CN111109248A - 一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法 - Google Patents

一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法，涉及细胞生物学技术领域。所述杂交瘤细胞冻存液其组分按体积百分比包括：8％～12％二甲基亚砜、50％～60％胎牛血清和30％～40％含添加剂的基础培养基IMDM。本发明的杂交瘤细胞冻存液，可以在杂交瘤细胞筛选过程中，在96孔板内，每个孔的细胞数量较少时即对其进行冻存，并且可以进行批量冻存复苏，操作简单；同时保持了细胞高复苏活率，不影响细胞的特性，有助于细胞冻存技术的快速应用和推广。

Description

一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种一种杂交瘤细胞冻存液 及96孔板冻存复苏方法。
背景技术
细胞冻存：是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一 种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。
细胞复苏：是指将冻存在液氮或者-80℃冰箱中的细胞37℃解冻之后重新 培养，细胞恢复生长的过程。
现有冻存液基本配方基本为10％二甲基亚砜(DMSO)+90％胎牛血清， 冻存方法都是程序降温，即4℃，2h；然后转到-20℃，2h；-80℃，2h；最后 放入液氮罐。冻存过程比较繁琐和费时。细胞冻存与复苏后，细胞存活率不 高；并且需要冻存前至少5*106细胞数目才能保证复苏出来成活率。而杂交瘤 细胞一般都是在96孔板中筛选出来，细胞数目比较少，要单个孔的细胞冻存， 需要从96孔—48孔—24孔—6孔—10cm培养皿，不断扩大培养至可以冻存 的细胞数目，耗时比较长。而不同操作之间的批间差异较大；现有冻存液及 方法不适合96孔板杂交瘤细胞的冻存与复苏，对于批量细胞的短期冻存与复 苏，其操作繁琐。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种一种杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏 方法，旨在现有冻存液不适合杂交瘤细胞筛选过程中的冻存复苏的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种杂交瘤细胞冻存液，所述杂交瘤细胞 冻存液其组分按体积百分比包括：
二甲基亚砜 8％～12％
胎牛血清 50％～60％
含添加剂的基础培养基IMDM 30％～40％。
优选地，所述添加剂的组分包括：硫酸锌、对氨基苯甲酸、硫辛酸、亚 油酸、腐胺、乙醇胺和谷胱甘肽。
优选地，所述硫酸锌的质量浓度为0.0114mg/L、所述对氨基苯甲酸的质 量浓度为1mg/L、所述硫辛酸的质量浓度为0.2mg/L、所述亚油酸的质量浓度 为0.084mg/L，所述腐胺的质量浓度为0.161mg/L，所述乙醇胺的质量浓度为 0.16mg/L，所述谷胱甘肽的质量浓度为1mg/L。
优选地，所述杂交瘤细胞冻存液配制完成后，于-20℃保存。
此外，本发明还提出一种杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法，包括以下 步骤：S10、取待冻存的孔内有杂交瘤细胞悬液的96孔板，吸掉所述96孔板 中待冻存孔内的杂交瘤细胞悬液的上清液；
S20、将如权利要求1～4任意一项所述的杂交瘤细胞冻存液和完全培养基 加入按1:1的体积比加入到所述待冻存孔内，轻拍96孔板，使所述冻存液和 完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀，然后转入-80℃冰箱冷冻保存。
S30、将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出，于培养箱中解冻 30～40min，从培养箱中取出所述冻存杂交瘤细胞的96孔板，吸弃冻存孔内上 清液，加入所述完全培养基，于培养箱中培养，得到复苏细胞。
优选地，步骤S10中，所述杂交瘤细胞悬液中的细胞浓度为2×104～5×104个/ml。
优选地，所述完全培养基包括胎牛血清、谷氨酰胺、青链双抗、HT和 IMDM基础培养基。
优选地，步骤S30中，所述培养箱培养条件为：37℃、5％CO2。
本发明提供的杂交瘤细胞冻存液，可以在杂交瘤细胞筛选过程中，在96 孔板内，每个孔的细胞数量较少时即对其进行冻存，并且可以进行批量冻存 复苏，操作简单；同时保持了细胞高复苏活率，不影响细胞的特性，有助于 细胞冻存技术的快速应用和推广。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明 实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是 本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买 获得的常规产品。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必 须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛 盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的 保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创 造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
现有冻存液及冻存复苏方法，比较繁琐，并且需要细胞达到一定细胞总 数进行冻存才能保证复苏出来的细胞的一定存活率。而杂交瘤细胞一般都是 在96孔板中筛选出来，细胞数目比较少，要单个孔的细胞冻存，需要不断扩 大培养至可以冻存的细胞数目，耗时比较长。
鉴于此，本发明提出一种杂交瘤细胞冻存液，操作简单，同时保持了细 胞高复苏活率，并且不影响细胞的特性。所述杂交瘤细胞冻存液其组分按体 积百分比包括：二甲基亚砜(Sigma-Aldrich公司)8％～12％；胎牛血清(上 海博升生物科技有限公司)50％～60％；以及含添加剂的基础培养基IMDM(武 汉博士德生物工程有限公司)30％～40％。其中，所述添加剂的组分包括硫酸 锌、对氨基苯甲酸、硫辛酸、亚油酸、腐胺、乙醇胺和谷胱甘肽。
较优地，所述硫酸锌(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为0.0114mg/L、 所述对氨基苯甲酸(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为1mg/L、所述硫辛酸 (Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为0.2mg/L、所述亚油酸(Sigma-Aldrich 公司)的质量浓度为0.084mg/L，所述腐胺(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度 为0.161mg/L，所述乙醇胺(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为0.16mg/L， 所述谷胱甘肽(Sigma-Aldrich公司)的质量浓度为1mg/L。所述杂交瘤细胞 冻存液配置完成后，于-20℃保存备用。
此外，本发明还提出一种杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法，包括以下 步骤：
步骤S10、取待冻存的孔内有杂交瘤细胞悬液的96孔板，吸掉所述96 孔板中待冻存孔内的杂交瘤细胞悬液的上清液；
其中，所述杂交瘤细胞悬液的细胞浓度为2×104～5×104个/ml。需要说明 的是，所述杂交瘤细胞是经ELISA间接法检测为阳性克隆的单克隆细胞，在 96孔细胞板中培养细胞调整其活力，待生长状态好后，转到新的96孔板，作 为待冻存的杂交瘤细胞。
步骤S20、将如权利要求1～4任意一项所述的杂交瘤细胞冻存液和完全培 养基加入按1:1的体积比加入到所述待冻存孔内，轻拍96孔板，使所述冻存 液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀，然后转入-80℃冰箱冷冻保存。
其中，所述完全培养基包括胎牛血清、谷氨酰胺、青链双抗、HT和IMDM 基础培养基，具体地，所述完全培养基各组分按体积的配比为20％胎牛血清、 1％谷氨酰胺、1％青链双抗、2％HT、76％IMDM基础培养基。需要说明的是， 所述完全培养基为现配现用。
步骤S30、将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出，于培养箱中解 冻30～40min，从培养箱中取出所述冻存杂交瘤细胞的96孔板，吸弃冻存孔内 上清液，加入所述完全培养基，于培养箱中培养，得到复苏细胞。
其中，所述培养箱培养条件均为：37℃、5％CO2。此外，所述完全培养 基配制与步骤S20中配制一样，且同样为现配现用。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解， 以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
(1)杂交瘤细胞冻存液的配制：吸取3ml基础培养基IMDM(并向内加 入0.0342ug硫酸锌、3ug的对氨基苯甲酸、0.6ug的硫辛酸、0.252ug的亚 油酸、0.483ug的腐胺，0.48ug的乙醇胺、3ug的谷胱甘肽)于15ml离心管 中，再向内加入6ml胎牛血清和1ml二甲基亚砜，混匀，于-20℃保存备 用。
(2)取孔中杂交瘤细胞悬液的密度约占孔的80％的96孔板，各个孔的 细胞由一株杂交瘤细胞株扩大培养到96孔板不同孔中，取样计数，选4株杂 交瘤细胞悬液的细胞浓度为2×104～5×104个/ml的细胞来冻存，分别标记为A1、 A2、A3、A4，分别吸掉这4个待冻存孔内的上清液。
(3)取步骤(1)配制的杂交瘤细胞冻存液100μL和完全培养基100μL (完全培养基配制：20％胎牛血清+1％谷氨酰胺+1％青链双抗 +2％HT+76％IMDM基础培养基)加入到4个待冻存孔内，轻拍96孔板，使 所述冻存液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀，然后转入-80℃冰箱冷 冻保存。
(4)将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出，于37℃、5％CO2培养箱中解冻40min，吸弃冻存孔内上清液，加入200μL完全培养基(完全 培养基配制：20％胎牛血清+1％谷氨酰胺+1％青链双抗+2％HT+76％IMDM基 础培养基)，分别取样计数，于培养箱(培养箱条件：37℃、5％CO2)中培 养，得到复苏细胞。
实施例2
(1)杂交瘤细胞冻存液的配制：吸取4ml基础培养基IMDM(并向内加 入0.0456ug的硫酸锌、4ug的对氨基苯甲酸、0.8ug的硫辛酸、0.336ug的 亚油酸、0.644ug的腐胺，0.64ug的乙醇胺、4ug的谷胱甘肽)于15ml离心 管中，再向内加入5.2ml胎牛血清和0.8ml二甲基亚砜，混匀，于-20℃保 存备用。
(2)从实施例1中96孔板的其余未冻存孔中选4株杂交瘤细胞悬液的 细胞浓度为2×104～5×104个/ml的细胞来冻存，分别标记为B1、B2、B3、B4， 分别吸掉这4个待冻存孔内的上清液。
(3)取步骤(1)配制的杂交瘤细胞冻存液100μL和完全培养基100μL (完全培养基配制：20％胎牛血清+1％谷氨酰胺+1％青链双抗 +2％HT+76％IMDM基础培养基)加入到4个待冻存孔内，轻拍96孔板，使 所述冻存液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀，然后转入-80℃冰箱冷 冻保存。
(4)将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出，于37℃、5％CO2培养箱中解冻30min，吸弃冻存孔内上清液，加入200μL完全培养基(完全 培养基配制：20％胎牛血清+1％谷氨酰胺+1％青链双抗+2％HT+76％IMDM基 础培养基)，分别取样计数，于培养箱(培养箱条件：37℃、5％CO2)中培 养，得到复苏细胞。
实施例3
(1)杂交瘤细胞冻存液的配制：吸取3.8ml基础培养基IMDM(并向内 加入0.04332ug的硫酸锌、3.8ug的对氨基苯甲酸、0.76ug的硫辛酸、0.3192ug 的亚油酸、0.6118ug的腐胺，0.608ug的乙醇胺、3.8ug的谷胱甘肽)于15ml 离心管中，再向内加入5ml胎牛血清和1.2ml二甲基亚砜，混匀，于-20℃保 存备用。
(2)从实施例2中96孔板的其余未冻存孔中选4株杂交瘤细胞悬液的 细胞浓度为2×104～5×104个/ml的细胞来冻存，分别标记为C1、C2、C3、C4， 分别吸掉这4个待冻存孔内的上清液。
(3)取步骤(1)配制的杂交瘤细胞冻存液100μL和完全培养基100μL (完全培养基配制：20％胎牛血清+1％谷氨酰胺+1％青链双抗 +2％HT+76％IMDM基础培养基)加入到4个待冻存孔内，轻拍96孔板，使 所述冻存液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀，然后转入-80℃冰箱冷 冻保存。
(4)将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出，于37℃、5％CO2培养箱中解冻解冻35min，吸弃冻存孔内上清液，加入200μL完全培养基(完 全培养基配制：20％胎牛血清+1％谷氨酰胺+1％青链双抗+2％HT+76％IMDM 基础培养基)，分别取样计数，于培养箱(培养箱条件：37℃、5％CO2)中 培养，得到复苏细胞。
对比例
(1)从实施例3中96孔板的其余未冻存孔中选4株杂交瘤细胞悬液的 细胞浓度为2×104～5×104个/ml的细胞来冻存，分别标记为D1、D2、D3、D4， 分别吸掉这4个待冻存孔内的上清液。
(2)向待冻存的这4个孔中加入按体积比为10％DMSO+90％胎牛血清 配制的冻存液，然后程序降温(即4℃，2h；然后转到-20℃，2h；-80℃，2h)， 最后放入液氮罐。
(3)将冻存细胞于37℃解冻之后，加入原细胞悬液的培养基，分别取样 计数，然后复苏培养。
一、计数结果分析：
实施例1至3以及对比例冻存前和复苏后计数结果如表1所示。
表1细胞冻存前和复苏后计数结果分析
Figure BDA0002332872370000071
Figure BDA0002332872370000081
从表1可以看出，A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、 C4的细胞复苏活率较好，也就是本发明提供的杂交瘤细胞冻存液以及96孔 板冻存复苏方法，对96孔板中的杂交瘤细胞进行冻存复苏的效果较好，相比 于冻存前细胞，细胞活率下降较少，并且复苏后活率都在85％以上。而用现 有的冻存液以及冻存复苏方法的杂交瘤细胞D1、D2、D3、D4复苏后的活率 较低，相比于冻存前的细胞活率也下降较多，说明现有冻存液及冻存复苏方 法不适合96孔板中的杂交瘤细胞的批量冻存。
二、细胞特性检测
将复苏后的A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4用 ELISA方法进行检测。
(1)待96孔复苏的杂交瘤细胞密度达到80％以上时吸取100ul细胞上清 液到包被好的酶标板中；放入到37℃温箱中孵育60分钟；
(2)洗板4次，每次300μl洗板液，静置10s，每次拍干。然后加羊抗 小鼠IgG-HRP工作浓度为1:1W，100μl/孔加样，37℃孵育45min；
(3)洗板5次，每次300μl洗板液，静置20s，每次拍干。将TMB A、 B液等体积混合，100μl/孔，37度避光孵育15min-20min。
(4)加2M硫酸，50μl/孔，酶标仪测定OD450，杂交瘤细胞冻存前的检 测与复苏后的检测方法相同，只是在冻存前吸取上清液检测，在此不做详细 说明。检测结果见表2。
表2ELISA检测结果
杂交瘤细胞 冻存前ELISA OD值 复苏后ELISA OD值
A1 0.834 0.759
A2 1.235 1.184
A3 1.944 1.845
A4 1.665 1.579
B1 0.750 0.723
B2 1.328 1.249
B3 1.505 1.498
B4 1.955 1.943
C1 0.890 0.847
C2 1.356 1.305
C3 1.853 1.807
C4 1.489 1.408
ELISA检测结果显示，复苏的杂交瘤细胞，经ELISA间接法检测100％ 都有OD值，说明本发明提供的杂交瘤细胞冻存液及96孔板冻存复苏方法在 保证复苏细胞成活率的情况下不会由阳转阴，也就是不会丢失阳性克隆。
综上所述，本发明提供的杂交瘤细胞冻存液以及96孔板冻存复苏方法可 以在杂交瘤细胞筛选过程中，在96孔板内，每个孔的细胞数量较少时即对其 进行冻存，并且可以进行批量冻存复苏，操作简单；同时保持了细胞高复苏 活率，不影响细胞的特性，有助于细胞冻存技术的快速应用和推广。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于 本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神 和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专 利保护范围内。

Claims (8)

1.一种杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，其组分按体积百分比包括：
二甲基亚砜 8％～12％
胎牛血清 50％～60％
含添加剂的基础培养基IMDM 30％～40％。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，所述添加剂的组分包括：硫酸锌、对氨基苯甲酸、硫辛酸、亚油酸、腐胺、乙醇胺和谷胱甘肽。
3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，所述硫酸锌的质量浓度为0.0114mg/L、所述对氨基苯甲酸的质量浓度为1mg/L、所述硫辛酸的质量浓度为0.2mg/L、所述亚油酸的质量浓度为0.084mg/L，所述腐胺的质量浓度为0.161mg/L，所述乙醇胺的质量浓度为0.16mg/L，所述谷胱甘肽的质量浓度为1mg/L。
4.如权利要求1所述的杂交瘤细胞冻存液，其特征在于，所述杂交瘤细胞冻存液配制完成后，于-20℃保存。
5.一种杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：S10、取待冻存的孔内有杂交瘤细胞悬液的96孔板，吸掉所述96孔板中待冻存孔内的杂交瘤细胞悬液的上清液；
S20、将如权利要求1～4任意一项所述的杂交瘤细胞冻存液和完全培养基加入按1:1的体积比加入到所述待冻存孔内，轻拍96孔板，使所述冻存液和完全培养基与所述杂交瘤细胞混合均匀，然后转入-80℃冰箱冷冻保存；
S30、将冻存杂交瘤细胞的96孔板从-80℃冰箱取出，于培养箱中解冻30～40min，从培养箱中取出所述冻存杂交瘤细胞的96孔板，吸弃冻存孔内上清液，加入所述完全培养基，于培养箱中培养，得到复苏细胞。
6.如权利要求5所述的杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法，其特征在于，步骤S10中，所述杂交瘤细胞悬液中的细胞浓度为2×104～5×104个/ml。
7.如权利要求5所述的杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法，其特征在于，所述完全培养基包括胎牛血清、谷氨酰胺、青链双抗、HT和IMDM基础培养基。
8.如权利要求5所述的杂交瘤细胞的96孔板冻存复苏方法，其特征在于，步骤S30中，所述培养箱培养条件均为：37℃、5％CO2。
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