JP6931656B2 - クローン病における肛囲複雑瘻孔の治療において使用するための脂肪組織由来間質幹細胞 - Google Patents

Description

本発明は、クローン病患者における難治性の肛囲複雑瘻孔の治療において使用するための脂肪組織由来幹細胞に関する。

一般に、瘻孔は、通常はつながっていない器官間または血管間の異常な接続または通路である。瘻孔は身体の様々な部分に生じ得る。例えば、瘻孔が生じる身体の領域に関して命名された瘻孔の種類として、肛門直腸瘻、すなわち肛門瘻または糞瘻（直腸または他の肛門直腸領域と皮膚表面の間）、動静脈瘻、すなわちＡ−Ｖ瘻（動脈と静脈の間）、胆道瘻（胆管と皮膚表面の間、多くの場合、胆嚢手術によって生じる）、頸瘻（子宮頸部の異常な開口）、頭蓋洞瘻（頭蓋内腔と副鼻腔の間）、腸腸瘻(enteroenteral fistula)（腸管の２つの部分の間）、腸皮瘻（腸と皮膚表面の間、すなわち十二指腸または空腸または回腸に由来する）、腸腟瘻（腸管と膣の間）、胃瘻（胃と皮膚表面の間）、子宮腹腔瘻（子宮と腹膜腔の間）、外リンパ瘻（中耳と内耳の間にある膜間の裂け目）、肺動静脈瘻（肺の動脈と静脈の間、これにより血液の短絡が起こる）、直腸腟瘻（直腸と膣の間）、臍瘻（臍と消化管の間）、気管食道瘻（呼吸管と栄養管の間）、および膀胱腟瘻（膀胱と膣の間）が挙げられる。瘻孔の原因としては、外傷、医療処置からの合併症、および疾患が挙げられる。

瘻孔の治療は、瘻孔の原因および程度によって異なるが、一般には、外科的介入を必要とする。様々な外科的処置が一般的に用いられ、最も一般的には、瘻孔切開術、排液線(seton)（排液用に瘻孔を開けておくために瘻孔の通路に通されるより糸）の留置、または直腸内フラップ手法(endorectal flap procedure)（糞便または他の物質がチャネルを再感染させないようにするために、健常組織を瘻孔の内側に引き寄せる）が用いられる。肛門直腸瘻の手術では、再発、再感染、および失禁を含む副作用を避けられない。

炎症性腸疾患、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎は、肛門直腸瘻、腸腸瘻、および腸皮瘻の主因である。クローン病において報告された瘻の発生率は、１７％〜５０％に及ぶ。多くのそのような瘻は利用可能な治療に奏効しないため、クローン病患者における瘻の管理は極めて困難な問題を呈し続けている。そのような瘻およびそれらの再発は、罹患患者の生活の質を大幅に低下させる極めて苦痛を伴う合併症である。最近の医療処置の向上（例えば、インフリキシマブ(Infliximab)（登録商標）を用いた処置）および専門的な外科的管理により複雑な手術の必要が少なくなっているが、多くの患者は治癒していない。瘻孔の治癒の失敗は恐らくはクローン病によって影響を受けた組織の質が最適とは言えないためである。実際に、クローン病の瘻孔は、一部のあり得る最悪の状況下での創傷治癒のモデル系となっている。

肛囲瘻孔はクローン病の一般的な合併症であり^Ａ１、診断後、最初の２０年で、特に結腸疾患および直腸関与を有するものが^Ａ４患者の最大２８％と推定される^{Ａ２，Ａ３}。それらは患者の生活の質を著しく損ない、重大な罹患が起こる^{Ａ５，Ａ６}。肛囲瘻孔のおよそ７０〜８０％は複雑型であり^{Ａ３，Ａ７}、それらは従来の治療戦略（抗生物質、免疫抑制剤）および抗腫瘍壊死因子（抗ＴＮＦ）療法に特に難治性であるので治療が難しい^{Ａ８−Ａ１２}。さらに、患者の６０〜７０％は処置を止めると再発し^{Ａ１３−Ａ１７}、長期寛解に至るのは少数の患者だけである^Ａ１８。

医学的療法が失敗するまたは忍容されないと、結局、ダイバーティングストーマ(diverting stoma)または直腸切除などの消耗性の外科的アプローチに至る^Ａ１９。よって、まだ対処されていない別の医学的処置の大きな必要性が残っている。

間葉系間質細胞(Mesenchymal stromal cells)（ＭＳＣ）は、骨、軟骨、筋肉、靱帯、腱、および脂肪などの間葉系組織に分化することができる非造血系間質細胞である。ＭＳＣは、骨髄または脂肪組織などの組織から容易に単離し、急速に拡大培養することができる。ＷＯ−Ａ−２００６／１３６２４４には、脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物を用いた瘻孔の治療が記載されている。脂肪由来間葉系間質細胞は、それらの抗炎症能および組織再生能のために肛囲複雑瘻孔の治療に有用であり得る有望な新たな治療アプローチである^{Ａ２０−Ａ２２}。最初の概念実証は、２４名の肛囲複雑瘻孔を有するクローン病患者における同種異系拡大培養脂肪由来幹細胞（expanded adipose-derived stem cell)（ｅＡＳＣ、Ｃｘ６０１）の非盲検第１／２ａ相臨床試験で従前に得られ、ここでは処置２４週間後の処置された瘻孔のＭＲＩにより測定した場合に患者の５６．３％が外口の完全閉鎖および集塊の不在を示した^Ａ２３。
クローン病の肛囲複雑瘻孔は特に治療が難しく、クローン病の肛囲複雑瘻孔の治療のための臨床的に実証済みの療法を確立する必要が残っている。

本発明は、クローン病および難治性、排液性(draining)の肛囲複雑瘻孔を有する２１２名の成人におけるｅＡＳＣの有効性および安全性を評価した多施設共同二重盲検プラセボ対照試験の結果に基づく、クローン病における難治性の肛囲複雑瘻孔を治療するための臨床的に実証済みの療法の提供に関する。本明細書の実施例では、クローン病患者における難治性の肛囲複雑瘻孔(refractory complex perianal fistula)に対する拡大培養同種異系脂肪由来幹細胞単独または現行の医学的療法への付加の有効性および安全性を評価する最初のプラセボ対照第３相治験が記載される。本明細書に報告される結果は、２４週目の主要評価項目および副次的評価項目である。

これらの新たな臨床試験データは、驚くことに、脂肪由来幹細胞が多瘻管肛囲複雑瘻孔を特に有効に治療することを明らかにした。これらのデータはまた、瘻の処置時に抗ＴＮＦ療法および免疫抑制剤療法のいずれをも受けていない、または両方を受けた患者においていくつかの細胞に最大の効果が見られたことを示す。加えて、驚くことに処置後間もなく臨床的寛解が達成され、処置群の臨床寛解までの中央時間は６．７週間であった。同様に、奏効までの中央時間は６．３週間であった。肛門周囲病変活動性指標(perianal disease activity index)（ＰＤＡＩ）の改善は、６週間、１２週間および１８週間において有意に大きかった。全体的に見れば、これらのデータから同種異系ｅＡＳＣはクローン病患者の肛囲複雑瘻孔に驚くほど効果的な療法であることが明らかになり、それにより、単回投与で従前の薬物療法が失敗に終わった最も治療の困難な非常に複雑な瘻孔であっても迅速かつ持続的な治療効果を提供することができる。

本発明の第１の面は、クローン病を有する患者において難治性の肛囲複雑瘻孔を治療する方法での使用のための、拡大培養された同種異系脂肪組織由来間質幹細胞を提供する。

本発明の第２の面は、クローン病を有する患者において難治性の肛囲複雑瘻孔を治療するための薬剤の製造における拡大培養された同種異系脂肪組織由来間質幹細胞の使用を提供する。

本発明の第３の面は、クローン病を有する患者において難治性の肛囲複雑瘻孔を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者において、拡大培養された同種異系脂肪組織由来間質幹細胞を瘻孔に投与する工程を含んでなる方法を提供する。

また、本明細書では、とりわけ、脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物も開示される。本明細書に記載の脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物は、明確な表現型を有し、表現型の有益な均一性を呈し、従って、それらを瘻孔の治療に使用するためにより好適とする。脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物は、医薬または医療デバイス、例えば、縫合糸または接着剤として役立つように溶液または他の物質とともに処方され得る。さらに、脂肪組織由来間質幹細胞を用いて肛囲複雑瘻孔を治療する新規な方法、ならびにそれを実施するためのキットが提供される。

図１は、第ＩＩＩ相臨床試験計画を示す。Ｃｘ６０１は同種異系拡大培養脂肪由来幹細胞；ＩＣＦはインフォームド・コンセント書式；ＭＲＩは磁気共鳴画像法。 図２に患者の配置をまとめる。Ｃｘ６０１は同種異系拡大培養脂肪由来幹細胞；ＩＴＴは、治療企図(intention to treat)；ｍＩＴＴは修正治療企図(modified intention to treat)；^＊深静脈血栓症、クローン病再燃、腸閉塞、クローン病、肛門腫瘍（ｎ＝３）；†瘻孔、直腸痛、肛門腫瘍（ｎ＝４）；‡治癒無しまたは症状の増悪；新たな抗生物質コース；肛門周囲領域の新たな手術；§療法の変更を要するクローン病の増悪。 図３は、主要評価項目を示す：ＩＴＴ集団における２４週目の臨床的および放射線学的な混合寛解^＊（パネルＡ）。ｍＩＴＴ集団における２４週目の臨床的および放射線学的な混合寛解^＊（パネルＢ）。無作為化層化因子に応じた２４週目までの混合寛解^＊、すなわち、クローン病処置はｍＩＴＴ集団では無作為化時に施される（パネルＣ）。Ｃｘ６０１は同種異系拡大培養脂肪由来幹細胞；ＩＳは免疫抑制剤；ＩＴＴは治療企図解析；ｍＩＴＴは修正治療企図解析；ＴＮＦは腫瘍壊死因子。ベースライン時に体液排出していた総ての処置済み外口の閉鎖の^＊臨床評価、および２４週目までの中央盲検ＭＲＩ評価における３寸法のうち２寸法以上での処置済み肛門周囲瘻孔の＞２ｃｍ集塊の不在。閉鎖の臨床評価は、指で軽く圧迫しても排出がないことと定義した。

発明の具体的説明

１．定義
本明細書において、次の用語および表現は以下に示す意味を有するものとする。特に断りのない限り、本明細書において用いられる総ての技術用語および科学用語は、本発明が属す分野の熟練者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。

冠詞「a」および「an」は、その冠詞の、１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つの）の文法的対象物を指す。一例として、「要素(an element)」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

「脂肪組織」とは、いずれの脂肪組織(fat tissue)も意味する。脂肪組織は、皮下脂肪組織部位、網／内臓脂肪組織部位、乳房脂肪組織部位、生殖腺脂肪組織部位、または他の脂肪組織部位に由来する褐色または白色脂肪組織であり得る。一般に、脂肪組織は皮下白色脂肪組織である。そのような細胞は、初代細胞培養物または不死化細胞株を含んでなり得る。脂肪組織は、脂肪組織(fat tissue)を有するいずれの生物由来のものでもよい。一般に、脂肪組織は哺乳類のものであり、最も一般には、脂肪組織はヒトのものである。脂肪組織の好都合な供給源は脂肪吸引手術であるが、脂肪組織の供給源または脂肪組織の単離方法は本発明にとって重要ではない。

「脂肪組織由来間質幹細胞」または「ＡＳＣ」は、脂肪組織の間葉系画分、一般にヒト脂肪組織（ｈＡＳＣ）に由来する間葉系幹細胞を指す。

用語「接着剤」は、表面を互いに接合または結合するいずれの物質も指し、例えば、糊である。

用語「生物学的医薬品」は、一般に天然（非操作）の生物学的得供給源からの直接抽出以外の手段によって生産される、治療的使用のためのタンパク質または核酸に基づく原薬を意味するものとする。

用語「細胞組成物」とは、細胞の調製物を指し、この調製物は、細胞の他に、非細胞成分、例えば、細胞培養培地、例えば、タンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、補酵素、抗酸化剤、金属などを含んでよい。さらに、細胞組成物は、細胞成分の増殖または生存力には影響を及ぼさず、特定の形式で細胞を提供するために用いられる成分を、例えば、カプセル封入または医薬製剤用のポリマーマトリックスとして含み得る。

「肛囲複雑瘻孔」は、
（ｉ）高位括約筋間、括約筋貫通、括約筋外または括約筋起源；
（ｉｉ）≧２の外口；または
（ｉｉｉ）集塊の随伴
のうち１以上を有する肛囲瘻孔である。

肛囲複雑瘻孔は、場合により、最大２つの内口と３つの外口を有し得る。さらに、肛囲複雑瘻孔は、本発明による処置前に少なくとも６週間、体液排出していたものであり得る。

用語「培養」は、培地における細胞、生物、多細胞実体、または組織のいずれの増殖も指す。用語「培養すること」は、そのような増殖を達成するいずれの方法も指し、複数の工程を含み得る。用語「さらに培養すること」は、細胞、生物、多細胞実体、または組織をある特定の増殖段階まで培養した後、別の培養方法を用いて、前記細胞、生物、多細胞実体、または組織を別の増殖段階に持っていくことを指す。「細胞培養」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の増殖を指す。このような培養では、細胞は増殖するが、それらの細胞が組織自体を構成することはない。「組織培養」とは、組織の構造および機能を保つための、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組織、例えば、器官原基もしくは成体器官の外植体の維持または増殖を指す。「単層培養」とは、細胞が適当な培地で、主として互いに付着し、基質にも付着つつ増殖する培養を指す。さらに、「懸濁培養」とは、細胞が適当な培地中に懸濁されつつ増殖する培養を指す。同様に、「連続流動培養」とは、細胞の増殖、例えば、生存力を維持するための、新鮮培地の連続流中での細胞または外植体の培養を指す。用語「馴化培地」は、培地が、細胞により生産され、培養物中に分泌されたある特定の傍分泌因子および／または自己分泌因子を含むように改変されるように、培養細胞と接触させた期間の後に得られる、例えば、培養細胞／組織を含まない、上清を指す。「集密培養」とは、総ての細胞が接触しており、従って培養容器の全表面が覆われる細胞培養であり、それらの細胞が最大密度に達したことも意味するが、集密状態は必ずしも分裂が停止すること、または集団のサイズが大きくならないことを意味するわけではない。

用語「培養培地」または「培地」は、当技術分野で認識されており、一般には、生細胞の培養に用いられるいずれの物質または調製物も指す。細胞培養に関して用いられる「培地」という用語は、細胞を取り巻く環境の成分を含む。培地は、固体、液体、気体、または相および材料の混合物であってよい。培地は、液体増殖培地、ならびに細胞増殖を支援しない液体培地を含む。培地はまた、寒天、アガロース、ゼラチン、およびコラーゲンマトリックスなどのゼラチン状培地も含む。例示的な気体培地としては、ペトリ皿または他の固体もしくは半固体支持体上で増殖している細胞が曝される気相が含まれる。用語「培地」は、たとえ細胞と接触しなかったとしても細胞培養において使用が意図されるも材料も指す。言い換えれば、細菌の培養のために調製された栄養分に富んだ液体が培地である。同様に、水または他の液体と混合した際に細胞培養に適するようになる粉末混合物は、「粉末培地」と呼べる。「合成培地」とは、化学的に定義された（通常精製された）成分で作られた培地を指す。「合成培地」は、酵母抽出物およびビーフブロスなどの特性決定が不十分な生物抽出物を含まない。「富栄養培地」とは、特定種のほとんどまたは総ての生存形態の増殖を補助するように設計された培地を含む。富栄養培地は、多くの場合、複雑な生物抽出物を含む。「高密度培養の増殖に適した培地」とは、他の条件（温度および酸素移動速度など）がそのような増殖を可能にする場合に、細胞培養物を３以上のＯＤ６００に到達させる任意の培地である。用語「基本培地」は、特別な栄養素補給を必要としない多くの種類の微生物の増殖を促進する培地を指す。多くの基本培地は、一般に、４つの基本化学分類群：アミノ酸、炭水化物、無機塩、およびビタミンからなる。基本培地は、一般に、より複雑な培地の基礎として機能し、血清、バッファー、増殖因子、脂質などの補給物が添加される。基本培地の例としては、限定されるものではないが、イーグル基本培地、最少必須培地、ダルベッコ改変イーグル培地、培地１９９、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１０およびＨａｍ’ｓ Ｆ−１２、マッコイ５Ａ、ダルベッコＭＥＭ／Ｆ−Ｉ ２、ＲＰＭＩ １６４０、およびイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が含まれる。

用語「含んでなる(comprise and comprising)」は、さらなる要素が含まれ得ることを意味して包括的、オープンセンスで用いられる。

用語「Ｃｘ６０１」は、同種異系起源のヒト拡大培養脂肪由来幹細胞（ｅＡＳＣ）を含有する無菌の緩衝生理食塩水中の細胞懸濁液を指す。これらの細胞は保存剤を含まないディスポーザブルバイアルで提供される。細胞は病巣内注入には１億２千万個の用量（５００万細胞／ｍＬ）で与えられる。

用語「分化」は、より特殊化され、さらなる分裂または分化の能力がない最終分化細胞になることにより近い細胞と関連があることが知られているマーカーを発現する細胞の形成を指す。例えば、膵臓に関しては、インスリンの生産量が多いβ−上皮細胞の割合が高い膵島様細胞塊の生産において分化を見ることができる。「さらなる」または「より大きな」分化とは、細胞が培養された起源の細胞よりも、より特殊化され、さらなる分裂または分化の能力がない最終分化細胞になることにより近い細胞を指す。用語「最終分化」は、さらなる分裂または分化の能力がない最終分化細胞となった細胞を指す。

用語「拡大培養された(expanded)」とは、本明細書において、細胞に関していう場合、当技術分野でのその通常の意味を有するものと理解されるべきであり、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖された細胞である。ｅＡＳＣの調製のための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ２００７／０３９１５０に記載されているとおりである。ＡＳＣは、ＡＳＣの、少なくとも１つの生物学的機能、一般に、標準培養条件下でプラスチック表面に接着する能力を保持する細胞の集団を提供するために拡大培養され得る。拡大培養された細胞集団は、１以上の細胞種に分化する能力を保持し得る。

用語「瘻孔(fistula)」は、通常、２つの内部器官の間の、または内部器官から体表面までに至る異常ないずれの通路または連絡または接続も指す。瘻孔の例としては、限定されるものではないが、肛門直腸瘻、すなわち肛門瘻または糞瘻、動静脈瘻、すなわちＡ−Ｖ瘻、胆道瘻、頸瘻、頭蓋洞瘻、腸腸瘻、腸皮瘻、腸腟瘻、胃瘻、子宮腹腔瘻 外リンパ瘻(metroperitoneal fistula perilymph)、肺動静脈瘻、直腸腟瘻、臍瘻、気管食道瘻、および膀胱腟瘻が含まれる。

用語「含む(including)」は、本明細書において「限定されるものではないが、含む」を意味して用いられる。「含む」と「限定されるものではないが、含む」は互換的に用いられる。

「マーカー」とは、その存在、濃度、活性、またはリン酸化状態が検出可能であり、細胞の表現型を確認するために用いられ得る生体分子を指す。

「間葉系間質細胞」（本明細書では「ＭＳＣ」とも呼称）は、多能性間質細胞（すなわち、それらは複数の異なる種類の細胞を生じ得る細胞である）、一般に結合組織に由来し、造血細胞である。ＭＳＣは、中胚葉系細胞（例えば、脂肪、軟骨細胞、骨芽細胞）などの体細胞へとまたはそれに向かって、および場合により内胚葉および／または外胚葉系細胞種または系譜へとまたはそれに向かって分化する能力を有する。一般に、これらの細胞は、脂肪系譜、軟骨芽細胞系譜および骨芽細胞系譜からなる群から選択される少なくとも２つまたは総ての細胞種へとまたはそれに向かって分化する能力を有する。ＡＳＣは、脂肪組織の間葉系画分から得られるＭＳＣの一種である。ＭＳＣおよびＡＳＣは、標準培養条件下でプラスチックに接着する。

「パッチ」とは、創傷または他の皮膚の破れた箇所を被覆または保護するために適用される包帯または被覆材である。

対象の方法により治療される「患者」、「被験体」、または「宿主」とは、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを意味し得る。

「薬学的に許容可能」とは、本明細書において、妥当な効果／リスク比に見合い、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なくヒトおよび動物の組織との接触に適した化合物、材料、組成物、および／または投与形を指して使用される。

本明細書において、「薬学的に許容可能な担体」とは、１つの器官または身体の部分から別の器官または身体の部分まで対象化合物の運搬または輸送に関わる、薬学的に許容可能な材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒封入材料を意味する。各担体は、処方物の他の成分と適合し、患者に無害であるという意味で「許容可能」でなければならない。用語「表現型」は、サイズ、形態、タンパク質発現などのような細胞の観察可能な特徴を指す。

用語「前駆細胞」は、それ自体よりも分化した後代を作出する能力を有する細胞を指す。例えば、その用語は、未分化細胞または最終分化に達していない程度に分化した細胞を指し得、これらの細胞は増殖能を有し、多数の母細胞を生じる能力を有するより多くの前駆細胞を生じる能力を有し、その母細胞が次に分化したまたは分化可能な娘細胞を生じさせ得る。好ましい実施態様では、前駆細胞という用語は、全身性母細胞を指し、その子孫（後代）は多くの場合、胚細胞および組織の漸進的な多様化に起こるように、分化により、例えば、個別の形質を完全に獲得することにより異なる方向に分化する。細胞分化は、一般に、多くの細胞分裂によって起こる複雑なプロセスである。分化細胞は多能性細胞から誘導され得、その多能性細胞自体は多能性細胞などから誘導される。これらの多能性細胞それぞれが幹細胞と考えられ得るが、それぞれが生じ得る細胞種の範囲はかなり変化し得る。一部の分化細胞はまた、発生能のより大きい細胞を生じる能力も有する。そのような能力は本来のものであり場合もあるし、様々な因子による処理によって人為的に誘導できる場合もある。この定義により、幹細胞は前駆細胞でもあり得るとともに、最終分化細胞により近い前駆体でもあり得る。

「増殖(proliferation)」とは、細胞数の増加を指す。「増殖すること」および「増殖」とは、有糸分裂中の細胞を指す。

「難治性」は、疾患の治療において使用される場合、有意な臨床利益が無いこと、例えば、症状の有意な改善または軽減が無いことを意味すると理解されるべきである。

用語「寛解」は、瘻孔の治療の成功を指す。「臨床的寛解」とは、ベースライン時に体液を排出していた総ての処置済みの外口が指で圧迫しても閉鎖していることである。臨床的寛解までの時間は、処置の開始から患者が最初に臨床的寛解と評価されるまでの時間と定義される。「混合寛解」とは、この臨床的寛解に加えて、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）による、処置済みの肛囲瘻孔に３寸法(dimensions)のうち少なくとも２つで２ｃｍを超える集塊が存在しないことの確認である。これは一般に盲検中央ＭＲＩ読影によって確認される。集塊または膿腫が存在しないことは、治癒していなければこれらは新たな瘻孔につながるので重要である。

用語「奏効」は、ベースライン時に体液を排出していた、総ての処置済み外口の少なくとも５０％が指で圧迫しても（すなわち、臨床的に評価した際に）閉鎖していることを指す。従って、奏効は、ベースライン時のＥＯの数が１または２であれば１つのＥＯが閉塞されている場合に当たり、ベースライン時に３つのＥＯが存在していれば２つのＥＯが閉塞されている場合に当たる。奏効までの時間は、処置の開始から最初の奏効評価までの時間と定義される。

用語「再発」は、過去の評価時に臨床的寛解を有した患者において、臨床的に評価した際に処置済み外口のいずれかの活発な排出を伴う再開口、またはＭＲＩにより確認した際の処置済み肛囲瘻孔の２ｃｍを超える肛門周囲集塊の発生を指す。

本明細書において、用語「溶液」には、その中で本発明の細胞が生存を維持する薬学的に許可能な担体または希釈剤が含まれる。

脂肪組織由来幹細胞集団に関して、用語「実質的に純粋な」は、細胞集団全体を構成する脂肪組織由来間質幹細胞に関して少なくとも約７５％、一般的には少なくとも約８５％、より一般には少なくとも約９０％、最も一般的には少なくとも約９５％純粋である脂肪組織由来幹細胞の集団を指す。言い換えると、用語「実質的に純粋な」は、続いての培養および増幅の前の増幅していない最初の単離集団において約２０％未満、より一般的には約１０％未満、最も一般的には約５％未満の系譜運命細胞を含む本発明の脂肪組織由来間質幹細胞の集団を指す。

本明細書において、「支持体」とは、脂肪組織由来間質幹細胞の増殖のための基板またはマトリックスとしての機能し得るいずれのデバイスまたは材料も指す。

用語「縫合糸」は、創傷を縫合するために使用できるスレッドもしくは繊維または他の締結材料を指す。

単「管」瘻孔は、１つの内口と１つの外口を有する。「多管」を有する瘻孔は、２つ以上の外口および／または２つ以上の内口を有する。よって、多管瘻孔は異なる分岐を有する。各外口は一般に管を表す。

本明細書において、用語「治療(treating)」は、瘻孔または創傷を修復することだけでなく、瘻孔または創傷を増悪または再発させないことをも指す。

「治療薬(Therapeutic agent or therapeutic)」とは、宿主に対して所望の生物学的作用を有し得る薬剤を指す。化学療法薬および遺伝毒性剤は治療薬の例であり、それぞれ、生物学的なものとは対照的に起源が化学的であること、または特定の作用機序により治療効果をもたらすことが一般に知られている。生物学的起源の治療薬の例としては、増殖因子、ホルモン、およびサイトカインが挙げられる。様々な治療薬が当技術分野で公知であり、それらの作用によって識別され得る。ある特定の治療薬は、細胞増殖および分化を調節することができる。例としては、化学療法薬ヌクレオチド、薬物、ホルモン、非特異的（非抗体）タンパク質、オリゴヌクレオチド（例えば、標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）と結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチド、およびペプチド模倣薬が挙げられる。

２．脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物
本発明は、ある特定の特徴、例えば、特定の表現型を有する脂肪組織由来間質幹細胞含有組成を含む。例えば、本発明の細胞組成物における脂肪組織由来間質幹細胞は、細胞表面マーカーの発現、サイズ、グルコース消費、乳酸生産、および細胞収率／生存力により特徴づけることができる。本発明のさらに別の面は、細胞成分として、特定の表現型を有する脂肪組織由来間質幹細胞、またはその後代の実質的に純粋な調製物を含む脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物に関する。本発明の脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物は、前駆細胞の実質的に純粋な集団を含むだけでなく、細胞培養成分、例えば、アミノ酸、金属、補酵素因子、ならびに他の間質細胞の小集団（例えば、それらの一部は本発明の細胞の後の分化によって生じる可能性がある）を含む培養培地も含み得る。さらに、他の非細胞成分には、特定の状況下、例えば、移植下、例えば、連続培養下での維持に適した、または生体材料もしくは医薬組成物としての使用に適した細胞成分を与えるものが含まれ得る。

特定の実施態様では、前記脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物は、第３節に記載されている培養方法により生産される。

好ましいＡＳＣは、Ｃｘ６０１細胞である。これらの細胞の提案される（確定されていない）国際一般名(International Nonproprietary Name）は「Ａｄａｌｅｘｔｅｍｃｅｌ」である。

ＡＳＣは、標準培養条件下でプラスチックに接着する。

拡大培養ＡＳＣ(expanded ASC)（ｅＡＳＣ）は、培養系で線維芽細胞様形態を呈する。具体的には、これらの細胞は大きく、形態学的には、長くて細い少数の細胞突起を有する厚みのない細胞体により特徴付けられる。核は大きく、球形で、明瞭な核小体を有し、核にクリアな外観を与えている。ｅＡＳＣＳのほとんどはこの紡錘形の形態を呈するが、一部の細胞は多角形の形態をとることが珍しくない（Ｚｕｋ ｅｔ ａｌ．，２００２）。

Ｃｘ６０１ ｅＡＳＣは、表面マーカーＨＬＡ Ｉ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５に対して陽性である。よって、１つの実施態様は、ｅＡＳＣの少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％、または一般に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％が表面マーカーＨＬＡ Ｉ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現するｅＡＳＣ含有組成物を提供する。一般に、ｅＡＳＣの少なくとも約９０％が表面マーカーＨＬＡ Ｉ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現する。より一般には、ｅＡＳＣの少なくとも約９５％が表面マーカーＨＬＡ Ｉ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を発現する。

ＣＸ６０１ ｅＡＳＣは、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対して陰性である。よって、１つの実施態様は、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現するｅＡＳＣが約５％未満であるｅＡＳＣ含有組成物を提供する。より一般には、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現するｅＡＳＣは約４％、３％または２％未満である。１つの実施態様では、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現するｅＡＳＣは約１％未満である。

いくつかの実施態様では、ｅＡＳＣは、ＨＬＡ Ｉ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５のうち１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６つまたは７つ）を発現し得る。いくつかの実施態様では、ｅＡＳＣは、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０のうち１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７つまたは８つ）について非発現であり得る。いくつかの実施態様では、ｅＡＳＣは、ＨＬＡ Ｉ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５のうち４以上を発現し、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０のうち４以上を発現しない。

本発明の特定の実施態様による拡大培養ヒトＡＳＣは、DelaRosa et al (“Requirement of IFN-gamma-mediated indoleamine 2,3-dioxygenase expression in the modulation of lymphocyte proliferation by human adipose-derived stem cells.”; Tissue Eng Part A. 2009 Oct;15(10):2795-806. doi: 10.1089/ten.TEA.2008.0630)およびLopez-Santalla et al 2015 (“Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Modulate Experimental Autoimmune Arthritis by Modifying Early Adaptive T Cell Responses.” STEM CELLS, 33: 3493-3503. doi: 10.1002/stem.2113)に記載されている。

１つの実施態様では（Ｌｏｐｅｚ−Ｓａｎｔａｌｌａ ｅｔ ａｌ ２０１５に記載のとおり）、健常ドナーからのヒト脂肪組織吸引物をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、０．０７５％コラゲナーゼ（Ｉ型；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消化した。消化したサンプルを１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄し、残留する赤血球を除去するために１６０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌで処理し、培養培地［１０％ＦＢＳを含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）］に懸濁させた。細胞を組織培養フラスコに播種し（２〜３・１０４細胞／ｃｍ２）、 ３〜４日ごとに培養培地を交換しつつ拡大培養した（３７℃、５％ＣＯ_２）。細胞は、９０％の集密度に達した際に新しいフラスコに移した（１０３細胞／ｃｍ２）。細胞を１２〜１４倍まで拡大培養し、冷凍した。実験は、２名の男性および２名の女性成人ドナーからの細胞を用い、１２〜１４倍の集団で行った。ＡＳＣは、各実験前に同じ低温バンクから解凍して播種した。ＡＳＣは、国際細胞治療学会(International Society for Cellular Therapy)の判定基準に従って定義した：ＨＬＡ−Ｉ、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５陽性かつＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＣＤ４５陰性。

別の実施態様では（ＤｅｌａＲｏｓａ ｅｔ ａｌ ２００９のより記載されるとおり）、健常成人ドナー由来ヒト脂肪組織から得られた脂肪吸引物をＰＢＳで２回洗浄し、３７８Ｃにて、３０分間、ＰＢＳ中、１８Ｕ＝ｍＬのＩ型コラゲナーゼで消化した。１単位のコラゲナーゼは、３７８Ｃ、ｐＨ７．５、５時間で、コラーゲンから１ｍＭのＬ−ロイシン当量を遊離させる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。消化したサンプルを１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄し、１６０ｍＭ ＣｌＮＨ４で処理し、培養培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）に懸濁させ、４０ｍｍナイロンメッシュで濾過した。細胞を組織培養フラスコに播種し（２〜３＿１０４細胞＝ｃｍ２）、７日ごとに培養培地を交換しつつ、３７８Ｃ、５％ＣＯ２で拡大培養した。培養物が９０％の集密度に達した際に、細胞を新たな培養フラスコに継代培養した（１０００８細胞＝ｃｍ２）。細胞は、それらの軟骨形成系譜、骨形成系譜、および脂肪形成系譜への分化能によって表現型的に特徴づけた。加えて、ｈＡＳＣは、特定の表面マーカーによる染色によって確認した。ｈＡＳＣは、ＨＬＡ−Ｉ、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５陽性であり、ＨＬＡ−ＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ３４陰性であった。この試験では６名の健常ドナー（３５〜４７歳の間の男性３名と女性３名）からのプールを使用した。細胞は４〜６代目で使用した。

いくつかの実施態様では、ＡＳＣは、（ｉ）ＡＰＣ特異的マーカーを発現せず；（ｉｉ）ＩＤＯを構成的に発現せず；（ｉｉｉ）ＭＨＣ ＩＩを構成的に有意に発現しない。一般に、ＩＤＯまたはＭＨＣ ＩＩの発現は、ＩＦＮ−γによる刺激によって誘導され得る。

いくつかの実施態様では、ＡＳＣは、マーカーＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１０５のうち１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上（例えば、最大１３））を発現し得る。例えば、ＡＳＣは、マーカーＣＤ２９、ＣＤ５９、ＣＤ９０およびＣＤ１０５のうち１以上（例えば、２つ、３つまたは総て）、例えば、ＣＤ５９および／またはＣＤ９０を発現し得る。

いくつかの実施態様では、ＭＳＣは、マーカー因子ＶＩＩＩ、α−アクチン、デスミン、Ｓ−１００、ケラチン、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＳＴＲＯ−１およびＣＤ１３３のうち１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上（例えば、最大１５））に関して非発現であり得、例えば、ＭＳＣは、マーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１およびＣＤ１４のうち１以上（例えば、２つ、３つまたは総て）、例えば、ＣＤ３１および／またはＣＤ３４を発現しない。

１つの実施態様では、幹細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または一般に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％がＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９Ａ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ９０および／またはＣＤ１０５マーカーを発現する脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物が提供される。脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物の特定の実施態様では、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０２、ＣＤ１０４、ＣＤ１０６および／またはＣＤ１３３マーカーを発現するのが幹細胞の約１５％、約１０％、約５％、一般に約４％、３％、２％または１％未満である。

別の実施態様では、幹細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または一般に少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％がｃ−Ｋｉｔ、ビメンチンおよび／またはＣＤ９０マーカーを発現する脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物が提供される。脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物の特定の実施態様では、ＣＤ３４、因子ＶＩＩＩ、α−アクチン、デスミン、Ｓ−１００および／またはケラチンマーカーを発現するのが幹細胞の約１５％、約１０％、約５％、一般に約４％、３％、２％または１％未満である。また、ｃ−Ｋｉｔ、ビメンチンおよびＣＤ９０マーカーを発現し、ＣＤ３４、因子ＶＩＩＩ、α−アクチン、デスミン、Ｓ−１００およびケラチンマーカーを発現しない脂肪組織由来間質幹細胞集団が提供される。

表面マーカーによる細胞集団の表現型の特徴づけは、通常の方法に従って行われる細胞の個々の染色（フローサイトメトリー）によって、またはｉｎ ｓｉｔｕで集団の組織学的切片を作製することによって行うことができる。抗体による表面マーカーの発現プロフィールの決定、すなわち、免疫表現型の特徴づけは、標識抗体を用いて直接的に行ってよく、または細胞マーカーの一次特異的抗体に対する二次標識抗体を用いて間接的に行ってもよく、そのようにしてシグナル増幅を行ってよい。また、抗体との結合の有無は、限定されるものではないが免疫蛍光顕微鏡検査法およびＸ線撮影法を含む様々な方法によって確認し得る。同様に、フローサイトメトリー、すなわち、蛍光色素のレベルを標識抗体と特異的に結合された細胞表面に存在する抗原の量と相関させる技術によって抗体の結合レベルのモニタリングを行うことも可能である。細胞集団における一連の表面マーカーの発現の違いにより、前記集団の同定および単離のための方法が提供される。よって、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）が一般に使用可能である。

特定の実施態様では、前記脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物は、以下でさらに詳細に記載するように、例えば、医薬品または生体材料として用いるための、様々な溶液または材料中の脂肪組織由来間質幹細胞の懸濁液である。１つの実施態様では、前記細胞組成物は、リンゲル溶液およびＨＳＡ中の対象とする脂肪組織由来間質幹細胞の懸濁液を含んでなる。別の実施態様では、前記細胞組成物は、ポリマー、糊、ゲルなどのような材料中の対象とする脂肪組織由来間質幹細胞の懸濁液を含んでなる。このような懸濁液は、例えば、培養培地から対象とする脂肪組織由来間質幹細胞を沈殿させ、それらを所望の溶液または材料中に再懸濁することにより調製され得る。細胞は、培養培地から、例えば、遠心分離、濾過、限外濾過などにより沈殿させ、かつ／または変更してもよい。

対象とする脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物中の対象とする脂肪組織由来間質幹細胞の濃度は、少なくとも約５×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約１０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約２０×１０^６細胞／ｍＬ、少なくとも約３０×１０^６細胞／ｍＬ、または少なくとも約４０×１０^６細胞／ｍＬであり得る。一般に、約１×１０^６細胞／ｍＬ〜１×１０^７細胞／ｍＬの間、例えば約約５×１０^６細胞／ｍＬ〜１×１０^７細胞／ｍＬの間の濃度であり得る。実施例に報告されている臨床試験では、ｅＡＳＣは、５００万細胞／ｍＬの濃度で投与された。

よって、本発明の別の面は、対象とする脂肪組織由来間質幹細胞の後代、例えば、該脂肪組織由来間質幹細胞から誘導された細胞に関する。このような後代は、脂肪組織由来間質幹細胞の次世代、ならびに例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導された、外植体から対とする脂肪組織由来間質幹細胞を単離した後に、それらの分化を誘導することにより生じた系譜運命細胞を含み得る。特定の実施態様では、前記後代細胞は、その親集団から約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、または約１０回継代後に得られる。しかしながら、前記後代細胞は、その親集団から何回継代した後にでも得られる。

特定の実施態様では、本発明の脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物は、医薬製剤、例えば、滅菌した、望ましくないウイルス、細菌、および他の病原体が存在しない、さらに発熱物質も含まない製剤の一部として提供される。すなわち、ヒトに投与するためには、対象とする組成物は、FDA Office of Biologies standardsが求めるような無菌性、発熱性、ならびに一般安全性および純度の基準を満たしていなければならない。

拡大培養脂肪組織由来間質幹細胞は、移植宿主に対して同種異系である。十分な自己幹細胞を得ることが難しいために、同種異系ドナーからの脂肪組織由来間質幹細胞は、治療用の幹細胞の有価なもう１つの供給源となる。骨髄間質幹細胞および脂肪組織由来間質細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで同種異系リンパ球の応答を惹起せず、結果として、ドナー由来の同種異系脂肪組織由来間質幹細胞はＭＨＣ不適合性に関係なく、いずれもの患者に用いることができることは当技術分野で知られている。

前記脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物を対象、特にヒト対象に投与する方法は、本明細書に詳細に記載され、それらの方法は対象の標的部位への細胞の注入または移植を含み、該細胞は、注入または移植による、対象への細胞の導入を容易にする送達デバイスに挿入することができる。このような送達デバイスとしては、細胞および流体をレシピエント対象の体内に注入するためのチューブ、例えば、カテーテルが含まれる。好ましい実施態様では、前記チューブは、前記脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物を対象の所望の位置に導入することができる針、例えば、シリンジをさらに備えている。前記脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物は様々な形態でこのような送達デバイス、例えば、シリンジに挿入することができる。例えば、前記脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物には、溶液に懸濁された、またはこのような送達デバイスに入れられる場合には支持マトリックスに埋め込まれた、脂肪組織由来間質幹細胞の組成物が含まれる。

薬学的に許容可能な担体および希釈剤としては、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒、および／または分散媒が含まれる。このような担体および希釈剤の使用は当技術分野で周知である。前記溶液は、一般には無菌であり、かつ容易なシリンジ操作性が存在する程度の流動性がある。一般に、前記溶液は、製造および保存の条件下で安定であり、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用によって細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護される。本発明の脂肪組織由来間質幹細胞組成物である溶液は、本明細書に記載の脂肪組織由来間質幹細胞を、薬学的に許容可能な担体または希釈剤および必要に応じて上記に列挙した他の成分中に配合し、その後、濾過除菌を行うことによって調製することができる。

薬学的に許容可能な担体として機能し得る材料および溶液のいくつかの例として、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、ココア脂および坐剤用ワックス；（９）油、例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）多価アルコール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリアンヒドリド；ならびに（２２）医薬処方物に使用される他の無毒の適合物質が挙げられる。

特定の実施態様では、脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物は、接着剤をさらに含んでなる。特定の実施態様では、前記接着剤は、フィブリンベースの接着剤、例えば、フィブリンゲルまたはフィブリン糊またはフィブリンベースのポリマーもしくは接着剤、あるいは他の組織接着剤または外科用糊、例えば、シアノアクリレート、コラーゲン、トロンビン、およびポリエチレングリコールなどである。用いてよい他の材料としては、限定されるものではないが、アルギン酸カルシウム、アガロース、タイプＩ、ＩＩ、ＩＶもしくは他のコラーゲンイソ型、ポリ乳酸／ポリグリコール酸、ヒアルロン酸誘導体、または他の材料が挙げられる(Perka C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311; Sechriest VF. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:534-541; Chu CR et al. (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29:1147-1154; Hendrickson DA et al. (1994) Orthop. Res. 12:485-497)。他の実施態様では、前記接着剤は、前記方法の脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物が液体包帯材料と混合されている液体包帯である。「液体包帯」とは、スプレーまたはブラシを用いて創傷に適用され、その後、蒸発により溶媒が除去されて、創傷の上に保護膜を与える化合物、例えば、高分子材料を含む溶液である。

本発明の脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物はまた、支持体、例えば、医療デバイスをコーティングするためにも使用され得る。例えば、支持体は縫合糸またはスレッドであり得る。

支持体は、例えば、浸漬、噴霧、塗布、捺印など、当業者に公知の任意の方法によって細胞でコーティングしてよい。

１つの実施態様では、支持体は、縫合糸、ステープル、吸収性スレッド、非吸収性スレッド、天然スレッド、合成スレッド、モノフィラメントスレッド、またはマルチフィラメントスレッド（ブレイズとも呼ばれる）である。脂肪組織由来間質幹細胞でコーティングされた、創傷を閉鎖するために用いられる縫合糸および他の支持体を調製する好ましい方法は、２００５年２月１４日出願の米国特許出願第１１／０５６，２４１号「Biomaterial for Suturing」で開示されており、この出願は引用することによりその全内容は本明細書の一部とされる。本明細書に開示される脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物は、米国特許出願第１１／０５６，２４１号で開示された方法で使用され得る新規組成物である。

さらに、いずれの前記脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物においても、組成物に少なくとも１つの治療薬を配合してよい（必要では無く、場合により排除できる）。例えば、組成物は、瘻孔の部位における炎症もしくは疼痛の処置を助けるための鎮痛薬、またはその組成物で処置される部位の感染を予防するための抗感染薬を含有し得る。

さらに具体的には、有用な治療薬の限定されない例としては、次の薬効分類が挙げられる：鎮痛薬、例えば、非ステロイド系抗炎症薬、オピエート作動薬、およびサリチル酸塩；抗感染薬、例えば、駆虫薬、抗嫌気性菌薬(antianaerobics)、抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、抗真菌性抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質、様々なβ−ラクタム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、キノロン系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、抗抗酸菌薬、抗結核性抗抗酸菌薬、抗原虫薬、抗マラリア性抗原虫薬、抗ウイルス薬、抗レトロウイルス薬、抗疥癬薬、抗炎症薬、コルチコステロイド抗炎症薬、止痒薬／局所麻酔薬、局所性抗感染薬、抗真菌性局所性抗感染薬、抗ウイルス性局所性抗感染薬；電解薬および腎臓薬、例えば、酸性化薬、アルカリ化薬、利尿薬、炭酸脱水酵素阻害薬である利尿薬、ループ利尿薬、浸透圧利尿薬、カリウム保持性利尿薬、チアジド系利尿薬、電解質代替物、および尿酸排泄促進薬；酵素、例えば、膵酵素および血栓溶解酵素；胃腸薬、例えば、下痢止め薬、制吐薬、胃腸抗炎症薬、サリチル酸系胃腸抗炎症薬、制酸性抗潰瘍薬、胃酸ポンプ阻害薬である抗潰瘍薬、胃粘膜抗潰瘍薬、Ｈ２遮断薬である抗潰瘍薬、胆石溶解剤、消化薬、吐薬、緩下薬、および便軟化薬、ならびに運動促進薬；全身麻酔薬、例えば、吸入麻酔薬、ハロゲン化吸入麻酔薬、静脈麻酔薬、バルビツレート系静脈麻酔薬、ベンゾジアゼピン系静脈麻酔薬、およびオピエート作動薬である静脈麻酔薬；ホルモンおよびホルモン調整物質、例えば、堕胎薬、副腎作用物質、コルチコステロイド副腎作用物質、アンドロゲン、抗アンドロゲン、免疫生物学的薬物、例えば、免疫グロブリン、免疫抑制薬、トキソイド、およびワクチン；局所麻酔薬、例えば、アミド型局所麻酔薬およびエステル型局所麻酔薬；筋骨格薬、例えば、抗痛風性抗炎症薬、コルチコステロイド抗炎症薬、金化合物抗炎症薬、免疫抑制性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、サリチル酸系抗炎症薬、無機物；ならびにビタミン、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミンＫ。

上記分類の有用な治療薬の好ましいクラスとしては、（１）一般鎮痛薬、例えば、リドカインまたはその誘導体、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である鎮痛薬（ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、およびナプロキセンを含む）；（２）オピエート作動薬である鎮痛薬、例えば、コデイン、フェンタニル、ヒドロモルホン、およびモルヒネ；（３）サリチル酸系鎮痛薬、例えば、アスピリン（ＡＳＡ）（腸溶性ＡＳＡ）；（４）Ｈ_１遮断薬である抗ヒスタミン薬、例えば、クレマスチンおよびテルフェナジン；（５）抗感染薬、例えば、ムピロシン；（６）抗嫌気性抗感染薬、例えば、クロラムフェニコールおよびクリンダマイシン；（７）抗真菌性抗生物質抗感染薬、例えば、アムホテリシンｂ、クロトリマゾール、フルコナゾール、およびケトコナゾール；（８）マクロライド系抗生物質抗感染薬、例えば、アジスロマイシンおよびエリスロマイシン；（９）様々なβ−ラクタム系抗生物質抗感染薬、例えば、アズトレオナムおよびイミペネム；（１０）ペニシリン系抗生物質抗感染薬、例えば、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、およびペニシリンＶ；（１１）キノロン系抗生物質抗感染薬、例えば、シプロフロキサシンおよびノルフロキサシン；（１２）テトラサイクリン系抗生物質抗感染薬、例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、およびテトラサイクリン；（１３）抗結核性抗抗酸菌性抗感染薬、例えば、イソニアジド（ＩＮＨ）、およびリファンピン；（１４）抗原虫性抗感染薬、例えば、アトバクオンおよびダプソーン；（１５）抗マラリア性抗原虫性抗感染薬、例えば、クロロキンおよびピリメタミン；（１６）抗レトロウイルス性抗感染薬、例えば、リトナビルおよびジドブジン；（１７）抗ウイルス性抗感染薬、例えば、アシクロビル、ガンシクロビル、インターフェロンα、およびリマンタジン；（１８）抗真菌性局所性抗感染薬、例えば、アムホテリシンＢ、クロトリマゾール、ミコナゾール、およびナイスタチン；（１９）抗ウイルス性局所性抗感染薬、例えば、アシクロビル；（２０）電解薬および腎臓薬、例えば、ラクツロース；（２１）ループ利尿薬、例えば、フロセミド；（２２）カリウム保持性利尿薬、例えば、トリアムテレン；（２３）チアジド系利尿薬、例えば、ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）；（２４）尿酸排泄促進薬、例えば、プロベネシド；（２５）酵素、例えば、ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼ；（２６）制吐薬、例えば、プロクロルペラジン；（２７）サリチル酸系胃腸抗炎症薬、例えば、スルファサラジン；（２８）胃酸ポンプ阻害薬である抗潰瘍薬、例えば、オメプラゾール；（２９）Ｈ_２遮断薬である抗潰瘍薬、例えば、シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、およびラニチジン；（３０）消化薬、例えば、パンクレリパーゼ；（３１）運動促進薬、例えば、エリスロマイシン；（３２）エステル型局所麻酔薬、例えば、ベンゾカインおよびプロカイン；（３３）筋骨格コルチコステロイド抗炎症薬、例えば、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、およびプレドニゾン；（３４）筋骨格抗炎症性免疫抑制薬、例えば、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびメトトレキサート；（３５）筋骨格非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ケトルラック(ketorlac)、およびナプロキセン；（３６）無機物、例えば、鉄、カルシウム、およびマグネシウム；（３７）ビタミンＢ化合物、例えば、シアノコバラミン（ビタミンＢ_１２）およびナイアシン（ビタミンＢ_３）；（３８）ビタミンＣ化合物、例えば、アスコルビン酸；ならびに（３９）ビタミンＤ化合物、例えば、カルシトリオールが挙げられる。

特定の実施態様では、前記治療薬は、細胞分化および／または増殖に影響を及ぼす増殖因子または他の分子であってよい。最終分化状態を誘導する増殖因子は当技術分野で周知であり、最終分化状態を誘導することが示されているそのようないずれもの因子から選択され得る。本明細書に記載の方法で使用するための増殖因子は、特定の実施態様では、天然増殖因子の変異体または断片であり得る。例えば、変異体は、保存的アミノ酸変化を起こし、その結果として得られた変異体は、上記の機能アッセイのうちの１つまたは当技術分野で公知の別の機能アッセイにおいて試験することにより作製し得る。保存的アミノ酸置換とは、類似側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸の置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。

当業者には明らかなように、ポリペプチド増殖因子の変異体または断片は、突然変異誘発（不連続な点突然変異の作出を含む）、または末端切断によるなどの従来の技術を用いて作製することができる。例えば、突然変異は、それが由来するポリペプチド増殖因子の生物活性と実質的に同じものまたは一部だけを保持する変異体を生じさせ得る。

３．脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物を調製する方法
ｅＡＳＣおよび本発明の細胞集団、ならびに本発明の細胞集団を含んでなる組成物を提供するためのＡＳＣの単離および培養方法は、当技術分野で公知である。細胞集団を含んでなる組成物を調製するための一般法は、以下の工程：
（ｉ）脂肪組織の間葉系画分からのＡＳＣの単離および好適な表面、例えば、プラスチックへの接着による選択、
（ｉｉ）ｅＡＳＣを含んでなる本発明の細胞集団を提供するためのＡＳＣの拡大培養
を含んでなる。

場合により、本発明の細胞集団は、拡大培養工程（ｉｉ）中および／または工程後に低温保存され得る。場合により、本発明の細胞集団の表現型は、拡大培養工程（ｉｉ）中および／または工程後に評価され得る。場合により、本発明の細胞集団は、拡大培養工程（ｉｉ）中および／または工程後に単離され、薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤に再懸濁され得る。

ＡＳＣは当技術分野で標準的ないずれの方法によっても得ることができる。一般に、前記細胞は、供給源組織（例えば、脂肪吸引物または脂肪組織）から細胞を解離すること、一般に、組織をコラゲナーゼなどの消化酵素で処理することによって得られる。次に、消化された組織物を一般に約２０ミクロン〜１ｍｍの間のフィルターで濾過する。その後、細胞を単離し（一般に、遠心分離による）、接着表面（一般に、組織培養プレートまたはフラスコ）上で培養する。このような方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６７７７２３１号に開示されている通りである。この方法論によれば、脂肪吸引物は脂肪組織およびそれに由来する細胞から得られる。この方法論の過程で、細胞は、夾雑残渣および赤血球を除去するために好ましくはＰＢＳで洗浄してよい。これらの細胞をＰＢＳ中コラゲナーゼ（例えば、３７℃で３０分間、０．０７５％コラゲナーゼ；Ｉ型、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）で消化する。残留する赤血球を除去するために、消化サンプルを洗浄し（例えば、１０％ウシ胎仔血清で）、１６０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣｌＮＨ４で処理し、最後に、ＤＭＥＭ完全培地（１０％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）に懸濁させることができる。これらの細胞を４０μｍナイロンメッシュで濾過することができる。

これらの細胞をＡＳＣの接着に適した表面、例えば、プラスチックを含んでなる好適な組織培養容器で培養する。非接着細胞は、例えば、好適なバッファー中で洗浄することによって除去し、接着性間質細胞（例えば、ＡＳＣ）の単離された集団を得る。このようにして単離された細胞を組織培養フラスコに播種し（好ましくは、２〜３×１０４細胞／ｃｍ２）、培養培地を３〜４日ごとに交換しつつ、３７℃および５％ＣＯ２で拡大培養することができる。細胞は好ましくは接着表面から解離させ(deatxhed)（例えば、トリプシンの手段による）、培養物が９０％前後の集密度に達した際に新しい培養フラスコに移す（「継代する」）（１，０００細胞／ｃｍ２）。

細胞単離は、好ましくは、無菌またはＧＭＰ条件下で行う。

１つの実施態様では、方法は、（ａ）対象から脂肪組織を採取すること；（ｂ）酵素消化により細胞懸濁液を得ること；（ｃ）該細胞懸濁液を沈殿させ、該細胞を培養培地に再懸濁すること；（ｄ）該細胞を少なくとも約１０日間培養すること；および（ｇ）該細胞を少なくとも２回の培養継代の間拡大培養することを含んでなる。

脂肪組織由来間質幹細胞は同種異系(alloegenic)であり、すなわち、最終的な脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物が導入される対象の脂肪組織から単離されたものではない。

特定の実施態様では、前記細胞は、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、または少なくとも約３０日間培養される。一般に、培養系での細胞の拡大培養は、その細胞集団における細胞表現型の均一性を高め、その結果、実質的に純粋なまたは均一な集団が得られる。

特定の実施態様では、細胞は、少なくとも３回の培養継代の間培養系で拡大培養され、すなわち「少なくとも３回継代される」。他の実施態様では、細胞は、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回継代される。細胞は、前記細胞集団における細胞表現型の均一性を高めるために、４回以上継代されることが好ましい。実際には、細胞表現型の均一性が高められ、特異な能力が維持される限り、細胞を無制限に培養系で拡大培養されてよい。

特定の実施態様では、細胞は、少なくとも３回の集団倍加の間、培養系で増殖させる。特定の実施態様では、細胞は、少なくとも４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回または２０回の集団倍加の間、培養系で拡大培養される。特定の実施態様では、細胞は、７回、８回、９回、１０回、１５回または２０回以内の集団倍加の間、培養系で拡大培養される。特定の実施態様では、細胞は、約５〜１０回の間の集団倍加の間、培養系で拡大培養される。特定の実施態様では、細胞は、約１０〜１５回の間の集団倍加の間、培養系で拡大培養される。

特定の実施態様では、細胞は、約１５〜２０回の間の集団倍加、例えば、約１６回の集団倍加の間、培養系で拡大培養される。

細胞は、幹細胞の培養のための当技術分野で公知の任意の技術により培養してよい。様々な培養技術、ならびにそれらのスケールアップについての考察は、Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, Wiley-Liss 2000に見出すことができる。細胞は、培養フラスコまたは大規模拡大培養に好適なバイオリアクターを用いて拡大培養され得る。間葉系間質細胞の大規模拡大培養に好適なバイオリアクターは市販されており、２Ｄ（すなわち、実質的に平面）および３Ｄ拡大培養バイオリアクターが含まれ得る。このようなバイオリアクターの例としては、限定されるものではないが、プラグフローバイオリアクター、灌流バイオリアクター、連続撹拌タンクバイオリアクター、固定床バイオリアクターが挙げられる。特定の実施態様では、細胞は単層培養により培養される。１つの実施態様では、細胞は、以下の実施例Ａに記載されるように培養および継代される。

組織培養において間質細胞を支持し得るいずれの培地も使用可能である。線維芽細胞の増殖を支持する培養処方物としては、限定されるものではないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α改変最少必須培地(αＭＥＭ)、およびRoswell Park Memorial Institute Media 1640(RPMI Media 1640)などが挙げられる。一般には、間質細胞および／または軟骨細胞の増殖を支持するために、上記培地に、０〜２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）または１〜２０％ウマ血清を添加する。しかしながら、間質細胞および軟骨細胞にＦＢＳ中必要な増殖因子、サイトカイン、およびホルモンが確認され、増殖培地中に適当な濃度で供給されるならば、合成培地も使用できる。本発明の方法に有用な培地には、１以上の対象化合物を含めてよく、限定されるものではないが、抗生物質 間質細胞の分裂促進または分化化合物が挙げられる。これらの細胞は、加湿インキュベーター中、３１℃〜３７℃の間の温度で増殖させる。二酸化炭素含量は２％〜１０％の間に、酸素含量は１％〜２２％の間に維持する。細胞はこの環境で最大４週間維持され得る。

培地に補充可能な抗生物質としては、限定されるものではないが、ペニシリンおよびストレプトマイシンが挙げられる。化学的に定義された培養培地中のペニシリンの濃度は約１０〜約２００単位／ｍｌである。化学的に定義された培養培地中のストレプトマイシンの濃度は約１０〜約２００ｕｇ／ｍｌである。

前記脂肪組織由来間質幹細胞は、プラスミド、ウイルス、または代替ベクター戦略を用いて、対象とする核酸で安定的にもしくは一過性にトランスフェクトまたは形質導入し得る。対象とする核酸としては、限定されるものではないが、修復する組織のタイプ、例えば、腸壁または膣壁に見られる細胞外マトリックス成分の生産を増強する遺伝子産物をコードするものが挙げられる。

前記間質幹細胞への調節遺伝子を有するウイルスベクターの形質導入は、塩化セシウムバンディングまたは他の方法により精製したウイルスベクター（アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、または他のベクター）を用いて多重感染度（ウイルス単位：細胞）１０：１〜２０００：１の間で実施することができる。細胞を、陽イオン性洗剤、例えば、ポリエチレンイミンまたはリポフェクタミン（商標）の不在または存在下の血清不含または血清含有培地中の前記ウイルスに１時間〜２４時間の間曝す(Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502；Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49)。

幹細胞にベクターまたはプラスミドを移入するための他の好適な方法としては、脂質／ＤＮＡ複合体、例えば、米国特許第５，５７８，４７５号；同第５，６２７，１７５号；同第５，７０５，３０８号；同第５，７４４，３３５号；同第５，９７６，５６７号；同第６，０２０，２０２号；および同第６，０５１，４２９号に記載されているものが含まれる。好適な試薬としては、膜濾過した水中の、ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ名：Ｎ−［２−（２，５−ビス［（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキシペンチル）アミノ］エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテートと、中性脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との３：１（ｗ／ｗ）リポソーム処方物であるリポフェクタミンが含まれる。例としては、処方物リポフェクタミン２０００ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能 ＃１１６６８０１９）がある。他の試薬としては、ＦｕＧＥＮＥＴＭ ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（８０％エタノール中の非リポソーム形態の脂質と他の化合物のブレンド、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．から入手可能 ＃１８１４４４３）；およびＬｉｐｏＴＡＸＩＴＭトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．製の脂質処方物、＃２０４１１０）が含まれる。幹細胞のトランスフェクションは、例えば、M. L. Roach and J. D. McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185:1に記載されるように、エレクトロポレーションにより実施することができる。安定な遺伝子変化を有する幹細胞を作出するために好適なウイルスベクター系は、アデノウイルスおよびレトロウイルスに基づいたものでよく、市販のウイルス成分を用いて調製してよい。

前記間質幹細胞への調節遺伝子を有するプラスミドベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシウムＤＮＡ沈降法または陽イオン性洗剤法（リポフェクタミン（商標）、ＤＯＴＡＰ）の使用により単層培養で、またはプラスミドＤＮＡベクターを生体適合性ポリマーに直接組み込むことによる三次元培養で、細胞に導入することができる(Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5:753-759)。

これらの遺伝子によりコードされる機能タンパク質の追跡および検出のため、前記ウイルスまたはプラスミドＤＮＡベクターは、容易に検出可能なマーカー遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ酵素（これらはいずれも組織化学的手段により追跡することができる）を含む。

４．肛囲複雑瘻孔の治療
本発明は、拡大培養された同種異系脂肪組織由来間質幹細胞を用いたクローン病患者における肛囲複雑瘻孔の治療に関する。脂肪組織由来間質幹細胞は一般に、「Ｃｘ６０１」と呼称されることもある本明細書に記載の脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物を含んでなる。しかしながら、脂肪組織由来間質幹細胞の他の調製物も、本明細書に記載の方法、例えば、米国特許第６，７７７，２３１号および同第６，５５５，３７４号、ならびに２００５年２月２５日出願の米国特許出願第１１／０６５，４６１号「Identification and Isolation of Multipotent Cells From Non-Osteochondral Mesenchymal Tissue」に記載されているものなどに用いてよい。

実施例は、同種異系ｅＡＳＣがクローン病患者における肛囲複雑瘻孔に驚くほど有効な療法であることを示し、単回の投与で最も治療が困難な従前の治療に奏効しなかった非常に複雑な瘻孔にさえ、迅速かつ持続的な治療効果を提供することができる。例えば、利益は、一般に療法から６週間前後に見られ、その利益は一般に２４週間持続する。

１つの実施態様では、クローン病患者の複雑難治性肛囲瘻孔を治療する方法は、約１億２千万の拡大培養された同種異系脂肪組織由来間質幹細胞を瘻孔の全管の病巣内に注入することを含んでなる。疑念を避けるため、本実施態様では、約１億２千万の細胞は１回の手順で患者に投与され、各瘻管はこの用量の少なくとも一部を受容する。この用量のおよそ半分は１または複数の内口周囲の組織に注入される。もう半分は、瘻管に沿った瘻壁（２ｍｍ以下の深さ）に注入されて、数個の微小水疱を形成する。実施例のデータは、この単回投与が２４週間以内、さらには６週間前後までまたは８週間前後までに混合寛解を提供できることを示す。よって、１つの実施態様では、この治療は１億２千万のｅＡＳＣの単回の病巣内投与からなる。

病巣内注入は一般に、例示された臨床試験と同様に行われ、細胞懸濁液は内口（肛門から侵入するシリンジで）また瘻管壁（瘻の外口から侵入するシリンジで）を介して注入される。

患者は男性であっても女性であってもよい。患者は一般に成人である。

１つの実施態様では、施されている場合がある排液線をまず除去する。一般に、瘻孔は、ｅＡＳＣの投与前に掻爬する。内口は、場合により縫合してもよい。次に、ｅＡＳＣを細く長い針で投与する。上記で述べたように、用量のおよそ半分を、縫合した内口周囲の組織に注入する。もう半分は、瘻管に沿った瘻壁（２ｍｍ以下の深さ）に注入されて数個の微小水疱を形成する。

本発明による療法の前に、外科手術をガイドするためにスクリーニング時に骨盤ＭＲＩスキャンを行ってもよい。患者はまた、治験薬投与２週間前以前に、臨床的に指示される場合には瘻孔の掻爬および排液線の留置を受けてもよい（図１）。排液線が留置される場合、その排液線は治験薬投与直前に抜去される。

処置される患者は、クローン病、一般に、管腔型クローン病(luminal Crohn’s disease)を有する。一般に、患者は、例えば、クローン病活動指標（ＣＤＡＩ）(Crohn’s Disease Activity Index)≦２０^Ａ２４によって定義されるような非活動性または軽度活動性型クローン病を有している。患者は少なくとも６か月クローン病を有していたものであり得る。

患者は、少なくとも１つの肛囲複雑瘻孔を有する。１つの実施態様では、患者は、直腸膣瘻、直腸狭窄、肛門狭窄、活動性重度直腸炎（表在性または深部潰瘍の存在により定義される）、ダイバーティングストーマ(diverting stoma)または外科的手法によっては消散しなかった＞２ｃｍの潰瘍もしくは集塊を持っていない。

患者は少なくとも１つの従前の薬物療法に難治性である。従前の療法は、小分子薬または生物学的医薬品であり得る。一般に、患者は、少なくとも約４、６、１２、１８、２４または３６週間前記処置を受けていてなお活動性疾患の症状を呈する。言い換えれば、少なくとも約４、６、１２、１８、２４または３６週間の処置の後であっても瘻孔の重篤度が改善されない。従前の療法は、抗生物質療法、例えば、シプロフロキサシンまたはメトロニダゾール、免疫抑制剤療法（例えば、プリン類似体、例えば、アザチオプリンまたは６−メルカプトプリン、ピリミジン類似体、例えば、フルオロウラシル、または葉酸類似体、例えば、メトトレキサート(methotrexate)）、または抗ＴＮＦ療法、例えば、アダリムマブ（ヒュミラ）、セルトリズマブ（シムジア）、エタネルセプト（エンブレル）、ゴリムマブ（シンポニー）、またはインフリキシマブ（レミケード）であり得る。適格患者は一般に、以下の処置の少なくとも１つに難治性（奏効しない）である：１か月の抗生物質（例えば、シプロフロキサシン、メトロニダゾール）の後；および／または３か月の免疫抑制剤（例えば、 アザチオプリン、６−メルカプトプリン）の後；および／または安定用量での抗ＴＮＦ療法（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ）の誘導または維持。

１つの実施態様では、患者は、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン）およびＴＮＦ−α阻害剤（例えば、インフリキシマブまたはアダリムマブ）に対して治療難治性である。

よって、典型的な患者は、抗生物質、免疫抑制剤または抗ＴＮＦ療法の１以上に十分な奏効を示さない、１または２つの内口と２または３つの外口を有する肛囲複雑瘻孔を有する、少なくとも６か月間診断された非活動性管腔型クローン病（ＣＤＡＩ≦２２０）を有する。１または２つの内口と３つの外口を有する瘻孔は極めて複雑であり、これまで治療が極めて困難であった。さらなる実施態様では、本発明による処置の時点で、患者は、（ａ）抗ＴＮＦ療法も免疫抑制剤療法も受けていないか、または（ｂ）抗ＴＮＦ療法と免疫抑制剤療法の療法を受けている。ｅＡＳＣが現行で利用可能な最良の療法である抗ＴＮＦおよび免疫抑制療法を受けている患者において混合寛解(remisison)を有意に改善することができる（２４週目）ことは特に驚くことである（図３Ｃ参照）。

肛囲複雑瘻孔は、少なくとも２つの外口、例えば、３以上の外口を有する。一部の瘻孔は、４または５つの外口を有することがある。

肛囲複雑瘻孔は一般に、複数の瘻管、少なくとも２つの内口、または３つの外口を有する。瘻孔は場合により、これらの特徴のうち２つまたは３つ、例えば、複数の瘻管と少なくとも２つの内口；複数の瘻管と３つの外口；少なくとも２つの内口と３つの外口；または複数の瘻管と少なくとも２つの内口と３つの外口を含んでなり得る。１つの実施態様では、肛囲複雑瘻孔は、２つ以下の内口および３つの外口を含み、例えば、瘻孔は、１または２つの内口と２または３つの外口からなる（例えば、１ＩＯ／２ＥＯ、１ＩＯ／３ＥＯ、２ＩＯ／２ＥＯ、または２ＩＯ／３ＥＯ）。

ｅＡＳＣ投与後、患者は所望により、４週間以内、抗生物質で処置してもよい。免疫抑制剤および抗ＴＮＦは、処置中、例えば、奏効、臨床的寛解または混合寛解まで安定な用量で維持されてもよい。

抗生物質を含め、肛囲瘻孔形成クローン病に対して従前の処置を受けていなかった患者、および体液排出または串線留置以外の活動性瘻孔の事前処置を受けていた患者は一般に除外される。患者は一般に、ｅＡＳＣ処置の直前４週間以内にグルココルチコステロイドを受けていれば処置に不適格である。ステロイドコースは、最大１２週間にわたって記録された開始用量４０ｍｇでの経過観察中に管腔疾患の再燃を処置するために行われ得る。

例えば、細胞の初回送達が不十分である特定の実施態様では、前記方法は、ｅＡＳＣＳのさらなる投与をさらに含んでなり得る。このさらなる投与は、（ｃ）場合により縫合閉鎖された）内口および瘻壁に、例えば本発明の脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物において、少なくとも約２０×１０^６細胞、少なくとも約３０×１０^６、または少なくとも約４０×１０^６の脂肪組織由来間質幹細胞、例えば、約１億２千万個の細胞の第２用量を送達することをさらに含んでなり得る。

いくつかの実施態様では、対象における難治性肛囲複雑瘻孔を治療する方法は、（ａ）内口を、同種異系ｅＡＳＣを含んでなる縫合糸で閉鎖することを含んでなる。前記対象脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物中の細胞でコーティングされたこのような縫合糸は、引用することにより本明細書の一部とされる、２００５年２月１４日出願の米国特許出願第１１／０５６，２４１号に詳細に記載されている。

前記方法は、いくつかの実施態様において、少なくとも１つの瘻管を深く掻爬すること(deep scraping)；および／または該瘻管に材料を充填することをさらに含んでなる。特定の実施態様では、前記方法は、前記材料に、例えば、対象細胞組成物由来の、少なくとも約１０×１０^６の脂肪組織由来間質幹細胞を送達することをさらに含んでなり得る。一般に、前記材料はフィブリンベースのポリマーまたは接着剤、例えば、フィブリン糊またはゲルである。特定の実施態様では、例えば、前記材料が前記脂肪組織由来幹細胞含有組成物を含んでなるように、少なくとも約１０×１０^６の用量の脂肪組織由来間質幹細胞が前記材料内にすでに包含されている。

さらなる実施態様では、対象において瘻孔を治療する方法は、
（ｉ）少なくとも１つの瘻管を深く掻爬すること、
（ｉｉ）掻爬された管の内口を縫合糸で閉鎖すること、
（ｉｉｉ）（場合により縫合閉鎖された）内口および瘻壁に、例えば、本発明の脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物において、約１億２千万個の同種異系の(alloegeneic)拡大培養された脂肪組織由来間質幹細胞を送達すること
を含んでなる。

細胞のさらなる投与は必要とされず、場合により省かれてもよい。しかしながら、特定の実施態様では、該方法は、
（ｉｖ）一般に縫合閉鎖された内口に、例えば、本発明の脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物において、少なくとも約２０×１０^６の細胞、少なくとも約３０×１０^６、または少なくとも約４０×１０^６の脂肪組織由来間質幹細胞、例えば、約１億２千万個のｅＡＳＣの第２用量を送達すること
をさらに含み得る。

工程（ｉ）は一般に、治療する総ての瘻管を深く掻爬することにより行われ、例えば、掻爬用針(a curettage needle)を瘻管内に挿入し、瘻壁を掻爬することにより誘発出血を引き起こして、天然フィブリンを得、そのフィブリンが瘻管を満たす。本発明者らによるこれまでの臨床研究では、この掻爬法(scraping method)により生じた天然フィブリンは、人工フィブリンシーラントの使用に比べて好ましい選択肢であることが示唆され、従って、本発明の方法の好ましい実施態様では、治療する瘻管にこのような材料を充填しない。

工程（ｉｖ）は、細胞、例えば、脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物の、瘻管に沿った瘻壁への注入による、局所送達によって行われる。例えば、３ｃｍの瘻管に沿って１千万個の細胞を複数回注入する。

瘻孔は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、切開、カテーテルなどにより外科的修復に関して評価され得る。

上記の方法は、治療を受けている対象に治療薬を、例えば全身的にまたは縫合部位に局所的に投与することをさらに含み得る。特定の実施態様では、脂肪組織由来間質幹細胞は、上記のように、治療薬を含有する脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物に処方される。他の実施態様では、前記治療薬は、別々に、例えば、前記方法と同時に、前記方法を実施する前に、または前記方法を実施した後に投与される。いくつかの実施態様では、治療薬は、該方法を対象に実施する前、実施中、および実施した後に、その対象に投与される。例示的な治療薬は上記されている。好ましい実施態様では、クローン病の治療のための治療薬が対象に投与される。例示的なクローン病治療薬は、抗炎症薬（メサラミンを含む薬剤など）、免疫抑制薬（６−メルカプトプリンおよびアザチオプリンなど）；生物学的製剤（インフリキシマブ（レミケード（登録商標））など）、抗生物質、および下痢止め薬（ジフェノキシラート、ロペラミド、およびコデインなど）である。

補助的治療を必要とする場合がある。例えば、ＧＶＨＤを予防するために、当技術分野で公知の方法に従って、治療前、治療中、および／または治療後に免疫抑制薬を投与してよい。また、投与前に、当技術分野で公知の方法に従って、対象から細胞への、またはその逆の免疫反応を抑制するように細胞を改変してもよい。

いずれの治療薬の用量も、患者の徴候、年齢、および体重、治療または予防する障害の性質および重篤度、投与の経路、ならびに薬剤の形態によって変わる。対象とする処方物はいずれも１回量または分割量で投与してよい。治療薬の用量は、当業者に公知の技術により、または本明細書で教示されるように、容易に決定され得る。また、２つ以上の治療薬の混合物を投与してもよく、または複数の治療薬を別個の組成物として投与してもよい。

特定の患者において最も効果的な治療をもたらす任意の特定の薬剤の正確な投与時間および量は、特定の化合物の活性、薬物動態、およびバイオアベイラビリティ、患者の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類および病期、健康状態、特定の用量に対する反応性、および投薬の種類を含む）、投与の経路などによって変わる。治療を最適化するために、本明細書で示されるガイドラインを用いて、例えば、投与の最適な時期および／または量を決定することができ、その決定には、対象をモニタリングし、用量および／または時機を調整することからなる慣例の実験を超えるものを必要としない。

対象が治療を受けている間、患者の健康状態は２４時間の間、所定の時点で１以上の関連する指標を測定することによりモニタリングされ得る。このようなモニタリングの結果に応じて、補給物、量、投与時期、および処方を含む治療を最適化し得る。改善の程度を確認するために、同じパラメーターを測定することにより、定期的に患者を再評価することができ、そのような最初の再評価は一般に療法開始から終わった時点で行い、その後の再評価は療法中４〜８週間ごとに、さらにその後は３ヶ月ごとに行う。療法は数か月またはさらには数年続けてもよく、最低１ヶ月がヒトに対する療法の典型的な長さである。これらの再評価に基づいて、投与する薬剤の量、場合によっては、投与の時期の調整を行うことができる。

本明細書で例示される瘻の混合寛解は、臨床的および放射線学的両方の寛解を含んでなる。寛解の放射線学的評価は一般に、周知の技術であるＭＲＩにより行われる。直腸内超音波検査などの他のイメージング技術も代用可能である。これらのイメージング技術は、腫瘍(ascesses)または集塊の存在を評価する。

治療は、化合物の最適用量に満たないより低用量で開始してよい。その後、最適な治療効果が得られるまで、その用量を少しずつ増やしてよい。

異なる成分の効果の発現および持続期間は相補的(complimentary)なものであり得るため、いくつかの治療薬を併用することにより任意の個別成分の必要用量が減少する可能性がある。このような併用療法では、異なる活性薬剤を一緒にまたは別々に、および同時にまたは１日のうちの異なる時間に送達してよい。

対象化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ_５０およびＥＤ_５０を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順により決定され得る。高い治療指標を示す組成物が好ましい。有害な副作用を示す化合物を用いてもよいが、副作用を軽減するために、薬剤を所望の部位に標的化する送達系を設計するよう注意を払うべきである。

細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおける使用のために一定範囲の用量を処方するのに用いてよい。いずれの治療薬、あるいはその中のいずれの成分の用量も一般に、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、使用する投与形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変更可能である。本発明の薬剤の場合、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養物で決定されるＩＣ_５０（すなわち、徴候の最大阻害の５０％を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量がさらに正確に決定され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。

５．臨床奏効および寛解
本発明の同種異系ｅＡＳＣは、クローン病患者における難治性肛囲複雑瘻孔の治療で驚くほど有効である。主要評価項目である２４週目の混合寛解は統計的に満たされ、Ｃｘ６０１はプラセボよりも統計的に優れている。重要な副次的評価項目である２４週目の臨床的寛解と奏効は両方ともベースラインの統計的有意性を満たす（それぞれＩＴＴ集団ではｐ＝０．０６４およびｐ＝０．０５４；ｍＩＴＴ集団ではｐ＝０．０５７および０．０４５）。

これらのデータは、ｅＡＳＣの単回投与を受けた患者の臨床的寛解に達する機会がプラセボよりも３０％大きいことを示す。これらのデータはまた、ｅＡＳＣを受けた患者の臨床奏効に達する機会がプラセボよりも３５％前後多いことも示す。

特定の実施態様では、臨床的寛解は、２４週間以内、一般に１８週間以内に達成される。臨床的寛解は１２週間以内またはそれより早く、例えば、１０週間以内、または８週間以内に達成され得る。臨床的寛解は場合により６週間後に達成され得る。これらのデータは、臨床的寛解までの中央時間がＣｘ６０１ではプラセボの１／２前後であることを示す（６．７週間と１４．６週間）。よって、１つの実施態様では、臨床的寛解は、１４週間以内に達成される。

いくつかの実施態様では、混合寛解は、２４週間以内、一般に１８週間以内に達成される。混合寛解は場合により、１２週間以内、またはそれより早く、例えば、１０週間以内、または８週間以内に達成され得る。混合寛解は場合により、６週間後に達成され得る。

特定の実施態様では、臨床奏効は、１１週間以内に達成される。これらのデータは、臨床的寛解までの中央時間がプラセボの１／２前後であることも示す（６．３週間と１１．７週間）。臨床奏効までの時間は、特定の実施態様では、１０週間以内、９週間以内、８週間以内であり得る。臨床奏効までの時間は場合により、７週間以内、例えば、６週間前後であり得る。

これらの結果は、これらの改善がｅＡＳＣの単回投与の後に見られることが示される場合に特に驚くことである。

肛門周囲病変活動性指標「ＰＤＡＩ」は、５つの分類：排出、疼痛、性活動の制限、肛門周囲病変の種類および硬化の程度を含んでなる。各分類は無症状（スコア０）から重度の症状（スコア４）の範囲の５点尺度で等級付けされる。肛門周囲病変活動指標スコアの改善は、６、１２および１８週目にプラセボよりもｅＡＳＣで有意に大きいことが観察される。よって、特定の実施態様では、ＰＤＡＩの改善は、６週間以内、１２週間以内または１８週間以内に達成される。ＰＤＡＩの改善は場合により、１．５ＰＤＡＩ点より大きい、場合により少なくとも２ＰＤＡＩ点の改善であり得る。ＰＤＡＩの改善は場合により、前記指標の５成分のそれぞれの低下（改善）であり得る。

６．キット
他の実施態様では、本発明は、脂肪組織由来間質幹細胞含有組成物と、場合によりそれらの使用説明書を含むキットに関する。本発明の医薬組成物および生体材料を含んでなるキットもまた本発明の範囲内である。キットの成分は、上述の方法を手動で実施するために、または部分的もしくは完全に自動で実施するためにパッケージングし得る。このようなキットは、例えば、療法、修復、生体材料の調製および他の適用を含む様々な用途を持ち得る。

例示
本発明を一般的に説明してきたが、次の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。これらの実施例は、単に本発明の特定の面および実施態様を例示するために含まれ、本発明を限定することを意図しない。

第ＩＩＩ相臨床試験
本試験は、単独またはクローン病患者の治療難治性肛囲複雑瘻孔のための現行の医学的療法に加えてのＣｘ６０１の有効性および安全性を評価する最初のプラセボ対象第３相試験である。

全体的に見れば、これらの結果は、同種異系のｅＡＳＣが、非活動性／軽度活動性管腔型クローン病を有する成人患者において、瘻孔が少なくとも１つの従来の療法または生物学的療法に不十分な応答しか示さない場合に、肛囲複雑瘻孔の治療のために指示されることを実証する。

方法
試験の管理
本第３相無作為化二重盲検並行群間プラセボ対照試験（ＮＣＴ０１５４１５７９；ＥＵＤＲＡＣＴ ２０１１−００６０６４−４３）は、２０１２年７月〜２０１５年７月に欧州７カ国およびイスラエルの４９の医療センターで実施された。プロトコールは中央または現地倫理委員会により承認された。総ての患者がインフォームド・コンセントに署名した。

本試験はＡＤＭＩＲＥ運営委員会により計画および実施された（捕捉付録参照）。治験依頼者がデータを収集し、それがチルターン・インターナショナルの生物統計部により解析され、治験依頼者が運営委員会とともにそれらのデータを解釈した。総ての著者がこれらのデータの総てにアクセスし、刊行用の最終稿を提出するという決定に合意し、報告されたデータの精度および完全性を保証した。現行は第１著者により草案され、総ての著者が以降の草稿に寄稿した。

患者
適格患者は１８歳以上の成人であり、６か月以上、クローン病活動指標（ＣＤＡＩ）≦２２０^Ａ２４により定義される非活動性または軽度活動性管腔型クローン病を有し、登録前に６週間以上体液排出をしていた最大２つの内口と３つの外口を有する肛囲複雑瘻孔を有した（以下のうち１以上と定義される：高位括約筋間、括約筋貫通、括約筋外または括約筋起源；≧２の外口；または集塊の随伴）。患者は、直腸膣瘻、直腸および／もしくは肛門狭窄、ならびに／または活動性重度直腸炎（表在性または深部潰瘍の存在によって定義）、ダイバーティングストーマ、または外科的手法によっては消散しなかった２ｃｍを超える潰瘍もしくは集塊を持っている場合には除外した。適格な患者は、１か月の抗生物質（シプロフロキサシン、メトロニダゾール）の後ならびに／または３か月の免疫抑制剤（アザチオプリン、６−メルカプトプリン）および／もしくは安定用量での抗ＴＮＦ療法の誘導または維持の後に奏効無しと報告された以上の処置のうち少なくとも１つに難治性でなければならなかった。抗生物質に対してのみ難治性の患者は、総集団の＜２５％に相当すると思われた。

治験薬投与後、患者は４週間以下の期間、抗生物質で処置可能であった。免疫抑制剤および抗ＴＮＦは試験中、安定用量で維持された。これらの薬剤の開始または用量増加は許容されなかった。

抗生物質を含め、肛囲瘻孔形成クローン病の事前の処置を受けていなかった患者、および体液排出または排液線留置以外の活動瘻に対する事前の手術を受けていなかった患者も除外した。患者は、過去４週間以内にグルココルチコステロイドを受容していた場合には不適格であった。ステロイドコースは、最大１２週間にわたって記録された開始用量４０ｍｇでの経過観察中に管腔疾患の再燃を処置するために行われた。

無作為化および処置
外科手術をガイドするためにスクリーニング時に骨盤ＭＲＩスキャンを行い、中央盲検読影により集塊を評価した。加えて、患者は、治験薬投与２週間前以前に、臨床的に指示される場合には、麻酔下での検査、瘻孔の掻爬および排液線の留置を受けた（図１）。排液線が留置された場合、その排液線は治験薬投与直前に抜去しなければならなかった。

患者は、治験薬投与の２週間以前に瘻孔の処置受診の後、Ｃｘ６０１またはプラセボに１：１比で無作為に割り付けられた（図１）。患者は、無作為化時に並行投薬に基づいて層別化された（抗ＴＮＦおよび／または免疫抑制剤またはどちらも無し）。処置は、リニカル社の生物統計部により作成された、事前に準備された無作為化リストを用いて割り付けられた。

Ｃｘ６０１区の患者は、病巣内分配される１億２千万のＣｘ６０１の単回注射を瘻管内に受けた。Ｃｘ６０１の単離および拡大培養は従前に記載されるように行った^Ａ２３。プラセボ区の患者は、同じ容量の生理食塩水を受けた。試験処置は、存在する場合には排液線を除去し、瘻孔を掻爬した後に、細く長い針で投与した。用量の半分を縫合した内口周囲の組織に注入した。もう半分は、瘻管に沿った瘻壁に注入され（２ｍｍ以下の深さ）、数個の微小水疱を形成した。

細胞懸濁液は生理食塩水と明らかに異なっていたので、処置の盲検化は不可能であった。二重盲検試験計画は、非盲検外科医および盲検胃腸病専門医により投与される処置と奏効を評価する放射線科医によって維持された。

試験手順および経過観察
瘻孔閉鎖は、６、１２、１８および２４週目に、処理済みの外口における自然体液排出および指で軽く加圧した後の体液排出の存在^Ａ１２を検査する検査士により臨床的に評価され、２４週目に盲検、中央読影骨盤ＭＲＩスキャンにより放射線学的に評価された；中央読影者は、処置済み瘻孔を特定するための図を提供されたが、患者データ、検査の順序および受けた処置については伏せられた。治療下発現有害事象(Treatment-emergent adverse events)（ＴＥＡＥ）は、総ての治験受診時に評価した。肛門周囲クローン病の重篤度は、ベースライン時と総ての治験受診時に肛門周囲病変活動性指標（ＰＤＡＩ）^Ａ２５を用いて評価した。生活の質は、ＣＤＡＩ^Ａ２４と同様に、ベースライン時と２４週目に炎症性腸疾患質問票(Inflammatory Bowel Disease Questionnaire)（ＩＢＤＱ）^Ａ２６を用いて評価した。

有効性および安全性評価項目
主要評価項目は、ベースライン時に体液を排出していた総ての処置済み外口の閉鎖の臨床評価、および盲検中央ＭＲＩ読影（Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａ ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ）により確認され３寸法のうち２つ以上での処置済み肛囲瘻孔の２ｃｍを超える集塊の不在として定義される、２４週目の混合寛解であった。閉鎖の臨床評価は、指で軽く圧迫しても排出がないことと定義した^Ａ１２。

２つの重要な副次的有効性評価項目が存在した：２４週目までの臨床的寛解（すなわち、ベースライン時に体液を排出していた総ての処置済み外口が指で軽く圧迫しても閉鎖していること）および奏効（すなわち、ベースライン時に体液を排出していた総ての処置済み外口の５０％以上の閉鎖）。他の副次的有効性評価項目として、臨床的寛解までの時間、奏効までの時間、２４週までのＰＤＡＩ、ＣＤＡＩおよびＩＢＤＱスコアが含まれた。

ＴＥＡＥは、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓバージョン１７．０に従ってコード化した。

統計分析
２０８名（各群１０４名）以上の患者を無作為化するために、スクリーニングを予定したサンプルサイズは２７８名であった。このサンプルサイズは、α過誤０．０２５および検出力８０％で、Ｃｘ６０１とプラセボの間で混合寛解を有する患者のパーセンテージにおいて最小２５％の差異を検出するために十分であり（予想される最小混合寛解率は、Ｃｘ６０１では５０％、プラセボでは２５％であった^{Ａ８，Ａ１２，Ａ２３，Ａ２７}）、患者の２０％に試験の中止が許容された。

有効性分析は、全無作為化患者を含んだ治療企図（ＩＴＴ）集団、試験処置を受容し、かつ、≧１のベースライン後有効性評価を持っていた全無作為化患者を含んだ修正ＩＴＴ（ｍＩＴＴ）集団、および大きなプロトコール逸脱のない全処置患者を含んだパープロトコール(per protocol)（ＰＰ）集団で行った。ＴＥＡＥは、試験処置を受容した全患者と定義される安全性集団で分析析した。

主要評価項目を、無作為化層（すなわち、無作為化時におけるクローン病処置）に関して補正する層化コクラン・マンテル・ヘンツェル検定(Cochran-Mantel-Haenszel test)を用いて分析した。一次分析はＩＴＴ集団を用いて行った。本発明者らはまた、他の無作為化臨床試験でｍＩＴＴ集団の定義がＩＴＴ集団により密接に類似しており、より信頼性の高い処置効果の評価をもたらすことから、ｍＩＴＴ集団に関する結果も示す。欠落しているデータは、last-observation-carried-forward（ＬＯＣＦ）法を用いて補完した。ベースライン後ＭＲＩスキャンまたは臨床評価が２４週までに行われなかった場合には非奏効／非寛解が補完された。また、２４週までに救済イベントが行われた場合にも非奏効／非寛解が補完された。有効性に対する救済イベントおよび欠落データ慣例の効果は、主要評価項目の感度分析で調べた。

多重度の問題に取り組むために、ゲートキーパーとして機能する主要有効性評価項目とともに、総合第一種過誤を制御するためのホッホバーグ検定法^Ａ２８を用いたゲートキーピング法を用いて、２つの重要副次的評価項目（２４週までの臨床的寛解および奏効）を短期ファミリーに分類した。統計的有意性は、両側第一種過誤水準０．０５で評価した。非重要副次的評価項目については多重度の統計的補正は行わなかった。パーセンテージおよび処置の差をワルドの漸近法で計算した９５％信頼区間（ＣＩ）で表した。臨床的寛解および奏効までの時間は、カプラン・マイヤー推定値を用いて分析した。安全性転帰は記述統計で示した。

ＳＡＳ Ｓｙｓｔｅｍ ｖ９．１．３以降を統計分析に使用した（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、ケーリー、ＮＣ、ＵＳＡ）。

結果
合計２８９名の患者をスクリーニングし、そのうち２１２名をＣｘ６０１またはプラセボで無作為化した（図２）。これらの２群のベースライン特性は類似していた（表１）。患者の大多数は過去６か月の間に１以上のクローン病処置を受けていた。プラセボ群に比べてＣｘ６０１群では、より高い割合の患者が多管瘻を有していた（それぞれ４６．６％および３０．４％）。合計１７１名の患者（８０．７％）が２４週の経過観察を完了した。試験中、Ｃｘ６０１群の１名の患者とプラセボ群の４名の患者がクローン病の再燃のためにステロイドを受けた。

有効性
ＩＴＴ集団（それぞれ４９．５％および３４．３％；差異［９７．５％ＣＩ］：１５．２％［０．２〜３０．３］；ｐ＝０．０２４］）およびｍＩＴＴ集団（５１．５％および３５．６％；１５．８％［０．５〜３１．２］；ｐ＝０．０２１；図３ＡおよびＢ）ではプラセボに対して有意に高い割合のＣｘ６０１処置患者が２４週混合寛解の主要評価項目を達成した。これらの結果は、ＰＰ集団およびさらなる感受性分析で確認された（表Ｓ１）。Ｃｘ６０１の効果は、４つの無作為化層でプラセボより大きく、Ｃｘ６０１の数的に最大の効果は、無作為化において抗ＴＮＦ療法および免疫抑制剤療法のいずれをも受けなかった患者または両方を受けた患者で見られた（それぞれ処置の差異３３．１％および２０．０％；図３Ｃ）。

ｍＩＴＴ集団では、プラセボ群に対してＣｘ６０１群では数的に多い割合の患者が２４週までに臨床的寛解を達成し（それぞれ５５．３％および４２．６％；差異［９５％ＣＩ］：１２．８％［−０．８〜２６．４］；ｐ＝０．０５７）、奏効を有した（それぞれ６８．９％および５５．４％；１３．５％［０．３〜２６．７］ｐ＝０．０４５）。

臨床的寛解までの中央時間（６．７［９５％ＣＩ、６．４〜１１．９］週間および１４．６［１１．９〜２２．９］週間）、ならびに奏効までの中央時間値（６．３［６．０〜６．６］週間および１１．７［６．７〜１２．９］週間）はＣｘ６０１ではプラセボの２分の１前後であった。

ｍＩＴＴ集団におけるＣｘ６０１によるＰＤＡＩの改善は、６週目（ベースラインからの変化としての処置の差異［９５％ＣＩ］：−１．０［−１．７〜−０．３］）、１２週目（−１．２［−２．０〜−０．４］）、および１８週目（−１．２［−２．０〜−０．３］）ではプラセボよりも有意に大きかったが、２４週目（−０．８［−１．８〜０．２］）ではそうではなかった。合計およびサブドメインＩＢＤＱおよびＣＤＡＩスコアでは、処置群間に有意差は無かった（表Ｓ２）。

安全性
ＴＥＡＥを受けたＣｘ６０１群およびプラセボ群の患者のパーセンテージは同等であった（それぞれ６６．０％および６４．７％；表２）。最もよく報告されたＴＥＡＥは、直腸痛、肛門腫瘍および鼻咽頭炎であった。Ｃｘ６０１群よりもプラセボ群でより高い割合の患者が処置関連のＴＥＡＥを受け（それぞれ２９．４％および１７．５％）、そのうち最も多いのが肛門腫瘍および直腸痛であった。ＴＥＡＥの大部分は軽度または中等度であった。ＴＥＡＥのために試験から脱落した患者は少なかったが（４．９％および５．９％）、Ｃｘ６０１群でやや高い割合の患者が重度のＴＥＡＥを受けた（１７．５％および１３．７％）。最も多い重度ＴＥＡＥは肛門腫瘍であった（Ｃｘ６０１：８．７％；プラセボ：６．９％）。死亡は無かった。

考察および概要
これはクローン病患者における、難治性の肛囲複雑瘻孔の処置の第１回大規模無作為化プラセボ対照臨床試験である。肛囲複雑瘻孔を有し、従来療法または生物学的療法に奏効しなかった患者の治療困難試験集団において、Ｃｘ６０１単独で処置したか、または現行医学療法に加えてＣｘ６０１で処置した２名の患者のうち１名が２４週目に複合臨床および放射線学的寛解に達した。Ｃｘ６０１群の患者はより多い多管瘻を有していたにもかかわらず、この結果は総ての統計集団で一貫していた。従って、これらの試験結果は、Ｃｘ６０１が難治性患者に肛囲複雑瘻孔の根治手術的アプローチに代わる最初の実閉鎖を与えることを示す。

複合臨床的および放射線学的寛解の主要評価項目は、一般に臨床奏効（すなわち、体液排出瘻孔の数の５０％以上の減少）または臨床的寛解を評価したクローン病における肛囲瘻孔に関する他の無作為化臨床試験^{Ａ８，Ａ１２}で使用されたものよりもストリンジェントである。これは、欧州クローン病および大腸炎会議のガイドライン^Ａ２９で推奨されているように、瘻孔閉鎖の臨床評価と膿腫の不在のＭＲＩ評価を用いるための第１回大規模無作為化臨床試験である。

副次的有効性分析は、Ｃｘ６０１の臨床利益を強調している。Ｃｘ６０１を用いた場合、臨床的寛解および奏効までの時間が速くなり、プラセボ群での時間の半分となった。Ｃｘ６０１群とプラセボ群の間の臨床的寛解率の差は、予想されていたものより、また、従前の試験で見られていたもの（１３〜１９％）よりも顕著に高い「プラセボ」効果（４２．６％）のために^{Ａ８，Ａ１２，Ａ２７}、統計的有意性に達しなかった。無作為化層のよるプラセボ効果（すなわち、並行抗ＴＮＦおよび免疫抑制剤の場合に最高［４６．７％］およびいずれの処置の無い場合に最低［２１．１％］）は、本試験におけるより高いプラセボ効果が並行投薬の使用によって誘導された可能性があることを示唆する。また、外科的排出および内口閉鎖もプラセボ奏効を増した可能性もある。Ｃｘ６０１群でＰＤＡＩスコアの有益な改善が見られたが、ＩＢＤＱスコアおよびＣＤＡＩスコアには処置間で差は無かった。これはおそらくベースライン時の低いＣＤＡＩ（非選択判定基準）および高いＩＢＤＱによるものであった。

安全性データは、事前の第１／２ａ相試験の結果^Ａ２３と一致して試験集団でＣｘ６０１は十分な忍容性があったことを示す。処置関連ＴＥＡＥは、プラセボ群でより頻繁に発生したので、疾患の自然経過または外科的試験手順に関連する可能性がある。好ましい安全性プロフィールは、薬物に対する免疫原性および結核を含む感染のリスクの増大からくるいくつかの重大な安全性の懸念^{Ａ３０，Ａ３１}が伴う抗ＴＮＦ療法に優る利点を示し得る。

本試験の結果は、クローン病および肛囲複雑瘻孔の患者にとっての有効かつ十分な忍容性がある新規な治療選択肢の必要を考慮すれば有望である。本試験はまた、難治性の肛囲複雑瘻孔を有するクローン病患者の医療に関して、それらの患者の多くは現行では括約筋を傷害して便失禁を招くリスクを伴う手術を繰り返し受けなければならないので大きな意味を持つ。結果として、肛囲瘻孔形成疾患を有する患者の１２〜３８％は直腸切除を要する^Ａ３２。これに対して、Ｃｘ６０１の投与は最小限の侵襲性であり、外来診療で行うことができる。

本治験の制限は、２つの内口および３つの外口を超える患者、ならびに体液排出および排液線留置以外の事前手術を伴う患者の除外であった。さらに、ＴＥＡＥが外科手術に関連していたかどうかは確認されなかった。

結論として、Ｃｘ６０１は、従来の処置および／または生物学的処置に奏効しなかったクローン病における肛囲複雑瘻孔に対する有効かつ安全な療法である。

参考文献
本発明の実施には、特に断りのない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用し、それらの技術は当技術分野の技量の範囲内である。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第2版, Sambrook, Fritsch and Maniatis編 (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. 米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al.編), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and
Walker編, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell編, 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)参照。

本明細書に記載した総ての刊行物および特許は、以下に挙げられている細目も含め、各個の刊行物または特許が引用することにより本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示される場合と同様に、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。矛盾がある場合には、本明細書におけるいずれの定義も含め本出願が優先される。

「Ａ」参考文献

均等
本発明は、特に、瘻孔を治療および予防するための方法および組成物を提供する。本発明の特定の実施態様を論じてきたが、上記の詳述は例示であって限定でない。本発明の多くの変形態様は、当業者には本明細書を読み返すことにより明らかになる。添付の特許請求の範囲は、このような総ての実施態様および変形態様を特許請求するものではなく、本発明の全範囲は、特許請求の範囲をそれらの等価物の全範囲とともに、また、本明細書をこのような変形態様とともに参照することにより決定されるべきである。

Claims (13)

1. クローン病を有する患者において難治性の肛囲複雑瘻孔の複数の管の治療のための、同種異系脂肪組織由来間質幹細胞であって、該細胞の５％未満がＣＤ３１マーカーを発現し、該細胞の少なくとも８０％が、表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現する幹細胞を含んでなる薬剤であって、
   （ｉ）１回の手順で、約１億２千万の細胞が患者に投与され、かつ、
   （ｉｉ）各瘻管はこの用量の一部を受容し、前記用量のおよそ半分は１または複数の内口周囲の組織に注入され、残りの半分は、瘻管に沿った瘻壁に注入される、
   薬剤。
2. 瘻孔が、２つの内口および／または３つの外口を含んでなる、請求項１に記載の薬剤。
3. 瘻孔が（ｉ）抗生物質、（ｉｉ）免疫抑制剤および（ｉｉｉ）抗ＴＮＦ療法のうち１以上に難治性である、請求項１または請求項２に記載の薬剤。
4. 患者が抗ＴＮＦ療法および免疫抑制剤療法のいずれも受けないか、または両方を受ける、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
5. 患者が
   （ａ）非活動性または軽度活動性クローン病；および／または
   （ｂ）管腔型クローン病
   を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤。
6. 細胞が病巣内に注入される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤。
7. 療法が混合寛解または臨床的寛解を誘導する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤。
8. 混合寛解または臨床的寛解が２４週間以内、１８週間以内または１２週間以内に達成される、請求項７に記載の薬剤。
9. 混合寛解が２４週間以内に達成される、請求項７に記載の薬剤。
10. 混合寛解または臨床的寛解が８週間以内または６週間以内に達成される、請求項８に記載の薬剤。
11. 瘻孔がＭＲＩによりモニタリングされる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬剤。
12. 前記同種異系脂肪組織由来間質幹細胞の少なくとも８０％が表面マーカーＨＬＡ Ｉ、ＣＤ４４およびＣＤ５９を発現し、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０およびＣＤ８６のうち４以上を発現しない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬剤。
13. 瘻管に人工フィブリンシーラントが充填されていない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬剤。

Images