BE1024781B1

BE1024781B1 - Von adipösem gewebe stammende stromale stammzellen zur verwendung bei der behandlung behandlungsresistenter komplexer perianalfisteln bei morbus crohn

Info

Publication number: BE1024781B1
Application number: BE2017/5156A
Authority: BE
Inventors: Eduardo Bravo; Maria Pascual
Original assignee: Tigenix S.A.U.
Priority date: 2016-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2018-07-02
Also published as: AU2017232718A1; RU2742308C2; GB201704065D0; CN108883135A; CN108883135B; DK3219321T3; IL298107B1; MX2018010699A; IL261730B1; AU2017232718B2; EP4074322A1; DE102017002458B4; HRP20220539T1; US20190381106A1; SI3219321T1; KR102277789B1; NO345415B1; IL298107A; KR20180120261A; SG10202008992YA

Abstract

Es werden vermehrte, allogene, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung bei der Behandlung einer komplexen Perianalfistel bei Morbus Crohn bereitgestellt.

Description

(73) Inhaber :

TIGENIX S.A.U. 28760, MADRID Spanien (72) Erfinder :

BRAVO Eduardo 28760 MADRID Spanien

PASCUAL Maria 28760 MADRID Spanien (54) VON ADIPÖSEM GEWEBE STAMMENDE STROMALE STAMMZELLEN ZUR VERWENDUNG BEI DER BEHANDLUNG BEHANDLUNGSRESISTENTER KOMPLEXER PERIANALFISTELN BEI MORBUS CROHN (57) Es werden vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung bei der Behandlung einer komplexen Perianalfistel bei Morbus Crohn bereitgestellt.

Figur 1. Siudiengestalturg,

BELGISCHES ERFINDUNGSPATENT

FÖD Wirtschaft, K.M.B., Mittelstand & Nummer der Veröffentlichung : 1024781 Energie Einreichungsnummer : BE2017/5156

Amt für Geistiges Eigentum Internat. Klassifikation : A61K 35/28 A61P 1/00

Datum der Erteilung am : 02/07/2018

Der Minister für Unternehmen,

Aufgrund des Pariser Vertrags vom 20. März 1883 zum Schutz des Gewerbliches Eigentums ;

Aufgrund des Gezetzes vom 28. März 1984 über Erfindungspatente, Artikel 22, für die Anträgen vor dem 22. September 2014 eingeführt;

Aufgrund des Titels I “Erfindungspatente” des Buches XI des Wirtschaftsgesetzbuches, Artikel XI.24, für die Anträgen ab 22. September 2014 eingeführt ;

Aufgrund des königlichen Erlasses vom 2. Dezember 1986 über die Anmeldung, die Erteilung und die Aufrechterhaltung von Erfindungspatenten, Artikel 28;

Aufgrund des Protokolls aufgenommen am 14/03/2017 beim Amt für Geistiges Eigentum.

In Erwägung, dass für Patentanmeldungen, die unter den Anwendungsbereich des Titels 1, Buch XI, des Wirtschaftgesetzbuches fallen, in Übereinstimmung mit Artikel XI.19, § 4, zweiter Absatz, des Wirtschaftsgesetzbuches, wenn die Patentanmeldung Gegenstand eines Recherchenberichts ist, in dem eine mangelnde Einheitlichkeit der Erfindung im Sinne des Paragraphen 1 erwähnt wird, und wenn der Anmelder seine Anmeldung nicht beschränkt und keine Teilanmeldung einreicht in Übereinstimmung des Recherchenberichts, das erteilte Patent beschränkt sein wird auf die Patentansprüche wofür der Recherchenbericht erstellt wurde.

BESCHLIEßT :

Artikel 1. - Es wird ein Erfindungspatent erteilt an :

TIGENIX S.A.U., Calle Marconi, 1 Parque Tecnolögico de Madrid Très Canto, 28760 MADRID Spanien;

vertreten von :

NLO BVBA, Technologiepark 19, 9052, ZWIJNAARDE- GENT;

für die Dauer von 20 Jahren, vorbehaltlich der Zahlung der Patentjahresgebühren erwähnt in Artikel XI.48, §1 des Wirtschaftsgesetzbuches, für : VON ADIPÖSEM GEWEBE STAMMENDE STROMALE STAMMZELLEN

ZUR VERWENDUNG BEI DER BEHANDLUNG BEHANDLUNGSRESISTENTER KOMPLEXER

PERIANALFISTELN BEI MORBUS CROHN .

ERFINDER :

BRAVO Eduardo, Calle Marconi, 1 Parque Tecnolôgico de Madrid Très Cantos, 28760, MADRID;

PASCUAL Maria, Calle Marconi,1 Parque Tecnolôgico de Madrid Très Cantos, 28760, MADRID ;

PRIORITÄT(EN) :

14/03/2016 GB 1604304.4;

ABSPALTUNG :

Teilantrag des früheren Antrags : Anmeldetag des früheren Antrags :

Artikel 2. - Dieses Patent wird erteilt ohne jede vorherige Prüfung der Patentfähigkeit der Erfindung, ohne Garantie des Verdienstes der Erfindung oder der Genauigkeit derer Beschreibung und auf eigene Gefahr des Patentanmelders/der Patentanmelder.

Brüssel, den 02/07/2018, In besonderer Vertretung :

VON ADIPÖSEM GEWEBE STAMMENDE STROMALE STAMMZELLEN ZUR

VERWENDUNG BEI DER BEHANDLUNG BEHANDLUNGSRESISTENTER KOMPLEXER

PERIANALFISTELN BEI MORBUS CROHN

2017 002 458.8 TIGENIX, S.A.U.

T 3537-kl

BE2017/5156

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft von adipösem Gewebe stammende Stammzellen zur Verwendung bei der Behandlung von behandlungsresistenten komplexen Perianalfisteln in Patienten mit Morbus Crohn.

Hintergrund der Erfindung

Im Allgemeinen ist eine Fistel eine anomale Verbindung oder ein anomaler Durchgang zwischen Organen oder Gefäßen, die normalerweise nicht verbunden sind. Fisteln können sich in verschiedenen Teilen des Körpers entwickeln. Beispielsweise umfassen Typen von Fisteln, die nach den Bereichen des Körpers benannt sind, in denen sie auftreten, eine Anorektalfistel oder „Fistula-in-ano“ oder Fäkalfistel (zwischen dem Rektum oder einem anderen Anorektalbereich und der Hautoberfläche), eine arteriovenöse Fistel oder A-V-Fistel (zwischen einer Arterie und einer Vene), eine biliäre Fistel (zwischen den Gallengängen zu der Hautoberfläche, häufig durch eine Gallenblasenchirurgie verursacht), eine Gebärmutterhalsfistel (anomale Öffnung im Gebärmutterhals), eine Kraniosinusfistel (zwischen dem intrakraniellen Raum und einer Nasennebenhöhle), eine Enteroenteralfistel (zwischen zwei Teilen des Darms), eine enterokutane Fistel (zwischen dem Darm und der Hautoberfläche, nämlich vom Zwölffingerdarm oder dem Leerdarm oder dem Krummdarm), eine Enterovaginalfistel (zwischen dem Darm und der Vagina), eine Magenfistel (zwischen dem Magen und der Hautoberfläche), eine Metroperitonealfistel (zwischen der Gebärmutter und dem Peritonealhohlraum), eine Perilymphfistel (ein Riss zwischen den Membranen zwischen dem Mittelohr und dem Innenohr), eine pulmonale arteriovenöse Fistel (zwischen einer Arterie und einer Vene der Lungen, die zu einem Nebenschluss von Blut führt), eine Rektovaginalfistel (zwischen dem Rektum und der Vagina), eine Nabelfistel (zwischen dem Nabel und dem Darm), eine tracheoösophageale Fistel (zwischen der Luftröhre und der Speiseröhre) und eine vesicovaginale Fistel (zwischen der Blase und der Vagina). Ursachen von Fisteln umfassen ein Trauma, Komplikationen von einer medizinischen Behandlung und eine Krankheit.

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Die Behandlung von Fisteln variiert abhängig von der Ursache und dem Ausmaß der Fistel, umfasst jedoch im Allgemeinen einen chirurgischen Eingriff. Verschiedene chirurgische Verfahren werden gebräuchlich verwendet, am gebräuchlichsten eine Fistulotomie, das Anordnen einer Fadeneinlage („Seton“) (eines Fadens, der durch den Weg der Fistel geführt wird, um sie für eine Drainage offen zu halten), oder ein Endorektalklappenverfahren („endorectal flap procedure“) (bei dem gesundes Gewebe über die Innenseite der Fistel gezogen wird, um Kot oder anderes Material von einer erneuten Infektion des Kanals abzuhalten). Die Chirurgie bezüglich Anorektalfisteln ist nicht ohne Nebenwirkungen, einschließlich einem Wiederauftreten, einer erneuten Infektion und Inkontinenz.

Entzündliche Darmerkrankungen, wie z.B. Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, sind die

Hauptursachen für anorektale, enteroenterale und enterokutane Fisteln. Das berichtete Auftreten von Fisteln bei Morbus Crohn reicht von 17 % bis 50 %. Die Handhabung von Fisteln in Patienten mit Morbus Crohn ist nach wie vor ein extrem herausforderndes Problem, da viele solcher Fisteln nicht auf verfügbare Behandlungen ansprechen. Solche Fisteln und ihr Wiederauftreten sind eine sehr schmerzliche Komplikation, welche die Lebensqualität von betroffenen Patienten signifikant vermindert. Kürzliche Verbesserungen bei der medizinischen Behandlung (z.B. der Behandlung mit Infliximab®) und einer professionellen Wundhandhabung haben den Bedarf für eine komplizierte Chirurgie vermindert. Viele Patienten werden jedoch nicht geheilt. Eine mangelnde Heilung von Fisteln ist wahrscheinlich auf die suboptimale Qualität von Geweben zurückzuführen, die von Morbus Crohn betroffen sind.

Tatsächlich stellen Crohn-Fisteln ein Modellsystem für die Wundheilung unter einigen der Schlechtestmöglichen Bedingungen bereit.

Perianalfisteln sind eine häufige Komplikation bei Morbus Crohn ^A1, wobei abgeschätzt wird, dass sie bis zu 28 % der Patienten in den ersten zwei Jahrzehnten nach der Diagnose betreffen ^A2A3, insbesondere solche mit Dickdarmerkrankung und rektaler Beteiligung ^A4. Sie beeinträchtigen die Lebensqualität eines Patienten schwer und verursachen eine beträchtliche Sterblichkeit^{A5 A6}. Etwa 70 bis 80 % der Perianalfisteln sind komplex^{A3 A7}, und diese sind schwer zu behandeln, da sie gegenüber herkömmlichen Behandlungsstrategien (Antibiotika, Immunsuppressiva) und Anti-Tumornekrosefaktor (Anti-TNF)-Therapien besonders behandlungsresistent sind ^A8bisA12. Ferner erleiden 60 bis 70 % der Patienten beim Beenden der Behandlung einen Rückfall^A13bisA17, und nur eine Minderheit der Patienten erreicht eine Langzeitrückbildung ^A18.

Ein Versagen einer medizinischen Therapie oder eine Unverträglichkeit einer medizinischen Therapie kann schließlich zu einer Verhinderung von chirurgischen Ansätzen, wie z.B. einer

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Umleitungsöffnung oder einer Protektomie, führen ^A19. Daher besteht ein starker unerfüllter Bedarf für alternative medizinische Behandlungen.

Mesenchymale stromale Zellen (MSCs) sind nicht-blutbildende stromale Zellen, die sich zu mesenchymalen Geweben, wie z.B. Knochen, Knorpel, Muskeln, Bändern, Sehnen und adipösem Gewebe differenzieren können. MSCs können einfach von Geweben, wie z.B. Knochenmark oder adipösem Gewebe isoliert und in einer Kultur schnell vermehrt werden. WO 2006/136244 A beschreibt die Behandlung von Fisteln unter Verwendung von Zusammensetzungen, die stromale Stammzellen enthalten, die von adipösem Gewebe stammen. Mesenchymale stromale Zellen, die von adipösem Gewebe stammen, sind ein vielversprechender neuer therapeutischer Ansatz, der aufgrund ihres entzündungshemmenden und geweberegenerierenden Potenzials für die Behandlung von komplexen Perianalfisteln nützlich sein kann ^A20bisA22. Eine anfängliche Untermauerung des Konzepts wurde bisher in einer klinischen Phase 1/2a-Open-label-Studie von allogenen, vermehrten, von adipösem Gewebe stammenden Stammzellen (eASC, Cx601) in 24 Patienten mit Morbus Crohn mit komplexen Perianalfisteln erhalten, wobei 56,3 % der Patienten 24 Wochen nach der Behandlung einen vollständigen Verschluss der äußeren Öffnung und das Fehlen von Ansammlungen zeigten, was durch MRI der behandelten Fistel gemessen worden ist^A23.

Es ist eine besondere Herausforderung, komplexe Perianalfisteln bei Morbus Crohn zu behandeln, und es verbleibt ein Bedarf zur Bereitstellung von klinisch bestätigten Therapien zur Behandlung von komplexen Perianalfisteln bei Morbus Crohn.

Zusammenfassung dar Erfindung

Die Erfindung betrifft die Bereitstellung von klinisch bestätigten Therapien zur Behandlung von behandlungsresistenten, komplexen Perianalfisteln bei Morbus Crohn auf der Basis der Ergebnisse einer Placebo-kontrollierten Mehrzentren-Doppelblindstudie, bei der die Wirksamkeit und Sicherheit von eASC in 212 Erwachsenen mit Morbus Crohn und behandlungsresistenten, drainierenden komplexen Perianalfisteln bewertet worden ist. Die hier genannten Beispiele beschreiben die erste Placebo-kontrollierte Phase 3-Studie, welche die Wirksamkeit und die Sicherheit von vermehrten, allogenen, von adipösem Gewebe stammenden Stammzellen allein oder zusätzlich zu einer gegenwärtigen medizinischen Therapie für behandlungsresistente komplexe Perianalfisteln in Patienten mit Morbus Crohn bewertet. Die hier angegebenen Ergebnisse sind die primären und sekundären Endpunkte in der 24. Woche.

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Die neuen klinischen Versuchsdaten zeigten überraschend, dass von adipösem Gewebe stammende Stammzellen komplexe Perianalfisteln mit mehreren Gängen besonders effektiv behandeln. Die Daten zeigen auch, dass die zahlenmäßig stärkste Wirkung der Zellen in Patienten festgestellt wurde, die bei der Fistelpräparation keine oder beide von einer anti-TNFTherapie und einer Immunsuppressionstherapie erhielten. Zusätzlich wurde bald nach der Behandlung überraschend eine klinische Rückbildung erreicht, wobei die mittlere Zeit bis zur klinischen Rückbildung in der Behandlungsgruppe 6,7 Wochen betrug. Entsprechend betrug die mittlere Zeit bis zum Ansprechen 6,3 Wochen. Eine Verbesserung des Perianalerkrankungsaktivitätsindex (PDAI) war bei den Wochen 6, 12 und 18 signifikant größer. Insgesamt zeigen die Daten, dass aiiogene eASCs eine überraschend wirksame Therapie für komplexe Perianalfisteln in Patienten mit Morbus Crohn sind, wobei eine einzelne Verabreichung selbst bei den am schwierigsten zu behandelnden, sehr komplexen Fisteln, bei denen eine bisherige Arzneistofftherapie versagt hat, eine schnelle und langanhaltende therapeutische Wirkung bereitstellen kann.

Ein erster Aspekt der Erfindung stellt vermehrte aiiogene, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer behandlungsresistenten komplexen Perianalfistel in einem Patienten mit Morbus Crohn bereit, wobei (i) die Fistel mehrere Gänge umfasst; (ii) dem Patienten in einem einzelnen Vorgang eine Dosis von 120 Millionen Zellen verabreicht wird, wobei jeder Fisteltrakt mindestens einen Anteil der Dosis erhält und wobei etwa die Hälfte der Dosis in das Gewebe, das die innere Öffnung oder inneren Öffnungen umgibt, injiziert wird, und die andere Hälfte entlang des Gangs oder der Gänge der Fistel in die Fistelwände injizierd wird, und (iii) die Therapie eine klinische Rückbildung innerhalb vond 8 Wochen induziert.

Hier ist unter anderem auch offenbart, die Verwendung von vermehrten allogenen, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer behandlungsresistenten komplexen Perianalfistel in einem Patienten mit Morbus Crohn.

Hier ist unter anderem auch offenbart, ein Verfahren zur Behandlung einer behandlungsresistenten komplexen Perianalfistel in einem Patienten mit Morbus Crohn für einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, umfassend den Schritt des Verabreichens von vermehrten allogenen, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen an die Fistel.

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Hier sind unter anderem auch Zusammensetzungen offenbart, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, weisen einen speziellen Phänotyp auf und zeigen eine spezifische Homogenität des Phänotyps, wodurch sie zur Verwendung bei der Behandlung von Fisteln besser geeignet sind. Die Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, können mit Lösungen oder anderen Substanzen gemischt werden, so dass sie als Pharmazeutika oder als medizinische Vorrichtungen dienen, wie z.B. als Nahtmaterialien oder Haftmittel. Ferner werden neue Verfahren zur Behandlung von komplexen Perianalfisteln, bei denen von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen verwendet werden, sowie Kits für die Durchführung dieser Verfahren bereitgestellt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Gestaltung der klinischen Phase 11l-Studie. Cx601, allogène, vermehrte, von adipösem Gewebe stammende Stammzellen; ICF, Formblatt für die Einverständniserklärung;

MRI, Magnetresonanzbildgebung.

Figur 2 fasst die Patienteneinteilung zusammen. Cx601, allogène, vermehrte von adipösem Gewebe stammende Stammzellen; ITT, Behandlungsabsicht; mITT, modifizierte Behandlungsabsicht; *Tiefe Venenthrombose, Ausbruch von Crohn, Darmverschluss, Morbus Crohn, Analabszess (n = 3); | Fistel, Proktalgie, Analabszess (n = 4); φ keine Heilung oder Verschlechterung der Symptome; neue Einnahme von Antibiotika; neue Chirurgie im Perianalbereich; § Verschlechterung von Morbus Crohn, die eine Änderung der Therapie erfordert.

Figur 3 zeigt den primären Endpunkt: Kombinierte klinische und radiologische Rückbildung* in der Woche 24 in der ITT-Population (Auftragung A). Kombinierte klinische und radiologische Rückbildung* in der Woche 24 in der mITT-Population (Auftragung B). Kombinierte Rückbildung* in der Woche 24 gemäß Randomisierungsschichtungsfaktoren, d.h. Morbus Crohn-Behandlungen, die zum Zeitpunkt der Randomisierung erhalten wurden, in der mlTTPopulation (Auftragung C). Cx601, allogène, vermehrte von adipösem Gewebe stammende Stammzellen; IS, Immunsuppressionsmittel; ITT, Behandlungsabsicht; mITT, modifizierte Behandlungsabsicht; TNF, Tumornekrosefaktor. *Klinische Bewertung des Verschlusses aller behandelten äußeren Öffnungen, die eine Drainage beim Grundwert aufwiesen, und der Abwesenheit von Ansammlungen > 2 cm der behandelten Perianalfisteln in > 2 von 3 Dimensionen einer zentral verbündeten MRI-Bewertung in der Woche 24. Die klinische Bewertung des

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Verschlusses wurde als Abwesenheit einer Drainage trotz eines sanften Fingerdrucks festgelegt.

Kurze Beschreibung der Erfindung

1. Definitionen:

Wie hier verwendet weisen die folgenden Begriffe und Ausdrücke die Bedeutungen auf, die nachstehend angegeben sind. Falls nichts anderes angegeben ist, weisen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung auf, wie sie üblicherweise von einem Fachmann des Gebiets, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden werden.

Die Artikel „ein(e)“, „eines“ und „einer“ beziehen sich auf eines oder mehr als eines (d.h., auf mindestens eines) des grammatischen Objekts des Artikels. Beispielsweise bezieht sich „ein Element“ auf ein Element oder mehr als ein Element.

Mit „adipösem Gewebe“ ist jedwedes Fettgewebe gemeint. Das adipöse Gewebe kann braunes oder weißes adipöses Gewebe sein, das von einer subkutanen Stelle, omentalen/visceralen Stelle, die Brust betreffende Stelle, gonadalen Stelle oder anderen adipösen Gewebestelle stammt. Typischerweise handelt es sich bei dem adipösen Gewebe um subkutanes weißes adipöses Gewebe. Solche Zellen können eine primäre Zellkultur oder eine immortalisierte Zelllinie umfassen. Das adipöse Gewebe kann von jedwedem Organismus stammen, der Fettgewebe aufweist. Typischerweise ist das adipöse Gewebe ein Säugergewebe, insbesondere stammt das adipöse Gewebe vom Menschen. Eine zweckmäßige Quelle für adipöses Gewebe stammt von einer Fettabsaugungschirurgie, jedoch ist die Quelle des adipösen Gewebes oder das Verfahren der Isolierung von adipösem Gewebe für die Erfindung nicht kritisch.

„Von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen“ oder „ASCs“ bezieht sich auf mesenchymale Stammzellen, die von dem stromalen Anteil von adipösem Gewebe stammen, im allgemeinen von menschlichem adipösen Gewebe (hASCs).

Der Begriff „Haftmittel“ bezieht sich auf jedwede Substanz, die Oberflächen miteinander vereinigt oder verbindet, wie z.B. einen Klebstoff.

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Der Ausdruck „biologisches medizinisches Produkt“ soll so aufgefasst werden, dass es sich um eine pharmazeutische Substanz auf Protein- oder Nukleinsäurebasis für eine therapeutische Verwendung handelt, die typischerweise durch Mittel hergestellt wird, die von einer direkten Extraktion von einer nativen (nicht technisch hergestellten) biologischen Quelle stammen.

Der Ausdruck „zelluläre Zusammensetzung“ bezieht sich auf ein Zellpräparat, wobei das Präparat zusätzlich zu den Zellen nicht-zelluläre Komponenten umfassen kann, wie z.B. Zellkulturmedien, wie z.B. Proteine, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Nukleotide, Coenzym, Antioxidationsmittel, Metalle und dergleichen. Ferner kann die zelluläre Zusammensetzung Komponenten aufweisen, die das Wachstum oder die Lebensfähigkeit der zellulären Komponente nicht beeinflussen, sondern die zur Bereitstellung der Zellen in einem bestimmten Format verwendet werden, z.B. als polymere Matrix zum Einkapseln oder als pharmazeutisches Präparat.

Eine „komplexe Perianalfistel“ ist eine Perianalfistel mit einem oder mehreren von:

(i) einem stark inter-, trans-, extra- oder supra-Sphinkterursprung;

(ii) > 2 äußeren Öffnungen; oder (iii) dazugehörigen Ansammlungen.

Die komplexe Perianalfistel kann gegebenenfalls maximal 2 innere und 3 äußere Öffnungen aufweisen. Ferner kann die komplexe Perianalfistel vor der Behandlung gemäß der Erfindung für mindestens 6 Wochen einer Drainage unterzogen worden sein.

Der Begriff „Kultur“ bezieht sich auf jedwedes Wachstum von Zellen, Organismen, mehrzelligen Einheiten oder Gewebe in einem Medium. Der Begriff „Kultivieren“ bezieht sich auf jedwedes Verfahren des Erreichens eines solchen Wachstums und kann eine Mehrzahl von Schritten umfassen. Der Ausdruck „weiteres Kultivieren“ bezieht sich auf das Kultivieren einer Zelle, eines Organismus, einer mehrzelligen Einheit oder eines Gewebes bis zu einem bestimmten Wachstumsstadium, wobei dann ein anderes Kultivierungsmedium verwendet wird, um die Zelle, den Organismus, die mehrzellige Einheit oder das Gewebe bis zu einem weiteren Wachstumsstadium zu bringen. Eine „Zellkultur“ bezieht sich auf das Wachstum von Zellen in vitro. In einer solchen Kultur proliferieren die Zellen, jedoch organisieren sie sich nicht per se zu einem Gewebe. Eine „Gewebekultur“ bezieht sich auf das Aufrechterhalten oder das Wachstum von Gewebe, z.B. Explantaten eines ursprünglichen Organs oder eines adulten Organs in vitro, so dass dessen Aufbau und Funktion bewahrt wird. Eine „Einschichtkultur“ bezieht sich auf eine Kultur, in der sich Zellen in einem geeigneten Medium

BE2017/5156 vermehren, während sie aneinander und an einem Substrat haften. Ferner bezieht sich eine „Suspensionskultur“ auf eine Kultur, in der sich Zellen vermehren, während sie in einem geeigneten Medium suspendiert sind. Entsprechend bezieht sich eine „Kultur mit kontinuierlicher Strömung“ auf die Kultivierung von Zellen oder Explantaten in einer kontinuierlichen Strömung von frischem Medium zum Aufrechterhalten des Zellwachstums, wie z.B. der Lebensfähigkeit. Der Ausdruck „konditioniertes Medium“ bezieht sich auf den Überstand, der z.B. frei von den kultivierten Zellen/dem kultivierten Gewebe ist, der nach einem Zeitraum in Kontakt mit den kultivierten Zellen resultiert, wodurch das Medium verändert worden ist, so dass es bestimmte parakrine und/oder autokrine Faktoren enthält, die durch die Zellen erzeugt und in die Kultur sekretiert worden sind. Eine „konfluente Kultur“ ist eine Zellkultur, in der alle Zellen in Kontakt sind und folglich die gesamte Oberfläche des Kulturbehälters bedeckt ist, und impliziert, dass die Zellen auch ihre maximale Dichte erreicht haben, obwohl eine Konfluenz nicht notwendigerweise bedeutet, dass die Teilung endet oder dass die Größe der Population nicht zunimmt.

Der Begriff „Kulturmedium“ oder „Medium“ ist in dem Fachgebiet bekannt und bezieht sich im Allgemeinen auf jedwede Substanz oder jedwedes Präparat, das für die Kultivierung von lebenden Zellen verwendet wird. Der Begriff „Medium“, wie er in Bezug auf eine Zellkultur verwendet wird, umfasst die Komponenten der Umgebung, welche die Zellen umgibt. Medien können fest, flüssig, gasförmig oder ein Gemisch von Phasen und Materialien sein. Medien umfassen flüssige Wachstumsmedien sowie flüssige Medien, die das Zellwachstum nicht unterstützen. Medien umfassen auch gelatinöse Medien, wie z.B. Agar-, Agarose-, Gelatineund Kollagenmatrizen. Beispiele für gasförmige Medien umfassen die gasförmige Phase, der Zellen ausgesetzt sind, die auf einer Petrischale oder einem anderen festen oder halbfesten Träger wachsen. Der Begriff „Medium“ bezieht sich auch auf ein Material, das zur Verwendung in einer Zellkultur vorgesehen ist, selbst wenn es noch nicht mit Zellen in Kontakt gebracht worden ist. Mit anderen Worten, eine nährstoffreiche Flüssigkeit, die für eine bakterielle Kultur hergestellt worden ist, ist ein Medium. Entsprechend kann ein Pulvergemisch, das dann, wenn es mit Wasser oder einer anderen Flüssigkeit gemischt wird, für eine Zellkultur geeignet wird, als „pulverförmiges Medium“ bezeichnet werden. Ein „definiertes Medium“ bezieht sich auf Medien, die aus chemisch definierten (üblicherweise gereinigten) Komponenten hergestellt sind. „Definierte Medien“ enthalten keine schlecht charakterisierten biologischen Extrakte, wie z.B. Hefeextrakt und Rinderbrühe. Ein „Vollmedium“ umfasst Medien, die zum Unterstützen des Wachstums der meisten oder aller lebensfähigen Formen einer bestimmten Spezies gestaltet sind. Vollmedien umfassen häufig komplexe biologische Extrakte.

Ein „Medium, das zum Wachsenlassen einer Kultur mit hoher Dichte geeignet ist“, ist jedwedes Medium, das es ermöglicht, dass eine Zellkultur eine OD600 von 3 oder größer erreicht,

BE2017/5156 wenn andere Bedingungen (wie z.B. die Temperatur und die Sauerstoffübertragungsrate) ein solches Wachstum zulassen. Der Begriff „Grundmedium“ bezieht sich auf ein Medium, welches das Wachstum vieler Typen von Mikroorganismen fördert, die keine speziellen Nährstoffergänzungen erfordern. Die meisten Grundmedien umfassen im Allgemeinen vier grundlegende chemische Gruppen: Aminosäuren, Kohlenhydrate, anorganische Salze und Vitamine. Ein Grundmedium dient im Allgemeinen als die Basis für ein komplexeres Medium, dem Zusätze, wie z.B. Serum, Puffer, Wachstumsfaktoren, Lipide und dergleichen zugesetzt werden. Beispiele für Grundmedien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Eagles Grundmedium, minimal essentielles Medium, Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium, Medium 199, Nährstoffgemische Ham's F-10 und Ham's F-12, Me Coy's 5A, Dulbecco's MEM/F-I 2, RPMI 1640 und Iscove's modifiziertes Dulbecco's Medium (IMDM).

Die Begriffe „umfassen“ und „umfassend“ werden im einschließlichen, offenen Sinn verwendet, was bedeutet, dass zusätzliche Elemente einbezogen werden können.

Der Begriff „Cx601“ bezieht sich auf eine Zellsuspension in aseptischer gepufferter Kochsalzlösung, die menschliche vermehrte, adipös abgeleitete Stammzellen (eASCs) allogener Herkunft enthält. Diese Zellen werden in Einmalbehältern ohne Konservierungsmittel bereitgestellt. Die Zellen werden bei einer Dosis von 120 Millionen Zellen (5 Millionen Zellen/ml) für eine intraläsionale Injektion verabreicht.

Der Begriff „Differenzierung“ bezieht sich auf die Bildung von Zellen, die Marker exprimieren, von denen bekannt ist, dass sie mit Zellen Zusammenhängen, die stärker spezialisiert sind und sich näher an der Ausbildung zu enddifferenzierten Zellen befinden, die sich nicht weiter teilen oder differenzieren können. Beispielsweise kann im Zusammenhang mit der Bauchspeicheldrüse eine Differenzierung bei der Erzeugung von inselzellenartigen Clustern festgestellt werden, die einen erhöhten Anteil von beta-Epithelzellen enthalten, die erhöhte Mengen von Insulin erzeugen. Die Begriffe „weitere“ oder „stärkere“ Differenzierung beziehen sich auf Zellen, die stärker spezialisiert sind und sich näher an der Ausbildung zu enddifferenzierten Zellen befinden, die sich nicht weiter teilen oder differenzieren können, als die Zellen, aus denen sie kultiviert worden sind. Der Begriff „Enddifferenzierung“ bezieht sich auf Zellen, die enddifferenzierte Zellen geworden sind, die sich nicht weiter teilen oder differenzieren können.

Der Begriff „vermehrt“, wie er hier in Bezug auf Zellen verwendet wird, soll dessen in dem Fachgebiet übliche Bedeutung haben, nämlich sich auf Zellen beziehen, die in vitro proliferiert worden sind. Verfahren zur Herstellung von eASCs sind in dem Fachgebiet bekannt, wie

BE2017/5156 es z.B. in WO 2007/039150 beschrieben ist. Eine ASC kann unter Standardkulturbedingungen vermehrt werden, so dass eine Population von Zellen bereitgestellt wird, die mindestens eine biologische Funktion der ASC bewahrt, typischerweise das Vermögen zum Haften an einer Kunststoffoberfläche. Die vermehrte Population von Zellen kann das Vermögen zur Differenzierung zu einem oder mehreren Zelltyp(en) bewahren.

Der Begriff „Fistel“ bezieht sich auf jedweden anomalen Durchgang oder Übertragungsweg oder jedwede anomale Verbindung üblicherweise zwischen zwei inneren Organen oder die von einem inneren Organ zu der Oberfläche des Körpers führt. Beispiele für Fisteln umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine Anorektalfistel oder „Fistula-in-ano“ oder Fäkalfistel, eine arteriovenöse Fistel oder A-V-Fistel, eine biliäre Fistel, eine Gebärmutterhalsfistel, eine Kraniosinusfistel, eine Enteroenteralfistel, eine enterokutane Fistel, eine Enterovaginalfistel, eine Magenfistel, eine Metroperitonealfistel, eine Perilymphfistel, eine pulmonale arteriovenöse Fistel, eine Rektovaginalfistel, eine Nabelfistel, eine tracheoösophageale Fistel und eine vesicovaginale Fistel. Die Erfindung betrifft eine Perianalfistel.

Der Begriff „umfassend“ wird hier in der Bedeutung von „umfassend, aber nicht beschränkt auf“ verwendet. „Umfassend“ und „umfassend, aber nicht beschränkt auf¹ werden austauschbar verwendet.

„Marker“ bezieht sich auf ein biologisches Molekül, dessen Gegenwart, Konzentration, Aktivität oder Phosphorylierungszustand erfasst werden können und das zur Identifizierung des Phänotyps einer Zelle verwendet werden kann.

„Mesenchymale stromale Zellen“ (hier auch als „MSCs“ bezeichnet) sind multipotente stromale Zellen (d.h., es sind Zellen, die zu einer Mehrzahl von verschiedenen Typen von Zellen führen können), die typischerweise von Bindegewebe stammen und nicht-blutbildende Zellen sind. MSCs weisen das Vermögen zum Differenzieren zu oder in die Richtung von somatischen Zellen auf, wie z.B. Mesodermalzellen (z.B. adipösen Zellen, Chondrozyten, Osteoblasten) und gegebenenfalls zu oder in die Richtung von endodermalen und/oder ektodermalen Zelltypen oder -Stämmen. Typischerweise weisen die Zellen das Vermögen zum Differenzieren zu oder in die Richtung von mindestens zwei oder allen Zelltypen auf, die aus der Gruppe, bestehend aus adipocytischen, chondroblastischen und osteoblastischen Stämmen, ausgewählt sind. ASCs sind ein Typ von MSC, der aus der stromalen Fraktion des adipösen Gewebes erhalten wird. MSCs und ASCs haften unter Standardkulturbedingungen an Kunststoff.

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Ein „Pflaster“ ist ein Verbandmaterial oder eine Abdeckung, das oder die zum Abdecken oder

Schützen einer Wunde oder einer anderen verletzten Stelle geeignet ist.

Ein „Patient“, ein „Lebewesen“ oder ein „Wirt“, der oder das durch das vorliegende Verfahren behandelt werden soll, kann sich entweder auf einen Menschen oderein nicht-menschliches Tier beziehen.

Der Ausdruck „pharmazeutisch verträglich“ wird hier verwendet, um diejenigen Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Dosierungsformen zu bezeichnen, die innerhalb des Umfangs einer gründlichen medizinischen Beurteilung zur Verwendung in einem Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktion oder ein anderes Problem oder eine andere Komplikation in Übereinstimmung mit einem vernünftigen Nutzen/Risiko-Verhältnis geeignet sind.

Der Ausdruck „pharmazeutisch verträglicher Träger“, der hier verwendet wird, steht für ein pharmazeutisch verträgliches Material, eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung oder ein pharmazeutisch verträgliches Bindemittel, wie z.B. einen flüssigen oder festen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel, einen Hilfsstoff oder ein Lösungsmitteleinkapselungsmaterial, das beim Tragen oder Transportieren der vorliegenden Verbindung von einem Organ oder Abschnitt des Körpers zu einem anderen Organ oder Abschnitt der Körpers beteiligt ist. Jeder Träger muss in dem Sinn „verträglich“ sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich ist und den Patienten nicht schädigt. Der Begriff „Phänotyp“ bezieht sich auf die feststellbaren Eigenschaften einer Zelle, wie z.B. die Größe, die Morphologie, die Proteinexpression, usw.

Der Begriff „Vorläuferzelle“ bezieht sich auf eine Zelle, die das Vermögen zum Erzeugen von Tochterzellen aufweist, die stärker differenziert sind als die Zelle selbst. Beispielsweise kann sich der Begriff auf eine undifferenzierte Zelle oder eine Zelle beziehen, die in einem Ausmaß kurz vor der Enddifferenzierung differenziert ist, die proliferieren kann und mehr Vorläuferzellen erzeugen kann, die das Vermögen zum Erzeugen einer großen Anzahl von Mutterzellen aufweisen, die wiederum differenzierte oder differenzierbare Tochterzellen erzeugen können. In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich der Begriff Vorläuferzelle auf eine generalisierte Mutterzelle, deren Nachkommen (Tochterzellen) sich häufig in verschiedenen Richtungen durch eine Differenzierung spezialisieren, wie z.B. durch Erwerben von vollständig individuellen Eigenschaften, wie es bei einer progressiven Diversifizierung von embryonalen Zellen und Geweben stattfindet. Die zelluläre Differenzierung ist ein komplexer Vorgang, der typischerweise durch viele Zellteilungen stattfindet. Eine differenzierte Zelle kann von einer

BE2017/5156 multipotenten Zelle abgeleitet sein, die selbst von einer multipotenten Zelle abgeleitet ist, usw. Während jede dieser multipotenten Zellen als Stammzelle aufgefasst werden kann, kann der Bereich von Zelltypen jeweils Anlass zu einer beträchtlichen Variation geben. Einige differenzierte Zellen weisen auch das Vermögen zum Erzeugen von Zellen mit einem größeren Entwicklungspotenzial auf. Ein solches Vermögen kann natürlich sein oder es kann bei der Behandlung mit verschiedenen Faktoren künstlich induziert werden. Aufgrund dieser Definition können Stammzellen auch Vorläuferzellen sowie die unmittelbareren Vorläufer für enddifferenzierte Zellen sein.

„Proliferation“ bezieht sich auf eine Zunahme der Zellanzahl. „Proliferieren“ und „Proliferation“ beziehen sich auf Zellen, die einer Mitose unterliegen.

„Behandlungsresistent“ soll bedeuten, dass kein signifikanter klinischer Nutzen vorliegt, wenn bei der Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit z.B. keine signifikante Verbesserung oder Linderung der Symptome auftritt.

Der Begriff „Rückbildung“ bezieht sich auf die erfolgreiche Behandlung der Fistel. Eine „klinische Rückbildung“ ist der Verschluss aller behandelten äußeren Öffnungen, die eine Drainage beim Grundwert aufwiesen, trotz eines sanften Zusammendrückens mit einem Finger.

Die Zeit bis zu einer klinischen Rückbildung ist als die Zeit vom Behandlungsbeginn bis zu der ersten Patientenbewertung mit einer klinischen Rückbildung festgelegt. Eine „kombinierte Rückbildung“ ist diese klinische Rückbildung plus die Bestätigung durch MRI (Magnetresonanzbildgebung) des Fehlens von Ansammlungen von größer als 2 cm in den behandelten Perianalfisteln in mindestens 2 von 3 Dimensionen. Dies wird typischerweise durch eine zentrale MRI-Blindablesung bestätigt. Die Abwesenheit von Ansammlungen oder Abszessen ist wichtig, da dann, wenn diese nicht ausgeheilt sind, dies zu einer neuen Fistel führen wird.

Der Begriff „Reaktion“ bezieht sich auf den Verschluss von mindestens 50 % aller behandelten äußeren Öffnungen, die eine Drainage beim Grundwert aufwiesen, trotz eines sanften Zusammendrückens mit einem Finger (d.h., gemäß der klinischen Bewertung). Eine Reaktion ist daher erfüllt, wenn 1 EO geschlossen ist, wenn die Anzahl von EOs beim Grundwert 1 oder 2 ist, und ist erfüllt, wenn 2 EOs geschlossen sind, wenn 3 EOs beim Grundwert Vorlagen. Die Zeit bis zur Reaktion ist als die Zeit vom Behandlungsbeginn bis zur ersten Bewertung einer Reaktion festgelegt.

Der Begriff „Rückfall“ bezieht sich auf ein erneutes Öffnen von jedweder der behandelten äußeren Öffnungen mit einer aktiven Drainage, die klinisch bewertet worden ist, in Patienten mit

BE2017/5156 einer klinischen Rückbildung von der vorhergehenden Bewertung, oderauf die Entwicklung einer perianalen Ansammlung von mehr als 2 cm der behandelten Perianalfistel(n), wie es durch MRI bestätigt wird.

Der Begriff „Lösung“ umfasst hier einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel, in dem die Zellen der Erfindung lebensfähig bleiben.

Der Ausdruck „im Wesentlichen rein“ hinsichtlich Stammzellenpopulationen, die von adipösem Gewebe stammen, bezieht sich auf eine Population von Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, die mindestens etwa 75 %, typischerweise mindestens etwa 85 %, noch typischer mindestens etwa 90 % und insbesondere mindestens etwa 95 % rein ist, und zwar bezüglich von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen, welche die Gesamtheit der Zellpopulation bilden. Anders gesagt bezieht sich „im Wesentlichen rein“ auf eine Population von stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, der vorliegenden Erfindung, die weniger als etwa 20 %, typischer weniger als etwa 10 %, insbesondere weniger als etwa 5 % von abstammenden („lineage-committed“) Zellen in der ursprünglichen nicht-amplifizierten und isolierten Population vor dem anschließenden Kultivieren und Amplifizieren enthalten.

„Träger“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jedwede Vorrichtung oder jedwedes Material, das als Basis oder Matrix zum Wachsenlassen von stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, dienen kann.

Der Begriff „Nahtmaterial“ bezieht sich auf einen Faden oder eine Faser oder ein anderes Befestigungsmaterial, das zum Zusammennähen einer Wunde verwendet werden kann.

Eine Fistel mit einem einzelnen „Gang“ weist eine innere Öffnung und eine äußere Öffnung auf. Eine Fistel mit „mehreren Gängen“ weist mehr als 1 äußere Öffnung und/oder mehr als 1 innere Öffnung auf. Daher weist eine Fistel mit mehreren Gängen verschiedene Verzweigungen auf. Jede äußere Öffnung repräsentiert typischerweise einen Gang.

Der Begriff „Behandeln“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf das Reparieren einer Fistel oder Wunde sowie darauf, dass das Verschlechtern oder erneute Auftreten einer Fistel oder Wunde verhindert wird.

BE2017/5156 „Therapeutisches Mittel“ oder „Therapeutikum“ bezieht sich auf ein Mittel, das eine gewünschte biologische Wirkung auf einen Wirt aufweist. Chemotherapeutika und genotoxische Mittel sind Beispiele für therapeutische Mittel, von denen allgemein bekannt ist, dass sie eine chemische Herkunft aufweisen, im Gegensatz zu einer biologischen Herkunft, oder die eine therapeutische Wirkung durch einen bestimmten Wirkmechanismus verursachen. Beispiele für therapeutische Mittel mit einer biologischen Herkunft umfassen Wachstumsfaktoren, Hormone und Zytokine. In dem Fachgebiet sind verschiedene therapeutische Mittel bekannt und können durch ihre Wirkungen identifiziert werden. Bestimmte therapeutische Mittel können die Zellproliferation und -differenzierung regulieren. Beispiele umfassen chemotherapeutische Nukleotide, Arzneistoffe, Hormone, unspezifische (nicht-Antikörper) Proteine, Oligonukleotide (z.B. Antisense-Oligonukleotide, die an eine Zielnukleinsäuresequenz (z.B. eine mRNA-Sequenz) binden), Peptide und Peptidomimetika.

2. Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten

Die Erfindung umfasst Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen mit bestimmten Eigenschaften, wie z.B. einem bestimmten Phänotyp, enthalten. Beispielsweise können die von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen in einer zellulären Zusammensetzung der Erfindung durch die Zelloberflächenmarkerexpression, die Größe, den Glukoseverbrauch, die Laktaterzeugung und die Zellausbeute/lebensfähigkeit gekennzeichnet sein. Ein weiterer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, die als zelluläre Komponente im Wesentlichen reine Präparate von stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, mit einem bestimmten Phänotyp oder deren Vorläufer enthalten. Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, umfassen nicht nur im Wesentlichen reine Populationen der Vorläuferzellen, sondern können auch Zellkulturkomponenten umfassen, wie z.B. Kulturmedien, die Aminosäuren, Metalle, Coenzymfaktoren, sowie kleine Populationen von anderen stromalen Zellen umfassen, wobei z.B. einige davon durch eine anschließende Differenzierung von Zellen entstehen können. Ferner können andere nicht-zelluläre Komponenten solche umfassen, welche die zelluläre Komponente für ein Trägern unter bestimmten Umständen geeignet machen, wie z.B. für eine Implantation, z.B. eine kontinuierliche Kultur, oder für eine Verwendung als Biomaterial oder pharmezeutische Zusammensetzung.

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In bestimmten Ausführungsformen werden die Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, durch die im Abschnitt 3 beschriebenen

Kulturverfahren hergestellt.

Die bevorzugten ASCs sind Cx601 -Zellen. Der vorgeschlagene (jedoch nicht bestätigte) internationale Freiname für diese Zellen ist „Adalextemcel“.

Die ASCs haften unter Standardkulturbedingungen an Kunststoff.

Vermehrte ASC (eASC) weisen in einer Kultur eine fibroblastenartige Morphologie auf. Insbesondere sind diese Zellen groß und sind morphologisch durch einen flachen Zellkörper mit wenigen Vorwölbungen gekennzeichnet, die lang und dünn sind. Der Kern ist groß und rund mit einem markanten Nukleolus, wodurch der Kern deutlich sichtbar ist. Die meisten eASCs zeigen diese spindelförmige Morphologie, wobei es jedoch üblich ist, dass einige der Zellen polygonale Morphologien aufweisen (Zuk et al., 2002).

Die Cx601-eASCs sind positiv für die Oberflächenmarker HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73,

CD90 und CD105. Eine Ausführungsform stellt daher eine eASC-enthaltende Zusammensetzung bereit, bei der mindestens etwa 80 %, mindestens etwa 90 % oder mindestens etwa 95 % oder typischerweise mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % der eASCs die Oberflächenmarker HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 und CD105 exprimieren. Typischerweise exprimieren mindestens etwa 90 % der eASCs die Oberflächenmarker HLA I, CD29,

CD44, CD59, CD73, CD90 und CD105. Noch typischer exprimieren mindestens etwa 95 % der eASCs die Oberflächenmarker HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 und CD105.

Die Cx601-eASCs sind negativ für HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 und CD86. Eine Ausführungsform stellt daher eine eASC-enthaltende Zusammensetzung bereit, bei der weniger als etwa 5 % der eASCs die Oberflächenmarker HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 und CD86 exprimieren. Noch typischer exprimieren weniger als etwa 4 %, 3 % oder 2 % der eASCs die Oberflächenmarker HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 und CD86. In einer Ausführungsform exprimieren weniger als etwa 1 % der eASCs die Oberflächenmarker HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 und CD86.

In einigen Ausführungsformen können die eASCs einen oder mehrere (z.B. zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, sechs oder sieben) von HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 und CD105 exprimieren. In einigen Ausführungsformen können die

BE2017/5156 eASCs nicht einen oder mehrere (z.B. zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, sechs oder mehr, sieben oder acht) von HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45,

CD31, CD34, CD80 exprimieren. In einigen Ausführungsformen exprimieren die eASCs vier oder mehr von HLAI, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 und CD105und exprimieren nicht vier oder mehrvon HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80.

Vermehrte menschliche ASCs gemäß bestimmten Ausführungsformen der Erfindung sind in DelaRosa et al. (“Requirement of IFN-gamma-mediated indoleamine 2,3-dioxygenase expression in the modulation of lymphocyte proliferation by human adipose-derived stem cells.”; Tissue Eng. Teil A. Okt. 2009;15(10):2795-806. doi: 10.1089/ten.TEA.2008.0630) und in Lopez-Santalla et al., 2015 (“Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Modulate Experimental Autoimmune Arthritis by Modifying Early Adaptive T Cell Responses.” STEM CELLS, 33: 3493-3503. doi: 10.1002/stem.2113) beschrieben.

In einer Ausführungsform (wie sie in Lopez-Santalla et al., 2015 beschrieben ist), wurde Absaugmaterial von menschlichem adipösen Gewebe von gesunden Spendern zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit 0,075 % Kollagenase (Typ I; Invitrogen) verdaut. Die verdaute Probe wurde mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) gewaschen, mit 160 mM NH4CI zum Entfernen der restlichen Erythrocyten behandelt und in Kulturmedium [Dulbecco’s modifiziertem Eagle’s Medium (DMEM) mit 10 % FBS] suspendiert. Zellen wurden in Gewebekulturkolben ausgesät (2-3 104 Zellen/cm²) und vermehrt (37 °C, 5 % CO2), wobei das Kulturmedium alle 3 bis 4 Tage gewechselt wurde. Zellen wurden in einen neuen Kolben überführt (103 Zellen/cm²), als sie 90 % Konfluenz erreichten. Zellen wurden bis zu 12-14 Verdopplungen vermehrt und eingefroren. Experimente wurden mit Zellen von zwei männlichen und zwei weiblichen erwachsenen Spendern bei 12-14 Populationsverdopplungen durchgeführt. ASCs wurden von den gleichen Kryobanken aufgetaut und vor jedem Experiment ausgesät. ASCs wurden gemäß den Kriterien der „International Society for Cellular Therapy” festgelegt, die für HLA-I, CD73, CD90 und CD105 positiv waren und fürCD11b, CD14, CD31, CD34 und CD45 negativ waren.

In einer weiteren Ausführungsform (wie sie von DelaRosa et al., 2009 beschrieben ist) wurde Fettabsaugmaterial, das von menschlichem adipösen Gewebe von gesunden erwachsenen Spendern erhalten worden ist, zweimal mit PBS gewaschen und für 30 min bei 378C mit 18U/ml Kollagenase Typ I in PBS verdaut. Eine Einheit von Kollagenase setzt 1 mM L-Leucin-Äquivalente von Kollagen in 5 Stunden bei 378C, pH 7,5 (Invitrogen, arlsbad, CA) frei.

Die verdaute Probe wurde mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) gewaschen, mit 160 mM

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NHLCI gewaschen, in Kulturmedium suspendiert (DMEM, das 10 % FBS enthält) und durch ein 40 mm-Nylonnetz filtriert. Zellen wurden auf Gewebekulturkolben ausgesät (2-3_104 Zellen/cm²) und bei 378C und 5 % CO2 vermehrt, wobei das Kulturmedium alle 7 Tage gewechselt worden ist. Zellen wurden in einen neuen Kulturkolben überführt (10008 Zellen/cm²), als die Kulturen 90 % Konfluenz erreichten. Zellen wurden durch ihr Vermögen zum Differenzieren in chondro-, osteo- und adipogene Stämme phänotypisch charakterisiert und darüber hinaus wurden hASCs durch Färben mit spezifischen Oberflächenmarkern verifiziert. hASCs waren für HLA-1, CD90 und CD105 positiv und für HLA-II, CD40, CD80, CD86 und CD34 negativ. Ein Pool von sechs menschlichen Spendern (drei Männer und drei Frauen mit einem Alter zwischen 35 und 47) wurde in der Studie eingesetzt. Zellen wurden bei den Durchgängen 4-6 verwendet.

In einigen Ausführungsformen exprimieren die ASCs (i) keine Marker, die spezifisch von APCs sind; (ii) exprimieren IDO nicht konstitutiv; (iii) exprimieren MHC II nicht konstitutiv. Eine typische Expression von IDO oder MHC II kann durch Stimulation mit IFN-γ induziert werden.

In einigen Ausführungsformen können die ASCs einen oder mehreren (z.B. zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, sechs oder mehr, sieben oder mehr, acht oder mehr, neun oder mehr oder zehn oder mehr (z.B. bis zu 13)) der Marker CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 und CD105 exprimieren. Beispielsweise können die ASCs einen oder mehrere (z.B. zwei, drei oder alle) der Marker CD29, CD59, CD90 und CD105 exprimieren, z.B. CD59 und/oder CD90.

In einigen Ausführungsformen können die MSCs nicht einen oder mehrere (z.B. zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, sechs oder mehr, sieben oder mehr, acht oder mehr, neun oder mehr oder zehn oder mehr (z.B. bis zu 15)) der Marker Faktor VIII, alpha-Actin, Desmin, S-100, Keratin, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 und CD133 exprimieren, wobei beispielsweise die MSCs nicht einen oder mehrere (z.B. zwei, drei oder alle) der Marker CD34, CD45, CD31 und CD14 exprimieren, z.B. CD31 und/oder CD34.

In einer Ausführungsform wird eine Zusammensetzung, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthält, bereitgestellt, bei der mindestens etwa 50 %, mindestens etwa 60 %, mindestens etwa 70 %, mindestens etwa 80 %, mindestens etwa 85 %, mindestens etwa 90 %, mindestens etwa 95 % oder typischerweise mindestens etwa 96 %, 97

BE2017/5156 %, 98 % oder 99 % der Stammzellen die CD9-, CD10-, CD13-, CD29-, CD44-, CD49A-,

CD51-, CD54-, CD55-, CD58-, CD59-, CD90- und/oder CD105-Marker exprimieren. In bestimmten Ausführungsformen der Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, exprimieren weniger als etwa 15 %, etwa 10 %, etwa 5 % und typischerweise etwa 4 %, 3 %, 2 % oder 1 % der Stammzellen die CD34-,

CD11b-, CD14-, CD15-, CD16-, CD31-, CD34-, CD45-, CD49f-, CD102-, CD104-, CD106und/oder CD133-Marker.

In einer weiteren Ausführungsform wird eine Zusammensetzung, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthält, bereitgestellt, bei der mindestens etwa 50 %, mindestens etwa 60 %, mindestens etwa 70 %, mindestens etwa 80 %, mindestens etwa 85 %, mindestens etwa 90 %, mindestens etwa 95 % oder typischwerweise mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % der Stammzellen die c-Kit-, Vimentin- und/oder CD90-Marker exprimieren. In bestimmten Ausführungsformen der Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, exprimieren weniger als etwa 15 %, etwa 10 %, etwa 5 % und typischerweise etwa 4 %, 3 %, 2 % oder 1 % der Stammzellen die CD34-, Faktor VIII-, alpha-Actin-, Desmin-, S-100- und/oder Keratin-Marker. Es wird auch eine von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellenpopulation bereitgestellt, welche die c-Kit-, Vimentin- und CD90-Marker exprimiert und die CD34-, Faktor VIII-, alpha-Actin-, Desmin-, S-100- und Keratin-Marker nicht exprimiert.

Die phänotypische Charakterisierung einer Zellpopulation durch Oberflächenmarker kann entweder durch ein individuelles Färben der Zellen (Durchflusszytometrie) oder durch Durchführen von histologischen Schnitten der Population in situ durchgeführt werden, die gemäß normalen Verfahren ausgeführt werden. Die Bestimmung des Profils der Expression von Oberflächenmarkern durch Antikörper, eine Immunphänotypcharakterisierung, kann direkt unter Verwendung eines markierten Antikörpers oder indirekt unter Verwendung eines zweiten markierten Antikörpers gegen den primären spezifischen Antikörper des Zellmarkers sein, wodurch eine Signalverstärkung erreicht wird. Andererseits kann die Gegenwart oder die Abwesenheit des Bindens an den Antikörper durch andere Verfahren bestimmt werden, die eine Immunfluoreszenzmikroskopie und eine Radiographie umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein. Entsprechend kann die Überwachung der Bindungsniveaus des Antikörpers durch Durchflusscytometrie durchgeführt werden, wobei es sich um eine Technik handelt, die eine Korrelation der Fluorochromieniveaus mit der Menge der Antigene ermöglicht, die auf der Zelloberfläche vorliegen und spezifisch an die markierten Antikörper gebunden sind. Die unterschiedliche Expression einer Reihe von Oberflächenmarkern auf einer Zellpopulation stellt ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung der Population bereit. Demgemäß kann

BE2017/5156 typischerweise ein FACS (fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren) eingesetzt werden.

In bestimmten Ausführungsformen sind die Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, Suspensionen von stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, in verschiedenen Lösungen oder Materialien, z.B. zur Verwendung als Pharmazeutika oder Biomaterialien, wie es nachstehend detaillierter beschrieben ist. In einer Ausführungsform umfasst die zelluläre Zusammensetzung eine Suspension der vorliegenden stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, in Ringer's Lösung und HSA. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die zelluläre Zusammensetzung eine Suspension der vorliegenden stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, in einem Material, wie z.B. einem Polymer, einem Klebstoff, einem Gel, usw. Solche Suspensionen können z.B. durch Sedimentieren der stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, aus dem Kulturmedium und erneutes Suspendieren derselben in der gewünschten Lösung oder dem gewünschten Material hergestellt werden. Die Zellen können aus dem Kulturmedium z.B. durch Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration, usw., sedimentiert und/oder gewechselt werden.

Die Konzentration der vorliegenden stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, in den vorliegenden Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, kann mindestens etwa 5 x 10⁶ Zellen/ml, mindestens etwa 10 x 10⁶ Zellen/ml, mindestens etwa 20 x 10⁶ Zellen/ml, mindestens etwa 30 x 10⁶ Zellen/ml oder mindestens etwa 40 x 10⁶ Zellen/ml betragen. Typischerweise liegt die Konzentration zwischen etwa 1 x 10⁶ Zellen/ml und 1 x 10⁷ Zellen/ml, z.B. zwischen etwa 5 x 10⁶ Zellen/ml und 1 x 10⁷ Zellen/ml. In dem in den Beispielen angegebenen klinischen Versuch wurden die eASCs bei einer Konzentration von 5 Millionen Zellen/ml verabreicht.

Demgemäß betrifft ein weiterer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Tochterzellen der vorliegenden stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, z.B. diejenigen Zellen, die von den stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, abgeleitet sind. Solche Tochterzellen können nachfolgende Generationen von stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, sowie abstammende Zellen umfassen, die durch eine Induzierung einer Differenzierung der vorliegenden stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, nach deren Isolierung von dem Explantat, die z.B. in vitro induziert worden ist, erzeugt werden. In bestimmten Ausführungsformen werden die Tochterzellen nach etwa 2, etwa 3, etwa 4, etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8, etwa 9 oder etwa 10 Durchgängen von der Elternpopulation erhalten. Die Tochterzellen können jedoch nach jedweder Anzahl von Durchgängen von der Elternpopulation erhalten werden.

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In bestimmten Ausführungsformen werden die Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, der Erfindung als Teil eines pharmazeutischen Präparats, wie z.B. als steriles Präparat, das frei von unerwünschten Viren, Bakterien und anderen Pathogenen ist, und als pyrogenfreies Präparat bereitgestellt. D.h., für eine Verabreichung an einen Menschen sollten die vorliegenden Zusammensetzungen die Sterilitätsstandards, Pyrogenitätsstandards sowie die allgemeinen Sicherheits- und Reinheitsstandards erfüllen, wie sie vom „FDA Office of Biologies standards“ gefordert werden.

Die vermehrten, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen sind bezüglich des Transplantationswirts allogen. Aufgrund von Schwierigkeiten beim Erhalten von ausreichenden autologen Stammzellen stellen von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen von einem allogenen Spender eine wertvolle alternative Quelle von Stammzellen für eine therapeutische Verwendung dar. Es ist in dem Fachgebiet bekannt, dass stromale Stammzellen von Knochenmark und von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen keine Reaktion von allogenen Lymphozyten in vitro hervorriefen und folglich allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen, die von einem Spender stammen, für jedweden Patienten ungeachtet der MHC-Unverträglichkeit verwendet werden konnten.

Verfahren zum Verabreichen der Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, an Lebewesen, insbesondere an Menschen, die hier detailliert beschrieben werden, umfassen eine Injektion oder Implantation der Zellen in Zielstellen in den Lebewesen, wobei die Zellen in eine Abgabevorrichtung eingebracht werden können, die das Einbringen der Zellen in die Lebewesen mittels Injektion oder Implantation erleichtert. Solche Abgabevorrichtungen umfassen Röhren, wie z.B. Katheter, zum Injizieren von Zellen und Fluiden in den Körper eines empfangenden Lebewesens. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Röhren zusätzlich eine Nadel, wie z.B. eine Spritze, auf, durch welche die Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, an einer gewünschten Stelle in das Lebewesen eingebracht werden können. Die Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, können in eine solche Abgabevorrichtung, wie z.B. eine Spritze, in verschiedenen Formen eingebracht werden. Beispielsweise umfassen die Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, Zusammensetzungen von stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, die in einer Lösung suspendiert sind oder die in einer Trägermatrix eingebettet sind, wenn sie in einer solchen Abgabevorrichtung enthalten sind.

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Pharmazeutisch verträgliche Träger und Verdünnungsmittel umfassen Kochsalzlösung, wässrige Pufferlösungen, Lösungsmittel und/oder Dispersionsmedien. Die Verwendung von solchen Trägern und Verdünnungsmitteln ist bekannt. Die Lösung ist typischerweise in einem Ausmaß steril und fluid, dass sie einfach durch eine Spritze abgegeben werden kann. Typischerweise ist die Lösung unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil und gegen die Verunreinigungswirkung von Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien und Pilzen, durch die Verwendung von z.B. Parabenen, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, konserviert. Lösungen, die Zusammensetzungen der Erfindung sind, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, können durch Einbringen von stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, wie sie hier beschrieben sind, in einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel und gegebenenfalls andere Bestandteile, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, und dann eine Filtrationssterilisation hergestellt werden.

Einige Beispiele für Materialien und Lösungen, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, umfassen: (1) Zucker, wie z.B. Laktose, Glukose und Saccharose, (2) Stärken, wie z.B. Maisstärke und Kartoffelstärke, (3) Cellulose und deren Derivate, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat, (4) pulverförmigen Tragant, (5) Malz, (6) Gelatine, (7) Talk, (8) Hilfsstoffe, wie z.B. Kakaobutter und Zäpfchenwachse, (9) Öle, wie z.B. Erdnussöl, Baumwollsaatöl, Saffloröl, Sesamöl, Olivenöl, Maisöl und Sojabohnenöl, (10) Glykole, wie z.B. Propylenglykol, (11) Polyole, wie z.B. Glycerin, Sorbit, Mannit und Polyethylenglykol, (12) Ester, wie z.B. Ethyloleat und Ethyllaurat, (13) Agar, (14) Puffermittel, wie z.B. Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid, (15) Alginsäure, (16) pyrogenfreies Wasser, (17) isotonische Kochsalzlösung, (18) Ringer's Lösung, (19) Ethylalkohol, (20) pH-gepufferte Lösungen, (21) Polyester, Polycarbonate und/oder Polyanhydride, und (22) weitere nicht-toxische, verträgliche Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden.

In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, ferner ein Haftmittel. In bestimmten Ausführungsformen ist das Haftmittel ein Haftmittel auf Fibrinbasis, wie z.B. ein Fibringel oder ein Fibrinkleber oder ein Polymer oder Haftmittel auf Fibrinbasis oder ein anderes Gewebehaftmittel oder ein anderer chirurgischer Kleber, wie z.B. Cyanacrylat, Kollagen, Thrombin und Polyethylenglykol. Andere Materialien, die verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Calciumalginat, Agarose, die Typen I, II, IV oder andere Kollagenisoformen, Polymilch/Polyglykolsäure, Hyalonuratderivate oder andere Materialien

BE2017/5156 (C. Perka et al., (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311 ; V. F. Sechriest et al., (2000) J.

Biomed. Mater. Res. 49:534-541 ; C. R. Chu et al., (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29:11471154; D. A. Hendrickson et al., (1994) Orthop. Res. 12:485-497). In anderen Ausführungsformen ist das Haftmittel ein flüssiger Verband, wobei Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, des Verfahrens mit dem flüssigen Verbandmaterial gemischt werden. Ein „flüssiger Verband“ ist eine Lösung, die eine Verbindung, wie z.B. ein polymeres Material, umfasst, die auf eine Wunde mit einem Spray oder einer Bürste aufgebracht wird, worauf das Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt wird, so dass ein Schutzfilm auf der Wunde bereitgestellt wird.

Die Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, der Erfindung können auch zum Beschichten eines Trägers, wie z.B. einer medizinischen Vorrichtung, verwendet werden. Beispielsweise kann der Träger ein Nahtmaterial oder ein Faden sein.

Der Träger kann mit Zellen in jedweder dem Fachmann bekannten Weise beschichtet werden, wie z.B. durch Eintauchen, Besprühen, Bestreichen, Bedrucken, usw.

In einer Ausführungsform ist der Träger ein Nahtmaterial, eine Klammer, ein absorbierbarer Faden, ein nicht-absorbierbarer Faden, ein natürlicher Faden, ein synthetischer Faden, ein Monofilamentfaden oder ein Multifilamentfaden (auch als Geflechte bezeichnet). Bevorzugte Verfahren zur Herstellung von Nahtmaterialien und anderen Trägern, die zum Verschließen von Wunden verwendet werden und die mit von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen beschichtet sind, sind in der US-Patentanmeldung Nr. 11/056,241, “Biomaterial for Suturing”, angemeldet am 14. Februar 2005, offenbart, wobei die Anmeldung vollständig unter Bezugnahme einbezogen ist. Die hier offenbarten Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, stellen neue Zusammensetzungen dar, die mit den Verfahren verwendet werden können, die in der US-Patentanmeldung Nr. 11/056,241 offenbart sind.

Ferner kann in jedwede der Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten, mindestens ein therapeutisches Mittel in die Zusammensetzungen einbezogen werden (obwohl dies nicht erforderlich ist und gegebenenfalls ausgeschlossen sein kann). Beispielsweise kann eine Zusammensetzung ein Analgetikum zur Unterstützung bei der Behandlung einer Entzündung oder von Schmerzen an der Stelle der Fistel, oder ein Antiinfektionsmittel zum Verhindern einer Infektion der Stelle, die mit der Zusammensetzung behandelt wird, enthalten.

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Insbesondere umfassen nicht-beschränkende Beispiele für geeignete therapeutische Mittel die folgenden therapeutischen Kategorien: Analgetika, wie z.B. nicht-steroide entzündungshemmende Arzneistoffe, Opiatagonisten und Salicylate; Antiinfektionsmittel, wie z.B. Antihelmintika, Antianaerobika, Antibiotika, Aminoglykosid-Antibiotika, fungizide Antibiotika, Cephalosporin-Antibiotika, Makrolid-Antibiotika, verschiedene ß-Lactam-Antibiotika, Penicillin-Antibiotika, Chinolon-Antibiotika, Sulfonamid-Antibiotika, Tetracyclin-Antibiotika, antimykobakterielle Mittel, antimykobakterielle Antituberkulosemittel, Antiprotozoika, Antimalaria-Antiprotozoika, antivirale Mittel, antiretrovirale Mittel, Skabizide, entzündungshemmende Mittel, kortikosteroide entzündungshemmende Mittel, Antipruritika/Lokalanästhetika, topische Antiinfektionsmittel, entzündungshemmende fungizide topische Antiinfektionsmittel, antivirale topische Antiinfektionsmittel; electrolytische Mittel und Nierenmittel, wie z.B. Säuerungsmittel, alkalisch machende Mittel, Diuretika, Carboanhydrasehemmstoff-Diuretika, Schleifendiuretika, osmotische Diuretika, Kalium-schonende Diuretika, Thiazid-Diuretika, Elektrolytersatzmittel und urikosurische Mittel; Enzyme, wie z.B. Bauchspeicheldrüsenenzyme und thrombolytische Enzyme; Magen-Darm-Mittel, wie z.B. Antidiarrhoika, Antiemetika, entzündungshemmende Magen-Darm-Mittel, entzündungshemmende Salicylat-Magen-Darm-Mittel, antazide Antigeschwürmittel, Magensäurepumpe-Hemmstoff-Antigeschwürmittel, Magenschleimhaut-Antigeschwürmittel, H2-Blocker-Antigeschwürmittel, cholelitholytische Mittel, verdauungsfördernde Mittel, Emetika, Abführmittel und Stuhlerweichungsmittel sowie prokinetische Mittel; allgemeine Anästhetika, wie z.B. Einatmungsanästhetika, halogenierte Einatmungsanästhetika, intravenöse Anästhetika, intravenöse Barbituratanästhetika, intravenöse Benzodiazepinanästhetika und intravenöse Opiatagonist-Anästhetika; Hormone und Hormonmodifiziermittel, wie z.B. Abtreibungsmittel, Nebennierenmittel, kortikosteroide Nebennierenmittel, Androgene, Anti-Androgene, immunbiologische Mittel, wie z.B. Immunglobuline, Immunsuppressiva, Toxoide und Impfstoffe; Lokalanästhetika, wie z.B. Amid-Lokalanästhetika und Ester-Lokalanästhetika; Muskelskelettmittel, wie z.B. entzündungshemmende Antigichtmittel, kortikosteroide entzündungshemmende Mittel, entzündungshemmende Goldverbindungsmittel, immunsuppressive entzündungshemmende Mittel, nichtsteroide entzündungshemmende Arzneistoffe (NSAIDs), entzündungshemmende Salicylatmittel, Mineralien; und Vitamine, wie z.B. Vitamin A, Vitamin B, Vitamin C, Vitamin D, Vitamin E und Vitamin K.

Bevorzugte Klassen von geeigneten therapeutischen Mitteln von den vorstehend genannten Kategorien umfassen: (1) Analgetika im Allgemeinen, wie z.B. Lidocain oder Derivate davon, und nichtsteroide entzündungshemmende Analgetikarzneistoffe (NSAIDs), einschließlich Diclofenac, Ibuprofen, Ketoprofen und Naproxen; (2) Opiatagonist-Analgetika, wie z.B. Kodein, Fentanyl, Hydromorphon und Morphin; (3) Salicylat-Analgetika, wie z.B. Aspirin (ASA)

BE2017/5156 (magensaftresistentes ASA); (4) Hi-Blocker-Antihistaminika, wie z.B. Clemastin und Terfenadin; (5) Antiinfektionsmittel, wie z.B. Mupirocin; (6) antianaerobe Antiinfektionsmittel, wie z.B. Chloramphenicol und Clindamycin; (7) fungizide antibiotische Antiinfektionsmittel, wie z.B. Amphotericin b, Clotrimazol, Fluconazol und Ketoconazol; (8) antibiotische MakrolidAntiinfektionsmittel, wie z.B. Azithromycin und Erythromycin; (9) verschiedene antibiotische ßLactam-Antiinfektionsmittel, wie z.B. Aztreonam und Imipenem; (10) antibiotische PenicillinAntiinfektionsmittel, wie z.B. Nafcillin, Oxacillin, Penicillin G und Penicillin V; (11) antibiotische Chinolon-Antiinfektionsmittel, wie z.B. Ciprofloxacin und Norfloxacin; (12) antibiotische Tetracyclin-Antiinfektionsmittel, wie z.B. Doxycyclin, Minocyclin und Tetracyclin; (13) antimycobacterielle Antituberkulose-Antiinfektionsmittel wie z.B. Isoniazid (INH) und Rifampin;

(14) antiprotozoische Antiinfektionsmittel, wie z.B. Atovaquon und Dapson; (15) antiprotozoische Antimalaria-Antiinfektionsmittel, wie z.B. Chloroquin und Pyrimethamin; (16) anti-retrovirale Antiinfektionsmittel, wie z.B. Ritonavir und Zidovudin; (17) antivirale Antiinfektionsmittel, wie z.B. Acyclovir, Ganciclovir, alpha-lnterferon und Rimantadin; (18) fungizide topische Antiinfektionsmittel, wie z.B. Amphotericin B, Clotrimazol, Miconazol und Nystatin; (19) antivirale topische Antiinfektionsmittel, wie z.B. Acyclovir; (20) Elektrolyt- und Nierenmittel, wie z.B. Lactulose; (21) Schleifendiuretika, wie z.B. Furosemid; (22) Kaliumschonende Diuretika, wie z.B. Triamteren; (23) Thiazid-Diuretika, wie z.B. Hydrochlorthiazid (HCTZ); (24) urikosurische Mittel, wie z.B. Probenecid; (25) Enzyme, wie z.B. RNase und DNase; (26) Antiemetika, wie z.B. Prochlorperazin; (27) entzündungshemmende SalicylatMagen-Darm-Mittel, wie z.B. Sulfasalazin; (28) Magensäurepumpe-HemmstoffAntigeschwürmittel, wie z.B. Omeprazol; (29) H2-Blocker-Antigeschwürmittel, wie z.B.

Cimetidin, Famotidin, Nizatidin und Ranitidin; (30) verdauungsfördernde Mittel, wie z.B. Pankreaslipase; (31) prokinetische Mittel, wie z.B. Erythromycin; (32) Ester-Lokalanästhetika, wie z.B. Benzocain und Procain; (33) entzündungshemmende MuskelskelettKortikosteroidmittel, wie z.B. Beclomethason, Betamethason, Cortison, Dexamethason, Hydrocortison und Prednison; (34) entzündungshemmende Muskelskelett-Immunsuppressiva, wie z.B. Azathioprin, Cyclophosphamid und Methotrexat; (35) nichtsteroide entzündungshemmende Muskelskelett-Arzneistoffe (NSAIDs), wie z.B. Diclofenac, Ibuprofen, Ketoprofen, Ketorlac und Naproxen; (36) Mineralien, wie z.B. Eisen, Calcium und Magnesium;

(37) Vitamin B-Verbindungen, wie z.B. Cyanocobalamin (Vitamin B12) und Niacin (Vitamin B3);

(38) Vitamin C-Verbindungen, wie z.B. Ascorbinsäure; und (39) Vitamin D-Verbindungen, wie z.B. Calcitriol.

In bestimmten Ausführungsformen kann das therapeutische Mittel ein Wachstumsfaktor oder ein anderes Molekül sein, das die Zelldifferenzierung und/oder -proliferation beeinflusst. Wachstumsfaktoren, die Enddifferenzierungszustände zu induzieren, sind in dem Fachgebiet

BE2017/5156 bekannt und können aus jedwedem solchen Faktor ausgewählt werden, von dem gezeigt worden ist, dass er einen Enddifferenzierungszustand induziert. Wachstumsfaktoren zur Verwendung in hier beschriebenen Verfahren können in bestimmten Ausführungsformen Varianten oder Fragmente eines natürlich vorkommenden Wachstumsfaktors sein. Beispielsweise kann eine Variante durch konservative Aminosäureveränderungen und Testen der resultierenden Variante in einem der vorstehend beschriebenen funktionellen Tests oder einem anderen funktionellen Test, der in dem Fachgebiet bekannt ist, erzeugt werden. Konservative Aminosäuresubstitutionen beziehen sich auf die Austauschbarkeit von Resten mit ähnlichen Seitenketten. Beispielsweise ist eine Gruppe von Aminosäuren, die aliphatische Seitenketten aufweisen, Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin; eine Gruppe von Aminosäuren, die aliphatische Hydroxylseitenketten aufweisen, ist Serin und Threonin; eine Gruppe von Aminosäuren, die Amid-enthaltende Seitenketten aufweisen, ist Asparagin und Glutamin; eine Gruppe von Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten ist Phenylalanin,

Tyrosin und Tryptophan; eine Gruppe von Aminosäuren mit basischen Seitenketten ist Lysin,

Arginin und Histidin; und eine Gruppe von Aminosäuren mit Schwefel-enthaltenden Seitenketten ist Cystein und Methionin. Bevorzugte konservative Aminosäuresubstitutionsgruppen sind: Valin-Leucin-Isoleucin, Phenylalanin-Tyrosin, LysinArginin, Alanin-Valin und Asparagin-Glutamin.

Dem Fachmann ist klar, dass Varianten oder Fragmente von Polypeptidwachstumsfaktoren unter Verwendung von herkömmlichen Techniken erzeugt werden können, wie z.B. Mutagenese, einschließlich die Erzeugung von (einer) getrennten Punktmutation(en), oder durch Trunkierung. Beispielsweise kann eine Mutation zu Varianten führen, die im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität oder einen Teilsatz der biologischen Aktivität eines Polypeptidwachstumsfaktors beibehalten, aus dem sie abgeleitet worden sind.

3. Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthalten

Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von ASCs zur Bereitstellung von eASCs und Zellpopulationen der Erfindung und von Zusammensetzungen, die Zellpopulationen der Erfindung umfassen, sind in dem Fachgebiet bekannt. Typische Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die Zellpopulationen enthalten, umfassen die folgenden Schritte:

(i) Isolierung von ASCs von der stromalen Fraktion von adipösem Gewebe und Auswahl durch Haftung an einer geeigneten Oberfläche, wie z.B. Kunststoff,

BE2017/5156 (ii) Vermehrung von ASCs zur Bereitstellung von Zellpopulationen der Erfindung, die eASCs umfassen.

Gegebenenfalls können die Zellpopulationen der Erfindung während und/oder nach dem Vermehrungsschritt (ii) kryokonserviert werden. Gegebenenfalls kann der Phänotyp der Zellpopulationen der Erfindung während und/oder nach dem Vermehrungsschritt (ii) bewertet werden. Gegebenenfalls können die Zellpopulationen der Erfindung anschließend an den Vermehrungsschritt (ii) isoliert werden und in einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder in pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln resuspendiert werden.

ASCs können durch jedweden Standard in dem Fachgebiet erhalten werden. Typischerweise werden die Zellen durch Ablösen der Zellen von dem Quellengewebe (z.B. Fettabsaugungsmaterial oder adipösem Gewebe) erhalten, typischerweise durch Behandeln des Gewebes mit einem Verdauungsenzym, wie z.B. Kollagenase. Das verdaute Gewebematerial wird dann typischerweise durch ein Filter zwischen etwa 20 Mikrometer bis 1 mm filtriert. Die Zellen werden dann isoliert (typischerweise durch Zentrifugation) und auf einer Anhaftoberfläche (typischerweise Gewebekulturplatten oder -kolben) kultiviert. Solche Verfahren sind in dem Fachgebiet bekannt und z.B. im US-Patent Nr. 6,777,231 offenbart. Gemäß dieser Vorgehensweise werden Fettabsaugungsmaterialien von adipösem Gewebe erhalten und die Zellen davon entnommen. Im Verlauf dieser Vorgehensweise können die Zellen zur Entfernung von kontaminierenden Rückständen und roten Blutzellen vorzugsweise mit PBS gewaschen werden. Die Zellen werden mit Kollagenase (z.B. bei 37 °C für 30 Minuten, 0,075 % Kollagenase, Typ I, Invitrogen, Carlsbad, CA) in PBS verdaut. Zum Beseitigen von roten Blutzellen kann die verdaute Probe gewaschen werden (z.B. mit 10 % fötalem Rinderserum), mit 160 mmol/Liter NH4CI behandelt werden und schließlich in vollständigem DMEM-Medium (DMEM, das 10 % FBS, 2 mmol/Liter Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin enthält) suspendiert werden. Die Zellen können durch ein 40 pm-Nylonnetz filtriert werden.

Die Zellen werden in einem geeigneten Gewebekulturbehälter kultiviert, der eine Oberfläche umfasst, die für das Anhaften von ASCs geeignet ist, wie z.B. Kunststoff. Nicht anhaftende Zellen werden z.B. durch Waschen in einem geeigneten Puffer entfernt, so dass eine isolierte Population von anhaftenden stromalen Zellen (z.B. ASC) erhalten wird. Auf diese Weise isolierte Zellen können auf Gewebekulturkolben ausgesät werden (vorzugsweise 2-3 x 104 Zellen/cm²) und bei 37 °C und 5 % CO2 vermehrt werden, wobei das Kulturmedium alle 3 bis 4 Tage gewechselt wird. Zellen werden vorzugsweise von der Anhaftoberfläche abgelöst (z.B. mit Trypsin) und in einen neuen Kulturkolben (1000 Zellen/cm²) überführt („passagiert“), wenn die Kulturen etwa 90 % Konfluenz erreicht haben.

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Die Zellisolierung wird vorzugsweise unter sterilen Bedingungen oder GMP-Bedingungen durchgeführt.

In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren: (a) Sammeln von adipösem Gewebe von einem Lebewesen, (b) Erhalten einer Zellsuspension durch enzymatischen Verdau, (c) Sedimentieren der Zellsuspension und Resuspendieren der Zellen in einem Kulturmedium, (d) Kultivieren der Zellen für mindestens etwa 10 Tage und (g) Vermehren der Zellen für mindestens zwei Kulturpassagen.

Die von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen sind allogen, d.h., nicht von dem adipösen Gewebe des Lebewesens isoliert, in das die schließlich erhaltene Zusammensetzung, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthält, eingebracht werden soll.

In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen für mindestens etwa 15, mindestens etwa 20 Tage, mindestens etwa 25 Tage oder mindestens etwa 30 Tage kultiviert. Typischerweise verbessert die Vermehrung der Zellen in der Kultur die Homogenität des Zellphänotyps in der Zellpopulation, so dass eine im Wesentlichen reine oder homogene Population erhalten wird.

In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen in der Kultur für mindestens drei Kulturpassagen vermehrt oder „mindestens dreimal passagiert“. In anderen Ausführungsformen werden die Zellen mindestens viermal, mindestens fünfmal, mindestens sechsmal, mindestens siebenmal, mindestens achtmal, mindestens neunmal oder mindestens zehnmal passagiert. Es ist bevorzugt, dass Zellen mehr als dreimal passagiert werden, um die Homogenität des Zellphänotyps in der Zellpopulation zu verbessern. Tatsächlich können die Zellen in der Kultur unbegrenzt vermehrt werden, solange die Homogenität des Zellphänotyps verbessert wird und die Differenzierungskapazität aufrechterhalten wird.

In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen in der Kultur für mindestens drei Populationsverdopplungen vermehrt. In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen in der Kultur für mindestens vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, 15 oder 20 Populationsverdopplungen vermehrt. In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen in der Kultur für weniger als sieben, acht, neun, zehn, 15 oder 20 Populationsverdopplungen vermehrt. In be28

BE2017/5156 stimmten Ausführungsformen werden die Zellen in der Kultur für zwischen etwa 5 und 10 Populationsverdopplungen vermehrt. In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen in der Kultur für zwischen etwa 10 und 15 Populationsverdopplungen vermehrt.

In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen in der Kultur für zwischen etwa 15 und 20 Populationsverdopplungen vermehrt, beispielsweise etwa für 16 Populationsverdopplungen.

Zellen können durch jedwede Techniken kultiviert werden, die in dem Fachgebiet zum Kultivieren von Stammzellen bekannt sind. Eine Diskussion verschiedener Kultivierungstechniken sowie deren Maßstabsvergrößerung findet sich in R. I. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4. Auflage, Wiley-Liss 2000. Zellen können unter Verwendung von Kulturkolben oder Bioreaktoren vermehrt werden, die für eine Vermehrung in einem großen Maßstab geeignet sind. Bioreaktoren, die für die Vermehrung von mesenchymalen stromalen Zellen in einem großen Maßstab geeignet sind, sind handelsüblich und können sowohl 2D (d.h., im Wesentlichen planare) als auch 3D-Vermehrungsbioreaktoren umfassen. Beispiele für solche Bioreaktoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, einen Pfropfenströmungsbioreaktor, einen Perfusionsbioreaktor, einen kontinuierlich gerührten Tankbioreaktor, einen Festbettbioreaktor. In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen durch eine Einschichtkultur kultiviert. In einer Ausführungsform werden die Zellen so kultiviert und passagiert, wie es im nachstehenden Beispiel A beschrieben ist.

Jedwedes Medium, das stromalen Zellen in einer Gewebekultur als Träger dienen kann, kann verwendet werden. Medienformulierungen, die das Wachstum von Fibroblasten unterstützen können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Dulbecco’s modifiziertes Eagle’s Medium (DMEM), alpha-modifiziertes minimal essentielles Medium (alpha.MEM) und Roswell Park Memorial Institute Medien 1640 (RPMI Medien 1640). Typischerweise werden den vorstehend genannten Medien 0 bis 20 % fötales Rinderserum (FBS) oder 1 bis 20 % Pferdeserum zugesetzt, um das Wachstum von stromalen Zellen und/oder Chondrozyten zu unterstützen. Ein definiertes Medium könnte jedoch verwendet werden, wenn die erforderlichen Wachstumsfaktoren, Cytokine und Hormone in FBS für stromale Zellen und Chondrozyten identifiziert werden und in geeigneten Konzentrationen in dem Wachstumsmedium bereitgestellt werden. Medien, die in den Verfahren der Erfindung geeignet sind, können eine oder mehrere interessierende Verbindung(en) enthalten, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, antibiotische, mitogene oder differenzierende Verbindungen für stromale Zellen. Die Zellen werden bei Temperaturen zwischen 31 °C bis 37 °C in einem befeuchteten Inkubator wachsen gelassen. Der Kohlendioxidgehalt wird zwischen 2 % bis 10 % gehalten und der

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Sauerstoffgehalt wird zwischen 1 % und 22 % gehalten. Zellen können in dieser Umgebung für Zeiträume bis zu 4 Wochen verbleiben.

Antibiotika, mit denen das Medium ergänzt werden kann, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Penicillin und Streptomycin. Die Konzentration von Penicillin in dem chemisch definierten Kulturmedium beträgt etwa 10 bis etwa 200 Einheiten pro ml. Die Konzentration von Streptomycin in dem chemisch definierten Kulturmedium beträgt etwa 10 bis etwa 200 pg/ml.

Die von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen können mit einer interessierenden Nukleinsäure unter Verwendung einer Plasmidvektorstrategie, viralen Vektorstrategie oder alternativen Vektorstrategie stabil oder vorübergehend transfiziert oder transduziert werden. Interessierende Nukleinsäuren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die Genprodukte kodieren, welche die Erzeugung von extrazellulären Matrixkomponenten verstärken, die in dem zu reparierenden Gewebetyp, z.B. der Darmwand oder der Vaginalwand, gefunden werden.

Die Transduktion von viralen Vektoren, die regulatorische Gene aufweisen, in die stromalen Stammzellen kann mit viralen Vektoren (Adenovirus, Retrovirus, adenoassoziiertem Virus oder einem anderen Vektor), die mit einem Cäsiumchlorid-„Banding“ oder einem anderen Verfahren bei einer Multiplizität der Infektion (virale EinheitemZelle) zwischen 10:1 bis 2000:1 gereinigt worden sind, durchgeführt werden. Zellen werden dem Virus in serumfreiem oder serumenthaltenden Medium in der Abwesenheit oder Gegenwart eines kationischen Detergenzes, wie z.B. Polyethylenimin oder Lipofectamin™, für einen Zeitraum von 1 Stunde bis 24 Stunden ausgesetzt (T. Byk et al., (1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502; B. Sommer et al., (1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49).

Andere geeignete Verfahren zum Überführen von Vektoren oder Plasmiden in Stammzellen umfassen Lipid/DNA-Komplexe, wie z.B. diejenigen, die in den US-Patenten Nr. 5,578,475, 5,627,175, 5,705,308, 5,744,335, 5,976,567, 6,020,202 und 6,051,429 beschrieben sind. Geeignete Reagenzien umfassen Lipofectamin, eine 3:1 (Gew./Gew.) Liposomenformulierung des polykationischen Lipids 2,3-Dioleyloxy-N-[2(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA) (Chemical Abstracts-Registriername: N-[2-(2,5-Bis[(3aminopropyl)amino]-1-oxpentyl}amino)ethyl]-N,N-dimethyl-2,3-bis(9-octadecenyloxy)-1-propanaminiumtrifluoracetat) und das neutrale Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) in membranfiltriertem Wasser. Beispielhaft ist die Formulierung Lipofectamin 2000™ (erhältlich von Gibco/Life Technologies, # 11668019). Weitere Reagenzien umfassen: FuGENETM 630

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Transfektionsreagenz (ein Gemisch von Lipiden in nicht-liposomaler Form und anderen Verbindungen in 80 % Ethanol, erhältlich von Roche Diagnostics Corp., # 1814443) und LipoTAXITM-Transfektionsreagenz (eine Lipidformulierung von Invitrogen Corp., #204110). Die Transfektion von Stammzellen kann mittels Elektroporation durchgeführt werden, wie es in M. L. Roach und J. D. McNeish, (2002) Methods in Mol. Biol. 185:1, beschrieben ist. Geeignete virale Vektorsysteme zur Erzeugung von Stammzellen mit stabilen genetischen Veränderungen können auf Adenoviren und Retroviren basieren und können mittels handelsüblicher Viruskomponenten hergestellt werden.

Die Transfektion von Plasmidvektoren, die regulatorische Gene tragen, in die stromalen

Stammzellen kann in die Zellen in Einschichtkulturen unter Verwendung von Calciumphosphat-DNA-Fällverfahren oder Verfahren mit einem kationischen Detergenz (Lipofectamin™,

DOTAP) oder in dreidimensionalen Kulturen durch Einbringen der Plasmid-DNA-Vektoren direkt in das bioverträgliche Polymer (J. Bonadio et al., (1999) Nat. Med. 5:753-759) durchgeführt werden.

Für das Verfolgen und Erfassen von funktionellen Proteinen, die durch diese Gene kodiert werden, werden die viralen Vektoren oder Plasmid-DNA-Vektoren ein einfach bestimmbares Markergen enthalten, wie z.B. grün fluoreszierendes Protein oder beta-Galaktosidase-Enzym, die beide durch histochemische Mittel verfolgt werden können.

4. Behandlung von komplexen Perianalfisteln

Die Erfindung betrifft die Behandlung von komplexen Perianalfisteln in Patienten mit Morbus Crohn unter Verwendung von vermehrten allogenen, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen. Die von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen umfassen typischerweise eine hier beschriebene Zusammensetzung, die stromale Stammzellen enthält, die von adipösem Gewebe stammen und die manchmal als „Cx601“ bezeichnet werden. In den hier beschriebenen Verfahren können jedoch andere Präparate von stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, verwendet werden, wie z.B. diejenigen, die in den US-Patenten Nr. 6,777,231 und 6,555,374 und in der US-Patentanmeldung Nr. 11/065,461 “Identification and Isolation of Multipotent Cells From Non-Osteochondral Mesenchymal Tissue”, eingereicht am 25. Februar 2005, beschrieben sind.

Die Beispiele zeigen, dass allogène ASCs eine überraschend wirksame Therapie für komplexe Perianalfisteln in Patienten mit Morbus Crohn sind, wodurch eine einzelne Verabreichung selbst in den am schwierigsten zu behandelnden, sehr komplexen Fisteln, die nicht

BE2017/5156 auf vorhergehende Behandlungen angesprochen haben, einen schnellen und anhaltenden therapeutischen Effekt bereitstellen kann. Beispielsweise zeigt sich ein Nutzen typischerweise bei etwa 6 Wochen, wobei der Nutzen bis 24 Wochen ausgehend von der Therapie anhält.

Einer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von komplexen Perianalfisteln in einem Patienten mit Morbus Crohn das intraläsionale Injizieren von etwa 120 Millionen vermehrten allogenen, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen in alle Gänge der Fistel. Um einen Zweifel auszuschließen, werden dem Patienten in dieser Ausführungsform in einem einzelnen Vorgang 120 Millionen Zellen verabreicht, wobei jeder Fisteltrakt mindestens einen Anteil dieser Dosierung erhält. Etwa die Hälfte der Dosis wird in das Gewebe injiziert, das die innere Öffnung oder inneren Öffnungen umgibt. Die andere Hälfte wird entlang des Gangs oder der Gänge der Fistel in die Fistelwände injiziert (nicht tiefer als 2 mm), wodurch mehrere Mikrobläschen erzeugt werden. Die Daten in den Beispielen zeigen, dass diese einzelne Verabreichung eine kombinierte Rückbildung innerhalb von 24 Wochen oder weniger bereitstellen kann, selbst innerhalb von etwa 6 Wochen oder innerhalb von etwa 8 Wochen. Demgemäß besteht die Behandlung in einer Ausführungsform aus dieser einzelnen intraläsionalen Verabreichung von 120 Millionen eASCs.

Die intraläsionale Injektion wird typischerweise wie in dem als Beispiel genannten klinischen Versuch durchgeführt, wodurch die Zellsuspension durch die innere(n) Öffnung(en) (wobei die Spritze durch den Anus eingeführt wird) und durch die Fistelgangwände (wobei die Spritze durch die äußere Öffnung der Fistel eingeführt wird) injiziert wird.

Der Patient kann männlich oder weiblich sein. Der Patient ist typischerweise ein Erwachsener.

In einer Ausführungsform werden jedwede Fadeneinlagen, die vorliegen können, zuerst entfernt. Typischerweise wird die Fistel vor der Verabreichung der eASCs ausgeschabt. Innere Öffnungen können gegebenenfalls vernäht werden. Die eASCs werden dann mit einer feinen langen Nadel verabreicht. Wie es vorstehend angegeben ist, wird etwa die Hälfte der Dosis in das Gewebe injiziert, das die vernähte(n) innere(n) Öffnung(en) umgibt. Die andere Hälfte wird entlang des Fistelgangs oder der Fistelgänge in die Fistelwände injiziert (nicht tiefer als 2 mm), wobei mehrere Mikroblasen erzeugt werden.

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Vor der Therapie gemäß der Erfindung kann bei einem Screening zum Führen der chirurgischen Vorgänge eine Becken-MRI-Abtastung durchgeführt werden. Bei den Patienten kann je nach klinischer Indizierung > 2 Wochen vor der Verabreichung des Untersuchungsprodukts auch eine Fistelausschabung und eine Fadeneinlagenanordnung durchgeführt werden (Fig. 1). Wenn eine Fadeneinlage angeordnet worden ist, wird diese unmittelbar vor der Verabreichung des Untersuchungsprodukts herausgezogen.

Der zu behandelnde Patient leidet an Morbus Crohn, typischerweise an luminalem Morbus Crohn. Typischerweise leidet der Patient an nicht aktivem oder schwach aktivem luminalen Morbus Crohn, wie er beispielsweise durch einen Morbus Crohn-Aktivitätsindex (CDAI) von <

220 festgelegt ist^A24. Der Patient kann für mindestens 6 Monate an Morbus Crohn leiden.

Der Patient weist mindestens eine komplexe Perianalfistel auf. In einer Ausführungsform weist der Patient keine(n) rektovaginale Fistel, Rektalstenose, Analstenose, aktive schwere Proktitis (definiert durch die Gegenwart von oberflächlichen oder tiefen Geschwüren), divertierenden Stomata oder Abszess oder Ansammlungen von >2 cm auf, die durch das chirurgische Vorbereitungsverfahren nicht beseitigt worden sind.

Patienten sind bezüglich mindestens einer vorhergehenden Arzneistofftherapie resistent. Die vorhergehende Therapie kann ein Kleinmolekül-Arzneistoff oder ein biologisches medizinisches Produkt sein. Typischerweise hat der Patient die Behandlung für mindestens etwa 4,

6, 12, 18, 24 oder 36 Wochen erhalten und zeigt immer noch Symptome der aktiven Erkrankung. Mit anderen Worten, selbst nach einer Behandlung für mindestens etwa 4, 6, 12, 18, oder 36 Wochen wird die Schwere der Fistel nicht vermindert. Die vorhergehende Therapie kann eine antibiotische Therapie, wie z.B. Ciprofloxacin oder Metronidazol, eine Immunsuppressionstherapie (z.B. ein Purinanalogon, wie z.B. Azathioprin oder 6-Mercaptopurin, ein Pyrimidinanalogon, wie z.B. Fluoruracil, oder ein Folsäureanalogon, wie z.B. Methotraxat), oder eine anti-TNF-Therapie sein, wie z.B. Adalimumab (Humira), Certolizumab (Cimzia),

Etanercept (Enbrel), Golimumab (Simponi) oder Infliximab (Remicade) sein. Geeignete Patienten sind typischerweise gegen mindestens eine der folgenden Behandlungen resistent (keine Reaktion): Nach 1 Monat Antibiotikum (z.B. Ciprofloxacin, Metronidazol); und/oder nach 3 Monaten Immunsuppressionsmittel (z.B. Azathioprin, 6-Mercaptopurin); und/oder nach dem Beginn oder dem Aufrechterhalten von anti-TNF-Therapien (z.B. Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab) bei einer stabilen Dosis.

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In einer Ausführungsform ist der Patient bezüglich einer Behandlung mit einem Immunsuppressionsmittel (z.B. Azathioprin, 6-Mercaptopurin) und einem TNF-a-Hemmstoff (z.B. Infliximab oder Adalimumab) resistent.

Ein typischer Patient weist daher einen nicht-aktiven luminalen Morbus Crohn (CDAI < 220), der für mindestens sechs Monate diagnostiziert worden ist, mit einer komplexen Perianalfistel mit 1 oder 2 inneren Öffnungen und 2 oder 3 äußeren Öffnungen auf, der eine unzureichende Reaktion auf eine oder mehrere von Antibiotikum-, Immunsuppressionsmittel- oder anti-TNF-Therapien gezeigt hat. Eine Fistel mit 1 oder 2 inneren Öffnungen und 3 äußeren Öffnungen ist sehr komplex und war bisher sehr schwer zu behandeln. In einer weiteren Ausführungsform erhält der Patient zum Zeitpunkt der Behandlung gemäß der Erfindung (a) keine anti-TNF-Therapie und keine Immunsuppressionsmitteltherapie oder (b) sowohl eine anti-TNF-Therapie als auch eine Immunsuppressionsmitteltherapie. Es ist besonders überraschend, dass eASCs die kombinierte Rückbildung (in der Woche 24) bei Patienten verbessern können, die sowohl eine anti-TNF-Therapie als auch eine Immunsuppressionsmitteltherapie erhalten, wobei es sich um die besten, gegenwärtig verfügbaren Therapien handelt (vgl. die Figur 3C).

Die komplexe Perianalfistel weist mindestens zwei äußere Öffnungen auf, wie z.B. 3 oder mehr äußere Öffnungen. Einige Fisteln können 4 oder 5 äußere Öffnungen aufweisen.

Die komplexe Perianalfistel weist typischerweise mehrere Gänge, mindestens zwei innere Öffnungen oder drei äußere Öffnungen auf. Die Fistel kann gegebenenfalls zwei oder drei dieser Merkmale aufweisen, wie z.B.: Mehrere Gänge und mindestens zwei innere Öffnungen; mehrere Gänge und drei äußere Öffnungen; mindestens zwei innere Öffnungen und drei äußere Öffnungen; oder mehrere Gänge, mindestens zwei innere Öffnungen und drei äußere Öffnungen. In einer Ausführungsform enthält die komplexe Perianalfistel nicht mehr als zwei innere Öffnungen und drei äußere Öffnungen, wobei die Fistel beispielsweise aus 1 oder 2 inneren Öffnungen und 2 oder 3 äußeren Öffnungen besteht (z.B. 11O/2EO, 11O/3EO,

2IO/2EO oder 2IO/3EO).

Nach der eASC-Verabreichung können Patienten gegebenenfalls für nicht mehr als 4 Wochen mit Antibiotika behandelt werden. Immunsuppressionsmittel und anti-TNFs können während der Behandlung bei stabilen Dosen gehalten werden, z.B. bis zu einer Reaktion, einer klinischen Rückbildung oder einer kombinierten Rückbildung.

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Patienten, die keine vorhergehende Behandlung für Morbus Crohn mit Perianalfisteln erhalten haben, einschließlich Antibiotika, und diejenigen, bei denen eine vorhergehende Chirurgie für die aktive Fistel durchgeführt worden ist, die von einer Drainage oder einer Fadeneinlageanordnung verschieden ist, sind typischerweise ausgeschlossen. Patienten sind typischerweise nicht für eine Behandlung geeignet, wenn sie Glukokortikosteroide innerhalb von 4 Wochen unmittelbar vor der eASC-Behandlung erhalten haben. Eine Steroidbehandlung kann zur Behandlung von Schüben einer luminalen Erkrankung während der Nachsorge mit einer Anfangsdosis von 40 mg zulässig sein, die während eines Maximums von 12 Wochen verabreicht wird.

In bestimmten Ausführungsformen, z.B. wenn die erste Abgabe von Zellen unzureichend ist, kann das Verfahren ferner ein weiteres Verabreichen der eASCs umfassen. Diese weitere Verabreichung kann umfassen: (c) Abgeben einer zweiten Dosis von mindestens etwa 20 x 10⁶ Zellen, mindestens etwa 30 x 10⁶ oder mindestens etwa 40 x 10⁶ stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, wie z.B. etwa 120 Millionen Zellen, z.B. in einer Zusammensetzung der Erfindung, die stromale Stammzellen enthält, die von adipösem Gewebe stammen, an das (gegebenenfalls geschlossene vernähte) innere Loch und die Fistelwände.

In einigen Ausführungsformen umfasst ein Verfahren zur Behandlung einer behandlungsresistenten, komplexen Perianalfistel in einem Lebewesen: (a) Schließen des inneren Lochs mit einem Nahtmaterial, das allogène eASCs umfasst. Solche mit Zellen in den vorliegenden Zusammensetzungen, die stromale Stammzellen enthalten, die von adipösem Gewebe stammen, beschichteten Nahtmaterialien sind detailliert in der US-Patentanmeldung Nr.

11/056,241 beschrieben, die am 14. Februar 2005 eingereicht worden ist und hier unter Bezugnahme einbezogen ist.

Die Verfahren können in einigen Ausführungsformen ferner umfassen: Tiefes Ausschaben mindestens eines Fistelgangs und/oder Füllen des Fistelgangs mit einem Material. In bestimmten Ausführungsformen kann das Verfahren ferner das Abgeben von mindestens etwa 10 x 10⁶ von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen, z.B. von einer vorliegenden zellulären Zusammensetzung, an das Material umfassen. Typischerweise ist das Material ein Polymer oder Haftmittel auf Fibrinbasis, wie z.B. ein Fibrinkleber oder -gel. In bestimmten Ausführungsformen ist die Dosis von mindestens etwa 10 x 10⁶ von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen bereits innerhalb des Materials enthalten, z.B. derart, dass das Material die Zusammensetzung umfasst, die Stammzellen enthält, die von adipösem Gewebe stammen.

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In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Behandeln einer Fistel in einem Lebewesen:

(i) Tiefes Ausschaben mindestens eines Fistelgangs (ii) Schließen des inneren Lochs des ausgeschabten Gangs mit einem Nahtmaterial (iii) Abgeben von etwa 120 Millionen allogenen, vermehrten, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen an eine (gegebenenfalls geschlossene vernähte) innere Öffnung und die Fistelwände

z.B. in einer Zusammensetzung der Erfindung, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthält.

Eine weitere Verabreichung von Zellen ist nicht erforderlich und kann gegebenenfalls ausgeschlossen sein. In bestimmten Ausführungsformen kann das Verfahren jedoch ferner umfassen:

(iv) Abgeben einer zweiten Dosis von mindestens etwa 20 x 10⁶ Zellen, mindestens etwa 30 x 10⁶ oder mindestens etwa 40 x 10⁶ stromalen Stammzellen, die von adipösem Gewebe stammen, wie z.B. etwa 120 Millionen eASCs, typischerweise an eine geschlossene vernähte innere Öffnung,

Der Schritt (i) wird typischerweise durch tiefes Ausschaben aller zu behandelnden Fistelgänge durchgeführt, wobei z.B. eine Ausschabnadel in den Fistelgang eingeführt wird und eine induzierte Blutung durch Ausschaben der Fistelwände erzeugt wird, um natürliches Fibrin zu erhalten, das den Fistelgang füllen wird. Vorhergehende klinische Studien durch die Erfinder legen nahe, dass das durch dieses Ausschaben erzeugte natürliche Fibrin verglichen mit der Verwendung von künstlichen Fibrinabdichtungsmitteln eine bevorzugte Option ist, so dass in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung die zu behandelnden Fistelgänge nicht mit einem solchen Material gefüllt werden.

Der Schritt (iv) wird durch lokales Abgeben der Zellen, z.B. einer Zusammensetzung, die von adipösem Gewebe abgeleitete stromale Stammzellen enthält, durch Injektion in die Fistelwände entlang des Fistelgangs durchgeführt. Beispielsweise werden mehrfache Injektionen von 10 Millionen Zellen entlang 3 cm des Fistelgangs durchgeführt.

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Die Fistel kann für eine chirurgische Reparatur mittels jedweden Verfahrens erreicht werden, das in dem Fachgebiet bekannt ist, wie z.B. über einen Einschnitt, einen Katheter, usw.

Die vorstehend beschriebenen Verfahren können ferner das Verabreichen eines therapeutischen Mittels an das zu behandelnde Lebewesen umfassen, und zwar z.B. systemisch oder lokal an der Nahtstelle. In bestimmten Ausführungsformen werden die von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen in einer Zusammensetzung, die von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen enthält, die ein therapeutisches Mittel enthält, formuliert, wie es vorstehend beschrieben worden ist. In anderen Ausführungsformen wird das therapeutische Mittel separat, wie z.B. gleichzeitig mit den Verfahren, verabreicht, bevor das Verfahren durchgeführt wird oder nachdem das Verfahren durchgeführt worden ist. In einigen Ausführungsformen wird das therapeutische Mittel an das Lebewesen vor, während oder nach der Durchführung der Verfahren mit dem Lebewesen verabreicht. Beispielhafte therapeutische Mittel sind vorstehend beschrieben. In bevorzugten Ausführungsformen werden therapeutische Mittel zur Behandlung von Morbus Crohn an das Lebewesen verabreicht. Beispielhafte therapeutische Mittel für Morbus Crohn sind entzündungshemmende Mittel, wie z.B. Mittel, die Mesalamin umfassen, immunsuppressive Mittel, wie z.B. 6-Mercaptopurin und Azathioprin, biologische Mittel, wie z.B. Infliximab (Remicade®), Antibiotika und Antidiarrhöemittel, wie z.B. Diphenoxylat, Loperamid und Kodein.

Es kann eine unterstützende Behandlung erforderlich sein. Beispielsweise können Immunsuppressiva vor, während und/oder nach der Behandlung zum Verhindern von GVHD gemäß in dem Fachgebiet bekannter Verfahren verabreicht werden. Vor der Verabreichung können die Zellen in dem Fachgebiet bekannter Verfahren auch modifiziert werden, so dass eine Immunreaktion des Lebewesens bezüglich der Zellen oder umgekehrt unterdrückt wird.

Die Dosierung von jedwedem therapeutischen Mittel wird abhängig von den Symptomen, dem Alter und dem Körpergewicht des Patienten, der Art und der Schwere der zu behandelnden oder verhindernden Erkrankung, dem Verabreichungsweg und der Form des Mittels variieren. Jedwede der vorliegenden Formulierungen kann in einer Einzeldosis oder in aufgeteilten Dosen verabreicht werden. Dosierungen für die therapeutischen Mittel können durch Techniken einfach bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind oder die hier gelehrt werden. Ferner können auch Gemische von mehr als einem therapeutischen Mittel verabreicht werden oder mehrere therapeutische Mittel können in getrennten Zusammensetzungen verabreicht werden.

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Die genaue Zeit der Verabreichung und die genaue Menge von irgendeinem bestimmten Mittel, welche die effektivste Behandlung in einem gegebenen Patienten ergeben, werden von der Aktivität, der Pharmakokinetik und der Bioverfügbarkeit einer bestimmten Verbindung, dem physiologischen Zustand des Patienten (einschließlich das Alter, das Geschlecht, den Krankheitstyp und das Krankheitsstadium, den allgemeinen physischen Zustand, das Ansprechen auf eine gegebene Dosierung und den Typ der Medikation), dem Verabreichungsweg und dergleichen abhängen. Die hier angegebenen Richtlinien können zur Optimierung der Behandlung, wie z.B. zum Bestimmen der optimalen Zeit und/oder der optimalen Menge der Verabreichung, verwendet werden, das nicht mehr als Routineexperimente erfordert, die aus dem Überwachen des Lebewesens und dem Einstellen der Dosierung und/oder des zeitlichen Ablaufs bestehen.

Während das Lebewesen behandelt wird, kann die Gesundheit des Patienten durch Messen von einem oder mehreren der relevanten Indizes bei vorgegebenen Zeiten während eines 24 Stunden-Zeitraums überwacht werden. Eine Behandlung, einschließlich eine Ergänzung,

Mengen, Zeiten einer Verabreichung und eine Formulierung können gemäß den Ergebnissen einer solchen Überwachung optimiert werden. Der Patient kann periodisch erneut bewertet werden, um das Ausmaß der Verbesserung durch Messen derselben Parameter zu bestimmen, wobei die erste derartige erneute Bewertung typischerweise am Ende von vier Wochen ab dem Beginn der Therapie stattfindet und anschließende erneute Bewertungen alle vier bis acht Wochen während der Therapie stattfinden und dann alle drei Monate danach. Die Therapie kann für mehrere Monate oder sogar Jahre fortgesetzt werden, wobei ein Minimum von einem Monat eine typische Länge der Therapie für Menschen ist. Einstellungen der Menge(n eines verabreichten Mittels und gegebenenfalls derzeit der Verabreichung können auf der Basis dieser erneuten Bewertungen vorgenommen werden.

Die hier beispielhaft angegebene kombinierte Rückbildung der Fistel umfasst sowohl eine klinische als auch eine radiologische Rückbildung. Die radiologische Bewertung der Rückbildung wird typischerweise durch MRI durchgeführt, wobei es sich um eine bekannte Technik handelt. Andere Bildgebungstechniken können alternativ verwendet werden, wie z.B. eine endorektale Ultrasonographie. Diese Bildgebungstechniken bewerten das Vorliegen von Abszessen oder Ansammlungen.

Die Behandlung kann mit kleineren Dosierungen begonnen werden, die kleiner sind als die optimale Dosis der Verbindung. Danach kann die Dosierung um kleine Inkremente erhöht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung erreicht wird.

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Die kombinierte Verwendung mehrerer therapeutischer Mittel kann die erforderliche Dosierung für jedwede einzelne Komponente vermindern, da das Einsetzen und die Dauer der Wirkung der verschiedenen Komponenten komplementär sein können. Bei einer solchen kombinierten Therapie können die verschiedenen Wirkstoffe zusammen oder getrennt und gleichzeitig oder zu verschiedenen Zeiten während eines Tages verabreicht werden.

Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit der vorliegenden Verbindungen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren z.B. zur Bestimmung der LD50 und der ED50 bestimmt werden. Zusammensetzungen, die große therapeutische Indizes aufweisen, sind bevorzugt. Obwohl Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen aufweisen, verwendet werden können, sollte darauf geachtet werden, dass ein Abgabesystem gestaltet wird, das die Mittel zu der gewünschten Stelle bringt, um Nebenwirkungen zu vermindern.

Die aus den Zellkulturtests und Tierversuchen erhaltenen Daten können bei der Formulierung eines Bereichs einer Dosierung zur Verwendung bei Menschen verwendet werden. Die Dosierung von jedwedem therapeutischen Mittel oder alternativ von jedweden Komponenten darin liegt typischerweise innerhalb eines Bereichs der Kreislaufkonzentrationen, welche die ED50 mit einer geringen oder keiner Toxizität umfassen. Die Dosierung kann abhängig von der eingesetzten Dosierungsform und dem verwendeten Verabreichungsweg innerhalb dieses Bereichs variieren. Für Mittel der vorliegenden Erfindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich von Zellkulturtests abgeschätzt werden. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, so dass eine Kreislaufplasmakonzentration erreicht wird, welche die IC50 (d.h., die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Hemmung von Symptomen erreicht) umfasst, die in einer Zellkultur bestimmt worden ist. Solche Informationen können zur genaueren Bestimmung von geeigneten Dosen für Menschen verwendet werden. Plasmakonzentrationen können z.B. durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen werden.

5. Klinische Reaktion und Rückbildung

Die allogenen eASCs der Erfindung sind bei der Behandlung von behandlungsresistenten komplexen Perianalfisteln in Patienten mit Morbus Crohn überraschend effektiv. Der primäre Endpunkt, die kombinierte Rückbildung in der Woche 24, wird statistisch erfüllt; Cx601 ist einem Placebo statistisch überlegen. Beide sekundären Schlüsselendpunkte, die klinische Rückbildung und die Reaktion in der Woche 24, erfüllten die statistische Grenzsignifikanz (p

BE2017/5156 = 0,064 und p = 0,054 in der ITT-Population bzw. p = 0,057 und 0,045 in der mlTT-Population).

Die Daten zeigen, dass Patienten, die eine einzelne Verabreichung von eASCs erhalten, eine 30 % höhere Chance des Erreichens einer klinischen Rückbildung als bei einem Placebo aufweisen. Die Daten zeigen auch, dass Patienten, die eASCs erhalten, eine etwa 35 % höhere Chance des Erreichens einer klinischen Reaktion als bei einem Placebo aufweisen.

In bestimmten Ausführungsformen wird eine klinische Rückbildung innerhalb von 24 Wochen erreicht, typischerweise innerhalb von 18 Wochen erreicht. Eine klinische Rückbildung kann innerhalb von 12 Wochen oder weniger, z.B. innerhalb von 10 Wochen oder innerhalb von 8 Wochen, erreicht werden. Eine klinische Rückbildung kann gegebenenfalls nach 6 Wochen erreicht werden. Die Daten zeigen, dass die mittlere Zeit bis zur klinischen Rückbildung mit Cx601 etwa 2-fach kürzer ist als bei einem Placebo (6,7 Wochen gegenüber 14,6 Wochen). Demgemäß wird in einer Ausführungsform die klinische Rückbildung innerhalb von 14 Wochen erreicht.

In einigen Ausführungsformen wird eine kombinierte Rückbildung innerhalb von 24 Wochen, typischerweise innerhalb von 18 Wochen erreicht. Eine kombinierte Rückbildung kann gegebenenfalls innerhalb von 12 Wochen oder weniger, z.B. innerhalb von 10 Wochen oder innerhalb von 8 Wochen, erreicht werden. Eine kombinierte Rückbildung kann gegebenenfalls nach 6 Wochen erreicht werden.

In bestimmten Ausführungsformen wird eine klinische Reaktion in 11 Wochen oder weniger erreicht. Die Daten zeigen, dass die mittlere Zeit bis zur klinischen Reaktion ebenfalls etwa 2fach kürzer ist als bei einem Placebo (6,3 Wochen gegenüber 11,7 Wochen). Die Zeit bis zur klinischen Reaktion kann in bestimmten Ausführungsformen 10 Wochen oder weniger, 9 Wochen oder weniger, 8 Wochen oder weniger betragen. Die Zeit bis zur klinischen Reaktion kann gegebenenfalls 7 Wochen oder weniger, beispielsweise etwa 6 Wochen, betragen.

Diese Ergebnisse sind besonders überraschend, wenn beachtet wird, dass diese Verbesserungen nach einer einzelnen Verabreichung der eASCs festgestellt werden.

Der Perianalerkrankungsaktivitätsindex „PDAI“ umfasst fünf Kategorien: Ausfluss, Schmerzen, Einschränkung der sexuellen Aktivität, Art der Perianalkrankheit und Grad der Induration. Jede Kategorie wird auf einer fünf Punkte-Skala bewertet, die von keine Symptome

BE2017/5156 (Grad 0) bis schwere Symptome (Grad 4) reicht. Eine Verbesserung des Grads des Perianalerkrankungsaktivitätsindex wird bei den Wochen 6, 12 und 18 für eASCs signifikant stärker festgestellt als bei einem Placebo. Daher wird in bestimmten Ausführungsformen eine Verbesserung des PDAI innerhalb von 6 Wochen, innerhalb von 12 Wochen oder innerhalb von 18 Wochen erreicht. Die Verbesserung des PDAI kann gegebenenfalls eine Verbesserung von mehr als 1,5 PDAI-Punkten, gegebenenfalls mindestens zwei PDAI-Punkten, sein.

Die Verbesserung des PDAI kann gegebenenfalls eine Verminderung (Verbesserung) bei jeder der fünf Komponenten des Index sein.

6. Kits

Die vorliegende Antrag veröffentlicht Kits, welche die Zusammensetzungen, die stromale

Stammzellen enthalten, die von adipösem Gewebe stammen, und gegebenenfalls Anweisungen für deren Verwendung umfassen. Kits, welche die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Biomaterialien der vorliegenden Erfindung umfassen, liegen ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung. Kitkomponenten können entweder für eine manuelle oder eine teilweise oder vollständig automatisierte Durchführung der vorstehend genannten Verfahren verpackt sein. Solche Kits können für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich z.B. eine Therapie, eine Reparatur, die Herstellung von Biomaterialien und andere Anwendungen.

Beispiele

Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben worden ist, wird sie unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die lediglich für die Zwecke der Veranschaulichung bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angegeben sind und die Erfindung nicht beschränken sollen, leichter verständlich.

KLINISCHER VERSUCH DER PHASE III

Die vorliegende Studie ist die erste Placebo-kontrollierte Phase 3-Studie, welche die Wirksamkeit und Sicherheit von Cx601 allein oder zusätzlich zu einer gegenwärtigen medizinischen Therapie für behandlungsresistente komplexe Perianalfisteln in Patienten mit Morbus Crohn bewertet.

Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass allogène eASCs für die Behandlung einer komplexen Perianalfistel oder von komplexen Perianalfisteln in erwachsenen Patienten mit einem nicht

BE2017/5156 aktiven/schwach aktiven luminalen Morbus Crohn indiziert ist, wenn (eine) Fistel(n) eine unzureichende Reaktion auf mindestens eine herkömmliche oder biologische Therapie zeigt bzw. zeigen.

Verfahren

Studienübersicht

Diese randomisierte, Placebo-kontrollierte Phase 3-Doppelblindstudie mit parallen Gruppen (NCT01541579; EUDRACT 2011-006064-43) wurde an 49 medizinischen Zentren in 7 europäischen Ländern und Israel von Juli 2012 bis Juli 2015 durchgeführt. Das Ablaufschema wurde durch eine zentrale oder lokale Ethikkommission zugelassen. Alle Patienten haben ihre schriftliche Einverständniserklärung abgegeben.

Die Studie wurde durch die ADMIRE-Leitungskommission (vgl. den ergänzenden Anhang) gestaltet und implementiert. Der Sponsor sammelte die Daten, die durch das „Department of Biostatistics of Chiltern International“ analysiert wurden, und der Sponsor hat die Daten zusammen mit der Leitungskommission interpretiert. Alle Autoren hatten vollen Zugang zu den Daten, stimmten der Entscheidung zum Einreichen des fertiggestellten Manuskripts zur Veröffentlichung zu und garantieren die Genauigkeit und Vollständigkeit der angegebenen Daten. Das Manuskript wurde durch den ersten Autor erstellt und alle Autoren trugen zu den nachfolgenden Entwürfen bei.

Patienten

Geeignete Patienten waren Erwachsene mit einem Alter von 18 Jahren oder älter, wiesen einen nicht aktiven oder schwach aktiven luminalen Morbus Crohn für > 6 Monate, definiert durch einen Morbus Crohn-Aktivitätsindex (CDAI) von < 220 ^A24, auf und wiesen komplexe Perianalfisteln (definiert als eine oder mehrere der Folgenden: stark Inter-, Trans-, Extra- oder Supra-Sphinkter-Herkunft; > 2 äußere Öffnungen oder dazugehörige Ansammlungen) mit einem Maximum von 2 inneren und 3 äußeren Öffnungen auf, die für > 6 Wochen vor dem Einbeziehen einer Drainage unterlagen. Patienten wurden ausgeschlossen, wenn sie Rektovaginalfisteln, eine Rektal- und/oder Analstenose und/oder aktive schwere Proktitis (definiert durch das Vorliegen von oberflächlichen oder tiefen Geschwüren), divertierende Stomata oder einen Abszess oder Ansammlungen von > 2 cm aufwiesen, die nicht durch das chirurgische Vorbereitungsverfahren entfernt worden sind. Geeignete Patienten mussten gegenüber mindestens einer der folgenden Behandlungen behandlungsresistent sein, die nach 1 Monat

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Antibiotika (Ciprofloxacin, Metronidazol) und/oder nach 3 Monaten Immunsuppressiva (Azathioprin, 6-Mercaptopurin) und/oder einer Induktion oder einem Aufrechterhalten von antiTNF-Therapien bei einer stabilen Dosis keine Reaktion zeigten. Patienten, die nur gegenüber

Antibiotika behandlungsresistent waren, repräsentierten < 25 % der Gesamtpopulation.

Nach der Verabreichung des Untersuchungsprodukts konnten Patienten für nicht mehr als 4 Wochen mit Antibiotika behandelt werden. Immunsuppressiva und anti-TNFs wurden während der Studie bei stabilen Dosen gehalten. Eine Initiierung oder Dosiserhöhung dieser Mittel wurde nicht zugelassen.

Patienten, die keine vorhergehende Behandlung für Morbus Crohn mit Perianalfisteln, einschließlich Antibiotika, erhalten haben, und diejenigen, bei denen eine vorhergehende Chirurgie für die aktive Fistel verwendet wurde, die von einer Drainage oder einer Fadeneinlagenanordnung verschieden ist, wurden ebenfalls ausgeschlossen. Patienten waren nicht geeignet, wenn sie Glukokortikosteroide innerhalb der vorhergehenden 4 Wochen erhielten.

Eine Steroidbehandlung wurde zur Behandlung von Schüben einer luminalen Erkrankung während der Nachsorge mit einer Anfangsdosis von 40 mg zugelassen, die während eines Maximums von 12 Wochen verabreicht wird.

Randomisierung und Behandlung

Beim Screening wurde eine MRI-Beckenabtastung zum Führen der chirurgischen Vorgänge und zur zentralen Blindbewertung von Ansammlungen durchgeführt. Darüber hinaus wurden bei Patienten je nach klinischer Indikation > 2 Wochen vor der Verabreichung des Untersuchungsprodukts eine Untersuchung unter Narkose, eine Fistelausschabung und eine Fadeneinlagenanordnung durchgeführt (Fig. 1). Wenn eine Fadeneinlage angeordnet worden ist, musste diese unmittelbar vor der Verabreichung des Untersuchungsprodukts herausgezogen werden.

Patienten wurde nach der Fistelvorbereitungsvisite > 2 Wochen vor der Verabreichung des Untersuchungsprodukts zufällig in einem 1:1-Verhältnis Cx601 oder Placebo zugeordnet (Fig. 1). Patienten wurden auf der Basis einer begleitenden Medikation bei der Randomisierung (anti-TNF und/oder Immunsuppressionsmittel oder keines davon) geschichtet. Behandlungen wurden unter Verwendung einer vorher erstellten Randomisierungsliste zugeordnet, die vom „Department of Biostatistics“, Linical, erzeugt worden ist.

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Patienten in der Cx601-Gruppe erhielten eine einzelne Injektion von 120 Millionen Cx601 intraläsional verteilt in Fistelgängen. Die Isolierung und Vermehrung von Cx601 wurde so durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben ist^A23. Patienten in der Placebo-Gruppe erhielten das identische Volumen Kochsalzlösung. Studienbehandlungen wurden mit einer feinen langen Nadel nach dem Entfernen einer Fadeneinlage oder von Fadeneinlagen, falls diese vorlag(en), und dem Ausschaben der Fistel verabreicht. Die Hälfte der Dosis wurde in das Gewebe injiziert, das die vernähte(n) innere(n) Öffnung(en) umgibt. Die andere Hälfte wurde in die Fistelwände (nicht tiefer als 2 mm) entlang des Fistelgangs oder der Fistelgänge injiziert, wodurch mehrere Mikroblasen erzeugt wurden.

Eine Verbündung von Behandlungen war nicht möglich, da die Zellsuspension von der Kochsalzlösung deutlich verschieden war. Die Doppelblindstudiengestaltung wurde dadurch aufrechterhalten, dass die Behandlung durch einen nicht verbündeten Chirurgen verabreicht wurde und ein verbündeter Gastoenterologe und Radiologe die Reaktion bewerteten.

Studienablauf und Nachsorge

Ein Fistelverschluss wurde in den Wochen 6, 12, 18 und 24 durch den Untersuchenden bezüglich der Gegenwart einer spontanen Drainage und nach einem sanften Fingerdruck auf die behandelten äußeren Öffnungen klinisch bewertet^A12 und wurde durch eine verbündete, zentral bewertete MRI-Beckenabtastung in der Woche 24 bewertet; zentralen Bewertern wurden Zahlen zur Identifizierung der behandelten Fisteln zur Verfügung gestellt, jedoch waren diese bezüglich der Patientendaten, der Reihenfolge der Untersuchungen und der erhaltenen Behandlung verbündet. Während der Behandlung auftretende nachteilige Ereignisse (TEAEs) wurden bei allen Studienvisiten bewertet. Die Schwere des perianalen Morbus Crohn wurde bei dem Grundwert und allen Studienvisiten mit dem Perianalerkrankungsaktivitätsindex (PDAI) bewertet^A25. Die Lebensqualität wurde mit dem Fragebogen für entzündliche Darmerkrankungen (IBDQ) ^A26 bei dem Grundwert und in der Woche 24 wie bei CDAL bewertet^A24.

Wirksamkeit und Sicherheitsendpunkta

Der primäre Endpunkt war eine kombinierte Rückbildung in der Woche 24, die als die klinische Bewertung des Verschlusses aller behandelten äußeren Öffnungen, die beim Grundwert einer Drainage unterlagen, und die Abwesenheit von Ansammlungen > 2 cm der behandelten Perianalfisteln in > 2 von 3 Dimensionen definiert ist, die durch eine verbündete zentrale MRI-Bewertung (Bioclinica GmbH, München, Deutschland) bestätigt wurde. Die klinische

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Bewertung eines Verschlusses wurde als Abwesenheit einer Drainage trotz eines sanften

Fingerdrucks definiert^A12.

Es gab zwei sekundäre Wirksamkeitsschlüsselendpunkte: Eine klinische Rückbildung (d.h., der Verschluss aller behandelten äußeren Öffnungen, die bei dem Grundwert trotz eines sanften Fingerdrucks einer Drainage unterlagen) und eine Reaktion (d.h., ein Verschluss von > 50 % aller behandelten äußeren Öffnungen, die bei dem Grundwert einer Drainage unterlagen) in der Woche 24. Andere sekundäre Wirksamkeitsendpunkte umfassten die Zeit bis zur klinischen Rückbildung, die Zeit bis zur Reaktion, PDAI-, CDAI- und IBDQ-Bewertungen bis zur Woche 24.

TEAEs wurden gemäß dem „Medical Dicitionary for Regulatory Activities“, Version 17.0, kodiert.

Statistische Analyse

Die geplante, zu screenende Probengröße war 278 Patienten zum Randomisieren von > 208 Patienten (104 in jeder Gruppe). Die Probengröße war ausreichend, um einen minimalen Unterschied von 25 % in dem Prozentsatz von Patienten mit einer kombinierten Rückbildung zwischen Cx601 und Placebo (die antizipierten Raten der kombinierten Rückbildung waren 50 % für Cx601 und 25 % für Placebo ^A8·^A12· a23. a27) _mj_{t e}j_nem alpha-Fehler von 0,025 und 80 % Leistung zu erfassen und ermöglichte, dass 20 % der Patienten die Studie abbrachen.

Wirksamkeitsanalysen wurden mit der Population mit Behandlungsabsicht („intention to treat“ (ITT)), die alle randomisierten Patienten umfasste, der modifizierten ITT (mlTT)-Population, die alle randomisierten Patienten umfasste, die eine Studienbehandlung erhielten und eine Wirksamkeitsbewertung > 1 nach dem Grundwert erhielten, und der Population gemäß Protokoll (PP), die alle behandelten Patienten ohne große Protokollabweichungen umfasste, durchgeführt. TEAEs wurden in der Sicherheitspopuiation analysiert, die als alle Patienten definiert ist, die eine Studienbehandlung erhalten haben.

Der primäre Endpunkt wurde unter Verwendung eines geschichteten Cochran-Mantel-Haenszel-Tests analysiert, der bezüglich randomisierter Schichten eingestellt wurde (d.h., randomisierter Morbus Crohn-Behandlungen). Die primäre Analyse wurde unter Verwendung der ITT-Population durchgeführt. Es werden auch Ergebnisse für die mITT-Popuiation bereitgestellt, da deren Definition stärker der ITT-Population in anderen randomisierten klinischen

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Versuchen ähnelt und eine zuverlässigere Abschätzung von Behandlungseffekten bereitstellt. Fehlende Daten wurden unter Verwendung des „last-observation-carried-forward“ (LOCF)-Verfahrens zugerechnet. Eine fehlende Reaktion/fehlende Rückbildung wurde zugerechnet, wenn eine MRI-Abtastung nach dem Grundwert oder eine klinische Bewertung in der Woche 24 nicht durchgeführt wurde. Eine fehlende Reaktion/fehlende Rückbildung wurde auch zugerechnet, wenn vor der Woche 24 ein Rettungsereignis stattgefunden hat. Die Effekte der Rettungsereignisse und der Grundsätze bezüglich fehlender Daten auf die Wirksamkeit wurden in Empfindlichkeitsanalysen des primären Endpunkts untersucht.

Um das Problem der Multiplizität zu berücksichtigen, wurden die zwei sekundären Schlüsselendpunkte (klinische Rückbildung und Reaktion in der Woche 24) mit einem „Gatekeeping“Verfahren unter Verwendung des Hochberg-Testverfahrens ^A28 zu einer Kurzzeitfamilie gruppiert, um den gesamten Typ l-Fehler zu kontrollieren, wobei der primäre Wirksamkeitsendpunkt als „gatekeeper“ dient. Die statistische Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen Typ IFehlerniveau von 0,05 bewertet. Für sekundäre nicht-Schlüsselendpunkte wurde keine statistische Einstellung bezüglich der Multiplizität vorgenommen. Prozentsätze und Behandlungsunterschiede wurden mit Vertrauensintervallen (CI) von 95 % ausgedrückt, die mit einem asymptotischen Verfahren nach Wald berechnet wurden. Die Zeit bis zur klinischen Rückbildung und Reaktion wurde mit Kaplan-Meier-Abschätzungen analysiert. Die Sicherheitsergebnisse wurden mit deskriptiven Statistiken dargestellt.

Das SAS-System v9.1.3 oder später wurde für die statistischen Analysen verwendet (SAS

Institute Inc., Cary, NC, USA).

Ergebnisse

Insgesamt wurden 289 Patienten gescreent und von diesen wurden 212 bezüglich Cx601 oder Placebo randomisiert (Fig. 2). Die Grundwerteigenschaften der 2 Gruppen waren ähnlich (Tabelle 1). Der größte Teil der Patienten hatte in den letzten 6 Monaten > 1 Behandlung für Morbus Crohn erhalten. Ein höherer Anteil von Patienten in der Cx601-Gruppe wies verglichen mit der Placebo-Gruppe Fisteln mit einer Mehrzahl von Gängen auf (46,6 % bzw.

30,4 %). Insgesamt 171 Patienten (80,7 %) haben die 24 Wochen-Nachsorge abgeschlossen. Während der Studie erhielten 1 Patient in der Cx601-Gruppe und 4 Patienten in der Placebo-Gruppe Steroide bei einem Morbus Crohn-Schub.

Wirksamkeit

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Ein signifikant größerer Anteil der Cx601-behandelten Patienten erreichte den primären Endpunkt der kombinierten Rückbildung in der Woche 24 gegenüber Placebo in der ITTPopulation (49,5 % bzw. 34,3 %, Differenz [97,5 % CI]: 15,2 % [0,2 - 30,3]; p = 0,024]) und der mITT-Population (51,5 % und 35,6 %; 15,8 % [0,5 - 31,2]; p = 0,021 ; Fig. 3A und B).

Diese Ergebnisse wurden in den PP-Populationen und zusätzlichen Empfindlichkeitsanalysen bestätigt (Tabelle S1). Der Effekt von Cx601 war in den 4 Randomisierungsschichten größer als derjenige von Placebo, wobei der zahlenmäßig stärkste Effekt von Cx601 in Patienten festgestellt wurde, die bei der Randomisierung keine oder beide von einer anti-TNFund einer Immunsuppressionstherapie erhielten (Behandlungsdifferenz 33,1 % bzw. 20,0 %;

Fig. 3C).

In der mITT-Population erreichte ein zahlenmäßig größerer Anteil von Patienten in der

Cx601-Gruppe gegenüber der Placebo-Gruppe eine klinische Rückbildung (55,3 % bzw. 42,6 %; Differenz [95 % CI]: 12,8 % [-0,8-26,4]; p = 0,057) und wies eine Reaktion (68,9 % bzw.

55,4 %; 13,5 % [0,3 - 26,7] p = 0,045) in der Woche 24 auf.

Die mittlere Zeit bis zur klinischen Rückbildung war mit Cx601 gegenüber Placebo etwa 2fach kürzer (6,7 [95 % CI, 6,4 -11,9] Wochen und 14,6 [11,9 -22,9] Wochen), so, wie dies bei der mittleren Zeit bis zur Reaktion der Fall war (6,3 [6,0 - 6,6] Wochen und 11,7 [6,7 12,9] Wochen).

Die Verbesserung des PDAI mit Cx601 in der mITT-Population war in der Woche 6 (Änderung von der Grundwertbehandlungsdifferenz [95 % CI]: -1,0 [-1,7 bis -0,3]), der Woche 12 (-1,2 [-2,0 bis -0,4]) und der Woche 18 (-1,2 [-2,0 bis -0,3]) signifikant größer als bei dem Placebo, jedoch nicht in der Woche 24 (-0,8 [-1,8 bis 0,2]). Für Gesamt- und Teildomänen-IBDQund CDAI-Grade gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen Behandlungsgruppen (Tabelle S2).

Sicherheit

Der Prozentsatz von Patienten in den Cx601- und Placebo-Gruppen, bei denen TEAEs aufgetreten waren, war ähnlich (66,0 % bzw. 64,7 %; Tabelle 2). Die am häufigsten angegebenen TEAEs waren Proktalgie, Analabszess und Nasopharyngitis. Bei einem höheren Anteil von Patienten in der Placebo-Gruppe gegenüber der Cx601-Gruppe traten behandlungsbezogene TEAEs auf (29,4 % bzw. 17,5 %), wobei die häufigsten davon ein Analabszess und Proktalgie waren. Der größte Teil der TEAEs wies eine schwache oder mäßige Intensität auf.

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Wenige Patienten haben die Studie aufgrund von TEAEs verlassen (4,9 % und 5,9 %), wohingegen bei einem geringfügig höheren Anteil von Patienten in der Cx601 -Gruppe schwere TEAEs auftraten (17,5 % und 13,7 %). Das häufigste schwerwiegende TEAE war ein Analabszess (Cx601: 8,7%; Placebo: 6,9 %). Es gab keine Todesfälle.

Diskussion und Übersicht

Dies ist die erste randomisierte, Placebo-kontrollierte klinische Studie der Behandlung von komplexen, therapieresistenten Perianalfisteln in Patienten mit Morbus Crohn im großen Maßstab. In der schwierig zu behandelnden Studienpopulation von Patienten, die komplexe Perianalfisteln aufwiesen und bei denen eine herkömmliche oder biologische Therapie versagte, erreichte 1 von 2 Patienten, die mit Cx601 allein oder zusätzlich zu einer gegenwärtigen medizinischen Therapie behandelt worden sind, eine kombinierte klinische und radiologische Rückbildung in der Woche 24. Dieses Ergebnis war über alle statistischen Populationen konstant, obwohl Patienten in der Cx601-Gruppe mehr Fisteln mit mehreren Gängen aufwiesen. Die Studienergebnisse zeigen daher, dass Cx601 behandlungsresistenten Patienten eine erste wirkliche Verschlussalternative für komplexe Perianalfisteln gegenüber radikalchirurgischen Ansätzen bietet.

Der primäre Endpunkt einer kombinierten klinischen und radiologischen Rückbildung ist strikter als derjenige, der in anderen randomisierten klinischen Studien von Behandlungen für Perianalfisteln bei Morbus Crohn verwendet worden ist, bei denen typischerweise klinische Reaktionen (d.h., eine > 50 %-Verminderung der Anzahl von drainierenden Fisteln) oder eine klinische Rückbildung bewertet worden ist^A8’^A12. Dies ist der erste randomisierte klinische Versuch in einem großen Maßstab, bei dem eine klinische Bewertung des Fistelverschlusses und eine MRI-Bewertung der Abwesenheit von Abszessen verwendet werden, wie dies in den Richtlinien der „European Crohn's and Colitis Organisation” empfohlen wird^A29.

Die Analysen der sekundären Wirksamkeit verstärken den klinischen Nutzen von Cx601. Mit Cx601 war die Zeit bis zur klinischen Rückbildung und bis zur Reaktion kurz und betrug die Hälfte derzeit in der Placebogruppe. Die Differenz bei den klinischen Rückbildungsraten zwischen Cx601- und Placebogruppen erreichte aufgrund eines beträchtlich höheren als erwarteten (42,6 %) und in vorhergehenden Studien festgestellten (13-19 %) „Placebo“-Effekts ^A8· ^{A12 A27} keine statistische Signifikanz. Die Placeboeffekte gemäß Randomisierungsschichten (d.h., am höchsten mit gleichzeitigem anti-TNF und Immunsuppressionsmittel [46,7 %] und am niedrigsten mit keiner dieser Behandlungen [21,1 %]) legen nahe, dass der höhere Place48

BE2017/5156 boeffekt in dieser Studie durch die Verwendung einer gleichzeitigen Medikation bewirkt worden ist. Eine chirurgische Drainage und ein Verschließen von inneren Öffnungen können ebenfalls die Placebo-Reaktion erhöht haben. Obwohl vorteilhafte Verbesserungen bei den PDAI-Graden in der Cx601-Gruppe festgestellt wurden, gab es zwischen Behandlungsgruppen keine Unterschiede bei IBDQ- und CDAI-Graden. Dies war möglicherweise auf den niedrigen CDAI (ein Einschlusskriterium) und dem hohen IBDQ bei dem Grundwert zurückzuführen.

Die Sicherheitsdaten zeigen, dass Cx601 in der Studienpopulation in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der vorhergehenden Phase 1/2a-Studie gut vertragen wurde ^A23. Mit der Behandlung zusammenhängende TEAEs traten in der Placebo-Gruppe häufiger auf und könnten so mit dem natürlichen Verlauf der Krankheit oder chirurgischen Vorgängen in der Studie in Zusammenhang gebracht werden. Das vorteilhafte Sicherheitsprofil kann einen Vorteil gegenüber anti-TNF-Therapien darstellen, mit denen mehrere schwerwiegende Sicherheitsbedenken einhergehen, die auf die Immunogenität gegenüber dem Arzneistoff und ein erhöhtes Infektionsrisiko, einschließlich Tuberkulose, zurückzuführen sind^{A30 A31}.

Die Ergebnisse dieser Studie sind ermutigend, wenn der Bedarf für effektive und gut verträgliche neue Behandlungsoptionen für Patienten mit Morbus Crohn und komplexen Perianalfisteln berücksichtigt wird. Diese Studie hat auch starke Auswirkungen auf die Pflege von Morbus Crohn-Patienten mit behandlungsresistenten komplexen Perianalfisteln, da viele davon gegenwärtig einer wiederholten Chirurgie mit dem Risiko der Beschädigung von Sphinktermuskeln unterzogen werden müssen, die zu einer Fäkalinkontinenz führt. Als Ergebnis benötigen 12 bis 38 % der Patienten mit einer Krankheit mit Perianalfisteln eine Protektomie ^A32.

Im Gegensatz dazu ist die Verabreichung von CX601 minimal invasiv und kann in einem ambulanten Umfeld durchgeführt werden.

Beschränkungen dieses Versuchs waren der Ausschluss von Patienten mit mehr als 2 inneren und 3 äußeren Öffnungen sowie solchen mit einer vorhergehenden Chirurgie, die von einer Drainage und einer Fadeneinlagenanordnung verschieden war. Ferner wurde nicht untersucht, ob TEAEs mit dem chirurgischen Vorgang zusammenhingen.

Zusammenfassend ist Cx601 eine effektive und sichere Therapie für komplexe Perianalfisteln bei Morbus Crohn, die auf herkömmliche und/oder biologische Behandlungen nicht angesprochen haben.

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Tabelle 1. Patienteneigenschaften (Sicherheitspopulation).

Variable	Cx601 (N = 103)	Placebo (N =102)
Alter-Jahre	38,9 (13,1)	37,6 (13,2)
Männliches Geschlecht-Anzahl (%)	57 (55,3)	54 (52,9)
Ethnie - Anzahl (%)
Weiß	96 (93,2)	93 (91,2)
Schwarz	4 (3,9)	1 (1,0)
Andere	0	1 (1,0)
Fehlt	3 (2,9)	7 (6,9)
Masse - kg	73,3 (14,4)	71,4 (15,0)
CD-Dauer-Jahre	11,8 (9,8)	11,4 (9,0)
Medikation vor CD in den letzten 6 Monaten - An-
zahl (%)
Antibiotika	78 (75,7)	72 (70,6)
Immunsuppressiva	87 (84,5)	74 (72,5)
Anti-TNF	80 (77,7)	82 (80,4)
Gleichzeitige CD-Medikation (Schichtungsfaktor) -
Anzahl (%)
Anti-TNF	36 (35,0)	32 (31,4)
Immunsuppressiva	16 (15,5)	21 (20,6)
Anti-TNF + Immunsuppressiva	27 (26,2)	30 (29,4)
Keines davon	24 (23,3)	19(18,6)
Perianal-Morbus Crohn-Aktivitätsindex*	6,7 (2,5)	6,5 (2,9)
Fistelöffnungen - Anzahl (%)
0 innere + 1 äußere	0	1 (1,0)
1 innere + 1 äußere	55 (53,4)	70 (68,6)
1 innere + 2 äußere	23 (22,3)	17(16,7)

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1 innere + 3 äußere	4 (3,9)	3 (2,9)
2 innere + 1 äußere	3 (2,9)	2 (2,0)
2 innere + 2 äußere	14 (13,6)	8 (7,8)
2 innere + 3 äußere	4 (3,9)	1 (1>0)
Morbus Crohn-Aktivitätsindexf	87,8 (48,3)	92,5 (55,3)
Fragebogen für entzündliche Darmerkrankungen φ	173,5(31,6)	169,8 (36,2)
C-reaktives Protein - mg/Liter	7,9 (11,5)	6,3 (9,5)
Hämoglobin - mmol/Liter	8,3 (0,8)	8,3 (0,8)

CD, Morbus Crohn; Cx601, allogène, vermehrte, adipös abgeleitete Stammzellen; TNF, Tumornekrosefaktor.

Daten sind Mittelwerte (Standardweichung), falls nichts anderes angegeben ist.

*Grade für den Perianal-Morbus Crohn-Aktivitätsindex können von 0 bis 20 reichen; höhere

Grade geben eine schwerere Erkrankung an.

t Grade für den Morbus Crohn-Aktivitätsindex können von 0 bis 600 reichen; höhere Grade geben eine schwerere Erkrankung an.

φ Grade für den Fragebogen für entzündliche Darmerkrankungen können von 32 bis 224 reichen; höhere Grade geben eine bessere Lebensqualität an.

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Tabelle 2. Während der Behandlung auftretende nachteilige Ereignisse bis zur Woche 24 (Sicherheitspopulation).

TEAE-Anzahl (%)	Cx601 (N = 103)	Placebo (N = 102)
Gesamt	68 (66,0)	66 (64,7)
Zum Verlassen der Studie führende	5 (4,9)	6 (5,9)
TEAEs
Schwerwiegende TEAEs	18 (17,5)	14(13,7)
TEAEs in > 5,0 % der Patienten*
Proktalgie	13 (12,6)	11 (10,8)
Analabszess	12(11,7)	13(12,7)
Nasopharyngitis	10(9,7)	5 (4,9)
Diarrhöe	7 (6,8)	3 (2,9)
Bauchschmerzen	4 (3,9)	6 (5,9)
Fistel	3 (2,9)	6 (5,9)
Mit der Behandlung zusammenhängende	18 (17,5)	30 (29,4)
TEAEs
Mit der Behandlung zusammenhängende
TEAEs in > 2,0 % der Patienten*
Analabszess	6 (5,8)	9 (8,8)
Proktalgie	5 (4,9)	9 (8,8)
Behandlungsschmerzen	1 (1,0)	2 (2,0)
Fistelablauf	1 (1,0)	2 (2,0)
Induration	0	2 (2,0)

TEAE, während der Behandlung auftretendes nachteiliges Ereignis; Cx601, allogène, vermehrte, adipös abgeleitete Stammzellen; *ln jeder Behandlungsgruppe.

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Tabelle S1. Ergänzende Analysen und Empfindlichkeitsanalysen für den primären Endpunkt:

kombinierte Rückbildung.*

Analyse- typ	Analy- seein- stel- lung	Details der Handhabung von fehlenden Daten	Cx601 (%)	Placebo (%)	Differenz (%) (97,5% CI)	p-Wert
Ergän-	ITT	Keine Reaktion/keine	48,6	32,4	16,2	0,014
zend		Rückbildung für alle feh-			(1,3-
		lenden Daten und nach			31,1)
		der Rettungstherapie zu-
		gerechnet (keine LOCF)
Ergän-	PP1\|	LOCF angewandt	57,0	36,9	20,1	0,010
zend		Keine Reaktion/keine			(3,3-
		Rückbildung wird nach			36,9)
		der Rettungstherapie zu-
		gerechnet
Ergän-	ΡΡ2φ	Keine Reaktion/keine	63,2	39,7	23,4	0,005
zend		Rückbildung wird nach			(5,6-
		der Rettungstherapie zu-			41,3)
		gerechnet
Empfind-	ITT	Fehlen = Keine Reak-	49,5	34,3	15,2	0,024
lichkeit		tion/keine Rückbildung			(0,2-

nach LOCF-Anwendung. 30,3)

Rettungsmedikation wird nicht als Versagen betrachtet

Empfind- ITT Fehlen = Keine Reaklichkeit tion/keine Rückbildung nach LOCF-Anwendung. Logistische Analyse, die den Schichtungsfaktor und die Anzahl der Öffnungen des Grundwerts als Faktoren umfasst

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49,5 34,3 NA 0,017

CI, Vertrauensintervall; Cx601, allogène, vermehrte, adipös abgeleitete Stammzellen; ITT, Behandlungsabsicht („intention to treat“); LOCF, „last observation carried forward“; NA, keine Angabe; PP, gemäß Protokoll; TNF, Tumornekrosefaktor.

Eine Rettungstherapie ist als Kortikoide bei 40 mg Prednisolonäquivalent für > 12 Wochen 5 festgelegt; neue anti-TNF verglichen mit der Grundwerttherapie für > 8 Wochen; neues Immunsuppressionsmittel verglichen mit der Grundwerttherapie für > 12 Wochen; oder chirurgischer Eingriff für die behandelte Fistel.

*Klinische Bewertung des Verschlusses aller behandelten äußeren Öffnungen, die beim Grundwert einer Drainage unterlagen, und die Abwesenheit von Ansammlungen > 2 cm der behandelten Perianalfisteln in > 2 von 3 Dimensionen bei einer zentral verbündeten MRIBewertung in der Woche 24. Die klinische Bewertung eines Verschlusses wurde als Abwesenheit einer Drainage trotz eines sanften Fingerdrucks definiert.

|PP1 Die Population umfasst diejenigen mit größeren Protokollabweichungen (Cx601, n =

86; Placebo, n = 84).

φΡΡ2 Die Population umfasst PP1-Patienten, welche die Visite in der Woche 24 abgeschlossen haben (Cx601, n = 76; Placebo, n = 73).

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Tabelle S2. Von Patienten angegebene Ergebnisse der Morbus Crohn-Aktivitätsindex (CDAI)*- und Fragebogen für entzündliche Darmerkrankungen (IBDQ)j--Grade bis zur Woche 24 (mITT-Population).

CDAI	Cx601 (N =103)	Placebo (N =101)	Behandlungsdifferenz (95 % CI)
Gesamt
Grundwert	87,8 (48,3)	93,3 (55,0)
Woche 24	92,5 (66,5)	94,1 (76,1)
Veränderung ausgehend	5,7 (62,2)	2,2 (65,5)	1,8 (-16,0 bis 19,7)
vom Grundwert
Anzahl der flüssigen Stühle
Grundwert	9,8(12,3)	9,3 (9,4)
Woche 24	9,5(12,6)	10,0 (12,6)
Veränderung ausgehend	-0,0 (9,5)	0,9 (10,7)	-0,7(-3,4 bis 2,1)
vom Grundwert
Bauchschmerzen
Grundwert	1,6(2,9)	2,0 (3,1)
Woche 24	2,7 (4,5)	3,0 (4,1)
Veränderung ausgehend	1,1 (4,4)	0,9 (4,0)	-0,1 (-1,2 bis 1,1)
vom Grundwert
Allgemeines Wohlbefinden
Grundwert	2,7 (3,7)	3,2 (4,1)
Woche 24	3,1 (4,6)	3,3 (4,7)
Veränderung ausgehend	0,6 (4,5)	0,3 (4,5)	0.1 (-1,1 bis 1,3)

vom Grundwert

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IBDQ

Cx601 Placebo Behandlungsdifferenz (N = 103) (N = 101) (95% Cl)

Gesamt

Grundwert	173,5(31,6)	169,4 (36,1)
Woche 24	178,3 (34,6)	174,7(36,2)
Veränderung ausgehend	3,8 (25,5)	4,0 (25,6)	0,3 (-6,6 bis 7,3)
vom Grundwert Darmfunktion
Grundwert	57,1 (9,2)	56,6 (9,9)
Woche 24	57,2(10,2)	56,4 (9,8)
Veränderung ausgehend	0,0 (7,6)	-0,6 (8,2)	0,5(-1,6 bis 2,7)
vom Grundwert Emotionaler Status
Grundwert	62,9(14,5)	61,4(15,2)
Woche 24	64,7(15,6)	63,9 (15,3)
Veränderung ausgehend	1,7(11,3)	2,1 (11,2)	-0,3 (-3,3 bis 2,7)
vom Grundwert Systemische Symptome
Grundwert	25,8 (5,2)	24,9 (6,5)
Woche 24	26,2 (5,9)	25,6 (6,3)
Veränderung ausgehend	0,3 (4,7)	0,6 (5,1)	-0,1 (-1,4 bis 1,2)
vom Grundwert Soziale Funktion
Grundwert	27,7 (6,9)	26,5 (8,4)
Woche 24	29,5 (7,3)	28,4 (8,0)
Veränderung ausgehend	1,6(6,4)	17(6,0)	0,3 (-1,3 bis 2,0)

vom Grundwert

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CI, Vertrauensintervall; Cx601, allogène, vermehrte, adipös abgeleitete Stammzellen; mITT, modifizierte Behandlungsabsicht („intention to treat“).

Daten sind Mittelwerte (Standardabweichung).

* Grade für den Morbus Crohn-Aktivitätsindex (CDAI) können von 0 bis 600 reichen; höhere Grade geben eine schwerere Erkrankung an.

t Grade für den Fragebogen für entzündliche Darmerkrankungen (IBDQ) können von 32 bis 224 reichen; höhere Grade geben eine bessere Lebensqualität an.

Ausführungsformen der Erfindung umfassen:

1. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer behandlungsresistenten komplexen Perianalfistel in einem Patienten mit Morbus Crohn.

2. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß der Ausführungsform 1, wobei die Fistel eine, zwei, oder alle drei von mehreren Gängen, zwei inneren Öffnungen und drei äußeren Öffnungen umfasst.

3. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß der Ausführungsform 1 oder der Ausführungsform 2, wobei die Fistel gegenüber einem oder mehreren eines (i) Antibiotikums, (ii) eines Immunsuppressionsmittels und (iii) einer anti-TNF-Therapie resistent ist.

4. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei der Patient keine oder beide einer anti-TNF-Therapie und einer Immunsuppressionsmitteltherapie erhält.

5. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei der Patient:

(a) an nicht aktivem oder schwach aktivem Morbus Crohn; und/oder (b) luminalem Morbus Crohn leidet.

6. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Zellen intraläsional injiziert werden.

7. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei in einer einzelnen Verabreichung 120 Millionen Zellen verabreicht werden.

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8. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Therapie eine kombinierte Rückbildung oder klinische Rückbildung induziert.

9. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß der Ausführungsform 8, wobei die kombinierte Rückbildung oder klinische Rückbildung innerhalb von 24 Wochen, innerhalb von 18 Wochen oder innerhalb von 12 Wochen erreicht wird.

10. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß der Ausführungsform 9, wobei die kombinierte Rückbildung oder klinische Rückbildung innerhalb von 8 Wochen oder innerhalb von 6 Wochen erreicht wird.

11. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei die Fistel durch MRI überwacht wird.

12. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei mindestens etwa 90 % oder mindestens etwa 95 % der vermehrten, allogenen, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen die Oberflächenmarker H LA I, CD29, CD44, CD59, CD73,

CD90 und CD105 exprimieren.

13. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei weniger als etwa 5 % der vermehrten, allogenen, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen die Oberflächenmarker HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 und CD86 exprimieren.

14. Verwendung von vermehrten, allogenen, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer behandlungsresistenten komplexen Perianalfistel in einem Patienten mit Morbus Crohn.

15. Verfahren zur Behandlung einer behandlungsresistenten komplexen Perianalfistel in einem Patienten mit Morbus Crohn in einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, umfassend den Schritt des Verabreichens von vermehrten, allogenen, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzellen an die Fistel.

16. Verwendung gemäß der Ausführungsform 14 oder Verfahren gemäß der Ausführungsform 15, die oder das ferner die Merkmale gemäß einer der Ausführungsformen 2 bis 13 umfasst.

Literatur

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Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung werden, falls nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Techniken der Zellbiologie, der Zellkultur, der Molekularbiologie, der transgenen Biologie, der Mikrobiologie, bezüglich rekombinanter DNA und der Immunologie verwendet, die fachüblich sind. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erläutert. Vgl. z.B.

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Alle hier genannten Veröffentlichungen und Patente, einschließlich die nachstehend angegebenen Literaturstellen, werden in ihrer Gesamtheit hierin einbezogen, so als ob jede einzelne Veröffentlichung oder jedes einzelne Patent spezifisch und individuell durch Bezugnahme einbezogen wäre. In dem Fall eines Konflikts gilt die vorliegende Anmeldung, einschließlich jedwede Definitionen darin.

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Äquivalent»

Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem Verfahren und Zusammensetzungen zur Be5 handlung und Prävention von Fisteln bereit. Während spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung diskutiert worden sind, dient die vorstehende Beschreibung lediglich der Veranschaulichung und ist nicht beschränkend aufzufassen. Beim Studieren dieser Beschreibung sind für den Fachmann viele Variationen der Erfindung ersichtlich. Die beigefügten Patentansprüche sollen nicht alle derartigen Ausführungsformen und Variationen bean10 Sprüchen und der volle Umfang der Erfindung sollte unter Bezugnahme auf die Patentansprüche zusammen mit deren vollem Umfang von Äquivalenten und die Beschreibung zusammen mit solchen Variationen festgelegt werden.

Claims

Patentansprüche

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1. Vermehrte, aiiogene, von adipösem Gewebe stammende stromaie Stammzeiien zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer behandlungsresistenten komplexen Perianalfistel in einem Patienten mit Morbus Crohn, wobei (i) die Fistei mehrere Gänge umfasst;

(ii) dem Patienten in einem einzelnen Vorgang eine Dosis von 120 Millionen Zeilen verabreicht wird, wobei jeder Fisteitrakt mindestens einen Anteil der Dosis erhält und wobei etwa die Hälfte der Dosis in das Gewebe, das die innere Öffnung oder inneren Öffnungen umgibt, injiziert wird, und die andere Hälfte entlang des Gangs oder der Gänge der Fiste! in die Fistelwände injiziert wird, und (iii) die Therapie eine klinische Rückbildung innerhalb von 8 Wochen induziert.
2. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Fistel 2 Innere Öffnungen umfasst.
3. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Fistel 2 oder 3 äußere Öffnungen umfasst.
4. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Therapie eine klinische Rückbildung innerhalb von 6 Wochen Induziert.
5. Vermehrte, aiiogene, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzeiien zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die klinische Rückbildung während 24 Wochen ausgehend von der Therapie aufrechterhaiten wird.
6. Vermehrte, aiiogene, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Therapie eine kombinierte Rückbildung innerhalb von 24 Wochen, innerhalb von 18 Wochen, Innerhalb von 12 Wochen, innerhalb von 10 Wochen, innerhalb von 8 Wochen oder innerhalb von 6 Wochen induziert.
7. Vermehrte, aiiogene, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzeiien zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Verbesserung des Perianaierkrankungsaktivitätsindex (PDAI) innerhalb von 24 Wochen, innerhalb von 18 Wochen, innerhalb von 12 Wochen, innerhalb von 10 Wochen, innerhalb von 8 Wochen oder innerhalb von 6 Wochen erreicht wird.
8. Vermehrte, aiiogene, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Verbesserung des PDA! eine Verbesserung von mehr als 1,5 PDAiPunkten Ist.

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9. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei die Verbesserung des PDA! eine Verbesserung von mindestens zwei PDAI-Punkten ist.
10. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fistel gegen eine(s) oder mehrere von (i) einem Antibiotikum, (ii) einem Immunsuppressionsmittel und (iii) einer anti-TNF-Therapie behandlungsresistent ist.
11. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Patient keine oder beide von einer antiTNF-Therapie und einer Immunsuppressionstherapie erhält.
12. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Patient (a) an nicht aktivem oder schwach aktivem Morbus Crohn und/oder (b) luminalem Morbus Crohn leidet.
13. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fiste! mittels Magnetresonanzbildgebung (MR!) überwacht wird.
14. Vermehrte, allogène, von adipösem Gewebe stammende stromale Stammzellen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die vermehrten, allogenen, von adipösem Gewebe stammenden stromalen Stammzeiien vier oder mehr von HLAI, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, und CD105 exprimieren; und nicht vier oder mehr von HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, und CD80 exprimieren.