CN100462432C - 杂交瘤细胞株及其产生的抗人肝素酶单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583及其产生的抗人肝素酶单克隆抗体。此外，本发明还提供了一种肝素酶水平的检测方法，该方法包括以下步骤：1)将待测样品与权利要求2所述的抗人肝素酶的单克隆抗体在20-37℃下反应30-90min，洗涤；2)加入与步骤1)中抗人肝素酶的单克隆抗体发生相互作用的第二抗体，在20-37℃下反应30-90min，洗涤；3)加入针对第二抗体的显色底物和/或显色试剂进行显色反应，检测样品中肝素酶的水平。本发明不仅为进一步研究肝素酶的生物学功能及其作用机理奠定了基础，而且在制备肿瘤、炎症、胚泡着床、创伤及免疫病的治疗性药物中具有潜在的应用前景。

Description

杂交瘤细胞株及其产生的抗人肝素酶单克隆抗体

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株及其产生的抗人肝素酶单克隆抗体。

背景技术

硫酸肝素，即线形阴离子糖胺聚糖，广泛存在于各种细胞表面，介导蛋白质之间的相互作用，如参与细胞因子(FGF-1，2、HGF、TGFβ、PDGF)与受体的结合，调节抗凝血酶与凝血酶之间的作用，并是细胞间质和血管内皮下基底膜的重要组成部分。在肿瘤形成过程中，细胞外间质包裹肿瘤形成的与正常组织的分隔，以及血管内皮下的基底膜构成了阻止肿瘤向相邻组织浸润和血行转移的生理屏障。

肝素酶—β-1，4葡萄糖苷内切酶，特异性地作用于硫酸肝素的特定位点，将其降解为小分子片段。有关肝素酶的研究已二十余年，研究表明肝素酶对机体的发育、炎症过程、血管生成、肿瘤转移均有重要的作用。目前被人们普遍关注的是恶性肿瘤的发生和发展均伴有肝素酶的高表达，这意味着：①基底膜的完整性遭到破坏，肿瘤细胞将突破局限转移至它处或穿透基底膜进入血管；②肝素酶促血管生成作用为侵袭、转移的肿瘤细胞提供了定居、生长所需营养。因此，肝素酶对肿瘤的发生、发展具有重要作用。肝素酶降解血管基底膜中的硫酸肝素，使基底膜通透性增加，是肝素酶参与炎症反应的机理，当肝素酶超表达时将引发自身免疫性疾病。由此可见，肝素酶与肿瘤的发生、发展及转移以及自身免疫性疾病密切相关。

目前，国内外尚无有关检测血清中肝素酶水平的报导，对肿瘤组织中肝素酶表达水平的检测尚处在研究阶段，因此建立一种灵敏的肝素酶水平检测方法凸显重要。此外，以肝素酶单抗作为导向的抗肿瘤药也正处于研发之中。实现上述目的的关键是制备高特异性的单克隆抗体。现今，国际上只有日本SEIKAGAKU公司生产肝素酶单克隆抗体，远远不能满足研究及临床的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一株可产生抗人肝素酶(heparanase)单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明所提供的可产生抗人肝素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为AHPAT1，该细胞株已于2006年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1583。

由上述杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583产生的抗人肝素酶的单克隆抗体也属于本发明的保护范围，将其命名为Anti-AHPAT1。

本发明的第二个目的是提供一种肝素酶水平的检测方法。

本发明所提供的肝素酶水平的检测方法，包括以下步骤：

1)将待测样品与上述杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583产生的抗人肝素酶的单克隆抗体在20-37℃下反应30-90min，洗涤，除去未结合的单克隆抗体；

2)加入与上述杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583产生的抗人肝素酶的单克隆抗体发生相互作用的第二抗体，在20-37℃下反应30-90min，洗涤，除去多余的第二抗体；

3)加入针对第二抗体的显色底物和/或显色试剂进行显色反应，检测样品中肝素酶的水平。

上述检测方法中，待测样品的可以是多样的，如对于实体瘤患者，可为：来自患者肿瘤组织的活检物、组织切片等，对于非实体瘤患者，可为：来自患者的血清、淋巴液、尿液等，此外，还可使用细胞系作为标本来源。

本领域技术人员知晓，所述“诊断有效量”的单克隆抗体是指具有适当的稀释度且能够与待测样品发生足以检测的相互作用的量的单克隆抗体。可依据单克隆抗体制备的情况不同，以及检测的方法不同，在检测过程中，通过与阳性标准品的反应，选取不同的稀释度。通常，不同批次制备的单克隆抗体要经过效价测定，然后确定工作浓度，单克隆抗体原液制品优选的稀释比为1：5-80。

所述单克隆抗体与待测样品发生相互作用的条件，依据检测方法的不同而不同。

所述步骤2)中的第二抗体可为羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG等。

所述第二抗体可为经过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶等标记酶标记的，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上。

当第二抗体未经标记酶标记，步骤3)中所用的显色底物和显色试剂可为抗碱性磷酸酶抗体与碱性磷酸酶形成的复合物(APAAP)和坚固红溶液，第二抗体起桥联作用，其中一个Fab段连接第一抗体，另一个Fab段连接APAAP，通过APAAP复合物中的碱性磷酸酶催化底物显色，以鉴定相应抗原物质。

当第二抗体为经过标记酶标记的，步骤3)中所用的显色试剂可包括显色液A液和显色液B液，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液。

上述检测方法中所用的洗涤液可为PBS-T等常规的洗涤试剂。

本发明的另一个目的是提供一种检测肝素酶水平的试剂盒。

本发明所提供的检测肝素酶水平的试剂盒，可包括由上述杂交瘤细胞株AHPAT1CGMCC No.1583产生的抗人肝素酶的单克隆抗体Anti-AHPAT1。

所述试剂盒还可包括与上述杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583产生的抗人肝素酶的单克隆抗体发生相互作用的第二抗体。

所述第二抗体可为羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG等。

所述第二抗体可为经过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶等标记酶标记的，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上。

当第二抗体未经标记酶标记，该试剂盒中还可包括APAAP复合物和坚固红溶液等显色物和显色试剂；当第二抗体为经过标记酶标记的，该试剂盒中还可包括显色液A液和显色液B液，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺溶液。

为方便使用，所述试剂盒还可包括检测用的洗涤液，如PBST等常规的洗涤试剂；封闭液，如10％小牛血清等；抗体稀释液，如50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)等。

本发明提供了一种抗人肝素酶的单克隆抗体Anti-AHPAT1。该抗体可与肝素酶上的表位“QKKFKNSTYSRSS(157-169)”(序列表中的SEQ ID №：1)特异结合，从而可用于科研和临床上，如病人血清、肿瘤组织中肝素酶的定性及定量检测，有助于相关疾病的临床诊断和预后判断。由于该单克隆抗体为人源化的抗体，因而可作为靶向药物的导向物，引导药物到达病灶发挥疗效。此外，该抗体制备方法简单，可由杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583直接分泌产生。用本发明的单克隆抗体及用其制备的肝素酶表达水平的检测试剂盒进行肝素酶表达水平的检测具有灵敏度高的优点。本发明不仅为进一步研究肝素酶的生物学功能及其作用机理奠定了基础，而且在制备肿瘤、炎症、胚泡着床、创伤及免疫病的治疗性药物中具有潜在的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1a为杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583产生的单克隆抗体与合成的多肽抗原的结合特异性鉴定结果

图1b为杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583产生的单克隆抗体与肝素酶的结合特异性鉴定结果

图2为用常规的Western Blot法检测肝细胞和肝癌细胞(HePG2)中肝素酶表达水平的结果

图3为用本发明的单克隆抗体及方法检测肝细胞和肝癌细胞(HePG2)中肝素酶表达水平的结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583及其产生的抗人肝素酶单克隆抗体的获得

一、人肝素酶的优势抗原表位分析

人肝素酶基因的cDNA全长1632bp，编码543个氨基酸残基(VlodavskyI，Friedmann，Y，Elkin M，et al Mammalian heparanase：gene cloning，expressionand function in tumor progression and metastasis Nat Med，1999，5：793-802)。用BioSun软件分析肝素酶蛋白的空间结构，以获得人肝素酶的优势抗原表位，其中自人肝素酶氨基酸残基序列的氨基端第157-169位氨基酸残基(序列表中SEQ ID №：1)为选出的具有较好的抗原抗体结合特性的优势抗原表位。

2、人肝素酶半抗原多肽的合成

采用Novabiochem公司生产的Novasyn KR树脂，用固相合成法(潘和平等人，“鲑鱼降钙素及其类似物的合成”，中国生物化学与分子生物学报，第14卷第4期1998年8月463-466)合成步骤1获得的具有序列表中SEQ ID №：1氨基酸残基序列的人肝素酶关键抗原表位，并在该13肽的氨基末端添加一半胱氨酸(C)，以提供巯基，用于连接载体蛋白(钥孔虫戚血蓝蛋白，KLH)。检测结果表明所合成多肽的纯度在90％以上。

3、半抗原多肽与载体蛋白交联

选择钥孔虫戚血蓝蛋白作为半抗原载体蛋白。按照(Sambrook，J.等人，分子克隆：实验指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，856页)中的方法，首先将载体蛋白与MBS连接，形成MBS/KLH连接物，纯化后，将MBS/KLH与步骤2合成的含Cys的多肽交联。载体蛋白N端和Lys侧链提供氨基，合成肽提供游离的巯基(-SH)。

4、免疫动物

选取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，用100μg抗原/只免疫2个月以上。第一次免疫加福氏完全佐剂(0.25mL/只)，第二次以后加福氏不完全佐剂，前三次免疫间隔时间为3周，第三次免役之后每2周腹腔注射一次。细胞融合前3天，取鼠尾静脉血，用间接ELISA法测定效价，选择效价最高的小鼠腹腔加强免疫一次。

5、细胞融合

1)免疫脾细胞的制备

将步骤4加强免疫三天后的BALB/c小鼠处死，无菌状态下取出脾脏，去表面包膜及脂肪，剪碎，加不完全1640培养液(SIGMA公司，10.4g加水定容至1L，HEPES和NaHCO₃各2g，青霉素和链霉素各1万单位)制成单细胞悬液。去除大的细胞团块后，离心，用不完全1640培养液洗涤并重悬脾细胞，计活细胞数，约为1×10⁸个细胞。

2)SP2/0骨髓瘤细胞的处理

取指数生长期的SP2/0细胞，离心，用不完全1640培养液洗一次并悬浮于其中，计活细胞数，约为2×10⁷个细胞。

3)免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合

将步骤2)的SP2/0骨髓瘤细胞与步骤1)的免疫脾细胞混合均匀，离心，尽量倒净上清；然后在37℃水浴条件下，加入50％聚乙二醇(MW1450)进行细胞融合；再加入不完全1640培养液溶液洗涤，用HAT选择性培养液(向含10％胎牛血清的1640培养液中加入100×氨基喋呤储存液，SIGMA公司)重悬，加入到96孔细胞培养板，在5％CO₂孵箱中培养，第四天换新培养液，第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，当细胞生长至显微镜视野一半时，用下述ELISA法检测上清中抗体活性的高低。

6、杂交瘤细胞的筛选

采用ELISA法筛选抗人肝素酶抗体的杂交瘤细胞，具体方法为：

1)用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)稀释步骤2的合成多肽至5mg/L，加入到96孔板中进行包被，每孔100μl，4℃ 12-24小时，用PBS-T缓冲液(800mL蒸馏水中溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，用HCl调节pH至7.4，然后加1mL Tween-100，用水定容到1L，室温保存)洗三遍；

2)用10％小牛血清进行封闭，每孔100μl，37℃ 30分钟，用PBS-T缓冲液洗三遍；

3)向96孔板中添加步骤5的杂交瘤细胞上清，每孔100μl，37℃ 1小时，用PBS-T缓冲液洗三遍；

4)向96孔板中添加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠第二抗体(购自军事医学科学院)，每孔50μl，37℃ 30分钟，用PBS-T缓冲液洗三遍；

5)加碱性磷酸酶底物溶液(0.2M Tris液50mL，0.1N盐酸40mL，MgCl₂·6H₂O0.2g，左旋咪唑2mg，1％叠氮钠5mL，调pH至8.3，加水至100mL)，37℃显色15分钟，加2N H₂SO₄终止反应，测定OD₄₅₀值，OD₄₅₀值为阴性对照2.1倍的为阳性杂交瘤细胞。

7、阳性杂交瘤细胞的克隆化及细胞库的建立

1)阳性杂交瘤细胞的克隆化

用有限稀释法(Kohler G和C.Milstein.，1975，Nature 256：495)对步骤5筛选出的阳性孔的杂交瘤细胞进行多次亚克隆，使分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞单克隆化，从而使其能分泌均一的单克隆抗体，同时也避免了不分泌抗体的杂交瘤细胞过度生长而使分泌抗体的杂交瘤细胞丢失。反复克隆化至所有单个克隆的阳性率为100％，选取强阳性克隆扩大培养，大量冻存作为原始细胞库。部分细胞连续传代培养3个月以上，用步骤6的方法检测杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。

2)细胞库的建立

在对阳性杂交瘤细胞进行克隆化过程中，由融合细胞、一次亚克隆、二次亚克隆及体外连续培养3个月以上稳定分泌抗体的三次亚克隆细胞组成原始细胞库。取原始细胞库中三次亚克隆的杂交瘤细胞株全面检定，大量培养冻存，建立主细胞库。取主细胞库的细胞大量培养，经抗体活性及支原体复查合格后，冻存，每批不少于20管，建成工作细胞库。每次生产时取1管复苏，用于制备腹水抗体。

8、杂交瘤细胞的鉴定

1)抗体分泌稳定性检测

对经筛选获得的其中一株强阳性单克隆细胞株AHPAT1进行扩大培养，取部分细胞用生理盐水调整浓度为2×10⁶/mL，将其接种于小鼠腹腔，接种细胞数为1×10⁶/只。约7-10天形成腹水，至腹水增多，腹部特别膨隆时，处死小鼠，取腹水，离心后取上清并用ELISA法测腹水效价。另取部分细胞，连续传代培养3个月后，用与上述同样条件对小鼠进行腹腔接种，取腹水，离心后取上清并测腹水效价。二次ELISA测定结果均达到1×10⁶。再采用APAAP法测定腹水与4株肝素酶阳性质控肿瘤细胞(可分泌肝素酶)的反应，结果效价均达到1:100。上述检测结果表明强阳性单克隆细胞株AHPAT1具有较好的抗体分泌稳定性。

2)杂交瘤细胞染色体分析

对细胞株AHPAT1传代培养36-48小时后加入秋水仙素，继续培养4-6小时后收集细胞，加入已预温至37℃的0.075M KCl溶液悬浮细胞，37℃水浴15-20分钟作低渗处理；将细胞用甲醇/冰醋固定液三次固定后，悬浮在固定液中，4℃12-24小时，然后离心，去上清，留少许固定液将细胞悬浮，混匀后滴在刚从冰水中取出的载玻片上，吹散，通过火焰数次，自然干燥，用10％Giemsa染色液染色10-20分钟，洗去染液，自然干燥，镜下观察杂交瘤细胞的染色体核型，显微拍照。BALB/c小鼠脾细胞染色体数目为40条。SP2/0细胞的平均染色体数目为60条左右。杂交瘤细胞AHPAT1平均染色体数目为94条左右，接近SP2/0细胞和脾细胞染色体数目之和，证明该杂交瘤细胞株是由SP2/0细胞和小鼠脾细胞融合而来的。

9、单克隆细胞株AHPAT1的抗体的大量制备及特异性鉴定

1)获取抗体腹水

选取10周龄BALB/C小鼠(军事医学科学院实验动物中心提供)，接种细胞前10-20天，预先腹腔注射Pristane0.5mL/只。收集处于对数生长期的杂交瘤细胞AHPAT1，用生理盐水调整细胞浓度至2×10⁶/mL，腹腔接种杂交瘤细胞，接种细胞数为1×10⁶个/只，约7-10天形成腹水，至腹水形成增多，使得腹部特别膨隆时，处死小鼠，取腹水，离心后取上清并用ELISA法测腹水效价，结果符合要求，分装，-20℃冻存备用。

2)抗体亚型鉴定

采用双向免疫扩散法，对步骤1)获得的杂交瘤腹水进行免疫球蛋白亚型的鉴定，具体方法为：铺制1％琼脂板，待琼脂凝固后，用打孔器在上面打出梅花形的小孔，过火焰封底；将按常规方法制备的抗小鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgA及IgM抗血清加入中心孔，将腹水倍比稀释后加入周边孔，37℃放置24h。结果单克隆抗体腹水仅与抗小鼠IgG₁抗血清有明显的沉淀线，表明杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG₁亚类。

3)抗体的纯化

A、硫酸铵沉淀法初步提纯

将步骤1)腹水于4℃、10000rpm离心10分钟，取上清，按1：1比例加入0.01MPBS(pH7.2)混匀，搅拌下加入饱和硫酸铵使成50％饱和度，25℃作用30分钟，然后4℃、10000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀用适量0.01M PBS(pH7.2)溶解，加入饱和硫酸铵使成33％饱和度，25℃作用30分钟，然后4℃、10000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀用适量0.02M PBS(pH7.0)溶解，备用。

B、Protein G-Sepharose亲和层析纯化

用Pharmacia Biotech.公司的AKTA FPLC蛋白层析仪对经初步纯化的单克隆抗体进行亲和纯化，具体方法为：先用3倍柱体积的0.02M PBS(pH7.0)冲洗

Protein G层析柱(1mL)填料中的乙醇，然后用5倍柱体积的0.02M PBS(pH7.0)平衡层析柱，将2mL经硫酸铵初步纯化的抗体溶液加入层析柱，用5倍柱体积的0.02MPBS(pH7.0)冲洗层析柱，当紫外线检测器出现Ig G洗脱峰时，迅速用已加入60-100μl0.05M Tris-HCl缓冲液(pH9.5)的离心管收集，最后用5倍体积的0.02M PBS(pH7.0)冲洗平衡层析柱，将纯化的抗体分装，-20℃保存。

4)抗体纯度及浓度测定

分别将单克隆抗体腹水、硫酸铵沉淀后抗体及经Protein G-Sepharose亲和层析后抗体按常规方法进行SDS-PAGE电泳检测，结果抗体腹水中含大量杂蛋白；经硫酸铵沉淀后的抗体的电泳图谱呈现清蛋白、抗体重链和轻链三条带；经亲和层析后抗体的电泳图谱呈现二条区带，为抗体的轻链和重链，分子量约为22.8KD和53.1KD。经扫描测定，亲和层析后抗体纯度达98％以上，获得了纯度较高的抗体。将20毫升单克隆腹水抗体提纯后，用PBS调整至原体积，以PBS为空白对照，测定抗体溶液的OD_280nm值，计算出抗体浓度约为1.0mg/mL。

5)单克隆抗体特异性鉴定

a、与多肽抗原及KLH的结合特异性鉴定

用ELISA法测定上述纯化的单克隆抗体与上述步骤2合成的多肽抗原及KLH的结合特异性，即分别用KLH和步骤2合成的多肽抗原包被96孔酶标板，50μg/板，4℃12-24小时，其余步骤与常规的ELISA法相同，一抗分别采用鼠抗肝素酶(Hpa)抗血清和纯化的单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，同时设空白对照组和阴性对照组(只加二抗)，与多肽抗原结合特异性的检测结果如图1a所示(1、空白对照组；2、阴性对照组；3和4、鼠抗Hpa抗血清组；6和7、纯化的单克隆抗体组)，鼠抗肝素酶抗血清组和纯化的单克隆抗体组检测结果均为阳性，表明本发明的单克隆抗体只与合成的多肽抗原特异结合，而与KLH不结合。

b、与肝素酶的结合特异性鉴定

用ELISA法测定上述纯化的单克隆抗体与肝素酶的结合特异性，即用肝素酶包被96孔酶标板，50μg/板，4℃12-24小时，其余步骤与常规的ELISA法相同，一抗分别采用鼠抗肝素酶抗血清和纯化的单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，同时设空白对照组和阴性对照组(只加二抗)，与肝素酶结合特异性的检测结果如图1b所示(1、空白对照组；2、阴性对照组；3和4、鼠抗Hpa抗血清组；6和7、纯化的单克隆抗体组)，鼠抗肝素酶抗血清组和纯化的单克隆抗体组检测结果均为阳性，表明本发明的单克隆抗体可与肝素酶特异结合。

上述实验结果表明本发明的单克隆细胞株AHPAT1产生的单克隆抗体具有较好的结合特异性，将该抗体命名为Anti-AHPAT1。该杂交瘤细胞株AHPAT1已于2006年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.1583。

实施例2、不同组织中肝素酶表达水平的检测

下面分别采用本发明的肝素酶水平的检测方法及常规的Western Blott方法进行肝素酶表达水平的检测，具体方法如下：

一、Western Blot检测

1、多克隆抗体的制备

选取健康雄性家兔2只，体重2.5千克左右，4-5周龄，1mg多肽/只免疫4次，选取皮下多点注射。第一次免疫加2mL/只福氏完全佐剂，第二次以后加福氏不完全佐剂，4次免疫间隔时间为3周，4次免疫后间接ELISA法测定效价，效价为1:10⁶，符合要求，股静脉放血处死，收集血液分离血清，加入0.1％叠氮钠分装冻存。

2、Western Blot检测

采用常规的Western Blot法检测正常肝细胞和肝癌细胞(HePG2)裂解液中肝素酶的表达水平，具体方法为：收集肝细胞和肝癌细胞(HePG2)离心弃上清，加入500μl裂解液(细胞裂解液、pepstain A、PMSF)震荡冰浴30分钟，12000g离心15分钟，收集上清，进行10％SDS凝胶电泳，电转至PVDF膜(购自MILLP0RE)，4℃封闭12-24小时，加入步骤1制备的抗肝素酶多克隆抗体室温1小时，TBS-T(Sambrook，J.，等人，分子克隆：实验指南，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，888页)洗涤3次，加入羊抗兔二抗(博大泰克生物技术有限公司)，室温30分钟，TBS-T洗涤3次，加ECL液(购自中杉金桥生物技术有限公司)，转移至暗盒中加入感光胶片感光，显影、定影。结果如图2所示(泳道1和2为肝细胞，泳道3和4为HeP G2细胞)，肝癌细胞的检测结果呈阳性。

二、用本发明的单克隆抗体Anti-AHPAT1及方法检测肝细胞和肝癌细胞(HePG2)中的肝素酶表达水平

现用本发明的方法检测正常肝细胞和肝癌细胞(HePG2)中肝素酶的表达水平，具体方法为：将肝细胞和肝癌细胞(HePG2)甩片于甲醇丙酮液(1:1)中固定，用PBST缓冲液洗三遍。用10％的小牛血清于37℃封闭30分钟，加杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCCNo.1583分泌的抗人肝素酶的单克隆抗体Anti-AHPAT1(约50μg/mL)，37℃、反应1小时，PBST洗三遍，加第二抗体羊抗鼠IgG，37℃反应30分钟，PBST洗三遍，加APAAP复合物，37℃反应30分钟，PBST洗三遍，加坚固红溶液37℃显色10分钟，结果如图3所示，肝癌细胞显示出明显的红色颗粒(如图中箭头所指细胞)，呈阳性结果。

上述检测结果表明：本发明的杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583分泌的抗人肝素酶的单克隆抗体及方法可用于检测不同组织及细胞中的肝素酶表达水平，且具有操作简单、检测速度快、灵敏度及准确性高的特点。

序列表

<160>1

<210>1

<211>13

<212>PRT

<213>小鼠属小鼠(Mus musculus)

<400>1

Claims (3)

1.杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株AHPAT1 CGMCC No.1583在制备抗人肝素酶的单克隆抗体上的应用。

3.一种检测肝素酶水平的试剂盒，包括由权利要求1所述的杂交瘤细胞株AHPAT1CGMCC No.1583产生的抗人肝素酶的单克隆抗体。

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