KR102314825B1 - 세포 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치료적 세포 또는 조직 치료를 필요로 하는 포유동물에 대한 치료적 적용에 적절한 세포 및 조직 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 치료용 세포를 배양하는 방법으로서, (i) 제1 혈청, 혈청 대체물, 및/또는 혈청 분획을 포함하는 제1 세포 배양 배지 중에 세포 시료를 배양하는 단계 및 (ii) 치료에 사용하기 위한 세포를 수확하기 전에 제2 혈청, 혈청 대체물 및/또는 혈청 분획을 포함하는 제2 세포 배양 배지 중에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세포 및 조직 치료를 위한 신규하고 개선된 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 치료적 세포 또는 조직 치료를 필요로 하는 포유동물에 대한 치료적 적용에 적절한 세포 및 조직 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
세포 치료는 일부 종류의 질환, 상해, 악성 종양 및 질병에 대한 점점 중요해지는 치료이다. 세포 치료는 환자에게 세포를 주입(infusion), 적용 또는 이식하는 것을 포함하는데, 상기 주입, 적용 또는 이식된 세포는 상기 환자 외의 공여자로부터(동종이계(allogeneic)) 또는 상기 환자 자신으로부터(자기유래(autologous)) 유래된다. 중간엽간질세포(Mesenchymal stromal cell; MSC)는 치료적 사용에 대해 가능성을 갖는 하나의 세포 타입이다.
이들의 가능성에도 불구하고, MSC와 함께하여 수득된 임상적 결과는 일반적으로 좋지 못하였다. 이러한 좋지 못한 임상적 결과의 주요한 이유는 상기 MSC가 생산되는 방법 때문인 것 같다. 예를 들어, 대부분의 MSC는 태아 소 혈청 중에 배양된 다음 상기 수득-후의 세포를 단순히 세척함으로써 제거된다. 그러나, 이 단순한 세척 단계는 상기 세포 표면 또는 후에 상기 세포 표면 외측으로 통합될 수 있는 상기 세포 내 위치된 것들에 부착된 소 단백질을 제거하지 못할 수 있다. 그리하여 이식 상에 이러한 세포는 혈액 중에 존재하는 소 단백질에 대한 항체를 갖는 환자에게는 외래물질로 나타나고(호주 인구의 약 40 내지 50%의 발생정도), 상기 환자의 면역계에 의해서 인식되어 그들의 치료적 이익을 전달하기 전에 파괴된다.
그러므로 세포 치료를 위한 세포를 생산하는 방법에 대한 지속적인 요구가 있다.
본 발명은 세포가 상기 현재 생산 방법이 갖는 문제를 개선하고 해결하는 그러한 방법으로 생산되어 증진된 임상적 결과로 유도함을 발견하였다.
따라서, 첫번째 양상은, 본 발명은 (i) 충분한 시간 동안 제1 혈청, 제1 혈청 대체물 및/또는 제1 혈청 분획을 포함하는 제1 배양 배지 중에 세포 시료를 배양하여 상기 세포가 의도된 팽창 정도를 달성할 수 있게 하는 단계; 및
(ii) 치료에 사용하기 위한 세포를 수확하기 전에 상기 제1 세포 배양 배지를 제2 혈청, 제2 혈청 대체물 및/또는 제2 혈청 분획을 포함하는 제2 세포 배양 배지로 교체하고 상기 세포를 추가의 시간 기간 동안 배양하는 단계를 포함하는 치료에 사용하기 위한 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
두번째 양상에서, 본 발명은 (i) 열 불활성화 태아 소 혈청 (heat inactivated fetal calf serum; HIFCS)로 보충된 DMEM을 포함하는 제1 세포 배양 배지 중에 중간엽간질세포를 상기 세포가 약 70 내지 85%의 콘플루언스(confluence)에 도달할 때까지 배양하는 단계; 및
(ii) 치료에 사용하기 위한 세포를 수확하기 약 24시간 전에 상기 제1 세포 배양 배지를 제거하고 무-페놀 레드 DMEM 및 약 2% 인간 혈청 알부민을 포함하는 제2 세포 배양 배지로 교체한 다음 상기 세포를 추가의 약 24시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 세포 치료에 사용하기 위한 중간엽간질세포를 배양하는 방법을 제공한다.
세번째 양상에서, 본 발명은 (i) 열 불활성화 태아 소 혈청 (HIFCS)로 보충된 DMEM을 포함하는 제1 세포 배양 배지 중에 중간엽간질세포의 배양용기 cm2 당 1.0 x 103 세포 내지 배양용기 cm2 당 1.0 x 1010 세포를 상기 세포가 약 70 내지 85% 콘플루언스에 도달할 때까지 배양하는 단계; 및
(ii) 치료에 사용하기 위한 세포를 수확하기 약 24시간 전에 상기 제1 세포 배양 배지를 제거하고 무-페놀 레드 DMEM 및 약 2% 인간 혈청 알부민을 포함하는 제2 세포 배양 배지로 교체한 다음 상기 세포를 약 24시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 세포 치료에 사용하기 위한 인간 중간엽간질세포를 배양하는 방법을 제공한다.
네번째 양상에서, 본 발명은 (i) 건강한 공여자로부터의 세포 시료를 제공하는 단계;
(ii) 제1 혈청, 제1 혈청 대체물 및/또는 제1 혈청 분획을 포함하는 제1 세포 배양 배지 중에 상기 세포 시료를 상기 세포가 의도된 팽창 정도를 달성할 수 있게 충분한 시간 동안 배양하는 단계; 및
(ii) 치료에 사용하기 위한 세포를 수확하기 전에 상기 제1 세포 배양 배지를 제2 혈청, 제2 혈청 대체물 및/또는 제2 혈청 분획을 포함하는 제2 배양 배지로 교체하고 상기 세포를 추가의 시간 기간 동안 배양하는 단계; 및
(iv) 상기 세포를 수확하는 단계를 포함하는 환자에서의 동종이계 세포 치료를 위한 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법의 단계 (i)이 상기 세포 시료를 상기 세포를 담고 있는 상기 배양용기가 수확될 콘플루언스 정도로 도달할 때까지 대사시키고, 세포 수에 있어서 팽창시키고 또는 증식시키기는 것을 요구한다는 것을 당업계에 숙련된 자는 인식할 것이다.
일부 구체예에서, 상기 제1 세포 배양 배지 중에 바람직한 혈청은 태아 소 혈청 (FCS) 또는 열 불활성화 태아 소 혈청 (HIFCS)이다. 그러나, 영양소, 호르몬 및 단백질의 다른 원천이 FCS의 주요 구성 성분인 혈청 알부민을 포함하는 FCS 대신 사용될 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 또한 혈소판 용해물 및 Ultroser™ G 혈청 대체물(Pall Corporation, NY, USA); 이스코브's MDM 중에 인간 혈청 알부민, 인슐린 및 트란스페린을 함유하는 HIT™ 혈청 대체물 MDM (Stemcell Technologies, BC, Canada); 약 84%의 인간 혈청 알부민, 16% 알파 및 베타 글로불린 및 < 1% 감마 글로불린 (Irvine Scientific, CA, USA)을 함유하는 총 단백질 6%로 구성된 혈청 대체 보충물™ (SSS™) 및 Quinns Advantage® 혈청 단백질 대체물 (CooperSurgical Inc, CT, USA)과 같은 상업적 상품과 같은 다른 혈청 대체물. 이러한 혈청 대체물 모두는 알맞은 삼투 포텐셜, 성장 인자 및 영양소/단백질을 제공하여 상기 세포 시료가 상기 배양용기에 부착하거나 세포 수에 있어서 팽창할 수 있게 한다.
일부 구체예에서, 상기 제1 세포 배양 배지는 혈청 알부민과 같은 혈청 분획을 포함한다.
상기 제2 배지는 상기 배양될 세포와 동일한 종 기원을 갖는 제2 혈청 또는 제2 혈청 분획을 포함한다. 예를 들어, 인간의 세포가 배양다면 그때는 상기 제2 배지는 인간 혈청, 인간 혈청 대체물 또는 인간 혈청 알부민을 포함할 것이다. 만약 말의 세포가 배양된다면 그때는 상기 제2 배지는 말 혈청, 말 혈청 대체물 또는 말 혈청 알부민을 포함하게 될 것이다. 유사하게, 개의 세포가 배양된다면 그때는 상기 제2 배지는 개 혈청 등을 포함하게 될 것이다.
상기 세포 시료가 동종이계 및 자가유래의 간세포, 동종이계 및 자가유래의 조혈세포, 동종이계 및 자가유래의 섬유아세포, 동종이계 및 자가유래의 지방세포, 동종이계 및 자가유래의 중간엽세포, 동종이계 및 자가유래의 심장세포, 동종이계 및 자가유래의 내피세포, 동종이계 및 자가유래의 상피세포, 동종이계 및 자가유래의 신경세포, 동종이계 및 자가유래의 교세포, 동종이계 및 자가유래의 내분비세포, 또는 이들의 전구체를 포함하는 세포 치료에 사용하기 위해 사용될 수 있는 임의의 세포를 포함할 수 있다는 것을 당업계에 숙련된 자는 인식할 수 있을 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 세포는 중간엽전구체세포(Mesenchymal progenitor cell), 특히 중간엽간질세포(MSC)이다.
본 발명의 상기 방법 및 조성물이 임의의 포유동물에서 세포 치료를 위해 이용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 세포 시료는 인간, 카멜린, 말, 개 및 고양이 또는 임의의 다른 상업적으로 또는 경제적으로 가치있는 포유동물로부터 단리될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이 제1 혈청, 제1 혈청 대체물 및/또는 제1 혈청 분획을 함유하면서, 제1 배지가 또한 기본 배지를 포함할 수 있을 것이라는 것을 당업계에 숙련된 자는 인식할 수 있을 것이다. 당업계에 알려진 많은 기본배지가 있으나, 가장 바람직한 기본되는 배지는 DMEM (고포도당 또는 저포도당), 이글스 기본 배지 (MEM), 햄스 F10 배지 (F10), 햄스 F-12 배지 (F12), 이스코브스 변경된 둘베코 배지, M-199, 중간엽줄기세포 성장 배지 (MSCGM), 리보비츠 L-15 배지, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, 어드밴스드 DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), 및 CELL-GRO FREE 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 제1 기본 배지는 DMEM이다.
바람직하게는, 상기 제1 기본 배지는 열 불활성화 태아 소 혈청 (HIFCS)으로 보충된다.
상기 세포 또는 조직 배양 방법은 당업계에 잘 알려진 표준적인 방법이다. 이것은 예를 들어, 약 37℃의 온도 범위, 예를 들어 10% CO2의 CO2 농도 등을 포함한다. 또한 상기 세포 시료 중에 세포의 양은 대략 표준적인 세포 배양 방법에서 사용되는 정도일 것이다. 예를 들어, 일부 구체예에서 상기 세포 시료 중에 상기 세포 수는 배양용기의 cm2 당 1.0 x 103 세포 내지 배양용기의 cm2 당 1.0 x 1010 세포일 것이다. 이 세포 수는 대략 조직 배양 플라스크의 80 cm2 당 12 x 106 또는 조직 배양 플라스크의 175 cm2 당 28 x 106과 동일할 것이다.
일부 구체예에서, 상기 바람직한 방법의 단계 (i) 중에 상기 세포 시료는 상기 세포가 대략 85% 콘플루언트가 될 때까지 배양될 수 있다. 이는 상기 배지를 신선하게 유지하기 위해 상기 제1 기본 배지의 정기적인 교환(change)을 포함할 수 있다는 것을 당업계에 숙련된 사람은 인식할 수 있을 것이다. 이 단계에서 상기 세포는 예를 들어, 본 발명 방법의 단계 (ii)로 더 가공하거나 또는 계대(passaged)된다.
상기 세포가 세포 치료에 사용하기 위해 수확된다면 상기 제1 배양 배지를 제거하고 제2 배양 배지로 교체한다. 단계 (ii)는 상기 세포가 세포 치료에 사용하기 위해 수확되기 적어도 12시간 전에 수행된다. 바람직하게는, 단계 (ii)는 상기 세포가 세포 치료에 사용되기 위해 수확되기 적어도 18시간 전에 수행된다. 보다 바람직하게는, 단계 (ii)는 상기 세포가 세포 치료에 사용되기 위해 수확되기 적어도 24시간 전에 수행된다.
상기 세포가 노년기(senescent)에 접어들기 시작하기 때문에 상기 세포를 상기 제2 배양 배지와 약 48시간 이상 접촉한 채로 잔류하도록 허용되지 않을 수 있다는 것을 또한 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 일부 구체예에서, 단계 (ii)는 상기 세포가 세포 치료에 사용하기 위해 수확되기 약 24시간 내지 약 36 시간 전에 수행될 수 있다.
일부 양상에서 단계 (ii) 중에 상기 세포는 상기 제2 배양 배지의 존재 하에 12, 13, 14, 15, 16, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 및 48 시간 동안 배양될 수 있을 것이다.
단계 (ii) 중에 상기 제2 배지는 전형적으로 DMEM (고포도당 또는 저포도당), 이글스 기본 배지 (MEM), 햄스 F-10 배지 (F10), 햄스 F-12 배지 (F12), 이스코브스 변경된 둘베코 배지, M-199, 중간엽줄기세포 성장 배지 (MSCGM), 리보비츠 L-15 배지, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, 어드밴스드 DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), 및 CELL-GRO FREE 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 기본 배지를 포함한다. 바람직하게는, 상기 제2 기본 배지는 무-페놀 레드 DMEM이다.
일부 구체예에서, 상기 제2 기본 배지는 인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민으로 보충된다. 상기 제2 배지 중에 사용되는 상기 인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민의 양은 제한되지 않는데, 즉 혈청의 임의의 양이 사용될 수 있어, 일부 구체예에서 상기 인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민의 양은 약 2%이다.
본 발명의 상기 방법이 동종이계 또는 자가유래적 환경(setting)에서 세포 상에 사용될 수 있다는 것을 당업계에 숙련된 자는 인식할 수 있을 것이다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 "공여자"는 매치하는 공여자이고, 반면 다른 구체예에서 상기 "공여자"는 매치되지 않을 수 있다.
다섯번째 양상에서, 본 발명은 1 내지 4 중 하나의 양상에 따른 상기 방법에 의하여 생산된 세포를 포함하는 세포 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 >90% CD73, >90% CD90, >90% CD105 발현 및 <5% CD34, <5% CD45, <5% CD14 발현을 포함하는 표현형을 갖는다. 추가적인 구체예에서, 상기 세포는 CD54, CD61, CD89, CD140A 및 CD201의 발현을 포함하는 표현형을 갖는다. 상기 CD54, CD61, CD89, CD140A 및 CD201의 발현은 여기에 기재된 본 발명의 방법과 다른 방법으로 배양된 인간 중간엽간질세포에 대하여 상대적으로 증가된다.
상기 세포가 다양한 운반 장치로 제공될 수 있다는 것을 당업계에 숙련된 자는 인식할 수 있을 것이다. 예를 들어, 일부 구체예에서 상기 세포는 시린지에 현탁되고, 반면 다른 구체예에서 상기 세포는 조립식 용기(collapsible container)에 현탁된다. 바람직하게는, 상기 세포는 환자에 대해 치료적 투여에 적절한 매체에 현탁된다.
여섯번째 양상에서, 본 발명은 (i) 건강한 공여자로부터의 세포 시료를 제공하는 단계;
(ii) 제1 혈청, 제1 혈청 대체물 및/또는 제1 혈청 분획을 포함하는 제1 세포 배양 배지 중에 상기 세포 시료를 상기 세포가 의도된 팽창 정도를 달성할 수 있게 충분한 시간 동안 배양하는 단계; 및
(ii) 치료에 사용하기 위한 세포를 수확하기 전에 상기 제1 세포 배양 배지를 제2 혈청, 제2 혈청 대체물 및/또는 제2 혈청 분획을 포함하는 제2 배양 배지로 교체하고 상기 세포를 추가의 시간 기간 동안 배양하는 단계;
(iv) 상기 세포를 수확하는 단계; 및
(v) 이들을 필요로 하는 환자에게 상기 세포를 이식하거나 또는 투여하는 단계를 포함하는 세포 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 팽창된 세포가 생산되면 그들은 추후 사용을 위해 저장될 수 있다는 것을 당업계의 숙련된 자는 인식할 수 있을 것이다. 게다가, 상기 팽창된 세포는 세포 시료 및 배양배지와 같은 관련된 시약 및 배양 및 사용을 위한 지침서를 포함하는 키트의 형태로 제공될 수 있다.
따라서, 일곱번째 양상에서, 본 개시는 상기 제1 양상의 방법에 의해 생산된 세포의 팽창된 집단을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 상기 세포는 단층 또는 3차원적 배양으로 인큐베이션될 수 있다. 3차원적 배양물을 수득하기 위해 적절한 스캐폴드가 사용될 수 있다는 것을 당업계에 숙련된 자가 인식할 수 있을 것이다. 적절한 스캐폴드는 Vitrogen™, 겔화하여 세포-채워진(populated) 기질을 형성하는 콜라겐-함유 용액, 및 Hwang (US 특허출원번호 20040267362), Kladaki 등 (US 특허출원번호 20050177249) 및 Binette 등 (US 특허출원번호 20040078077) 연결-조직 스캐폴드를 포함한다.
본 발명의 상기 세포는 또한 의학적 장치의 임의의 광범위한 다양한 접촉하는 표면에 적용될 수 있다. 접촉하는 표면은 혈액 또는 특히 인간을 포함하는 동물의 다른 조직 또는 체액과 접촉하도록 의도된 표면을 포함한다. 적절한 접촉하는 표면은 혈액 또는 다른 조직과 접촉하도록 의도된 의학적 장치의 하나 이상의 표면을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 의학적 장치는 동맥류 코일(aneurysm coil), 인공혈관, 인공심장, 인공판막, 인공신장, 인공힘줄 및 인대, 혈액백, 혈액 산소발생기, 뼈 및 심혈관 교체물, 뼈 보철물(bone prosthese), 뼈 밀납(wax), 심혈관 접목(graft), 카트리지 교체 장치, 카테터, 미크로비드, 신경-성장 가이드, 안과적 임플란트, 정형외과적 임플란트, 보철, 션트(shunt), 스텐트, 상처 커버, 상처 치료 장치 및 당업계에 알려진 다른 의학적 장치를 포함한다.
상기 접촉하는 표면은 혈관내적 위치, 내강내적(intralumenal) 위치, 고체 조직 내 위치 등을 포함하는 표적 위치에 이식될 수 있는 메쉬, 코일, 와이어, 팽창가능한 벌룬, 또는 임의의 다른 구조물을 포함할 수 있다. 상기 이식가능한 장치는 영구적 또는 일시적 이식을 위해 의도될 수 있다. 그러한 장치는 혈관내 및 다른 의학적 카테터에 의해서 또는 그로 통합되어 운반될 수 있다.
따라서, 여덟번째 양상에서, 본 발명은 상기 첫번째 양상의 방법에 의하여 생산된 세포의 팽창된 집단을 포함하는 의학적 장치를 제공한다.
아홉번째 양상에서, 본 발명은 세포 치료에 유용한 약제의 제조에서 인간 중간엽간질세포의 사용을 제공하고, 상기 인간 중간엽간질세포는
(i) 열 불활성화 태아 소 혈청 (HIFCS)으로 보충된 DMEM을 포함하는 제1 세포 배양 배지 중에 중간엽간질세포를 상기 세포가 약 70 내지 85%의 콘플루언스에 도달할 때까지 배양하는 단계;
(ii) 치료에 사용하기 위한 세포를 수확하기 약 24시간 전에 상기 제1 세포 배양 배지를 제거하고 무-페놀 레드 DMEM 및 약 2% 인간 혈청 알부민을 포함하는 제2 세포 배양 배지로 교체한 다음 상기 세포를 추가의 약 24시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 치료에 사용하기 위한 중간엽간질세포를 배양하는 단계;
(iii) 약학적으로 허용가능한 배지, 희석제 또는 담체 중에 상기 중간엽간질세포를 배양하는 단계에 의하여 생산되는데, 이는 환자에게 치료적으로 투여하기에 적절하다.
열번째 양상에서, 본 발명은 인간 치료에 사용하기 위한 인간 중간엽간질세포를 인 비트로로 배양하기 위한 세포 배양 배지를 제공하는데, 상기 배양 배지는 인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민을 인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민의 존재 하에 배양되지 않은 인간 중간엽간질세포에 비하여 상기 인간 중간엽간질 세포 표면 상에 하나 이상의 부착 마커의 발현 증가를 허용하기에 충분한 양으로 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 발현을 증가시키는 세포 표면 마커는 CD54, CD61, CD89, CD140A, 및 CD201로 이루어진 군으로부터 선택된다.
열한번째 양상에서 본 발명은 인 비트로로 배양된 인간 중간엽간질 세포를 제공하는데, 상기 세포는 이것의 세포 표면 상에 CD54, CD61, CD89, CD140A, 및 CD201로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현하고, 상기 마커는 자연적으로 발생하는 중간엽간질세포 보다 우선적으로 발현된다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 이 발명은 특별하게 예시된 생산 방법에 제한되지 않고 물론 다양할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한 여기서 사용된 전문 용어는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위한 목적일 뿐이고, 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것으로 제한하는 것을 의도하지 않음을 이해할 것이다.
상기 또는 하기(infra)든 여기서 인용된 모든 발행물, 특허 및 특허 출원은 그들 전체로 참조에 의하여 여기에 통합된다. 그러나, 여기서 언급된 발행물은 상기 발행물에서 보고되고 본 발명과 관련하여 이용될 수 있는 프로토콜 및 시약을 서술하고 개시하기 위한 목적으로 인용된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 그러한 개시보다 날짜가 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
게다가, 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내의 종래의 면역학적 기법, 세포 생물학 및 조직 배양 기법 및 의학적 기법을 채용한다. 그러한 기법은 숙련된 노동자에게 잘 알려져 있고, 문헌으로 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher 및 Wingfield "단백질 과학에서의 현재의 프로토콜(Current Protocols in Protein Science)" (1999) Volume I 및 II (John Wiley & Sons Inc.); 및 Bailey, J.E. 및 Ollis, D.F., 생화학적 엔지니어링 핵심 (Biochemical Engineering Fundamentals), McGraw-Hill Book Company, NY, 1986; 세포 및 분자 생물학에서의 면역화학적 방법(Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology) (Mayer 및 Walker, eds., Academic Press, London, 1987); 실험적 면역학 핸드북(Handbook Of Experimental Immunology), Volumes I 내지 IV (D. M. Weir 및 C. C. Blackwell, eds., 1986); G. Morstyn & W. Sheridan eds에 의한 세포 치료법: 줄기 세포 이식, 유전자 치료법, 및 세포적 면역치료법(Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy), Cambridge University Press, 1996; 및 조혈줄기세포 치료법 (Hematopoietic Stem Cell Therapy), E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000을 보라.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같은, 단일한 형태인 "a," "an," 및 "the"는 문맥상 명확하게 다른 것을 지시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다. 따라서 예를 들어, "a cell"의 언급은 그러한 세포의 복수를 포함하고, "an animal"의 언급은 하나 이상의 동물을 의미하고, 그 등등이다. 다르게 정의되지 않는 한, 여기서 사용되는 모든 기법 및 과학적 단어는 이 발명이 속하는 당업계의 일반적인 기술을 가진 자에 의해서 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 비록 여기에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 물질 및 방법이 본 발명을 실시하거나 테스트하는데 사용될 수 있더라도, 바람직한 물질 및 방법이 이제 기재된다.
가장 넓은 양상 중 하나에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 세포를 배양하는 방법과 관련된다.
단어 "배양하는(culturing)", "배양(culture)" 및 "배양된(cultured)"은 여기서 교환할 수 있게 사용되고 일반적으로 인 비트로로 세포를 성장시키는데 사용되는 표준적인 세포 및 조직 배양 기법을 의미한다. 표준적인 기법은 세포를 수득기 위한 단리 기법, 특정 세포 타입을 클로닝 및 선택하는 것, 원하지 않는 세포의 선택적인 파괴(음성적 선택), 혼합된 집단에서 세포 응집력(agglutinability)의 차이에 기반된 분리, 동결-융해(freeze-thaw) 방법, 혼합된 집단에서 상기 세포의 부착 특성의 차이, 여과, 종래의 및 지역적(zonal) 원심분리, 원심분리적 세정(elutriation)(역류(counter-streaming) 원심분리), 단위 중력 분리, 역류(countercurrent) 분배, 전기영동 및 형광-활성화 세포 분류를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 클론 선택 및 세포 분리 기법의 리뷰에 대해, Freshney의 동물 세포 배양, 기본 기법의 매뉴얼(Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques), 2판, A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 and 12, pp. 137-168을 보라.
문구 "세포 시료(a sample of cells)" 또는 "본 발명의 세포(cells of the invention)"는 배양하여 치료를 위한 세포의 단리 또는 공급을 의미한다. 본 발명의 방법이 임의의 포유동물 세포에 사용될 수 있듯이 상기 세포 시료는 인간, 카멜린, 말, 개 또는 고양이 또는 상업적으로 또는 경제적으로 가치있는 포유동물을 포함하나 이에 제한되지 않는 포유동물 종으로부터 단리될 수 있다.
용어 "단리된(isolated)"은 이것이 의미하는 상기 세포 또는 세포 집단이 이것의 자연적 환경 내에 있지 않다는 것을 나타낸다. 상기 세포 또는 세포 집단은 둘러싸는 조직으로부터 실질적으로 분리된다. 일부 구체예에서, 상기 시료가 약 75% 이상, 일부 구체예에서 약 85% 이상, 일부 구체예에서 약 90% 이상, 및 일부 구체예에서 약 95% 이상 세포를 함유한다면 상기 세포 또는 세포 집단은 둘러싸는 조직으로부터 실질적으로 분리된다. 즉, 상기 세포 시료는 상기 둘러싸는 조직으로부터 실질적으로 분리되고 상기 시료는 상기 세포 외 물질을 약 25% 이하, 일부 구체예에서 약 15% 이하, 및 일부 구체예에서 약 5% 이하를 함유한다. 이러한 백분위 값은 세포수에 따른 백분율을 의미한다. 상기 용어는 이들이 유래된 유기체로부터 제거되어 배양물에 존재하는 세포를 포함한다. 상기 용어는 또한 이들이 유래된 유기체로부터 제거되고 연속적으로 유기체로 재-삽입된 세포를 포함한다. 상기 재-삽입된 세포를 함유하는 유기체는 상기 세포가 제거된 유기체와 동일할 수 있고 또는 다른 유기체일 수 있다.
상기 세포 시료가 동종이계 및 자가유래의 간세포, 동종이계 및 자가유래의 조혈세포, 동종이계 및 자가유래의 섬유아세포, 동종이계 및 자가유래의 지방세포, 동종이계 및 자가유래의 중간엽세포, 동종이계 및 자가유래의 심장세포, 동종이계 및 자가유래의 내피세포, 동종이계 및 자가유래의 상피세포, 동종이계 및 자가유래의 신경세포, 동종이계 및 자가유래의 교세포, 동종이계 및 자가유래의 내분비세포, 또는 이들의 전구체를 포함하는 세포 치료에 사용될 수 있는 임의의 세포를 포함할 수 있다는 것을 당업계에 숙련된 자는 인식할 수 있을 것이다.
일부 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 세포는 특히 중간엽간질세포 (MSC)에서 중간엽전구체세포이다. 일부 구체예 있어서, 상기 MSC는 배아 물질로부터 생산되지 않으나, 성인 중간엽간질세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 세포 집단은 또한 상기 세포가 마커의 특정 부분을 검출가능한 정도로 발현하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기서 정의된 바와 같이 이러한 마커는 음성적 마커로 언급된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 상기 세포 집단은 만약 단리된 세포 집단 중 약 70% 이상의 세포가 상기 마커의 검출가능한 발현을 보이지 않는다면 마커를 발현하지 않는 것으로 여겨질 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 세포 집단 중 상기 세포의 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 또는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 또는 100%가 상기 마커의 검출가능한 발현을 전혀 보이지 않을 수 있다. 다시 말해, 검출가능한 발현의 결핍은 RT-PCR 실험의 이용 또는 FACS를 이용함을 통해 증명될 수 있다.
상기 기재된 상기 음성적 마커는 만약 발현이 세포당 약 100 복제보다 적은 세포발현 정도와 상응하는 PCR 30 사이클 정도에서 적절히 검출되지 않는다면 본 발명의 세포 집단에 의해서 발현되지 않는 것으로 여겨질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세포 집단은 상기 세포가 상기 마커 CD14, CD34 및 CD45 중 하나, 둘 또는 셋 모두를 검출가능한 정도로 발현시키기 않는 것을 더 특징으로 한다. 상기 기재된 바와 같이, 이러한 마커는 작은 양의 잔여 발현을 지속하더라도 이러한 마커는 발현되지 않을 수 있다.
본 발명의 상기 세포 집단은 또한 상기 세포가 마커의 특정 부분을 검출가능한 정도로 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 여기에 정의된 바와 같이, 이러한 마커는 양성 마커로 언급된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 상기 세포 집단은 만약 상기 단리된 세포 집단의 세포 약 70% 이상이 상기 마커의 검출가능한 발현을 보인다면 마커를 발현하는 것으로 여겨질 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 세포 집단의 세포의 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상 또는 약 97% 이상 또는 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 또는 100%가 상기 마커의 검출가능한 발현을 보인다. 검출가능한 발현은 RT-PCR 실험의 이용 또는 FACS를 이용함을 통해 증명될 수 있다.
상기 기재된 양성적 마커는 만약 세포당 약 100 복제 이상의 세포발현 정도와 상응하는 PCR 30 사이클 정도에서 발현이 적절히 검출된다면 본 발명의 세포 집단의 세포에 의해서 발현되는 것으로 여겨질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 세포 집단은 상기 세포가 상기 마커 CD73, CD90 및 CD105 중 하나, 둘 또는 셋 모두를 검출가능한 정도로 발현하는 것을 더 특징으로 한다.
용어 CD73은 CD73 및 NT5E, 5'-뉴클레오티다제인 엑토, RP11-321N4.1, E5NT, NT, NT5, NTE, eN, eNT, 5' 뉴클레오티다제 (CD73), 5' 뉴클레오티다제인 OTTHUMP00000040565, 퓨린 5-프라임-뉴클레오티다제, 및 엑토-5'-뉴클레오티다제를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 그의 이종상동체(ortholog)를 포함한다.
용어 CD90은 CD90 및 Thy-1, 5E10을 포함하나 이제 제한되지 않는 임의의 그의 이종상동체를 포함한다.
용어 CD105는 CD105 및 ENG, endoglin, RP11-228B15.2, END, FLJ41744, HHT1, ORW, 및 ORW1를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 그의 이종상동체를 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 >90% CD73, >90% CD90, >90% CD105 발현 및 <5% CD34, <5% CD45, <5% CD14 발현을 포함하는 표현형을 갖는다.
일부 구체예에서, 바람직한 세포 시료는 골수 흡인물(aspirate)로부터 단리된 골수 단핵구세포이다. 골수 흡인물은 수확 바늘로부터 헤파린화된 시린지로 수집될 수 있다. 만약 상기 수집부터 가공까지의 시간이 2시간 이상이라면, 상기 골수는 바람직하게는 차갑게 (2 내지 8℃) 저장 될 수 있고 가공을 24시간 이내에 즉각 시작한다.
일부 구체예에서, 상기 골수 단핵구세포는 농도 구배 원심분리에 의해 분리되고 PBS로 세척된 후 제1 세포 배양 배지에 현탁되고 플레이팅 된다.
플레이팅되는 세포 수는 세포 타입 및 배양용기 타입에 의존할 것이다. 그러나 상기 세포수는 전형적으로 배양용기의 cm2 당 1.0 x 103 세포 내지 배양용기의 cm2 당 1.0 x 1010 세포일 것이다. 일부 구체예에서 상기 세포 수는 대략 조직 배양 플라스크의 80 cm2 당 12 x 106 또는 조직 배양 플라스크의 175 cm2 당 28 x 106 와 동일하다.
문구 "제1 세포 배양 배지(first cell culture medium)"는 여기서 상기 세포 시료를 상기 배양용기에 담긴 상기세포가 수확되기 위한 콘플루언스 정도에 도달할 때까지의 세포수로 대사시키거나, 팽창하거나 번식하도록 허용하는 표준적인 배양 배지를 언급하는데 여기서 사용된다.
용어 "배양 배지(culture medium)" 또는 "배지(medium)" 또는 "매체(media)"는 살아있는 세포의 배양을 위해 이용되는 임의의 물질 또는 제제로 당업계에서 인지되고 일반적으로 의미한다. 세포 배양에 관하여 사용되는 바와 같은 용어 "배지(media)"는 상기 세포를 둘러싼 환경의 구성요소를 포함한다.
용어 "제1 배양 배지(first cell culture medium)"는 전형적으로 DMEM (고포도당 또는 저포도당), 이글스기본 배지 (MEM), 햄스 F10 배지 (F10), 햄스 F-12 배지 (F12), 이스코브스 변경된 둘베코 배지, M-199, 중간엽줄기세포 성장 배지 (MSCGM), 리보비츠 L-15 배지, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, 어드밴스드 DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), 및 CELL-GRO FREE 또는 이들의 조합과 같은 제1 기본 배지 (예를 들어, 상업적으로 사용가능한 배지)를 포함할 것이다. 일부 구체예에서, 상기 제1 기본 배지는 DMEM이다.
용어 "제1 세포 배양 배지(first cell culture medium)"는 또한 전형적으로 제1 혈청, 제1 혈청 대체물, 제1 혈청 분획 또는 이들의 조합을 포함할 것이다. 용어 "제1 혈청"은 태아 소 혈청(FCS) 또는 열 불활성화 태아 소 혈청 (HIFCS)와 같은 상업적으로 이용가능한 혈청 원료를 포함한다. 바람직하게는, 상기 제1 기본 배지는 열 불활성화 태아 소 혈청 (HIFCS)로 보충된다.
용어 "제1 혈청 대체물(first serum substitutes)"은 혈소판 용해물 및 Ultroser™ G 혈청 대체물(Pall Corporation, NY, USA); 이스코브's MDM 중에 인간 혈청 알부민, 인슐린 및 트란스페린을 함유하는 HIT™ 혈청 대체물 MDM (Stemcell Technologies, BC, Canada); 약 84% 인간 혈청 알부민, 16% 알파 및 베타 글로불린 및 < 1% 감마 글로불린 (Irvine Scientific, CA, USA)을 함유하는 총 단백질 6%로 이루어진 혈청 대체 보충물™ (SSS™) 및 Quinns Advantage® 혈청 단백질 대체물 (CooperSurgical Inc, CT, USA)과 같은 상업적 상품을 포함한다. 이러한 혈청 대체물 모두 알맞은 삼투 포텐셜, 성장 인자 및 영양소/단백질을 제공하여 상기 세포 시료가 상기 배양용기에 부착하거나 세포 수에 있어서 팽창할 수 있게 한다.
용어 "제1 혈청 분획(first serum fraction)"은 혈청 알부민과 같은 혈청 구성요소를 포함한다.
상기 제1 세포 시료가 플레이팅되면 상기 세포는 표준적인 세포 배양 환경 하에 요구되는 콘플루언스 정도로 팽창하고 도달하도록 충분한 시간 동안 인큐베이션된다. 세포 배양 조건의 하나의 일반적인 세트는 약 37℃, 약 5% CO2 및 약 70% 습도이다.
문구 "충분한 시간(sufficient)"은 상기 세포가 "의도된 팽창 정도(desired level of expansion)"를 달성기 위한 시간의 길이를 의미한다. 상기 의도된 팽창 정도에 도달하기 위해 요구되는 시간은 세포 타입, 개시 플래이팅 세포 밀도, 제1 세포 배양 배지의 종류 및 최종 치료 용도를 위해 요구되는 세포의 수와 같은 특정 인자에 의존할 것이라는 것을 당업계에 숙련된 자는 인지할 것이다. 그러나 일부 구체예에서 상기 세포는 18 내지 72시간 동안 인큐베이션 된 후, 부착된 세포를 PBS로 세척하고 계속되는 배양을 위해 배지를 교체한다.
문구 "의도된 팽창 정도(desired level of expansion)"는 전형적으로 상기 세포가 70 내지 90% 콘플루언시에 도달할 때까지 3 내지 4일마다 배지를 교환하면서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 세포는 CellSTACK 공장(Corning, USA)과 같은 세포 공장에서 성장될 수 있다. 세포를 이러한 공장에 전형적 세포 밀도인 약 5,000 세포/cm2로 파종한다. 하기에 기재된 바와 같이, 치료에 사용되는 세포의 수는 약 1 x 106 세포/kg 몸무게 내지 약 15 x 106/kg 몸무게 이다. 따라서, 80 kg인 사람은 전체 대략 약 80 x 106 세포 내지 1200 x 106 세포가 요구될 것이다. 따라서 일부 구체예에서 문구 "의도된 팽창 정도"는 80 x 106 세포 내지 1200 x 106 세포와 같이 의도된 부피의 세포가 생산될 때까지 상기 세포를 배양하는 것을 의미한다.
상기 세포가 의도된 팽창 정도에 도달하면 상기 세포는 수확을 위해 준비될 수 있다. 여기서 사용된 바와 같은 문구 "세포를 수확하기 전에(prior to harvesting cells)"는 "제1 세포 배양 배지(first cell culture medium)"를 "제2 세포 배양 배지"로 교체하는 것을 의미한다. 용어 "전에(prior)"가 의미하는 시간 기간은 전형적으로 상기 세포가 세포 치료에 사용하기 위해 수확되기 적어도 12시간 전이다. 바람직하게는 이 단계는 상기 세포가 세포 치료에 사용되기 위해 수확되기 적어도 18 시간 전에 수행된다. 보다 바람직하게는, 단계 (ii)는 상기 세포가 세포 치료에 사용되기 위해 수확되기 적어도 24 시간 전에 수행된다. 따라서, 전형적으로 상기 제1 세포 배양 배지를 제거하고 제2 세포 배양 배지로 교체한 후 상기 세포를 약 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습 인큐베이터 중에 약 24시간 동안 인큐베이션 한다. 상기 세포가 노년기에 접어들기 시작하기 때문에 상기 세포를 상기 제2 배양 배지와 약 48시간 이상 접촉되어 잔류하도록 허용되지 않을 수 있다는 것을 또한 인식할 수 있을 것이다.
문구 "세포를 추가의 시간 기간 동안 배양(cell are cultured for a further period of time)"은 용어 "전에(prior)"에 의해 포함되는 바와 동일한 시간 기간을 의미한다는 것을 인지할 수 있을 것이다.
여기서 사용된 바와 같은 문구 "제2 세포 배양 배지(second cell culture medium)"는 DMEM (고포도당 또는 저포도당), 이글스 기본 배지 (MEM), 햄스 F10 배지 (F10), 햄스 F-12 배지 (F12), 이스코브스 변경된 둘베코 배지, M-199, 중간엽줄기세포 성장 배지 (MSCGM), 리보비츠 L-15 배지, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, 어드밴스드 DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), 및 CELL-GRO FREE 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 기본 배지를 포함하는 조직 배양 배지를 언급한다. 바람직하게는, 상기 제2 기본 배지는 무-페놀 레드 DMEM이다.
상기 "제2 세포 배양 배지(second cell culture medium)"는 또한 "제2 혈청(a second erum)", "제2 혈청 대체물(a second serum substitute)", "제2 혈청 분획(a second serum fraction)" 또는 이들의 조합을 포함할 것이다. 그러나 상기 제2 혈청 및/또는 제2 혈청 분획이 상기 배양될 세포와 동일한 종 기원을 갖는다는 것은 중요하다. 예를 들어, 인간 세포가 배양된다면 그때는 인간 혈청, 인간 혈청 대체물 또는 인간 혈청 알부민을 포함할 것이다. 만약 말의 세포가 배양된다면 그때는 상기 제2 배지는 말 혈청, 말 혈청 대체물 또는 말 혈청 알부민을 포함하게 될 것이다. 유사하게, 개의 세포가 배양된다면 그때는 상기 제2 배지는 개 혈청 등을 포함하게 될 것이다.
일부 구체예에서, 상기 제2 기본 배지는 인간 세포를 배양하는데 사용하기 위해 인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민으로 보충된다. 상기 제2 배지에 사용되는 인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민의 양은 제한되지 않는데, 즉 혈청의 임의의 양이 사용될 수 있어, 일부 구체예에서 상기 인간 혈청 또는 인간 혈청 알부민의 양은 약 2%이다.
임의의 이론 또는 가설에 얽매이기를 바라지 않고, 본 발명자들은 예를 들어, 인간 세포에 대한 인간 혈청, 말 세포에 대한 말 혈청 등, 종의 기원과 매치되지 않는 혈청 중에 치료를 위한 세포를 배양하면, 생산된 상기 배양된 세포가 조직 거부 문제 및 궁극적으로는 치료의 실패를 발생시키는 환자의 면역계에 의하여 외부물질로 인지되는 표면 마커를 발현한다고 믿는다. 그러나, 종 매치된 혈청 예를 들어 인간 혈청 중에 너무 긴 시간 동안 세포를 배양하는 것은 (i) 비싸고 (ii) 치료에 충분한 세포를 너무 느리게 생산한다. 따라서, DMEM 및 태아 소 혈청과 같은 "표준적인" 조직 배양 배지 중에 치료를 위한 세포를 배양한 후 상기 "제1 세포 배양 배지"를 제거하여 상기 잘못된 세포 표면 마커의 제거를 허용하는 본 발명의 "제2 세포 배양 배지"로 교체하는 것이 바람직하다.
상기를 염두에 두고, 상기 제2 세포 배양 배지 중에 본 발명의 상기 세포를 배양하는 단계 후, 상기 세포가 하나 이상의 부착 마커의 발현에서의 증가를 갖는다는 것을 주목해야 한다. 용어 "발현에서의 증가(increase in the expression)"는 부착 마커 단백질을 코딩하는 검출가능한 mRNA양 또는 부착 마커 단백질 그 자체의 검출의 증가를 나타낸다. 상기 증가는 mRNA 및/또는 제2 세포 배양 배지의 존재 하에 배양되지 않거나 또는 보다 특이적으로 제1 세포 배양 배지에 사용된 배지와 같은 태아 소 혈청 보충된 배지의 존재 하에 배양된 세포상의 이들 부착 마커들에 대한 단백질의 검출 수준에 대해 상대적인 것이다. mRNA 및/또는 단백질의 증가를 측정하는 기법은 이 분야에 잘 알려져 있고 상기 언급되어 있다.
용어 "수확(harvest)" 또는 "수확하는 것(harvesting)"은 여기서 치료에 사용하기 위한 팽창된 세포를 수집하는 과정을 의미한다는 것으로 사용된다. 세포 배양 플라스크 및 공장으로부터 세포를 제거하기 위해 표준적인 기법이 사용된다. 예를 들어, 트립신이 플라스틱 세포 배양 플라스크로부터 부착된 세포를 제거하는데 이용될 수 있다. 하나의 선호되는 방법은 상기 세포 공장으로부터 흡인(aspiration)에 의해서 상기 제2 세포 배양 배지의 제거하는 단계; PBS로 상기 세포를 헹구는 단계; TrypLE™ Select (Life Technologies Inc, CA, USA)를 첨가하는 단계; 37℃에서 모든 세포가 떨어질때까지, 보통 30분 내이나 1시간 이하로 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
적당한 현탁 배지 중의 상기 세포는 치료를 위해 적당한 세포 수에서 여기서 정의되는 바와 같은 세포 치료 조성물을 구성한다.
상기 "적절한 현탁 배지(appropriate suspension medium)"는 상기 치료, 투여 경료, 세포 타입 등에 의존할 것이지만, 전형적으로 상기 현탁 배지는 정맥주사적 사용에 적절한 등장성 용액이다. 바람직하게는 상기 등장성 용액은 약 2%의 HAS를 포함한다.
상기 "적절한 세포 수(appropriate cell number)"는 다시 착수될 치료, 투여 경로, 세포 타입 등에 의존한다.
본 발명의 상기 팽창된 세포가 생산되면 그들은 후에 사용되기 위해 저장될 수 있다는 것을 당업계에 숙련된 자는 인지할 수 있을 것이다. 저온 보존(cryopreservation)을 위한 본 발명의 세포를 제조하는 기법은 상기 세포의 최종 용도에 의존할 것이다. 만약 예를 들어, 상기 저온보존이 서브컬쳐를 위함이라면 상기 세포는 예를 들어 10% HIFBS 및 5㎍/mL 겐타마이신으로 보충된 DMEM과 같은 적당한 배지, 및 20% DMSO (디메틸 술폭시드) 첨가된 10% HIFBS 및 5㎍/mL 겐타마이신으로 보충된 DMEM과 같은 80% 세포 배양 배지의 저온 보존 용액의 동일한 부피 중에 상기 기재된 바와 같이 수확될 수 있다. 대안적으로, 만약, 예를 들어 상기 저온보존이 미래의 환자투여를 위함이라면, 상기 세포는 바람직하게는 2% HSA를 함유하는 등장성 용액 중에 수확되어, 원심분리되고 상등액이 제거될 수 있다. 그런 다음 상기 세포를 등장성 용액 및 예를 들어, 40% 등장성 용액, 40% HSA (20% 용액) 및 20% DMSO를 포함하는 저온보존 용액의 동일한 부피 중에 재현탁될 수 있다. 상기 세포는 초기에 2 내지 8℃로 냉동되고 그 후 제어되는 냉각 속도로 -160℃로 냉각된다.
상기 세포를 해동하는 방법은 다시 최종 용도에 의존할 것이다. 예를 들어, 배양될 세포를 해동하는 것은 전형적으로 36 내지 40℃로 전-가열된 멸균된 염수(sterile saline)를 함유하는 수조 중에 막 해동될 때까지 빠르게 해동시키는 것을 포함한다. 그런 다음 상기 세포를 PBS로 세척하고, 450g (1500rpm)에서 5분 동안 원심분리하고 요구되는 세포 농도를 얻기 위해 배지 중에 재현탁한다.
환자 사용을 위해, 상기 저온보존된 세포를 36 내지 40℃로 전-가열된 멸균된 염수를 함유하는 수조 중에 막 해동될 때까지 빠르게 해동시킨다. 그런 다음 상기 세포를 동일한 양의 등장성 용액으로 희석하고 해동 5시간 내에 주입한다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 동종이계 또는 자가유래 세포로 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서 상기 "공여자(donor)"는 매치된 공여자인 반면, 다른 구체예에서 상기 "공여자(donor)"는 매치되지 않는다. 예를 들어, 상기 공여자는 환자에 대하여 50% 이하의 조직 매치를 가질 수 있으나, 다른 환경에서 전혀 매치되지 않는 즉 동종이계 공여자일 것이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 상기 세포는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된다. 문구 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically-acceptable)"은 여기서 그러한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 용법 형태를 언급하기 위하여 채용되는데, 이는 건전한 의학적 판단의 범위 내에, 합리적인 이익/위험 비율로 적합한(commensurate) 과잉의 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 또는 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적절하다
여기서 사용된 문구 "약학적으로-허용가능한 담체(pharmaceutically-acceptable carrier)"는 하나의 장기 또는 신체의 부분으로부터 다른 기관 또는 신체의 부분으로 대상 세포를 수송하거나 이동시키는데 포함되는 약학적으로-허용가능한 물질, 조성물, 또는 액체 또는 고체 충전제(filler), 희석제, 부형제 또는 물질을 캡슐화하는 용매와 같은 비히클을 의미한다. 각 담체는 투여될 물질의 다른 성분에 적합하고 상기 환자에게 상해를 입히지 않는다는 의미로 "허용가능 (acceptable)"하여아 한다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 상기 세포 생존을 지지하는 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 상기 배지는 수여자에서 면역 반응을 유발하는 것을 피하기 위해 일반적으로 무-혈청일 것이다. 상기 담체는 일반적으로 완충되거나 및/또는 무-발열원(pyrogen-free)이다.
약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 염수(saline), 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산 매체를 표함한다. 그러한 담체 및 희석제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 용액은 바람직하게는 멸균성이고 쉽게 시린지화될 수 있는 정도의 액체이다. 많은 구체예에서, 상기 용액은 제조 및 보관의 조건 하에 안정하고 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브 산, 티메로살의 사용을 통해 세균 또는 진균과 같은 미생물의 오염 활성에 대해 보존적이다. 이 나열은 단지 설명을 위해 제공될 뿐이고, 이에 제한되는 것을 의도하지 않는다. 본 발명의 세포 조성물인 용액을 여기에 기재된 바와 같이 여과에 의해서 멸균된 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및 요구된다면 상기 열거된 다른 성분 중에 세포를 통합시킴으로써 제조할 수 있다.
약학적으로-허용가능한 담체로서 역할할 수 있는 물질 및 용액의 일부 실시예는 (1) 젖당, 포도당 및 설탕과 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 소디움 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스 및 그의 유도체; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌약(suppository) 왁스와 같은 부형제; (9) 피넛 오일, 목화씨 오일, 해바라기유, 참기름, 올리브유, 옥수수 기름 및 콩기름과 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 곤약; (14) 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄과 같은 완충화제; (15) 알긴산; (16) 무-발열원 수; (17) 등장성 염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리안히드리드; 및 (22) 약학적 제형으로 채용된 다른 비독성인 적합한 물질을 포함한다. 이 나열은 단지 설명을 위해 제공될 뿐이고, 이에 제한되는 것을 의도하지 않는다.
상기 세포가 여기에 기재된 대로 제조되면 이들은 환자를 치료하기 위한 치료에 사용될 수 있다. 일반적으로, 용어 "치료하는 것(treating)", "치료(treatment)" 등은 의도된 약학적 및/또는 생리학적 효과를 얻기 위해 개인 또는 동물, 그들의 조직 또는 세포에 영향을 미치는 것을 의미하는 것으로 여기서 사용된다. 상기 영향은 특히 질환 및/또는 질병의 부분적 또는 완전한 치료의 의미로 치료적이다. 여기서 사용된 바와 같은 "치료하는 것(treating)"은 척추생물, 포유동물 특히 인간에서의 질환 및/또는 질병의 임의의 치료를 아우르고 (a) 상기 질병 및/또는 질환을 저해, 즉 이것의 발전을 멈추거나; 또는 (b) 상기 질병 및/또는 질환의 증상을 경감시키거나 개선시키는 것을 포함한다.
용어 "질환(condition)" 및/또는 "질병(disorder)"은 여기서 교환될 수 있게 사용되고 본 발명의 세포를 사용하여 치료될 수 있는 인간을 포함하는 동물에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 의미한다.
본 명세서 전체에 기재된 바와 같이 본 발명의 세포는 특히 인 비보에서의 조직 수선/재생의 유도를 포함하는 세포적 치료에 적절하다. 따라서, 본 발명은 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 환자에게 적당한 양으로 본 발명의 세포를 투여하는 것을 포함한다.
일반적으로 본 발명의 상기 세포 또는 이들의 자손(progeny)은 주입, 주사 또는 이식에 의해서 상기 환자의 신체로 도입될 수 있다. 상기 세포를 주입할 수 있고 또는 그들이 활동하도록 의도되는 조직으로 직접적으로 주사하거나 이식할 수 있다. 본 발명의 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 시린지가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 시린지에 부착된 카테터는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 상기 세포는 조직 재생에 이용될 수 있다. 이 기능을 달성하기 위해서, 세포를 상기 신체 내 그들의 위치에 따라 이들이 작용을 가할 손상된 조직으로 주사하거나 직접적으로 이식할 수 있고, 수회 및 궁극적으로 조직으로 주사하거나 직접적으로 이식할 수 있고, 상기 요구된 세포 타입으로 분화될 수 있다. 치료에 민감한 조직은, 특히 질병, 상해, 트라우마, 자가면역 반응, 또는 바이러스 또는 세균 감염에 의해 손상될 수 있는 것들을 포함하는 모든 손상된 조직을 포함한다.
일 구체예에서 다양한 조성물의 용액, 미립구(microsphere) 또는 미세입자 중에 본 발명의 세포 또는 이들의 자손을 재생이 필요한 동맥 관개한(irrigating) 조직 또는 손상된 조직의 부분으로 투여할 것이다. 일반적으로 그러한 투여는 카테터를 이용하여 수행될 것이다. 상기 카테터는 혈관형성술(angioplasty) 및/또는 세포 운반을 위해 사용되는 매우 다양한 벌룬 카테터 또는 세포를 신체의 특정 구역으로 운반할 특정 목적을 위해 고안된 카테터 중 하나 일 수 있다. 비록 상기 세포가 특정 지표로 특정 조직 (예를 들어, 심근)에 대해 강한 트로피즘을 보인다하더라도, 환자에게 투여될 상기 세포의 대부분은 모세혈관망을 통과하지 않고 전신적 순환으로 들어가지 않는다는 것은 주목할 가치 있을 수 있다. 특정한 용도를 위해, 상기 세포를 다수의 다른 생체분해적 화합물로 이루어지고 약 15 ㎛의 지름을 갖는 미립구로 캡슐화할 수 있다. 이 방법은 정맥으로 투여된 세포를 손상된 위치에 잔류하여 모세혈관망을 통과하지 않고 제1 관문인 전신순환으로 가지 않도록 한다. 상기 모세혈관망의 동맥 쪽에서의 잔류는 또한 혈관 밖 공간으로 그들의 전좌(translocation)를 촉진시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 세포는 그들을 전신에 운반하기 위해 정맥을 통하거나 상기 세포가 지향된 조직 또는 신체 일부로 흘러들어가는 특정정맥관으로 국소적으로 혈관수상구조(vascular tree)에 역행(retrograde) 주사될 수 있다. 이 구체예를 위해 상기 기재된 많은 제제가 사용될 수 있다.
심근의 치료를 위한 대안적인 구체예는 노가 시스템 또는 임의의 유사한 주사 시스템과 같은 시스템을 갖는 전기적 맵핑으로 또는 그것 없이 심장내통과적으로(transendocardically) 경도관(transcatheter) 주사한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 상기 세포 또는 그들의 자손은 생체적합성 이식체에 부착된 손상된 조직으로 이식될 수 있다. 이 구체예 내에, 상기 세포는 환자로 이식하기 전에 인 비트로에서 상기 생체적합성 이식체에 부착될 수 있다. 당업계에 숙련된 자에게 명백할 것으로서, 많은 부착제(adherents) 중 임의의 하나는 이식하기 전에 상기 세포를 상기 이식체에 부착시키는데 이용될 수 있다. 오직 예로서, 그러한 부착제는 피브린, 인테그린 패밀리의 하나 이상의 구성물, 카드헤린 패밀리의 하나 이상의 구성물, 셀렉틴 패밀리의 하나 이상의 구성물, 하나 이상의 세포 부착 분자 (CAM), 하나 이상의 면역글로불린 패밀리 및 하나 이상의 인공 부착물을 포함할 수 있다. 이 나열은 단지 설명을 위해 제공될 뿐이고, 이에 제한되는 것을 의도하지 않는다. 하나 이상의 부착물의 임의의 조합이 사용될 수 있다는 것은 당업계에 숙련된 자에게 명백할 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 상기 세포 또는 그들의 자손을 기질에 내장시킨 후 환자로 상기 기질을 이식할 수 있다. 일반적으로 상기 기질은 환자의 손상된 조직으로 이식될 것이다. 기질의 예는 콜라겐 기반 기질, 피브린 기반 기질, 라미닌 기반 기질, 피브로넥틴 기반 기질 및 인공기질을 포함한다. 이 나열은 단지 설명을 위해 제공될 뿐이고, 이에 제한되는 것을 의도하지 않는다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 상기 세포 또는 그들의 자손은 환자에게 기질 형성 구성요소와 함께 이식되거나 주사될 수 있다. 이는 상기 세포가 기질을 형성한 다음 주사 또는 이식되어, 상기 세포가 환자 내에 적당한 위치에 잔류하는 것을 확실히 할 수 있다. 기질을 구성하는 구성요소의 예는 피브린 글루(glue) 액체 알킬, 시아노아크릴레이트 단량체, 가소제, 덱스트란과 같은 다당류, 에틸렌 옥시드-함유 올리고머, 폴록사머 및 Pluronic과 같은 블록 코-폴리머, Tween 및 Triton`8`과 같은 비-이온성 계면활성제, 및 인공기질 형성 구성요소를 포함한다. 이 나열은 단지 설명을 위해 제공될 뿐이고, 이에 제한되는 것을 의도하지 않는다. 하나 이상의 기질 형성 구성요소의 임의의 조합이 이용될 수 있다는 것이 당업계 숙련된 자에게 명백할 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 상기 세포 또는 그들의 자손은 미립구 내에 함유 될 수 있다. 이 구체예 내에, 상기 세포는 미립구의 중심 내에 캡슐화될 수 있다. 또한 이 구체예 내에, 상기 세포는 상기 미립구의 기질 물질로 내장될 수 있다. 상기 기질 물질은 알긴산염, 폴리에틸렌글리콜(PLGA) 및 폴리우레탄을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 생체분해성 폴리머를 포함할 수 있다. 이 나열은 단지 설명을 위해 제공될 뿐이고, 이에 제한되는 것을 의도하지 않는다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 상기 세포 또는 그들의 자손은 이식을 위해 의도된 의학적 장치에 부착될 수 있다. 그러한 의학적 장치의 예는 스텐트, 핀, 스티치, 스플릿, 심박조율기(pacemaker), 보철관절(prosthetic joint), 인공피부 및 로드(rod)를 포함한다. 이 나열은 단지 설명을 위해 제공될 뿐이고, 이에 제한되는 것 의도하지 않는다. 상기 세포가 다양한 방법에 의해 상기 의학적 장치에 부착될 것이라는 것이 당업계에 숙련된 사람에게 명백할 것이다. 예를 들어, 상기 세포는 피브린, 인테그린 패밀리의 하나 이상의 구성물, 카드헤린 패밀리의 하나 이상의 구성물, 셀렉틴 패밀리의 하나 이상의 구성물, 하나 이상의 세포 부착 분자 (CAM), 하나 이상의 면역글로불린 패밀리 및 하나 이상의 인공 부착물을 포함할 수 있다. 이 나열은 단지 설명을 위해 제공될 뿐이고, 이에 제한되는 것을 의도하지 않는다. 하나 이상의 부착제의 임의의 조합이 사용될 수 있다는 것이 당업계에 숙련된 사람에게 명백할 것이다.
다른 구체예에 있어 본 발명의 상기 세포는 말초 순환으로 투여될 수 있고 기원의 조직에 대한 그들의 트로피즘을 통해 상기 세포가 치료될 상기 장기/조직에 정착할 것을 예상할 수 있을 것이다.
상기 기재된 바와 같이, 약물로 사용하기 위해, 상기 세포를 환자에게 치료적으로 효과적인 양으로 운반할 수 있을 것이다. 인 비보 또는 엑스 비보로 운반될 세포의 수는 환자의 체중, 조직 손상의 심각성 및 개체 내 생존하는 세포의 수를 포함하는 파라미터의 수에 기반될 수 있다. 세포의 전형적인 수는 약 106 내지 109 세포일 수 있다. 필수적인 누적 총 질량을 달성하기 위해서 및/또는 죽은 세포를 교체하기 위해서 수 년간 상기 세포의 주입, 주사 또는 이식을 반복하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 단일 치료 계획(regiment)에서 환자에게 운반되는 세포의 총 수는 약 1 x 106 이상일 것이다. 그러나, 운반되는 세포의 총 수는 1 x 1010 이상일 수 있다. 상기 환자 또는 수용자(recipient)는 보통 1회 이상의 투여량의 세포를 수여받는다. 바람직하게는 상기 환자 또는 수용자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 투여량을 수여받을 수 있다.
상기 세포는 규정된 시간 기간 동안 또는 그 기간까지 단일 투여량, 복수 투여량으로서 주어질 수 있고 일상적인 만성 보전 투여량(maintenance dosing)을 포함할 수 있다. 상기 세포의 투여량은 전형적으로 떨어져 간격을 이룰 것이다. 예를 들어, 상기 투여량은 1 내지 2 일간 또는 주간 또는 월간일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 투여량은 4주 동안 주간이다.
본 발명 내에 추가적으로, 본 발명의 상기 단리된 세포는 조직 재생 또는 세포 치료에 이용하기 위한 약제의 제조에 이용되는데, 이는 크론병, 이식편대숙주병(graft versus host disease), 간의 재생, 파킨슨 병과 관련된 것과 같은 신경계의 특정 영역, 및 이자를 포함한다. 그러한 재생은 파킨슨 병, 2형 당뇨병, 만성 피부 궤양, 및 자가면역 질환의 치료를 허용할 수 있다. 본 발명의 상기 세포는 또한 높은 단계의 일차성 신경교종 또는 신경교종, 뇌교종(ependymoma), 수아세포종(medulloblastoma) 또는 기형발생적(teratogenic) 종양과 같은 낮은 단계의 재발성 뇌 종양, 일부 말초 동맥 질환, 힘줄 복구, 복합 골수종, 백혈병, 각막 손상, 피부경화증, 복합 경화증, 전신 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus; SLE), 맥관염, 베셋병, 골관절염(osteoarthritis), 연골 복구 및 류마티스 관절염을 치료하는데 이용될 수 있다. 이 나열은 단지 설명을 위해 제공될 뿐이고, 이에 제한되는 것을 의도하지 않는다.
본 발명의 상기 세포는 또한 의학적 장치의 임의의 광범위하게 다양한 접촉하는 표면에 적용될 수 있다. 접촉하는 표면은 혈관, 세포 또는 특히 인간을 포함하는 동물의 다른 체액 또는 조직에 접촉하도록 의도된 표면을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적절한 접촉하는 표면은 혈관 또는 다른 조직에 접촉하도록 의도된 의학적 장치의 하나 이상의 표면을 포함한다. 상기 의학적 장치는 동맥류 코일, 인공혈관, 인공심장, 인공판막, 인공신장, 인공힘줄 및 인대, 혈액백, 혈액 산소발생기, 뼈 및 심혈관 교체물, 뼈 보철물, 뼈 밀납(wax), 심혈관 접목(graft), 카트리지 교체 장치, 카테터, 콘텍트 렌즈, 세포 및 조직 배양 및 재생을 위한 용기, 폐색 입자, 여과 시스템, 이식체(graft), 가이드 채널, 내부-내재하는(in-dwelling) 카테터, 실험적 도구, 미크로비드, 신경-성장 가이드, 안과적 임플란트, 정형외과적 임플란트, 심박조율 발생기(pacemaker lead), 탐침, 보철, 션트(shunt), 스텐트, 펩티드 지지체, 수술적 도구, 봉합선, 시린지, 요도 교체물, 상처커버, 상처 치료 장치 및 당업계에 알려진 다른 의학적 장치를 포함한다.
본 발명의 적용으로부터 이익을 얻을 의학적 장치의 다른 예는 수술 및 의학적 방법의 업계에 숙련된 자에게 쉽게 명백할 것이므로 즉각적인 발명으로써 고려될 수 있을 것이다. 상기 접촉하는 표면은 메쉬, 코일, 와이어, 팽창가능한 벌룬, 또는 표적 위치에 이식될 수 있는 임의의 다른 구조를 포함할 수 있고, 상기 표적 위치는 혈관내적 위치, 내강내적 위치, 고체 조직 내 위치 등을 포함할 수 있다. 상기 이식가능한 장치는 영구적 또는 일시적 이식을 위해 의도될 수 있다. 그러한 장치는 혈관 내 및 다른 의학적 카테터에 의해서 운반되거나 그에 통합될 수 있다.
게다가, 상기 팽창된 세포는 개별적으로 포장된 치료적 물품을 함유하는 키트, 시스템 또는 방법팩의 형태로 제공될 수 있고 약물, 의학적 장치 및 생물제제(biological)의 조합을 포함할 수 있다.
"포함하는(comprising)"은 상기 단어 "포함하는"에 앞서는 (follow) 것이라면 무엇이든 포함하나 그에 제한되지 않는 것을 의미한다. 따라서, 상기 용어 "포함하는"의 사용은 나열된 요소가 요구되거나 의무적이나 다른 요소는 선택적이고 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 것을 나타낸다. "구성되는(consisting of)"은 상기 문구 "구성되는"에 앞서는 것이라면 무엇이든 포함하고 이에 제한되는 것을 의미한다. 따라서 상기 문구 "구성되는"은 나열된 요소가 요구되거나 의무적이고 다른 요소가 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. "필수적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 상기 문구 전에 나열되고 상기 나열된 요소의 공개에 특화된 활성 또는 활동을 방해하지 않거나 기여하는 다른 요소에 제한되는 임의의 요소를 포함하는 것을 의미한다. 따라서 상기 문구 "필수적으로 구성되는"은 상기 나열된 요소가 요구되거나 의무적이나 다른 요소는 선택적이고 이들이 상기 나열된 요소의 활성 또는 활동에 영향을 미치는지 아닌지에 의존하여 존재하거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타난다.
본 발명은 이제 오직 참조로써 하기의 비-제한적 실시예로 더 기재될 것이다. 그러나 하기의 실시예는 단지 설명적일 뿐, 상기 기재된 발명의 일반성으로 제한하는 것으로서 임의로 판단해서는 안된다는 것을 이해할 것이다.
도 1: 실제 생존률, 제1 MSC 주입으로부터의 시간.
도 2a: 급성의 경우, 반응에 따른 실제 생존률 및 제1 MSC 주입으로부터의 시간.
도 2b: 만성의 경우, 반응에 따른 실제 생존 및 제1 MSC 주입으로부터의 시간.
도 3: 연구 기간 동안 크론병 활성 수치 (CDAI)의 평균.
도 4: MSC 처리 전&후의 크론병 활성 수치 (CDAI).
도 2a: 급성의 경우, 반응에 따른 실제 생존률 및 제1 MSC 주입으로부터의 시간.
도 2b: 만성의 경우, 반응에 따른 실제 생존 및 제1 MSC 주입으로부터의 시간.
도 3: 연구 기간 동안 크론병 활성 수치 (CDAI)의 평균.
도 4: MSC 처리 전&후의 크론병 활성 수치 (CDAI).
실시예
1
본 발명의
중간엽간질세포(MSC)의
제조 방법
골수 단핵구 세포를 농도 구배 원심분리로써 분리하고 세척된 세포를 10% 태아 소 혈청 (FBS) (SAFC Biosciences, Australia)으로 보충된 둘베코 변경된 이글스 배지 (Invitrogen, Australia) (상기 기재된 바와 같은 본 발명의 "제1 세포 배양 배지" 중 대표적인 예)에 재현탁하고, cm2 당 160,000 세포의 밀도로 플레이팅하였다.
배양물을 5% CO2 를 함유하는 가습 인큐베이터 중에 37℃에서 18 내지 72시간 동안 유지하고, 부착된 세포를 PBS(DKSH, Australia)로 세척하고 계속되는 배양을 위해 신선한 제1 배지로 교체하였다. 세포를 3 내지 4일 마다 배지를 교환하면서 80 내지 90% 콘플루언시로 성장시킨 후 TrypLE-Select (Invitrogen, Australia)를 이용하여 가공하고 CellSTACK 공장 (Corning, USA)에 5,000 세포/cm2 로 재파종하였다. 팽창 후, 보통 계대(passage) 2 또는 3에서, 상기 FBS를 포함하는 배지를 제거하고 2% 인간 혈청 알부민(HSA) (ARCBS)으로 보충된 무-페놀 레드 둘베코 변경된 이글스 배지(Invitrogen, Australia) (상기 기재된 바와 같은 본 발명의 "제2 세포 배양 배지" 중 대표적인 예)로 교체하였다. 그런 다음 이 방법에 의해 생산된 상기 MSC를 5% CO2 를 함유하는 가습 인큐베이터 중에 37℃에서 24시간 동안 인큐배이션하였다. 그런 다음 상기 세포를 수확하여 투여하거나 또는 10% 디메틸 술폭시드(WAK-Chemie, Germany), 50% Plasma-Lyte (Baxter Health Care, Sydney Australia), 20% 염화나트륨 용액 및 20% 인간 혈청 알부민 중에 저온보존하여 -196℃에서 저장한다. 세포 팽창을 마지막 계대에서 수행된 세포유전학적 분석으로 계대 5에 제한하였다. 세포를 1 내지 10 x 106 세포/kg 환자 몸무게의 투여량을 허용할 수 있게 제조하였다.
MSC는 이들이 하기의 방출 기준(release criteria)에 충족된다면 임상적 사용에 이용가능할 것으로 보였다: 호기성 및 혐기성 배양에 의한 최종 생성물의 미생물-오염 테스트 (Bactec plus aerobe/F 및 Bactec plus anaerobe/F, BD)에서 음성이었고, 트립탄 블루 차단에 의한 세포 생존성이 70% 이상이었고 FACS Diva 소프트웨어를 이용한 FACS Canto 기계 상의 유동 세포계측법에 의해 분석된 바와 같이 특징적인 MSC 면역표현형(CD73, CD90 및 CD105 발현 및 CD45, CD34 및 CD14 발현의 결여)의 발현이 있었다.
실시예2
세포 표면 발현
세포 표면 표현형을 Becton dickinson's BD lyoplateTM 스크리닝 패널을 이용하여 수행하였는데, 이는 유동 세포계측기 또는 바이오이미징에 의해 수 백가지의 쥐 및 인간 세포 표면 마커의 효율적인 프로필링에 이용할 수 있는 제1 포괄적인 시스템이다. 상기 패널은 하기의 제조사의 지침에 따라 사용되었다. 본 발명의 세포를 실시예 1에 기재된 방법론을 이용하여 생산하였고 비교 측정기(comparator)로서 MSC의 다른 시료를 실시예 1과 같으나 인간 혈청 알부민의 존재 하의 최종 배양 단계는 없는 동일한 시간 기간 동안 배양하였다. 그런 다음 242개 마커의 발현을 고출력 유동 세포 계측기를 통해 스크리닝하였고 본 발명자들은 다수의 세포 표면 마커가 다르게 발현한다는 것을 발견하였다. 예를 들어, CD54, CD61, CD89, CD140A 및 CD201은 태아 소 혈청을 함유하는 배지 대비 인간 혈청 알부민을 함유하는 배지 중에 세포 성장에서 증가된 발현을 가졌다. 이러한 마커는 주로 부착 마커이다.
실시예
3
스테로이드-불응(refractory) 급성 및 만성
이식편대숙주병을
위한 치료에서 본 발명의
중간엽간질세포의
사용
이식편대숙주병(GVHD)의 생물 작용 및 예방 및 치료를 이해하는데 있어 유의한 발전은 최근 20년 동안 이루어졌는데, 이는 항-종양 괴사 인자 (TNF) 및 항-CD25 생물제제(biologic)와 같은 2차-계열 제제의 도입을 유발하였다. 그러나, 스테로이드-불응 급성 GVHD의 예후는 약 20%의 장기 생존율(Deeg, (2007), Blood, 109(10): 4119-26)로 좋지 않게 남아있다. 급성 GVHD 단계 II 내지 IV의 발생률은 동종이계 조혈줄기세포 이식 (HSCT)후 대략 50%이다. 표준적인 치료는 보통 메틸프레드니솔론 2 mg/kg IV 투여 또는 동등량의 경구투여인 고용량 코르티코스테로이드로 이루어지고, 이는 환자의 약 30 내지 40%에서 오래가는 완전한 반응을 유도한다 (MacMillan et al., (2002), Biol Blood Marrow Transplant; 8(7): 387-94). 스테로이드-불응 급성 GVHD (CGVHD)로, 장기 생존률이 감소하고 장애가 발생함(disabling morbidity)이 일반적이다.
본 발명자들은 실시예 1의 방법에 의해 생산된 상기 MSC가 스테로이드-불응 급성 및 만성 이식편대숙주병을 치료할 수 있는지 여부를 조사하였다.
2007년 3월 내지 2010년 7월에, 고지에 입각하여 서명한 급성 및 CGVHD를 갖는 환자가 단일 기관의 1 상의 안전성 시험에서 MSC를 수여받을 자격이 되었다. 상기 연구는 윤리위원회(Ethics Committee), 왕립퍼스병원(Royal Perth Hospital) 및 호주규제당국(Australian regulatory authority), 치료적상품행정부(Therapeutics Goods Administration; TGA)에 의해 수여된 임상시험통지(Clinical Trials Notification; CTN)에 의해 승인받았다. 상기 시험은 호주 및 뉴질랜드 임상시험등록(Australian and New Zealand Clinical Trials Registry) (ANZCTR12610000068066)으로 등록되었다.
모든 동종이계 이식 환자는 칼시뉴린 저해제 및 메토트렉세이트의 4회 투여로 AGVHD에 대한 예방을 받았다. 14명의 환자에서 골수소멸성(myeloablative) 및 7명의 환자에서 비-골수소멸성으로 이식-전 조건화하였다. 상기 조혈줄기세포 원천은 모든 환자에서의 유동화된 말초혈액세포이다.
AGVHD를 갖는 18살 이상의 환자가 만약 AGVHD 단계 II 내지 IV가 2 mg/kg 메틸프레드니솔론의 정맥투여 또는 2.5 mg/kg 프레드니솔론 경구투여로 치료한지 7일 후에 반응하는데 실패하거나 진행된다면 상기 연구를 받을 자격이 되었다. AGVHD는 합의된 단계화(consensus grading)에 의해 평가되었다 (Przepiorka et al. (1995), Bone Marrow Transplant; 15(6): 825-8). 모든 환자에게 스테로이드 치료 및 칼시뉴린 저해제를 계속하였고, 모두 에타네르셉트 25mg을 피하투여로 매주 2회 투여하는 부수 2차 치료를 시작하였다. 에타네르셉트는 TNF 결합에 대항하고 TNF가 불활성화되도록 하는 용해가능한 이합체(dimeric)의 TNFα 수용체 2이다. AGVHD의 생검-확인 진단이 시험 도입에 요구되었다. 7일을 생존할 것으로 예상되지 않는 좋지 못한 수행 상태를 갖는 환자는 배제되었다.
만성적 GVHD 환자는 프레드니솔론 2.5 mg/kg 및 칼시뉴린 저해제에도 불구하고 강력한 질병을 갖고 보통 미코페놀레이트를 수여받으나, 상기 프로토콜의 부분으로는 요구되지 않는다. 그들은 NIH 합의기준(consensus criteria)에 따라 2점 이상을 갖는 주요 표적 장기로 분류된다(Filipovich et al., (2005), Biol . Blood Marrow Transplant; 11(12): 945-56).
상기 시험의 일차성 최종점은 안전성이고 두번째 최종점은 가장 좋은 반응 및 전체적인 생존률이다. AGVHD를 위해, 완전한 반응은 모든 증상 및 AGVHD의 조짐의 소실이고, 부분적인 반응은 적어도 한 단계 이상으로 개선되는 것이다. CGVHD를 위해, 완전한 반응은 AGVHD에 대한 바와 같고 부분적 반응은 NIH 합의체 점수의 1점 이상으로 개선되는 것이다 (상기의, Filipovich et al., (2005))
공여자는 60세 이하이고, 의학적 공존이환(comorbidity)을 갖지 않으며, 고지에 입각하여 서명할 것이 요구된다. 이들은 또한 혈액 및 조직 기증에 대한 TGA에 의해 요구되는 바와 같은 음성적 감염성 질병 마커를 가져야 했다.
AGVHD를 갖는 12명 및 CGVHD를 갖는 7명으로, 19명의 환자가 2007년 1월 내지 2010년 6월 사이에 등록되었다. 환자 특징 및 반응이 AGVHD에 대해 표 1 및 CGVHD에 대해 표 2에 보여진다.
모든 환자가 혈액학적 악성종양을 가졌다. 매치된 무관한 공여자의 매치된 이식을 받은 환자는 AGVHD를 갖는 12명 중 10명 및 CGVHD를 갖는 7명 중 2명로 나타났다.
개시적으로, 환자는 4 주 동안 매주 2회 정맥투여로 MSC를 8회 주입을 받았고, 입원환자로서 AGVHD의 경우에서 또는 CGVHD 환자를 위한 데이센터에서 주입-관련된 반응을 모니터링하였다. 계속적으로, AGVHD에 대한 MSC의 2회 투여량를 비교하는 임의적인 시험의 발행 (Kebriaei et al., (2009), Biol Blood Marrow Transplant.; 15(7): 804-11) 후, 매주 2회 주입 및 이러한 기반 상에 주입을 수여받는 9명의 환자를 이루는 것으로 시험을 보정하였다. 완전한 반응을 달성하나 유지하지 못하는 환자가 매주 2회의 주입의 치료를 받을 자격이 되었다. 완전한 반응은 GVHD의 모든 조짐의 소실이고, 부분적인 반응이 한 단계 개선되는 것이며, 안정한 병은 증상 또는 GVHD의 조짐에서 변화가 없는 것이고, 진행은 한단계 이상으로 악화되는 것이다.
안전성을 각 주입 후 주입적 반응에 대한 활력 징후를 모니터링하며 4시간 동안 환자를 관찰함으로써 평가하였다. 또한 주입을 위해 차후 방문한 환자에게 상기 이전의 주입 후 상기 간격 동안 경험한 증상에 대하여 질문하고 정기적인 진행의 팔로우-업으로 부작용 반응을 모니터링하였다.
이것이 1상 연구라는 것을 감안하면, 본 발명자들은 통계학적 방법을 급성 및 만성 분류로 계층화된 환자의 전체적인 경험을 나타내는 상기 서술적인 방법으로 제한하였다. 생존율을 제1 MSC 주입으로부터의 시간으로서 기재하였다. 카플란-마이어 방법이 급성 및 만성의 경우에 대해 개별적으로 생존 시간을 평가하는데 사용되었다. 비-파라미터적 로그-서열 테스트가 그룹 간의 생존율에서의 차이를 검사하는데 및 노령 그룹에 대한 생존 패턴에서의 경향을 검사하는데 사용되었다.
첫번째 연구를 위한 MSC는 총 16 개의 동일단배체(haploidentical) 패밀리 구성요소 또는 HLA-미스매치된, 관련 또는 무관한 공여자로부터의 골수흡인물로부터 유래되었다. MSC는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조되었다.
총 109번의 주입이 상기 19명의 환자에게 환자당 2회의 주입의 중간으로 투여되었다. 두명의 환자는 AGVHD의 재발로 추가적인 주입을 요구하였는데, 한명의 환자는 재주입 1회를 가졌고, 두번째는 3년 동안 7회의 주입을 수여받았다. 한번의 치료에서 2회의 주입을 수여받은 CGVHD를 갖는 6명의 환자 및 CGVHD를 갖는 한명의 환자는 1회 이상의 치료를 가졌고, 총 11 회의 주입을 수여받았다. 일부 환자에서 나타난 저온보관 디메틸 술폭시드로 인한 개인적인 가벼운 이상을 제외하고, 상기 주입은 급성 주입-관련된 독성 및 알려진 MSC 주입에 기인하는 추후 독성을 보이지 않으며 잘 용인되었다.
관련된 장기에 의한 반응 및 전체적인 반응이 AGVHD에 대한 표 1 및 CGVHD에 대한 표 2로 보여진다. AGVHD에 대한 전반적인 반응 속도는 7명에게서 완전하고, 4명에게서 부분적이고, 한명에게서 반응이 없었다. 완전한 반응을 갖지 않는 모든 환자는 사망하였는데, 5명은 기회적 감염 및 한명은 출혈성 뇌졸중이었다. 완전한 반응을 달성한 7명의 환자 중 6명은 생존하고 있고 한명은 세균성 패혈증으로 사망하였다.
CGVHD를 갖는 두명의 환자는 완전한 반응을 달성하였고, 반면 2명은 부분적인 반응을 달성하였으며 3명은 반응이 없었다. 이 그룹 중에 5명이 사망하였고, 3명은 흉부 감염과 관련된 점진적인 말소 세기관지염(obliterative bronchiolitis), 한명은 CGVHD 때문에 간기능 상실 및 한명은 재발된 급성 림프아세포성 백혈병 때문이었다. 두 그룹에 대한 상기 실제적 생존률이 도 1로 보여지는데, 상기 급성 그룹에 대해 55%가 3년간 생존했고, CGVHD에 대한 중간 생존률은 8개월이었다. AGVHD에서, 완전한 반응은 생존률에서 중요하다. 로그서열(logrank) 테스트는 반응이 급성 GVHD 환자에 대한 생존률의 통계적으로 유의한 예측변수임을 보여주지만 (c2 = 11.3, p = 0.0008) (도 2a), 만성적인 경우에는 그렇지 않다 (c2 = 2.79, p = 0.100)(도 2b).
이 연구는 GMP 조건 하에 배양되고 저장된 공여자-유래된 MSC의 109회 투여량이 안전한 주입임을 보고한다. 초기 및 후기 주입-관련된 독성의 결실은 제조된 생성물의 품질 뿐만 아니라 MSC의 자연적 획득면역 상태 모두를 반영한다. 요약하여, 본 발명자들은 본 발명자들의 그룹인 19명 환자에서 초기 또는 후기에 안전성 문제가 없다는 것을 확인하였다.
실시예
4
생물학적 치료에 대한
내강성
(
Luminal
) 크론병 재발 치료에서의 본 발명의 동종이계 중간엽간질세포
크론병 (CD)의 생물학적 치료의 도래에도 불구하고, 환자의 약 4분의 1이 여전히 진단 1 단계 후 5년 내에 주요 복부 수술을 필요로한다. 수술을 피하기 위해, 동종이계 또는 자가유래한 골수 또는 말초혈관줄기세포 이식에 의한 세포적 치료가 작은 수의 환자에서 성공적으로 사용되나, 사전 골수소멸성 치료 또는 조혈줄기세포 이동화를 요구한다 (Hommes et al. (2011), J Crohns Colitis; 5: 543-549).
반대로, MSC는 다분화능 성인 줄기 세포인데, 이는 면역원성(immunogenicity)을 결여하므로 면역 인지를 피하는 것으로 여겨진다; 그들은 낮은 정도의 HLA 클래스 I 발현을 갖고, HLA 클래스 II 항원을 결여하고, 공동-자극성 분자를 발현하지 않는다. 따라서 동종이계 투여에서, 수용자에 대한 공여자의 매칭이 요구되지 않고 화학치료적 골수 조건화도 요구되지 않는다 (Le Blanc et al. (2003), Exp Hematol; 31: 890-896).
본 발명자들이 실시예 2로 상기에 증명한 바와 같이, 본 발명자들의 발명의 상기 MSC는 스테로이드 불응 GVHD를 성공적으로 치료한다. 본 발명자들은 본 발명자들의 MCS가 또한 다른 생물학적 치료에 불응하는 내강성 크론 병을 치료하는데 이용될 수 있을 것이라 제기한다.
본 발명자들의 2상이고, 오픈-라벨인 복수-중심 연구는 인플릭시맙- 또는 아달리무맙-불응이고, 내시경적으로 확인된, 활성적 내강성 CD (CD 활성 수치 [CDAI]>250)를 갖는 16명의 환자(21 내지 55 세; 6명은 남성)를 포함하였다. 대상자들은 실시예 1에서 제조된 바와 같은 동종이계 MSC를 정맥 주입(2 x 106 cells/kg 몸무게)으로 4주 동안 매주 받았다. 일차적 종점은 1차 MSC 투여 42일 후 임상적 반응 (CDAI >100 포인트로 감소)이고; 이차적 종결점은 임상적 차도(CDAI<150), 내시경적 개선 (급격한 [CDEIS]의 내시경 수치 값 < 3 또는 >5CD까지 감소), 삶의 질, C-반응적인 단백질 정도 및 안전성이다.
하기의 포함 기준이 적용되었다: 대장 또는 소장 CD (내시경 및 조직학에 기반된); CDAI > 250; 내시경적으로 활성화 질병; 인플릭시맙 또는 마달리무맙으로 유도하는데 불응인 질병, 또는 둘 모두에 대한 반응 소실, 또는 추가적 사용을 불가능하게하는 이러한 약물 각각 또는 모두에 대한 부작용. 차도를 유도하는 것에 대한 실패는 0, 2 및 6 주 째에 인플릭시맙의 최소(5 mg / kg)의 3회 투여량; 또는 아달리무맙(0주는 160 mg, 2주 째는 80 mg, 4주 째는 40 mg)의 3회 투여량으로 4주 후 임상적 유도의 실패로서 정의된다. 하기의 포함 기준이 적용되었다: 염증 없는 만성적 협착성 질환; 공존하는 세균성 소장-대장염(entero-colitis) 또는 시토메갈로바이러스(CMV) 감염; 이전악성종양(prior malignancy); 치료 중 임신 또는 피임의 거부; 수유; 기공(CDAI 는 측정불가); 또는 항문주위 패혈증(perianal sepsis)을 포함하는 급성 패혈증 또는 천공 질환(perforating disease). 하기는 수반되는 약물 치료법과 관련하여 적용된다: 4 주 이상 전에 마지막 생물제제 (인필릭시맙 또는 아달리무맙); 및 t =-14 일 내지 42일에, 코르티코스테로이드의 안정한 용량 (10 mg 프레드니솔론 변화 내), 면역조절자 (아자티오프린, 6-멀캅토퓨린, 메토트렉세이트) 또는 지사제.
상기 시험을 완료한 15명의 환자 중에, 평균 CDAI 점수가 42일 째에 370 (중간, 327; 256 내지 603 범위)에서 203 (중간, 129)으로 감소되었다 (P<.0001). 평균 CDAI 점수는 각 MSC의 주입 후 감소하였다 (투여 전 370, 7일 째 269, 14일 째 240, 21일 째 209, 28일 째 182, 및 42일 째 203). 도 3은 상기 시험 기간 동안 평균 크론병 활성 수치(CDAI)를 보여준다. 12명의 환자가 임상적으로 반응하였고 (80%; 95% 신뢰구간인 72% 내지 88%; CDAI에서의 평균 감소인 211; 102 내지 367 범위), 8명은 임상적으로 개선되었다(53%; 43% 내지 64% 범위; 42일 째 CDAI의 평균인 94; 44 내지 130 범위). 도 4는 MSC 치료 전후 크론병 활성 수치(CDAI)를 보여준다. 7명의 환자가 내시경적 개선(47%)을 가졌고, 이들의 평균 CDEIS 점수가 21.5(3.3 내지 33 범위)에서 11.0 (0.3 내지 18.5 범위)로 감소하였다. 한명의 환자가 심각한 부작용(2회의 형성장애-연관된 병변(dysplasia-associated lesions))을 가졌으나, 이는 MSC에 의해 유발된 것은 아닌 것으로 보였다.
표 3은 상기 시험의 인구 통계를 보여주는 반면, 표 4 및 5는 평가의 결과를 보여준다.
본 발명자들의 데이터는 내강성 CD에서 동종이계성 MSC의 정맥투여의 효능을 제안한다. 15명의 환자에서 심각한 활성화 질환인 항-TNF 치료에 대한 불응을 완화시키며, 매주 2 x 106 세포/kg의 4회의 주입은 12명(80%)에게서 임상적 반응, 8명(53%)에서 임상적 개선, 및 7명(47%)에서 내시경적 개선을 유발하였다. CDAI에서의 개선과 병렬적으로 삶의 질도 개선되었다 (Irvine et al., (1994), Gastroenterol; 106: 287-296.). 본 발명자들의 데이터는 설득력있는 방법으로 내강성 질환에 대한 효과를 처음으로 증명한다.
Claims (51)
- 하기 단계를 포함하는 환자에서 동종이계(allogeneic) 세포 치료에 사용하기 위한 골수유래 중간엽간질세포를 배양하는 방법:
(i) 태아 소 혈청(FCS) 및 열 불활성화 태아 소 혈청 (HIFCS)로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 혈청, 제1 혈청 대체물 및/또는 제1 혈청 분획을 포함하는 제1 세포 배양 배지 중에, 인간, 카멜린, 말, 개, 또는 고양이의 비-환자 공여자(non-patient donor)의 골수로부터 미리 획득된 중간엽간질세포(mesenchymal stromal cell; MSC) 시료를 18 내지 72 시간 동안 배양한 다음, 상기 세포가 적어도 70%의 콘플루언스에 도달할 때까지 계속 배양하기 위해 배지를 신선한 제1 세포 배양 배지로 교환하는 것인 배양하는 단계; 및
(ii) 환자에서 상기 동종이계 세포 치료에 사용하기 위한 세포를 수확하기 전에, 상기 제1 세포 배양 배지를 제2 혈청, 제2 혈청 대체물 및/또는 제2 혈청 분획을 포함하는 제2 세포 배양 배지로 교체하는 단계로서, 여기서 혈청 또는 혈청 대체물 또는 혈청 분획은 상기 배양되는 골수유래 중간엽간질세포와 동일한 종 기원을 갖는 것인 단계, 및 그런 다음 상기 제2 세포 배양 배지 중에 상기 세포를 20 내지 36 시간 동안 추가로 배양하는 단계. - 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (ii) 에서 세포를 24 내지 36시간 동안 배양하는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 단계 (ii) 에서 배양된 세포를 수확하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 단계 (ii) 후에, 상기 배양된 세포는 CD54, CD61, CD140A 및 CD201 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 세포 표면 마커를 발현하는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 단계 (i) 중에서 상기 제1 세포 배양 배지 및/또는 단계 (ii) 중에서 상기 제2 세포 배양 배지는 DMEM (고포도당 또는 저포도당), 이글스 기본 배지 (MEM), 햄스 F10 배지 (F10), 햄스 F-12 배지 (F12), 이스코브스 변경된 둘베코 배지, M-199, 중간엽줄기세포 성장 배지 (MSCGM), 리보비츠 L-15 배지, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, 어드밴스드 DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), 및 CELL-GRO FREE 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 기본 배지를 포함하고, 선택적으로 상기 단계 (i) 중에서 상기 제1 세포 배양 배지는 DMEM을 포함하고, 및/또는 단계 (ii) 중에서 상기 제2 세포 배양 배지는 무-페놀 레드 DMEM을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 단계 (i) 중에서 세포 시료를 상기 세포가 70 내지 90%의 콘플루언스에 도달할 때까지 배양하는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 단계 (ii) 중에서, 제2 혈청, 제2 혈청 대체물 및/또는 제2 혈청 분획은 혈청 또는 혈청 알부민인 것인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 단계 (ii) 중에서, 제2 혈청, 제2 혈청 대체물 및/또는 제2 혈청 분획은 2% v/v 혈청 또는 혈청 알부민인 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 단계 (i)는 제1 세포 배양 배지 중에 상기 세포 시료를 18 내지 72 시간 동안 배양한 다음, 부착 세포를 PBS로 세척하고, 상기 세포가 적어도 70%의 콘플루언스에 도달할 때까지 계속 배양하기 위해 배지를 신선한 제1 세포 배양 배지로 교환하는 것을 포함하고, 선택적으로 상기 단계 (i)는 상기 세포가 적어도 70%의 콘플루언스에 도달할 때까지 3-4일마다 배지 교환을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 단계 (ii) 후에, 상기 세포를 환자에게 치료적 투여에 적합한 배지 중에 현탁시키고, 및/또는 상기 세포를 시린지 또는 조립식 용기(collapsible container) 중에 현탁시키는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 세포를 상기 단계 (ii)에서 20 내지 36 시간 동안 배양하여, 세포가 노년기(senescent)에 접어들기 시작하지 않도록 하는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 따른 방법에 의하여 생산된 골수유래 중간엽간질세포를 포함하는, 동종이계 세포 치료에 사용하기 위한 조성물.
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