JP2022036736A

JP2022036736A - 切除脂肪から間葉系幹細胞を製造する方法

Info

Publication number: JP2022036736A
Application number: JP2020141101A
Authority: JP
Inventors: 千穂小林; Chiho Kobayashi; 伸彦佐藤; Nobuhiko Sato
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2022-03-08

Abstract

【課題】極少量の切除脂肪組織から効率的に間葉系幹細胞を製造する方法を提供すること。【解決手段】工程（１）０．０５ｇ以上０．５ｇ未満の切除脂肪を生体から採取する工程、工程（２）採取した切除脂肪を酵素処理して、間質血管細胞群を得る工程、工程（３）前記間質血管細胞群を、培養容器の面積当たりの有核細胞数比率として、１ｃｍ２あたり３，８００個以上の密度で播種し、間葉系幹細胞を培養する工程、工程（４）培養した間葉系幹細胞を回収する工程、を含む間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造する方法。【選択図】なし

Description

本発明は、極少量の切除脂肪より効率的に間葉系幹細胞を製造する方法に関する。

間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、歯髄などに存在することが報告されている体性幹細胞であり、骨や軟骨及び脂肪などに分化する能力を有するため、細胞治療における有望な細胞ソースとして注目されている。また、間葉系幹細胞は、分化能だけでなく免疫抑制能も有しており、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）や炎症性腸疾患の一種であるクローン病などに対する実用化が進んでいる。

特に脂肪組織は、多くの間葉系幹細胞が含まれていることから、間葉系幹細胞の有望な原料として注目されてきた。脂肪組織から間葉系幹細胞を得る方法としては、吸引によって得られる脂肪組織（吸引脂肪）から間葉系幹細胞を分離する方法が一般的である（例えば、非特許文献１）。しかしながら、この方法では、治療に必要な量の間葉系幹細胞を得るためには約６０ｍＬもの多量の吸引脂肪を採取しなければならず、全身麻酔が必要な上に患者への大きな侵襲（吸引後の痛みや吸引部位の凹み等）が伴うこと、さらには、吸引時の機械的ストレスにより吸引された脂肪組織は、その細胞のダメージが大きい等の課題が報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。一方、別の採取方法として、脂肪組織を吸引するのではなく、切除することで脂肪組織を採取する方法もあるが、切除する脂肪組織の量が多い場合には、患者への痛みや切除部位の凹み等の課題は依然として残されている。

秋山謙太郎、古味佳子他、間葉系幹細胞の新しい機能─免疫調節細胞としての間葉系幹細胞─、日補綴会誌 Ann Jpn Prosthodont Soc 8, 2016、８、３４６－３５３ Julien Freitag．Jon Ford他 BMJ Open 2015;5:e009332 DAISUKE MATSUMOTO, KATSUJIRO SATO他, Cell-Assisted Lipotransfer: Supportive Use of Human Adipose-Derived Cells for Soft Tissue Augmentation with Lipoinjection, Tissue Eng. 2006 Dec;12(12):3375-82.

本発明の課題は、極少量の切除脂肪から安定して効率的に間葉系幹細胞を製造する方法を提供することである。

上記課題の下で検討を進める中で、治療に必要な数の間葉系幹細胞を、患者への負担が少ない状態で取得できる極少量の切除脂肪から取得することは難しく、従来の方法では治療に必要な数の間葉系幹細胞を製造するためには多大な日数を要することがわかった。例えば、０．０２～０．１ｇの脂肪組織から、不織布を基材として２週間培養することにより、１×１０^６個の脂肪幹細胞を取得できると報告している市販のキット（株式会社バイオ未来工房、脂肪幹細胞分離キット）があるが、上記の培養で得られる細胞数は治療用としては十分ではなく、さらに多くの細胞数を取得するためにはさらに１～２週間の培養期間を要する。また、本発明者らが、実際にこのキットを用いて脂肪組織から間葉系幹細胞を培養したところ、顕微鏡による観察を行っても、培養中の細胞の状態（不織布への細胞接着の状態など）を十分に確認できず、培養を適切に管理することが困難であった。このような培養日数の増加や培養工程管理における問題を抱えている状態では、治療用の細胞を効率的に、かつ安定して提供することができず、患者の病態悪化、製造コストや医療コストの増加、日本経済が直面する医療経済の圧迫に繋がることから、極少量の切除脂肪から、治療用の細胞を効率的に、かつ安定して製造する方法が望まれる。

本発明者らは上記課題を解決するために更に鋭意検討した結果、切除脂肪の採取量を適切な範囲にコントロールし、さらに採取した極少量の切除脂肪に特定の処理を行うことで、上記課題を解決することを見いだした。すなわち、本発明は、下記の工程（１）から工程（４）を含む、間葉系幹細胞含有細胞集団を製造する方法である。
工程（１）０．０５ｇ以上０．５ｇ未満の切除脂肪を生体から採取する工程
工程（２）採取した切除脂肪を酵素処理して、間質血管細胞群を得る工程
工程（３）前記間質血管細胞群を、培養容器の面積当たりの有核細胞数比率として、１ｃｍ^２あたり３，８００個以上の密度で播種し、間葉系幹細胞を培養する工程
工程（４）培養した間葉系幹細胞を回収する工程

さらに本発明は、工程（１）と工程（２）の間に、採取した切除脂肪を水溶液に１０分以上１７０時間以下の期間、接触させる工程をさらに含む前記製造方法である。

また、本発明は、工程（４）で回収した間葉系幹細胞を再び播種して培養し、回収する工程をさらに含む前記製造方法でもある。

さらに本発明は、工程（４）の後に、さらにジメチルスルホキシドを含む溶液で間葉系幹細胞を凍結保存する工程を含む前記製造方法でもある。

本発明によれば、極少量の切除脂肪から効率的に間葉系幹細胞を取得することが可能となり、適切な工程管理のもとで治療用の間葉系幹細胞を製造することができる。

以下、本発明の実施形態について具体的に説明するが、下記の説明は本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が下記の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も本発明の範囲に含まれる。

［１］用語の説明
本明細書における「間葉系幹細胞」とは、下記の定義を満たす幹細胞を指す。なお、本明細書において、「間葉系幹細胞」は「ＭＳＣ」と記載されることがある。

間葉系幹細胞の定義
i)標準培地での培養条件で、プラスチックへの接着性を示す。
ii)表面抗原ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３１が陰性。

本発明においては、間葉系幹細胞として脂肪組織由来の間葉系幹細胞を対象とする。また、本発明における脂肪組織由来の間葉系幹細胞には、「脂肪間質細胞 (Ａｄｉｐｏｓｅｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ)」や「脂肪幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）」も含まれる。

本明細書における「間葉系幹細胞含有細胞集団」の形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞シート、細胞凝集塊、細胞浮遊液又は細胞懸濁液などが挙げられる。

本明細書における「切除脂肪」とは、生体の皮下脂肪を切除して得られた脂肪組織のことであり、具体的には、生体の皮膚を切開し、皮膚下から任意の手術器具等を用いて切り取ることで採取された、皮下脂肪のなかでも比較的浅い層の脂肪組織を指す。

本明細書における「間質血管細胞群」とは、脂肪組織を酵素処理することで分離した脂肪細胞を除去して得られる細胞群を指す。間質血管細胞群は、一般に末梢血由来の細胞群（マクロファージ、好中球など）が有核細胞における半数程度を占め、残りは間葉系幹細胞の他、血管内皮細胞、血管壁細胞などを含む脂肪組織由来の細胞群である。本明細書における「間質血管細胞群」としては、完全に分離除去できなかった脂肪細胞が少量含まれてもよい。

本明細書における「水溶液」とは、水と水溶性の成分を含むものであれば特に限定されず、水、緩衝液、等張液、低張液、高張液など、どのような水溶液でも使用することができる。組織へのダメージ低減の観点で、緩衝液や等張液がより好ましく、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ（－）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、ブドウ糖液、各種輸液、生理食塩液、培養液、アルブミン溶液、血液由来成分、それらの混合物などが挙げられる。また、ＵＷ冷保存液（アステラス製薬）、セリオキープ（株式会社バイオベルデ）、肺組織/細胞用冷蔵保存液ＳｔｅｍＳｕｒｅｖｉｖｅ－Ｌｕｎｇ（トスク株式会社）などの組織保存液も使用できる。なおこれらを適宜水で希釈して用いることも出来る。

上記乳酸リンゲル液としては、ハルトマン液、ハルトマン輸液、ラクテック注、ソルラクト輸液、ポタコール輸液、ラクトリンゲル液、ニソリ注、ニソリ輸液等を使用することができるが、特に限定されない。上記５％ブドウ糖液としては、小林糖液、大塚糖液、マルトス輸液、キリット注、テルモ糖注、ブドウ糖注、光糖液、マドロス輸液等を使用することができるが、特に限定されない。

本発明で用いられる水溶液として、上記の緩衝液や等張液を希釈して使用する場合は、その希釈割合は５倍以内が好ましく、３倍以内がより好ましく、２倍以内が更に好ましい。さらには、体液（血漿）の浸透圧とほぼ等しい浸透圧をもち、細胞外内の水の輸送がない等張液をそのまま使用するか、あるいは適宜調整して体液の浸透圧と同程度に調製した水溶液も使用できる。また、菌の抑制の観点で、抗生物質を上記水溶液に添加することもできる。

本明細書における「培養液」とは特に限定されず、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（アルブミン、血清、血清代替試薬、増殖因子、ヒト血小板溶解物など）を適宜添加することにより調製することができる。

上記基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、ＥａｇｌｅＭＥＭ培地、αＭＥＭ（ＡｌｐｈａＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ／ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ－１２Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。また、市販の各種の無血清培地も使用できる。

前記基礎培地に対して添加する他の成分としては、例えば、アルブミン、血液由来成分、増殖因子、などが挙げられる。前記基礎培地にアルブミンを添加する態様においては、アルブミンの濃度は０．０５重量％以上、５重量％以下が好ましい。また、血液由来成分としては、各種の血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳやＦＣＳ）などの動物由来血清、ヒト血清、各種動物および／またはヒト血液由来の多血小板血漿や血小板溶解物を原料として調製される血清など）、各種動物および／またはヒト血液由来の血小板溶解物、血漿、などが挙げられる。ヒト血清は、接着性細胞を含む組織を取得した個体と同一個体由来の血清であっても、異なる個体由来であっても、どちらでも構わない。前記基礎培地に血液由来成分を添加する態様においては、血液由来成分の濃度は２体積％以上４０％体積以下が好ましい。より好ましくは３体積％以上３０％体積以下である。増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなどの抗凝固剤、ゲル、多糖類など）を、増殖因子に加えてさらに添加してもよいし、あらかじめ安定化させた増殖因子を前記基礎培地に対して添加してもよい。増殖因子は例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、及びそれらのファミリーを使用することができるが、特に限定されない。

［２］極少量の切除脂肪から間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造する方法
以下、本発明の間葉系幹細胞含有細胞集団を製造する方法の各工程について説明する。

まず、本発明では、工程（１）として、０．０５ｇ以上０．５ｇ未満の切除脂肪を生体から採取する。本工程は、例えば、以下のような手順にて行うことができる。患者の任意の箇所（例えば、腹部、腰部、大腿部）を尖刃のメスで０．５ｃｍ～１ｃｍ程度切開し、任意の手術器具（例えば、モスキート鉗子）で脂肪を摘出し、切除する。切開創は1針縫合するか、テープで固定する。

本発明では、切除脂肪の重量は、０．０５ｇ以上０．５ｇ未満であることが重要である。切除脂肪の重量が０．０５ｇ未満の場合、採取した脂肪組織中に十分量の間葉系幹細胞が含まれず、間葉系幹細胞を分離し培養することができないことがある。切除脂肪の重量は、０．０８ｇ以上がより好ましく、更に好ましくは０．０９ｇ以上である。一方、切除脂肪の重量が多い場合には、得られた組織中に多くの間葉系幹細胞が含まれることから間葉系幹脂肪を製造する観点では好ましいが、患者への負担（痛みや切除部位の凹み等）が大きくなることから０．５ｇ未満が適切であり、０．４ｇ未満がより好ましく、更に好ましくは０．３ｇ未満以上である。

さらに本発明では、上記工程（１）と次の工程（２）の間に、採取した極少量の切除脂肪を水溶液に接触させる工程を含むこともできる。この工程（接触工程）は、例えば、以下のような手順にて行うことができる。１．５ｍＬマイクロチューブに水溶液を充填し、その中に切除脂肪を収容する。中身が漏洩しないように容器の蓋を密閉し、接触させる。接触させる温度は特に限定されないが、組織へのダメージの観点で、３７℃以下が好ましく、冷蔵環境下がより好ましい。好ましくは２～３０℃、より好ましくは２～２５℃、更に好ましくは２～２０℃、最も好ましくは２～１５℃である。ここで使用する水溶液は、上記［１］の用語の説明に記載した水溶液であればいずれも使用することができるが、等張液が好ましい。切除脂肪を水溶液に接触させる時間は特に限定されないが、例えば１０分以上、３０分以上、１時間以上、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７２時間以上である。上限も特に限定されないが、長すぎると脂肪組織へのダメージも懸念されることから、好ましくは１７０時間以下、より好ましくは１６８時間以下、更に好ましくは１４４時間以下，もっとも好ましくは１２０時間以下である。

次に本発明では、工程（２）として、採取した切除脂肪を酵素処理して、間質血管細胞群を得る。本工程は、例えば、以下のような手順にて行うことができる。まずは、切除脂肪をハサミで細かく切り、酵素溶液を添加し攪拌する。次に、遠心分離により間質血管細胞群を分離させる。その後、必要に応じて洗浄液を用いて洗浄と遠心分離を複数回繰り返し、洗浄操作を実施することもできる。酵素溶液は脂肪組織を消化可能な溶液であればよく、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、等の酵素を適度な濃度に溶かし、使用する。上記酵素は混合物と使用しても良い。なかでも、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、またはその混合物である酵素を使用することが好ましい。

次に本発明では、工程（３）として、上記のようにして得られた間質血管細胞群を、培養容器の面積当たりの有核細胞数比率として、１ｃｍ^２あたり３，８００個以上の密度で播種し、間葉系幹細胞を培養する。本工程は、例えば、以下のような手順にて行うことができる。まず、工程（２）で得られた間質血管細胞群を含む細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて再懸濁する。次に、培養容器に前記再懸濁した細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。ここで用いる培地としては、［１］の用語の説明に記載した「培養液」が使用できる。なかでも、血小板溶解物および／または多血小板血漿由来血清を含む培地を用いるのが好ましい。

間質血管細胞群をフラスコやプレートなどの培養容器に播種する際は、培養容器の面積当たりの間質血管細胞群中の有核細胞数比率（個／ｃｍ^２）を適切な範囲でコントロールすることが必要である。間質血管細胞群は非常に夾雑細胞の多い細胞集団で、間質血管細胞群中の有核細胞数に対する脂肪由来ＭＳＣの比率は１０～４０％程度であること、そして個々人で比率が大きく異なることから、コントロールすることが難しい。種々の検討を実施した結果、培養容器の面積当たりの有核細胞数比率（個／ｃｍ^２）が低い場合、十分量の細胞が培養容器に接着しないことから、３，８００個／ｃｍ^２以上の密度で播種することが必要であることが判明した。培養容器の面積当たりの有核細胞数比率は、４，０００個／ｃｍ^２以上が好ましく、４，３００個／ｃｍ^２以上が更に好ましい。また、培養容器の面積当たりの有核細胞数比率が高すぎる場合には限定されないが、脂肪由来ＭＳＣを取得する効率性の観点から、１００，０００個／ｃｍ^２以下が一般的である。他にも例えば、８０，０００個／ｃｍ^２以下、７０，０００個／ｃｍ^２以下、６０，０００個／ｃｍ^２以下、５０，０００個／ｃｍ^２以下、４０，０００個／ｃｍ^２以下、３０，０００個／ｃｍ^２以下、２０，０００個／ｃｍ^２以下が挙げられる。

上記の１回の培養の培養期間としては、例えば２～２１日を挙げることができ、より好ましくは３～１９日、更に好ましくは４～１７日である。

さらに本発明では、工程（４）として、培養した間葉系幹細胞を回収する工程を実施する。本工程においては、培養した細胞を、細胞剥離手段にて処理して培養容器から剥離させて回収する。

上記の初代培養の細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することもできる。まず、初代培養の細胞を、細胞剥離手段にて処理して培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、培養容器に細胞を播種し、３％以上、５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。ここで用いる培地としては、初代培養時と同じく、［１］の用語の説明に記載した「培養液」が使用できる。なかでも、血小板溶解物および／または多血小板血漿由来血清を含む培地を用いるのが好ましい。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、ｎ回継代した細胞を取得することができる（ｎは１以上の整数を示す）。継代回数ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、１回以上、好ましくは２回以上、より好ましくは３回以上、さらに好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上である。また、継代回数ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、２５回以下、２０回以下、１５回以下、１０回以下であることが好ましい。

上記の細胞剥離手段として、例えば、細胞剥離剤を使用してもよい。細胞剥離剤としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等を使用することができるが、特に限定されない。細胞剥離剤として、市販の細胞剥離剤を用いてもよい。例えば、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ａｃｃｕｍａｘ（ＳｔｅｍｃｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞剥離手段として、物理的な細胞剥離手段を使用してもよく、例えば、セルスクレーパー（コーニング社製）を使用することができるが、これに限定されない。細胞剥離手段は、単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。

本発明の細胞集団においては、間葉系幹細胞は、生体外での培養開始後、２日から３カ月間培養することができる。好ましくは２日以上９０日以下、より好ましくは２日以上７０日以下、更に好ましくは３日以上５０日以下、もっとも好ましくは４日以上３０日以下である。

本発明においては、工程（１）～（４）を行い、回収した間葉系幹細胞を、凍結する工程をさらに含んでも良い。本発明における間葉系幹細胞を含む細胞集団を凍結保存するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素での凍結保存などが挙げられる。上記の凍結保存手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の温度は、好ましくは－３０℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－８０℃以下、－９０℃以下、－１００℃以下、－１５０℃以下、－１８０℃以下、又は－１９６℃（液体窒素温度）以下である。プログラムフリーザーを用いた場合、凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、－１℃／分以下、－２℃／分以下、－５℃／分以下、－９℃／分以下、－１０℃／分以下、－１１℃／分以下、又は－１５℃／分以下である。上記の凍結保存手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、－２℃／分以上－１℃／分以下の凍結速度で－５０℃以上－３０℃以下の間の温度（例えば、－４０℃）まで温度を下げ、さらに－１１℃／分以上－９℃／分以下（例えば、－１０℃／分）の凍結速度で－１００℃以上－８０℃以下の温度（例えば、－９０℃）まで温度を下げることができる。また、上記の凍結手段として液体窒素を用いた場合、例えば、－１９６℃まで急速に温度を下げて凍結させた後、液体窒素（気相）中で保存することができる。また液体窒素（液相）中で保存することもできる。

上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。上記の保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。

上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の凍結保存液中で凍結されてもよい。上記の凍結保存液としては、市販の凍結保存液を用いてもよい。例えば、ＣＰ－１（登録商標）（極東製薬工業社製）、ＢＡＭＢＡＮＫＥＲ（リンフォテック社製）、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社製）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏＲＭ（リプロセル社製）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（ＡｋｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＭＳＣＦｒｅｅｚｉｎｇＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（ＨｅｍａＣａｒｅ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。

上記の凍結保存液は、所定濃度の多糖類を含有することができる。多糖類の好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、４質量％以上、又は６質量％以上である。また、多糖類の好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１８質量％以下、１６質量％以下、１４質量％以下、又は１３質量％以下である。多糖類としては、例えば、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）やデキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ４０など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。

上記の凍結保存液は、所定濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有することができる。ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、又は５質量％以上である。また、ＤＭＳＯの好ましい濃度は、例えば、２０質量％以下、１８質量％以下、１６質量％以下、１４質量％以下、１２質量％以下、又は１０質量％以下である。

上記の凍結保存液は、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有するものでもよい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、又は４質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、３０質量％以下、２０質量％以下、１０質量％以下、又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これらに限定されない。

本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率が８０％以上であることを満たしていてもよい。

ＣＤ７３は、分化クラスター７３を意味し、５－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ、或いはＥｃｔｏ－５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅとしても知られているタンパク質である。

ＣＤ９０は、分化クラスター９０を意味し、Ｔｈｙ－１としても知られているタンパク質である。

ＣＤ１０５は、分化クラスター１０５を意味し、Ｅｎｄｏｇｌｉｎとしても知られているタンパク質である。

細胞集団においてＣＤ７３が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。

細胞集団においてＣＤ９０が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。

細胞集団においてＣＤ１０５が陽性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。

本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系幹細胞を含む細胞集団は、ＣＤ４５、ＣＤ３１が陰性を呈する間葉系幹細胞の比率が８０％以上であることを満たしていてもよい。

ＣＤ４５は、分化クラスター４５を意味し、ＰＴＰＲＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｙｒｏｓｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅ，Ｃ）、或いはＬＣＡ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｃｏｍｍｏｎａｎｔｉｇｅｎ）としても知られているタンパク質である。

ＣＤ３１は、分化クラスター３１を意味し、ＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎＣＤ３１としても知られているタンパク質である。

細胞集団においてＣＤ４５が陰性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。

細胞集団においてＣＤ３１が陰性を呈する間葉系幹細胞の比率は、８０％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％でもよい。

以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

＜比較例１:脂肪重量の検討（脂肪重量０．０５ｇの場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
インフォームドコンセントに同意したドナー（ドナーＡ）の任意の箇所を尖刃のメスで切開し、モスキート鉗子で脂肪を切除した。得られた切除脂肪をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）が入った１．５ｍＬマイクロチューブに１時間以上５時間以下収容した。

（工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪は、採取から約５時間以内に重量を測定した結果０．０５ｇであった。これをハサミで細かく切り、０．１％（ｖ／ｗ）コラゲナーゼ含有のハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）に浸し、３７℃にて３０分間、２００ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより酵素処理した。酵素処理後の溶液は遠心分離し、上清を除去した後洗浄した。前記遠心分離と洗浄の工程を５回繰り返し、脂肪由来ＭＳＣを含む間質血管細胞群（ＳＶＦ）を取得した。

（工程３：取得したＳＶＦの細胞数と播種密度の評価）
上述の「工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得」で得られたＳＶＦに関して、ヌクレオカウンターを用いて、総細胞濃度を測定した。

細胞濃度測定は、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社のＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（型式：ＮＣ－１００）を用いた。本測定における総細胞濃度は、細胞懸濁液と細胞処理試薬Ａ１００（型番：９１０－０００３）および細胞処理試薬Ｂ（型番：９１０－０００２）を等量で混合することで全ての細胞をＰＩ溶液の染色対象としたものを、ＰＩ溶液が封入されたカセット（型番：９４１－０００２）に吸引し、測定した。

得られた細胞濃度測定の数値から、取得したＳＶＦの細胞数を算出した。算出する計算式は以下の通り実施した。
ＳＶＦの細胞数（個）＝総細胞濃度（個/ｍＬ）×３（測定時の希釈倍率）×細胞懸濁液量（ｍＬ）
その結果、０．４×１０^５個のＳＶＦが得られた。

（工程４：脂肪由来ＭＳＣの培養）
上述の「工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得」で得られたＳＶＦを、培養容器の面積が２５ｃｍ^２のＴ－２５フラスコ（コーニング社製）に全量播種した。その際の播種密度は、１，３００個／ｃｍ^２であった。なお播種密度は以下の計算式にて算出した。
ＳＶＦの播種密度（個／ｃｍ^２）＝ＳＶＦの細胞数（個）／２５（培養容器の面積（ｃｍ^２））
それを、終濃度にして５％のヒト血小板溶解物を含むαＭＥＭ（ＡｌｐｈａＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）にて接着培養した。この接着培養した細胞を、０継代目の細胞集団と呼ぶ。サブコンフルエントもしくは任意の培養期間に達した時点で、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて０継代目の細胞集団を剥離した。剥離した０継代目の細胞集団は、５００個／ｃｍ^２以上の密度で、培養容器の面積が６３６ｃｍ^２のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に播種することにより、継代培養を行った。この継代培養した細胞集団を、１継代目の細胞集団と呼ぶ。１継代目の細胞集団は、サブコンフルエントに達した時点でＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔを用いて剥離し、培地を用いて希釈し、遠心分離により回収した。回収した細胞集団はＣＰ－１（登録商標）（極東製薬工業社製）：２５％ヒト血清アルブミン：生理食塩液＝２：１：３の比で混合した凍結保存溶液に懸濁し、－８０℃まで緩慢凍結し、その後も－８０℃で凍結保存した。

（工程５：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
上述の「工程４：脂肪由来ＭＳＣの培養」で得られた０継代目の細胞集団に関して、ヌクレオカウンターを用いて、死細胞濃度と総細胞濃度を測定した。

細胞濃度測定は、ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社のＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（型式：ＮＣ－１００）を用いた。本測定における死細胞濃度は、死細胞を染色するＰＩ溶液が封入されたカセット（型番：９４１－０００２）に細胞懸濁液を吸引し、測定した。また、本測定における総細胞濃度は、細胞懸濁液と細胞処理試薬Ａ１００（型番：９１０－０００３）および細胞処理試薬Ｂ（型番：９１０－０００２）を等量で混合することで全ての細胞をＰＩ溶液の染色対象とし、上述のカセットに吸引し、測定した。

細胞濃度測定の数値から、得られた脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率を算出した。算出する計算式は以下の通り実施した。
（１）脂肪由来ＭＳＣの細胞数（個）＝総細胞濃度（個/ｍＬ）×３（測定時の希釈倍率）×細胞懸濁液量（ｍＬ）
（２）脂肪由来ＭＳＣの生存率（％）＝１００－（死細胞濃度（個/ｍＬ）／（総細胞濃度（個/ｍＬ）×３（測定時の希釈倍率））×１００）
その結果、比較例１のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は０．３×１０^５個、生存率は取得細胞数が低値であったため測定不可であった。さらに、前記ドナーＡに由来する０継代目の細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種するために必要な細胞数（６．３６×１０^５個）に到達しなかったため、１継代目への継代培養を中止した。

＜実施例１:脂肪重量の検討（脂肪重量０．１９ｇの場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＢ）から脂肪を切除したこと以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪を採取から約２４時間以内に重量を測定した結果、０．１９ｇであった。この切除脂肪を用いたこと以外は、比較例１の工程２と同様の手法にて、脂肪由来ＭＳＣを含むＳＶＦを取得した。

（工程３：取得したＳＶＦの細胞数と播種密度の評価）
比較例１の工程３と同様の手法にて、取得したＳＶＦの細胞数および播種密度を算出した。その結果、実施例１の切除脂肪からは２．８×１０^５個のＳＶＦが得られた。これを、１０，３００個／ｃｍ^２の密度で播種した。

（工程４：脂肪由来ＭＳＣの培養）
比較例１の工程４と同様の手法にて、７日間の培養で０継代目の細胞集団を取得し、５日間の培養で１継代目の細胞集団を取得した。

（工程５：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程と同様の手法にて、実施例１の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。その結果、実施例１のドナーＢに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は１．４×１０^６個、生存率は９７．７％であった。前記ドナーＢに由来する０継代目の細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種して継代培養するために必要な細胞数（６．３６×１０^５個）に到達した。継代培養によって得られた実施例１のドナーＢに由来する１継代目の細胞集団の細胞数は、２．８×１０^７個、生存率は９５．２％であった。以上より、実施例１の方法では、生存率の高い多くの脂肪由来ＭＳＣを製造できることが分かった。

（工程６：表面抗原解析）
実施例１のドナーＢに由来する１継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各表面抗原（ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ４５の陽性率及び陰性率、ＣＤ３１の陽性率及び陰性率）を測定した。

表面抗原解析は、メルク（ＭＥＲＣＫ）社のＧｕａｖａｅａｓｙＣｙｔｅＳｉｎｇｌｅを用い、解析細胞数：１０，０００個、流速設定：Ｓｌｏｗにて実施した。本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＰＥＭｏｕｓｅＩｇＧ１ｋＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社製／型番：５５５７４９）、ＦＩＴＣＭｏｕｓｅＩｇＧ１ｋＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社製／型番：５５５７４８）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ＭｏｕｓｅＩｇＧ１ｋＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌ（ＢＤ社製／型番：５５７７１４）を使用し、ＣＤ７３抗原に対する抗体としてＰＥＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＨｕｍａｎＣＤ７３（ＢＤ社製／型番：５５０２５７）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体としてＰＥＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＨｕｍａｎＣＤ９０（ＢＤ社製／型番：５５５５９５）を、ＣＤ１０５抗原に対する抗体としてＰＥＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＨｕｍａｎＣＤ１０５（ＢＤ社製／型番：５６０８３９）を、ＣＤ４５抗原に対する抗体としてＦＩＴＣＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＨｕｍａｎＣＤ４５（ＢＤ社製／型番：５５５４８２）を、ＣＤ３１抗原に対する抗体としてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７ＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＨｕｍａｎＣＤ３１（ＢＤ社製／型番：５６１６５４）使用した。

表面抗原解析の結果、実施例１のドナーＢに由来する１継代目の細胞集団では、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５の陽性率はいずれも９０％以上であり（具体的にはＣＤ７３：１００％、ＣＤ９０：１００％、ＣＤ１０５：１００％）、ＣＤ４５、ＣＤ３１の陽性率は５％未満（陰性率は９５％以上）であった（具体的にはＣＤ４５の陽性率：１％（陰性率：９９％）、ＣＤ３１の陽性率：１％（陰性率：９９％））。以上の結果から、実施例１の１継代目の細胞集団は、間葉系幹細胞を含む細胞集団であることが確認された。

＜実施例２:脂肪重量の検討（脂肪重量０．１５ｇの場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーと同じドナー（ドナーＡ）から脂肪を切除したこと以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪の重量を測定した結果、０．１５ｇであった。この切除脂肪を用いたこと以外は、比較例１の工程２と同様の手法にて脂肪由来ＭＳＣを含むＳＶＦを取得した。

（工程３：取得したＳＶＦの細胞数と播種密度の評価）
比較例１の工程３と同様の手法にて、取得したＳＶＦの細胞数および播種密度を算出した。その結果、実施例２のドナーＡの切除脂肪からは１．８×１０^５個のＳＶＦが得られ、これを６，６００個／ｃｍ^２の密度で播種した。

（工程４：脂肪由来ＭＳＣの培養）
比較例１の工程４と同様の手法にて、７日間の培養で０継代目の細胞集団を取得し、６日間の培養で１継代目の細胞集団を取得した。

（工程５：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程５と同様の手法にて、実施例２の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。その結果、実施例２のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は１．２×１０^６個、生存率は９６．６％であった。前記ドナーＡに由来する０継代目の細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種して継代培養するために必要な細胞数（６．３６×１０^５個）に到達した。継代培養によって得られた実施例２のドナーＡに由来する１継代目の細胞集団の細胞数は１．８×１０^７個、生存率９４．４％であった。以上より、実施例２の方法では、生存率の高い多くの脂肪由来ＭＳＣを製造できることが分かった。

＜実施例３:脂肪重量の検討（脂肪重量０．１１ｇの場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＣ）から脂肪を切除したこと以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪の重量を測定した結果、０．１１ｇであった。この切除脂肪を用いたこと以外は、比較例１の工程２と同様の手法にて脂肪由来ＭＳＣを含むＳＶＦを取得した。

（工程３：取得したＳＶＦの細胞数と播種密度の評価）
比較例１の工程３と同様の手法にて、取得したＳＶＦの細胞数および播種密度を算出した。その結果、実施例３のドナーＣの切除脂肪からは１．２×１０^５個のＳＶＦが得られた。これを、４，５００個／ｃｍ^２の密度で播種した。

（工程５：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程５と同様の手法にて、実施例３の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。その結果、実施例３のドナーＣに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は１．０×１０^６個、生存率は９４．８％であった。前記ドナーＣに由来する０継代目の細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種して継代培養するために必要な細胞数（６．３６×１０^５個）に到達した。さらに、実施例３のドナーＣに由来する１継代目の細胞集団の細胞数は１．６×１０^７個、生存率９７．３％であった。以上より、実施例３の方法では、生存率の高い多くの脂肪由来ＭＳＣを製造できることが分かった。

＜比較例２:脂肪重量の検討（脂肪重量０．０２ｇの場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーと同じドナー（ドナーＡ）から、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪の重量を測定した結果、０．０２ｇであった。この切除脂肪を用いたこと以外は、比較例１の工程２と同様の手法にて、脂肪由来ＭＳＣを含むＳＶＦを取得した。

（工程３：取得したＳＶＦの細胞数と播種密度の評価）
比較例１の工程３と同様の手法にて、取得したＳＶＦの細胞数および播種密度を算出した。その結果、比較例２のドナーＡの切除脂肪からは０．６×１０^５個のＳＶＦが得られた。これを、２，１００個／ｃｍ^２の密度で播種した。

（工程４：脂肪由来ＭＳＣの培養）
比較例１の工程４と同様の手法にて、０継代目の細胞集団を取得した。

（工程５：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程５と同様の手法にて、比較例２の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。

その結果、比較例２のドナーＡに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は１．７×１０^５個、生存率は取得細胞数が低値であったため測定不可であった。さらに、前記細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種するために必要な細胞数（６．３６×１０^５個）に到達しなかったため、１継代目への継代培養を中止した。

＜実施例４:脂肪重量の検討（脂肪重量０．１５ｇの場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＤ）から脂肪を切除したこと以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程３：取得したＳＶＦの細胞数と播種密度の評価）
比較例１の工程３と同様の手法にて、取得したＳＶＦの細胞数および播種密度を算出した。その結果、実施例４の切除脂肪からは１．２×１０^５個のＳＶＦが得られた。これを、４，５００個／ｃｍ^２の密度で播種した。

（工程４：脂肪由来ＭＳＣの培養）
比較例１の工程４と同様の手法にて、７日間の培養で０継代目の細胞集団を取得し、１１日の培養で１継代目の細胞集団を取得した。

（工程５：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程５と同様の手法にて、実施例４の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。その結果、実施例４のドナーＤに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は０．８×１０^６個、生存率は９３．３％であった。前記ドナーＤに由来する０継代目の細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種して継代培養するために必要な細胞数（６．３６×１０^５個）に到達した。さらに、実施例４のドナーＤに由来する１継代目の細胞集団の細胞数は３．６×１０^７個、生存率９６．１％であった。以上より、実施例４の方法では、生存率の高い多くの脂肪由来ＭＳＣを製造できることが分かった。

＜実施例５:脂肪重量の検討（脂肪重量０．２０ｇの場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＤ）から脂肪を切除したこと以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪の重量を測定した結果、０．２０ｇであった。この切除脂肪を用いたこと以外は、比較例１の工程２と同様の手法にて脂肪由来ＭＳＣを含むＳＶＦを取得した。

（工程３：取得したＳＶＦの細胞数と播種密度の評価）
比較例１の工程３と同様の手法にて、取得したＳＶＦの細胞数および播種密度を算出した。その結果、実施例５の切除脂肪からは５．２×１０^５個のＳＶＦが得られた。これを、１９，２００個／ｃｍ^２の密度で播種した。

（工程４：脂肪由来ＭＳＣの培養）
比較例１の工程４と同様の手法にて、７日間の培養で０継代目の細胞集団を取得し、８日間の培養で１継代目の細胞集団を取得した。

（工程５：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程５と同様の手法にて、実施例５の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。その結果、実施例５のドナーＤに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は１．７×１０^６個、生存率は９６．４％であった。前記ドナーＤに由来する０継代目の細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種して継代培養するために必要な細胞数（６．３６×１０^５個）に到達した。さらに、実施例５のドナーＤに由来する１継代目の細胞集団の細胞数は３．４×１０^７個、生存率９２．９％であった。以上より、実施例５の方法では、生存率の高い多くの脂肪由来ＭＳＣを製造できることが分かった。

＜実施例６:脂肪重量の検討（脂肪重量０．０６ｇの場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＥ）から脂肪を切除したこと以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪の重量を測定した結果、０．０６ｇであった。この切除脂肪を用いたこと以外は、比較例１の工程２と同様の手法にて脂肪由来ＭＳＣを含むＳＶＦを取得した。

（工程３：取得したＳＶＦの細胞数と播種密度の評価）
比較例１の工程３と同様の手法にて、取得したＳＶＦの細胞数および播種密度を算出した。その結果、実施例６の切除脂肪からは６．８×１０^４個のＳＶＦが得られ、６ウェルプレートで７，１００個／ｃｍ^２の密度で播種されることがわかった。以上より、実施例６の方法で取得することで多くのＳＶＦを取得できることが分かった。

（工程４：脂肪由来ＭＳＣの培養）
培養容器をＴ－２５フラスコ（コーニング社製）の代わりに６ウェルプレート（面積９．６ｃｍ^２）を使うこと以外は、比較例１の工程４と同様の手法にて、１３日間の培養で０継代目の細胞集団を取得した。

（工程５：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程５と同様の手法にて、実施例５の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。その結果、実施例６のドナーＥに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は６．９×１０^５個、生存率は９７．０％であった。前記ドナーＥに由来する０継代目の細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種して継代培養するために必要な細胞数に到達した。

以上の結果を総括すると、表１のようになる。

表１に示すように、比較例に記載の方法で取得した０継代目の細胞集団はいずれも、実施例に記載の方法で取得した０継代目の細胞集団の１／３以下の細胞数しか取得できなかった。実施例に記載した方法では、７日間で１０^６個程度の脂肪由来ＭＳＣが取得でき、１２日から１８日で１０^７個以上の脂肪由来ＭＳＣが取得できた。従って、実施例に記載した方法によると、０．０５ｇ以上０．５ｇ未満の少量の切除脂肪から２週間程度という短期間で、１治療に使用する細胞数（１０^７個程度）を安定して製造できることが分かった。

以上より、比較例の方法は以下に示す工程（１）の０．０５ｇ以上０．５ｇ未満の切除脂肪を生体から採取する工程、工程（３）の間質血管細胞群を、培養容器の面積当たりの有核細胞数比率として、１ｃｍ^２あたり３，８００個以上の密度で播種し、間葉系幹細胞を培養する工程のいずれかの条件を満たしておらず、その場合は短期間で治療に必要な量の脂肪由来ＭＳＣを製造できないことがわかった。

次に、切除脂肪から脂肪由来ＭＳＣを分離する方法の検討を行った。

＜実施例７:脂肪由来ＭＳＣ分離方法の検討（酵素処理法の場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＦ）から脂肪を切除したこと以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程２：切除脂肪の酵素処理およびＳＶＦの取得）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪の重量は約０．３ｇであった。この切除脂肪を用いたこと以外は、比較例１の工程２と同様の手法にて脂肪由来ＭＳＣを含むＳＶＦを取得した。

（工程３：取得したＳＶＦの細胞数と播種密度の評価）
比較例１の工程３と同様の手法にて、取得したＳＶＦの細胞数および播種密度を算出した。その結果、実施例７の切除脂肪からは１．２×１０^５個のＳＶＦが得られた。これを、４，６００個／ｃｍ^２の密度で播種した。

（工程４：脂肪由来ＭＳＣの培養）
比較例１の工程４と同様の手法にて、１１日間の培養で０継代目の細胞集団を取得し、５日間の培養で１継代目の細胞集団を取得した。

（工程５：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程５と同様の手法にて、実施例７の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。その結果、実施例７のドナーＦに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は４．１×１０^６個、生存率は９８．０％であった。前記ドナーＦに由来する０継代目の細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種して継代培養するために必要な細胞数（６．３６×１０^５個）に到達した。さらに、実施例７のドナーＦに由来する１継代目の細胞集団の細胞数は３．２×１０^７個、生存率９８．８％であった。以上より、実施例７の方法では、生存率の高い多くの脂肪由来ＭＳＣを製造できることが分かった。

＜比較例４:脂肪由来ＭＳＣ分離方法の検討（天井培養法の場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＦ）から脂肪を切除したこと以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程２：脂肪由来ＭＳＣの培養）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪の重量は約０．３ｇであった。この切除脂肪を、採取から５時間以内にハサミで細かく切り、培養容器の面積が２５ｃｍ^２のＴ－２５フラスコ（コーニング社製）に入れた。そこに、終濃度にして５％のヒト血小板溶解物を含むαＭＥＭ（ＡｌｐｈａＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）を満杯に添加し、培養面を上側に反転させた状態で培養した。この接着培養した細胞を、０継代目の細胞集団と呼ぶ。培養開始から３日後の培地交換にて培養面を下側に戻し、その後８日間の培養で、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて０継代目の細胞集団を剥離した。

（工程３：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程５と同様の手法にて、比較例４の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。その結果、比較例４のドナーＦに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は０．３×１０^６個、生存率は８３．５％であった。前記細胞集団は、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（コーニング社製）に５００個／ｃｍ^２以上の密度で播種するために必要な細胞数（６．３６×１０^５個）に到達しなかったため、１継代目への継代培養を中止した。

＜比較例５:脂肪由来ＭＳＣ分離方法の検討（エクスプラント法の場合）＞
（工程１：切除脂肪の採取）
比較例１におけるドナーとは異なるドナー（ドナーＦ）から脂肪を切除したこと以外は、比較例１の工程１と同様の手法にて切除脂肪を採取した。

（工程２：脂肪由来ＭＳＣの培養）
上述の「工程１：切除脂肪の採取」で得られた切除脂肪の重量は約０．３ｇであった。この切除脂肪を、採取から５時間以内にハサミで細かく切り、培養容器の面積が５５ｃｍ^２の１０ｃｍディッシュ（住友ベークライト社製）に入れた。切除脂肪に被せる様に金属メッシュ器材（製品名：セルアミーゴ）を静置した。それを、終濃度にして５％のヒト血小板溶解物を含むαＭＥＭ（ＡｌｐｈａＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）で培養した。この接着培養した細胞を、０継代目の細胞集団と呼ぶ。培養開始から６日後の培地交換にて金属メッシュ器材を除去し、その後５日間の培養で、ＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて０継代目の細胞集団を剥離した。

（工程３：培養した脂肪由来ＭＳＣの細胞数および生存率の評価）
比較例１の工程５と同様の手法にて、比較例５の０継代目の細胞集団の細胞数と生存率を評価した。その結果、比較例５のドナーＦに由来する０継代目の細胞集団の細胞数は０．９×１０^６個、生存率は８７．０％であった。

以上の結果を総括すると、表２のようになる。

表２に示すように、比較例に記載の方法で取得した０継代目の細胞集団はいずれも、実施例に記載の方法で取得した０継代目の細胞集団の１／６以下の細胞数しか取得できず、実施例で取得した細胞集団に比べて生存率も低値傾向であった。従って、実施例に記載した方法により脂肪由来ＭＳＣを分離することで、より多くの細胞を高い生存率で取得できることが分かった。

Claims

下記の工程（１）から工程（４）を含む、間葉系幹細胞含有細胞集団を製造する方法。
工程（１）０．０５ｇ以上０．５ｇ未満の切除脂肪を生体から採取する工程
工程（２）採取した切除脂肪を酵素処理して、間質血管細胞群を得る工程
工程（３）前記間質血管細胞群を、培養容器の面積当たりの有核細胞数比率として、１ｃｍ^２あたり３，８００個以上の密度で播種し、間葉系幹細胞を培養する工程
工程（４）培養した間葉系幹細胞を回収する工程
工程（１）と工程（２）の間に、採取した切除脂肪を水溶液に１０分以上１７０時間以下の期間、接触させる工程をさらに含む、請求項１記載の製造方法。
水溶液が等張液である請求項２記載の製造方法。
工程（３）において、血小板溶解物および／または多血小板血漿由来血清を含む培地で培養する、請求項１から３いずれか１項記載の製造方法。
工程（２）において、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、またはその混合物である酵素を使用して酵素処理を行う請求項１から４いずれか１項記載の製造方法。
工程（４）で回収した間葉系幹細胞を再び播種して培養し、回収する工程をさらに含む請求項１から５いずれか１項記載の製造方法。
工程（４）の後に、さらにジメチルスルホキシドを含む溶液で間葉系幹細胞を凍結保存する工程を含む請求項１から６いずれか１項記載の製造方法。