CN107805626A - 一种人脐带间充质干细胞的复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞生物技术领域，涉及一种细胞复苏方法，具体地说是涉及一种人脐间充质干细胞的复苏方法，该方法能够改善无血清冻存技术冻存的细胞存活率低的不足。本方法通过在复苏液中加入一定比例的对数生长期的人脐间充质干细胞培养液，保证无血清冻存的人脐间充质干细胞90%以上的存活率（贴壁率）。对数生长期的人脐间充质干细胞在生长过程中，会向培养基中释放多种生长因子及蛋白，这些生长因子及蛋白能够促进复苏后细胞的贴壁及生长，保证细胞的存活率。采用本方法复苏人脐间充质干细胞，即使细胞无血清冻存2年，仍能保证细胞存活率高达90%以上。本方法还可实现细胞复苏后，无需离心去除冻存试剂中的DMSO，减少离心过程中剪切力对细胞造成的危害，可直接进行后续的细胞培养。

Description

一种人脐带间充质干细胞的复苏方法
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，涉及一种干细胞复苏方法，具体地说是涉及一种人脐间充质干细胞的复苏方法。
背景技术
间充质干细胞（MSC）是目前实验室和临床研究最多的成体多能干细胞，在造血干细胞移植、移植物抗宿主病等中具有重要应用。根据来源可分为骨髓来源MSC（BMSC）、脂肪来源MSC和脐带来源MSC（hUCMSCs)。目前研究最多最为深入广泛的是BMSC，但由于当前人骨髓来源BMSC水平极低，且存在病毒感染率较高，细胞增殖分化潜能随年龄的增大而下降且穿刺取材是一个侵袭性、有创伤、易污染的操作，对其临床广泛应用带来限制。研究发现从人脐带中分离出的hUCMSCs，在细胞含量、增殖能力方面均优于BMSC，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫原性比BMSC低，且取材方便，无伦理学争议，是目前认为较为理想的种子细胞。实现人脐间充质干细胞的深低温保存并提高其复苏率，对整个组织工程学、临床医学等都具有重要意义。
细胞冻存使用的冻存试剂分为含血清和无血清两类，由于血清具有生产批次不稳定、成分复杂、价格昂贵等缺点，所以无血清冻存技术逐渐成为发展趋势。然而采用无血清冻存技术冻存的细胞其复苏率远低于采用含血清冻存技术冻存的细胞的复苏率。
发明内容
为解决无血清冻存技术的不足，本发明提供了一种新的针对人脐间充质干细胞无血清冻存后的复苏方法，以提高无血清冻存细胞的复苏率。本发明的特征在于，其包括如下复苏步骤。
（1）在细胞传代过程中，收集对数生长期的人脐间充质干细胞的培养液，分装后于-80℃的冰箱内保存备用。
（2）细胞复苏前，将保存于-80℃冰箱中的对数生长期的人脐间充质干细胞的培养液提前二天移入4℃冰箱中解冻。
（3）复苏液的配制：将对数生长期人脐间充质干细胞培养液与新鲜的间充质干细胞培养基按一定比例混匀备用。
（4）细胞的复苏：取出冻存管，立即置于37℃～40℃水浴锅中进行细胞复苏，解冻过程中轻轻摇动冻存管。待冻存管中冰块消失之后，立即取出，在无菌操作台中移入含有复苏液的培养瓶中，于37℃二氧化碳培养箱中进行培养。待细胞贴壁生长24小时后，弃去培养基，换入新鲜培养基进行培养。
本发明方法中，细胞复苏时，复苏液按照对数生长期人脐间充质干细胞培养液与新鲜的间充质干细胞培养基1:1～1:2的比例配制。
本发明方法中，培养瓶中所含有的复苏液，其体积至少为冻存管体积的2倍。
结果显示，本发明提供的细胞复苏方法，能够有效提高人脐间充质干细胞复苏后的细胞活力。人脐间充质干细胞在培养过程中，会释放多种生长因子及蛋白到培养液中，这些生长因子及蛋白能够促进复苏后的人脐间充质干细胞迅速贴壁生长，因而能够提高细胞的复苏率。采用本种细胞复苏方法，不仅能够降低新鲜培养基的使用量，降低细胞复苏成本，且能够提高复苏后细胞的活力，经观察，复苏后细胞其贴壁率达到90%以上，形态饱满规则无异样。
本发明方法适用于人脐间充质干细胞的复苏，经过多次试验验证，该方法的使用不会导致细胞特性的改变，且即使人脐间充质干细胞无血清冻存2年，仍能保证细胞复苏后的存活率高达90%以上。本方法可用于人脐间充质干细胞长期无血清冻存后的复苏。
附图说明
图1是采用本发明所提供的方法复苏人脐间充质干细胞后的贴壁率（存活率）。
具体实施方式
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细的描述。
实施例一。
（1）在细胞传代过程中，收集对数生长期人脐间充质干细胞的培养液，分装后于-80℃的冰箱内保存备用。
（2）细胞复苏前，将保存于-80℃冰箱中的对数生长期人脐间充质干细胞的培养液提前二天移入4℃冰箱中解冻。
（3）复苏液的配制：将对数期人脐间充质干细胞培养液与新鲜的间充质干细胞培养基按1:1.5的比例混匀备用。
（4）细胞的复苏：取出冻存管，立即置于37℃～40℃水浴锅中进行细胞复苏，解冻过程轻轻摇动冻存管。待冻存管中冰块消失之后，立即取出，在无菌操作台中移入含有冻存管3倍体积的复苏液的培养瓶中，于37℃二氧化碳培养箱中进行培养。待细胞贴壁生长24小时后，弃去培养基，换入新鲜培养基进行培养。
实施例二。
（1）在细胞传代过程中，收集对数生长期人脐间充质干细胞的培养液，分装后于-80℃的冰箱内保存备用。
（2）细胞复苏前，将保存于-80℃冰箱中的对数生长期人脐间充质干细胞的培养液提前二天移入4℃冰箱中解冻。
（3）复苏液的配制：将对数生长期人脐间充质干细胞培养液与新鲜的间充质干细胞培养基按1:2的比例混匀备用。
（4）细胞的复苏：取出冻存管，立即置于37℃～40℃水浴锅中进行细胞复苏，解冻过程轻轻摇动冻存管。待冻存管中冰块消失之后，立即取出，在无菌操作台中移入含有冻存管2倍体积的复苏液的培养瓶中，于37℃二氧化碳培养箱中进行培养。待细胞贴壁生长24小时后，弃去培养基，换入新鲜培养基进行培养。
复苏后细胞形态学观察。
在细胞冻存之前和复苏后贴壁生长24小时之后，从培养箱中取出培养皿，放置在倒置显微镜下观察比较冻存前与复苏后的细胞形态差异。
经观察，复苏贴壁后的细胞形态饱满，边界清晰，贴壁良好，与冻存前细胞无太大差异。
细胞贴比率的计算。
对上述实施例中的细胞进行冻存，冻存前采用台盘蓝染色与血球计数板计数冻存前的活细胞数。细胞无血清冻存二年后对细胞进行复苏，分别在细胞复苏0.5h，1h，2h，4h和8h后，弃去培养瓶中的培养基，并用PBS缓冲液清洗培养瓶两遍后，采用胰酶消化搜集细胞，将细胞悬浮于新鲜间充质干细胞培养基中制备成单细胞悬液。采用台盘蓝染色与血球计数板计数不同复苏时间后的活细胞，计算细胞贴壁率。对照同样采用上述方法复苏细胞，但复苏液中的对数生长期人脐间充质干细胞培养液用新鲜培养基替换。结果见图1。细胞贴壁率计算公式为：
贴壁率（存活率）%=（冻存前活细胞数-贴壁培养后活细胞数）/冻存前活细胞数*100。
以上实验结果说明：本发明不仅可以很好的保持细胞的形态学特征，而且能够促进细胞更快贴壁生长，保证细胞的存活率。
对数生长期的人脐间充质干细胞在生长过程中，会向培养基中释放多种生长因子及蛋白。本发明搜集对数生长期的人脐间充质干细胞的培养液，在细胞复苏过程中，通过加入一定比例的对数生长期的人脐间充质干细胞培养液，来促进细胞的贴壁及生长，保证细胞的复苏率；同时可实现细胞复苏后，无需离心去除冻存试剂中的DMSO，可以直接进行后续的细胞培养。
需要说明的是，上述实例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种人脐间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）在细胞传代过程中，收集对数生长期的人脐间充质干细胞的培养液，分装后于-80℃的冰箱内保存备用；
（2）细胞复苏前，将保存于-80℃冰箱中的对数生长期的人脐间充质干细胞的培养液提前二天移入4℃冰箱中解冻；
（3）复苏液的配制：将对数生长期人脐间充质干细胞培养液与新鲜的间充质干细胞培养基按一定比例混匀备用；
（4）细胞的复苏：取出冻存管，立即置于37℃～40℃水浴锅中进行细胞复苏，解冻过程中轻轻摇动冻存管，待冻存管中冰块消失之后，立即取出，在无菌操作台中移入含有复苏液的培养瓶中，于37℃二氧化碳培养箱中进行培养；待细胞贴壁生长24小时后，弃去培养基，换入新鲜培养基进行培养。
2.根据权利要求1一种人脐间充质干细胞的复苏方法所述的步骤（3）中，复苏液按照对数生长期人脐间充质干细胞培养液与新鲜的间充质干细胞培养基1:1～1:2的比例配制。
3.根据权利要求1一种人脐间充质干细胞的冻存方法所述的步骤（4）中，培养瓶中所含有的复苏液，其体积至少为冻存管体积的2倍。
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