CN110713970A - 利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏bhk21细胞的连续生产方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法及其应用，属于生物制药领域中的细胞保存。本发明提供的方法通过调整生物反应器中的低温保存条件和/或重复进行低温保存和复苏的过程，不仅可以实现在生物反应器中保存BHK21细胞长达15天以上，并且可以连续获得满足生产所需的细胞密度和细胞活力的BHK21细胞，且获得的BHK21细胞批次差异小，能够保证产品质量稳定，显著提高生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域中的悬浮细胞保存和复苏方法，具体涉及一种利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法及其应用，尤其涉及一种利用生物反应器低温保存BHK21悬浮细胞的方法以及利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法及其应用。
背景技术
BHK21细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞(BabyHamster Syrian Kidney)，于1961年建株。原始的BHK21细胞株是成纤维细胞，具有贴壁依赖性，于1963年获得其单细胞克隆细胞，后经无数次传代后细胞可悬浮生长，可广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗。目前，大部分兽用疫苗企业都采用反应器悬浮培养BHK21细胞。
针对悬浮培养的BHK21细胞，现有的保存方法为将其在液氮中冻存，需要使用时，将其复苏。由于液氮冻存复苏的BHK21细胞初始密度低，一般初始密度仅约为0.5×106cell/ml，需要对其进行大量扩繁，一般需要8-15天才能满足大规模生产的种子需求，这期间细胞代次升高4-7代，因此复苏周期较长，并且该复苏操作过程繁琐，操作人员必须有较强的无菌操作能力，因此劳动强度大；另外，在细胞复苏传代过程中要多次打开摇瓶操作，污染风险大。而再次冻存则需要经过将冻存管放于4℃冰箱中30min，-20℃放置30min，-70℃放置16-18h的过程才能放入液氮罐内-196℃保存，保存方法较为繁琐。
综上，现有的液氮保存BHK21细胞的方法复苏生产周期长，复苏污染风险大，劳动强度大，冻存方法操作繁琐，很容易导致疫苗质量不稳定。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种利用生物反应器低温保存BHK21细胞的方法，包括以下步骤：
1)将在生物反应器中悬浮培养的BHK21细胞低温保存于该生物反应器中；
生物反应器低温保存BHK21细胞的条件为：温度：4-6℃，pH值：7.0-7.5，溶氧浓度：40％-60％，搅拌转速：0rpm。
上述利用生物反应器低温保存BHK21细胞的方法还包括以下步骤：
2)在所述生物反应器中经低温保存的BHK21细胞沉降后进行排上清处理，再流加更换新的营养液，所述营养液与悬浮培养BHK21细胞的营养液相同，优选营养液配方为B21-JY培养基加2-5％血清；
3)对步骤2)更换新的营养液后的细胞液进行培养至细胞活力在90％以上，获得复苏悬浮细胞液；
4)将步骤3)获得的复苏悬浮细胞液通过所述生物反应器进行降温并低温保存；
5)重复步骤2)、步骤3)和步骤4)的操作N次，其中N为≥0的自然数。
上述步骤2)中所述排上清处理的具体操作方法为：向所述生物反应器中增加压力，将上清从所述生物反应器上方提清口排出；所述流加更换新的营养液的方法为：向已经排上清后的生物反应器中添加新鲜的营养液。
上述步骤3)中所述培养的条件为：温度为35℃-37.2℃，pH值为7.0-7.5，溶氧浓度为40％-60％，搅拌转速为80-120rpm；优选温度为36.2℃-37.2℃，PH值为7.0-7.3，溶氧浓度为40％-60％，搅拌转速为80-120rpm。
上述步骤4)中所述降温方式为：通过所述生物反应器的夹层冷冻水对步骤3)获得的复苏悬浮细胞液进行持续降温，并在降温同时逐步降低搅拌转速，直至搅拌转速为0rpm；其中所述夹层冷冻水温度为2-8℃。
本发明另一方面提供一种利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法，包括以下步骤：
S1：在生物反应器中悬浮培养BHK21细胞至细胞密度为4.0×106cell/ml及以上，活力90％以上；
S2：将步骤S1培养获得的BHK21细胞利用所述生物反应器进行降温并低温保存；
S3：经低温保存的BHK21细胞沉降后通过所述生物反应器进行排上清处理，再流加更换新的营养液；再次培养至细胞密度达到4.0×106cell/ml及以上，活力90％以上，获得BHK21复苏细胞液；
S4：从所述生物反应器中排出步骤S3获得的BHK21复苏细胞液中的一部分用于生产，剩余部分补加新的营养液；
S5：重复步骤S1、步骤S2、步骤S3和步骤S4的操作M次，其中M为≥0的自然数。
上述步骤S1中所述悬浮培养BHK21细胞的条件为：温度为35℃-37.2℃，pH值为7.0-7.5，溶氧浓度为40％-60％，培养转速为80-120rpm，营养液为B21-JY培养基和2-5％血清；优选地，所述悬浮培养BHK21细胞的条件为：初始细胞密度为0.4-1.0×106cell/ml，温度为36.2℃-37.2℃，PH值为7.0-7.3，溶氧浓度为40％-60％，搅拌转速为80-120rpm，培养时间为48-72h，营养液为B21-JY培养基和2-5％血清。
上述步骤S2中所述利用生物反应器进行降温的操作方法为：通过所述生物反应器的夹层冷冻水对步骤S1培养获得的BHK21细胞进行持续降温，并在降温同时逐步降低搅拌转速，直至搅拌转速为0rpm；其中所述夹层冷冻水温度为2-8℃。
上述步骤S2中所述低温保存的条件为：温度：4℃-6℃，PH值：7.0-7.5，溶氧浓度40％-60％，搅拌转速为0rpm。
上述步骤S3中所述排上清处理的操作方法为：向所述生物反应器中增加压力，将上清从所述生物反应器上方提清口排出；所述流加更换新的营养液的方法为：向已经排上清后的生物反应器中添加新鲜的营养液。
上述步骤S3中所述再次培养的培养条件为：温度为35℃-37.2℃，pH值为7.0-7.5和溶氧浓度为40％-60％，培养转速为80-120rpm；优选地，再次培养至所述BHK21复苏细胞液中细胞密度为4.0-6.0×106cell/ml，细胞活力90％以上。
上述步骤S4中所述剩余部分补加新的营养液后的细胞密度为0.4-1.0×106cell/ml。
上述生物反应器包括搅拌式生物反应器、气升式生物反应器。
本发明又一方面还提供一种生产疫苗产品的方法，该方法使用上述的利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法获得BHK21细胞液，并用该BHK21细胞液进行疫苗生产。
基于以上技术方案提供的利用生物反应器低温保存BHK21细胞的方法通过调整保存参数设置，例如保存温度、营养液的选择、营养液的pH值、营养液中的溶氧浓度以及搅拌转速等，可以实现在生物反应器中低温保存BHK21细胞长达15天，并且在生物反应器中经低温保存的BHK21细胞沉降后通过排上清、流加更换新的营养液以及进行培养复苏操作，即可在短时间内获得细胞活力在90％以上的BHK21复苏细胞液。通过不断重复低温保存和流加更换新的营养液后培养复苏操作，可以实现BHK21细胞在生物反应器中的长时间保存(长达60天以上)。本发明提供的利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法首先在生物反应器中悬浮培养BHK21细胞至满足生产所需要的细胞密度以及细胞活力，随后可利用生物反应器自身的特点，通过其夹层冷冻水对生物反应器进行降温和对存在于其中的BHK21细胞进行低温保存，低温保存的时间可长达15天，随后通过排上清、流加更换新的营养液以及进行培养复苏操作，即可在短时间内(例如约5h)获得细胞活力在90％以上并满足生产用细胞密度的BHK21复苏细胞液，并且获得的BHK21复苏细胞液中细胞状态良好，能够直接应用到生产中，例如用于生产疫苗产品。在生物反应器中留下少量的BHK21复苏细胞液补加新的营养液后，不断重复在生物反应器中悬浮培养、低温保存以及复苏的操作，可以连续获得满足生产所需的BHK21细胞，并且获得的BHK21细胞批次差异小，能够保证使用该细胞生产的疫苗产品质量稳定，同时提供的连续生产方法可利用溶氧及在线计数装置实现BHK21细胞培养、保存和复苏的自动化、快捷化、准确化操作，方法简单、高效，并且污染风险小。
现有的利用生物反应器保存细胞的技术一般认为：悬浮培养的BHK21细胞在生物反应器中经过96小时后就开始进入衰退期，细胞出现大量死亡。而本发明人克服了现有技术的偏见，通过调整低温保存参数，例如保存温度、营养液的选择、营养液的pH值、营养液中的溶氧浓度以及搅拌转速等参数，可以将生物反应器保存细胞周期延长至15天以上，并通过不断重复低温保存和复苏操作的方法可以实现将生物反应器低温保存细胞延长至60天及以上，同时还保证了能够快速复苏低温保存的细胞，并且细胞复苏后活力在90％以上，细胞状态良好，能够直接用于后续生产。
附图说明
图1为本发明的一个实施例悬浮培养的BHK21细胞的显微镜照片；
图2为本发明的另一个实施例悬浮培养的BHK21细胞的显微镜照片。
具体实施方式
针对现有技术中采用液氮保存BHK21悬浮细胞的方法复苏生产周期长，复苏污染风险大，劳动强度高，冻存方法操作繁琐，很容易导致疫苗质量不稳定的缺陷，本发明人通过创造性努力，提供一种利用反应器低温保存BHK21细胞的方法，其通过调整低温保存条件，将反应器低温保存细胞周期延长至15天以上，并结合复苏的方法将反应器低温保存细胞延长至60天以上，并保证细胞复苏后活力在90％以上，同时还提供了一种利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法，可以连续不断地获得生产所需要的BHK21细胞，大大提高生产效率。
除非特殊说明，本发明实施例使用的各种试剂均可以商购，也可以采用本领域常用的方法制备。用于悬浮培养的试剂，优选药用级别，而且不能影响细胞正常生理代谢。本发明使用的BHK21细胞是叙利亚地鼠肾细胞，属于可以连续传代的细胞。
以下实施例中使用的BHK21细胞种子液为金宇保灵生物药品有限公司的BHK21(P3)株的细胞种子液；使用的营养液为B21-JY培养基(购自gibco)和2-5％血清(购自内蒙古维克生生物科技有限公司)；使用的生物反应器为100L搅拌式生物反应器(购自北京天和瑞生物科技有限公司)。
本发明中使用的术语“排上清处理”是指在低温保存后的BHK21细胞复苏前，BHK21细胞是聚集沉降在生物反应器底部的，通过向生物反应器增加压力的情况下，将细胞上清液从生物反应器上方提清口排出，为更换新的营养液提供空间。本发明中使用的术语“流加”、“流加更换新的营养液”是指在细胞复苏过程中，向已经排上清后的生物反应器中添加新鲜的营养液。例如，在100L的生物反应器中，初始添加50L营养液进行细胞悬浮培养，待低温保存后，BHK21细胞在温度4℃-6℃、搅拌转速为0rpm条件下会进行沉降，上层清液中仅仅含有少部分的细胞，因此可以排掉上清液47L，向剩余的3L沉降细胞液中再添加约47L新鲜的营养液，由于排出了上清液，并添加了新鲜的营养液，不仅补充了细胞生长繁殖所需的营养，而且稀释了代谢副产物，在复苏过程中可快速地提高细胞密度和增殖速率。
通过以下具体实施方式详细说明本发明。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
实施例1：
1)悬浮培养BHK21细胞：预先向生物反应器中加入45L营养液，并完成营养液的除菌，在转速为120rpm、温度37℃、pH值为7.2以及40％的溶氧浓度条件下，接种细胞密度为4×106cell/ml的5L种子液并培养，培养48h后，取样测定细胞密度为5×106cell/ml，细胞活力95％。其中，培养48h的BHK21细胞的显微镜照片如图1所示，可见培养48h获得的BHK21细胞大小均一、边缘整齐、折光度好，细胞状态正常；
2)低温保存BHK21悬浮细胞：将生物反应器启动降温模式，具体采用夹层2-8℃冷冻水持续降温，同时逐步降低搅拌转速至生物反应器中低温保存BHK21悬浮细胞的条件为：4℃，7.2的pH值和40％的溶氧浓度，搅拌转速为0rpm；
3)低温保存的BHK21细胞的复苏：低温保存15天后，存在于生物反应器中的BHK21细胞是聚集沉降在生物反应器底部的，通过排上清处理移除上清47L，向剩余的3L细胞液中流加新的47L营养液，随后在转速为120rpm、温度37℃、pH值为7.2以及40％的溶氧浓度条件下，培养5h，取样测定密度为4.7×106cell/ml，活力93％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常。
可见，上述实施例提供的利用生物反应器低温保存BHK21细胞的方法可以实现在生物反应器中将BHK21细胞的保存时间延长至15天，远远长于现有技术中只能在生物反应器中保存的96小时。因此，该实施例提供的BHK21细胞的保存方法可以显著延长生物反应器保存BHK21细胞的时间。
实施例2：
1)悬浮培养BHK21细胞：预先向生物反应器中加入45L营养液，并完成营养液的除菌，在转速为120rpm、温度37℃、pH值为7.2以及50％的溶氧浓度条件下，接种细胞密度为4.1×106cell/ml的5L种子液并培养，培养48h后，取样测定密度为5.2×106cell/ml。其中，培养48h的BHK21细胞的显微镜照片如图2所示，可见培养48h获得的BHK21细胞大小均一、边缘整齐、折光度好，细胞状态正常；
2)第一次低温保存BHK21悬浮细胞：将生物反应器启动降温模式，具体采用夹层2-8℃冷冻水持续降温，同时逐步降低搅拌转速至生物反应器中低温保存BHK21悬浮细胞的条件为：6℃，7.2的pH值和50％的溶氧浓度，搅拌转速为0rpm；
3)第一次低温保存的BHK21细胞的复苏：低温保存15天后，存在于生物反应器中的BHK21细胞是聚集沉降在生物反应器底部的，通过排上清处理移除细胞上清液47L，向剩余的3L细胞液中再流加50L营养液，在转速为120rpm、温度37℃、pH值为7.2以及50％的溶氧浓度条件下，培养5h，获得第一次的BHK21复苏细胞液，取样测定密度为5.3×106cell/ml，活力91％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常。
4)第二次低温保存BHK21悬浮细胞：将生物反应器启动降温模式，具体采用夹层2-8℃冷冻水持续降温，同时逐步降低搅拌转速至生物反应器中低温保存BHK21悬浮细胞的条件为：6℃，7.2的pH值和50％的溶氧浓度，搅拌转速为0rpm；
5)第二次低温保存的BHK21细胞的复苏：低温保存15天后，存在于生物反应器中的BHK21细胞是聚集沉降在生物反应器底部的，通过排上清处理移除细胞上清液47L，向剩余的3L细胞液中再流加50L营养液，在转速为120rpm、温度37℃、pH值为7.2以及50％的溶氧浓度条件下，培养5h，获得第二次的BHK21复苏细胞液，取样测定密度为5.1×106cell/ml，活力92％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常。
可见，上述实施例提供的利用生物反应器低温保存BHK21细胞的方法可以实现在生物反应器中将BHK21细胞的保存时间延长至30天，远远长于现有技术中只能在生物反应器中保存的96小时，例外通过不断重复低温保存和复苏的操作，可以将生物反应器保存BHK21细胞的时间延长至更长时间，例如该实施例重复次数N为1，保存时间可长达30天，当重复次数N为3时，保存时间可长达60天，当重复次数N为4时，保存时间可长达75天，依次类推，大大延长生物反应器的保存时间。
实施例3：
1)悬浮培养BHK21细胞：预先向生物反应器中加入45L营养液，并完成营养液的除菌，在转速为120rpm、温度37℃、pH值为7.2以及60％的溶氧浓度条件下，接种细胞密度为4.8×106cell/ml的5L种子液并培养，培养48h后，得到第一细胞悬液，取样测定密度为5.6×106cell/ml，活率为93％。其中，培养48h的BHK21细胞显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常；
2)第一次低温保存BHK21悬浮细胞：将生物反应器启动降温模式对步骤1)的第一细胞悬液进行低温保存，具体采用夹层2-8℃冷冻水持续降温，同时逐步降低搅拌转速至生物反应器中低温保存BHK21悬浮细胞的条件为：6℃，7.2的PH值和60％的溶氧浓度，搅拌转速为0rpm；
3)第一次低温保存的BHK21细胞的复苏：低温保存15天后，存在于生物反应器中的BHK21细胞是聚集沉降在生物反应器底部的，通过排上清处理移除细胞上清液47L，向剩余的3L细胞液中再流加47L营养液，在转速为120rpm、温度37℃、pH值为7.2以及40％的溶氧浓度条件下，培养5h，获得第一次的BHK21复苏细胞液，取样测定密度为5.3×106cell/ml，活力93％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常；将第一次的BHK21复苏细胞液从生物反应器的底部排液口排出45L(作为细胞液M1)，留5L细胞液，补加新的营养液至50L后再次培养48h，获得第二细胞悬液，取样测定密度为4.9×106cell/ml，活力93％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常；
4)第二次低温保存BHK21悬浮细胞和复苏：重复步骤2)的操作对第二细胞悬液进行低温保存；低温保存15天后重复步骤3)的操作对经低温保存的BHK21细胞进行复苏，得到第二次的BHK21复苏细胞液，取样测定密度为4.9×106cell/ml，活率94％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常；将第二次的BHK21复苏细胞液从生物反应器的底部排液口排出45L(作为细胞液M2)，留5L细胞液，补加新的营养液至50L后再次培养48h，获得第三细胞悬液，取样测定密度为5.2×106cell/ml，活力93％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常；
5)第三次低温保存BHK21悬浮细胞和复苏：重复步骤2)的操作对第三细胞悬液进行低温保存；低温保存15天后重复步骤3)的操作对经低温保存的BHK21细胞进行复苏，得到第三次的BHK21复苏细胞液，取样测定密度为5.4×106cell/ml，活率93％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常；将第三次的BHK21复苏细胞液从生物反应器的底部排液口排出45L(作为细胞液M3)，留5L细胞液，补加新的营养液至50L后再次培养48h，获得第四细胞悬液，取样测定密度为5.0×106cell/ml，活力94％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常；
6)第四次低温保存BHK21悬浮细胞和复苏：重复步骤2)的操作对第四细胞悬液进行低温保存；低温保存15天后重复步骤3)的操作对经低温保存的BHK21细胞进行复苏，得到第四次的BHK21复苏细胞液，取样测定密度为5.4×106cell/ml，活率93％，显微镜下观察大小均一、边缘整齐、分散均匀，细胞状态正常；该步骤获得的第四次的BHK21复苏细胞液与前述步骤获得的细胞液M1、M2和M3均可直接用于后续生产，例如疫苗产品的生产。
综上实施例3可见，可以利用生物反应器实现悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产，该实施例中通过四次重复的BHK21细胞的悬浮培养、低温保存和复苏操作，实现了BHK21细胞在生物反应器中的保存时间长达60天，并且还可以通过连续不断重复上述操作，将生物反应器保存BHK21细胞的时间再次延长，例如当重复5次时，保存时间可延长至75天，当重复6次时，保存时间可延长至90天，依次类推。另外，在每次经低温保存后的复苏操作时，可在非常短的时间内(该实施例为5h)获得细胞密度为4.0×106cell/ml及以上，细胞活力为90％以上的BHK21复苏细胞液，并且细胞液中的细胞生长状态良好，可直接用于生产。因此，本发明提供的方法还可以为后续生产源源不断地提供满足生产需要的BHK21细胞，显著提高生产效率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用生物反应器低温保存BHK21细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将在生物反应器中悬浮培养的BHK21细胞低温保存于该生物反应器中；
生物反应器低温保存BHK21细胞的条件为：温度：4-6℃，pH值：7.0-7.5，溶氧浓度：40％-60％，搅拌转速：0rpm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
2)在所述生物反应器中经低温保存的BHK21细胞沉降后进行排上清处理，再流加更换新的营养液，所述营养液与悬浮培养BHK21细胞的营养液相同，优选营养液配方为B21-JY培养基加2-5％血清；
3)对步骤2)更换新的营养液后的细胞液进行培养至细胞活力在90％以上，获得复苏悬浮细胞液；
4)将步骤3)获得的复苏悬浮细胞液通过所述生物反应器进行降温并低温保存；
5)重复步骤2)、步骤3)和步骤4)的操作N次，其中N为≥0的自然数。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述排上清处理的具体操作方法为：向所述生物反应器中增加压力，将上清从所述生物反应器上方提清口排出；所述流加更换新的营养液的方法为：向已经排上清后的生物反应器中添加新鲜的营养液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述培养的条件为：温度为35℃-37.2℃，pH值为7.0-7.5，溶氧浓度为40％-60％，搅拌转速为80-120rpm；
优选温度为36.2℃-37.2℃，PH值为7.0-7.3，溶氧浓度为40％-60％，搅拌转速为80-120rpm。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述降温方式为：通过所述生物反应器的夹层冷冻水对步骤3)获得的复苏悬浮细胞液进行持续降温，并在降温同时逐步降低搅拌转速，直至搅拌转速为0rpm；其中所述夹层冷冻水温度为2-8℃。
6.一种利用生物反应器悬浮培养、保存和复苏BHK21细胞的连续生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：在生物反应器中悬浮培养BHK21细胞至细胞密度为4.0×106cell/ml及以上，活力90％以上；
S2：将步骤S1培养获得的BHK21细胞利用所述生物反应器进行降温并低温保存；
S3：经低温保存的BHK21细胞沉降后通过所述生物反应器进行排上清处理，再流加更换新的营养液；再次培养至细胞密度达到4.0×106cell/ml及以上，活力90％以上，获得BHK21复苏细胞液；
S4：从所述生物反应器中排出步骤S3获得的BHK21复苏细胞液中的一部分用于生产，剩余部分补加新的营养液；
S5：重复步骤S1、步骤S2、步骤S3和步骤S4的操作M次，其中M为≥0的自然数。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述悬浮培养BHK21细胞的条件为：温度为35℃-37.2℃，pH值为7.0-7.5，溶氧浓度为40％-60％，培养转速为80-120rpm，营养液为B21-JY培养基和2-5％血清；
优选地，所述悬浮培养BHK21细胞的条件为：初始细胞密度为0.4-1.0×106cell/ml，温度为36.2℃-37.2℃，PH值为7.0-7.3，溶氧浓度为40％-60％，搅拌转速为80-120rpm，培养时间为48-72h，营养液为B21-JY培养基和2-5％血清。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述利用生物反应器进行降温的操作方法为：通过所述生物反应器的夹层冷冻水对步骤S1培养获得的BHK21细胞进行持续降温，并在降温同时逐步降低搅拌转速，直至搅拌转速为0rpm；其中所述夹层冷冻水温度为2-8℃；和/或
步骤S2中所述低温保存的条件为：温度：4℃-6℃，PH值：7.0-7.5，溶氧浓度40％-60％，搅拌转速为0rpm；和/或
步骤S3中所述排上清处理的操作方法为：向所述生物反应器中增加压力，将上清从所述生物反应器上方提清口排出；所述流加更换新的营养液的方法为：向已经排上清后的生物反应器中添加新鲜的营养液；和/或
步骤S3中所述再次培养的培养条件为：温度为35℃-37.2℃，pH值为7.0-7.5和溶氧浓度为40％-60％，培养转速为80-120rpm；优选地，再次培养至所述BHK21复苏细胞液中细胞密度为4.0-6.0×106cell/ml，细胞活力90％以上；和/或
步骤S4中所述剩余部分补加新的营养液后的细胞密度为0.4-1.0×106cell/ml。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物反应器包括搅拌式生物反应器、气升式生物反应器。
10.一种生产疫苗产品的方法，使用权利要求6-9中任一项所述的方法获得BHK21复苏细胞液，用该BHK21复苏细胞液进行疫苗生产。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101851608A (zh) * | 2009-03-31 | 2010-10-06 | 北京清大天一科技有限公司 | 一种悬浮培养bhk21细胞生产狂犬病病毒的方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101851608A (zh) * | 2009-03-31 | 2010-10-06 | 北京清大天一科技有限公司 | 一种悬浮培养bhk21细胞生产狂犬病病毒的方法 |
| CN102382794A (zh) * | 2010-09-01 | 2012-03-21 | 山东新时代药业有限公司 | 一种哺乳动物细胞的灌流培养方法 |
| CN107142249A (zh) * | 2017-05-08 | 2017-09-08 | 广东渔跃生物技术有限公司 | 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 范田梅等: "冷藏保存BHK21细胞悬液及复苏试验", 《中国兽药杂志》 * |
| 贾英等: "BHK21悬浮细胞在2～8℃下短期保存的研究", 《中国兽药杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI823252B (zh) * | 2022-02-09 | 2023-11-21 | 國立臺灣大學 | 連續型細胞生產系統及方法 |
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