WO2022210574A1 - 筋ジストロフィー治療剤 - Google Patents

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真広 林
智之 中石
尚巳 岡田
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株式会社カネカ
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Definitions

  • the amniotic membrane is a translucent membrane located closest to the fetus in the placenta of a pregnant woman, and has the role of wrapping the fetus and retaining amniotic fluid. It has been reported that cells belonging to the mesenchymal system are also present in the amniotic membrane (Non-Patent Document 1).
  • the amniotic membrane can be collected non-invasively as medical waste at the time of delivery, without additional invasion for cell collection.
  • Mesenchymal cells present in the amniotic membrane are considered to be mesenchymal stem cells because they have properties similar to mesenchymal stem cells derived from bone marrow and fat, but they have the ability to differentiate into adipocytes and vascular endothelial cells. (Non-Patent Document 2), it is considered that the cell characteristics are different from those of bone marrow mesenchymal stem cells and adipose mesenchymal stem cells.
  • "***" indicates P ⁇ 0.0001 in one-way ANOVA of wild-type and each mdx mouse.
  • the ratio of CD73-positive mesenchymal cells is 80% or more
  • the ratio of CD166-positive mesenchymal cells is 80% or more
  • the ratio of CD45-positive cells is The therapeutic agent for muscular dystrophy according to any one of (1) to (3), wherein the proportion of CD105-positive mesenchymal cells is 10% or less and 70% or more.
  • the therapeutic agent for muscular dystrophy according to any one of (1) to (4), wherein the cell population is obtained from a living body of the same species as the subject to which it is administered.
  • Patent Document 3 It has been reported that muscle symptoms were stabilized in muscular dystrophy model animals injected with dental pulp cell-derived MSCs (Patent Document 3 and Non-Patent Document 3). Since they have no or low differentiation ability, their differentiation ability is greatly different from that of dental pulp cells, and their cell characteristics are different.
  • the activity concentration of collagenase is preferably 50 PU/ml or more, more preferably 100 PU/ml or more, still more preferably 200 PU/ml or more, still more preferably 300 PU/ml or more, still more preferably 400 PU/ml or more.
  • the activity concentration of collagenase is not particularly limited, but is, for example, 1000 PU/ml or less, 900 PU/ml or less, 800 PU/ml or less, 700 PU/ml or less, 600 PU/ml or less, or 500 PU/ml or less.
  • PU Protease Unit
  • PU Protease Unit
  • the mesenchymal cells are preferably doubling 10 times or more, more preferably 15 times or more, 20 times or more, 25 times or more, 30 times or more, and 35 times after the start of in vitro culture. It is possible to culture until 40 times or more, 45 times or more, or 50 times or more.
  • Step 1-2 enzymatic treatment of amniotic membrane and collection of mesenchymal cells
  • the amniotic membrane containing the epithelial cell layer and the mesenchymal cell layer was immersed in a Hank's balanced salt solution (containing Ca and Mg) containing 240 PU/mL collagenase and 200 PU/mL dispase I, at 37°C for 90 minutes at 50 rpm.
  • the amniotic membrane was enzymatically treated by shaking and stirring at .
  • the enzyme-treated solution was filtered through a nylon mesh with an opening of 95 ⁇ m to remove undigested amniotic membrane, and a cell suspension containing mesenchymal cells was recovered.
  • Example 2 hPL culture I of amniotic mesenchymal cells> (Step 2-1: Collection of amniotic membrane) An amniotic membrane was obtained from the same donor (donor #1) as in Example 1 in the same manner as in Example 1.
  • RPMI1640 was added so that the cell concentration was 2 ⁇ 10 7 cells/mL.
  • CellSTACK registered trademark
  • cryopreserved cell population was thawed, and the first passage cell population was seeded on CellSTACK (registered trademark) at a density of about 1,000 cells/cm 2 to obtain a final concentration of 5% human platelet lysate.
  • the cells were adherently cultured in ⁇ MEM containing (hPL) for 5 days until subconfluent.
  • mice Male, 4-5 weeks old, weighing 10 g or more, obtained from Clea Japan, Inc.
  • mice Male, 4-5 weeks old, weighing 10 g or more, obtained from Clea Japan, Inc.
  • the cell suspension prepared above once a week for 4 or 6 weeks through the tail vein. administered internally.

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Abstract

簡便に製造可能で、かつ治療効果の高い筋ジストロフィー治療剤を提供する。　羊膜組織に由来する間葉系細胞を含む細胞集団を、筋ジストロフィー治療剤の有効成分として含有させる。

Description

筋ジストロフィー治療剤
　本発明は、羊膜組織に由来する間葉系細胞を含む筋ジストロフィー治療剤に関する。
　筋ジストロフィーは、骨格筋の変性・壊死を主病変とする遺伝性筋疾患であり、その主症状としては、骨格筋障害に伴う運動機能障害がある。筋ジストロフィーの主な病型としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー等がある。特にＤＭＤは、最も患者数の多い代表的な筋ジストロフィーである。
　筋ジストロフィーの治療法について、いずれの病型においても根本的な治療法は確立されておらず、多くはリハビリテーションによる機能維持、補助呼吸管理や心臓ペースメーカー等の対症療法にとどまる。
　間質性細胞に含まれる間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ）は、骨髄、脂肪組織、歯髄、及び胎盤、臍帯、卵膜などの胎児付属物に存在する体性幹細胞として知られる。体性幹細胞は、特に再生医療への応用が進められており、近年、間葉系幹細胞に代表される間葉系細胞などの細胞を患者に投与し、組織や臓器の再生や機能改善を促進する新たな治療法の実用化が急速に進んでいる。例えば、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）や脊髄損傷の患者を対象とした骨髄間葉系細胞製剤や、重症心不全の患者を対象とした骨格筋芽細胞シートが、再生医療等製品として国内で販売されている。
　間葉系細胞は、通常、培養基材に接着する性質を有しており、前記細胞製剤を製造する際は、細胞を培養基材に接着させて増殖培養する工程に加えて、培養基材に接着した細胞を剥離する工程を要する。上述した骨髄間葉系細胞も培養基材に接着する性質を有しており、細胞を培養基材に接着させた状態で増殖培養した後、細胞を培養基材から剥離する工程を経て、細胞懸濁液を回収する。前記細胞を培養基材から剥離する方法としては、例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素や化学薬品を用いた化学的手段や、セルスクレーパーのような物理的に細胞を剥離する器具を用いた物理的手段が挙げられる。例えば、特許文献１は、トリプシンを培養基材に添加し、間葉系細胞を剥離させる方法を開示している。また、特許文献２には、温度によって細胞接着性が変化する温度応答性高分子を表面に被覆した培養基材を用い、温度変化によって培養基材から細胞を剥離する方法が開示されている。
　羊膜は妊婦の胎盤の最も胎児側に位置する半透明の膜であり、胎児を包み、羊水を保持する役割を持つ。羊膜にも間葉系に属する細胞が存在することが報告されている（非特許文献１）。羊膜は出産時の医療廃棄物として非侵襲的に採取することができ、細胞採取のために新たな侵襲を伴うことが無い。羊膜に存在する間葉系細胞は、骨髄や脂肪に由来する間葉系幹細胞に類する性質を有することから間葉系幹細胞であると考えられているが、脂肪細胞、血管内皮細胞への分化能がほとんどないとも報告されていることから（非特許文献２）、骨髄間葉系幹細胞や脂肪間葉系幹細胞とは細胞特性が異なると考えられる。
　ＤＭＤ治療について、間葉系幹細胞である歯髄由来の幹細胞の使用が検討されている。非特許文献３では、ＤＭＤモデル動物にヒト歯髄幹細胞を血管内投与することで、症状が安定したことが報告されている。また、特許文献３には、多能性幹細胞富化ヒト歯髄由来細胞を有効成分とする筋ジストロフィー治療剤が提案されており、ＤＭＤモデル動物において、該治療剤の投与によって、ＤＭＤに伴う筋肉の炎症の進行、運動機能の低下及び心機能の低下が抑制されたことが報告されている。
国際公開２００９／０５７５３７ 国際公開２００１／０６８７９９ 国際公開２０１６／０７６４３４
Casey ML, et al. Biol Reprod. 1996 Dec;55(6):1253-60 Chen L, et al. Stem Cell Res. 2019 Oct;40:101537. Kerkis I. et al., J Transl Med. 6: 35 (2008)
１０％のＦＢＳを含むαＭＥＭで、羊膜間葉系細胞（ヒト羊膜間葉系幹細胞（ｈＡＭＳＣ）を含む）を増殖停止するまで継代培養した際の増殖曲線の結果を示すグラフである。 ５％のｈＰＬを含むαＭＥＭで、羊膜間葉系細胞（ヒト羊膜間葉系幹細胞（ｈＡＭＳＣ）を含む）を増殖停止するまで継代培養した際の増殖曲線の結果を示すグラフである。 ｍｄｘマウス（ＤＭＤモデルマウス）の握力比較の結果を示すグラフである。野生型（ｎ＝７）、無処置ｍｄｘマウス（ｎ＝１６）、羊膜間葉系細胞（ヒト羊膜間葉系幹細胞（ｈＡＭＳＣ）を含む）を４回投与したｍｄｘマウス（ｎ＝７）、及び羊膜間葉系細胞を６回投与したｍｄｘマウス（ｎ＝５）の握力を比較した。図中、野生型と各ｍｄｘマウスの一元配置分散分析（ｏｎｅ　ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）において、「＊＊＊＊」はＰ＜０．０００１であったことを示す。また、無処置ｍｄｘマウスと各羊膜間葉系細胞投与マウスのｏｎｅ　ｗａｙ　ＡＮＯＶＡにおいて、「＃＃」はＰ＜０．０１、「＃＃＃」はＰ＜０．００１、「ｎｓ」は有意差がなかったことを示す。 ｍｄｘマウス（ＤＭＤモデルマウス）の循環機能比較の結果を示すグラフである。野生型（ｎ＝４）、無処置ｍｄｘマウス（ｎ＝６）、及び羊膜間葉系細胞（ヒト羊膜間葉系幹細胞（ｈＡＭＳＣ）を含む）を４回投与したｍｄｘマウス（ｎ＝５）の左室内径短縮率（ＬＶＦＳ（％））を比較した。図中、野生型と無処置ｍｄｘマウスのｔ検定において、「＊＊」はＰ＜０．０１であったことを示す。また、無処置ｍｄｘマウスと羊膜間葉系細胞投与マウスのｔ検定において、「＃」はＰ＜０．０５であったことを示す。左室内径短縮率（ＬＶＦＳ（％））
　特許文献３に記載の筋ジストロフィー治療剤は、歯髄由来細胞を有効成分としている。しかし、歯髄由来細胞は、１つの試料から少量しか採取できないことから、その拡大培養のために多くの時間とコストを要する。また、特許文献３には、歯髄由来細胞の初代培養時に支持細胞が使用されたことが報告されているが、実際に患者に投与される治療剤として使用するためには目的の細胞と支持細胞とを分離する工程を要する。治療剤としての実用性を考慮すると、より効率よく製造可能な筋ジストロフィー治療剤が望まれる。
　本発明は、簡便に製造可能で、かつ治療効果の高い筋ジストロフィー治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究を行った結果、羊膜由来の間葉系細胞を含む細胞集団を使用することで、筋ジストロフィーへの罹患により低下した対象の骨格筋機能や心機能を改善できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本明細書によれば、以下の発明が提供される。
（１）羊膜組織に由来する間葉系細胞を含む細胞集団を有効成分として含有する、筋ジストロフィー治療剤。
（２）前記細胞集団が、前記細胞集団における、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつ、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である、（１）に記載の筋ジストロフィー治療剤。
（３）前記細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、（１）又は（２）に記載の筋ジストロフィー治療剤。
（４）前記細胞集団において、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率が１０％以下であり、かつＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、（１）～（３）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（５）前記細胞集団が、投与される対象とは異なる生体から得られたものである、（１）～（４）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（６）前記細胞集団が、投与される対象と同種の生体から得られたものである、（１）～（４）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（７）投与される対象がヒトである、（１）～（６）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（８）前記細胞集団がヒト由来である、（１）～（７）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（９）前記間葉系細胞が、骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能がない又は低いものである、（１）～（８）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（１０）前記間葉系細胞が、抗炎症作用を有する、（１）～（９）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（１１）前記細胞集団が、血小板溶解物を含む培地を用いて培養された細胞の集団である、（１）～（１０）に記載の筋ジストロフィー治療剤。
（１２）静脈内に投与される、（１）～（１１）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（１３）投与後の治療効果が６ヶ月以上持続する、（１）～（１２）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（１４）デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用される、（１）～（１３）のいずれかに記載の筋ジストロフィー治療剤。
（１５）（ａ）羊膜組織より間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程；及び（ｂ）（ａ）の細胞集団を培養する工程、を含む、筋ジストロフィー治療剤の製造方法。
（１６）前記（ｂ）の培養に、血小板溶解物を含む培地が使用される、(１５）に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-059235号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、従来よりも簡易に製造可能で、かつ治療効果の高い筋ジストロフィー治療剤を提供することが可能である。
［１］用語の説明
　本明細書における「胎児付属物」は、卵膜、胎盤、臍帯及び羊水を指す。さらに「卵膜」は、胎児の羊水を含む胎嚢であり、内側から羊膜、絨毛膜及び脱落膜からなる。このうち、羊膜は胎児を起源とする。「羊膜」は、卵膜の最内層にある血管に乏しい透明薄膜を指す。羊膜の内層（上皮細胞層ともよばれる）は分泌機能のある一層の上皮細胞で覆われ羊水を分泌し、羊膜の外層（細胞外基質層ともよばれ、間質に相当する）は間葉系細胞を含む。
　本明細書における「間葉系細胞」は「間葉系幹細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ)」を含み、以下の定義を満たす細胞を指す。
ｉ）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す。標準培地は、基礎培地（例：αＭＥＭ培地）に血清、血清代替試薬又は増殖因子（例：血清代替試薬であるヒト血小板溶解物）を添加した培地である。
ｉｉ）表面抗原のＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ４５、ＣＤ３２６が陰性。
　本明細書において、「間葉系幹細胞」は、「間葉系間質細胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｌｌｓ)」と区別なく用いられる。本明細書において、「間葉系幹細胞」は「ＭＳＣ」と記載されることがある。
　本明細書において、所定の表面抗原について「陽性を呈する間葉系細胞の比率」とは、表面抗原発現が陽性である細胞の比率を示す。本明細書において、所定の表面抗原について陽性を呈する細胞の比率は「陽性率」と記載されることがあり、また、所定の表面抗原について陰性を呈する細胞の比率は「陰性率」と記載されることがある。
　本明細書における「間葉系細胞を含む細胞集団」とは、少なくとも間葉系細胞を含む細胞集団であれば特に限定されず、他の細胞を含む集団であってもよい。間葉系細胞は一つの組織から分離したもののみであっても、複数の組織から分離したものの混合物であってもよい。また、「間葉系細胞を含む細胞集団」の形態は特に限定されず、例えば、細胞ペレット、細胞凝集塊、細胞シート、細胞浮遊液、細胞懸濁液、これらの凍結物等が挙げられる。
　表面抗原の「ＣＤ３２４」は、分化クラスター３２４を意味し、上皮カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）としても知られているタンパク質である。
　表面抗原の「ＣＤ９０」は、分化クラスター９０を意味し、Ｔｈｙ－１としても知られているタンパク質である。
　表面抗原の「ＣＤ３２６」は分化クラスター３２６を意味し、ＥｐＣＡＭとしても知られているタンパク質である。
　表面抗原の「ＣＤ７３」は、分化クラスター７３を意味し、５－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅ、或いはＥｃｔｏ－５’－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｓｅとしても知られているタンパク質である。
　表面抗原の「ＣＤ１６６」は、分化クラスター１６６を意味し、Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＡＬＣＡＭ）としても知られているタンパク質である。
　表面抗原の「ＣＤ１０５」は、分化クラスター１０５を意味し、Ｅｎｄｏｇｌｉｎとしても知られているタンパク質である。
　表面抗原の「ＣＤ４５」は、分化クラスター４５を意味し、ＰＴＰＲＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｐｅ，Ｃ）、或いはＬＣＡ（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ）としても知られているタンパク質である。
　表面抗原の「ＣＤ３４」は、分化クラスター３４を意味し、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　ＣＤ３４としても知られているタンパク質である。
［２］筋ジストロフィー治療剤
　本発明の筋ジストロフィー治療剤は、羊膜組織に由来する間葉系細胞を含む細胞集団を有効成分として含有することを特徴とする。
　本発明の筋ジストロフィー治療剤の投与対象は、典型的にはヒトであるが、他の動物であってもよい。他の動物としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、フェレット等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類が挙げられる。好適な投与対象はヒトである。以下、本発明の筋ジストロフィー治療剤について、投与対象をヒトとする態様を説明するが、本発明における投与対象をヒトに限定することを意図するものではない。
［２－１］羊膜組織に由来する間葉系細胞を含む細胞集団
　本発明の筋ジストロフィー治療剤（以下、「治療剤」とも称する）において、「間葉系細胞を含む細胞集団」に含まれる間葉系細胞の比率は、特に限定されないが、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上でもよい。
　また、前記間葉系細胞を含む細胞集団における他の細胞の比率は、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下でもよい。なお、前記他の細胞は、間葉系細胞以外であれば特に限定されないが、例えばリンパ球、顆粒球、赤血球などの血球系細胞を挙げることができる。
　本発明の治療剤に使用される間葉系細胞を含む細胞集団は、上記の定義ｉ）及びｉｉ）を満たす細胞を含む細胞集団であれば、特に限定されないが、下記（ａ）及び（ｂ）の特性を有するように調製された細胞集団とすることが好ましい。
　（ａ）前記細胞集団においてＣＤ３２４が陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、
　（ｂ）前記細胞集団において、ＣＤ９０が陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である。
　前記特性を備えることにより、間葉系細胞を含む細胞集団は、培養後に基材から自発的に剥離することができる。これにより、特許文献１又は２に記載の方法のような酵素や特殊な装置を用いることなく、培養後の細胞を効率よく取得することが可能となる。
　前記細胞集団において、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは７５％以上、８０％以上、８５％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上でもよい。
　前記細胞集団において、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよく、１００％でもよい。
　本発明の治療剤の一以上の実施態様において、前記細胞集団は、好ましくは、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である。
　前記細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率は、より好ましくは５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、３％以下（陰性率９７％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
　本発明の一態様によれば、本発明により提供される間葉系細胞を含む細胞集団は、好ましくは、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、ＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、ＣＤ３４陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、のうち１以上を満足する。
　前記細胞集団においてＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよく、１００％でもよい。
　前記細胞集団においてＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上でもよい。
　前記細胞集団においてＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率は、より好ましくは７４％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上でもよい。
　前記細胞集団においてＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率は、より好ましくは５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、３％以下（陰性率９７％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
　前記細胞集団においてＣＤ３４陽性を呈する細胞の比率は、より好ましくは５％以下（陰性率９５％以上）、４％以下（陰性率９６％以上）、３％以下（陰性率９７％以上）、２％以下（陰性率９８％以上）、１％以下（陰性率９９％以上）でもよく、０％（陰性率１００％）でもよい。
　ここで、ＣＤ３２４陽性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ３２６陽性、ＣＤ７３陽性、ＣＤ１６６陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ４５陽性及びＣＤ３４陽性を呈する細胞又は間葉系細胞とは、それぞれ、ＣＤ３２４、ＣＤ９０、ＣＤ３２６、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５、ＣＤ４５及びＣＤ３４の発現が陽性である細胞又は間葉系細胞を意味する。
　本発明の治療剤に使用される細胞集団について、指標とする発現マーカー（ＣＤ３２４、ＣＤ９０、ＣＤ３２６、ＣＤ７３、ＣＤ１６６、ＣＤ１０５、ＣＤ４５又はＣＤ３４）は、当該技術分野において公知の任意の検出方法により検出することができる。発現マーカーを検出する方法としては、例えばフローサイトメトリー又は細胞染色が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識抗体を用いるフローサイトメトリーにおいて、ネガティブコントロール（アイソタイプコントロール）と比較してより強い蛍光を発する細胞が検出された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。蛍光標識抗体は、当該技術分野において公知の任意の抗体を使用することができ、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）等により標識された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞染色において、着色するか若しくは蛍光を発する細胞が顕微鏡下にて観察された場合、当該細胞は当該マーカーについて「陽性」と判定される。細胞染色は、抗体を使用する免疫細胞染色であってもよく、抗体を使用しない非免疫細胞染色であってもよい。なお、本明細書において、発現マーカーと表面抗原は同義であり、両者は置き換えて使うことができる。
　本発明の治療剤に使用される間葉系細胞を含む細胞集団は、羊膜組織より分離された間葉系細胞を含む細胞集団である。羊膜組織より分離された間葉系細胞（以下、「羊膜間葉系細胞」とも称する）は、原料組織から分離可能な細胞数が多く、かつ高増殖性であることから所定量の細胞を短期間で取得できる。そのため、羊膜間葉系細胞は、継代数の少ない高品質な細胞を安定的に取得でき、また、培養に際して必ずしも支持細胞を必要としないことから、比較的低コストで製造可能である。羊膜間葉系細胞としては、投与される対象とは異なる生体から得られたもの、すなわち、他家の羊膜間葉系細胞を使用することができる。
　前記間葉系細胞を含む細胞集団は、抗炎症作用を有する細胞集団であることが好ましい。羊膜間葉系細胞に含まれる羊膜間葉系幹細胞は高い抗炎症作用を有することが知られるが（例えば、Yamahara K, et al., Pros One, 9(2) e88319 (2014)を参照のこと）、本発明の治療剤において、細胞集団の回収・選別方法は、その抗炎症作用が維持される条件で実施されることが好ましい。
　前記羊膜間葉系細胞は任意の哺乳動物由来のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター等のげっ歯類；ヒト、ゴリラ、チンパンジー等の霊長類；及びイヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜若しくは愛玩動物などの哺乳動物由来のものであってよいが、特に投与対象と同種の動物由来のものが好ましい。投与対象がヒトの場合は、ヒト由来の羊膜間葉系細胞であることが好ましい。
　前記羊膜間葉系細胞は、骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能がない又は低いものであることが好ましい。本明細書において、骨芽細胞への分化能がない又は低い間葉系細胞とは、公知のいずれかの石灰化誘導培地（例えば、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＯｓｔｅｏＤｉｆｆ　Ｍｅｄｉａ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ等の市販培地をいずれも使用可能である）で２１日間培養した細胞をアリザリンレッド染色した場合に、検鏡視野下の細胞群における染色細胞の割合が４０％以上とならない（最も好ましくは０％となる）間葉系細胞をいう。歯髄細胞由来のＭＳＣを注入した筋ジストロフィーモデル動物において、筋肉の症状が安定したという報告があるが（特許文献３及び非特許文献３）、本発明における羊膜間葉系細胞は、骨芽細胞への分化能がない又は低いため、歯髄細胞とは分化能が大きく異なることから、細胞特性に違いがある。
　また、本明細書において、脂肪細胞への分化能がない又は低い間葉系細胞とは、公知のいずれかの脂肪細胞分化誘導培地（例えば、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ　Ｍｅｄｉａ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ等の市販培地をいずれも使用可能である）で２１日間以上培養した細胞をオイルレッドＯ染色した場合に、検鏡視野下の細胞群における染色細胞の割合が２０％以上とならない（最も好ましくは０％となる）間葉系細胞をいう。より好ましくは、脂肪細胞への分化能がない又は低い間葉系細胞は、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標）ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ　Ｍｅｄｉａ、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔの脂肪細胞分化誘導培地のうち、２つ又は３つの培地をそれぞれ用いて培養した場合において、いずれの場合においても、２１日間以上培養した細胞をオイルレッドＯ染色した際に、検鏡視野下の細胞群における染色細胞の割合が２０％以上とならない。
［２－２］間葉系細胞を含む細胞集団の回収
　本発明の治療剤に含まれる間葉系細胞を含む細胞集団を試料から回収する方法は、羊膜もしくは羊膜を含む胎児付属物を酵素処理させる工程及び／又は培養容器に接着させることにより、間葉系細胞を含む細胞集団を取得する工程を含んでいてもよい。回収した細胞集団は、羊膜間葉系細胞が含まれていれば、他の雑多な細胞が含まれていても構わない。組織から細胞を取得する際は、組織に付着した血液などから血液細胞が混入することも起こりうる。
　前記細胞集団の初代細胞は、好ましくは羊膜を少なくともコラゲナーゼで処理して得た細胞である。羊膜は、上皮細胞層と細胞外基質層からなり、羊膜間葉系細胞は後者に含まれる。羊膜の酵素処理は、好ましくは、羊膜の細胞外基質層に含まれる間葉系細胞を遊離することができ、かつ上皮細胞層を分解しない酵素（又はその組み合わせ）による処理である。かかる酵素としては、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼを挙げることができる。金属プロテイナーゼとしては、非極性アミノ酸のＮ末端側を切断する金属プロテイナーゼであるサーモリシン及び／又はディスパーゼを挙げることができるが、特に限定されない。
　コラゲナーゼの活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、コラゲナーゼの活性濃度は、特に限定されないが、例えば、１０００ＰＵ／ｍｌ以下、９００ＰＵ／ｍｌ以下、８００ＰＵ／ｍｌ以下、７００ＰＵ／ｍｌ以下、６００ＰＵ／ｍｌ以下、５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、ＦＩＴＣ－ｃｏｌｌａｇｅｎ　１ｕｇを１分間で分解する酵素量と定義する。
　金属プロテイナーゼ（例えば、サーモリシン及び／又はディスパーゼ）の活性濃度は、好ましくは５０ＰＵ／ｍｌ以上、より好ましくは１００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは２００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは３００ＰＵ／ｍｌ以上、さらに好ましくは４００ＰＵ／ｍｌ以上である。また、金属プロテイナーゼの活性濃度は、好ましくは１０００ＰＵ／ｍｌ以下、より好ましくは９００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは８００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは７００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは６００ＰＵ／ｍｌ以下、さらに好ましくは５００ＰＵ／ｍｌ以下である。ここで、金属プロテイナーゼとしてディスパーゼを用いた態様において、ＰＵ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｕｎｉｔ）とは、ｐＨ７．５、３０℃において、乳酸カゼインから１分間に１ｕｇのチロシンに相当するアミノ酸を遊離する酵素量と定義される。上記の酵素濃度の範囲において、胎児付属物の上皮細胞層に含まれる上皮細胞の混入を防止しながら、細胞外基質層に含まれる間葉系細胞を効率よく遊離させることができる。コラゲナーゼ及び／又は金属プロテイナーゼの好ましい濃度の組み合わせは、酵素処理後の胎児付属物の顕微鏡観察や、取得した細胞のフローサイトメトリーにより決定することができる。
　生細胞を効率的に回収する観点から、コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを組み合わせて胎児付属物を同時一括に処理することが好ましい。この場合の金属プロテイナーゼとしては、サーモリシン及び／又はディスパーゼを使用することができるが、これらに限定されない。コラゲナーゼ及び金属プロテイナーゼを含有する酵素液を用いて胎児付属物を一回のみ処理することにより、間葉系細胞を簡便に取得することができる。また、同時一括に処理することにより、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクを低減することができる。
　羊膜の酵素処理は、生理食塩水やハンクス平衡塩溶液等の洗浄液を用いて洗浄した羊膜を酵素液に浸漬し、撹拌手段によって撹拌しながら処理することが好ましい。かかる撹拌手段としては、胎児付属物の細胞外基質層に含まれる間葉系細胞を効率よく遊離させる観点から、例えば、スターラー又はシェーカーを使用することができるが、これらに限定されない。撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、５ｒｐｍ以上、１０ｒｐｍ以上、２０ｒｐｍ以上、３０ｒｐｍ以上、４０ｒｐｍ以上又は５０ｒｐｍ以上である。また、撹拌速度は、特に限定されないが、スターラー又はシェーカーを用いた場合、例えば、１００ｒｐｍ以下、９０ｒｐｍ以下、８０ｒｐｍ以下、７０ｒｐｍ以下又は６０ｒｐｍ以下である。酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、６０分以上、７０分以上、８０分以上又は９０分以上である。また、酵素処理時間は、特に限定されないが、例えば、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、２時間以下、１１０分以下、１００分以下である。酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、１５℃以上、１６℃以上、１７℃以上、１８℃以上、１９℃以上、２０℃以上、２１℃以上、２２℃以上、２３℃以上、２４℃以上、２５℃以上、２６℃以上、２７℃以上、２８℃以上、２９℃以上、３０℃以上、３１℃以上、３２℃以上、３３℃以上、３４℃以上、３５℃以上又は３６℃以上である。また、酵素処理温度は、特に限定されないが、例えば、４０℃以下、３９℃以下、３８℃以下又は３７℃以下である。
　所望により、遊離した間葉系細胞を含む酵素溶液からフィルター、遠心分離や中空糸分離膜、セルソーター等の公知の方法により遊離した間葉系細胞を分離及び／又は回収することができる。好ましくは、フィルターによって遊離した間葉系細胞を含む酵素溶液を濾過する。前記酵素溶液をフィルターによって濾過する態様においては、遊離した細胞のみがフィルターを通過し、分解されなかった上皮細胞層はフィルターを通過できずにフィルター上に残るため、遊離した間葉系細胞を容易に分離及び／又は回収することができるだけでなく、細菌やウィルス等のコンタミネーションのリスクも低減することができる。フィルターとしては、特に限定されないが、例えば、メッシュフィルターを挙げることができる。メッシュフィルターのポアサイズ（メッシュの大きさ）は、特に限定されないが、例えば、４０μｍ以上、５０μｍ以上、６０μｍ以上、７０μｍ以上、８０μｍ以上、又は９０μｍ以上である。また、メッシュフィルターのポアサイズは、特に限定されないが、例えば、２００μｍ以下、１９０μｍ以下、１８０μｍ以下、１７０μｍ以下、１６０μｍ以下、１５０μｍ以下、１４０μｍ以下、１３０μｍ以下、１２０μｍ以下、１１０μｍ以下、又は１００μｍ以下である。濾過速度に関しては特に限定されないが、メッシュフィルターのポアサイズを上記の範囲とすることにより、間葉系細胞を含む酵素溶液を自然落下により濾過することができ、これにより細胞生存率の低下を防止することができる。
　メッシュフィルターの材質としては、ナイロンが好ましく用いられる。研究用として汎用されるＦａｌｃｏｎセルストレーナーなどの４０μｍ、７０μｍ、９５μｍ又は１００μｍのナイロンメッシュフィルターを含有するチューブが利用可能である。また、血液透析などで使用されている医療用メッシュクロス（ナイロン及びポリエステル）が利用できる。さらに、体外循環時に使用される動脈フィルター（ポリエステルメッシュフィルター、ポアサイズ：４０μｍ以上１２０μｍ以下）も利用可能である。他の材質、例えば、ステンレスメッシュフィルター等も用いることが可能である。
　間葉系細胞をフィルター通過させる場合、自然落下（自由落下）が好ましい。ポンプ等を用いた吸引など強制的なフィルター通過も可能であるが、細胞に損傷を与えることを避けるため、できるだけ弱い圧力とすることが望ましい。
　フィルターを通した間葉系細胞は、倍量又はそれ以上の培地又は平衡塩緩衝液で濾液を希釈した後、遠心分離により回収することができる。平衡塩緩衝液としては、ダルベッコリン酸バッファー（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等を用いることができるが、これらに限定されない。
［２－３］細胞集団の選別方法
　本発明の治療剤に使用される細胞集団は、以下に示す（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団の選別工程により調製されてもよい。
（ａ）ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、
（ｂ）ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である。
　前記特性を指標として細胞集団を選別する手段は、例えばＦＡＣＳ、セルソーター、磁気ビーズによる分取などの物理的な手段や、適切な培養条件によって指標を満たさない細胞を淘汰し、上記指標を満たすように間葉系細胞を含む細胞集団を純化させる化学的な手段を挙げることができるが、その手段は特に限定されず、培養条件等に応じて適宜選択すればよい。なお、選別工程においても、培養は、血小板溶解物を含む培地で実施することが好ましい。
　上記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別するタイミングは、特に限定されないが、例えば、培養前、培養の途中、培養後、細胞集団の回収前、細胞集団の回収後、細胞の凍結保存ストック作成前、細胞の凍結保存ストックを解凍した後、等を挙げることができる。
　上記（ａ）及び（ｂ）の特性を有する細胞集団を選別する手順について、さらに詳細に説明する。例えば、間葉系細胞を含む細胞集団を培養基材に播種し、培養基材上で増殖培養することにより、ＣＤ３２４陽性、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞がポジティブセレクションされ、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上となった細胞集団を剥離・回収する手段が挙げられる。このとき、抗ＣＤ３２４抗体や抗ＣＤ９０抗体によりコーティングした培養基材を用いて培養しても良い。間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を培養により選別するタイミングは特に限定されず、任意の継代培養において選別することができるが、初代培養において間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を選別することが好ましい。
　また、フローサイトメトリーや磁気ビーズを用いた細胞分離法により、間葉系細胞を含む細胞集団から、ＣＤ３２４陽性を呈し且つＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞を選別することもできる。
　細胞集団の選別は更に、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である細胞集団を選別して分取することが好ましく、更に、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上である、ＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、ＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、ＣＤ３４陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、のうち１以上を満足する細胞集団を選別して分取することが好ましい。選別した細胞集団を、更に上記の手段で培養してもよい。
［２－４］間葉系細胞の培養方法
　上記の方法により回収された間葉系細胞を含む細胞集団は、培養することで増殖させることができる。培養における細胞集団の播種密度は、例えば５００～１０，０００細胞／ｃｍ２が挙げられる。細胞集団を播種する際の密度はさらに好ましくは５００細胞／ｃｍ２以上、１，０００細胞／ｃｍ２以上、２，０００細胞／ｃｍ２以上、３，０００細胞／ｃｍ２以上、４，０００細胞／ｃｍ２以上、５，０００細胞／ｃｍ２以上である。細胞集団を播種する際の密度はさらに好ましくは１０，０００細胞／ｃｍ２以下、９，０００細胞／ｃｍ２以下、８，０００細胞／ｃｍ２以下、７，０００細胞／ｃｍ２以下である。
　上記培養方法は、継代工程を含んでもよいし、異なる培養条件で複数回培養を繰り返す工程を含んでもよい。１回の培養の培養期間としては、例えば４～１０日間を挙げることができ、より具体的には、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間又は１０日間を挙げることができる。
　上記の培養に用いる培地は、任意の動物細胞培養用液体培地を基礎培地とし、必要に応じて他の成分（血清、血清代替試薬、増殖因子など）を適宜添加することにより調製することができる。
　基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ（Ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）培地、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ－１２　Ｈａｍ））等の培地を使用することができるが、特に限定されない。
　他の成分としては例えば、アルブミン、血清、血清代替試薬又は増殖因子などが挙げられる。増殖因子を添加する態様においては、増殖因子を培地中で安定化させるための試薬（ヘパリンなど）を、増殖因子に加えて、さらに添加することにより調製してもよいし、増殖因子をあらかじめゲルや多糖類などで安定化しておき、その後、安定化した増殖因子を前記基礎培地に対して添加することで調製してもよい。アルブミンの場合、０．０５％より多く５％以下の濃度が好ましい。血清の場合、５％以上の濃度が好ましい。
　本発明者らは、血小板溶解物（ＰＬ）特にヒトＰＬ（ｈＰＬ）を含む培地で培養された間葉系細胞を含む細胞集団について、例えばＰＬに代えてＦＢＳを含む培地で培養された間葉系細胞と比較して、より多くの継代培養が可能となることを見出した。そのため、前記他の成分としては、ＰＬ、特にｈＰＬが含まれることが好ましい。ｈＰＬの培地中の濃度の下限としては例えば、終濃度として１重量％以上、２重量％以上、３重量％以上を挙げることができる。また、ｈＰＬの培地中の濃度の上限としては例えば、２０重量％以下、１０重量％以下、７重量％以下が好ましい。
　上記の培養に用いる培地は、一般的に市販されている無血清培地を用いても良い。例えば、ＳＴＫ１やＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社）、ＥＸＰＲＥＰ　ＭＳＣ　Ｍｅｄｉｕｍ（バイオミメティクスシンパシーズ社）、Ｃｏｒｎｉｎｇ　ｓｔｅｍｇｒo　ヒト間葉系幹細胞培地（コーニング社）などが挙げられるが、特に限定されない。
　間葉系細胞を含む細胞集団の培養は、例えば、以下のような工程にて行うことができる。まず、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。次に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような培養により取得した細胞は、１回培養した細胞である。
　上記の１回培養した細胞は、例えば、以下のようにさらに継代し、培養することができる。まず、１回培養した細胞を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて処理した後にトリプシンにて処理してプラスチック製培養容器から剥離させる。次に、得られた細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、得られた細胞ペレットを培地にて懸濁する。最後に、プラスチック製培養容器に細胞を播種し、３％以上５％以下のＣＯ２濃度、３７℃環境にて、培地を用いてコンフルエント率９５％以下となるように培養する。上記の培地としては、例えば、αＭＥＭ、Ｍ１９９、或いはこれらを基礎とする培地を挙げることができるが、これらに限定されない。上記のような継代及び培養により取得した細胞は、１回継代した細胞である。同様の継代及び培養を行うことにより、Ｎ回継代した細胞を取得することができる（Ｎは１以上の整数を示す）。継代回数Ｎの下限は、細胞を大量に製造する観点から、例えば、２回以上、好ましくは３回以上、より好ましくは４回以上、さらに好ましくは５回以上、さらに好ましくは６回以上、さらに好ましくは７回以上、さらに好ましくは８回以上、さらに好ましくは９回以上、さらに好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１１回以上、さらに好ましくは１２回以上、さらに好ましくは１３回以上、さらに好ましくは１４回以上、さらに好ましくは１５回以上、さらに好ましくは１６回以上、さらに好ましくは１７回以上、さらに好ましくは１８回以上、さらに好ましくは１９回以上、さらに好ましくは２０回以上、さらに好ましくは２５回以上である。また、継代回数Ｎの上限は、細胞の老化を抑える観点から、例えば、５０回以下、４５回以下、４０回以下、３５回以下、３０回以下であることが好ましい。
　上記の培養工程において、間葉系細胞は、生体外での培養開始後、好ましくは４０日以降まで、さらに好ましくは４５日以降まで、５０日以降まで、５５日以降まで、６０日以降まで、６５日以降まで、７０日以降まで、７５日以降まで、８０日以降まで、８５日以降まで、９０日以降まで、９５日以降まで、１００日以降まで、１０５日以降まで、又は１１０日以降まで、増殖停止することなく培養することが可能である。
　上記の培養工程において、間葉系細胞は、生体外での培養開始後、倍加回数が好ましくは１０回以上、さらに好ましくは１５回以上、２０回以上、２５回以上、３０回以上、３５回以上、４０回以上、４５回以上、又は５０回以上になるまで培養することが可能である。
　倍加回数とは、ある一定の培養期間において細胞が分裂した回数であり、[ｌｏｇ１０（培養終了時の細胞数）－ｌｏｇ１０（培養開始時の細胞数）]／ｌｏｇ１０（２）の計算式にて算出される。継代を行った場合は、継代数毎の倍加回数を上記の式で計算した後、累積することによって、総倍加回数が算出される。
［２－５］間葉系細胞を含む細胞集団の保存方法
　間葉系細胞を含む細胞集団は、凍結保存することができる。前記細胞集団を凍結保存する場合、前記細胞集団を解凍後、必要に応じて前記細胞集団を分離、回収及び／又は培養してもよい。また、前記細胞集団を解凍後、そのまま使用してもよい。
　前記細胞集団を凍結保存するための手段は、特に限定されないが、例えば、プログラムフリーザー、ディープフリーザー、液体窒素への浸漬などが挙げられる。凍結する際の温度は、好ましくは－３０℃以下、－４０℃以下、－５０℃以下、－６０℃以下、－７０℃以下、－８０℃以下、－９０℃以下、－１００℃以下、－１１０℃以下、－１２０℃以下、－１３０℃以下、－１４０℃以下、－１５０℃以下、－１６０℃以下、－１７０℃以下、－１８０℃以下、－１９０℃以下、又は－１９６℃（液体窒素温度）以下である。凍結する際の好ましい凍結速度は、例えば、１℃／分、２℃／分、３℃／分、４℃／分、５℃／分、６℃／分、７℃／分、８℃／分、９℃／分、１０℃／分、１１℃／分、１２℃／分、１３℃／分、１４℃／分又は１５℃／分である。かかる凍結手段としてプログラムフリーザーを用いた場合、例えば、１℃／分以上２℃以下の凍結速度で－５０℃以上－３０℃以下の間の温度（例えば、－４０℃）まで温度を下げ、さらに９℃／分以上１１℃／分以下（例えば、１０℃／分）の凍結速度で－１００℃以上－８０℃以下の温度（例えば、－９０℃）まで温度を下げることができる。
　上記の凍結手段により凍結する際、上記の細胞集団は、任意の保存容器に入った状態で凍結されてよい。かかる保存容器としては、例えば、クライオチューブ、クライオバイアル、凍結用バッグ、輸注バッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　凍結用保存液は、細胞の生存率を高める観点から、０質量％より多い所定濃度のアルブミンを含有することが好ましい。アルブミンの好ましい濃度は、例えば、０．５質量％以上、１質量％以上、２質量％以上、３質量％以上、４質量％以上、５質量％以上、６質量％以上、７質量％以上又は８質量％以上である。また、アルブミンの好ましい濃度は、例えば、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、２５質量％以下、２０質量％以下、１５質量％以下、１０質量％以下又は９質量％以下である。アルブミンとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、マウスアルブミン、ヒトアルブミン等を挙げることができるが、これに限定されない。
［２－６］治療剤
　本発明の筋ジストロフィー治療剤は、上記の羊膜組織に由来する間葉系細胞を含む細胞集団を有効成分として含む、筋ジストロフィーの治療のために使用される医薬組成物である。
　本発明の治療剤の治療対象となる疾患は、筋ジストロフィーであれば特に限定されず、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、及び福山型先天性筋ジストロフィーのいずれであってもよい。特にＤＭＤの治療に好適に使用できる。本発明の治療剤は、筋ジストロフィーへの罹患によって低下した、対象の筋肉機能、特に骨格筋の機能を回復させるために使用される。あるいは、筋ジストロフィー患者の筋肉機能の低下を予防するために使用される。
　また、本発明の治療剤は、筋ジストロフィー以外の患者の筋力低下を伴う症状、例えば、サルコペニア、フレイル等にも使用することができる。
　本発明の治療剤は、その治療効果が６ヶ月間以上、より好ましくは１２ヶ月間以上継続することが好ましい。
　本発明の治療剤は、他の間葉系細胞と混合して投与されるものであっても良い。
　本発明の治療剤の投与量は、患者又は被験者に投与した場合に、投与していない患者又は被験者と比較して疾患の治療対して効果を得ることができるような細胞量となる投与量である。具体的な投与量は、投与形態、投与方法、使用目的、患者又は被験者の年齢、症状、及び生着させる脂肪組織の量等によって適宜決定することができる。投与量は、特に限定されないが、例えば、一投与あたり１０５個以上、１０６個以上又は１０７個以上である。また、投与量は、特に限定されないが、例えば、一投与あたり１０１０個以下、１０９個以下又は１０８個以下である。
　本発明の治療剤の投与方法は、特に限定されないが、例えば、血管内注射（例えば、静脈注射）による全身投与、局所への直接注射、又は局所への直接移植などが挙げられる。
　本発明の治療剤は、他の疾患治療目的に注射用製剤、或いは細胞塊又はシート状構造の移植用製剤、或いは任意のゲルと混合したゲル製剤として用いることも可能である。
　本発明の治療剤は、培養直後のものを使用しても構わないが、使用直前まで凍結状態にて保存することが好ましい。投与前の凍結保存可能期間は１ヶ月以上が好ましく、６ヶ月以上がより好ましく、１年以上がより好ましい。本発明の治療剤は、ヒトの治療の際に用いられる任意の成分、もしくは細胞の凍結保存の際に用いられる任意の成分を含んでもよい。かかる成分としては、例えば、塩類、多糖類（例えば、ＨＥＳ、デキストランなど）、タンパク質（例えば、アルブミンなど）、ＤＭＳＯ、培地成分（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に含まれる成分など）などを挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、ジメチルスルホキシド、ヒドロキシエチルデンプン及びヒトアルブミンを含有したものであることが好ましく、５～１０質量％のジメチルスルホキシド、４～１０質量％のヒドロキシエチルデンプン及び５質量％以下のヒトアルブミンを含有したものであることが更に好ましい。
　本発明の治療剤は、間葉系細胞を含む細胞集団を、製薬上許容し得る媒体として使用される輸液製剤により希釈したものでもよい。本明細書における「輸液製剤（製薬上許容し得る媒体）」としては、ヒトの治療の際に用いられる溶液であれば特に限定されないが、例えば、生理食塩液、５％ブドウ糖液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、開始液（１号液）、脱水補給液（２号液）、維持輸液（３号液）、術後回復液（４号液）等を挙げることができる。
［３］筋ジストロフィー治療剤の製造方法
　本発明の筋ジストロフィー治療剤の製造方法（以下、「製造方法」とも称する）は、（ａ）羊膜組織より間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程；及び（ｂ）（ａ）の細胞集団を培養する工程を含むことを特徴とする。
［３－１］羊膜組織より間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程（工程（ａ））
　本発明の製造方法は、「羊膜組織より間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程（以下、「工程（ａ）」とも称する）を含む。本発明の製造方法において、「細胞集団を調製する工程」は、羊膜組織より間葉系細胞を含む細胞集団を回収する工程を含み、必要に応じて、前記細胞集団を選別する工程を含む。なお、工程（ａ）における諸条件は、特に矛盾のない限り、上記の「［２－２］間葉系細胞を含む細胞集団の回収方法」、及び「［２－３］細胞集団の選別方法」の項に記載の条件と同様である。
［３－２］細胞集団を培養する工程
　本発明の製造方法は、（ｂ）（ａ）の細胞集団を培養する工程（以下、「工程（ｂ）」とも称する）を含む。工程（ｂ）で使用される培地は、特に限定されないが、特に血小板溶解物を含む培地の使用が好ましい。なお、工程（ｂ）における他の諸条件は、特に矛盾のない限り、上記の「［２－４］間葉系細胞を含む細胞集団の培養方法」の項に記載の条件と同様である。
［３－３］その他の工程
　本発明の製造方法は、さらに、細胞集団の保存工程、製剤工程等を含むことができる。各工程の詳細な条件は、特に矛盾のない限り、上記の「［２－５］間葉系細胞を含む細胞集団の保存方法」「［２－６］治療剤」の項に記載の条件と同様である。
［４］筋ジストロフィーを治療する方法
　本明細書は、対象の筋ジストロフィーを治療する方法を提供する。本明細書における対象の筋ジストロフィーを治療する方法は、羊膜由来の間葉系細胞を含む細胞集団を有効成分として含む筋ジストロフィー治療剤を対象に投与する工程を含む、ことを特徴とする。
　筋ジストロフィーを治療する方法に用いる、筋ジストロフィー治療剤、及び筋ジストロフィー治療剤の製造方法の詳細な条件は、特に矛盾のない限り、「［２］筋ジストロフィー治療剤」の項及び「［３］筋ジストロフィー治療剤の製造方法」の項に記載の通りである。
＜実施例１：羊膜間葉系細胞のＦＢＳ培養＞
（工程１－１：羊膜の採取）
　インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦（ドナー♯１）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。得られた卵膜及び胎盤を生理食塩水が入った滅菌バットに収容し、卵膜の断端から羊膜を用手的に剥離した。羊膜をハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ不含有）にて洗浄し、付着した血液及び血餅を除去した。
（工程１－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収）
　上皮細胞層と間葉系細胞層とを含む羊膜を２４０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼ及び２００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、間葉系細胞を含む細胞懸濁液を回収した。
（工程１－３：間葉系細胞の培養）
　上述の「工程１－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング社製）に播種した。播種密度は、６，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。細胞播種後は、終濃度が１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。
　その後、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１５，０００～１８，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において、前記１継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度にして１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は２継代目の細胞集団である。
　その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は３継代目の細胞集団である。
　前記細胞集団について、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において前記３継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むαＭＥＭ（Ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ）にてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は４継代目の細胞集団である。
　その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が１０％のＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートしたところ、３割程度の細胞集団が剥離されずにＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に接着したまま培養容器に残存した。そこで、追加で５分間（合計８分間）インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させ、残存した細胞集団についても回収した。ここで取得した細胞集団は５継代目の細胞集団である。その後、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移して－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
（工程１－４：間葉系細胞の表面抗原解析）
　上記の培養方法で培養した５継代目の細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４の陽性率は７０％未満（具体的には３３％）、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的には９３％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的にはＣＤ７３：９９％、ＣＤ９０：９３％、ＣＤ１６６：９７％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的にはＣＤ４５：１００％、ＣＤ３２６：１００％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞集団は、間葉系細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、実施例１の５継代目の細胞集団は、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上という条件は満たすものの、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であるという条件は満たさない細胞集団であることが分かった。
　なお、本測定では、アイソタイプコントロール用抗体として、ＲＥＡ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓ）ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ２９３、型番：１３０－１１３－４３４）を使用し、ＣＤ３２４抗原に対する抗体として、ＣＤ３２４－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ８１１、型番：１３０－１１１－８４０）を、ＣＤ７３抗原に対する抗体として、ＣＤ７３－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ８０４、型番：１３０－１１１－９０９）を、ＣＤ９０抗原に対する抗体として、ＣＤ９０－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ８９７、型番：１３０－１１４－８６１）を、ＣＤ１０５抗原に対する抗体として、ＣＤ１０５－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ７９４、型番：１３０－１１２－１６６）を、ＣＤ１６６抗原に対する抗体として、ＣＤ１６６－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ４４２、型番：１３０－１０６－５７６）を、ＣＤ４５抗原に対する抗体として、ＣＤ４５－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ７４７、型番：１３０－１１０－６３３）を、ＣＤ３２６抗原に対する抗体として、ＣＤ３２６－ＡＰＣ、Ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社、クローン：ＲＥＡ７６４、型番：１３０－１１１－０００）を使用した。表面抗原解析は、メルク社のＧｕａｖａ　ｅａｓｙＣｙｔｅを用い、測定条件は解析細胞数：３０，０００ｃｅｌｌｓ、流速設定：３５．４μＬ／ｍｉｎ）とした。また、各抗原に対する陽性細胞の比率（陽性率）は、以下の手順で算出した。
（１）アイソタイプコントロールの測定結果を、縦軸にＳＳＣ、横軸にＦＳＣとしたドットプロットで展開した。
（２）間葉系細胞に該当する細胞集団のゲートを設定し、その細胞集団に対して、縦軸にカウント数、横軸をＡＰＣの傾向強度としたヒストグラムで展開した。
（３）（２）のヒストグラムにおいて、アイソタイプコントロール用抗体で測定した総細胞のうち、より蛍光強度が強い細胞集団が０．５％以下となる全ての領域（ゲート）を選択した。
（４）表面抗原マーカーに対応する抗体で測定した総細胞のうち、（２）で選択したゲート内に含まれる細胞の割合を算出した。
（工程１－５：間葉系細胞の長期継代培養）
上述の「工程１－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を接着細胞培養シャーレ９０（住友ベークライト社製）に９，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。細胞播種後は、終濃度が１０％のＦＢＳを含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、接着細胞培養シャーレ９０　１枚あたり２ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で１０インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させた。その後、５００～９，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で継代培養を行い、細胞増殖が停止するまで培養した。増殖曲線を図１に示す。その結果、間葉系幹細胞は約４２回まで分裂することが可能であった。
＜実施例２：羊膜間葉系細胞のｈＰＬ培養Ｉ＞
（工程２－１：羊膜の採取）
　実施例１と同じドナー（ドナー♯１）から、実施例１と同様の手法にて羊膜を取得した。
（工程２－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収）
　実施例１と同じ手法にて間葉系細胞を含む細胞集団を取得した。
（工程２－３：間葉系細胞の培養）
　上述の「工程２－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング製）に播種した。播種密度は、６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度とした。細胞播種後は、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。
　その後、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１５，０００～１８，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において、前記１継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は２継代目の細胞集団である。
　次いで、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は３継代目の細胞集団である。
　その後、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１溶液（登録商標）（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度において、前記３継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。その後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は４継代目の細胞集団である。
　次いで、前記細胞集団の１／５量の細胞集団を先の培養と同じスケールのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種することにより、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにて継代培養を行った。培地交換は２～４日に１回の頻度で実施した。サブコンフルエントに達した時点でＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は５継代目の細胞集団である。前記細胞集団について、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようＲＰＭＩ１６４０を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
（工程２－４：間葉系細胞の表面抗原解析）
　上記の培養方法で培養した５継代目の間葉系細胞集団に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＭＳＣマーカーと知られているＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的にはＣＤ３２４：９１％、ＣＤ１０５：９５％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的にはＣＤ７３：１００％、ＣＤ９０：１００％、ＣＤ１６６：９９％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的にはＣＤ４５：１００％、ＣＤ３２６：９９％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した細胞は、間葉系細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、実施例１に記載の細胞集団は、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である細胞集団であることが確認された。
　なお、本測定の方法、試薬は実施例１と同じである。
（工程２－５：間葉系細胞の長期継代培養）
上述の「工程２－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（コーニング製）に１，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種した。細胞播種後は、終濃度が５％のｈＰＬを含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培養後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で１０インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させた。その後、１，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で継代培養を行い、細胞増殖が停止するまで培養した。増殖曲線を図２に示す。その結果、間葉系幹細胞は約８４回まで分裂することが可能であった。
＜実施例３：羊膜間葉系細胞のｈＰＬ培養ＩＩ＞
　以下に示す実施例３では、実施例１、実施例２と比較してドナーや酵素処理条件、培養条件が異なる間葉系細胞集団を取得した。実施例１、実施例２とは異なる、インフォームドコンセントを得た待機的帝王切開症例の妊婦３名（ドナー＃２～＃４）から、胎児付属物である卵膜及び胎盤を無菌的に採取した。
（工程３－１：羊膜の採取）
　実施例１及び実施例２と同様の手法にて羊膜を取得した。
（工程３－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収）
　上皮細胞層と間葉系細胞層とを含む羊膜を４８０ＰＵ／ｍＬコラゲナーゼ及び４００ＰＵ／ｍＬディスパーゼＩを含有するハンクス平衡塩溶液（Ｃａ・Ｍｇ含有）に浸し、３７℃にて９０分間、５０ｒｐｍの条件にて振盪攪拌することにより羊膜を酵素処理した。酵素処理後の溶液を目開き９５μｍのナイロンメッシュでろ過することにより羊膜の未消化物を取り除き、間葉系細胞を含む細胞懸濁液を回収した。
（工程３－３：間葉系細胞の培養）
　上述の「工程３－２：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、間葉系細胞を含む細胞集団を培養容器のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種した。播種密度は、１，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２とした。細胞播種後は、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで接着培養した。培地交換は３～５日に１回の頻度で実施した。培養後、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は０継代目の細胞集団である。その後、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度で１継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで５日間接着培養した。
　その後、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は１継代目の細胞集団である。次いで、細胞濃度が２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のＣＰ－１（登録商標）溶液（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移した後、－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で１日凍結保存した。その後、前記凍結保存していた細胞集団を解凍し、約１，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度で２継代目の細胞集団をＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）に播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで５日間接着培養した。
　その後、ＣｅｌｌＳｔａｃｋ（登録商標）１スタックあたり１５ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で３分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させることができた。ここで取得した細胞集団は２継代目の細胞集団である。前記細胞集団について、細胞濃度が４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう生理食塩液を添加した。これに等量のＣＰ－１溶液（登録商標）（ＣＰ－１（登録商標）：２５％ヒト血清アルブミン＝３４：１６の比で混合した溶液）を加え、１ｍＬずつクライオバイアルに移して－８０℃まで緩慢凍結し、その後液体窒素下で凍結保存した。
（工程３－４：間葉系細胞の表面抗原解析）
　工程３－３に記載の培養方法で培養した２継代目の細胞集団（＃２～＃４）に関し、フローサイトメーターを用いて各種表面抗原（ＣＤ３２４の陽性率、ＣＤ７３の陽性率、ＣＤ９０の陽性率、ＣＤ１０５の陽性率、ＣＤ１６６の陽性率、ＣＤ４５の陰性率、ＣＤ３２６の陰性率）を解析した。その結果、ＣＤ３２４、ＣＤ１０５の陽性率は７０％以上（具体的には＃２、＃３、＃４の順にそれぞれ、ＣＤ３２４：９０％、８７％、８７％、ＣＤ１０５：８９％、９１％、７４％）、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１６６の陽性率はいずれも９０％以上であった（具体的には＃２、＃３、＃４の順にそれぞれ、ＣＤ７３：１００％、９９％、１００％、ＣＤ９０：１００％、９９％、１００％、ＣＤ１６６：９９％、９７％、９８％）。ＣＤ４５、ＣＤ３２６の陰性率はいずれも９５％以上であった（具体的には＃２、＃３、＃４の順にそれぞれ、ＣＤ４５：９９％、１００％、１００％、ＣＤ３２６：９９％、１００％、１００％）。以上の結果から、上記の培養方法で培養した＃２、＃３、＃４の細胞集団は、全てＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞を含む細胞集団であることが分かった。また、実施例３に記載の細胞集団は、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である細胞集団であることが確認された。なお、本測定の方法、試薬は実施例１と同じである。
＜実施例４：ｍｄｘマウス（ＤＭＤモデルマウス）に対する羊膜間葉系細胞の有効性評価＞
（工程４－１：ｍｄｘマウスへの羊膜間葉系細胞の投与）
　実施例３の「工程３－３：羊膜の酵素処理及び間葉系細胞の回収」で得られた、凍結保存した２継代目の羊膜間葉系細胞（羊膜間葉系幹細胞（ｈＡＭＳＣ）を含む）の細胞集団（＃３）を解凍し、約６，０００ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２の密度で２２５ｃｍ２組織培養用フラスコに播種し、終濃度が５％のヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）を含むαＭＥＭにてサブコンフルエントになるまで５日間接着培養した。その後、フラスコあたり２．５ｍＬの０.２５％トリプシン（ＥＤＴＡ含有）を添加し、室温で１分間インキュベートし、前記細胞集団を完全に剥離させた。細胞濾過フィルター（６０μｍセルストレイナー）を用いて均一な細胞懸濁液を取得後、ＰＢＳで再懸濁し、８×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬに調製した。
　ｍｄｘ/Ｃ５７ＢＬ/Ｂ１０マウス(４－５週齢雄、体重１０ｇ以上、日本クレア株式会社より入手)に対して、上記で調製した細胞懸濁液を週１回、４週間もしくは６週間、尾静脈内投与した。
（工程４－２：握力評価）
　斎藤式マウス用握力測定装置を用い、羊膜間葉系細胞を投与したｍｄｘマウス（１歳齢）の前肢握力を測定した。本試験では、対照として野生型マウス及び無処置のｍｄｘマウス（ともに１歳齢）についても測定した。結果を図３に示す。羊膜間葉系細胞を４回もしくは６回投与したｍｄｘマウスでは、通常のｍｄｘマウスと比較し、握力低下が改善した。
（工程４－３：循環機能評価）
　超音波画像診断装置（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＶｉｖｉｄＳ６０ＲＮ、１２Ｈｚプローブ）を用い、羊膜間葉系細胞を投与したｍｄｘマウス（１歳齢）の左心室機能を評価した。本評価では、２％イソフルラン吸引麻酔下において、左心室内の拡張期と収縮期の直径を測って左室容積を推定し、左室内径短縮率（ＬＶＦＳ（％））を算出した。本試験では、対照として野生型マウス及び無処置のｍｄｘマウス（ともに１歳齢）についても測定した。結果を図４に示す。羊膜間葉系細胞を４回投与したｍｄｘマウスでは、通常のｍｄｘマウスと比較し、ＬＶＦＳが有意に改善した。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (16)

  1. 　羊膜組織に由来する間葉系細胞を含む細胞集団を有効成分として含有する、筋ジストロフィー治療剤。
  2. 　前記細胞集団が、
    　前記細胞集団における、ＣＤ３２４陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上であり、かつ、ＣＤ９０陽性を呈する間葉系細胞の比率が９０％以上である、請求項１に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  3. 　前記細胞集団において、ＣＤ３２６陽性を呈する細胞の比率が１０％以下である、請求項１又は２に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  4. 　前記細胞集団において、ＣＤ７３陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ１６６陽性を呈する間葉系細胞の比率が８０％以上であり、ＣＤ４５陽性を呈する細胞の比率が１０％以下であり、かつＣＤ１０５陽性を呈する間葉系細胞の比率が７０％以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  5. 　前記細胞集団が、投与される対象とは異なる生体から得られたものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  6. 　前記細胞集団が、投与される対象と同種の生体から得られたものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  7. 　投与される対象がヒトである、請求項１～６のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  8. 　前記細胞集団がヒト由来である、請求項１～７のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  9. 　前記間葉系細胞が、骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能がない又は低いものである、請求項１～８のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  10. 　前記間葉系細胞が、抗炎症作用を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  11. 　前記細胞集団が、血小板溶解物を含む培地を用いて培養された細胞の集団である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  12. 　静脈内に投与される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  13. 　投与後の治療効果が６ヶ月以上持続する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  14. 　デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の筋ジストロフィー治療剤。
  15. 　（ａ）羊膜組織より間葉系細胞を含む細胞集団を調製する工程；及び
    　（ｂ）（ａ）の細胞集団を培養する工程、
    を含む、筋ジストロフィー治療剤の製造方法。
  16. 　前記（ｂ）の培養に、血小板溶解物を含む培地が使用される、請求項１５に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2020251020A1 (ja) * 2019-06-14 2020-12-17 株式会社カネカ 間葉系細胞を含む細胞集団、それを含む医薬組成物、及び、その製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020251020A1 (ja) * 2019-06-14 2020-12-17 株式会社カネカ 間葉系細胞を含む細胞集団、それを含む医薬組成物、及び、その製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAWAMICHI YAYOI, CHANG-HAO CUI, MASASHI TOYODA, HATSUNE MAKINO, AKANE HORIE, YORIKO TAKAHASHI, KENJI MATSUMOTO, HIROHISA SAITO, HI: "Cells of Extraembryonic Mesodermal Origin Confer Human Dystrophin in the Mdx Model of Duchenne Muscular Dystrophy", JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY, vol. 223, no. 3, 30 June 2010 (2010-06-30), pages 695 - 702, XP055974286, DOI: 10.1002/jcp.22076 *
UMEZAWA, AKIHIRO: "S3-4 Treatment for disease model using amnion-derived mesenchymal stem cells", LECTURE PROGRAMS AND ABSTRACTS OF THE 119TH ANNUAL MEETING OF THE JAPANESE SOCIETY OF ANATOMISTS, vol. 119, 1 January 2014 (2014-01-01), pages 74, XP009540982 *

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