WO2015159950A1 - 多能性幹細胞の細胞集塊製造方法および細胞集塊製造システム - Google Patents

多能性幹細胞の細胞集塊製造方法および細胞集塊製造システム Download PDF

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WO2015159950A1
WO2015159950A1 PCT/JP2015/061716 JP2015061716W WO2015159950A1 WO 2015159950 A1 WO2015159950 A1 WO 2015159950A1 JP 2015061716 W JP2015061716 W JP 2015061716W WO 2015159950 A1 WO2015159950 A1 WO 2015159950A1
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WO
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cells
cell
pluripotent stem
well
cryopreservation
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PCT/JP2015/061716
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English (en)
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慎一 五味
原　圭祐
直希 西下
万里江 村松
Original Assignee
東京エレクトロン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a cell agglomeration production method and a cell agglomeration production system of pluripotent stem cells, and a pluripotent stem cell using the cell agglomeration produced by the cell agglomeration production method or the cell agglomeration production system It relates to the culture method of.
  • Pluripotent stem cells form colonies by adhesion culture.
  • cell clumps obtained by detaching these colonies are cryopreserved.
  • Various cryopreservation solutions for freezing cell clusters of pluripotent stem cells are commercially available (for example, Patent Document 1). In these cryopreservation methods, the vitrification method and the slow freezing method are mainly used.
  • a cryopreservation solution for freezing cell aggregates of pluripotent stem cells by vitrification is highly cytotoxic, and it has been necessary to rapidly freeze cells after suspending them in the cryopreservation solution. For this reason, the degree of recovery of cells after thawing is not constant, resulting in individual differences among operators, and not suitable for mechanization of operations and large-scale processing of cells. Further, in the slow freezing method, cells cultured under feeder-free conditions are known to have extremely low survival rate after thawing, and it was thought that they were not suitable as a cryopreservation method for pluripotent stem cells.
  • the present invention relates to a cell agglomeration production method and a cell agglomeration production system of pluripotent stem cells, and a pluripotent stem cell using the cell agglomeration produced by the cell agglomeration production method or the cell agglomeration production system
  • a culture method is provided.
  • the present inventors when pluripotent stem cells are made into a single cell and frozen, there are few cells that are restored after thawing and transferred to an adherent culture system as it is, It was found that the size of growing colonies varies. Therefore, after thawing, an attempt was made to form a cell clump in a single cell and then transfer it to an adhesion culture system. When cell clumps were formed using wells having a cell non-adhesive surface, it was found that thawed pluripotent stem cells formed cell clumps immediately after thawing.
  • the formed cell agglomerates are maintained in an undifferentiated state, and there are few variations in the size of the obtained colonies, which can be cultured well thereafter, and there are many cells that return. I also found.
  • cell clumps are formed in the thawed cells using large wells and adhesion culture is performed, cell clumps having a plurality of sizes are formed in one well, and this cell clumps are formed. It was found that the cells can be proliferated very efficiently and the size of the obtained colonies is uniform. The present invention has been made based on such knowledge.
  • a method for producing a cell cluster of pluripotent stem cells (A) thawing the unipotent and frozen pluripotent stem cells; (B) forming a cell clump in the thawed pluripotent stem cells; Comprising a method.
  • step (B) a plurality of cell clumps are formed in the well.
  • a cell clump is formed by seeding the cells in a well so that the cell density is 100 to 20,000 cells / mm 2 , according to the above (1) to (4) Method.
  • (6) The method according to any one of (1) to (5) above, wherein the pluripotent stem cells are frozen by a slow freezing method.
  • the step (B) comprises agitating the well during the formation of the cell clump.
  • the pluripotent stem cells are human ES cells or human iPS cells.
  • the well is a well having a cone shape, a round bottom, a V bottom, a U bottom, a chamfered flat bottom, or a flat bottom.
  • the well of step (B) is a well of a round bottom 96-well microtiter plate, the number of cells to be seeded per well is 5 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 5 , and the cells are human The method according to any one of (1) to (9) above, which is an iPS cell.
  • the formation time of the cell cluster of pluripotent stem cells is 14 days or less.
  • the freezing means is a freezing means for freezing a cryopreservation solution in a cryopreservation container by slow freezing.
  • the cell agglomeration forming unit has a well having a cone shape, a round bottom, a V bottom, a U bottom, a chamfered flat bottom, or a flat bottom.
  • a recording medium storing a computer program for causing a computer for controlling the system according to any one of (12) to (14) to execute the method for producing a cell cluster production method of pluripotent stem cells,
  • a method for producing a cell cluster of pluripotent stem cells Dissociating the pluripotent stem cell mass into single cells; Mixing the dissociated cells into a cryopreservation solution; Introducing a cryopreservation solution mixed with cells into a cryopreservation container; Freezing the cryopreservation solution mixed with cells in a cryopreservation container; Cryopreserving the cryopreservation container; Thawing a frozen stock solution frozen in a cryopreservation container; Mixing the thawed cells into the cell culture medium; Forming a cell clump from cells mixed in the medium.
  • a method for culturing pluripotent stem cells which is produced by the method according to any one of (1) to (11) above or the system according to any one of (12) to (14) above A method comprising adherent culture of a cell cluster of pluripotent stem cells.
  • the method of the present invention is suitable for automation of subculture.
  • a cell that has been frozen and thawed into a single cell can be cultured more quickly after main culturing, compared to a case in which cell clotting is not formed. Is done.
  • FIG. 1 shows the outline of the procedure of the pluripotent stem cell clump production method of the present invention and the pluripotent stem cell culture method using the cell clump produced by the method.
  • FIG. 2 shows a cross-sectional shape of a well used for forming a cell clump in Example 1.
  • FIG. 3 shows the cell clump formed in the well. 3A-E are frozen using CryoStem (FIG. 3A), mFreSR (FIG. 3B), Synth-a-Freeze (FIG. 3C), ATCC (FIG. 3D) and Millipore (FIG. 3E) as cell cryopreservation solutions, respectively.
  • FIG. 3F is a diagram illustrating a relationship between the number of cells included in the cell clump and the diameter of the cell clump.
  • FIG. 4 shows the state of the cell colony on the 10th day after seeding the cell clumps in an adherent culture dish.
  • FIG. 5 shows the transition of cell colony growth 1 to 6 days after seeding the cell clumps in an adherent culture dish.
  • FIG. 6 shows that the resulting cell colonies express undifferentiated markers.
  • FIG. 7 shows the transition of cell colony growth on days 2 to 14 after seeding pluripotent stem cells that have become single cells into an adherent culture dish.
  • FIG. 8 shows the number of colonies and estimated number of cells on the 14th day (FIG. 8A) and a microscopic image of the colonies (FIG. 8B) after seeding pluripotent stem cells that have become single cells into an adherent culture dish.
  • FIG. 9 shows the result of forming a cell clump using AggreWell on pluripotent stem cells that have been made into single cells after thawing.
  • FIG. 10 shows that cell aggregates are formed using AggreWell on pluripotent stem cells that have been made into single cells after thawing, and then seeded on an adherent culture dish, and the number of colonies and the colony expansion rate on day 12 (FIG. 10A).
  • the microscope image (FIG. 10B) of a colony is shown.
  • FIG. 11 shows the transition of the shape of the cell clump when a cell clump is formed in a single cell pluripotent stem cell after freezing using a well of PrimeSurface (trademark) 96M manufactured by Sumitomo Bakelite.
  • FIG. 12 shows the day 10 after seeding the cell clump obtained on day 4 after seeding the single-cell pluripotent stem cells thawed into a well of PrimeSurface TM 96M manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • the number of colonies and the estimated number of cells (FIG. 12A) and the microscopic image of the colonies (FIG. 12B) are shown.
  • FIG. 13 shows that after the cells are made into single cells and the pluripotent stem cells are frozen, no cell clumps are formed (condition 1), or after cell clumps are formed (conditions 2 and 3), adhesion culture is started. In this case, comparison data of the cell recovery rate on day 14 after thawing is shown.
  • FIG. 14 shows the effect of the type of cryopreservation solution and the presence or absence of stirring on the formation of cell clumps in Example 2.
  • FIG. 15 is a graph showing the effect of the type of cryopreservation solution and the presence or absence of stirring on the formation of cell clumps in Example 2.
  • FIG. 16 shows that the size of the cell clump formed increases when the cell clump is formed while stirring.
  • FIG. 17 shows the influence of the presence or absence of an initial centrifugation treatment and the presence or absence of agitation during formation on the cell collection rate (formation period is 4 days).
  • FIG. 18 is a graph obtained from the result of FIG.
  • FIG. 19 shows the effect of the presence or absence of an initial centrifugation treatment and the presence or absence of agitation during formation on the cell recovery rate (formation period is 8 days).
  • FIG. 20 is a graph obtained from the result of FIG.
  • FIG. 21 shows the effect on the cell clump formation given by the number of cells introduced into each well of PrimeSurface TM 96M manufactured by Sumitomo Bakelite.
  • the cryopreservation solution is CryoStem.
  • FIG. 22 shows the effect on cell clump formation given by the number of cells introduced into each well of PrimeSurface TM 96M manufactured by Sumitomo Bakelite.
  • the cryopreservation solution is mFreSR.
  • FIG. 23 shows the influence of the number of cells introduced into each well of Sumitomo Bakelite's PrimeSurface TM 96M on pluripotent stem cell colony formation.
  • FIG. 24 shows a colony size histogram (FIG. 24 left) formed in FIG. 23, and an average value and standard deviation (FIG. 24 right) of the size.
  • FIG. 25 shows the relationship between the number of cells introduced into each well of PrimeSurface (trademark) 96M manufactured by Sumitomo Bakelite and the number of cells obtained after the start of adhesion culture.
  • FIG. 26 shows the effect of the contact time between the cryopreservation solution before freezing and the cells on the formation of cell clumps by the cells after thawing.
  • FIG. 27 is a microscopic image of a colony 8 days after seeding the cell clump obtained in FIG. 26 on an adherent culture dish.
  • FIG. 28 shows a microscopic image of the cell agglomeration on the 14th day after forming the cell agglomeration, and the time in the figure indicates the contact time between the cryopreservation solution and the cell before freezing.
  • FIG. 29 shows the effect of the contact time between the cryopreservation solution and the cells before freezing on the degree of cell recovery.
  • FIG. 29A shows the results when the cryopreservation solution is CytoStem, and FIG.
  • FIG. 29B shows the results when the cryopreservation solution is mFreSR.
  • FIG. 30 shows the degree of recovery of cells after freezing by the conventional freezing method and the freezing method of the present invention.
  • FIG. 31 shows an outline of a cell cluster production system for pluripotent stem cells of the present invention.
  • a cell agglomeration production method and a cell agglomeration production system of pluripotent stem cells that are simple and less susceptible to manipulation, and a cell agglomeration produced by the cell agglomeration production method or the cell agglomeration production system
  • a method for culturing pluripotent stem cells using a mass is provided.
  • the cell to be cryopreserved according to the present invention is a pluripotent stem cell.
  • pluripotent stem cells used in the present invention include pluripotent stem cells such as tumor cells (EC cells) or embryonic germ stem cells (EG cells), preferably ES cells or iPS cells.
  • the pluripotent stem cells used in the present invention are also preferably pluripotent stem cells of mammals such as primates or rodents, and more preferably human pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cell used in the present invention is most preferably a human ES cell or a human iPS cell.
  • pluripotent stem cells In general, single cell formation is not preferable for pluripotent stem cells, and many conventional protocols employ a technique in which pluripotent stem cells are cryopreserved in a cell mass state.
  • pluripotent stem cells are cryopreserved in a cell mass state.
  • cells that have been made into single cells and freeze-thawed can be recovered physiologically by rapidly forming cell clumps again, then seeding the cell clumps and performing main culture. Good freezing and thawing is possible even at a degree of.
  • a method for producing a cell cluster of pluripotent stem cells comprising: (A) thawing the unicellularized and frozen cells; (B) forming a cell clump in the thawed pluripotent stem cells; A method comprising is provided.
  • the method for producing a cell cluster of pluripotent stem cells is performed before step (A). (A) dissociating the pluripotent stem cell mass into single cells; (B) freezing and storing the cells; Is further included.
  • step (a), step (b), step (A) and step (B) will be described.
  • step (A) Dissociating the pluripotent stem cell mass into single cells To dissociate the pluripotent stem cell mass into single cells and then freeze them, in step (a), Dissociate the cell mass into single cells.
  • step (a) a cell cluster of pluripotent stem cells obtained by detaching pluripotent stem cell colonies is dissociated into single cells.
  • Pluripotent stem cells form colony-like cell clusters on the adhesion surface of the culture container when adhesion culture is performed.
  • pluripotent stem cells that have been enzymatically, physiologically or physically detached from the cell adhesion surface can be used in adhesion culture.
  • an enzyme for detaching pluripotent stem cells from the cell adhesion surface an enzyme used in a conventional method can be used.
  • enzymes such as trypsin, dispase, accutase, and collagenase can be used.
  • the detachment of pluripotent stem cells from the cell adhesion surface may also be performed using a chemical substance having a cell detaching action, such as a chelating agent of divalent ions (particularly Mg 2+ ) such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), These may be performed in combination with the above enzyme.
  • a chemical substance having a cell detaching action such as a chelating agent of divalent ions (particularly Mg 2+ ) such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), These may be performed in combination with the above enzyme.
  • vibration such as high-frequency vibration may be applied to the cell adhesion surface, and / or a cell scraper may be used.
  • the cells may be detached by combining the above physiological detachment method and physical detachment method. Those skilled in the art will be able to appropriately remove the pluripotent stem cells from the cell adhesion surface using the well-known peeling method as described above.
  • the cell mass can be dissociated into single cells.
  • the dissociation of the cell mass may be performed simultaneously with the detachment of the cell from the culture surface, or may be performed after the cell mass is detached.
  • the cell mass exfoliated from the culture surface may be dispersed to a single cell level by further treatment with an enzyme.
  • Enzymes that can be used to dissociate cells to the single cell level include those that can break cell-cell bonds and cell-extracellular matrix (ECM) bonds. Can be mentioned and these enzymes are well known to those skilled in the art. Examples of enzymes that can be used to dissociate cells to the single cell level include accutase.
  • a compound that suppresses adverse effects on the cells for example, cell death
  • a ROCK inhibitor such as Y-27632 can be added.
  • step (b) Freezing and storing cells
  • pluripotent stem cells dissociated into single cells are frozen and stored.
  • Pluripotent stem cells dissociated into single cells can be frozen by a well-known method suitable for freezing pluripotent stem cells. Hereinafter, a slow cooling method often used for freezing cells will be described.
  • the slow cooling method is also called a slow freezing method, in which cells are suspended in a cryopreservation solution to which about 5 to 20% of a cryoprotectant such as dimethyl sulfoxide or glycerol is added, and slowly cooled (for example, 1 ° C. This is a method of freezing cells.
  • a cryoprotectant such as dimethyl sulfoxide or glycerol
  • This is a method of freezing cells.
  • the water in the extracellular solution is gradually crystallized by slowly cooling, and the osmotic pressure of the extracellular solution increases. Then, intracellular water flows out of the cell due to the difference in osmotic pressure. When the intracellular moisture is dehydrated in this way and the cells are concentrated, ice crystals are less likely to be formed in the cells, creating a vitrified state.
  • the slow cooling method can be usually performed using a program freezer or the like, but a commercially available cell cryopreservation solution and a commercially available freezing container (for example, Mr. Frosty Freezing Container (trademark) (manufactured by Thermo Scientific)), etc. Can also be used.
  • Mr. Frosty Freezing Container trademark
  • the cells can be frozen by a slow cooling method.
  • the cryopreservation solution is not particularly limited, but the cryopreservation solutions shown in Table 1 can be used.
  • a cryopreservation solution is toxic to cells, it is considered unpreferable to leave cells immersed for a long time.
  • the cell suspension in the cryopreservation solution is kept for a long time (for example, within 6 hours, preferably 2. (Within 5 hours, more preferably within 1 hour, even more preferably within 30 minutes, even more preferably within 15 minutes, particularly preferably within 2 minutes) Even if kept on ice, the viability of the cells tends to be maintained.
  • the retention time of the cell suspension in the cryopreservation solution is required to be 15 seconds or less.
  • This method has a great advantage in terms of time delay between freezing and mixing cells in a cryopreservation solution and freezing, for example, in the case of mass processing of cells and mechanization of operations. Is very advantageous.
  • the cells After freezing the cells, the cells can be stored frozen.
  • the cryopreservation of the cells in the cryopreservation container is performed in a deep freezer capable of maintaining the temperature of the freezer at -80 ° C. or lower, or in liquid nitrogen from the viewpoint of long-term storage.
  • the pluripotent stem cells that have been made into single cells and frozen can be subjected to adhesion culture after thawing and forming cell clumps.
  • step (A) Thawing pluripotent stem cells that have been unicellularized and frozen
  • pluripotent stem cells that have been unicellularized and frozen are thawed.
  • Single cellized and frozen cells can be obtained by, for example, step (a) and step (b).
  • Cell frozen products can be transported to remote locations in a frozen state. Therefore, in the present invention, a frozen cell containing a single cell and frozen cell may be obtained and thawed.
  • Frozen cells can be thawed using conventional methods. For example, as usual when thawing cells, immerse the frozen cryopreservation container in a 37 ° C.
  • cryopreservation container when the internal cryopreservation solution thaws about half, transfer the contents of the cryopreservation container to a centrifuge tube. After centrifugation, the solution can be exchanged with the medium.
  • a ROCK inhibitor such as Y-27632 can be added to the medium. After the cryopreservation solution is exchanged with a medium and suspended in the medium, the cells can form cell clumps.
  • a cell clump is formed in the thawed pluripotent stem cell. Formation of cell clumps can be performed by seeding the obtained cells in a well. Cells that have become unicellularly sink naturally due to gravity in the culture medium. In the present invention, as long as cells accumulate on the bottom surface of the well, the shape of the bottom surface is not limited, and the well may be a flat bottom. However, when cells are seeded in a well having a slope, the cells are effectively collected in the well by utilizing the slope of the well. Thereafter, the collected cells form cell clumps with neighboring cells to form cell clumps.
  • the well preferably has a shape that gathers when cells sink, for example, a shape that becomes smaller as the horizontal cross section approaches the bottom surface (bottom). That is, the well preferably has a shape with a concave bottom, for example, a conical shape, a round bottom, a V bottom, a U bottom, and a chamfered flat bottom (having a bottom surface but with a corner and a concave bottom. It is preferable to have a shape of a shape.
  • the shape of the upper opening of each well can be appropriately selected in consideration of ease of processing and the shape in which a large number of wells can be arranged. For example, the shape of a polygon such as a triangle, a quadrangle, or a hexagon Or it can have a circular shape.
  • the present inventors improve the uniformity of the size of colonies obtained after adherent culture when cell culture is started after forming cell clumps, but the 96-well type having large wells with a cell non-adhesive surface It has been found that when cells in a single state suspended in the wells of a microtiter plate are seeded, the cells can form cell clumps with extremely high efficiency. Moreover, surprisingly, the cell clump obtained in a large well was one or more cell clumps of uniform size.
  • freeze-thawed pluripotent stem cells by seeding the thawed cells so as to form one or more cell clumps in one well without partition.
  • “well without partition” means that there is no wall or protrusion separating the bottom surface of the well, the bottom surface of the well is smooth, or a smaller well is inscribed on the bottom surface of the well. Means not.
  • a cell clump is spontaneously formed by depositing on the cell.
  • the size of the well and the number of cells seeded in one well can be determined by those skilled in the art based on the number of cells contained in one cell clump. Can be determined as appropriate.
  • the number of cells contained in one cell cluster can be obtained with reference to FIG. 3F, for example.
  • the size of the well and the number of cells seeded in one well may be determined according to the following guidelines.
  • the ratio of the number of cells that contributed to the cell cluster to the number of seeded cells is estimated to be about 0.1 to about 0.4, and can be determined with reference to the description of this example.
  • the area of the bottom or opening of the well to be seeded is preferably 1 mm 2 or more.
  • the area of the bottom or opening of the well to be seeded can be 1 mm 2 to 400 mm 2 .
  • Area of the bottom portion or the opening of the well may be a 5 mm 2 ⁇ 200 mm 2, may suitably form a cell clump as 5 mm 2 ⁇ 100 mm 2 or 5mm 2 ⁇ 50mm 2.
  • the size of the well can be specified by the area of the opening. Further, the size and shape of the well may be specified by the area of the region where the cells are deposited.
  • the wells of 384-well microtiter plate, 96-well microtiter plate, 48-well microtiter plate, 24-well microtiter plate and 12-well microtiter plate Can be used.
  • the area of the bottom or opening of each well is about 5 mm 2 to 400 mm 2 .
  • the volume of the volume is 50 ⁇ L to 500 ⁇ L
  • the area of the horizontal cross section of the well decreases as it approaches the bottom
  • a well having a round bottom can be preferably used, and more preferably, the top
  • the top A well having a horizontal cross-sectional area of the well located at the midpoint between the opening and the bottom may be 40% to 100% with respect to the top opening area.
  • the volume is 50 ⁇ L to 500 ⁇ L
  • the radius of curvature of the inner surface of the round bottom portion of the well is 1 mm to 3 mm
  • the ridgeline of the inner surface of the well side wall having a tapered shape
  • the center and bottom of the well opening Wells can also be used that have an angle of intersection of 4 degrees to 30 degrees with a straight line through the center (where the straight line is a normal to the horizontal cross section of the well) (eg, FIG. 2).
  • the number of cells to be introduced can be calculated from the cell density.
  • the cell density is 100 to 20,000 cells / mm 2 , 100 to 10,000 cells / mm 2 , and 1,000 to 7,500 cells / mm 2 with respect to the area of the area where the cells are deposited. Or 3,000 to 6,000 cells / mm 2 . By doing so, it is expected that a plurality of cell agglomerates are formed in wells of other sizes as well as in the 96-well type microtiter plate.
  • the number of cells to be introduced depends on the size of the well, but in the case of a normal 96-well microtiter plate for cell culture (opening area: about 33 mm 2 ), 1 ⁇ 10 3 per well. Cells to about 5 ⁇ 10 5 cells, preferably about 5 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 5 cells. From the viewpoint of visibility and recovery rate, the number of cells to be introduced can be preferably 1 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 4 cells per well of a 96-well microtiter plate.
  • the cell clump is usually formed in about 4 to 6 days, depending on the conditions.
  • the cell agglomeration can be quickly transferred to the adhesion culture system, that is, the cell agglomeration can be seeded to start the cell adhesion culture.
  • the cells proliferated well even when the adhesion culture was started 8 days after the formation of the cell agglomeration, but the cell recovery rate was higher when the adhesion culture was started 4 days after the formation of the cell aggregation. Therefore, the period required for the formation of cell clusters is preferably 3 days or more, more preferably about 4 to 10 days, and further preferably about 4 to 6 days.
  • the medium can be exchanged, for example, every 48 hours by a conventional method during the formation of cell clumps.
  • the medium can be exchanged, for example, by 1/3 each.
  • the formation of cell clumps may or may not involve centrifugation. Centrifugation is effective in collecting cell clumps at the bottom of the well and is thought to promote the formation of cell clumps, but the cell recovery rate is high even without centrifugation.
  • the cell agglomeration may be formed while stirring the well for the purpose of increasing the chance that the cell comes into contact with other cells, or may be performed by allowing the well to stand without stirring. Good.
  • Forming cell clumps with occasional stirring of the wells has the advantage of promoting the formation of cell clumps, increasing the size of the formed cell clumps, and improving the cell recovery rate.
  • cell clumps can be formed without centrifugation and with occasional agitation. In the present invention, it is desirable that the stirring be performed carefully so as not to break the cell clumps. Stirring can be performed once every 12 to 48 hours.
  • step (B) thawed pluripotent stem cells are seeded in a well, and one or more cell clusters are formed in the pluripotent stem cell in the well.
  • a person skilled in the art will be able to appropriately determine the number of cells necessary for the cells to form one or more cell clumps in the well and the size and shape of the well to be seeded. In that case, you may refer to the said description regarding the number of introduced cells and a cell density. Specifically, it is as follows. From the viewpoint of obtaining a plurality of cell clumps, it is preferable that the bottom area of the well to be seeded has an area as described above.
  • the number of cells to be introduced can be determined, for example, so that the cell density in the well becomes the cell density as described above.
  • the number of cells to be introduced can be the number of cells as described above.
  • the present inventors show for the first time in this example that, when thawed cells are seeded to form one or more cell clumps in one well without partition, cell clumps can be formed. It was. That is, according to the present invention, it has become possible for the first time to produce a cell cluster from pluripotent stem cells after freeze-thawing. Moreover, when the obtained cell conglomerate was adhered and cultured, a good undifferentiated state was maintained. Thereby, it can be said that the way of the new freeze-thaw method and the subculture method of making a cell clump in the thawed cell, and subculturing after that was opened up.
  • the cell clumps are spontaneously formed.
  • the obtained cell agglomeration is approximately 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, based on the number of cells contained in one cell agglomeration, one or more cell agglomerates (for example, one or a plurality of cell agglomerates) are obtained.
  • Those skilled in the art can appropriately determine the size of the well necessary for forming the cell conglomerate) and the number of cells seeded in one well.
  • the cell agglomerate produced by the method for producing a cell agglomeration of pluripotent stem cells of the present invention or the system described later can be used for cell culture. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for culturing pluripotent stem cells, wherein cell clumps produced by the pluripotent stem cell clump production method of the present invention or a cell clump production system described later are adhered. A method comprising culturing is provided.
  • a cell cluster production system for pluripotent stem cells is provided.
  • the cell cluster production system 100 for pluripotent stem cells of the present invention will be described with reference to FIG.
  • the pluripotent stem cell cluster production system 100 of the present invention includes a dissociation means 10 for dissociating a pluripotent stem cell cluster into single cells, and a mixing means for mixing the dissociated cells into a cryopreservation solution.
  • introduction means 30 for introducing a cryopreservation liquid mixed with cells into a cryopreservation container, freezing means 40 for freezing the cryopreservation liquid mixed with cells in the cryopreservation container, and cryopreservation of the cryopreservation container
  • the dissociation means 10 for dissociating a cell cluster of pluripotent stem cells into a single cell is a means for performing step (a) of the method for producing a cell clump of the present invention.
  • the dissociation means 10 includes, for example, a means 10a (not shown) for bringing the enzyme solution (for example, an actase enzyme solution) used in the step (a) into contact with the cells, and then dissociating the cells into single cells by water flow. Means 10b (not shown).
  • the dissociation means 10 may further include a centrifuge 10c, and after dissociating the cells, the cells may be pelleted by the centrifuge 10c (not shown) and the supernatant discarded.
  • Step (b) of the method for producing a cell agglomeration of the present invention comprises mixing means 20 for mixing dissociated cells into a cryopreservation solution, introduction means 30 for introducing a cryopreservation solution mixed with cells into a cryopreservation container, cells This is performed by a freezing means 40 for freezing the cryopreservation liquid mixed with the above in a cryopreservation container and a cryopreservation means 50 for freezing and preserving the cryopreservation container.
  • the mixing means 20 for mixing the dissociated cells into the cryopreservation solution adds the cryopreservation solution to the dissociated cells and stirs the cells into the cryopreservation solution.
  • Introducing means 30 for introducing a cryopreservation liquid mixed with cells into a cryopreservation container injects the cryopreservation liquid mixed with cells into the cryopreservation container.
  • the freezing means 40 for freezing the cryopreservation liquid in which the cells are mixed in a cryopreservation container a well-known means can be used as a freezing method for pluripotent stem cells.
  • a freezing method for pluripotent stem cells for example, for freezing the cells by a slow cooling method It can have freezing means.
  • Freezing means for freezing cells by the slow cooling method include, for example, a program freezer or a container designed for slow cooling of cells such as Mr. It may have a cell cooling means 40a (not shown), such as means capable of reducing the temperature at a rate of ° C to, for example, -80 ° C.
  • the cryopreservation means 50 for cryopreserving the cryopreservation container can include, for example, a freezing chamber 50a capable of storing the cryopreservation container into which frozen cells have been introduced in a frozen state and its cooling means 50b.
  • the cryopreservation means 50 may include an indoor transport means 50c for carrying a cryopreservation container into the freezer compartment 50a and taking out a desired cryopreservation container from the freezer compartment 50a and a drive mechanism 50d for the indoor transport means.
  • the thawing means 60 for thawing the cryopreservation solution frozen in the cryopreservation container can have a heating means 60a such as a 37 ° C. constant temperature bath or a heat block.
  • the thawing means 60 is also a medium exchange means for exchanging the cell cryopreservation solution with a medium, such as a centrifuge unit for forming a cell pellet, and a solution exchange unit for removing the cryopreservation solution and adding the cell medium. 60b may be provided.
  • the cell agglomeration forming means 70 for forming a cell agglomeration from the thawed cells is a means for carrying out step (c) of the method for producing a cell agglomeration of the present invention.
  • the cell agglomeration forming unit 70 can include, for example, a cell counter 70a for counting cells, a cell seeding unit 70b for seeding cells in a well, and a well 70c used in the step (c).
  • the well 70c and the cells seeded in the well are incubated in an incubator 70d (not shown) for cell culture.
  • the cell clump formation unit 70 may include an agitation unit 70e (not shown) for agitating the well. Cells seeded in the wells spontaneously form cell clumps.
  • the number of cells and the well shape for forming a cell clump are as described above.
  • the stirring unit 70e is not particularly limited, and examples thereof include an electric pipetter that can electrically inhale and discharge the solution
  • the cell cluster production system for pluripotent stem cells of the present invention comprises a cell inlet 1 and an outlet 2.
  • the cultured cells are transferred from the inlet 1 into the cell clump production system, frozen and stored, and then thawed to form a cell clump. Then, the cells are transferred from the outlet 2 and transferred to the adhesion culture system. Can do.
  • the arrows in FIG. 31 indicate the cell transport means 15 in the system.
  • the pluripotent stem cell agglutination production system of the present invention may have a control unit 100A, and preferably performs a series of steps from singularization of pluripotent stem cells to freezing, storage and thawing. It is controlled by the control unit 100A so as to be performed automatically.
  • dissociation means 10 for dissociating the cell mass of pluripotent stem cells into single cells
  • mixing means 20 for mixing the dissociated cells into the cryopreservation liquid, and freezing the cryopreservation liquid mixed with the cells.
  • Introducing means 30 to be introduced into the storage container freezing means 40 for freezing the cryopreservation liquid mixed with cells in the cryopreservation container, cryopreservation means 50 for cryopreserving the cryopreservation container, and freezing in the cryopreservation container
  • the ID information acquisition unit reads ID information such as a barcode attached to a cryopreservation container containing cells that have been cultured, and sends this ID information to the control unit 100A.
  • the control unit 100A can obtain ID information from the cryopreservation containers and identify and manage each cryopreservation container.
  • a barcode reader that reads barcodes can be used as the ID information acquisition unit.
  • the ID information in addition to the identification information of the cryopreservation container, the type of stored cell, HLA typing, culture condition, passage number, and / or evaluation / inspection history may be stored.
  • the control unit 100A particularly identifies and manages each cryopreservation container in the freezer 50a. It is possible to input the ID information of a desired cryopreservation container to the control unit 100A. When the control unit 100A receives the ID information, the conveyance unit 50c is driven by the conveyance mechanism drive mechanism 50d to be cryopreserved. It is possible to remove the cryopreservation container from the means 50.
  • the control unit 100A can be realized by, for example, a general-purpose computer as hardware and a program for operating the computer as software.
  • the software is stored in a recording medium such as a hard disk drive that is fixedly provided in the computer, or is stored in a recording medium that is detachably set in the computer, such as a CDROM, DVD, or flash memory.
  • a recording medium is indicated by reference numeral 100B.
  • the processor 100C calls and executes a predetermined processing recipe from the recording medium 100B based on an instruction from a user interface (not shown) or the like as necessary, thereby causing a cell cluster of pluripotent stem cells under the control of the control unit 100A.
  • Each means of the manufacturing system operates to perform a predetermined process.
  • control unit 100A allows the above-described functional units, for example, enzymes provided in the dissociation means 10 to be the cells by software so as to realize the operation of the cell cluster production system for pluripotent stem cells of the present invention described below.
  • the driving mechanism 50d of the indoor transport means 50b, the heating means 60a and the medium exchanging means 60b provided in the thawing means 60, and the cell seeding means 70b provided in the cell clump forming means 70 can be driven and controlled.
  • the control unit 100A may stop the seeding of cells by the cell seeding means 70b when the number of cells seeded in the well reaches a predetermined value.
  • the pluripotent stem cells are introduced into the dissociation means 10 for dissociating the pluripotent stem cell mass into single cells.
  • the dissociation means 10 dissociates cell clusters formed from pluripotent stem cells into single cells. Dissociation of cell clumps into single cells is achieved by weakening cell-cell adhesion in the cell clumps by means 10a for contacting cells with an enzyme that dissociates cell adhesion (for example, an actase enzyme solution).
  • the cells can be dissociated into single cells by the means 10b for dissociating the clumps into single cells.
  • the cells dissociated into single cells are mixed into the cryopreservation solution by the mixing means 20 for mixing the dissociated cells into the cryopreservation solution, and then the cryopreservation solution mixed with the cells is stored frozen. It is introduced into the cryopreservation container by the introduction means 30 for introducing into the container. Thereafter, the cryopreservation container is transported to the freezing means 40 for freezing the cryopreservation liquid mixed with cells by the transporting means 15 in the cryopreservation container.
  • the cryopreservation container conveyed to the freezing means 40 for freezing the cryopreservation liquid mixed with cells in the cryopreservation container is frozen by the cell cooling means 40a.
  • the frozen cryopreservation container is preferably transported to the cryopreservation means 50 for cryopreserving the cryopreservation container by the transport means 15 while being immersed in liquid nitrogen.
  • the cryopreservation container transported to the cryopreservation means 50 has its ID information read by the ID information acquisition unit as necessary, and then carries the cryopreservation container into the freezer and takes out the cryopreservation container from the freezer. Is transported and stored in the freezer compartment 50a by the transport means 50c. When taking out the stored cryopreservation container, the desired cryopreservation container is taken out of the freezer compartment by the transport means 50c. When taking out, a desired cryopreservation container may be taken out based on the ID information input to the control unit 100A.
  • the taken-out cryopreservation container is preferably transported to the thawing means 60 for thawing the cryopreservation solution frozen in the cryopreservation container by the transporting means 15 while being immersed in liquid nitrogen.
  • the cryopreservation container conveyed to the thawing means 60 is heated by a heating means 60a such as a 37 ° C. constant temperature bath or a heat block, and the cell suspension in the cryopreservation container is thawed.
  • a heating means 60a such as a 37 ° C. constant temperature bath or a heat block
  • the cell suspension in the cryopreservation container is thawed.
  • the cryopreservation solution is exchanged to the medium as completely as possible by means 60b for replacing the cell cryopreservation medium with the medium and suspension means 60c for suspending the medium.
  • the suspension means 60c for suspending the medium can suspend the medium until the cell clumps are dissociated to the single cell level.
  • An example of the suspending means 60c for suspending the medium includes an electric pipettor.
  • the suspended cells are conveyed to a cell agglomeration forming unit 70 that forms a cell agglomeration from the thawed cells by
  • the cells conveyed to the cell agglomeration forming means 70 are seeded in the well 70c by the means 70b for seeding cells.
  • the number of cells to be seeded is adjusted by the cell counter 70a.
  • the number of cells to be seeded is appropriately set depending on the size of the well 70c.
  • the well 70c and the cells seeded in the well are incubated in a cell culture incubator 70d (not shown), and the seeded cells spontaneously form a cell clump in the well 70c.
  • the well 70c may be stirred by a stirring means 70e (not shown) that stirs the well in order to grow the cell clump larger.
  • the formed cell agglomeration is carried out from the means 70 for forming the cell agglomeration through the carry-out port 2 and can be used for culture thereafter.
  • Example 1 Freezing and thawing of pluripotent stem cells and cell agglomeration using round-bottomed wells
  • cells were frozen by slow cooling and then single-celled, and cells were then thawed into thawed pluripotent stem cells. Agglomerates were formed.
  • An outline of the procedures for freeze-thawing and cell clump formation is shown in FIG.
  • iPS cells human iPS cells (established strain by Kawasada Laboratory, Cell Evaluation Group, Advanced Medical Promotion Foundation) were used.
  • ReproFF2 medium manufactured by ReproCell, product number: RCHEMD006 was used.
  • iPS cells Single humanization of human iPS cells
  • Human iPS cells were seeded in 6-well plates (BD Falcon, product number: 353046) and cultured until the sixth day of culture (that is, until the logarithmic growth phase was reached).
  • Visually abnormal iPS cell colonies were removed by suction with an aspirator, and then all the medium was removed with an aspirator.
  • Each well was washed with Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) (Life Technologies, product number: 14190) and then warmed to 37 ° C in advance (Innovative Cell Technologies, product number: 200 ⁇ L of AT104) was added to each well.
  • DPBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • Cryopreservation of cells was performed as follows. The suspension of iPS cells was centrifuged (2,500 G, 5 minutes), the supernatant was discarded, and the cells were again suspended in ReproFF2 medium supplemented with Y27632. After cell counting, a cell suspension of 2 ⁇ 10 5 cells was collected and dispensed into 1.5 mL tubes, centrifuged (2,500 G, 5 minutes), and the supernatant was discarded. iPS cells were suspended in an ice-cold cryopreservation solution, and the cell suspension was transferred to a cryopreservation vessel and again kept on ice.
  • cryopreservation containers were placed in a Cryo 1 ° C. Freezing Container (manufactured by Thermo Scientific, product number: 5100-001), and then cryopreserved in a ⁇ 80 ° C. freezer.
  • cryopreservation solution various cryopreservation solutions in Table 1 were used. The amount of cryopreservation solution used and the storage method were determined based on the manufacturer's manual for each cryopreservation solution.
  • cryopreservation container was taken out from Cryo 1 ° C Freezing Container, moved to a liquid nitrogen storage container, and stored frozen.
  • the frozen storage container was immersed in a constant temperature bath at 37 ° C. while gently shaking, and the frozen storage solution was half-thawed. Thereafter, the entire amount of the preservation solution was transferred to a 15 mL centrifuge tube.
  • ReproFF2 medium supplemented with 5 volumes of Y27632 was added and stirred. The supernatant was discarded by centrifugation (2,500 G, 5 minutes). Newly, 800 ⁇ L of ReproFF2 medium supplemented with Y27632 was added and lightly pipetted.
  • FIG. 9A shows the state of the cell agglomeration 48 hours after the start of the cell agglomeration, whereas in the cells in culture, the cells aggregated at the bottom of the well to form a cell agglomeration.
  • FIG. 9B shows the cells after freezing and thawing.
  • Pluripotent stem cells may initiate uncontrolled differentiation when they form cell clumps. Even with AggreWell, which is used to form cell clumps as a pre-stage of differentiation experiments for pluripotent stem cells, human cell clumps are formed for 24 hours. Further, it has not been considered that cell clumps can be formed over 3 days or 4 days or more during normal subculture or cryopreservation. However, in the cell clumps artificially formed according to this example, the pluripotent stem cells after freezing and thawing are in an undifferentiated state even when the cell clumps are continuously formed over a long period of 12 days. It became clear to keep.
  • FIG. 7 shows the growth of colonies when pluripotent stem cells thawed by the above method are seeded in 6-well plates without forming cell clumps. Even when seeded without forming cell clumps, it was observed that some cells formed colonies (FIG. 7). However, the number of colonies was very small compared to the number of seeded (0.068%, FIG. 8A). Moreover, when observed on the 14th day of culture, many colonies formed were relatively small (FIG. 8B). The increase rate after 7 days of freezing and thawing (that is, the ratio of the number of cells at the 7th day after thawing to the number of cells before freezing) was about 420%. However, under these conditions, the variation in the size of each colony during adhesion culture was large, and could not be said to be a condition suitable for automation of subculture.
  • FIG. 9 shows the state of cell clump formation when pluripotent stem cells thawed by the above method are seeded on AggreWell (trademark) to form cell clumps.
  • AggreWell trademark
  • PrimeSurface (trademark) 96M manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. the well is large, and it is said that one large cell clump can be obtained per well when seeded with human iPS cells in culture.
  • the frozen and thawed iPS cells formed one or more small cell clumps in one well of Sumitomo Bakelite's PrimeSurface TM 96M. This result suggests that dead cells are contaminated after freezing and thawing, which inhibits the formation of cell clumps.
  • cell clumps Due to the presence of dead cells, cell clumps cannot be integrated into one, and when using a large well, one or more cell clumps are formed, and when using a small well, cell clumps are formed. It was thought that the result would be suppressed.
  • Example 2 Conditions for forming cell clumps
  • the conditions for forming cell clumps in pluripotent stem cells were examined.
  • the cells used were human iPS cells frozen and thawed in Example 1. Moreover, in order to form a cell clump, a well of Prime Surface (trademark) 96M manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. was used.
  • a method of collecting cells at the bottom of the well by utilizing natural fall under gravity (“stationary”) and a method of collecting cells at the bottom of the well by performing a centrifugation treatment (“centrifugation”) is possible.
  • Example 3 Time required to form cell clumps
  • the time required to form cell clumps in pluripotent stem cells was examined.
  • the cells used were human iPS cells frozen and thawed in Example 1. Moreover, in order to form a cell clump, a well of Prime Surface (trademark) 96M manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. was used.
  • the cells were dispensed into wells and allowed to stand in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ). After 4 days or 8 days of standing, the cell clumps were collected, and the cell clumps were seeded in a 6-well plate. The increase rate of the cells on the 14th day of thawing was calculated. In this example, the centrifugal treatment was performed under conditions of 2,000 g and 5 minutes. Agitation was performed mildly so as not to destroy the cell clumps every 12 hours.
  • Example 4 Number of cells introduced into wells during formation of cell clumps
  • the number of cells introduced into each well during the formation of cell clumps was examined.
  • the cells used were human iPS cells frozen and thawed in Example 1. Moreover, in order to form a cell clump, a well of Prime Surface (trademark) 96M manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. was used.
  • the number of cells to be seeded is 1 ⁇ 10 5 cells per well (cell density: about 15,000 cells / mm 2 ), 5 ⁇ 10 4 cells (cell density: about 7,000 cells / mm 2 ), 2 ⁇ 10 5 4 cells (cell density: about 6,000 cells / mm 2 ), 1 ⁇ 10 4 cells (cell density: about 3,000 cells / mm 2 ) or 5 ⁇ 10 3 cells (cell density: about 1,500 cells / mm 2 ) mm 2 ).
  • the cell density is a value obtained by dividing the number of cells seeded by the area of the portion where the cells are stacked when the inside of the well is observed from above the well with a microscope. The formation of cell clumps after 2 days, 4 days or 6 days after seeding was observed.
  • FIG. 21 CryoStem was used as a cryopreservation solution. Even when mFreSR was used, the formation of cell clumps was clearly observed after 4 days and 6 days after seeding (FIG. 22).
  • FIG. 22 Even when cells were seeded at a cell density of about 1,500 cells / mm 2 to about 15,000 cells / mm 2 , cell clumps could be formed well in the wells. It has been clarified that a cell clump can be formed stably and easily even if the cells necessary for forming a cell clump are seeded at any of the above cell densities.
  • the number of cells to be seeded is preferably 1 ⁇ 10 4 cells or more per well. More preferred was 1 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 4 cells per well.
  • Each of the cell clumps formed as described above was seeded in a 6-well plate, and colonies after 2 days were observed. Then, when the number of cells to be seeded was 5 ⁇ 10 3 cells per well, the formed colonies tended to be slightly small (FIG. 23). When the diameter of colonies formed was counted, the number of cells to be seeded was almost the same when the number of cells to be seeded was 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 5 cells per well, whereas the cells to be seeded When the number was 5 ⁇ 10 3 cells per well, the colony diameter tended to be smaller than the others (FIG. 24).
  • the number of cells was counted 2 days after seeding in a 6-well plate. Then, the number of cells tended to be large when the number of cells was 1 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 4 cells per well (FIG. 25). Using this technique, it was confirmed that cells introduced per well can be arbitrarily selected over a wide range.
  • the number of cells to be seeded is preferably a certain value or more, and adverse effects due to cell confluence are prevented. From the viewpoint of improving the visibility of the well and the well, the number of cells to be seeded (cell density) is preferably not more than a certain value.
  • the cells to be introduced into one well during the formation of cell clumps can be arbitrarily set, but 1 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 4 cells (cell density: about 3,000 / mm 2 to about 6,000 / mm 2 ), the above conditions were satisfied, and it was also excellent from the viewpoint of visibility of individual cell clumps in the well.
  • Example 5 Effect of cryopreservation solution on cells
  • the effect of the cryopreservation solution on cells was examined.
  • the cryopreservation solution was CryoStem, and iPS cells were suspended in the cryopreservation solution, and then on ice for 0 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2.5 hours, or 6 hours.
  • the mixture was allowed to stand and then frozen and thawed by the method described in Example 1 to form cell clumps. Then, the formation of cell clumps could be confirmed under any condition, but the number of cell clumps was less when the cells were allowed to stand for 6 hours (FIG. 26).
  • the formed cell cluster was seeded in a 6-well plate and cultured for 8 days. Then, it was found that the colonies formed in the cells that were suspended in the cryopreservation solution and allowed to stand for 6 hours were small (FIG. 27).
  • the cells were seeded in wells of Prime Surface (trademark) 96M manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., and the cell clumps on the 14th day were observed.
  • the method of the present invention has a large time margin for operation, and is considered to have a great advantage in terms of operation stability, mechanization, and increase in quantity.
  • Comparative Example 1 Comparison of Freezing Method In the method of the present invention, cells are dissociated into single cells and then frozen, and then a cell clump (clamp) is formed again before culturing. In this comparative example, a comparison between normal clamp freezing and freezing according to the present invention was performed.
  • cryopreservation method of the present invention has better recovery of cells after freezing than conventional clamp freezing in which the clamp is frozen as it is.
  • the cryopreservation method of the present invention is more advantageous than the conventional clamp freezing method in the following points. That is, in the cryopreservation method of the present invention, a reagent having low toxicity can be used, and by making it into a single cell, the difference in the freezing condition for each cell is small, that is, the difference in the frozen state between the cryovials is small. In addition, after freezing, the cells can be recovered well by forming an agglomerate and then performing adhesion culture.
  • the method of the present invention in which the cells are frozen after being made into a single cell is advantageous in fully automating the procedure.
  • it has been required to obtain and freeze a uniform cell agglomeration without breaking the cell agglomeration as much as possible, and this has been difficult to achieve, and a very high technical level was required.
  • the unicellularization step can be easily achieved by enzyme treatment or physical treatment with water flow, and the formation of cell clumps after freezing and thawing should be set according to the conditions of the present invention. Is easily achievable. That is, according to the present invention, not only stable and homogeneous cell freezing and thawing can be performed, but also this process can be mechanized.
  • the cryopreservation method of the present invention has a better recovery rate of cells after thawing than the conventional method.

Abstract

　多能性幹細胞の細胞集塊製造方法を提供することを課題とし、かかる課題を解決するために、多能性幹細胞の細胞集塊を製造する方法であって、（Ａ）単一細胞化され、凍結された多能性幹細胞を解凍することと、（Ｂ）解凍した多能性幹細胞に細胞集塊を形成させることとを含んでなる方法を提供する。

Description

多能性幹細胞の細胞集塊製造方法および細胞集塊製造システム
　本発明は、多能性幹細胞の細胞集塊製造方法および細胞集塊製造システム、ならびに、該細胞集塊製造方法または該細胞集塊製造システムによって製造された細胞集塊を用いた多能性幹細胞の培養方法に関する。
　多能性幹細胞は、接着培養によりコロニーを形成する。多能性幹細胞の凍結保存は、このコロニーを剥離して得られた細胞集塊を凍結保存するものである。多能性幹細胞の細胞集塊を凍結するための凍結保存液としては、様々なものが市販されている（例えば、特許文献１）。これらの凍結保存方法においては、ガラス化法と緩慢凍結法が主に用いられている。
　しかしながら、ガラス化法により多能性幹細胞の細胞集塊を凍結するための凍結保存液は細胞毒性が強く、細胞を凍結保存液で懸濁した後には迅速に凍結させる必要があった。そのため、解凍後の細胞の回復の程度が一定せず、操作者の個人差が発生するばかりでなく、操作の機械化および細胞の大規模処理には適さなかった。また、緩慢凍結法では、フィーダーフリー条件で培養した細胞は、解凍後の生存率が極めて低いことが知られており、多能性幹細胞の凍結保存法としては適さないと考えられていた。
　このように、ガラス化法と緩慢凍結法のいずれも凍結操作の機械化および細胞の大規模処理に適した方法ではない。また、機械化および細胞の大規模処理が可能な多能性幹細胞の凍結保存方法は報告されていない。
国際公開第２００５／０４５００７号パンフレット
　本発明は、多能性幹細胞の細胞集塊製造方法および細胞集塊製造システム、ならびに、該細胞集塊製造方法または該細胞集塊製造システムによって製造された細胞集塊を用いた多能性幹細胞の培養方法を提供する。
　本発明者らは、多能性幹細胞を単一細胞化して凍結させた場合には、解凍後、単一細胞化した細胞をそのまま接着培養系に移すと復帰してくる細胞が少ないことや、成長するコロニーの大きさにばらつきが生じることを見出した。そこで、解凍後、単一細胞化した細胞に細胞集塊を形成させてから接着培養系に移す試みを行った。細胞非接着性表面を持つウェルを用いて細胞集塊を形成させたところ、解凍した多能性幹細胞は、解凍直後にも関わらず細胞集塊を形成することを見出した。形成された細胞集塊は、未分化状態を維持しており、得られるコロニーの大きさのばらつきが少なく、その後の良好に培養することが可能であり、かつまた復帰してくる細胞が多いことも見出した。また、大きなウェルを用いて解凍した細胞に細胞集塊を形成させてから接着培養を行なうと、１ウェル中に複数の大きさの揃った細胞集塊が形成されることや、この細胞集塊を接着培養すると極めて効率良く細胞を増殖させることができ、かつ、得られるコロニーの大きさも揃っていることを見出した。本発明はこのような知見に基づいて行われたものである。
　すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）多能性幹細胞の細胞集塊を製造する方法であって、
　（Ａ）単一細胞化され、かつ、凍結された多能性幹細胞を解凍することと、
　（Ｂ）解凍した多能性幹細胞に細胞集塊を形成させることと、
を含んでなる、方法。
（２）工程（Ａ）の前に、
　（ａ）多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させることと、
　（ｂ）細胞を凍結して保存することと、
をさらに含んでなる、上記（１）に記載の方法。
（３）工程（Ｂ）において、解凍した多能性幹細胞をウェルに播種してウェル中で多能性幹細胞に１以上の細胞集塊を形成させる、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）工程（Ｂ）において、細胞集塊をウェル中で複数形成させる、上記（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）工程（Ｂ）において、細胞を細胞密度１００～２０，０００個／ｍｍ２となるようにウェルに播種することにより細胞集塊を形成させる、上記（１）～（４）に記載の方法。
（６）多能性幹細胞の凍結が、緩慢凍結法により行われる、上記（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）工程（Ｂ）が、細胞集塊形成中にウェルを攪拌することを含んでなる、上記（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、上記（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）ウェルが、錐形状、丸底、Ｖ底、Ｕ底、角取平面底または平面底のウェルである、上記（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）工程（Ｂ）のウェルが、丸底９６穴型マイクロタイタープレートのウェルであり、１ウェル当りに播種する細胞数が５×１０３個～１×１０５個であり、細胞がヒトｉＰＳ細胞である、上記（１）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）工程（Ｂ）において、多能性幹細胞の細胞集塊の形成時間が、１４日以下である、上記（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）多能性幹細胞の細胞集塊製造システムであって、
　　多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させる解離手段と、
　　解離させた細胞を凍結保存液に混入させる混入手段と、
　　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器に導入する導入手段と、
　　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させるための凍結手段と、
　　凍結保存容器を凍結保存する凍結保存手段と、
　　凍結保存容器中で凍結した凍結保存液を解凍する解凍手段と、
　　解凍した細胞を細胞培養培地に混入させる混入手段と、
　　培地に混入させた細胞から細胞集塊を形成させる細胞集塊形成手段と
を備えた、細胞集塊製造システム。
（１３）凍結手段が、緩慢凍結により凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させるための凍結手段である、上記（１２）に記載のシステム。
（１４）前記細胞集塊形成手段が、錐形状、丸底、Ｖ底、Ｕ底、角取平面底または平面底のウェルを有する、上記（１２）または（１３）に記載のシステム。
（１５）上記（１２）～（１４）のいずれかに記載のシステムを制御するコンピュータに、多能性幹細胞の細胞集塊製造方法を実行させるためのコンピュータプログラムを格納した記録媒体であって、
　多能性幹細胞の細胞集塊製造方法は、
　　多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させることと、
　　解離させた細胞を凍結保存液に混入させることと、
　　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器に導入することと、
　　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させることと、
　　凍結保存容器を凍結保存することと、
　　凍結保存容器中で凍結した凍結保存液を解凍することと、
　　解凍した細胞を細胞培養培地に混入させることと、
　　培地に混入させた細胞から細胞集塊を形成させることと
を含んでなる、記録媒体。
（１６）多能性幹細胞を培養する方法であって、上記（１）～（１１）のいずれかに記載の方法または上記（１２）～（１４）のいずれかに記載のシステムによって製造された多能性幹細胞の細胞集塊を接着培養することを含んでなる、方法。
　細胞集塊は、ピペット操作などにより容易に崩壊するため、技術者の技能により大きさや形状、濃度にばらつきが生じ、従って、凍結条件を均質に保つことは困難であると考えられる。しかし、本願発明では、単一細胞化させてから凍結させるため、凍結は均質に行われ得る。従って、本発明の方法は、継代培養の自動化に適している。本発明ではまた、単一細胞化して凍結解凍した細胞は、速やかに細胞集塊を形成させてから本培養をおこなうと、細胞集塊を形成させない場合と比べて生理的に良好な培養が実現される。
図１は、本発明の多能性幹細胞の細胞集塊製造方法および該方法によって製造された細胞集塊を用いた多能性幹細胞の培養方法の手順の概略を示す。 図２は、実施例１で細胞集塊を形成させるために用いたウェルの断面形状を示す。 図３は、ウェル中で形成された細胞集塊を示す。図３Ａ～Ｅはそれぞれ、細胞凍結保存液として、ＣｒｙｏＳｔｅｍ（図３Ａ）、ｍＦｒｅＳＲ（図３Ｂ）、Ｓｙｎｔｈ－ａ－Ｆｒｅｅｚｅ（図３Ｃ）、ＡＴＣＣ（図３Ｄ）およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（図３Ｅ）を用いて凍結させた多能性幹細胞の解凍後に形成された細胞集塊を示す。図３Ｆは、細胞集塊に含まれる細胞数と細胞集塊の直径との関係を示す図である。 図４は、細胞集塊を接着培養皿に播種後、１０日目の細胞コロニーの様子を示す。 図５は、細胞集塊を接着培養皿に播種後、１～６日目の細胞コロニーの成長の推移を示す。 図６は、得られた細胞コロニーが未分化マーカーを発現することを示す。 図７は、単一細胞化した多能性幹細胞をそのまま接着培養皿に播種後、２～１４日目の細胞コロニーの成長の推移を示す。 図８は、単一細胞化した多能性幹細胞をそのまま接着培養皿に播種して１４日目のコロニー数および推定細胞数（図８Ａ）並びにコロニーの顕微鏡画像（図８Ｂ）を示す。 図９は、解凍後の単一細胞化した多能性幹細胞にＡｇｇｒｅＷｅｌｌを用いて細胞集塊を形成させた結果を示す。 図１０は、解凍後の単一細胞化した多能性幹細胞にＡｇｇｒｅＷｅｌｌを用いて細胞集塊を形成させ、その後接着培養皿に播種して１２日目のコロニー数およびコロニー展開率（図１０Ａ）並びにコロニーの顕微鏡画像（図１０Ｂ）を示す。 図１１は、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標）96Mのウェルを用いて凍結後の単一細胞化した多能性幹細胞に細胞集塊を形成させた際の細胞集塊の形状の推移を示す。 図１２は、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標）96Mのウェルに解凍した単一細胞化多能性幹細胞を播種して４日目に得られる細胞集塊を接着培養皿に播種して１０日目のコロニー数および推定細胞数（図１２Ａ）並びにコロニーの顕微鏡画像（図１２Ｂ）を示す。 図１３は、単一細胞化して多能性幹細胞を凍結させた後、細胞集塊を形成させないで（条件１）、または細胞集塊を形成させてから（条件２および３）接着培養を開始した場合の、解凍後１４日目の細胞の回収率の比較データを示す。 図１４は、実施例２の細胞集塊の形成に対する、凍結保存用液の種類および攪拌の有無の影響を示す。 図１５は、実施例２の細胞集塊の形成に対する、凍結保存用液の種類および攪拌の有無の影響を示すグラフである。 図１６は、攪拌しながら細胞集塊を形成させると、形成される細胞集塊の大きさが増大することを示す。 図１７は、細胞集塊形成（形成期間は４日間）の初期の遠心処理の有無および形成中の攪拌の有無が細胞の回収率に与える影響を示す。 図１８は、図１７の結果から得られたグラフである。 図１９は、細胞集塊形成（形成期間は８日間）の初期の遠心処理の有無および形成中の攪拌の有無が細胞の回収率に与える影響を示す。 図２０は、図１９の結果から得られたグラフである。 図２１は、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標）96Mの各ウェルに導入する細胞数が与える細胞集塊形成への影響を示す。凍結保存液は、ＣｒｙｏＳｔｅｍである。 図２２は、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標）96Mの各ウェルに導入する細胞数が与える細胞集塊形成への影響を示す。凍結保存液は、ｍＦｒｅＳＲである。 図２３は、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標）96Mの各ウェルに導入する細胞数の多能性幹細胞コロニー形成への影響を示す。 図２４は、図２３で形成されたコロニーサイズのヒストグラム（図２４左）とそのサイズの平均値および標準偏差（図２４右）を示す。 図２５は、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標）96Mの各ウェルに導入する細胞数と接着培養開始後得られる細胞数との関係を示す。 図２６は、凍結前の凍結保存液と細胞との接触時間が、解凍後の細胞による細胞集塊の形成に及ぼす影響を示す。 図２７は、図２６で得られた細胞集塊を接着培養皿に播種して８日後のコロニーの顕微鏡画像である。 図２８は、細胞集塊を形成させて１４日目の細胞集塊の顕微鏡画像を示し、図中の時間は、凍結前の凍結保存液と細胞との接触時間を示す。 図２９は、凍結前の凍結保存液と細胞との接触時間が細胞の回復の程度に与える影響を示す。図２９Ａは、凍結保存液がＣｙｔｏＳｔｅｍであるときの結果を示し、図２９Ｂは、凍結保存液がｍＦｒｅＳＲであるときの結果を示す。 図３０は、従来凍結法と本発明の凍結法による凍結後の細胞の回復の程度を示す。 図３１は、本発明の多能性幹細胞の細胞集塊製造システムの概要を示す。
発明の具体的な説明
　本発明では、簡便で、操作によるブレの少ない多能性幹細胞の細胞集塊製造方法および細胞集塊製造システム、ならびに、該細胞集塊製造方法または該細胞集塊製造システムによって製造された細胞集塊を用いた多能性幹細胞の培養方法が提供される。
　本発明の凍結保存の対象となる細胞は、多能性幹細胞である。本発明で用いられる多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞または人工多能性幹細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）または、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などの多能性幹細胞が挙げられ、好ましくは、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞である。本発明に用いる多能性幹細胞はまた、好ましくは、霊長類または齧歯類などの哺乳類の多能性幹細胞であり、より好ましくは、ヒトの多能性幹細胞である。本発明に用いる多能性幹細胞は、最も好ましくは、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である。
　一般的に多能性幹細胞にとって単一細胞化は好ましいものではなく、従前の多くのプロトコルが多能性幹細胞を細胞塊の状態で凍結保存する手法を採用している。しかし、本発明によれば、単一細胞化して凍結解凍した細胞は、速やかに再び細胞集塊を形成させてから、細胞集塊を播種して本培養を行なうことにより、生理的にも回復の程度においても良好な凍結解凍が可能である。
　従って、本発明によれば、多能性幹細胞の細胞集塊を製造する方法であって、
　（Ａ）単一細胞化され、かつ、凍結された細胞を解凍することと、
　（Ｂ）解凍した多能性幹細胞に細胞集塊を形成させることと、
　を含んでなる方法が提供される。
　本発明の一実施態様において、多能性幹細胞の細胞集塊を製造する方法は、工程（Ａ）の前に、
　（ａ）多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させることと、
　（ｂ）細胞を凍結して保存することと、
をさらに含んでなる。
　以下、工程（ａ）、工程（ｂ）、工程（Ａ）および工程（Ｂ）について説明する。
（ａ）多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させること
　多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させてから凍結させるために、工程（ａ）では、多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させる。本発明の一実施形態では、工程（ａ）において、多能性幹細胞コロニーを剥離して得られる多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させる。
（細胞接着面からの細胞の剥離）
　多能性幹細胞は、接着培養を行なうと、培養容器の接着表面上でコロニー状の細胞塊を形成する。本発明では、接着培養において、酵素的に、生理的にまたは物理的に細胞接着面から剥離させた多能性幹細胞を用いることができる。本発明では、多能性幹細胞を細胞接着面から剥離させる酵素としては、常法で用いられる酵素を用いることができ、例えば、トリプシン、ディスパーゼ、アキュターゼおよびコラゲナーゼなどの酵素を用いることができる。多能性幹細胞の細胞接着面からの剥離はまた、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの二価イオン（特にＭｇ２＋）のキレート剤など、細胞剥離作用を有する化学物質を用いて行ってもよく、これらを上記酵素と組み合わせて用いて行ってもよい。本発明ではまた、多能性幹細胞を細胞接着面から剥離させるために、細胞の接着表面に高周波振動などの振動を与えてもよく、および／または、セルスクレイパーを用いてもよい。本発明では更に、上記の生理学的な剥離法と物理的な剥離法を組み合わせて細胞を剥離してもよい。当業者であれば、細胞接着面からの多能性幹細胞の剥離は上記のような周知の剥離法を用いて適宜行うことができるであろう。
　本発明では、細胞塊は単一細胞にまで解離させることができる。細胞塊の解離は、細胞の培養面からの剥離と同時に行ってもよいし、細胞塊として剥離させた後に行ってもよい。
（細胞塊の解離）
　培養面から剥離させた細胞塊は、酵素を用いてさらに処理することにより単一細胞レベルにまで分散させてもよい。細胞を単一細胞レベルにまで解離させるために用いることができる酵素としては、細胞－細胞間の結合を切断することのできる酵素や細胞－細胞外基質（ＥＣＭ）間の結合を切断することのできる酵素を挙げることができ、これらの酵素は、当業者に周知である。細胞を単一細胞レベルにまで解離させるために用いることができる酵素としては、例えば、アキュターゼなどが挙げられる。接着面から剥離させた細胞が細胞塊の形状を保っている場合には、剥離させた細胞塊は、例えば、ピペッティングの水流により単一細胞レベルにまで解離させてから分散させることができる。酵素や水流を用いた細胞塊の解離は、自動化が可能であり、工程（ａ）は自動化が可能である。
　細胞を単一細胞レベルにまで解離させ分散させている間は、分散させた細胞の懸濁液に、細胞を分散させたことによる細胞への悪影響（例えば、細胞死等）を抑制する化合物、例えば、Ｙ－２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を添加することができる。
（ｂ）細胞を凍結して保存すること
　工程（ｂ）では、単一細胞に解離させた多能性幹細胞を凍結して保存する。単一細胞に解離させた多能性幹細胞は、多能性幹細胞の凍結に適した周知の方法により凍結させることができる。以下、細胞の凍結によく用いられる緩慢冷却法について説明する。
　緩慢冷却法とは、緩慢凍結法とも呼ばれ、５～２０％程度のジメチルスルホキシドやグリセロールなどの凍結保護剤を添加した凍結保存溶液に細胞を懸濁し、緩慢に冷却して（例えば、１℃／分の冷却）細胞を凍結する方法である。緩慢冷却法では、ゆっくりと冷却することにより細胞外の溶液中の水分が徐々に結晶化し、細胞外溶液の浸透圧が上昇する。すると、細胞内の水分が浸透圧の差により細胞外に流出する。このようにして細胞内の水分が脱水されて細胞が濃縮されると細胞内に氷の結晶が形成されにくくなり、ガラス化状態を生み出す。このガラス化状態では、細胞の破壊は起こらないため、一般的な細胞などの凍結手法として常用されている。緩慢冷却法は、通常はプログラムフリーザーなどを用いて行うことができるが、市販の細胞凍結保存液および市販の凍結容器（例えば、Mr. Frosty Freezing Container（商標）（Thermo Scientific社製））などを用いて行うこともできる。このように、工程（ｂ）では、緩慢冷却法により細胞を凍結させることができる。
　本発明では、凍結保存液としては、特に限定されないが、表１に記載の凍結保存液を用いることができる。一般に、凍結保存液は細胞に対し毒性を有するため、長時間細胞を浸漬した状態に置くことは好ましくないと考えられている。本発明でも、凍結保存液中での細胞の保持時間は短くすることが好ましいが、本発明では、凍結保存液中での細胞懸濁液を長時間（例えば、６時間以内、好ましくは２．５時間以内、より好ましくは１時間以内、さらに好ましくは３０分以内、さらにより好ましくは１５分以内、特に好ましくは２分以内）氷上で保持しても、細胞の生存率は維持されやすい。従来の多能性幹細胞で用いられてきたガラス化法で用いられるガラス化試薬では、凍結保存液中での細胞懸濁液の保持時間は１５秒以内とすることが求められており、本発明の方法は、凍結保存液に細胞を混入させてから、または懸濁してから、凍結までの時間的猶予の点で大きな利点を有するものであり、例えば、細胞の大量処理や操作の機械化の際に極めて有利である。
　細胞を凍結した後は、細胞を凍結保存することができる。凍結保存容器中の細胞の凍結保存は、冷凍室の温度を－８０℃以下に維持できるディープフリーザー中か、あるいは、長期保存の観点からは、液体窒素中で行なわれる。
　単一細胞化され、かつ、凍結された多能性幹細胞は、解凍後、細胞集塊を形成させてから接着培養に供することができる。
（Ａ）単一細胞化され、かつ、凍結された多能性幹細胞を解凍すること
　工程（Ａ）では、単一細胞化され、かつ、凍結された多能性幹細胞を解凍する。単一細胞化され、かつ、凍結された細胞は、例えば、工程（ａ）および工程（ｂ）により得ることができる。細胞凍結物は、凍結状態で遠隔地に輸送することができる。従って、本発明では、単一細胞化され凍結された細胞を含む細胞凍結物を入手して、解凍してもよい。凍結した細胞は、常法を用いて解凍することができる。例えば、通常細胞を解凍する際に行うように、３７℃の恒温槽に凍結した凍結保存容器を浸し、内部の凍結保存液が半分程度解凍したところで凍結保存容器の内容物を遠心管に移し、遠心分離した後に培地で溶液交換することができる。培地には、Ｙ－２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を添加することができる。凍結保存液を培地で交換し、培地で懸濁した後に、細胞に細胞集塊を形成させることができる。
（Ｂ）解凍した多能性幹細胞に細胞集塊を形成させること
　工程（Ｂ）では、解凍した多能性幹細胞に細胞集塊を形成させる。細胞集塊の形成は、得られた細胞をウェルに播種することにより行うことができる。単一細胞化された細胞は、培養液中では重力により自然と沈む。本発明では細胞がウェル底面に集積する限りその底面形状は限定されず、ウェルは平面底でもよい。しかし、傾斜を有するウェル（くぼみ）中に細胞を播種すると、ウェル中では細胞がウェルの傾斜を利用して効果的に集まる。その後、集まった細胞は、隣り合う細胞と細胞接着を形成して細胞集塊を形成する。従って、本発明では、ウェルは、細胞が沈んだときに集まる形状、例えば、その水平断面が底面（底部）に近づくほど小さくなる形状を有していることが好ましい。すなわち、ウェルは、底がすぼんだ形状を有していることが好ましく、例えば、錐形状、丸底、Ｖ底、Ｕ底および角取平面底（底面を有するが角が取れて底がすぼんだ形状となったもの）の形状を有していることが好ましい。また、各ウェルの上部開口部の形状は、加工の容易性やウェルを大量に配置できる形状を考慮して適宜選択することができるが、例えば、三角形、四角形若しくは六角形などの多角形の形状または円の形状を有することができる。
　本発明者らは、細胞集塊を形成させてから培養を開始すると接着培養後に得られるコロニーの大きさの均一性が向上するが、細胞非接着性表面を備えた大きなウェルを有する９６穴型マイクロタイタープレートのウェルに懸濁した単一の状態の細胞を播種すると、細胞が細胞集塊を極めて高効率に形成させることができることを見出した。しかも、驚くべきことに、大きなウェル中で得られる細胞集塊は、大きさの揃った１以上の細胞集塊であった。培養後の細胞を９６穴型マイクロタイタープレートのウェルに導入すると一つの大きな細胞集塊を形成と予想されたにも関わらず（PrimeSurface(R)ヒトｉＰＳ細胞の凝集塊形成実験例、Ｖｅｒ１．２、住友ベークライト株式会社Ｓ－バイオ事業部編）、凍結解凍後の細胞では、複数の細胞集塊を形成することは驚くべきことであった。おそらく、死細胞が邪魔するために、一つの大きな細胞集塊を形成することができなかったことが原因であると思われる。形成された細胞集塊を接着培養に用いることを考慮すると、細胞集塊播種後の展開に要する時間が短く良好な培養が期待できる点で、大きさの揃った小さな細胞集塊が複数得られることは好ましいことであった。
　このように、本発明者らは、凍結解凍した多能性幹細胞は、解凍後の細胞を仕切りのない１ウェル中で１以上の細胞集塊を形成させるように播種すると、細胞集塊を形成させることができることを本実施例で初めて示した。本明細書では、「仕切りのないウェル」とは、そのウェルの底面を仕切る壁や突起が存在しないこと、そのウェルの底面がなめらかであること、または、より小さなウェルがウェルの底面に刻まれていないことを意味する。
　そして、仕切りのない１ウェル中で１以上の細胞集塊（例えば、複数の細胞集塊）を形成させるように播種する限り、例えば、細胞を細胞集塊の形成に必要な数だけウェルの底部に堆積させることにより、細胞集塊は自発的に形成される。ここで、得られる細胞集塊は、概ね１００μｍ～２００μｍであることから、１つの細胞集塊に含まれる細胞数に基づいて、ウェルの大きさおよび１ウェルに播種する細胞数は当業者であれば適宜決定できる。ここで、１つの細胞集塊に含まれる細胞数は、例えば、図３Ｆを参考にして求めることができる。ウェルの大きさおよび１ウェルに播種する細胞数は以下のガイドラインに沿って決定してもよい。播種した細胞数に対する細胞集塊に寄与した細胞数の比は、約０．１～約０．４程度と見積もられ、本実施例の記載を参考にして決定することができる。
　１ウェル中に細胞集塊が複数得られるという観点では、播種するウェルの底部または開口部の面積は、１ｍｍ２以上であることが好ましい。例えば、播種するウェルの底部または開口部の面積は、１ｍｍ２～４００ｍｍ２とすることができる。ウェルの底部部又は開口部の面積は、５ｍｍ２～２００ｍｍ２としてもよく、５ｍｍ２～１００ｍｍ２あるいは５ｍｍ２～５０ｍｍ２としても好適に細胞集塊を形成させ得る。なお、底部を規定できない形状（例えば、錐形状）のウェルは、開口部の面積によりウェルの大きさを特定することができる。また、細胞が堆積する領域の面積によりウェルの大きさや形状を特定してもよい。現在販売されているマルチウェルプレートを流用するならば、３８４穴型マイクロタイタープレート、９６穴型マイクロタイタープレート、４８穴型マイクロタイタープレート、２４穴型マイクロタイタープレートおよび１２穴型マイクロタイタープレートのウェルを利用し得る。これらのマイクロタイタープレートは、各ウェルの底部または開口部の面積が５ｍｍ２～４００ｍｍ２程度である。市販のマルチウェルプレートを利用しない場合でもウェルあたり１ｍｍ２～４００ｍｍ２程度の底部または開口部の面積を有するウェルで細胞集塊を形成させることが好ましい。このようにすることで、細胞を播種するウェル数を減らすことが可能となり、ウェルへの細胞播種の手間を軽減でき、かつ解凍後の細胞の回収率も優れているという利点が生ずる。例えば、本発明では、容積が５０μＬ～５００μＬであり、ウェルの水平断面の面積は底部に近づくに従って減少し、かつ、丸底を有するウェルを好ましくは使用することができ、より好ましくは、さらに上部開口部と底部との中点に位置するウェルの水平断面の面積が上部開口部面積に対して４０％～１００％であるウェルを使用することができる。本発明ではまた、容積が５０μＬ～５００μＬであり、ウェルの丸底部分の内面の曲率半径が１ｍｍ～３ｍｍであり、テーパ形状を有するウェル側壁の内面の稜線と、ウェル開口部の中心および底部の中心を通る直線（ここで、直線はウェルの水平断面に対する垂線である）との交差角が４度～３０度である、ウェルを使用することもできる（例えば、図２）。
　導入する細胞数は、細胞密度から計算することができる。細胞は、例えば、細胞密度が細胞が堆積する領域の面積に対して、１００～２０，０００個／ｍｍ２、１００～１０，０００個／ｍｍ２、１，０００～７，５００個／ｍｍ２、または３，０００～６，０００個／ｍｍ２となるようにウェルに播種することができる。このようにすることで、９６穴型マイクロタイタープレートで形成されたのと同様に他のサイズのウェル中でも複数の細胞集塊が形成されると期待される。
　従って、導入する細胞数は、ウェルの大きさにも依るが、通常の細胞培養用の９６穴型マイクロタイタープレートの場合（開口部面積：約３３ｍｍ２）には、１ウェルあたり１×１０３細胞～５×１０５細胞程度とすることができ、好ましくは５×１０３細胞～１×１０５細胞程度とすることができる。視認性や回収率の観点では、導入する細胞数は、９６穴型マイクロタイタープレートのウェルあたり、好ましくは１×１０４～２×１０４細胞とすることができる。
　本発明では、細胞集塊は、条件にもよるが通常４～６日ほどで形成される。本発明では、細胞集塊が形成されたら、速やかに細胞集塊を接着培養系に移行させる、すなわち、細胞集塊を播種して細胞の接着培養を開始することができる。本発明では、細胞集塊形成８日後に接着系培養を開始しても細胞は良好に増殖したが、細胞集塊形成後４日後に接着系培養を開始した方が細胞の回収率が高かったことから、細胞集塊形成に必要な期間は好ましくは３日以上、より好ましくは４～１０日程度、さらに好ましくは４～６日程度である。
　本発明では、細胞集塊形成中は、常法により、培地を例えば４８時間毎に交換することができる。培地は、例えば、１／３量ずつ交換することができる。
　本発明では、細胞集塊の形成は、遠心処理を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。遠心処理は、細胞集塊をウェルの底部に集めるには効果的であり、細胞集塊の形成を促進すると考えられるが、遠心処理をしなくても細胞の回復率は高い。本発明では、細胞集塊は、細胞が他の細胞と接触する機会を増やすことを目的としてウェルを攪拌しながら形成させてもよいし、ウェルを攪拌せずに静置することによって行ってもよい。ウェルを時折攪拌しながら細胞集塊を形成させると、細胞集塊の形成が促進され、形成される細胞集塊の大きさが大きくなり、また細胞の回復率が向上するという利点がある。本発明では、細胞集塊は、遠心処理を行わずに、かつ時折攪拌しながら形成させることができる。本発明では、攪拌は、細胞集塊を崩さないように丁寧に行なうことが望まれる。攪拌は、１２時間～４８時間に１回の割合で行うことができる。
　本発明の一実施態様では、工程（Ｂ）において、解凍した多能性幹細胞をウェルに播種してウェル中で多能性幹細胞に１以上の細胞集塊を形成させる。当業者であれば、ウェル中で細胞に１以上の細胞集塊を形成させるために必要な細胞数や播種するウェルの大きさおよび形状を適宜決定することができるであろう。その際には、導入細胞数および細胞密度に関する上記記載を参考にしてもよい。具体的には以下の通りである。細胞集塊が複数得られるという観点では、播種するウェルの底面積は、上記に記載した通りの面積を有することが好ましい。導入する細胞数は、例えば、ウェル中の細胞密度が上記に記載した通りの細胞密度となるように決定することができる。導入する細胞数は、例えば、９６穴型マイクロタイタープレートの場合には、上記に記載した通りの細胞数とすることができる。
　本発明者らは、解凍した細胞を、仕切りのない１ウェル中で１以上の細胞集塊を形成させるように播種すると、細胞集塊を形成させることができるということを本実施例で初めて示した。すなわち、本発明により、凍結解凍後の多能性幹細胞から細胞集塊を作ることが初めて可能になった。また、得られた細胞集塊を接着培養したところ、良好な未分化状態を維持していた。これにより、解凍後の細胞に細胞集塊を形成させ、その後、継代培養するという、新しい凍結解凍方法および継代培養方法の途が切り拓かれたといえる。
　そして、仕切りのない１ウェル中で１以上の細胞集塊（例えば、１つまたは複数の細胞集塊）を形成させるように播種する限り、細胞集塊は自発的に形成される。ここで、得られる細胞集塊は、概ね１００μｍ～２００μｍであることから、１つの細胞集塊に含まれる細胞数に基づいて、１ウェル中で１以上の細胞集塊（例えば、１つまたは複数の細胞集塊）を形成させるために必要なウェルの大きさおよび１ウェルに播種する細胞数は、当業者であれば適宜決定できる。
　本発明の多能性幹細胞の細胞集塊を製造する方法又は後述するシステムによって製造された細胞集塊は、細胞の培養に用いることができる。従って、本発明によれば、多能性幹細胞を培養する方法であって、本発明の多能性幹細胞の細胞集塊製造方法または後述する細胞集塊製造システムによって製造された細胞集塊を接着培養することを含んでなる方法が提供される。
　本発明によれば、多能性幹細胞の細胞集塊製造システムが提供される。以下、図３１により本発明の多能性幹細胞の細胞集塊製造システム１００を説明する。
　本発明の多能性幹細胞の細胞集塊製造システム１００は、多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させるための解離手段１０と、解離させた細胞を凍結保存液に混入させる混入手段２０と、細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器に導入する導入手段３０と、細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させる凍結手段４０と、凍結保存容器を凍結保存する凍結保存手段５０と、凍結保存容器中で凍結した凍結保存液を解凍する解凍手段６０と、解凍した細胞から細胞集塊を形成させる細胞集塊形成手段７０とを備えている。
　多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させるための解離手段１０は、本発明の細胞集塊製造方法の工程（ａ）を実施する手段である。解離手段１０は、例えば、上記工程（ａ）で用いられる酵素液（例えば、アキュターゼ酵素溶液）を細胞と接触させる手段１０ａ（図示せず）と、その後、水流により細胞を単一細胞にまで解離させる手段１０ｂ（図示せず）とを有することができる。解離手段１０は、さらに遠心分離機１０ｃを備えていてもよく、細胞を解離させた後は、遠心分離機１０ｃ（図示せず）により、細胞をペレット化して上清を廃棄してもよい。
　本発明の細胞集塊製造方法の工程（ｂ）は、解離させた細胞を凍結保存液に混入させる混入手段２０、細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器に導入する導入手段３０、細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させる凍結手段４０、および凍結保存容器を凍結保存する凍結保存手段５０により行なわれる。
　解離させた細胞を凍結保存液に混入させる混入手段２０は、解離させた細胞に凍結保存液を加え、攪拌することにより細胞を凍結保存液中に混入させる。
　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器に導入する導入手段３０は、凍結保存容器に細胞を混入させた凍結保存液を注入する。
　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させる凍結手段４０は、多能性幹細胞の凍結法として周知手段を用いることができるが、例えば、緩慢冷却法により細胞を凍結させるための凍結手段を有することができる。緩慢冷却法により細胞を凍結させるための凍結手段は、例えば、プログラムフリーザーやMr. Frosty Freezing Container（商標）などの細胞の緩慢冷却のために設計された容器など、毎分０．１℃～２℃の速度で温度を、例えば－８０℃まで低下させることのできる手段などの細胞の冷却手段４０ａ（図示せず）を有することができる。
　凍結保存容器を凍結保存する凍結保存手段５０は、例えば、凍結細胞が導入された凍結保存容器を凍結状態で保存できる冷凍室５０ａおよびその冷却手段５０ｂを有することができる。凍結保存手段５０は、冷凍室５０ａに凍結保存容器を搬入し、冷凍室５０ａから所望の凍結保存容器を取り出すための室内搬送手段５０ｃおよび室内搬送手段の駆動機構５０ｄを有していてもよい。
　凍結保存容器中で凍結した凍結保存液を解凍する解凍手段６０は、例えば、３７℃の恒温槽やヒートブロックなどの加熱手段６０ａを有することができる。解凍手段６０はまた、細胞のペレットを形成するための遠心分離ユニット、および、凍結保存液を除去して細胞培地を添加する溶液交換ユニットなどの、細胞凍結保存液を培地に交換する培地交換手段６０ｂを備えていてもよい。
　解凍した細胞から細胞集塊を形成させる細胞集塊形成手段７０は、本発明の細胞集塊製造方法の工程（ｃ）を実施する手段である。細胞集塊形成手段７０は、例えば、細胞を計数する細胞カウンター７０ａと、ウェルに細胞を播種する細胞播種手段７０ｂと、上記工程（ｃ）で用いられるウェル７０ｃとを有することができる。ウェル７０ｃおよびウェル中に播種された細胞は、細胞培養用のインキュベータ７０ｄ（図示せず）中でインキュベートされる。細胞集塊形成手段７０は、ウェルを攪拌する攪拌手段７０ｅ（図示せず）を備えていてもよい。ウェルに播種された細胞は、自発的に細胞集塊を形成する。細胞集塊を形成させるための細胞数やウェル形状は、上述した通りである。撹拌手段７０ｅとしては、例えば、特に限定されないが、電動で溶液の吸入および排出が可能な電動ピペッターが挙げられる。
　本発明の多能性幹細胞の細胞集塊製造システムは、細胞の搬入口１と搬出口２とを備える。培養が完了した細胞を搬入口１から細胞集塊製造システム内に搬入し、凍結保存した後に、解凍して細胞集塊を形成させたら搬出口２から搬出して接着培養系に細胞を移すことができる。図３１中の矢印は、システム内における細胞の搬送手段１５を示す。
　本発明の多能性幹細胞の細胞集塊製造システムは、制御部１００Ａを有していてもよく、好ましくは多能性幹細胞の単一細胞化から凍結、保存および解凍までの一連の工程を全自動で行うように制御部１００Ａにより制御されている。この場合、多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させるための解離手段１０と、解離させた細胞を凍結保存液に混入させる混入手段２０と、細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器に導入する導入手段３０と、細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させる凍結手段４０と、凍結保存容器を凍結保存する凍結保存手段５０と、凍結保存容器中で凍結した凍結保存液を解凍する解凍手段６０と、解凍した細胞から細胞集塊を形成させる細胞集塊形成手段７０とからなる群から選択される少なくとも１つの手段、好ましくは少なくとも凍結保存手段５０には、ＩＤ情報取得部（図示せず）が設置されている。ＩＤ情報取得部は、培養が完了した細胞を含む凍結保存容器に付されたバーコード等のＩＤ情報を読み取り、このＩＤ情報を制御部１００Ａに送る。次に制御部１００Ａは、凍結保存容器からＩＤ情報を得て、それぞれの凍結保存容器を識別して管理することができる。この場合、ＩＤ情報取得部としては、バーコードを読み取るバーコードリーダーを用いることができる。ＩＤ情報としては、凍結保存容器の識別情報の他に、保存されている細胞の種類、ＨＬＡタイピング、培養条件、継代数および／または評価・検査履歴が保存されていてもよい。
　制御部１００Ａは、特に、冷凍室５０ａ中で各凍結保存容器を識別して管理している。制御部１００Ａには、所望の凍結保存容器のＩＤ情報を入力することが可能であり、制御部１００ＡがＩＤ情報を受け取ると、搬送手段の駆動機構５０ｄにより、搬送手段５０ｃを駆動させて凍結保存手段５０から当該凍結保存容器を取り出すことが可能である。
　制御部１００Ａは、ハードウェアとして例えば、汎用コンピュータと、ソフトウェアとして当該コンピュータを動作させるためのプログラムとにより実現することができる。ソフトウェアは、コンピュータに固定的に設けられたハードディスクドライブ等の記録媒体に格納されるか、あるいは、ＣＤＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ等の着脱可能にコンピュータにセットされる記録媒体に格納される。図３１では、このような記録媒体が参照符号１００Ｂで示されている。プロセッサ１００Ｃは、必要に応じて図示しないユーザーインターフェースからの指示等に基づいて所定の処理レシピを記録媒体１００Ｂから呼び出して実行させ、これによって制御部１００Ａの制御下で多能性幹細胞の細胞集塊製造システムの各手段が動作して所定の処理が行なわれる。例えば、制御部１００Ａは、下記に説明する本発明の多能性幹細胞の細胞集塊製造システムの動作を実現するように、ソフトウェアにより上記の各機能部、例えば、解離手段１０に備わる酵素を細胞と接触させる手段１０ａおよび細胞塊を単一細胞にまで解離させる手段１０ｂ、搬送手段１５、混入手段２０、導入手段３０、凍結手段４０に備わる細胞の冷却手段４０ａ、凍結保存手段５０に備わる冷却手段５０ｂおよび室内搬送手段の駆動機構５０ｄ、解凍手段６０に備わる加熱手段６０ａおよび培地交換手段６０ｂ、並びに、細胞集塊形成手段７０に備わる細胞播種手段７０ｂが駆動制御され得る。制御部１００Ａは、細胞カウンター７０ａからの情報に基づいて、ウェルに播種する細胞数が既定値に達した場合には、細胞播種手段７０ｂによる細胞の播種を停止させてもよい。
　本発明の多能性幹細胞の細胞集塊製造システムの動作の一例を図３１に基づき説明する。
　多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させるための解離手段１０に、多能性幹細胞が導入される。解離手段１０では、多能性幹細胞から形成される細胞集塊を単一細胞にまで解離する。細胞集塊の単一細胞への解離は、細胞接着を解離させる酵素（例えば、アキュターゼ酵素溶液）を細胞と接触させる手段１０ａにより、細胞集塊における細胞間接着を弱め、その後、水流等により細胞塊を単一細胞にまで解離させる手段１０ｂにより、細胞を単一細胞にまで解離させることができる。その後、単一細胞にまで解離させた細胞は、解離させた細胞を凍結保存液に混入させる混入手段２０により、凍結保存液中に混入され、その後、細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器に導入する導入手段３０により、凍結保存容器に導入される。凍結保存容器は、その後、搬送手段１５により細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させる凍結手段４０に搬送される。
　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させる凍結手段４０に搬送された凍結保存容器は、細胞の冷却手段４０ａにより、凍結される。凍結された凍結保存容器は、好ましくは液体窒素中に浸された状態で、搬送手段１５により凍結保存容器を凍結保存する凍結保存手段５０へ搬送される。
　凍結保存手段５０に搬送された凍結保存容器は、必要に応じてＩＤ情報取得部によりそのＩＤ情報が読み取られ、その後、冷凍室に凍結保存容器を搬入し、冷凍室から凍結保存容器を取り出すための搬送手段５０ｃにより、冷凍室５０ａに搬送されて保存される。保存された凍結保存容器を取り出す際には、搬送手段５０ｃにより、所望の凍結保存容器が冷凍室から取り出される。取り出しの際には、制御部１００Ａに入力されたＩＤ情報に基づいて所望の凍結保存容器を取り出してもよい。取り出された凍結保存容器は、好ましくは液体窒素中に浸された状態で、搬送手段１５により凍結保存容器中で凍結した凍結保存液を解凍する解凍手段６０へ搬送される。
　解凍手段６０に搬送された凍結保存容器は、３７℃の恒温槽やヒートブロックなどの加熱手段６０ａにより加熱されて凍結保存容器中の細胞懸濁液が解凍される。凍結保存容器中の細胞懸濁液が半解凍されたら、細胞凍結保存液を培地に交換する手段６０ｂおよび培地を懸濁する懸濁手段６０ｃにより、できるだけ完全に凍結保存液を培地に交換して懸濁する。培地を懸濁する懸濁手段６０ｃは、細胞集塊を単一細胞レベルにまで解離させるまで培地を懸濁することができる。培地を懸濁する懸濁手段６０ｃの例としては電動ピペッターなどが挙げられる。懸濁された細胞は、搬送手段１５により解凍した細胞から細胞集塊を形成させる細胞集塊形成手段７０に搬送される。
　細胞集塊形成手段７０に搬送された細胞は、細胞を播種する手段７０ｂによりウェル７０ｃに播種される。播種の際には、細胞カウンター７０ａにより播種する細胞数が調整される。播種する細胞数は、ウェル７０ｃの大きさにより適宜設定される。ウェル７０ｃおよびウェル中に播種された細胞は、細胞培養用のインキュベータ７０ｄ（図示せず）中でインキュベートされ、播種された細胞は、ウェル７０ｃ中で自発的に細胞集塊を形成する。細胞集塊を形成させる際には、細胞集塊をより大きく成長させるために、ウェル７０ｃは、ウェルを攪拌する攪拌手段７０ｅ（図示せず）により攪拌してもよい。形成された細胞集塊は、細胞集塊を形成させる手段７０から搬出口２を介して搬出され、その後、培養に用いることができる。
実施例１：多能性幹細胞の凍結解凍と丸底ウェルを用いた細胞集塊形成
　本実施例では、単一細胞化して緩慢冷却により細胞を凍結し、その後、解凍した多能性幹細胞に細胞集塊を形成させた。凍結解凍と細胞集塊形成の手順の概要を図１に示す。
　多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞（公益財団法人　先端医療振興財団　細胞評価グループ　川真田研究室による樹立株）を用いた。培養培地は、ReproFF2培地（ReproCell社製、製品番号：RCHEMD006）を用いた。
ヒトｉＰＳ細胞の単一細胞化
　ヒトｉＰＳ細胞を６穴プレート（ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ社製、製品番号：353046）に播種し、培養６日目まで（すなわち、対数増殖期に達するまで）培養した。目視により異常のあるｉＰＳ細胞コロニーをアスピレータで吸引除去し、その後、培地すべてをアスピレータで除去した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Life Technologies社製、製品番号：14190）で各ウェルを洗浄してから、予め３７℃に温めておいたAccutase溶液（Innovative Cell Technologies社製、製品番号：AT104）を２００μＬずつ各ウェルに添加した。インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で５分間インキュベートした後に、Accutase溶液をアスピレータで吸引除去し、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（５００μＬのY27632（和光純薬社製、製品番号：257-00511）および５ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ナカライテスク社製、製品番号：09367-34）を５００ｍＬの培地に添加して作製した）１ｍＬを添加した。セルスクレイパーを用いて接着表面からｉＰＳ細胞を剥離させ、得られた細胞懸濁液をピペッティングして細胞を単一細胞の状態にまで解離させた。
細胞の凍結保存
　細胞の凍結保存は以下のように行った。ｉＰＳ細胞の懸濁液を遠心分離（２，５００Ｇ、５分間）して上清を廃棄し、再び、Ｙ２７６３２を添加したＲｅｐｒｏＦＦ２培地に懸濁して細胞を計数した。細胞計数後、２×１０５細胞の細胞懸濁液を採取して１．５ｍＬチューブに分注し、遠心分離（２，５００Ｇ、５分間）して上清を廃棄した。ｉＰＳ細胞を氷冷した凍結保存液で懸濁し、細胞懸濁液を凍結保存容器に移して、再び、氷上で保持した。すべての凍結保存容器が揃ったら、凍結保存容器をCryo１℃Freezing Container（Thermo Scientific社製、製品番号：5100-001）に入れた後に、－８０℃の冷凍庫で凍結保存した。凍結保存液は、表１の各種凍結保存液を用いた。凍結保存液の使用量や保存法は、各凍結保存液の製造者マニュアルに基づいて決定した。
[規則26に基づく補充 19.05.2015]　
Figure WO-DOC-TABLE-1
　翌朝、Cryo１℃Freezing Containerから凍結保存容器を取り出して液体窒素保存容器内に移動して凍結保存した。
細胞の融解と培地への懸濁
　凍結した凍結保存容器を軽く揺すりながら３７℃の恒温槽に浸して凍結保存液を半解凍した。その後、保存液の全量を１５ｍＬの遠心管に移した。５倍量のＹ２７６３２を添加したＲｅｐｒｏＦＦ２培地を添加して攪拌した。遠心分離（２，５００Ｇ、５分間）して上清を廃棄した。新たに、Ｙ２７６３２を添加したＲｅｐｒｏＦＦ２培地を８００μＬ添加して、軽くピペッティングをした。
細胞集塊の形成
　細胞集塊は、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）または９６穴型マイクロタイタープレートを用いて形成させた。９６穴型マイクロタイタープレートとしては、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96M（製品番号：MS-9096M）を用いた。９６穴型マイクロタイタープレートの各ウェルの断面は、図２のような丸底形状であった。住友ベークライト社によれば、このウェルにヒトｉＰＳ細胞を播種すると、１つの大きな細胞集塊を形成するとされている（PrimeSurface(R)ヒトｉＰＳ細胞の凝集塊形成実験例、Ｖｅｒ１．２、住友ベークライト株式会社Ｓ－バイオ事業部編）。
　９６穴型マイクロタイタープレートに１５０μＬずつ８ウェルに解凍したｉＰＳ細胞懸濁液を分注して、インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で静置した。４８時間毎に５０μＬの培地を除去し、５０μＬのY27632を添加したＲｅｐｒｏＦＦ２培地を添加した。１２日目まで培養すると、各ウェル内で細胞集塊が形成された（図３Ａ～Ｅ）。なお、各細胞集塊に含まれる細胞数と細胞集塊の直径との関係は、図３Ｆに示される通りであると見積もられた。
　住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96Mでは、培養中のヒトｉＰＳ細胞を播種すると１つの大きな細胞集塊が得られるとされている。しかし、凍結解凍後のヒトｉＰＳ細胞は、１以上の小さな細胞集塊（約５０μｍ～２００μｍ）を形成した（図３）。そして、多くのウェルでは複数の細胞集塊が形成された。また、表１のいずれの凍結保存液を用いた場合でも比較的良好に細胞集塊が形成された。
　一方、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）を用いて製造者マニュアルに従って細胞集塊を形成させた場合には、図９に示すように通常の継代時と比較して凍結解凍後のｉＰＳ細胞は、細胞集塊が形成され難かった。図は、細胞集塊形成開始４８時間後の細胞集塊の状況を示すが、培養中の細胞では、細胞がウェルの底に凝集して細胞集塊が形成されているのに対して（図９Ａ）、凍結解凍後の細胞では、細胞が凝集しにくく、細胞集塊の形成が困難である（図９Ｂ）。
細胞集塊の播種
　住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96Mによる細胞集塊形成開始４日後の細胞集塊を６穴プレートに播種すると、図４に示すように、凍結保存液には依らずに細胞は良好に増殖した。凍結融解７日後の細胞の増加率は、凍結解凍後、培養を再開して７日目の細胞数を凍結時の細胞数で割って得た。すると、凍結保存液に依らず増加率は６００％を超えた。
　播種後のコロニーの成長を観察した。すると、いずれの凍結保存液を用いて凍結した細胞も良好な成長を示した（図５）。また、凍結解凍後のコロニーの分化状態を確認するため、常法により、各コロニーにおけるアルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇの発現を確認した（図６）。すると、いずれの未分化マーカーも良好に発現しており、細胞は良好な未分化状態にあることが示された。
　多能性幹細胞は、細胞集塊を形成すると制御されない分化を開始する恐れがあった。多能性幹細胞の分化実験の前段階として細胞集塊を形成させるために用いられる、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌでさえも、ヒトの細胞集塊の形成は２４時間とされている。そして、通常の継代培養や凍結保存時に、３日間または４日間以上にわたり細胞集塊を形成させることができるとは考えられていなかった。しかし、本実施例により人工的に形成させた細胞集塊では、１２日間の長期にわたり細胞集塊を形成させ続けた場合であっても、凍結解凍後の多能性幹細胞は未分化状態を良好に保つことが明らかとなった。
　上記の方法で解凍した多能性幹細胞に細胞集塊を形成させずにそのまま、６穴プレートに播種した場合のコロニーの成長を図７に示す。細胞集塊を形成させずに播種した場合でもいくつかの細胞がコロニーを形成する様子が観察された（図７）。しかし、播種した数に対してコロニーの数は非常に少なかった（０．０６８％、図８Ａ）。また、培養１４日目に観察したところ、形成されたコロニーは比較的小さいものが多かった（図８Ｂ）。凍結融解７日後の増加率（すなわち、凍結前の細胞数に対する、解凍後７日目の時点での細胞数の比）は、約４２０％であった。しかし、この条件では、接着培養中の各コロニーの大きさのばらつきが大きく、継代培養の自動化に適した条件とは言えなかった。
　上記の方法で解凍した多能性幹細胞をＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）に播種して細胞集塊を形成させた場合の細胞集塊の形成状態を図９に示す。この条件では、解凍後の細胞は細胞集塊を形成しにくい性質を持ち、形成したとしてもすぐに崩壊する傾向が見られた。また、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）に播種して２日後の細胞を６穴プレートに播種して、播種後１２日目に観察したところ、比較的大きさの揃ったコロニーが形成された。しかし、形成されるコロニー数は少なく（図１０Ａ）、形成されたコロニーは比較的小さかった（図１０Ｂ）。凍結融解７日後の増加率（すなわち、凍結前の細胞数に対する、解凍後７日目の時点での細胞数の比）は、約１．５％であった。
　住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96Mでは、ウェルが大きく、培養中のヒトｉＰＳ細胞を播種すると１つのウェルに対して１つの大きな細胞集塊が得られるとされている。しかし、上記の通り、凍結解凍後のｉＰＳ細胞は、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96Mの１つのウェルに対して１以上の小さな細胞集塊を形成した。この結果は、凍結解凍後は死細胞が混入しており、これが細胞集塊の形成を阻害していることを示唆する。死細胞が混入しているために、細胞集塊が一つにまとまりきれず、大きなウェルを用いた時には、１以上の細胞集塊が形成され、小さいウェルを用いた時には細胞集塊の形成が抑制される結果になってしまうと考えられた。
　ところが、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96Mのウェルで細胞集塊を形成させたところ、予想に反して細胞集塊は複数得られ、得られた１以上の細胞集塊は、いずれもほぼ同じ大きさであり、ウェル毎の大きさの違いも少なく、大きさの点で安定していた。しかも、このウェルを用いて細胞集塊を形成させてから、６穴プレートに播種すると、播種された細胞集塊が崩壊することなく培養面に接着し、その後、速やかに展開してコロニーを形成した。接着系で培養を再開してから１０日後の細胞数は図１２Ａに示され、そのときのコロニーの状態は図１２Ｂに示される。細胞集塊を形成させてから播種した場合には、播種直後から大きなコロニーが形成される傾向がある。凍結融解７日後の増加率（すなわち、凍結前の細胞数に対する、解凍後７日目の時点での細胞数の比）は、約７１０％であった。１以上の細胞集塊を１ウェル中で形成させることができる大きなウェルを用いると、細胞集塊の作製効率が向上することが示唆される。なお、ウェルに播種した細胞のうち細胞集塊を形成した細胞の割合は、約３０～４０％と見積もられた。上記見積もりは、１継代で細胞数が２０倍に増加すると仮定して行なった。
　上記結果は図１３にまとめられている。
実施例２：細胞集塊の形成条件
　本実施例では、多能性幹細胞に細胞集塊を形成させるときの形成条件を調べた。
　細胞は、実施例１で凍結解凍したヒトｉＰＳ細胞を用いた。また、細胞集塊を形成させるため、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96Mのウェルを用いた。
　細胞集塊を形成させるときには、重力での自然落下を利用して細胞をウェルの底に集める方法（「静置」）と遠心分離処理を施して細胞をウェルの底に集める方法（「遠心」）が可能である。また、ウェルを攪拌せずに静置して細胞集塊を形成させる方法（「攪拌あり」または「攪拌○」）とウェルを時々攪拌（振とう）して細胞集塊を形成させる方法（「攪拌無し」または「攪拌×」）が可能である。攪拌は、細胞をウェルの底部に集めるために行い、形成された細胞集塊にできるだけ損傷が加わらないように行なった。
　まず、静置攪拌ありまたは静置攪拌無しの条件下で細胞集塊の形成を観察した。すると、図１４に示されるように、細胞をウェルに播種してから４日目、８日目および１２日目のいずれにおいても、静置攪拌ありの条件では、数は少ないが細胞集塊が大きい傾向が観察された（図１４Ａ、ＢおよびＣ）。
　上記条件にて４日目に細胞集塊を６穴プレートに播種して１０日後（すなわち、解凍後１４日目）の細胞の増加率を集計した。すると、凍結保存液に依らず、細胞集塊を静置攪拌無しの条件で形成させたときに細胞の増加率が向上する傾向が見られた（図１５）。形成される細胞集塊の大きさの観点およびウェル中での細胞集塊の視認性の観点では、静置攪拌条件が好ましいことが分かる（図１４および図１６）。
実施例３：細胞集塊形成に要する時間
　本実施例では、多能性幹細胞に細胞集塊を形成させるために要する時間を検討した。
　細胞は、実施例１で凍結解凍したヒトｉＰＳ細胞を用いた。また、細胞集塊を形成させるため、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96Mのウェルを用いた。
　細胞をウェルに分注してインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内で静置した。静置４日後または８日後に細胞集塊を回収し、細胞集塊を６穴プレートに播種した。解凍１４日目での細胞の増加率を算出した。本実施例では、遠心処理は、２，０００ｇ、５分の条件で行った。攪拌は、１２時間おきに細胞集塊を破壊しないようマイルドに行った。
　すると、静置４日後に６穴プレートに播種した場合には、遠心処理ありの条件で細胞集塊を形成させた群や静置攪拌ありの条件で細胞集塊を形成させた群よりも、静置攪拌無しの条件において細胞集塊を形成させた群で高い回収率を得た（図１７）。細胞の回収率をグラフにすると図１８の通りであった。
　また、静置８日後に６穴プレートに播種した場合には、遠心処理ありの条件で細胞集塊を形成させた群や静置攪拌ありの条件で細胞集塊を形成させた群よりも、静置攪拌無しの条件において細胞集塊を形成させた群で高い回収率を得た（図１９）。細胞の回収率をグラフにすると図２０の通りであった。
　そして、静置４日後に６穴プレートに播種した群と静置８日後に６穴プレートに播種した群とを比較すると、静置４日後に６穴プレートに播種した群でより高い細胞の増加が見られた。
　さらに静置８日後に６穴プレートに播種した群は、静置１２日後に６穴プレートに播種した群よりも高い増加率を示した（データ示さず）。
　このことから、細胞の回収率を高める観点では、細胞集塊形成後は、細胞集塊を速やかに接着培養系に移すことが好ましいと考えられた。
実施例４：細胞集塊の形成の際にウェルに導入する細胞数
　本実施例では、細胞集塊の形成の際に、各ウェルに導入する細胞数を検討した。
　細胞は、実施例１で凍結解凍したヒトｉＰＳ細胞を用いた。また、細胞集塊を形成させるため、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96Mのウェルを用いた。
　播種する細胞数は、１ウェルあたり１×１０５細胞（細胞密度：約１５，０００個／ｍｍ２）、５×１０４細胞（細胞密度：約７，０００個／ｍｍ２）、２×１０４細胞（細胞密度：約６，０００個／ｍｍ２）、１×１０４細胞（細胞密度：約３，０００個／ｍｍ２）または５×１０３細胞（細胞密度：約１，５００個／ｍｍ２）とした。ここで、細胞密度は、顕微鏡でウェルの上方からウェル内部を観察した際に細胞が積み重なった部分の面積で播種した細胞数を割って求めた値である。播種２日後、４日後または６日後の細胞集塊の形成を観察した。
　すると、いずれの細胞数条件においても播種４日後および６日後では明確に細胞集塊の形成が観察された（図２１）。図２１は、凍結保存液としてＣｒｙｏＳｔｅｍを用いたが、ｍＦｒｅＳＲを用いた場合でも、播種４日後および６日後では明確に細胞集塊の形成が観察された（図２２）。このように、約１，５００個／ｍｍ２～約１５，０００個／ｍｍ２のいずれの細胞密度で細胞を播種した場合でも、ウェル中で良好に細胞集塊を形成させることができた。細胞集塊を形成させるに必要な数の細胞を、上記のいずれの細胞密度で播種しても、安定的かつ容易に細胞集塊を形成させられることが明らかとなった。
　それぞれの細胞集塊をより詳細に観察すると、播種する細胞数が１ウェルあたり５×１０３細胞の場合、形成される細胞集塊がやや小さい傾向が見られた（図２１および２２）。また、播種する細胞数が１ウェルあたり１×１０４～２×１０４細胞の場合に細胞集塊の視認性が高かった（図２１および２２）。このため、細胞集塊に一般的な丸底ウェルを有する９６穴型マイクロタイタープレートを使用する場合には、播種する細胞数は、１ウェルあたり１×１０４細胞以上であることが好ましく、１ウェルあたり１×１０４～２×１０４細胞であるとより好ましかった。
　上記のように形成された細胞集塊それぞれを６穴プレートに播種して２日後におけるコロニーを観察した。すると、播種する細胞数が１ウェルあたり５×１０３細胞の場合、形成されるコロニーがやや小さい傾向が見られた（図２３）。形成されるコロニーの直径を集計すると、播種する細胞数が１ウェルあたり１×１０４細胞～１×１０５細胞の場合には、ほとんど同等の大きさであったのに対して、播種する細胞数が１ウェルあたり５×１０３細胞の場合には、コロニーの直径がその他よりも小さい傾向が見られた（図２４）。
　上記の場合において、６穴プレートに播種して２日後における細胞数を計数した。すると、１ウェルあたり１×１０４～２×１０４細胞のときに細胞数が多い傾向が見られた（図２５）。本手法を用いることで、１ウェルあたりに導入する細胞が広い範囲で任意に採り得ることが確認された。単一細胞同士が接触する機会を増やして細胞集塊の形成を促進させるためには、播種する細胞数（細胞密度）は一定値以上であることが好ましく、細胞が密集することによる悪影響を防ぐ観点およびウェルの視認性を向上させる観点では、播種する細胞数（細胞密度）は一定値以下であることが好ましい。例えば、細胞集塊形成時に１ウェルに導入する細胞は任意に設定し得るが、１×１０４～２×１０４細胞（細胞密度：約３，０００個／ｍｍ２～約６，０００個／ｍｍ２）とすると、上記条件を満たし、ウェル中の個々の細胞集塊の視認性の観点でも優れていた。
実施例５：凍結保存液の細胞に対する影響
　本実施例では、凍結保存液が細胞に対して与える影響を調べた。
　実施例１に記載の凍結保存条件で、凍結保存液をＣｒｙｏＳｔｅｍにし、ｉＰＳ細胞を凍結保存液に懸濁後、氷上で０分、１５分、３０分、１時間、２．５時間または６時間静置して、その後、実施例１に記載の方法で凍結解凍し、細胞集塊を形成させた。すると、いずれの条件でも細胞集塊の形成が確認できたが、６時間静置したものでは細胞集塊数が少なかった（図２６）。
　その後、形成された細胞集塊を６穴プレートに播種して８日間培養した。すると、凍結保存液に懸濁して６時間放置した細胞は、形成されるコロニーが小さいことが分かった（図２７）。細胞集塊の形成をより詳しくみるために、住友ベークライト社製PrimeSurface（商標） 96Mのウェルに細胞を播種して１４日目の細胞集塊を観察した。すると、凍結保存液中で０～２．５時間放置してから凍結した群では、細胞集塊の形成の程度に大きな差は見られなかったが、６時間放置してから凍結した群では、細胞集塊の形成効率が低下していた（図２８）。凍結保存液をｍＦｒｅＳＲに変えて行った場合には、６時間放置してから凍結した群でも細胞集塊は十分に形成され、１４日目での増加率もそれほど低下しなかった（図２９Ｂ）。また、追加実験において、凍結保存液に懸濁して２分後に凍結工程に持ち込んだ細胞は、いずれの凍結保存液を用いた場合でも極めて良好な増加率（５００％以上）を示した。従来のクランプ凍結では、ガラス化凍結が必要とされており、ガラス化凍結の場合は、凍結保存液の毒性が高く、凍結まで１５秒以内程度で完了させなければいけないとされていることを考えれば、本発明の方法は、操作の時間的余裕が大きく、操作の安定性、機械化および多量化の面で大きな優位性があると考えられる。
比較例１：凍結方法の比較
　本発明の方法は、細胞を単一細胞に解離させてから凍結し、その後再び細胞集塊（クランプ）を形成させてから培養する。本比較例では、通常のクランプ凍結と本発明の凍結との比較を行った。
　本比較例では、凍結しない対照（図３０）に対する実験群のコロニー数の比として回復率を定義した。すなわち、回復率は、
（回復率）＝（解凍後のコロニー数）÷（解凍しなかった際のコロニー数）
で計算した。
　従来のクランプ凍結法では、凍結保存液としてＳｔｅｍＣｅｌｌＫｅｅｐとＲｅｐｒｏＣｅｌｌでは高い回復率を示した一方で、それ以外の凍結保存液を用いた場合では、ほとんど回復しなかった（データ示さず）。一方、本発明の凍結保存方法により、実施例１に記載の通りに凍結保存して細胞集塊を形成させた場合には、従来のクランプ凍結よりも約２倍高い回復率が見られた（図３０）。
　このことから、本発明の凍結保存方法は、クランプをそのまま凍結する従来のクランプ凍結よりも、凍結後の細胞の回復がよいことが示された。
　以上の結果から、本発明の凍結保存方法は、従来のクランプ凍結法よりも、以下の点で有利であることが示された。すなわち、本発明の凍結保存方法は、毒性の低い試薬を使用可能であり、単一細胞化することにより細胞毎の凍結条件の差が小さく、すなわち、凍結バイアル間での凍結状態の差が小さく、さらに凍結後は細胞集塊を形成させてから接着培養することにより、細胞の復帰が良好であるという利点を有する。
　単一細胞化してから凍結する本発明の手法は、手技を全自動化する上で有利である。従来は、できるだけ細胞集塊を壊さずに均一な細胞集塊を得て凍結することが求められ、これを達成することは困難であり、かつ、とても高度な技術的が必要とされた。しかし、単一細胞化工程は、酵素処理や水流による物理的処理により容易に達成可能であり、かつ、凍結解凍後の細胞集塊形成も本発明の条件に従って一定の条件を設定しておけば、容易に達成可能である。すなわち、本発明によれば、細胞の安定かつ均質な細胞の凍結解凍が可能となるばかりでなく、この工程の機械化が可能となる。しかも、本発明の凍結保存方法は、解凍後の細胞の回復率が従来と比較して良好である。

Claims (16)

  1. 　多能性幹細胞の細胞集塊を製造する方法であって、
    　（Ａ）単一細胞化され、かつ、凍結された多能性幹細胞を解凍することと、
    　（Ｂ）解凍した多能性幹細胞に細胞集塊を形成させることと、
    を含んでなる、方法。
  2. 　工程（Ａ）の前に、
    　（ａ）多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させることと、
    　（ｂ）細胞を凍結して保存することと、
    をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（Ｂ）において、解凍した多能性幹細胞をウェルに播種してウェル中で多能性幹細胞に１以上の細胞集塊を形成させる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　工程（Ｂ）において、細胞集塊をウェル中で複数形成させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　工程（Ｂ）において、細胞を細胞密度１００～２０，０００個／ｍｍ２となるようにウェルに播種することにより細胞集塊を形成させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　多能性幹細胞の凍結が、緩慢凍結法により行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　工程（Ｂ）が、細胞集塊形成中にウェルを攪拌することを含んでなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　ウェルが、錐形状、丸底、Ｖ底、Ｕ底、角取平面底または平面底のウェルである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　工程（Ｂ）のウェルが、丸底９６穴型マイクロタイタープレートのウェルであり、１ウェル当りに播種する細胞数が５×１０３個～１×１０５個であり、細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　工程（Ｂ）において、多能性幹細胞の細胞集塊の形成時間が、１４日以下である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　多能性幹細胞の細胞集塊製造システムであって、
    　　多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させる解離手段と、
    　　解離させた細胞を凍結保存液に混入させる混入手段と、
    　　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器に導入する導入手段と、
    　　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させるための凍結手段と、
    　　凍結保存容器を凍結保存する凍結保存手段と、
    　　凍結保存容器中で凍結した凍結保存液を解凍する解凍手段と、
    　　解凍した細胞を細胞培養培地に混入させる混入手段と、
    　　培地に混入させた細胞から細胞集塊を形成させる細胞集塊形成手段と
    を備えた、細胞集塊製造システム。
  13. 　凍結手段が、緩慢凍結により凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させるための凍結手段である、請求項１２に記載のシステム。
  14. 　前記細胞集塊形成手段が、錐形状、丸底、Ｖ底、Ｕ底、角取平面底または平面底のウェルを有する、請求項１２または１３に記載のシステム。
  15. 　請求項１２～１４のいずれか一項に記載のシステムを制御するコンピュータに、多能性幹細胞の細胞集塊製造方法を実行させるためのコンピュータプログラムを格納した記録媒体であって、
    　多能性幹細胞の細胞集塊製造方法は、
    　　多能性幹細胞の細胞塊を単一細胞に解離させることと、
    　　解離させた細胞を凍結保存液に混入させることと、
    　　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器に導入することと、
    　　細胞を混入させた凍結保存液を凍結保存容器中で凍結させることと、
    　　凍結保存容器を凍結保存することと、
    　　凍結保存容器中で凍結した凍結保存液を解凍することと、
    　　解凍した細胞を細胞培養培地に混入させることと、
    　　培地に混入させた細胞から細胞集塊を形成させることと
    を含んでなる、記録媒体。
  16. 　多能性幹細胞を培養する方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法または請求項１２～１４のいずれか一項に記載のシステムによって製造された多能性幹細胞の細胞集塊を接着培養することを含んでなる、方法。
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