５、およびＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される分泌性マルチマーである、〈４〉に記載のウイルスベクター。
〈６〉分泌性マルチマーが、エピトープが結合されたＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ複合体である、〈５〉に記載のウイルスベクター。
〈７〉分泌性マルチマーの生産方法であって、（ａ）〈１〉から〈６〉のいずれかに記載のウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、および（ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、分泌性マルチマーを回収する工程、を含む方法。
〈８〉〈７〉に記載の方法により生産された分泌性マルチマー。
〈９〉〈１〉から〈６〉のいずれかに記載のウイルスベクターが導入された哺乳動物細胞。
本発明において特に好適な哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターは、パラミクソウイルスベクターである。「パラミクソウイルスベクター」とは、パラミクソウイルスに由来し遺伝子を宿主細胞に導入するベクター（担体）を指す。パラミクソウイルス科に属するセンダイウイルス（ＳｅＶ）は最近、遺伝子導入ベクターとして開発が進められている（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５９８，１９９７；国際公開番号９７／１６５３８号および国際公開番号９７／１６５３９号）。ＳｅＶベクターは毒性が低く、導入した遺伝子から発現される蛋白質量が極めて高い。また、ベクター内の遺伝子が宿主染色体へ導入されることがないため、安全性にも優れている。ＳｅＶベクターのゲノムの安定性は高く、異種遺伝子発現の結果ではウイルスを連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２，４５７−４６６（１９９７））。また、カプシド構造タンパク質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。複製能を有するＳｅＶベクターは、外来ＤＮＡを少なくとも４ｋｂｐまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事が可能である。ＳｅＶのレプリコンをベースにしたベクターは複製されたウイルスが周囲の細胞にも再感染し、感染細胞の細胞質で多コピーに複製されたＲＮＰが細胞の分裂に伴い娘細胞にも分配されるため持続発現が期待される。また、ＳｅＶベクターは非常に広い組織適用範囲を持つ。
また、安全性の面においても、ヒト病原性が否定されているためパラミクソウイルスベクターはヒトへの遺伝子治療の臨床試験に好適に用いられうることが示唆される。第一に、プラスミドＤＮＡ等による導入遺伝子の発現は、多くの場合、導入したＤＮＡの核局在化または核膜の消失が必要であることが、遺伝子発現の成功率を低下させる主要な障害になっている。しかし、例えばセンダイウイルスなどの場合、外来遺伝子の発現は、細胞質内において細胞性チューブリンおよび自身が持つＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ蛋白質）の両方によってウイルスゲノムの複製に伴って駆動される。これは、センダイウイルスが宿主の染色体と相互作用しないことを示しており、染色体異常による癌化や不死化などの安全面における問題が生じないと考えられる。第二に、センダイウイルスは齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、ヒトに対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １５：５３３−５４０，１９９７）。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスベクターが、ヒトの治療へ応用しうることを示唆し、センダイウイルスベクターが、エピトープ結合β２ｍのインビボまたはエクスビボでの発現を目的とした遺伝子治療における有望な選択肢の一つとなることを支持するものである。
本発明のパラミクソウイルスベクターはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）であってもよく、また、感染力を持つウイルス粒子であってもよい。ここで「感染力」とは、組み換えパラミクソウイルスベクターが細胞への接着能および膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベクター内部の遺伝子を導入することのできる能力を言う。本発明のパラミクソウイルスベクターは、複製能を有していてもよく、あるいは複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。宿主細胞としては、例えばＬＬＣ−ＭＫ２またはＣＶ−１等が挙げられる。以下にパラミクソウイルスベクターを例に本発明を詳細に説明するが、本発明のウイルスベクターとしてはパラミクソウイルスベクターに制限されず、以下の記載を基にして他のウイルスベクターも同様に作製することができる。
本発明において「パラミクソウイルス」とはパラミクソウイルス科に属するウイルスまたはその誘導体を指す。本発明を適用可能なパラミクソウイルスとしては、例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソ亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルス、より好ましくはレスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（パラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ；マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウイルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明のパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などであり得る。ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウイルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も、本発明のウイルスベクターを製造するための材料として使用することができる。
パラミクソウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子が含まれる。「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
レスピロウイルス属 ＮＰ Ｐ／Ｃ／Ｖ Ｍ Ｆ ＨＮ − Ｌ
ルブラウイルス属 ＮＰ Ｐ／Ｖ Ｍ Ｆ ＨＮ （ＳＨ） Ｌ
モービリウイルス属 ＮＰ Ｐ／Ｃ／Ｖ Ｍ Ｆ Ｈ − Ｌ
例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のレスピロウイルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）属に分類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。なお、本発明において「遺伝子」とは遺伝物質を指し、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸が含まれる。遺伝子の由来に制限はなく、天然または人為的に設計された配列に由来するものであり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。
本発明に用いるパラミクソウイルスベクターとしては、特に制限はないが、好適なパラミクソウイルスベクターとして、例えば、複製能を有し、自立的に増殖するようなベクターが挙げられる。例えば、一般に天然型パラミクソウイルスのゲノムは、３’の短いリーダー領域に続き、Ｎ（ヌクレオキャプシド）、Ｐ（ホスホ）、Ｍ（マトリックス）、Ｆ（フュージョン）、ＨＮ（ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ）、およびＬ（ラージ）蛋白質をコードする６つの遺伝子が並んでおり、短い５’トレイラー領域を他端に有する。これと同様の構造を有するゲノムを設計することにより、自律複製可能な本発明のベクターを製造することができる。ゲノム内にエピトープ結合β２ｍおよび／またはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をコードする遺伝子を挿入することにより、これらの蛋白質を発現するベクターを製造することができる。なお、本発明のパラミクソウイルスベクターにおいては、ベクター上のウイルス遺伝子の配置は野生型ウイルスから改変されていてもよい。
また、本発明に用いるパラミクソウイルスベクターとしては、野生型パラミクソウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってもよい。例えば、センダイウイルスベクターを再構成させる場合、ＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ遺伝子から作られる蛋白質群がトランスに必要だと考えられているが、該蛋白質群をコードする遺伝子自体は、本発明のウイルスベクターに含まれていなくてもよい。例えば、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、ベクターゲノムをコードする発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ベクターの再構成を行うことができる。また、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する宿主細胞にベクターゲノムをコードする発現ベクターを導入し、該宿主細胞から該蛋白質群を供給して再構成を行ってもよい。これらの蛋白質群のアミノ酸配列は、ウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、パラミクソウイルスベクターが細胞に伝播してゆくためには、Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子から作られる蛋白質群が必要だと考えられているが、パラミクソウイルスベクターをＲＮＰとして調製する場合は、これらの蛋白質は必要ない。ＲＮＰに含まれるゲノムに、Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子が含まれていれば、宿主に導入された時に、これらの遺伝子産物が生産され、感染性のあるウイルス粒子が形成される。感染性ウイルスを産生するＲＮＰベクターとしては、例えばＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子をコードするウイルスゲノムＲＮＡと、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質とを含むＲＮＰが挙げられる。このようなＲＮＰを細胞内に導入すると、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、およびＬ蛋白質の働きによりウイルスゲノムが発現、複製され、感染性ウイルスベクターが増幅する。このように、パラミクソウイルスベクターの再構成の過程などで形成されるＲＮＰをＬＬＣ−ＭＫ２細胞などの宿主細胞に導入して培養することにより、パラミクソウイルスベクターを増幅することもできる。この過程は、（ａ）パラミクソウイルスに由来するネガティブ鎖一本鎖ＲＮＡ、並びにＮＰ、Ｐ／Ｃ、およびＬ蛋白質からなる複合体を細胞に導入する工程、および（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収する工程、を含む。
ＲＮＰを細胞に導入するには、例えばリポフェクトアミンやポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３０１５）。複製型ウイルスの場合、産生されたウイルスは、培養細胞、鶏卵、個体（例えばマウスなどの哺乳動物）などに再感染させて増幅または継代することができる。
また、Ｍ、Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子が含まれていないパラミクソウイルスベクターも、本発明のパラミクソウイルスベクターとして用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはこれらのいずれかの遺伝子を欠損しているため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子および／またはＨＮ遺伝子が挙げられる。例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ／ＣおよびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０）。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いて製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
また、本発明のウイルスベクターとして、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をベクターのエンベロープに含むベクターを作製することもできる。例えば、ウイルス再構成の際に、ベクターのベースとなるウイルスのゲノムがコードするエンベロープタンパク質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有するウイルスベクターを製造することができる。このようなタンパク質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。本発明のウイルスベクターには、ＶＳＶ−Ｇタンパク質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。
また、本発明のウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラタンパク質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体などの遺伝子）の発現により供給されてもよい。
また、本発明のウイルスベクターは、例えばベクターに由来するウイルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウイルス遺伝子が改変されたものであってもよい。具体的には、例えばパラミクソウイルスベクターにおいては、複製因子であるＮＰ遺伝子、Ｐ／Ｃ遺伝子およびＬ遺伝子の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、膜融合に関わるＦ蛋白質を改変することにより、膜融合リポソームの融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質やＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたパラミクソウイルスを作製することもできる。
またパラミクソウイルスベクターにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、本発明のパラミクソウイルスベクターとして特に好適である。
エピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖などの外来遺伝子を含む組み換えパラミクソウイルスベクターは、上記のパラミクソウイルスベクターゲノムにこれらの遺伝子を挿入することによって得られる。β２ｍおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖としては、天然型蛋白質をコードする遺伝子を用いてもよく、また天然型蛋白質と同等の機能、すなわち、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の形成活性、あるいはこの複合体の細胞傷害性Ｔ細胞による認識またはこの複合体によるＣＴＬの活性化などの機能を有する蛋白質をコードする限り、欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子を用いてもよい。ウイルスベクターＤＮＡに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウイルスベクターＤＮＡにおいては、転写終結（Ｅ）配列と転写開始（Ｓ）配列との間などに、６の倍数の塩基数を有する配列を挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．８，１９９３，ｐ．４８２２−４８３０）。外来遺伝子は、ウイルスの各遺伝子（ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子）の前および／または後ろに挿入することができる。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜Ｅ−Ｉ−Ｓ配列（転写開始配列−介在配列−転写終結配列）またはその部分を挿入し、各遺伝子の間にＥ−Ｉ−Ｓ配列のユニットが配置されるようにする。あるいは、ＩＲＥＳを介して外来遺伝子を挿入し得る。
挿入した遺伝子の発現量は、その遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（国際公開番号ＷＯ０１／１８２２３）。また、遺伝子挿入の位置、および遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、センダイウイルスにおいては、挿入位置がウイルスゲノムのネガティブ鎖ＲＮＡの３’端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、ＮＰ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が高い。挿入遺伝子の高い発現を得るためには、挿入遺伝子をＮＰ遺伝子の上流（ネガティブ鎖においては３’側）またはＮＰ遺伝子とＰ遺伝子の間など、上流領域（ネガティブ鎖ゲノムにおいて３’側）に挿入することが好ましい。逆に、挿入位置がネガティブ鎖ＲＮＡの５’端に近いほど（野生型ウイルスのゲノム上の遺伝子配置においては、Ｌ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も５’側、すなわち野生型ウイルスゲノムにおいてはＬ遺伝子の下流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の５’隣接部位）、またはＬ遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてはＬ遺伝子の３’隣接部位）に外来遺伝子を挿入する。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルスタンパク質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。例えば、高力価ウイルスベクターの投与による導入遺伝子の高発現が毒性を示す場合は、投与するウイルス力価を制限することができる他、例えばベクターにおける挿入遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖のなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、個々のウイルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な発現量または治療効果が得られるすることも可能である。
一般に、細胞毒性を示さない限りにおいて、エピトープ結合β２ｍの高い発現が得られれば、効率的な蛋白質の産生や免疫誘導などにおいて有利と考えられるため、エピトープ結合β２ｍをコードする遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。好適なベクターの例としては、エピトープ結合β２ｍをコードする遺伝子が、パラミクソウイルスベクターのネガティブ鎖ゲノムにおいて、該パラミクソウイルスのウイルス蛋白質のいずれよりも３’側に配置されているベクターが挙げられる。例えばＮ遺伝子の上流（ネガティブ鎖においてＮ遺伝子コード配列の３’側）に外来遺伝子が挿入されたベクターが好ましい。あるいは、Ｎ遺伝子のすぐ下流に挿入してもよい。
外来遺伝子を容易に挿入できるようにするために、ゲノムをコードするベクターＤＮＡ中の挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。また、本発明のベクターは、このようにエピトープ結合β２ｍ遺伝子を挿入した以外の位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。このような外来遺伝子としては制限はない。例えばケモカインまたはサイトカイン遺伝子であってもよく、また、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖の遺伝子、その他の遺伝子であってもよい。
例えば外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスベクターは、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
まず、目的の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、外来遺伝子を、ＮｏｔＩ部位を利用してウイルスゲノムをコードするＤＮＡに挿入する場合を例にとって説明する。目的とするｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅回収する。増幅された断片の両端をＮｏｔＩ部位とし、さらに一端にセンダイウイルスの転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）（ＥＩＳ配列）のコピーを付加するために、ＮｏｔＩ制限酵素切断部位配列及び転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対として、フォワード側（センス鎖）合成ＤＮＡ配列及びリバース側（アンチセンス鎖）合成ＤＮＡ配列（プライマーセット）を作成する。
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、ＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを含め、ｃＤＮＡの相補鎖塩基配列と後述するセンダイウイルスに由来するセンダイウイルスゲノムのＥＩＳ塩基配列の合計が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ ｏｆ ｓｉｘ）」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１−８９９，１９９８；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３；Ｃａｌａｉｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｒｏｕｘ，Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４８２２−４８３０，１９９３）。さらに挿入断片の３’側にセンダイウイルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１）、Ｉ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＡＡＧ−３’、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：２）、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終始コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とする。
ＰＣＲは、例えば、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくはＶｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて行い、増幅した目的断片はＮｏｔＩで消化した後、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、ゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにウイルスゲノムｃＤＮＡ中のＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
例えば、組み換えセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６，１９９７；Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７）。例えば、まずＮｏｔＩ制限部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）（配列番号：３）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮ−タンパク質をコードする配列の５’末端との間の隣接遺伝子座に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒａｎｄ）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２８１３−２８２０）。ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることができる。
このベクターに、エピトープ結合β２ｍをコードするＤＮＡを挿入する。本発明において用いるエピトープに制限はなく、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に対して治療効果を有する所望のエピトープ等を用いることができる。エピトープは、一般的には約１０アミノ酸のペプチドを用いることが好ましいが、エピトープとするペプチドの長さは適宜変えることができる。エピトープ結合β２ｍは、例えばβ２ｍの分泌シグナルに続き、エピトープを連結させ、さらに適当な長さのスペーサー配列を介してβ２ｍに連結させた蛋白質とすることができる。あるいは、スペーサーを介さず、エピトープを直接β２ｍと連結してもよい。スペーサーのアミノ酸配列に特に制限はないが、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１３）からなるアミノ酸配列またはその繰返しである（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_ｎ等を含むペプチドを用いることが好ましい。繰返し回数（ｎ）に制限はないが、例えば１〜５（１、２、３、４、または５）にすることができる。スペーサーを用いる場合、その長さは好ましくは１６アミノ酸以内であり、例えば４アミノ酸、８アミノ酸、または１６アミノ酸等を例示することができる。
このようにして作製した組み換えパラミクソウイルスベクターＤＮＡに、適当な転写プロモーターを連結したＤＮＡを構築し、これを試験管内または細胞内で転写させ、パラミクソウイルスのＬ、Ｐ、およびＮＰタンパク質の共存下でＲＮＰを再構成させることにより、このＲＮＰを含むウイルスベクターを生成させることができる。本発明は、本発明のパラミクソウイルスベクターのゲノムをコードするＤＮＡを転写させる工程を含む、該ウイルスベクターの製造方法を提供する。また本発明は、該ＤＮＡからなる、本発明のパラミクソウイルスベクター製造用ＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のパラミクソウイルスベクターを製造するための、該ベクターのゲノムをコードするＤＮＡの使用に関する。ウイルスベクターＤＮＡからのウイルスの再構成は公知の方法に従って行うことができる（国際公開９７／１６５３９号；国際公開９７／１６５３８号；Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ．Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：４１９５−４２０３；Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ，Ｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ，Ａ．ａｎｄ Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｒ．Ｍ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９３：１５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含む所望のパラミクソウイルスベクターおよびその他の（−）鎖ＲＮＡウイルスベクターをＤＮＡから再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
パラミクソウイルスベクターは、通常、（ａ）パラミクソウイルスに由来するネガティブ鎖一本鎖ＲＮＡまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするベクターＤＮＡを、ＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞（ヘルパー細胞）で転写させ、（ｂ）該細胞を培養し、その培養上清からウイルス粒子を回収することにより調製することができる。ベクターＤＮＡから転写されたＲＮＡはＮＰ、Ｌ、およびＰタンパク質とＲＮＰ複合体を形成し、さらにエンベロープ蛋白質を含む外殻に包まれたウイルス粒子が形成する。
ヘルパー細胞で発現させる、ウイルスゲノムをコードするＤＮＡ（ベクターＤＮＡ）は、ゲノムのマイナス鎖（ネガティブ鎖ＲＮＡ）またはその相補鎖（ポジティブ鎖ＲＮＡ）をコードしている。例えば、ネガティブ鎖一本鎖ＲＮＡまたはその相補鎖をコードするＤＮＡをＴ７プロモーターの下流に連結させ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡに転写させる。プロモータとしては、Ｔ７ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させたＲＮＡをヘルパー細胞にトランスフェクトしてもよい。細胞内で転写させる鎖は、ウイルスゲノムのポジティブ鎖でもネガティブ鎖でもよいが、ポジティブ鎖が転写されるようにすることが再構成の効率を上げるためには好ましい。
例えば、ベクターＤＮＡを細胞内に導入する方法には、次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｊ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，Ｓ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を２〜４％ＣＯ_２、３５℃、１５〜２４時間、２）ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）沈殿混液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｄ−９８８５Ｍ．Ｗ．５×１０^５）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼や▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのＤＮＡの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適にはＳｕｐｅｒｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ Ｎｏ．３０１３０５）、またはＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｃａｔ Ｎｏ．１８１１１６９）が用いられるが、これらに制限されない。
ｃＤＮＡからの再構成は具体的には次のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿等で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２を７０〜８０％コンフルエントになるまで培養し、例えば１μｇ／ｍｌ ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下ＵＶ照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９，１９９６）を２ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間は適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜５μｇの上記の組換えセンダイウイルスｃＤＮＡを、全長センダイウイルスゲノムの生成に必須なトランスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミド（２４−０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、１２−０．２５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および２４−０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｌ、より好ましくは例えば１μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９，１９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションして培養する。または、培養上清を回収し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の培養液に添加して感染させ培養する。培養３〜７日後に培養液を回収する。あるいは、上記の凍結融解による細胞破砕物を１０日齢の発育鶏卵の尿膜内へ接種し、約３日後、尿液を回収してもよい。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞に重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。培養上清または尿液に含まれるウイルス力価は赤血球凝集活性（ＨＡ）を測定することにより決定することができる。ＨＡは「ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ希釈法」（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９；Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．＆ Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｄ．ｂｙ Ｂａｋｅｒ ＡＨ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：ｐｐ．２９５−３０６，１９９９）により決定することができる。混入し得るＴ７ポリメラーゼ発現ワクシニアウイルスを除去するために、得られた尿液試料を適宜希釈（例えば１０^６倍）して、鶏卵で再増幅させることができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返すことができる。得られたウイルスストックは−８０℃で保存することができる。
ウイルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウイルスベクター等の再構成においては、ＬＬＣＭＫ２細胞、サル腎由来のＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープタンパク質を発現させることで、その蛋白質をエンベロープに含む感染性ウイルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪，ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビュー社，ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。
例えば、Ｆ蛋白質を欠失したセンダイウイルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。
〈１〉Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡおよびＦ発現プラスミドの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）全長ゲノムｃＤＮＡ、ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：２８１３−２８２０）（「ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）は 「ｐＳｅＶ１８^＋」ともいう）のｃＤＮＡをＳｐｈＩ／ＫｐｎＩで消化してフラグメント（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ欠損部位の構築はこのｐＵＣ１８／ＫＳ上で行う。Ｆ遺伝子の欠損は、ＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（ＡＴＧ−ＴＧＡ＝１６９８ｂｐ）を除いて例えばａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：４）で連結し、Ｆ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ）を構築する。ＰＣＲは、Ｆの上流には（ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ／配列番号：５，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ／配列番号：６）、Ｆ遺伝子の下流には（ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ／配列番号：７，ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ／配列番号：８）のＰＣＲ産物をＥｃｏＴ２２Ｉで連結する。このように得られたプラスミドをＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、Ｆ欠損部位を含む領域の断片（４９３１ｂｐ）を回収してｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳとする。このｐＵＣ１８／ｄＦＳＳをＤｒａＩＩＩで消化して、断片を回収してｐＳｅＶ１８^＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦを得る。
外来遺伝子は、例えばｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ欠失部位にある制限酵素ＮｓｉＩおよびＮｇｏＭＩＶ部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、ＮｓｉＩ−ｔａｉｌｅｄプライマーおよびＮｇｏＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマーで増幅すればよい。
〈２〉ＳｅＶ−Ｆ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築はＳｅＶ−Ｆ遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｃｒｅ ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，１９９８，ｐ１１１５−１１２１）のユニークサイトＳｗａＩ部位に増幅産物を挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを構築する。
Ｆ欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ_２で培養する。ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Ｃｒｅ ＤＮＡリコンビナーゼによりＦ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入を行う。
１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆをトランスフェクション後、１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ １枚、２ｍｌ ２枚、０．２ｍｌ ２枚に蒔き、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
Ｆ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３８１６−３８２１（１９９５）；Ａｒａｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１１１５−１１２１（１９９８））により例えばｍｏｉ＝２または３で感染させて行う。
〈３〉Ｆ欠失ＳｅＶウイルスの再構築及び増幅
上記ｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦの外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで１００ｍｍペトリ皿に蒔き、２４時間培養後、ソラレンと長波長紫外線（３６５ｎｍ）で２０分間処理したＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８１２２−８１２６（１９８６））に室温で１時間感染させる（ｍｏｉ＝２）（ｍｏｉ＝２〜３、好適にはｍｏｉ＝２が用いられる）。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブを５本が装備されたＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ），ストラタジーン社，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いる。細胞を３回洗浄してからプラスミドｐＳｅＶ１８^＋／ΔＦ−ＧＦＰ、ｐＧＥＭ／ＮＰ、ｐＧＥＭ／Ｐ、及びｐＧＥＭ／Ｌ（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ，，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １，５６９−５７９（１９９６））をそれぞれ１２μｇ，４μｇ，２μｇ，及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比でＯｐｔｉＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（１μｇ ＤＮＡ／５μｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ，ＱＩＡＧＥＮ）を入れて混合し、室温で１０分間放置後、最終的に３％ＦＢＳを含むＯｐｔｉＭＥＭ ３ｍｌに入れ、細胞に添加して培養する。３時間培養後、細胞を、血清を含まないＭＥＭで２回洗浄し、シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド４０μｇ／ｍｌ（ＡｒａＣ，Ｓｉｇｍａ），トリプシン７．５μｇ／ｍｌ（ＧＩＢＣＯ）を含むＭＥＭで７０時間培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭに懸濁する（１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。凍結融解を３回繰り返してｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ）と混合し（１０^６ｃｅｌｌｓ／２５μｌ ＤＯＳＰＥＲ）室温で１５分放置した後、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞の一つＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞にトランスフェクション（１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ １２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ ＡｒａＣ，７．５μｇ／ｍｌトリプシンを含む）で培養し、上清を回収する。
欠損型ウイルスベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウイルスゲノム上で欠損しているエンベロープ遺伝子が異なる２種のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するエンベロープタンパク質が、もう一方のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、エンベロープタンパク質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのエンベロープ遺伝子欠損型ウイルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、エンベロープ遺伝子が欠損しているため、エンベロープ遺伝子を欠損していないウイルスに比べゲノムサイズが小さくなり長い外来遺伝子をより安定に保持することができる。また、元々感染性のないこれらのウイルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
なお、複製性のパラミクソウイルスベクターを個体や細胞に投与後、治療が完了するなどウイルスベクターの増殖を抑止する必要が生じた際には、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウイルスベクターの増殖だけを特異的に抑止することもできる。
回収したパラミクソウイルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーや安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
エピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターは、哺乳動物細胞に導入することにより、該細胞でエピトープ結合β２ｍを発現・分泌させることができる。本発明は、エピトープ結合β２ｍの生産方法であって、（ａ）エピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、および（ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、エピトープ結合β２ｍを回収する工程、を含む方法を提供する。
また、哺乳動物細胞で発現したエピトープ結合β２ｍは、細胞自身が持つか、あるいは外来的に発現されたＭＨＣ分子とヘテロダイマーを形成する。これを回収して、エピトープ結合β２ｍを含む蛋白質複合体を得ることができる。特に本発明は、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖、およびエピトープ結合β２ｍを含む、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の生産方法であって、（ａ）エピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、および（ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、生成したＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を回収する工程、を含む方法を提供する。ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を調製する場合、より好ましくは、哺乳動物細胞で外来的にＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を高発現させ、この重鎖とエピトープ結合β２ｍの複合体を形成させる。例えばＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を発現するウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する。ウイルスベクターとしては、特に制限はないが、パラミクソウイルスベクターを好適に用いることができる。あるいは、他のベクターを用いてもよい。または、哺乳動物細胞の染色体にベクターを組み込み、恒常的または誘導的に所望のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を発現するようにした細胞を用いることもできる。これにより、所望のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を細胞内で大量発現させ、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を調製することが可能である。また、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体は、別々に調製したエピトープ結合β２ｍとＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖とを結合させることにより調製することもできる。
発現させるＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖としては膜結合型であってもよく分泌型（または遊離型）であってもよい。また、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖は、野生型蛋白質であってもよく、アミノ酸配列が改変された蛋白質であってもよい。分泌型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖は、膜結合領域を欠失させた蛋白質を発現させることにより作製することができる。また、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖には所望のペプチドを付加することもできる。例えば、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖にビオチン化基質ペプチドを付加しておけば、これを発現させ、得られたＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体をビオチン化した後で、アビジンを用いてＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド４量体を簡便に調製することが可能である。
本発明において「ビオチン化基質ペプチド」とはビオチン化の基質となり得るペプチドを言う。ビオチン化基質ペプチドとしては特に制限はなく、例えば−ＮＨ_２がアミノ酸残基として化学反応可能な状態で配列しているペプチドであればどのようなものも利用可能である。例えば反応試薬にＡｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ社のＢｉｏｔｉｎ ｈｙｄｒａｚｉｄｅを用いるならば糖部分に化学修飾可能であり、Ｂｉｏｔｉｎ ＨＮＳを用いるならばリジンの−ＮＨ_２に化学修飾可能であり、Ｂｉｏｔｉｎ ＢＭＣＣを用いるならば−ＳＨに化学修飾可能であり、５−（Ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）−Ｐｅｎｔｙｌａｍｉｎｅ ＥＺ−Ｌｉｎｋを用いるならば−ＣＯＯＨに化学修飾可能である。好ましくは、ビオチン化基質ペプチドは酵素的にビオチン化され得るペプチドである。例えば、アミノ酸（例えばリジン）に特異的に１つのビオチンを付加する酵素（ビオチンライゲース）の基質となるペプチドが好適である。このような酵素としては、例えばＢｉｒ Ａという大腸菌由来のビオチンライゲースが挙げられる。Ｂｉｒ Ａは１３アミノ酸からなるペプチド配列を認識し、その中央にあるリジンにビオチンを１つ付加することができる。Ｂｉｒ Ａの基質となるペプチド配列は複数存在するが、例えばＬＧＧＩＦＥＡＭＫＭＥＬＲＤ（配列番号：３１）などが挙げられる（Ｓｃｈａｔｚ，Ｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１，１１３８−１１４３（１９９３）；Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｆ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：６７５−６８２（１９９８））。
このようなＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド４量体を作製するには、（ａ）ビオチン化基質ペプチドを含むＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をビオチン化する工程、および（ｂ）ビオチン化ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をアビジンの存在下で会合させる工程を含む方法により行うことができる。具体的には、例えばＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖にＢｉｒ Ａ基質ペプチド（ＢＳＰ）配列を付加しておき、このＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を含むＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を調製する。その後、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をＢｉｒ Ａ酵素によりビオチン化する。ＦＰＬＣ等により、ビオチン付加ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を精製し、ストレプトアビジンのビオチン化部位と１：１になるように反応させることにより多量体化することができる。ストレプトアビジンは、適宜、Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）、Ｃｙ５等により標識することができる。４量体化したＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体はＣＴＬ（エピトープ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞）への結合能が高まるため、ＣＴＬ（エピトープ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞）の検出や定量に極めて有用である。ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド多量体が結合した細胞は、ＦＡＣＳ等により検出することができる。
すなわち本発明は、本発明のベクターあるいは該ベクターを用いて発現させたエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を利用した抗原特異的Ｔリンパ球の検出および定量方法に関する。また本発明は本発明のベクター、あるいは該ベクターを用いて製造したエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む抗原特異的Ｔリンパ球の検出薬を提供する。また本発明は、本発明のベクター、あるいは該ベクターを用いて製造したエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の、抗原特異的Ｔリンパ球の検出のための使用を提供する。
例えば、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチドテトラマーを用いれば、エピトープ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の定量を高感度でかつ簡便に実施することができる。このテトラマーを用いた抗原特異的Ｔリンパ球の検出方法は、該テトラマーをＴリンパ球を含む試料中に存在させる工程、および、該テトラマーが結合した細胞を検出する工程、を含む方法である。該テトラマーが結合した細胞を定量することにより、抗原特異的Ｔリンパ球を定量することができる。
個体の中でのエピトープ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の定量は、例えばＨＩＶ由来のエピトープに対しては、ＨＩＶ感染者のＰＢＭＣ １×１０^６に対して、ＨＩＶエピトープを提示するテトラマーをＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の量にして２０μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で１５分、４℃で２０分反応させる。このとき最適なテトラマーの量と反応温度は各テトラマーによって異なるので適宜調整する。その後抗ＣＤ８抗体−ＡＰＣで重染色し、フローサイトメトリーを用いて解析すると、全ＣＤ８陽性Ｔ細胞中のテトラマー陽性細胞の頻度を得られる。ＰＢＭＣに限らず、リンパ節など組織から分離した細胞でも同様に定量できる。
上記の要領でテトラマーで染色した細胞をさらに抗ＰＥ抗体−マグネットビーズ（第一化学薬品）にてさらに染色し、磁気細胞分離装置（第一化学薬品）を用いてエピトープ特異的細胞を分離することが可能である。このように、本発明のテトラマーはエピトープ特異的細胞の分離にも有用である。すなわち、本発明のテトラマーをＴリンパ球を含む試料中に存在させる工程、および、該テトラマーが結合した細胞を分離する工程により、抗原特異的Ｔリンパ球を単離することができる。
また、本発明のベクターあるいは該ベクターを用いて発現させたエピトープ結合β２ｍは、インビトロにおけるＣＴＬアッセイに利用することもできる。ＣＴＬアッセイの標的細胞としては、通常ＣＴＬと同一個体由来の細胞株、例えばエプシュタインーバールウイルス（ＥＢＶ）を用いてｔｒａｎｓｆｏｒｍしたＢ細胞株（ａｕｔｏ−ｌｙｍｏｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ａｕｔｏ−ＬＣＬ）を合成ペプチドでパルスしたものが用いられるが、合成ペプチドの代わりに本発明のベクターにより製造したエピトープ結合β２ｍを添加したり、あるいは合成ペプチドの代わりにエピトープ結合β２ｍ発現ウイルスベクターをａｕｔｏ−ＬＣＬに感染させることによって標的細胞として使用することができ、実際に細胞傷害活性が確認された。またヒトの細胞株を使用する場合、目的のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖（膜結合型）を発現するウイルスベクターとそのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖によって提示されるエピトープ結合β２ｍを発現するウイルスベクターを重感染させることによって同様に標的細胞として使用することができる。
また、エピトープ結合β２ｍはエピトープ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の樹立に使用することができる。エピトープ特異的ＣＴＬは、試験管内で１回〜数回特異的な刺激を加えることによって樹立できる。例えばＨＩＶ Ｎｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬを樹立する場合、ＨＩＶ−１感染者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、放射線照射によって増殖不能にしＨＩＶ Ｎｅｆ１３８−１０ペプチドでパルスしたｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（同一個体由来の細胞）で刺激を加え、ＩＬ−２存在下で共培養することによって可能となる。この時、通常合成ペプチドを使用するが、本発明のエピトープ結合β２ｍを発現するウイルスベクターを感染させた細胞の培養上清（すなわち遊離型エピトープ結合β２ｍ蛋白質）でも同様の効果が見られた。また、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞にエピトープ結合β２ｍ発現ウイルスベクターを感染させることによっても同様にＣＴＬを樹立できる。
さらに、本発明のエピトープ結合β２ｍおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体（１量体または多量体）を、例えばビオチン−アビジンの結合を利用する方法以外の方法でプロテインチップの支持基材に結合し、プロテインチップとして用いることも可能である。
ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖としては、特に制限はないが、ヒトへの適用のためにはヒトのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子が好ましい。ヒトのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子はヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）と呼ばれ、非常に多様性に富んでいる。本発明において用いるＨＬＡは、これらのいずれの分子でもよい。例えば感染症や癌などにおいて目的のエピトープが判明しているいずれのＨＬＡ型にも本発明を適用することが可能であり、オーダーメイド（あるいはテーラーメイド）な試薬とすることができる。
特に日本においては、ＨＬＡ−Ａ２４（約６〜７割）、ＨＬＡ−Ａ２（約４割）、及びＨＬＡ−Ａ２６（約２割）などのＨＬＡ型の頻度が高く、次いで、ＨＬＡ−Ａ１１（２割）、−Ａ３１（２割弱）、−Ａ３３（２割弱）の頻度も高い。これらのＨＬＡは、日本人への適用を考えた場合に特に好ましい。
ある程度の不特定多数に対応した試薬および医薬の開発のためには、例えば日本であれば、日本人において５％以上のアレル頻度のＨＬＡ（すなわち１０％以上の日本人が有している）が好ましい。このようなＨＬＡ型としては以下のものが挙げられる。

実施例において本発明者らは、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子としてＡ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を用い、エピトープとしては、Ａ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ分子によって提示されるＨＩＶ−１由来のエピトープを用いた。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２という遺伝子型は日本人の約６−７割が持つ。従って、Ａ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖、特にＡ＊２４０２（Ｌｉｔｔｅ，Ａ．−Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：４１−４５（１９９２））は、本発明において好適である。
本発明により得られるエピトープ結合β２ｍおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体は、抗原特異的細胞性免疫を誘導するために使用することができる。本発明は、本発明により得られるエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む、抗原特異的細胞性免疫の誘導剤を提供する。また本発明は、本発明により得られるエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の抗原特異的細胞性免疫を誘導するための使用に関する。
本発明者らはＳｅＶの発現系にてＨＬＡ−Ａ＊２４０２によって提示されるＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク由来のエピトープを例にエピトープ結合β２ｍを作製し、これが分泌型蛋白質の形で細胞表面上のＨＬＡ−Ａ＊２４０２分子と結合し、ＣＴＬに効率良く抗原を提示できることを証明した。本発明のウイルスベクターにより産生されるエピトープ結合β２ｍはタンパク製剤として利用できる可能性が示され、これを精製しウイルスの混入を除去すれば、臨床応用に有用な抗原特異的細胞性免疫誘導剤を得ることが可能である。本発明は、本発明のウイルスベクターにより産生されるエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む医薬組成物を提供する。
本発明のエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を用いて抗原特異的細胞性免疫を誘導する方法は、具体的には、本発明のエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を（エピトープ特異的）ＣＤ８陽性Ｔ細胞に接触させる工程を含む方法である。
例えば、インビトロでのエピトープ特異的ＣＴＬ細胞株の樹立において、本発明のエピトープ結合β２ｍは有用である。エピトープ特異的ＣＴＬは、試験管内で１回〜数回特異的な刺激を加えることによって樹立できる。例えばＨＩＶ Ｎｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬを樹立する場合、ＨＩＶ−１感染者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、放射線照射によって増殖不能にし、ＨＩＶ Ｎｅｆ１３８−１０ペプチドでパルスしたｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（同一個体由来の細胞）で刺激を加え、ＩＬ−２存在下で共培養することによって可能となる。この時、通常合成ペプチドを使用するが、エピトープ結合β２ｍ感染細胞培養上清等でも同様の効果が得られる。
また、本発明のエピトープ結合β２ｍは、インビトロでのＣＴＬアッセイの標的細胞のパルスに有用である。ＣＴＬアッセイの標的細胞をパルスする際、合成ペプチドの代わりにエピトープ結合β２ｍ感染細胞培養上清等でも同様の効果が得られる。通常は細胞表面上に、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖（膜結合型）＋β２ｍ＋ペプチドが既に発現している。ペプチドのパルスは、ペプチド部分の入れ替えを狙ったやり方であるが、エピトープ結合β２ｍでは、β２ｍ＋ペプチドとの入れ替えが行われるものと考えられる。
また、エクスビボで患者樹状細胞へパルスする際にも本発明のエピトープ結合β２ｍは有用である。患者の末梢血単核球を採取し、スタンダードな方法で樹状細胞へと分化を誘導する。この樹状細胞にエピトープ結合β２ｍをパルスし、患者の皮下に接種する。インビボの項と同様、細胞表面でＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖（膜結合型）＋エピトープ結合β２ｍの形で発現し、エピトープ特異的ＣＴＬを誘導できることが期待される。樹状細胞をペプチドでパルスした場合より、エピトープがＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖（膜結合型）上に長く発現する可能性があり、細胞性ワクチン（治療ワクチン）として期待できる。また、本発明のエピトープ結合β２ｍをインビボでタンパク製剤として直接投与することにより、エピトープ特異的ＣＴＬを誘導することも可能と考えられる。
また、エピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクター自身を、抗原特異的細胞性免疫を誘導するために使用することができる。本発明は、エピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを含む抗原特異的細胞性免疫の誘導剤に関する。また本発明は、エピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターの、抗原特異的細胞性免疫を誘導するための使用に関する。本発明のウイルスベクターは、遺伝子治療のために有用である。本発明は、エピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。該ウイルスベクターは、抗原特異的細胞性免疫を誘導できるため、感染症や癌などにおいて抗原特異的免疫を誘導するために有用である。本発明のウイルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接（インビボ）投与による遺伝子発現、間接（エクスビボ）投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても投与することができる。
例えば、インビトロでのエピトープ特異的ＣＴＬ細胞株の樹立において、ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞での刺激において合成ペプチドを使用する代わりにエピトープ結合β２ｍ発現ウイルスベクターを感染させることによってＣＴＬを樹立できる。
また、インビトロでＣＴＬアッセイの標的細胞のパルスにおいて本発明のベクターを使用することもできる。合成ペプチドの代わりにエピトープ結合β２ｍ発現ウイルスベクターをａｕｔｏ−ＬＣＬに感染させることによって標的細胞として使用することができ、実際に細胞傷害活性が確認された。またヒトの細胞株を使用する場合、目的のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖（膜結合型）を発現するウイルスベクターとそのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖によって提示されるエピトープ結合β２ｍを発現するウイルスベクターを重感染させることによって同様に標的細胞として使用することができる。
さらに本発明のベクターは、エクスビボで患者樹状細胞への遺伝子導入にも有用である。患者の末梢血単核球を採取し、スタンダードな方法で樹状細胞へと分化を誘導する。この樹状細胞にエピトープ結合β２ｍ発現ウイルスベクターを感染させ患者の皮下に接種する。ペプチドやエピトープ結合β２ｍ蛋白などでパルスしても、樹状細胞上でどれくらいの期間持続発現されるかが問題かも知れない。実際にペプチドパルスでは、樹状細胞上でのエピトープは発現が短期間で消失することが指摘されている。その点ウイルスベクターで感染させ、細胞内からエピトープ結合β２ｍを発現させれば、長期にわたってエピトープ結合β２ｍを発現させることができる。さらに、インビボでのベクター投与によりエピトープ特異的ＣＴＬを誘導するインビボ遺伝子治療にも本発明のベクターは有用である。
ベクターによる遺伝子導入の標的となる細胞は、好ましくは抗原提示能を有する細胞である。このような細胞としては、特に樹状細胞（ＤＣ）が挙げられる。例えば、エクスビボにおいて、樹状細胞に本発明のベクターを導入することによって、該細胞において所望のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を形成させることができる。この細胞を用いて、抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができる。本発明は、本発明のエピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターが導入された哺乳動物細胞に関する。哺乳動物細胞としては、抗原提示能を有する所望の単離細胞等を用いることができる。特に、該細胞においてＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をコードする遺伝子を外来的に導入することにより、大量のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を形成させることができる。ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をコードする遺伝子は染色体外に存在する発現ベクターにコードされていてもよく、また細胞の染色体に組み込まれていてもよい。細胞内で分泌型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を発現させれば、細胞から分泌型のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体が産生される。この細胞は、特に分泌型のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の調製に有用である。細胞で膜結合型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を発現させれば、該細胞表面に膜結合型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体が発現する。この細胞は、エピトープ特異的ＣＴＬに対して優れた抗原提示能を有する。また本発明は、本発明の方法により製造したエピトープ結合β２ｍを細胞表面に有する細胞に関する。このような細胞は、例えば、本発明の方法により製造したエピトープ結合β２ｍを細胞に添加することにより調製することができる。例えば、患者から樹状細胞を調製し、試験管内で当業者に公知の方法で樹状細胞へと分化を誘導する。この細胞を本発明の方法により製造したエピトープ結合β２ｍと混合する。これにより、このエピトープ結合β２ｍが、患者由来の樹状細胞表面のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖と複合体を形成する。この細胞も、エピトープ特異的ＣＴＬに対して抗原提示を行う能力を有する。このようにして作製した、目的のエピトープを提示する細胞を患者体内に戻すことにより、このエピトープに特異的な免疫を誘導することができる。すなわちこの細胞はワクチンとして利用することができる。このように、本発明の方法により製造されたエピトープ結合β２ｍは、患者において抗原特異的免疫を誘導するための医薬として有用である。本発明の方法により製造したエピトープ結合β２ｍを細胞にパルスすることにより、エピトープ結合β２ｍを細胞表面に有する細胞を製造する場合においては、パルスする前に酸処理により既存のエピトープを除去することができる。酸処理とは、細胞表面に提示されているエピトープペプチドが有意に解離するような酸性票境に細胞を暴露する工程により実施することができる。酸処理は、例えば細胞を４℃のｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．１３Ｍ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ（ｐＨ３），６６ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１７ｍｇ／ｍｌ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ）で１分間処理し、その後十分量の培養液（例えばＲＰＭＩ）にて中和することにより実施することができる。当業者であれば、これ以外にも同様の効果を示す酸処理を異なるプロトコルで行うことができる。本発明は、上記のエピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターが導入された細胞、または本発明の方法により製造されたエピトープ結合β２ｍを持つ細胞を含む医薬組成物を提供する。
基本的に、体細胞のほとんどはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉを内因的に発現しているため、上記の細胞の製造においてはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を外来的に発現させる必要はなく、エピトープ結合β２ｍのみを発現または添加すればよい。患者のＭＨＣ型を検査し、この型に沿って選択したエピトープ結合β２ｍを発現または添加することにより、テーラーメイドの治療を実現することができる。例えば、患者のＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩのタイプがＡ２４拘束性であるなら、Ａ２４拘束性Ｔ細胞により提示されたエピトープを融合させたβ２ｍを用いることにより、より有効な治療効果を得ることができると期待される。ＭＨＣ型は血清型または遺伝型で一致していることが好ましく、遺伝型で一致していることがより好ましい。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２という遺伝子型は日本人の約７割が持つため、この型を持つ細胞により提示されたエピトープを同定し、これを用いてエピトープ結合β２ｍを設計することにより、特に日本人への適用に適した医薬を作り出すことが可能である。さらに様々なＭＨＣ型のエピトープを解析することにより、個々の患者に最適な治療戦略を決定することが可能となる。
本発明の哺乳動物細胞感染性ウイルスベクター、該ベクターにより得られるエピトープ結合β２ｍおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体、該ベクターが導入された細胞、または該エピトープ結合β２ｍを細胞表面に有する細胞は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせて組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは本発明のベクター、エピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体、あるいは上記細胞と共に投与することが可能であり、これらの活性を有意に阻害しない材料である。例えば本発明の哺乳動物細胞感染性ウイルスベクター、あるいは該ベクターにより得られるエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などで適宜希釈して組成物とすることができる。パラミクソウイルスベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。また上記細胞は生理食塩水、ＰＢＳ、または培養液などに懸濁してもよい。また本発明の組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。本発明の組成物は試薬として、および医薬として有用である。また本発明の組成物はワクチンとして有用である。本発明は、本発明のベクターあるいは該ベクターにより得られるエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体、あるいは上記細胞を含む組成物の試薬、医薬、またはワクチンとしての使用にも関する。ワクチン組成物は、免疫原性を高めるために、サイトカイン、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。またワクチンには、ミョウバン、不完全Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバント、ＭＦ５９（オイルエマルジョン）、ＭＴＰ−ＰＥ（マイコバクテリア細胞壁由来のｍｕｒａｍｙｌ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）、およびＱＳ−２１（ｓｏａｐｂａｒｋ ｔｒｅｅ Ｑｕｉｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ由来）などのアジュバントを組み合わせることもできる。
また、本発明の医薬組成物の投与に際しては、アジュバント効果を高めるサイトカイン類を組み合わせることも有効である。このような遺伝子としては、例えばｉ）ＩＬ−２と一本鎖ＩＬ−１２との組み合わせ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６（１５）：８５９１−８５９６，１９９９）、ｉｉ）ＩＬ−２とインターフェロン−γ（米国特許第５，７９８，１００号）、ｉｉｉ）単独で用いられる顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ｉｖ）脳腫瘍を治療対象としたＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の組み合わせ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ９０（６），１１１５−１１２４（１９９９））などが挙げられる。
ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に対して適用することができる。感染症の治療としては、例えば感染性微生物の抗原蛋白のエピトープを解析し、これを結合させたβ２ｍを製造することができる。抗原蛋白としては、例えばインフルエンザにおいては、強毒株Ｈ５Ｎ１型等のエンベロープ、日本脳炎においては、例えばエンベロープ蛋白質（Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１５−１６，１８６９−１８８２（１９９９））、エイズにおいては、例えばＨＩＶ ｇａｇまたはＳＩＶ ｇａｇ蛋白質（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）ｖｏｌ．１６４，４９６８−４９７８）、ＨＩＶエンベロープ蛋白質、Ｎｅｆ蛋白質、その他のウイルス蛋白質などが挙げられる。コレラにおいては、例えばコレラ毒素のＢサブユニット（ＣＴＢ）（Ａｒａｋａｗａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６（１０）：９３４−８、Ａｒａｋａｗａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６（３）：２９２−７）、狂犬病においては、例えば狂犬病ウイルスの糖タンパク（Ｌｏｄｍｅｌｌ ＤＬ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４（８）：９４９−５２）、子宮頚癌においては、ヒトパピローマウイルス６型のカプシドタンパクＬ１（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ，６０，２００−２０４（２０００））などが挙げられる。また、病原性のパラミクソウイルス、例えば、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルスのようなワクチンの必要性の高いウイルスに本発明を適用することもできる。また、日本脳炎のＪＥ−Ｅ抗原タンパク質（特開昭６４−７４９８２、特開平１−２８５４９８）。ヒト単純ヘルペスウイルスのｇＤ２タンパク質（特開平５−２５２９６５）。Ｃ型肝炎ウイルス由来ポリペプチド（特開平５−１９２１６０）。偽狂犬病ウイルス由来ポリペプチド（特表平７−５０２１７３）などにおけるエピトープを用いることもできる。例えば、これらの病原性微生物に感染した患者由来の細胞を解析して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）において提示された抗原蛋白のエピトープを同定する。ＨＬＡ型を適宜選択することにより、所望のＨＬＡ型に対するエピトープを同定することが可能である。
腫瘍特異的抗原に着目し、それらを標的とした多角的な新しい治療戦略や治療法の開発を行うことには腫瘍治療の上で臨床的意義がある。例えば腫瘍治療としては、腫瘍細胞、またはＤＣ細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に本発明のベクターを用いてエピトープ結合β２ｍを発現させたり、エピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体等の蛋白質製剤を投与することができる。
一般的な手法としては、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）への抗原提示能を持つことが知られている樹状細胞（ＤＣ）が、ＣＴＬに対してもＭＨＣクラスＩ分子を介して高い抗原提示能を有することが知られており、これを用いたワクチン療法の開発が挙げられる（Ｊ．Ｉ．Ｍａｙｏｒｄｏｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１（１２），１２７９−１３０２，（１９９５））。腫瘍免疫療法の一例としては、種々の悪性腫瘍にも発現が認められるＭＡＧＥ抗原を標的とした腫瘍ワクチン療法の確立が藤也寸志ら（国立病院九州がんセンター）により進められている。再発胃腫瘍症例６例、再発食道腫瘍１例の７例に対し治療を施行したところ、食道腫瘍症例で転移リンパ節の縮小、腫瘍マーカーの減少および臨床症状（嗄声）の改善が認められ、胃腫瘍症例では６例中４例で腫瘍マーカーの減少を認めている。副作用は全く認められておらず、腫瘍免疫療法の安全性が示唆されている。また臨床症状の改善や腫瘍マーカーの低下が見られた症例が多く、ワクチンの投与法や適応症例の選別などにより有効な治療法となりうる可能性を示唆している。ＭＡＧＥ−３ペプチドを用いたＤＣワクチン療法は、実際に臨床試験が開始され、進行再発消化器癌症例に対する安全な腫瘍特異的免疫療法となる可能性が示唆される。しかしながら多数の患者を対象とした予防的ワクチン投与においては、”ｎａｔｕｒｅ ａｄｊｕｖａｎｔ”である樹状細胞を各々の患者に対して最適に調整、投与していくのは明らかに頻雑で、非現実的である。何らかの効率的方法が求められている（『山岸 久一ら京都府立医科大学 日本癌治療学会総会１９９９年１０月１２日（火）於 岐阜市での発表』）。このような腫瘍ワクチン療法に本発明を適用することは極めて有効であると考えられる。
ウイルスが引き金となってできる腫瘍の予防は、そのウイルスのワクチンによる感染予防により達成されうる。ウイルスが原因の腫瘍は他の原因による腫瘍に比較し、確実に予防が可能となる。例えば、肝臓腫瘍に関わるＣ型肝炎（ＨＣＶ）、子宮がんに関わるパピローマウイルス（ＨＰＶ）、成人性白血病の原因であるＨＴＬＶ−１につき、感染予防と治療を目的としたワクチンがあげられる。肝臓腫瘍は日本の腫瘍発症の中でも高い割合を占める。Ｃ型肝炎ウイルスは非経口的に感染し、免疫能が正常の成人であっても高率に慢性化する。感染者の約２０％は慢性肝炎、肝硬変を発症するものと考えられる。更に、肝硬変患者の多くで肝細胞癌が発症する。Ｃ型肝炎に対する治療はインターフェロンの登場により患者の一部で治癒に導くことが可能となったが、有効率は当初期待されたほどではなく、半数以上の患者に対して、いまだに有効な治療法がない現状である。一般のウイルス感染の予防は、ワクチン接種により中和抗体を誘導して行うがＣ型肝炎ウイルスは変異しやすく、現在の所、感染を終息させる中和抗体の存在は証明されていない。ウイルス感染症では中和抗体の誘導以外にＣＴＬを誘導することにより、感染予防が可能であることが知られている。本発明のベクターの投与により、このようなケースに対してもＣＴＬ活性化を誘導できると期待される。
森山貴志（自治医科大学）らは、ＣＴＬを誘導する新しい方法として病原体抗原をコードする遺伝子そのものをワクチンとして用いる方法（ＤＮＡワクチン）を研究している。その問題点は概説書が示すとおり、発現量が十分でない、投与部位が筋肉などに限られる等がある（『ＤＮＡワクチンその現状と新知見：倉根一郎（感染症研）；今日の感染症；Ｖｏｌ．１９，ＮＯ．３ ＰＡＧＥ．６−９，２０００』）。また『癌と免疫 癌の特異的免疫療法 ＨＥＲ２由来ペプチドによる乳癌のワクチン療法；影山慎一，渡辺正人，日浅厚則，珠玖洋（三重大 医）；現代医療；Ｖｏｌ．３２，ＮＯ．５ ＰＡＧＥ．１１６７−１１７２ ２０００』では乳癌などで過剰発現が認められているチロシンキナーゼ活性を持つ膜型糖蛋白質ＨＥＲ２を利用した癌ワクチンについて概説されている。本発明により適用されるウイルスベクターは、このようなＤＮＡワクチンよりも高い効果を発揮することが期待される。哺乳動物の広範な組織で発現可能なウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクターなど）を用いて本発明のベクターを構築すれば、高い効率を有するワクチンを提供することが可能と考えられる。
子宮がんは女性のみの腫瘍であるが、ＨＰＶによる感染予防と治療ワクチンの開発の重要性は変わらない。ＨＴＬＶ−１は、母子感染が主な感染ルートと理解されるに至ったが、それ以外の感染経路もある。近年発見されたＨＧＶは病原性は明確になっていないが、ＨＣＶと共に社会に拡がっており、このようなウイルスの防疫も公衆衛生上必要であり、本発明の適用の対象となる。
抗原提示細胞の利用並びに投与経路に関する検討も重要である。最も研究されている投与経路は、樹状細胞（ＤＣ）がＣＴＬに対してもＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子を介する抗原提示能を有することを利用して、末梢血のわずかなＤＣを患者から取り出し試験管内で培養増幅して、これを静脈内注射で体内にもどす方法を用いたワクチン療法である。この方法は相当の施設と、培養時間を必要とする方法である。最近注目される方法は皮膚を利用したワクチン療法である。ランゲルハンス細胞（ＬＣ）を含む樹状細胞は、近年その細胞上のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ分子を介してウイルス抗原や癌抗原などの内在性の抗原を効率的にＣＴＬに提示することが判明し、この細胞を用いた抗ウイルスワクチン法や癌ワクチン治療法の研究が大きく注目されている。皮膚の表皮には多数のＬＣが常在しているので、皮膚へのウイルスペプチドまたは癌ペプチド、さらには抗原含有遺伝子の塗布により効果的なＤＮＡワクチン法が開発できる可能性がある。しかしながら正常皮膚でＬＣは休止状態にありＴｈやＣＴＬへの抗原提示能は低く、リンパ節内への移動性にも富まないので正常皮膚を用いてのウイルスワクチン法や癌ワクチン治療法は実現が難しい。これを解決する方法として、瀬尾尚弘、瀧川雅浩（浜松医科大学）らは皮膚最外層の角質層バリアをテープストリッピング（ＴＳ）を８〜１５回繰り返すことによって破壊し、その皮膚でＬＣが活性化し、リンパ節内へ移動し効率的にＴｈ細胞に抗原提示することを実証した（特願平１０−３１６５８５ Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｐｅｐｔｉｄｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｖｉａ ｃｏｒｎｅｕｍ ｂａｒｒｉｅｒ−ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｓｋｉｎ ｆｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｖｏｌ．９７，Ｉｓｓｕｅ １，３７１−３７６，Ｊａｎｕａｒｙ ４，２０００）。このような方法はバリア破壊皮膚へのウイルスペプチド、癌ペプチドさらには抗原ＤＮＡの適用においてウイルスワクチンまたは癌治療の可能を広げるものである。本発明においても、これらの投与方法を適用することができる。
さらに確実な臨床応用のためには、ヒトＨＬＡ拘束性癌特異的ＣＴＬ株を作製し、その認識する癌反応性ＣＴＬ誘導抗原遺伝子をクローニングし、癌患者に対して臨床応用可能な腫瘍特異的免疫療法の標的分子を開発することが重要である。対象とする患者と同じ型を持つＨＬＡにより提示されたエピトープを同定し、これを用いて本発明のベクターやペプチドワクチンを製造することにより、より効果的に免疫を誘導することが期待できる。
日本において多発する癌、例えば肺癌、消化管癌（食道、胃、大腸癌）、肝癌、頭頚部癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、腎癌及び白血病のなかでも、組織型としてはそれらの大部分を占める扁平上皮癌及び腺癌を治療ターゲットする事は臨床上有益である。上皮性癌は日本における成人悪性腫瘍の大半を占めるのみならず、世界にも最も頻発する癌である。よって、上皮性癌細胞特異的抗原のエピトープは、本発明において好適に用いられる。またＨＬＡとしては日本でも発現頻度の高いＨＬＡ−Ａ２４（癌患者の約６割）、ＨＬＡ−Ａ２（約４割）、及びＨＬＡ−Ａ２６（約２割）抗原拘束性のＣＴＬ認識性癌退縮抗原の同定が特に重要である。次いで、ＨＬＡ−Ａ１１（２割）、−Ａ３１（２割弱）、−Ａ３３（２割弱）を対象とする同定も重要である。日本人の９５％以上は少なくともＨＬＡ−Ａ２４、−Ａ２、−Ａ２６、−Ａ３１、−Ａ３３のいずれか一方を保有する。また上記ＨＬＡアレールは人種をこえて広く認められる。したがってこれらのタイプのＨＬＡを持つ細胞から癌反応性ＣＴＬ誘導抗原遺伝子を同定し、これを本発明に適用することが好ましい。
伊東恭悟（久留米大 医）らは日本人に多発するヒトＨＬＡ−クラス・拘束性上皮癌（腺癌及び扁平上皮癌）に対する特異的キラーＴ細胞を多数樹立し、それらの認識する上皮癌反応性ＣＴＬ誘導能をもつ抗原遺伝子をすでにクローニングしている。さらに同遺伝子によりコードされる癌抗原ペプチドを同定し、同ペプチドによるインビトロにおけるキラーＴ細胞誘導能の解析が行われている（食道癌患者自己ＣＴＬ癌局注による特異的養子免疫療法後の末梢血リンパ球に対するクローニングとその解析：唐宇飛，山名秀明，末吉晋，新谷文彦，田中寿明，久保田雅博，峯孝志，笹原弘子，伊東恭悟（久留米大）；日本消化器外科学会雑誌；Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．７，Ｐａｇｅ １１９１，２０００）。これまでのところ扁平上皮癌ｃＤＮＡライブラリーより４種類の遺伝子（ＳＡＲＴ−１〜ＳＡＲＴ−４）、腺癌ｃＤＮＡライブラリーより３種類の遺伝子がクローニングされ、それらをコードする蛋白が解析されている。ＳＡＲＴ−１遺伝子導入した癌細胞は選択的アポトーシスを誘導した。またＨＬＡ−Ａ２４拘束性ペプチド（ＳＡＲＴ−１ ６９０−６９８）が強いＣＴＬ誘導およびＨＬＡ−Ａ２６拘束性ペプチドＳＡＲＴ−１ ７３６−７４４によるＨＬＡ−Ａ２６０１、−Ａ２６０２、−Ａ２６０３癌患者ＣＴＬ誘導が確認されている（『腫ようの抗原ペプチド療法 ＳＡＲＴ−１抗原ペプチドを用いた癌ワクチン療法；山名秀明，伊東恭悟（久留米大 医）；医学のあゆみ；Ｖｏｌ．１９０，ＮＯ．２ ＰＡＧＥ．１２９−１３３ １９９９』、『ＳＡＲＴ１ペプチドによるサブタイプの異なるＨＬＡ−Ａ２６陽性健康人及び癌患者末梢血リンパ球からのＣＴＬの誘導；井上佳子（国立腫瘍セ 研）；中尾真修，松永和子，増岡・菊地慈，山名秀明，伊東恭悟（久留米大 医）；日本癌学会総会記事』）。さらにＳＡＲＴ−３癌反応性ＣＴＬ誘導抗原遺伝子：１４０ ｋＤのＳＡＲＴ−３抗原が増殖細胞に選択的に発現し、かつ癌細胞に限って核内にも発現し、同抗原内にＨＬＡ−Ａ２４＋癌患者リンパ球よりＣＴＬ誘導能を有する２つの９個のアミノ酸からなるペプチド（ｎｏｎａｐｅｐｔｉｄｅ）が同定されている（『転移性癌患者におけるＨＬＡ−Ａ２４拘束性ｌｃｋ由来ペプチドを用いた細胞傷害性Ｔ細胞の誘導と機能解析；山名秀明，笹富輝男，宮城佳昭，唐宇飛，白水和雄，伊東恭悟（久留米大 医）；日本外科学会雑誌；Ｖｏｌ．１０１，臨時増刊号ＰＡＧＥ．４１７ ２０００』）。これらの癌反応性ＣＴＬ誘導抗原の各種癌における蛋白レベルでの発現はＳＡＲＴ−１抗原は扁平上皮癌の６０〜８０％、乳癌を除く腺癌の４０〜５０％に発現していた。またＳＡＲＴ−２は扁平上皮癌の６０％以上に、ＳＡＲＴ−３は腺癌、扁平上皮癌を含む大部分の悪性腫瘍で発現していた。これに対し、これらの抗原は正常組織には睾丸を除き発現されていない（腫よう免疫９ヒト癌特異的キラーＴ細胞により認識される抗原２へん平上皮癌反応性ＣＴＬ誘導抗原ＳＡＲＴ−１およびペプチドワクチン；伊東恭悟，七条茂樹，山名秀明（久留米大 医）；免疫Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ；Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．３，Ｐａｇｅ １９５−２０４，１９９９）。ＨＬＡ−Ａ２６は日本人の２２％、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２は日本人の約６０％が保有している。これらより、日本における多くの上皮性癌患者に対してこれらのペプチドワクチンは応用可能と考えられている。現在久留米大学において上記ペプチドを用いての第１相臨床試験が計画されている（臨床ガイドライン解説第１回腫瘍ペプチドワクチン臨床試験のガイドラインについての提案；山名秀明，伊東恭悟（久留米大 医）；分子細胞治療；Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１，Ｐａｇｅ ８９−９５，２０００）。これらの抗原蛋白質に由来するエピトープに本発明を適用することは有効であると考えられる。
以上に記載したペプチド抗原をコートする遺伝子を本発明に用いれば、腫瘍に対する有効な免疫治療を行うことが可能となる。その他のエピトープとしては、癌抗原Ｍｕｃ−１またはＭｕｃ−１様ムチンタンデムリピートペプチド（米国特許第５，７４４，１４４号）、メラノーマｇｐ１００抗原などが挙げられる。これらの遺伝子による治療は、乳癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌等、幅広い応用が示されている。また、上記に示した腫瘍抗原ペプチドＨＥＲ２遺伝子の正常組織および腫瘍での発現は、乳癌、卵巣癌、胃癌、非小細胞性肺癌において約２０から４０％の症例に遺伝子増幅または発現の増加が認められ、その発現増加は腫瘍特異性の傾向が高いと考えてよい。卵巣癌患者および健常人末梢血由来単核球より精製した樹状細胞とＨＥＲ２由来の２種の９ｍｅｒペプチド（ＨＥＲ２ｐ６３−７１、ｐ７８０−７８８）なども例示することができる（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；３０：３３３８−３３４６）。また、ＣＥＡ陽性進行固形癌に対して、ＣＥＡエピトープペプチドを用いた癌ワクチン療法（特異能動免疫療法）に本発明のベクターまたは蛋白質を適用することも考えられる（Ｋｉｍ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４７（１９９８）９０−９６）。例えば、成分採血により患者より多量の末梢血単核細胞を採取した後、その単球分画からＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ添加下に樹状細胞（ＤＣ）を誘導、誘導されたＤＣに本発明のベクターを用いて製造したＣＥＡペプチドあるいはベクターそのものを導入し、”ＤＣワクチン”として皮内投与することが考えられる（ＣＥＡ特異的能動免疫療法により血清ＣＥＡ値と抗腫よう効果に解離を認めた肺癌 骨転移の一例；清水啓二，上田祐二，伊藤剛，岡本和真，白数積雄，阪倉長平，大辻英吾，北村和也，山岸久一（京都府医大）；日本臨床外科学会雑誌）。
また、一般病への適用も考えられる。糖尿病においては、例えばＩ型糖尿病モデル動物において、インシュリン断片のペプチドをエピトープとして利用することが考えられる（Ｃｏｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９９，１０４（２）：１８９−９４）。
本発明のベクターまたは本発明のベクターにより得られるエピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む組成物は、抗原特異的細胞性免疫を少なくとも部分的に誘導するのに十分な量を投与される。但し、投与蛋白質量、または導入遺伝子の発現量は、その有効レベルおよび中毒レベルを考慮して決められるべきである。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、または皮下等に行われうるがそれらに限定されない。また局所あるいは全身に投与し得る。細胞性免疫の誘導は、本発明に記載したようなＣＴＬアッセイ等により検出することができる。
本発明のベクターの投与により細胞に導入された遺伝子の発現量は、当業者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡプロテクションアッセイ等により検出・定量することができる。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ等による検出はｉｎ ｓｉｔｕでも行い得る。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンブロット、免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、プルダウンアッセイ等により行うことができる。また、導入遺伝子発現の検出を容易にするため、発現させる蛋白質にタグを付加したり、レポーター遺伝子を発現するように組み込んでおくことも可能である。レポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、アルカリホスファターゼ、またはＧＦＰをコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに制限されない。
エピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。例えば、１０ｎｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ、好ましくは１００ｎｇ／ｋｇから５０μｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ／ｋｇから５μｇ／ｋｇの範囲であるとよい。複数のエピトープを組み合わせて投与する場合には、それぞれを上記の量で投与するとよい。エピトープ結合β２ｍまたはＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体は、適宜、薬学上容認可能な担体と組み合わせて投与することができる。
ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。パラミクソウイルスベクターであれば、投与されるベクターの力価は好ましくは約１０^５ｐｆｕ／ｍｌから約１０^１１ｐｆｕ／ｍｌ、より好ましくは約１０^７ｐｆｕ／ｍｌから約１０^９ｐｆｕ／ｍｌ、最も好ましくは約１×１０^８ｐｆｕ／ｍｌから約５×１０^８ｐｆｕ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。投与量は、好ましくは約１０^５ｐｆｕ／回から１０^１１ｐｆｕ／回、より好ましくは約１０^７ｐｆｕ／回から１０^９ｐｆｕ／回、最も好ましくは約１０^８ｐｆｕ／回から１０^９ｐｆｕ／回で投与する。
本発明のウイルス含有組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、イヌなど全ての哺乳動物が含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］ ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子およびヒトβ２ｍ遺伝子の単離
ヒトのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉの１つであるＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子、およびヒトβ２ｍ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ２４を持つ健常人末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）よりクローニングした。ｍＲＮＡの分離にはＭｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ｃＤＮＡ合成にはＡＭＶ−ＲＴ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いた。
得られたｃＤＮＡを鋳型にしてＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子は、プライマーＨＬＡ−５Ｐ２，ＨＬＡ−３Ｂを用いて、β２ｍ遺伝子はｂ２ｍ−５’，ｂ２ｍ−３’を用いてＰＣＲを行った。

ＰＣＲは９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃１分、３５サイクルの後、７２℃７分で伸長反応を行った。ＰＣＲはＥｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてクローニングし（それぞれＡ＊２４０２／ｐＧＥＭおよびβ２ｍ／ｐＧＥＭとした）、塩基配列をシークエンス反応にて確認した。シークエンス反応はｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｇ−Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＡＢＩ−３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにて電気泳動を行った。
［実施例２］ エピトープ結合β２ｍ発現ベクターの作製
以下のようにして、エピトープ結合β２ｍを発現するＳｅＶベクターをコードするプラスミド（ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂ）を構築した。β２ｍのシグナル配列の下流への各エピトープ、リンカーの挿入、センダイウイルスのＥ，Ｓシグナル、ＮｏｔＩ部位の付加はＰＣＲ法によって行った（図１）。リンカーのアミノ酸配列は、ＧＧＧＳ（配列番号：１３）が３回繰り返した配列（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ／配列番号：１４）となるようにした。
使用したプライマー；

β２ｍ／ｐＧＥＭを鋳型にｅ／ｂ２ｍ−ａ１，ｂ２ｍ−ｄを用いて９４℃１分、４８℃１分、７２℃１分、にて１５サイクル行った後、７２℃７分にて伸長反応を行った。得られたＰＣＲ産物を鋳型としてｅ（Ｎｅｆ）−ａ２，あるいはｅ（Ｅｎｖ）−ａ２とｂ２ｍ−ｄを用いて同条件にてＰＣＲを、さらにそのＰＣＲ産物を鋳型としてｅ／ｂ２ｍ−ａ３とｂ２ｍ−ｄを用いて同条件にてＰＣＲを行い、ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ，ｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ断片を得た。ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ，ｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ断片をｐＧＥＭ−Ｔ ｖｅｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてクローニングし、塩基配列をシークエンス反応にて確認した。塩基配列確認後ＮｏｔＩにて消化し、ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ切断部位に挿入し、再度塩基配列を確認しｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ｐＳｅＶｂ，ｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ／ｐＳｅＶｂを得た（「ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂ」と総称する）。また、本来のβ２ｍのみを発現するセンダイウイルスβ２ｍ／ｐＳｅＶｂはｂ２ｍ−ａ（５’−ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＡＣＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡ−３’／配列番号：２０）とｂ２ｍ−ｄを用いて上記と同様にβ２ｍ／ｐＳｅＶｂを得た。Ｎｅｆのエピトープ（Ｎｅｆ１３８−１０）のアミノ酸配列を配列番号：２４に、Ｅｎｖのエピトープ（Ｅｎｖ５８４−１１）のアミノ酸配列を配列番号：２６に示す。
［実施例３］ ビオチン化基質ペプチドを付加した分泌型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖発現ベクターの作製
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子細胞外領域へのＢｉｒ Ａ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＢＳＰ）配列（配列番号：３１）とヒスチヂンタグ（ｈｉｓ），センダイウイルスのＥ，Ｓシグナル、ＮｏｔＩ部位の付加はＰＣＲにて行った（図２）。
使用したプライマー；

Ａ＊２４０２／ｐＧＥＭを鋳型としてＡ２４−ａ，Ａ２４−ｄ１を用い９４℃１分、４８℃１分、７２℃１分、にて１５サイクル行った後、７２℃７分にて伸長反応を行った。得られたＰＣＲ産物を鋳型としてＡ２４−ａ，Ａ２４−ｄ１ｈｉｓを用いて同様にＰＣＲを行い、さらにそのＰＣＲ産物を鋳型としてＡ２４−ａ，Ａ２４−ｄ２ｈｉｓを用いて同条件にてＰＣＲを行い、Ａ２４−ＢＳＰｈｉｓ断片を得た。以下ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂ作製時と同様にＡ２４−ＢＳＰｈｉｓ／ｐＳｅＶｂを得た。
［実施例４］ 膜結合型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖発現ベクターの作製
センダイウイルスＥ，Ｓシグナル、ＮｏｔＩ部位の付加はＰＣＲにて行った（図２および３）。
使用したプライマー；

Ａ＊２４０２／ｐＧＥＭを鋳型としてＡ２４−ａ＃，Ａ２４−ｄ４を用い９４℃１分、４８℃１分、７２℃１分、にて１５サイクル行った後、７２℃７分にて伸長反応を行い、Ａ２４ｆｕｌｌ断片を得た。以下ｅ／β２ｍ／ｐＳｅＶｂ作製時と同様にＡ２４ｆｕｌｌ／ｐＳｅＶｂを得た。
［実施例５］ センダイウイルスベクターの再構成および感染
ｐＳｅＶ１８^＋ｂ（＋），ｐＧＥＭ−Ｌ，ｐＧＥＭ−Ｐ，ｐＧＥＭ−Ｎ，ｖＴＦ７−３はＨａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：２８１３−２８２０，１９９７、Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５７８−５８７及びＹｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−４６６に記載されている。センダイウイルスベクターの再構成は、上記文献に記載の方法に従って行った。ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ｐＳｅＶｂおよびｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ／ｐＳｅＶｂから、それぞれｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂおよびｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ／ＳｅＶｂを得た（ｅ／β２ｍ／ＳｅＶｂと総称する）。また、Ａ２４−ＢＳＰｈｉｓ／ｐＳｅＶｂおよびＡ２４ｆｕｌｌ／ｐＳｅＶｂから、それぞれＡ２４−ＢＳＰｈｉｓ／ＳｅＶｂおよびＡ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂを得た。
サルの腎臓由来細胞株ＣＶ−１およびＬＬＣＭＫ２は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）培地（Ｍ１０）にて培養した。以下のセンダイウイルスの感染においては、特に断らない限り、各ｍ．ｏ．ｉ．にて組換えセンダイウイルスをＣＶ−１細胞に感染させ、無血清ＭＥＭにて三日間培養した。
［実施例６］ エピトープ結合β２ｍ（ｅ／β２ｍ）の回収および定量
ｅ／β２ｍ／ＳｅＶｂまたはβ２ｍ／ＳｅＶｂを感染させたＣＶ−１細胞の培養上清を、センダイウイルス粒子を除去するため、４０，０００×ｇで遠心し上清を回収した。
培養上清中のｅ／β２ｍの定量はサンドウィッチｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法にて行った。Ｃａｐｔｕｒｅ抗体には抗ヒトβ２ミクログロブリンモノクローナル抗体（ＤＡＣＯ）２．５μｇ／ｍｌを、ｄｅｔｅｃｔｏｒ抗体には抗ヒトβ２ミクログロブリンモノクローナル抗体パーオキシダーゼ標識（ＤＡＫＯ）５００ｎｇ／ｍｌを用い、発色にはＴＭＢパーオキシダーゼ発色キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた。
標準サンプルに精製ヒトβ２ミクログロブリン（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を用いた。
［実施例７］ 分泌型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の回収、精製
Ａ２４−ＢＳＰｈｉｓ／ＳｅＶｂとｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂあるいはｅ／Ｅｎｖ５８４−β２ｍ／ＳｅＶｂとをＣＶ−１細胞に重感染させた。感染細胞の培養上清を回収し、センダイウイルス粒子を除去するため、４０，０００×ｇで遠心し上清を回収、１ｍＭ ＰＭＳＦ、３μｇ／ｍｌ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、３μｇ／ｍｌ ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、３μｇ／ｍｌ ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａを加えた。ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の上清への分泌の確認はサンドウィッチＥＬＩＳＡ法にて行った。Ｃａｐｔｕｒｅ抗体には抗ヒトＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉモノクローナル抗体（Ａｎｃｅｌｌ）１μｇ／ｍｌを、ｄｅｔｅｃｔｏｒ抗体には抗ヒトβ２ミクログロブリンモノクローナル抗体パーオキシダーゼ標識（ＤＡＫＯ）２５０ｎｇ／ｍｌを用い、発色にはＴＭＢパーオキシダーゼ発色キット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いた（図４）。
培養上清はＮｉＳＯ_４を充填したＨｉｔｒａｐ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、ＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にて０．０２Ｍ ＮａＨＰＯ_４，０．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）のバッファー条件にて０から０．５ＭのＩｍｉｄａｚｏｌｅの濃度勾配中で溶出した。ＰＤ−１０ ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて溶液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に置換後、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて限外濾過法にて濃縮した（図５）。
［実施例８］ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の作製
ビオチンの付加にはＢｉｒ Ａ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ）を用いた。反応は１．８ｍｇ／ｍｌ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体１ｍｇをＢｉｒＡ １０μｇと、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．３），１０ｍＭ ＡＴＰ，１０ｍＭ ＭｇＯＡｃ，１００μＭ ｂｉｏｔｉｎ下で２５℃、１８時間反応させた。
ビオチン付加ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の精製はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ１０／３０ ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いＦＰＬＣにて２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌで行った。その後ＰＤ−１０ ｃｏｌｕｍｎを用いて２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに溶液置換し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０を用い限外濾過法にて２ｍｇ／ｍｌに調整した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＲＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体：Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎのビオチン化部位＝１：１で反応させることによって多量体化した。
［実施例９］ Ｎｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬクローンの樹立
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２を持つＨＩＶ−１感染者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を３×１０^５／９６ｗｅｌｌずつＲ１０ １００μｌで一晩培養した。次の日にｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（０．２μｇ／ｍｌ ＰＨＡ（ＳＩＧＭＡ）、１０％Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ−Ｔ（Ｂｉｏｔｅｓｔ）を含むＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）培地（Ｒ１０）で一晩活性化し３，０００ｒａｄにて放射線照射を行った後、１０μＭのＮｅｆ１３８−１０で１時間パルスした自己のＰＨＡ−ｂｌａｓｔ）を加え、抗ヒトＣＤ２８ １μｇ／ｍｌ存在下で２週間培養した。その後１週間おきにｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（１０，０００ｒａｄで放射線照射し１０μＭ Ｎｅｆ１３８−１０でパルスした自己のＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（Ｂ−ＬＣＬ））で刺激を加えた。２〜４回刺激後、ＣＴＬ活性が確認できたらクローニングを行った。
クローニングは０．８ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの細胞を１×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ細胞（１０，０００ｒａｄの放射線照射後、１０μＭ Ｎｅｆ１３８−１０でパルスをした自己のＢ−ＬＣＬ）、５×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ ｆｅｅｄｅｒ細胞（３，０００ｒａｄで放射線照射した健常人ＰＢＭＣ）とともに１０％Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ−Ｔ，２．５％ＰＨＡ−ｓｕｐ（健常人ＰＢＭＣ（３×１０^６／ｍｌ）を０．２μｇ／ｍｌ ＰＨＡで４８時間刺激した培養上清）存在下で３〜４週間培養した。
［実施例１０］ 膜結合型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を形成するＳｅＶ導入細胞のＣＴＬによる認識
ＣＴＬ ^５１Ｃｒ放出アッセイを以下のようにして行った。ヒトＣＤ４^＋Ｔリンパ球株Ｈ９を１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）培地（Ｒ１０）にて培養した。２×１０^３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの標的細胞（ヒトＴ細胞株Ｈ９）を１００μＣｉ Ｎａ_２ＣｒＯ_４で２時間ラベルし、Ｒ１０にて３回洗った後、１０μＭのペプチドで１時間パルスした。ＳｅＶベクター導入細胞を標的細胞とする場合は、ラベルの１７時間前（すなわち、エフェクター細胞を添加する２０時間前）に図６に示す組み合わせでＳｅＶベクターの感染をｍ．ｏ．ｉ．＝１０：２で行った。各Ｅ：Ｔ比（エフェクター細胞：標的細胞比）にしたがって実施例９の細胞をエフェクター細胞として加え４時間３７℃でインキュベートし、その上清中の^５１Ｃｒをγカウンターで測定した。自然放出（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）の測定にはエフェクター細胞の代わりにＲ１０を、最大放出（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）の測定にはエフェクター細胞の代わりに４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳを入れた。
特異的リシス（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｙｓｉｓ）（％）は［各サンプルのｃｐｍ−自然放出（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）のｃｐｍ］／［最大放出（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）のｃｐｍ−自然放出（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）のｃｐｍ］×１００で計算した。
膜結合型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体のＣＴＬによる認識を調べた結果を図６に示した。Ａ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂとｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂを共導入した細胞において、抗原特異的ＣＴＬ活性化を検出できることが判明した。
［実施例１１］ ＳｅＶ導入細胞から回収したエピトープ結合β２ｍの効果
ＳｅＶ導入細胞で産生されたエピトープ結合β２ｍを調製するため、ｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂをＨ９細胞にｍ．ｏ．ｉ．＝２で導入し、３日後に培養上清を回収し濾過してエピトープ結合β２ｍを含む溶液を得た。Ａ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂを感染させたＨ９を標的細胞として実施例１０と同様のＣＴＬアッセイを行い、ペプチドでのパルスと上記で得たエピトープ結合β２ｍを含む溶液でのパルスを比較した。
エピトープ結合β２ｍの効果を図７に示した。ＳｅＶ導入細胞から回収したエピトープ結合β２ｍを標的細胞の培養液に添加することによって、抗原特異的ＣＴＬ活性を検出できることが判明した。
［実施例１２］ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド４量体によるエピトープ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の検出
ＨＬＡ−Ａ＊２４０２を持つＨＩＶ感染者および健常人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１×１０^６に２０μｇ／ｍｌのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド４量体であるＡ２４／Ｎｅｆ１３８−１０テトラマー−ＲＰＥ標識を加え、３７℃で１５分反応させた。１回洗浄した後、抗ＣＤ８抗体−ＡＰＣ標識を加え４℃で２０分反応させた。その後３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）にて固定した。染色および洗浄には２％ウシ胎児血清、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いた。結果を図８に示した。図はリンパ球分画１×１０^５をＡ２４／Ｎｅｆ１３８−１０テトラマーと抗ＣＤ８抗体で展開したもので、図中の数字はＣＤ８陽性Ｔ細胞中のテトラマー陽性細胞の割合（％）を示している。
産業上の利用の可能性
本発明により、哺乳動物細胞においてエピトープ結合β２ｍおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を効率的に発現させることが可能となった。得られるエピトープ結合β２ｍおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体は、抗原特異的ＣＴＬの検出および定量のために、またエピトープ結合β２ｍ精製蛋白質を用いた抗原特異的ＣＴＬへの抗原提示のために、さらにはインビボおよびエクスビボにおけるベクター導入を介して、抗原特異的細胞性免疫を誘導するために極めて有用である。本発明により得ることができるエピトープ結合β２ｍおよびＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体は、自己抗原、あるいはウイルス抗原、腫瘍抗原などに反応するＣＴＬの検出および定量、並びにウイルスやバクテリア等の感染症に対する防御免疫の誘導、および癌に対する免疫療法に有用である。また本発明のベクターは、感染症に対する防御免疫の誘導、および癌に対する免疫療法などにおける遺伝子治療用ベクターとして有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、エピトープ結合β２ｍ（ｅ／β２ｍ）を発現するＳｅＶベクター（ｅ／β２ｍ／ＳｅＶｂ）の構造を示す図である。
図２は、膜結合型および分泌型ＨＬＡ Ａ＊２４０２を発現するＳｅＶベクターの構造を示す図である。分泌型分子には、ビオチン化基質ペプチド（Ｂｉｒ Ａ基質ペプチド）が付加されている。
図３は、膜結合型ＨＬＡ Ａ＊２４０２を発現するＳｅＶベクターの構造を示す図である。
図４は、エピトープ結合β２ｍ発現ＳｅＶベクターおよび分泌型ＨＬＡ Ａ＊２４０２発現ＳｅＶベクターを重感染させた細胞から回収されたＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の検出を示す図である。Ａ２４−ＢＳＰｈｉｓ／ＳｅＶｂおよびｅ／β２ｍ／ＳｅＶｂを、それぞれｍ．ｏ．ｉ．＝１０および２でＣＶ−１細胞に重感染した。３日後に、培養上清１００μｌを回収し、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体をＥＬＩＳＡで検出した。陰性コントロールとしてｅ／β２ｍ／ＳｅＶｂの代わりにβ２ｍ／ＳｅＶｂあるいはｗｔ／ＳｅＶ（外来遺伝子を持たない野生型ＳｅＶ）を感染したものを用いた。
図５は、分泌型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の精製を示す図および写真である。Ａ２４−ＢＳＰｈｉｓ／ＳｅＶｂおよびｅ／β２ｍ／ＳｅＶｂを、それぞれｍ．ｏ．ｉ．＝１０および２でＣＶ−１細胞に重感染した。３日後に、培養上清１００ｍｌを回収し、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたＦＰＬＣで分画した。各フラクションの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより確認し蛋白質を定量した。約１ｍｇの分泌型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を回収した。
図６は、膜発現型ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の効果を示す図である。Ｈ９細胞（ヒトＴ細胞株，ＨＬＡ−Ａ＊２４０２−）にＡ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂおよびｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂをそれぞれｍ．ｏ．ｉ．＝１０および２で感染した。陰性コントロールとしてｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂの代わりにｗｔ／ＳｅＶを感染したものを用いた。１８時間後１００μＣｉのＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４で２時間ラベルしＮｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬクローンを用いて^５１Ｃｒ放出アッセイを行った。
図７は、分泌型エピトープ結合β２ｍの効果を示す図である。Ｈ９細胞（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２−ヒトＴ細胞株）にｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂまたは対照群としてｗｔ／ＳｅＶをｍ．ｏ．ｉ．＝２で重感染させ、３日後に培養上清を回収し０．２２μｍのフィルターを用いて濾過した。
標的細胞としてＨ９細胞（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２−ヒトＴ細胞株）にＡ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂおよびｗｔ／ＳｅＶをそれぞれｍ．ｏ．ｉ．＝１０および２で重感染した。ＳｅＶ感染後、１８時間経過した標的細胞を１００μＣｉのＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４で２時間ラベルした。その後、上記のように調製したｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍを含む培養上清、もしくは陽性コントロールとして１０μＭ Ｎｅｆ１３８−１０合成ペプチド、陰性コントロールとしてｗｔ／ＳｅＶ感染細胞培養上清をパルスした。１時間後、Ｎｅｆ１３８−１０特異的ＣＴＬクローンを用いて^５１Ｃｒ放出アッセイを行った。比較としてＡ２４ｆｕｌｌ／ＳｅＶｂおよびｅ／Ｎｅｆ１３８−β２ｍ／ＳｅＶｂをそれぞれｍ．ｏ．ｉ．＝１０および２で重感染したＨ９細胞も同様にアッセイした。
図８は、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド４量体によるエピトープ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の検出を示す写真である。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２を持つＨＩＶ感染者および健常人の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）１×１０^６に２０μｇ／ｍｌのＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド４量体であるＡ２４／Ｎｅｆ１３８−１０テトラマー−ＲＰＥ標識を加え、３７℃で１５分反応させた。１回洗浄した後、抗ＣＤ８抗体−ＡＰＣ標識を加え４℃で２０分反応させた。その後３回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）にて固定した。染色および洗浄には２％ウシ胎児血清、０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いた。図はリンパ球分画１×１０^５をＡ２４／Ｎｅｆ１３８−１０テトラマーと抗ＣＤ８抗体で展開したもので、図中の数字はＣＤ８陽性Ｔ細胞中のテトラマー陽性細胞の割合（％）を示している。

Claims (31)

1. エピトープ結合β２ｍを発現可能にコードする哺乳動物細胞感染性ウイルスベクター。
2. 哺乳動物細胞感染性ウイルスベクターがパラミクソウイルスベクターである、請求項１に記載のウイルスベクター。
3. パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項２に記載のウイルスベクター。
4. エピトープが抗原提示細胞により提示されたエピトープペプチドのアミノ酸配列またはその部分を含む、請求項１から３のいずれかに記載のウイルスベクター。
5. エピトープがＨＩＶ−１のウイルス蛋白質の部分ペプチドである、請求項１から４のいずれかに記載のウイルスベクター。
6. エピトープが配列番号：２４または２６に記載のアミノ酸配列またはその部分を含む、請求項５に記載のウイルスベクター。
7. エピトープが癌抗原の部分ペプチドである、請求項１から４のいずれかに記載のウイルスベクター。
8. エピトープとβ２ｍの間に配列番号：１３に記載のアミノ酸配列またはその繰返しを含む、請求項１から７のいずれかに記載のウイルスベクター。
9. エピトープ結合β２ｍの生産方法であって、
   （ａ）請求項１から８のいずれかに記載のウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、
   （ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、エピトープ結合β２ｍを回収する工程、を含む方法。
10. 請求項９に記載の方法により生産されたエピトープ結合β２ｍ。
11. エピトープ結合β２ｍを含む、ヘテロダイマーの生産方法であって、
    （ａ）請求項１から８のいずれかに記載のウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、
    （ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、生成したヘテロダイマーを回収する工程、を含む方法。
12. ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖、およびエピトープ結合β２ｍを含む、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体の生産方法であって、
    （ａ）請求項１から８のいずれかに記載のウイルスベクターを哺乳動物細胞に導入する工程、
    （ｂ）該ベクターが導入された哺乳動物細胞またはその培養上清から、生成したＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を回収する工程、を含む方法。
13. 前記哺乳動物細胞に、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖を発現するウイルスベクターを導入する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
14. ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖が分泌型である、請求項１３に記載の方法。
15. ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖がビオチン化基質ペプチドを含む、請求項１４に記載の方法。
16. ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖がＡ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖である、請求項１３から１５のいずれかに記載の方法。
17. Ａ２４拘束性ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖がＡ＊２４０２由来である、請求項１６に記載の方法。
18. ビオチン化基質ペプチドを含むＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をビオチン化する工程、およびビオチン化ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をアビジンの存在下で会合させる工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
19. 請求項１２から１８のいずれかに記載の方法により生産されたＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体。
20. ４量体である、請求項１９に記載のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体。
21. 請求項１から８のいずれかに記載のウイルスベクター、請求項１０に記載のエピトープ結合β２ｍ、あるいは請求項１９または２０に記載のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む、抗原特異的細胞性免疫の誘導剤。
22. 請求項１から８のいずれかに記載のウイルスベクター、請求項１０に記載のエピトープ結合β２ｍ、あるいは請求項１９または２０に記載のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む医薬組成物。
23. 請求項１から８のいずれかに記載のウイルスベクターが導入された哺乳動物細胞。
24. 請求項１１に記載のエピトープ結合β２ｍを細胞表面に有する細胞。
25. ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖をコードする遺伝子が外来的に導入されている、請求項２３または２４に記載の細胞。
26. ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖が膜結合型である、請求項２５に記載の細胞。
27. ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ重鎖が分泌型である、請求項２５に記載の細胞。
28. 細胞が樹状細胞である、請求項２３から２７のいずれかに記載の細胞。
29. 請求項２３から２８のいずれかに記載の細胞を含む、抗原特異的細胞性免疫の誘導剤。
30. 請求項２３から２８のいずれかに記載の細胞を含む医薬組成物。
31. 請求項１９または２０に記載のＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ／ペプチド複合体を含む、抗原特異的Ｔリンパ球の検出薬。

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