ES2911718T3

ES2911718T3 - Células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso en el tratamiento de fístulas perianales complejas resistentes en enfermedad de Crohn

Info

Publication number: ES2911718T3
Application number: ES17160932T
Authority: ES
Inventors: Eduardo Bravo; Maria Pascual
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2037-03-14
Also published as: NO345415B1; BR112018068493A2; JP6931656B2; CN108883135A; BE1024781A1; GB2548490B; RU2018131519A; EP3219321A1; IL261730A; IL298107B2; MX2018010699A; RU2742308C2; US20170258851A1; FR3048614B1; AU2017232718B2; WO2017158509A1; NO20170376A1; US20190381106A1; RU2018131519A3; GB2548490A

Abstract

Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso en un método de tratamiento de una fístula perianal compleja resistente en un paciente que tiene la enfermedad de Crohn, en las que: (i) la fístula comprende múltiples trayectos; (ii) se administra al paciente una dosis de 120 millones de células en un solo procedimiento en el que cada trayecto de la fístula recibe al menos una parte de esta dosis y en el que aproximadamente la mitad de la dosis se inyecta en el tejido que rodea el orificio u orificios internos y la otra mitad se inyecta en las paredes de la fístula a lo largo de los trayectos de la fístula; y (iii) la terapia induce la remisión clínica en el plazo de 24 semanas.

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso en el tratamiento de fístulas perianales complejas resistentes en enfermedad de Crohn

Campo de la invención

Esta invención se define en las reivindicaciones 1-15 y se refiere a células madre derivadas de tejido adiposo para su uso en el tratamiento de fístulas perianales complejas resistentes en pacientes con enfermedad de Crohn.

Antecedentes de la invención

Generalmente, una fístula es una conexión o vía de paso anómala entre órganos o vasos que normalmente no se conectan. Las fístulas pueden desarrollarse en diversas partes del cuerpo. Por ejemplo, los tipos de fístulas, denominadas por las áreas del cuerpo en las que se producen, incluyen fístula anorrectal o fístula en el ano o fístula fecal (entre el recto u otra área anorrectal y la superficie de la piel), fístula arteriovenosa o fístula A-V (entre una arteria y una vena), fístula biliar (entre los conductos biliares y la superficie de la piel, a menudo provocada por cirugía de la vesícula biliar), fístula uterocervical (orificio anómalo en el cuello uterino), fístula craneosinusal (entre el espacio intracraneal y un seno paranasal), fístula enteroenteral (entre dos partes del intestino), fístula enterocutánea (entre el intestino y la superficie de la piel, concretamente desde el duodeno o el yeyuno o el íleon), fístula enterovaginal (entre el intestino y la vagina), fístula gástrica (entre el estómago y la superficie de la piel), fístula metroperitoneal (entre el útero y la cavidad peritoneal), fístula perilinfática (un desgarro entre las membranas entre el oído medio e interno), fístula arteriovenosa pulmonar (entre una arteria y una vena de los pulmones, lo que resulta en una derivación de la sangre), fístula rectovaginal (entre el recto y la vagina), fístula umbilical (entre el ombligo y el intestino), fístula traqueoesofágica (entre los conductos de respiración y alimentación) y fístula vesicovaginal (entre la vejiga y la vagina). Las causas de las fístulas incluyen traumatismos, complicaciones del tratamiento médico y enfermedades.

El tratamiento de las fístulas varía dependiendo de la causa y el grado de la fístula, pero generalmente implica una intervención quirúrgica. Comúnmente se usan diversos procedimientos quirúrgicos, los más comunes son la fistulotomía, la colocación de un setón (un cordón que se pasa a través del trayecto de la fístula para mantenerla abierta para el drenaje) o un procedimiento de colgajo endorrectal (en el que se tira de tejido sano sobre el lado interno de la fístula para evitar que las heces u otros materiales vuelvan a infectar el canal). La cirugía para las fístulas anorrectales no está exenta de efectos secundarios que incluyen recidiva, reinfección e incontinencia. Las enfermedades inflamatorias del intestino, tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son las principales causas de fístulas anorrectales, enteroenterales y enterocutáneas. La incidencia notificada de fístula en la enfermedad de Crohn oscila entre el 17% y el 50%. El manejo de las fístulas en pacientes con enfermedad de Crohn continúa presentando un problema extremadamente desafiante ya que muchas de estas fístulas no responden a los tratamientos disponibles. Tales fístulas y su recidiva son una complicación muy angustiante que reduce significativamente la calidad de vida de los pacientes afectados. Mejoras recientes en el tratamiento médico (por ejemplo, tratamiento con Infliximab®) y el manejo quirúrgico experto han disminuido la necesidad de cirugías complicadas. Sin embargo, muchos pacientes no se curan. La incapacidad de las fístulas de curarse se debe probablemente a la calidad subóptima de los tejidos que han sido afectados por la enfermedad de Crohn. De hecho, las fístulas de Crohn proporcionan un sistema modelo para la cicatrización de heridas en algunas de las peores condiciones posibles.

Las fístulas perianales son una complicación frecuente de la enfermedad de Crohn,A1 que se estima que afectan hasta el 28% de los pacientes en las primeras dos décadas después del diagnóstico, A2, A3 particularmente aquellos con enfermedad colónica y afectación rectal. A4 Alteran gravemente la calidad de vida de los pacientes y provocan una morbilidad considerable. A5, A6 Aproximadamente el 70-80% de las fístulas perianales son complejas, A3, A7 y estas son difíciles de tratar ya que son particularmente resistentes a las estrategias de tratamiento convencionales (antibióticos, inmunosupresores) y terapias con agentes anti-factor de necrosis tumoral (anti-TNF). A8-A12 Además, el 60-70% de los pacientes recaen al suspender el tratamiento, A13-A17 y sólo una minoría de pacientes logra la remisión a largo plazo. A18

El fallo de o la intolerancia a la terapia médica puede dar como resultado en última instancia enfoques quirúrgicos debilitantes, tales como el estoma de derivación o la proctectomía. A19 Por tanto, sigue existiendo una enorme necesidad insatisfecha de tratamientos médicos alternativos.

Las células estromales mesenquimatosas (MSC) son células estromales no hematopoyéticas que pueden diferenciarse en tejidos mesenquimatosos tales como hueso, cartílago, músculo, ligamento, tendón y tejido adiposo. Las MSC pueden aislarse fácilmente de tejidos tales como la médula ósea o el tejido adiposo y expandirse rápidamente en cultivo. El documento WO-A-2006/136244 describe el tratamiento de fístulas usando composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo. Las células estromales mesenquimatosas derivadas de tejido adiposo son un nuevo enfoque terapéutico prometedor que puede ser útil para el tratamiento de fístulas perianales complejas debido a su potencial antiinflamatorio y regenerador de tejidos. A20-A22 La prueba de concepto inicial se obtuvo previamente en un estudio clínico abierto de fase 1/2a de células madre derivadas de tejido adiposo expandidas alogénicas (eASC, Cx601) en 24 pacientes con enfermedad de Crohn y fístulas perianales complejas; el 56,3% de los pacientes mostró el cierre completo del orificio externo y la ausencia de acumulaciones medidas por IRM de la fístula tratada 24 semanas después del tratamiento. A23

Paneles et al. (2016) J. Crohn's Colitis 1-25; documentos US 2012/0020937; WO 2014/140632; US 2006/0045872 y Park et al. (2015) Colorectal Disease 18(5): 468-476 describen el uso de células madre estromales derivadas de tejido adiposo para el tratamiento de fístulas.

Las fístulas perianales complejas en la enfermedad de Crohn son particularmente difíciles de tratar y sigue existiendo la necesidad de establecer terapias clínicamente probadas para el tratamiento de las fístulas perianales complejas en la enfermedad de Crohn.

Sumario de la invención

La invención se refiere a la provisión de terapias clínicamente probadas para el tratamiento de fístulas perianales complejas resistentes en la enfermedad de Crohn, basándose en los resultados de un estudio multicéntrico, de doble ciego, controlado con placebo que evaluó la eficacia y seguridad de eASC en 212 adultos con enfermedad de Crohn y fístulas perianales complejas drenantes y resistentes al tratamiento. Los ejemplos en el presente documento describen el primer estudio de fase 3 controlado con placebo que evalúa la eficacia y seguridad de células madre derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas solas o añadidas a la terapia médica actual para fístulas perianales complejas resistentes al tratamiento en pacientes con enfermedad de Crohn. Los resultados informados en el presente documento son los criterios de valoración principal y secundario de 24 semanas.

Los datos del nuevo ensayo clínico revelaron sorprendentemente que las células madre derivadas de tejido adiposo tratan las fístulas perianales complejas de vías múltiples con especial eficacia. Los datos también muestran que el mayor efecto numérico de las células se observó en pacientes que estaban recibiendo tanto la terapia con agentes anti-TNF como la terapia con inmunosupresores o ninguna de las mismas, en el momento de la preparación de la fístula. Además, la remisión clínica se logró sorprendentemente poco tiempo después del tratamiento, con una mediana de tiempo hasta la remisión clínica en el grupo de tratamiento de 6,7 semanas. Del mismo modo, la mediana del tiempo de respuesta fue de 6,3 semanas. La mejora en el índice de actividad de la enfermedad perianal (PDAI) fue significativamente mayor en las semanas 6, 12 y 18. En general, los datos revelan que las eASC alogénicas son una terapia sorprendentemente eficaz para las fístulas perianales complejas en pacientes con enfermedad de Crohn, por lo que una sola administración puede proporcionar un efecto terapéutico rápido y sostenido incluso en las fístulas muy complejas y más difíciles de tratar, donde la terapia farmacológica previa ha fallado.

Un primer aspecto de la invención proporciona células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso en un método de tratamiento de una fístula perianal compleja resistente en un paciente que tiene la enfermedad de Crohn, en las que:

(i) la fístula comprende múltiples trayectos;

(ii) se administra al paciente una dosis de 120 millones de células en un solo procedimiento en el que cada trayecto de la fístula recibe al menos una parte de esta dosis y en el que aproximadamente la mitad de la dosis se inyecta en el tejido que rodea el orificio u orificios internos y la otra mitad se inyecta en las paredes de la fístula a lo largo de los trayectos de la fístula; y

(iii) la terapia induce la remisión clínica en el plazo de 24 semanas.

También se dan a conocer en el presente documento, entre otras cosas, composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo. Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo descritas en el presente documento tienen un fenotipo distinto y muestran una homogeneidad beneficiosa del fenotipo, haciéndolas así más adecuadas para su uso en el tratamiento de fístulas. Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo pueden formularse con disoluciones u otras sustancias para servir como productos farmacéuticos o dispositivos médicos, por ejemplo, como suturas o adhesivos. Además, se proporcionan métodos novedosos para tratar fístulas perianales complejas usando células madre estromales derivadas de tejido adiposo, así como kits para la práctica de los mismos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el diseño del estudio clínico de fase III. Cx601, células madre derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas; ICF, formulario de consentimiento informado; IRM, obtención de imágenes por resonancia magnética.

La figura 2 resume la disposición de pacientes. Cx601, células madre derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas; ITT: intención de tratar; mITT: intención de tratar modificada;

•Trombosis venosa profunda, reaparición de la enfermedad de Crohn, obstrucción intestinal, enfermedad de Crohn, absceso anal (n=3); fFístula, proctalgia, absceso anal (n=4); fSin curación o empeoramiento de los síntomas; nuevo curso de antibióticos; nueva cirugía en región perianal; §Empeoramiento de la enfermedad de Crohn que requiere un cambio en la terapia.

La figura 3 muestra el criterio de valoración principal: remisión clínica y radiológica combinadâ en la semana 24 en población ITT (panel A). Remisión clínica y radiológica combinadâ en la semana 24 en población mITT (panel B). Remisión combinadâ en la semana 24 según los factores de estratificación de la aleatorización, es decir, los tratamientos para la enfermedad de Crohn que se reciben en el momento de la aleatorización, en la población mITT (panel C). Cx601, células madre derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas; IS, inmunosupresor; ITT: intención de tratar; mITT: intención de tratar modificada; TNF, factor de necrosis tumoral. •Evaluación clínica del cierre de todos los orificios externos tratados que estaban drenando al inicio del estudio, y la ausencia de acumulaciones >2 cm de las fístulas perianales tratadas en >2 de 3 dimensiones en la evaluación de resonancia magnética enmascarada centralmente en la semana 24. La evaluación clínica del cierre se definió como ausencia de drenaje a pesar de la compresión suave con los dedos.

Descripción detallada de la invención

1. Definiciones:

Tal como se usan en el presente documento, los siguientes términos y frases tendrán los significados que se establecen a continuación. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos habituales en la técnica a la que pertenece esta invención.

Los artículos “un/uno” y “una” se refieren a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

Por “tejido adiposo” se entiende cualquier tejido graso. El tejido adiposo puede ser tejido adiposo marrón o blanco, derivado de tejido adiposo subcutáneo, omental/visceral, mamario, gonadal u otro sitio de tejido adiposo. Normalmente, el tejido adiposo es tejido adiposo blanco subcutáneo. Tales células pueden comprender un cultivo celular primario o una línea celular inmortalizada. El tejido adiposo puede ser de cualquier organismo que tenga tejido graso. Normalmente, el tejido adiposo es de mamífero, más normalmente el tejido adiposo es de humano. Una fuente conveniente de tejido adiposo es de la cirugía de liposucción, sin embargo, la fuente de tejido adiposo o el método de aislamiento del tejido adiposo no son críticos para la invención.

“Células madre estromales derivadas de tejido adiposo” o “ASC” se refiere a células madre mesenquimatosas que se originan a partir de la fracción estromal del tejido adiposo, generalmente de tejido adiposo humano (hASC).

El término “adhesivo” se refiere a cualquier sustancia que une o vincula superficies; por ejemplo, un pegamento. El término “medicamento biológico” se entenderá como una sustancia farmacéutica basada en proteínas o ácidos nucleicos para uso terapéutico, que normalmente se produce por medios distintos a la extracción directa de una fuente biológica nativa (no modificada por ingeniería).

El término “composición celular” se refiere a una preparación de células, preparación que puede incluir, además de las células, componentes no celulares tales como medios de cultivo celular, por ejemplo, proteínas, aminoácidos, ácidos nucleicos, nucleótidos, coenzimas, antioxidantes, metales y similares. Además, la composición celular puede tener componentes que no afectan el crecimiento o la viabilidad del componente celular, pero que se usan para proporcionar las células en un formato particular, por ejemplo, como matriz polimérica para encapsulación o preparación farmacéutica.

Una “fístula perianal compleja” es una fístula perianal que tiene uno o más de:

(i) alto origen inter-, trans-, extra- o supra-esfinteriano;

(ii) >2 orificios externos; o

(iii) acumulaciones asociadas.

La fístula perianal compleja puede tener opcionalmente un máximo de 2 orificios internos y 3 externos. Además, la fístula perianal compleja puede haber estado drenando durante al menos 6 semanas antes del tratamiento según la invención.

El término “cultivo” se refiere a cualquier crecimiento de células, organismos, entidades multicelulares o tejido en un medio. El término “cultivo” se refiere a cualquier método para lograr tal crecimiento y puede comprender múltiples etapas. El término “cultivo adicional” se refiere al cultivo de una célula, organismo, entidad multicelular o tejido hasta una determinada etapa de crecimiento, luego usando otro método de cultivo para llevar dicha célula, organismo, entidad multicelular o tejido a otra etapa de crecimiento. Un “cultivo celular” se refiere a un crecimiento de células in vitro. En tal cultivo, las células proliferan, pero no se organizan en tejido per se. Un “cultivo de tejidos” se refiere al mantenimiento o crecimiento de tejidos, por ejemplo, explantes de órganos primordiales o de un órgano adulto in vitro para preservar su arquitectura y función. Un “cultivo en monocapa” se refiere a un cultivo en el que las células se multiplican en un medio adecuado mientras se unen principalmente entre sí y a un sustrato. Además, un “cultivo en suspensión” se refiere a un cultivo en el que las células se multiplican mientras están suspendidas en un medio adecuado. Asimismo, un “cultivo de flujo continuo” se refiere al cultivo de células o explantes en un flujo continuo de medio recién preparado para mantener el crecimiento celular, por ejemplo, viabilidad. El término “medio acondicionado” se refiere al sobrenadante, por ejemplo, libre de células/tejidos cultivados, lo que resulta después de un periodo de tiempo en contacto con las células cultivadas de tal manera que el medio se ha alterado para incluir determinados factores paracrinos y/o autocrinos producidos por las células y secretados en el cultivo. Un “cultivo confluente” es un cultivo celular en el que todas las células están en contacto y, por tanto, se cubre toda la superficie del recipiente de cultivo, lo que implica que las células también han alcanzado su máxima densidad, aunque la confluencia no significa necesariamente que la división vaya a cesar o que la población no aumentará de tamaño.

El término “medio de cultivo” o “medio” se reconoce en la técnica y se refiere generalmente a cualquier sustancia o preparación usada para el cultivo de células vivas. El término “medio”, tal como se usa en referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento líquidos así como medios líquidos que no sustentan el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos tales como matrices de agar, agarosa, gelatina y colágeno. Los medios gaseosos a modo de ejemplo incluyen la fase gaseosa a la que están expuestas las células que crecen en una placa de Petri u otro soporte sólido o semisólido. El término “medio” también se refiere a material destinado a usarse en un cultivo celular, incluso si aún no se ha puesto en contacto con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para cultivo bacteriano es un medio. De manera similar, una mezcla de polvo que cuando se mezcla con agua u otro líquido se vuelve adecuada para el cultivo celular puede denominarse “medio en polvo”. “Medio definido” se refiere a medios que están elaborados por componentes químicamente definidos (generalmente purificados). Los “medios definidos” no contienen extractos biológicos mal caracterizados, tales como el extracto de levadura y el caldo de res. “Medio rico” incluye medios que están diseñados para soportar el crecimiento de la mayoría o todas las formas viables de una especie particular. Los medios ricos suelen incluir extractos biológicos complejos. Un “medio adecuado para el crecimiento de un cultivo de alta densidad” es cualquier medio que permita que un cultivo celular alcance una DO600 de 3 o más cuando otras condiciones (tales como la temperatura y la tasa de transferencia de oxígeno) permitan dicho crecimiento. El término “medio basal” se refiere a un medio que promueve el crecimiento de muchos tipos de microorganismos que no requieren ningún complemento nutricional especial. La mayoría de los medios basales generalmente comprenden cuatro grupos químicos básicos: aminoácidos, hidratos de carbono, sales inorgánicas y vitaminas. Un medio basal sirve generalmente como base para un medio más complejo, al que se añaden complementos tales como suero, tampones, factores de crecimiento, lípidos y similares. Los ejemplos de medios basales incluyen, pero no se limitan a, medio basal de Eagle, medio esencial mínimo, medio de Eagle modificado por Dulbecco, medio 199, mezclas de nutrientes de Ham F-10 y de Ham F-12, medio de Mc Coy 5A, medio de Dulbecco MEM/FI 2, RPMI 1640 y medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM).

Los términos “comprende” y “que comprende” se usan en el sentido abierto e inclusivo, lo que significa que se pueden incluir elementos adicionales.

El término “Cx601” se refiere a una suspensión celular en una solución salina tamponada aséptica que contiene células madre derivadas de tejido adiposo expandidas (eASC) humanas de origen alogénico. Estas células se proporcionan en viales desechables sin agentes conservantes. Las células se administran a una dosis de 120 millones de células (5 millones de células/ml) para inyección intralesional.

El término “diferenciación” se refiere a la formación de células que expresan marcadores que se sabe que están asociados con células que son más especializadas y más cercanas a convertirse en células diferenciadas terminalmente incapaces de división o diferenciación adicional. Por ejemplo, en un contexto pancreático, la diferenciación puede observarse en la producción de grupos de células similares a islotes que contienen una mayor proporción de células beta-epiteliales que producen mayores cantidades de insulina. Los términos diferenciación “adicional” o “mayor” se refieren a células que están más especializadas y más cercanas a convertirse en células diferenciadas terminalmente incapaces de una división o diferenciación adicional con respecto a las células de las cuales se cultivaron. El término “diferenciación final” se refiere a células que se han convertido en células diferenciadas terminalmente incapaces de división o diferenciación adicional.

El término “expandida”, como se usa en el presente documento cuando se refiere a células, se entenderá que tiene su significado habitual en la técnica, a saber, células que han proliferado in vitro. Los métodos para la preparación de eASC se conocen en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO2007/039150. Una ASC puede expandirse para proporcionar una población de células que conservan al menos una función biológica de la ASC, normalmente la capacidad de adherirse a una superficie de plástico, en condiciones de cultivo convencionales. La población expandida de células puede conservar la capacidad de diferenciarse en uno o más tipos de células.

El término “fístula” se refiere a cualquier pasaje, comunicación o conexión anómala, generalmente entre dos órganos internos o que va desde un órgano interno hasta la superficie del cuerpo. Los ejemplos de fístulas incluyen, pero no se limitan a, fístula anorrectal o fístula en el ano o fístula fecal, fístula arteriovenosa o fístula A-V, fístula biliar, fístula cervical, fístula craneosinusal, fístula enteroenteral, fístula enterocutánea, fístula enterovaginal, fístula gástrica, fístula metroperitoneal perilinfa, fístula arteriovenosa pulmonar, fístula rectovaginal, fístula umbilical, fístula traqueoesofágica y fístula vesicovaginal. La invención se refiere a la fístula perianal.

El término “que incluye(n)” se usa en el presente documento para significar “que incluye(n) pero no se limita(n) a”. “Que incluye(n)” y “que incluye(n) pero no se limita(n) a” se usan de manera intercambiable.

“Marcador” se refiere a una molécula biológica cuya presencia, concentración, actividad o estado de fosforilación puede detectarse y usarse para identificar el fenotipo de una célula.

Las “células estromales mesenquimatosas” (también denominadas en el presente documento “MSC”) son células estromales multipotentes (es decir, son células que pueden dar lugar a múltiples tipos diferentes de células), normalmente derivadas del tejido conjuntivo, y son células no hematopoyéticas. Las MSC tienen la capacidad de diferenciarse en o hacia células somáticas tales como células mesodérmicas (por ejemplo, adipocito, condrocitos, osteoblastos) y opcionalmente en o hacia tipos o linajes de células endodérmicas y/o ectodérmicas. Normalmente, las células tienen la capacidad de diferenciarse en o hacia al menos dos o todos los tipos de células seleccionados del grupo que consiste en linajes adipocíticos, condroblásticos y osteoblásticos. Las ASC son un tipo de MSC que se obtienen a partir de la fracción estromal del tejido adiposo. Las MSC y las ASC se adhieren al plástico en condiciones de cultivo convencionales.

Un “parche” es un apósito o cubierta que se aplica para cubrir o proteger una herida u otra llaga.

Un “paciente”, “sujeto” o “huésped” que va a tratarse por el método en cuestión puede significar o bien un ser humano o bien un animal no humano.

La expresión “farmacéuticamente aceptable” se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una razón de beneficio/riesgo razonable.

La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, un diluyente, un excipiente o un material que encapsula un disolvente, involucrado en el transporte del compuesto en cuestión desde un órgano, o parte del cuerpo, hasta otro órgano, o parte del cuerpo. Cada portador debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás componentes de la formulación y no perjudicial para el paciente. El término “fenotipo” se refiere a las características observables de una célula, tales como el tamaño, la morfología, la expresión de proteínas, etc.

El término “célula progenitora” se refiere a una célula que tiene la capacidad de crear progenie que está más diferenciada que ella misma. Por ejemplo, el término puede referirse a una célula indiferenciada o una célula diferenciada en un grado inferior a la diferenciación final que puede proliferar y dar lugar a más células progenitoras que tienen la capacidad de generar una gran cantidad de células madre que a su vez pueden dar lugar a células hijas diferenciadas o diferenciables. En una realización preferida, el término célula progenitora se refiere a una célula madre generalizada cuyos descendientes (progenie) se especializan, a menudo en diferentes direcciones, por diferenciación, por ejemplo, adquiriendo caracteres completamente individuales, tal como se produce en la diversificación progresiva de células y tejidos embrionarios. La diferenciación celular es un proceso complejo que ocurre normalmente a través de muchas divisiones celulares. Una célula diferenciada puede derivar de una célula multipotente que a su vez deriva de una célula multipotente, y así sucesivamente. Si bien cada una de estas células multipotentes puede considerarse células madre, la gama de tipos de células que cada una puede generar puede variar considerablemente. Algunas células diferenciadas también tienen la capacidad de dar lugar a células de mayor potencial de desarrollo. Tal capacidad puede ser natural o puede inducirse artificialmente mediante el tratamiento con diversos factores. Según esta definición, las células madre también pueden ser células progenitoras, así como los precursores más inmediatos de las células diferenciadas terminalmente.

“Proliferación” se refiere a un aumento en el número de células. “Que prolifera(n)” y “proliferación” se refieren a células que experimentan mitosis.

Se entenderá que “resistente” significa la ausencia de un beneficio clínico significativo cuando se usa en el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, sin mejoría o alivio significativo de los síntomas.

El término “remisión” se refiere al tratamiento exitoso de la fístula. La “remisión clínica” es el cierre de todos los orificios externos tratados que estaban drenando al inicio del estudio, a pesar de la compresión suave con los dedos. El tiempo hasta la remisión clínica se define como el tiempo desde el inicio del tratamiento hasta la primera evaluación del paciente con remisión clínica. “Remisión combinada” es esta remisión clínica más confirmación por IRM (obtención de imágenes por resonancia magnética) de la ausencia de acumulaciones mayores de 2 cm en las fístulas perianales tratadas, en al menos 2 de 3 dimensiones. Esto se confirma generalmente mediante una lectura de resonancia magnética enmascarada centralmente. La ausencia de acumulaciones o abscesos es importante porque si no se curan, darán lugar a una nueva fístula.

El término “respuesta” se refiere al cierre de al menos el 50% de todos los orificios externos tratados que estaban drenando al inicio del estudio, a pesar de la compresión suave con los dedos (es decir, según la evaluación clínica). Por tanto, la respuesta se cumple cuando se cierra 1 orificio externo (EO) si el número de EO al inicio de estudio es 1 o 2, y se cumple cuando se cierran 2 EO si había 3 EO al inicio de estudio. El tiempo de respuesta se define como el tiempo desde el inicio del tratamiento hasta la primera evaluación de la respuesta.

El término “recaída” se refiere, en pacientes con remisión clínica en la evaluación previa, a la reapertura de cualquiera de los orificios externos tratados con drenaje activo según lo evaluado clínicamente, o al desarrollo de una acumulación perianal mayor a 2 cm de la(s) fístula(s) perianal(es) tratada(s) tal como se confirma mediante IRM.

Tal como se usa en el presente documento, el término “disolución” incluye un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable en el que las células para su uso según la invención permanecen viables.

El término “sustancialmente puro”, con respecto a las poblaciones de células madre derivadas de tejido adiposo, se refiere a una población de células madre derivadas de tejido adiposo que es de al menos aproximadamente el 75%, normalmente al menos aproximadamente el 85%, más normalmente al menos aproximadamente el 90%, y más normalmente al menos aproximadamente el 95% pura, con respecto a las células madre estromales derivadas de tejido adiposo que constituyen una población de células total. Refundido, el término “sustancialmente puro” se refiere a una población de células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso según la presente invención que contienen menos de aproximadamente el 20%, más normalmente menos de aproximadamente el 10%, más normalmente menos de aproximadamente el 5%, de células comprometidas con el linaje en la población original no amplificada y aislada antes del cultivo y la amplificación posteriores. “Soporte” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier dispositivo o material que pueda servir como base o matriz para el crecimiento de células madre estromales derivadas de tejido adiposo.

El término “sutura” se refiere a un hilo o fibra u otro material de sujeción que puede usarse para coser una herida. Una fístula de un solo “trayecto” es una que tiene un orificio interno y un orificio externo. Una fístula con “trayectos múltiples” tiene más de un orificio externo y/o más de un orificio interno. Por tanto, una fístula de trayectos múltiples tiene diferentes ramas. Cada orificio externo normalmente representa un trayecto.

El término “tratar”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a reparar una fístula o herida, así como a prevenir que una fístula o herida empeore o reaparezca.

“Agente terapéutico” o “producto terapéutico” se refiere a un agente que puede tener un efecto biológico deseado en un huésped. Los agentes quimioterápicos y genotóxicos son ejemplos de agentes terapéuticos que generalmente se sabe que son de origen químico, en lugar de biológico, o que provocan un efecto terapéutico mediante un mecanismo de acción particular, respectivamente. Los ejemplos de agentes terapéuticos de origen biológico incluyen factores de crecimiento, hormonas y citocinas. Se conocen en la técnica una variedad de agentes terapéuticos y pueden identificarse por sus efectos. Determinados agentes terapéuticos pueden regular la proliferación y diferenciación celular. Los ejemplos incluyen nucleótidos quimioterápicos, fármacos, hormonas, proteínas no específicas (no anticuerpos), oligonucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido que se unen a una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ARNm)), péptidos y peptidomiméticos.

2. Composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo

El uso de la presente invención implica composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo con determinadas características, tales como un fenotipo particular. Por ejemplo, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo en una composición celular para su uso en la presente invención pueden caracterizarse por la expresión de marcadores de superficie celular, tamaño, consumo de glucosa, producción de lactato y rendimiento/viabilidad celular. En el presente documento se describen composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo que incluyen, como componente celular, preparaciones sustancialmente puras de células madre estromales derivadas de tejido adiposo que tienen un fenotipo particular, o la progenie de las mismas. Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso en la presente invención incluyen no sólo poblaciones sustancialmente puras de las células progenitoras, sino que también pueden incluir componentes de cultivo celular, por ejemplo, medios de cultivo que incluyen aminoácidos, metales o factores de coenzima. Además, otros componentes no celulares pueden incluir aquellos que hacen que el componente celular sea adecuado para soporte en circunstancias particulares, por ejemplo, implantación, por ejemplo, cultivo continuo, o adecuado para su uso como biomaterial o composición farmacéutica.

En determinadas realizaciones, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo se producen a través de los métodos de cultivo descritos en la sección 3.

Las ASC preferidas son células Cx601. La denominación común internacional propuesta (pero no confirmada) para estas células es “Adalextemcel”.

Las ASC se adhieren al plástico en condiciones de cultivo convencionales.

Las ASC expandidas (eASC) presentan una morfología similar a la de los fibroblastos en cultivo. Específicamente, estas células son grandes y se caracterizan morfológicamente por un cuerpo celular poco profundo con pocas proyecciones celulares que son largas y delgadas. El núcleo es grande y redondo con un nucléolo prominente, lo que le da aspecto transparente. La mayoría de las eASC presentan esta morfología fusiforme, pero es habitual que algunas de las células adquieran morfologías poligonales (Zuk et al., 2002). Las eASC Cx601 son positivas para los marcadores de superficie HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 y CD105. Por tanto, una realización proporciona una composición que contiene eASC en la que al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95%, o normalmente al menos el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de las eASC expresan los marcadores de superficie HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 y CD105. Por lo general, al menos el 90% de las eASC expresan los marcadores de superficie HLA I, CD29, Cd44, CD59, CD73, CD90 y CD105. Más normalmente, al menos el 95% de las eASC expresan los marcadores de superficie HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 y CD105.

Las eASC CX601 son negativas para HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 y CD86. Por tanto, una realización proporciona una composición que contiene eASC en la que menos del 5% de las eASC expresan los marcadores de superficie HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, c D31, CD34, CD80 y CD86. Más normalmente, menos del 4%, del 3% o del 2% de las eASC expresan los marcadores de superficie HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 y CD86. En una realización, menos del 1% de las eASC expresan los marcadores de superficie HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 y CD86.

En algunas realizaciones, las eASC pueden expresar uno o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o siete) de HLA I, CD29, CD44, CD59, Cd73, CD90 y CD105. En algunas realizaciones, los eASC pueden no expresar uno o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete u ocho) de H^lAII, CD11b, CD11c, C^d14, CD45, CD31, CD34, CD80. En algunas realizaciones, las eASC expresan cuatro o más de HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 y CD105 y no expresan cuatro o más de HLAII, CD11 b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80.

Las ASC humanas expandidas para su uso según determinadas realizaciones de la invención se describen en DelaRosa et al. (“Requirement of IFN-gamma-mediated indoleamine 2,3-dioxygenase expression in the modulation of lymphocyte proliferation by human adipose-derived stem cells”. Tissue Eng Part A. oct. de 2009; 15(10):2795-806. doi: 10.1089/ten.TEA.2008.0630) y en Lopez-Santalla et al. 2015 (“Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Modulate Experimental Autoimmune Arthritis by Modifying Early Adaptive T Cell Responses”. STEM CELLS, 33: 3493-3503. doi: 10.1002/stem.2113).

Tal como se describe en Lopez-Santalla et al. 2015, los aspirados de tejido adiposo humano de donantes sanos se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y se digirieron con colagenasa al 0,075% (tipo I; Invitrogen). La muestra digerida se lavó con suero bovino fetal al 10% (FBS), se trató con NH4Cl 160 mM para eliminar los eritrocitos restantes, y se suspendió en medio de cultivo [medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con FBS al 10%]. Las células se sembraron (2-3 104 células/cm2) en frascos de cultivo de tejidos y se expandieron (37°C, 5% de CO²) con cambio de medio de cultivo cada 3-4 días. Las células se transfirieron a un matraz nuevo (103 células/cm2) cuando alcanzaron el 90% de confluencia. Las células se expandieron hasta la duplicación 12-14 y se congelaron. Los experimentos se realizaron con células de dos donantes adultos masculinos y dos femeninos en duplicaciones de población 12-14. Las ASC se descongelaron de los mismos criobancos y se sembraron antes de cada experimento. Las ASC se definieron según los criterios de la International Society for Cellular Therapy: siendo positivas para HLA-I, CD73, CD90 y CD105 y negativas para CD11b, CD14, CD31, CD34 y CD45.

Tal como describieron DelaRosa et al. 2009, los lipoaspirados obtenidos de tejido adiposo humano de donantes adultos sanos se lavaron dos veces con PBS y se digirieron a 37°C durante 30 min con 18U=ml de colagenasa tipo I en PBS. Una unidad de colagenasa libera 1 mM de equivalentes de L-leucina a partir de colágeno en 5 h a 37°C, pH 7,5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). La muestra digerida se lavó con suero bovino fetal al 10% (FBS), se trató con ClNH4160 mM, se suspendió en medio de cultivo (DMEM que contiene FBS al 10%) y se filtró a través de una malla de nailon de 40 mm. Las células se sembraron (2-3 104 células/cm2) en matraces de cultivo de tejidos y se expandieron a 37°C y el 5% de CO², cambiando el medio de cultivo cada 7 días. Las células se pasaron a un nuevo matraz de cultivo (10008 células=cm2) cuando los cultivos alcanzaron el 90% de confluencia. Las células se caracterizaron fenotípicamente por su capacidad para diferenciarse en linajes condrogénicos, osteogénicos y adipogénicos. Además, las hASC se verificaron mediante tinción con marcadores de superficie específicos. Las hASC fueron positivas para HLA-I, CD90 y CD105 y negativas para HLA-II, CD40, CD80, CD86 y CD34. En el estudio se utilizó un grupo de seis donantes sanos (tres hombres y tres mujeres, de entre 35 y 47 años de edad). Las células se usaron en los pases 4-6.

En algunas realizaciones, las ASC (i) no expresan marcadores específicos de las APC; (ii) no expresan IDO constitutivamente (iii) no expresan significativamente CMH II constitutivamente. Normalmente, la expresión de IDO o CMH II puede inducirse mediante estimulación con IFN-y.

Las ASC pueden expresar uno o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, o diez o más (por ejemplo, hasta 13)) de los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y CD105. Por ejemplo, las ASC pueden expresar uno o más (por ejemplo, dos, tres o todos) de los marcadores CD29, CD59, CD90 y CD105, por ejemplo, CD59 y/o CD90.

Las MSC pueden no expresar uno o más (por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, o diez o más (por ejemplo, hasta 15)) de los marcadores factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100, queratina, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD34, CD45, STRO-1 y CD133, por ejemplo, las MSC no expresan uno o más (por ejemplo, dos, tres o todos) de los marcadores CD34, CD45, CD31 y CD14, por ejemplo, CD31 y/o CD34.

En el presente documento se describe una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo, en la que al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%%, al menos aproximadamente el 95% o normalmente al menos aproximadamente el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de las células madre expresan los marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 y/o CD105. En determinadas realizaciones de las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo, menos de aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5% y normalmente de aproximadamente el 4%, el 3%, el 2% o el 1% de las células madre expresan los marcadores CD34, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD31, CD34, CD45, CD49f, CD102, CD104, CD106 y/o CD133.

En el presente documento se describe una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo, en la que al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%%, al menos aproximadamente el 95% o normalmente al menos aproximadamente el 96%, el 97%, el 98% o el 99% de las células madre expresan los marcadores c-Kit, vimentina y/o CD90. En determinadas realizaciones de las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo, menos de aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5% y normalmente de aproximadamente el 4%, el 3%, el 2% o el 1% de las células madre expresan los marcadores CD34, factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100 y/o queratina. También se proporciona una población de células madre estromales derivadas de tejido adiposo que expresa los marcadores c-Kit, vimentina y CD90 y no expresa los marcadores CD34, factor VIII, alfa-actina, desmina, S-100 y queratina.

La caracterización fenotípica de una población de células mediante marcadores de superficie puede realizarse o bien mediante tinción individual de las células (citometría de flujo) o bien mediante cortes histológicos de la población in situ, realizados según los métodos habituales. La determinación del perfil de expresión de marcadores de superficie por anticuerpos, caracterización de inmunofenotipo, puede ser directa, usando un anticuerpo marcado o indirecta, usando un segundo anticuerpo marcado contra el anticuerpo específico primario del marcador celular, consiguiendo así la amplificación de la señal. Por otro lado, la presencia o ausencia de unión al anticuerpo puede determinarse mediante diferentes métodos que incluyen pero no se limitan a microscopía de inmunofluorescencia y radiografía. Asimismo, es posible realizar el seguimiento de los niveles de unión del anticuerpo mediante citometría de flujo, técnica que permite correlacionar los niveles de fluorocromo con la cantidad de antígenos presentes en la superficie celular unidos específicamente a los anticuerpos marcados. La expresión diferencial de una serie de marcadores de superficie sobre una población de células proporciona un método de identificación y aislamiento de dicha población. Por consiguiente, normalmente puede usarse FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia).

En determinadas realizaciones, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo son suspensiones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo en diversas disoluciones o materiales, por ejemplo, para su uso como productos farmacéuticos o biomateriales, tal como se describe con más detalle a continuación. En una realización, la composición celular comprende una suspensión de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo en cuestión en disolución de Ringer y HSA. En otra realización, la composición celular comprende una suspensión de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo en cuestión en un material, tal como un polímero, pegamento, gel, etc. Suspensiones de este tipo pueden prepararse, por ejemplo, sedimentando las células madre estromales derivadas de tejido en cuestión del medio de cultivo y resuspendiéndolas en la disolución o material deseado. Las células pueden sedimentarse y/o cambiarse del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración, ultrafiltración, etc.

La concentración de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo en cuestión en las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo en cuestión puede ser al menos aproximadamente 5 x 106 células/ml, al menos aproximadamente 10 x 106 células/ml, al menos aproximadamente 20 x 106 células/ml, al menos aproximadamente 30 x 106 células/ml, o al menos aproximadamente 40 x 106 células/ml. Normalmente, la concentración entre aproximadamente 1 x 106 células/ml y 1 x 107 células/ml, por ejemplo, entre aproximadamente 5 x 106 células/ml y 1 x 107 células/ml. En el ensayo clínico informado en los ejemplos, las eASC se administraron a una concentración de 5 millones de células/ml.

Por consiguiente, otro aspecto de la presente divulgación se refiere a la progenie de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo en cuestión, por ejemplo, aquellas células que se han derivado de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo. Tal progenie puede incluir generaciones posteriores de células madre estromales derivadas de tejido adiposo, así como células comprometidas con el linaje generadas al inducir la diferenciación de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo en cuestión después de su aislamiento del explante, por ejemplo, inducidas in vitro. En determinadas realizaciones, las células de la progenie se obtienen después de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 pases de la población parental. Sin embargo, las células de la progenie pueden obtenerse después de cualquier número de pases de la población parental.

En determinadas realizaciones, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso en la presente invención se proporcionarán como parte de una preparación farmacéutica, por ejemplo, una preparación estéril, libre de la presencia de virus, bacterias y otros patógenos no deseados, así como libre de pirógenos. Es decir, para la administración a los humanos, las composiciones en cuestión deben cumplir con las normas de esterilidad, pirogenicidad así como de seguridad general y pureza requeridas por las normas de la Oficina de Productos Biológicos de la FDA. Las células madre estromales derivadas de tejido adiposo expandido son alogénicas con respecto al huésped del trasplante. Debido a las dificultades para obtener suficientes células madre autólogas, la célula madre estromal derivada de tejido adiposo de un donante alogénico constituye una valiosa fuente alternativa de células madre para uso terapéutico. Se sabe en la técnica que las células madre estromales de la médula ósea y las células estromales derivadas de tejido adiposo no provocaron una respuesta de linfocitos alogénicos in vitro y, por consiguiente, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas derivadas de un donante podrían usarse para cualquier paciente, independientemente de la incompatibilidad del CMH.

Los métodos para administrar las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo a sujetos, particularmente sujetos humanos, que se describen en detalle en el presente documento, incluyen inyección o implantación de las células en sitios diana en los sujetos, las células pueden insertarse en un dispositivo de administración que facilita la introducción, inyección o implantación, de las células en los sujetos. Dichos dispositivos de administración incluyen tubos, por ejemplo, catéteres, para inyectar células y fluidos en el cuerpo de un sujeto receptor. En una realización preferida, los tubos tienen además una aguja, por ejemplo, una jeringa, a través de la cual las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo pueden introducirse en el sujeto en el lugar deseado. Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo pueden insertarse en dicho dispositivo de administración, por ejemplo, una jeringa, en diferentes formas. Por ejemplo, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo incluyen composiciones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo que están suspendidas en una disolución o embebidas en una matriz de soporte cuando están contenidas en un dispositivo de administración de este tipo.

Los portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina, disoluciones tampón acuosas, disolventes y/o medios de dispersión. El uso de tales portadores y diluyentes se conoce bien en la técnica. La disolución es normalmente estéril y fluida en la medida en que existe una jeringabilidad fácil. Normalmente, la disolución es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos mediante el uso de, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Las disoluciones que son composiciones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso en la presente invención pueden prepararse incorporando células madre estromales derivadas de tejido adiposo tal como se describe en el presente documento en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y, según se requiera, otros componentes enumerados anteriormente, seguidos por esterilización por filtración.

Algunos ejemplos de materiales y disoluciones que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) polvo de tragacanto; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones con pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

En determinadas realizaciones, las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo comprenden además un adhesivo. En determinadas realizaciones, el adhesivo es un adhesivo a base de fibrina, tal como un gel de fibrina o un pegamento de fibrina o un polímero o adhesivo a base de fibrina, u otro adhesivo tisular o pegamento quirúrgico, tal como, por ejemplo, cianoacrilato, colágeno, trombina y polietilenoglicol. Otros materiales que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, alginato de calcio, agarosa, tipos I, II, IV u otra isoforma de colágeno, poli(ácido láctico)/poli(ácido glicólico), derivados de hialuronato u otros materiales (Perka C. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:305-311; Sechriest VF. et al. (2000) J. Biomed. Mater. Res. 49:534-541; Chu CR et al. (1995) J. Biomed. Mater. Res. 29:1147-1154; Hendrickson DA et al. (1994) Orthop. Res. 12:485-497). En otras realizaciones, el adhesivo es un vendaje líquido, en el que las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo del método se mezclan con el material del vendaje líquido. Un “vendaje líquido” es una disolución que comprende un compuesto, por ejemplo, un material polimérico, que se aplica a una herida con un aerosol o un cepillo, seguido de la eliminación del solvente por vaporización para proporcionar una película protectora sobre la herida.

Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso según la invención también pueden usarse para recubrir un soporte, por ejemplo, un dispositivo médico. Por ejemplo, el soporte puede ser una sutura o un hilo.

El soporte puede recubrirse con células de cualquier forma conocida por un experto en la técnica, por ejemplo, por remojo, pulverización, pintura, impresión, etc.

En una realización, el soporte es una sutura, grapa, hilo absorbible, hilo no absorbible, hilo natural, hilo sintético, hilo monofilamento o hilo multifilamento (también denominados trenzas). Los métodos preferidos para preparar suturas y otros soportes usados para cerrar heridas recubiertas con células madre estromales derivadas de tejido adiposo se dan a conocer en la solicitud de patente estadounidense n.° 2006-0047312 A1 “Biomaterial for Suturing”, presentada el 14 de febrero de 2005. Las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo dadas a conocer en el presente documento representan composiciones novedosas que pueden usarse con los métodos dados a conocer en la solicitud de patente estadounidense n.° 2006 0047312 A1.

Además, en cualquiera de las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo, puede incorporarse al menos un agente terapéutico en la composición (aunque no es necesario y puede excluirse opcionalmente). Por ejemplo, una composición puede contener un analgésico para ayudar a tratar la inflamación o el dolor en el sitio de la fístula, o un agente antiinfeccioso para prevenir la infección del sitio tratado con la composición.

Más específicamente, los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos útiles incluyen las siguientes categorías terapéuticas: analgésicos, tales como fármacos antiinflamatorios no esteroideos, agonistas opiáceos y salicilatos; agentes antiinfecciosos, tales como antihelmínticos, antianaerobios, antibióticos, antibióticos aminoglucósidos, antibióticos antifúngicos, antibióticos de cefalosporina, antibióticos macrólidos, diversos antibióticos p-lactámicos, antibióticos de penicilina, antibióticos de quinolona, antibióticos de sulfonamida, antibióticos de tetraciclina, antimicobacterianos, antimicobacterianos antituberculosos, antiprotozoarios, antiprotozoarios antipalúdicos, agentes antivirales, agentes antirretrovirales, escabicidas, agentes antiinflamatorios, agentes antiinflamatorios corticosteroides, antipruriginosos/anestésicos locales, antiinfecciosos tópicos, antiinfecciosos tópicos antifúngicos, antiinfecciosos tópicos antivirales; agentes electrolíticos y renales, tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, diuréticos, diuréticos inhibidores de la anhidrasa carbónica, diuréticos de asa, diuréticos osmóticos, diuréticos ahorradores de potasio, diuréticos tiazídicos, reemplazo de electrolitos y agentes uricosúricos; enzimas, tales como enzimas pancreáticas y enzimas trombolíticas; agentes gastrointestinales, tales como antidiarreicos, antieméticos, agentes antiinflamatorios gastrointestinales, agentes antiinflamatorios gastrointestinales de salicilatos, agentes antiulcerosos antiácidos, agentes antiulcerosos inhibidores de la bomba de ácido gástrico, agentes antiulcerosos de la mucosa gástrica, agentes antiulcerosos del bloqueante H2, agentes colelitolíticos, digestivos, eméticos, laxantes y ablandadores de heces y agentes procinéticos; anestésicos generales, tales como anestésicos por inhalación, anestésicos por inhalación halogenados, anestésicos intravenosos, anestésicos intravenosos con barbitúricos, anestésicos intravenosos con benzodiacepinas y anestésicos intravenosos agonistas de opiáceos; hormonas y modificadores de hormonas, tales como abortivos, agentes suprarrenales, agentes corticosteroides suprarrenales, andrógenos, antiandrógenos, agentes inmunobiológicos, tales como inmunoglobulinas, inmunosupresores, toxoides y vacunas; anestésicos locales, tales como anestésicos locales de amida y anestésicos locales de éster; agentes musculoesqueléticos, tales como agentes antiinflamatorios contra la gota, agentes antiinflamatorios corticosteroides, agentes antiinflamatorios de compuestos de oro, agentes antiinflamatorios inmunosupresores, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), agentes antiinflamatorios de salicilatos, minerales; y vitaminas, tales como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K.

Las clases preferidas de agentes terapéuticos útiles de las categorías anteriores incluyen: (1) analgésicos en general, tales como lidocaína o derivados de la misma, y analgésicos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), incluyendo diclofenaco, ibuprofeno, cetoprofeno y naproxeno; (2) analgésicos agonistas opiáceos, tales como codeína, fentanilo, hidromorfona y morfina; (3) analgésicos de salicilato, tales como aspirina (ASA) (ASA con cubierta entérica); (4) antihistamínicos bloqueantes de H¹, tales como clemastina y terfenadina; (5) agentes antiinfecciosos, tales como mupirocina; (6) antiinfecciosos antianaerobios, tales como cloranfenicol y clindamicina; (7) antiinfecciosos antibióticos antifúngicos, tales como anfotericina b, clotrimazol, fluconazol y cetoconazol; (8) antiinfecciosos antibióticos macrólidos, tales como azitromicina y eritromicina; (9) diversos antiinfecciosos antibióticos p-lactámicos, tales como aztreonam e imipenem; (10) antiinfecciosos antibióticos de penicilina, tales como nafcilina, oxacilina, penicilina G y penicilina V; (11) antiinfecciosos antibióticos de quinolona, tales como ciprofloxacina y norfloxacina; (12) antiinfecciosos antibióticos de tetraciclina, tales como doxiciclina, minociclina y tetraciclina; (13) antiinfecciosos antimicobacterianos antituberculosos tales como isoniazida (INH) y rifampicina; (14) antiinfecciosos antiprotozoarios, tales como atovacuona y dapsona; (15) antiinfecciosos antiprotozoarios antipalúdicos, tales como cloroquina y pirimetamina; (16) antiinfecciosos antirretrovirales, tales como ritonavir y zidovudina; (17) agentes antiinfecciosos antivirales, tales como aciclovir, ganciclovir, interferón alfa y rimantadina; (18) antiinfecciosos tópicos antifúngicos, tales como anfotericina B, clotrimazol, miconazol y nistatina; (19) antiinfecciosos tópicos antivirales, tales como aciclovir; (20) agentes electrolíticos y renales, tales como lactulosa; (21) diuréticos de asa, tales como furosemida; (22) diuréticos ahorradores de potasio, tales como triamtereno; (23) diuréticos tiazídicos, tales como hidroclorotiazida (HCTZ); (24) agentes uricosúricos, tales como probenecid; (25) enzimas tales como ARNasa y ADNasa; (26) antieméticos, tales como proclorperazina; (27) agentes antiinflamatorios gastrointestinales de salicilato, tales como sulfasalazina; (28) agentes antiulcerosos inhibidores de la bomba de ácido gástrico, tales como omeprazol; (29) agentes antiulcerosos bloqueantes de H², tales como cimetidina, famotidina, nizatidina y ranitidina; (30) digestivos, tales como pancrelipasa; (31) agentes procinéticos, tales como eritromicina; (32) anestésicos locales de éster, tales como benzocaína y procaína; (33) agentes antiinflamatorios corticosteroides musculoesqueléticos, tales como beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, hidrocortisona y prednisona; (34) inmunosupresores antiinflamatorios musculoesqueléticos, tales como azatioprina, ciclofosfamida y metotrexato; (35) fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) musculoesqueléticos, tales como diclofenaco, ibuprofeno, ketoprofeno, ketorolaco y naproxeno; (36) minerales, tales como hierro, calcio y magnesio; (37) compuestos de vitamina B, tales como cianocobalamina (vitamina B¹²) y niacina (vitamina B³); (38) compuestos de vitamina C, tales como ácido ascórbico; y (39) compuestos de vitamina D, tales como calcitriol.

En determinadas realizaciones, el agente terapéutico puede ser un factor de crecimiento u otra molécula que afecte a la diferenciación y/o proliferación celular. Los factores de crecimiento que inducen estados finales de diferenciación son bien conocidos en la técnica y pueden seleccionarse de cualquier factor de este tipo que se haya demostrado que induce un estado final de diferenciación. En determinadas realizaciones, los factores de crecimiento para su uso en los métodos descritos en el presente documento pueden ser variantes o fragmentos de un factor de crecimiento que se produce de manera natural. Por ejemplo, puede generarse una variante haciendo cambios conservadores de aminoácidos y sometiendo a prueba la variante resultante en uno de los ensayos funcionales descritos anteriormente u otro ensayo funcional conocido en la técnica. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.

Tal como apreciarán los expertos en la técnica, las variantes o fragmentos de factores de crecimiento polipeptídicos pueden generarse usando técnicas convencionales, tales como mutagénesis, incluyendo la creación de mutaciones puntuales discretas, o por truncamiento. Por ejemplo, la mutación puede dar lugar a variantes que conservan sustancialmente la misma, o simplemente un subconjunto, de la actividad biológica de un factor de crecimiento polipeptídico del que se derivó.

3. Métodos para preparar composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo Se conocen en la técnica métodos para el aislamiento y cultivo de ASC para proporcionar eASC y poblaciones de células para su uso según la invención, y composiciones que comprenden poblaciones de células usadas según la invención. Normalmente, los métodos para la preparación de composiciones que comprenden poblaciones de células comprenden las siguientes etapas:

(i) aislamiento de ASC de la fracción estromal del tejido adiposo y selección por adherencia a una superficie adecuada, por ejemplo, el plástico

(ii) expansión de ASC para proporcionar poblaciones de células para su uso según la invención que comprenden eASC.

Opcionalmente, las poblaciones de células para su uso según la invención pueden crioconservarse durante y/o después de la etapa de expansión (ii). Opcionalmente, el fenotipo de las poblaciones de células para su uso según la invención puede evaluarse durante y/o después de la etapa de expansión (ii). Opcionalmente, las poblaciones de células para su uso según la invención pueden aislarse después de la etapa de expansión (ii) y resuspenderse en un portador y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Las ASC pueden obtenerse por cualquier medio convencional en la técnica. Normalmente, dichas células se obtienen disociando las células del tejido de origen (por ejemplo, lipoaspirado o tejido adiposo), normalmente tratando el tejido con una enzima digestiva tal como colagenasa. Luego la materia tisular digerida normalmente se filtra a través de un filtro de entre aproximadamente 20 micrómetros y 1 mm. Luego las células se aíslan (normalmente mediante centrifugación) y se cultivan en una superficie adherente (normalmente placas o matraces de cultivo de tejidos). Tales métodos son conocidos en la técnica y por ejemplo, tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° 6777231. Según esta metodología, los lipoaspirados se obtienen a partir del tejido adiposo y las células derivadas del mismo. En el transcurso de esta metodología, las células pueden lavarse para eliminar los desechos contaminantes y los glóbulos rojos, preferiblemente con PBS. Las células se digieren con colagenasa (por ejemplo, a 37°C durante 30 minutos, el 0,075% de colagenasa; tipo I, Invitrogen, Carlsbad, CA) en PBS. Para eliminar los glóbulos rojos restantes, la muestra digerida puede lavarse (por ejemplo, con suero bovino fetal al 10%), tratarse con ClNH4160 mmol/l y finalmente suspenderse en medio completo DMEM (DMEM que contiene FBS al 10%, glutamina 2 mmol/l y el 1% de penicilina/estreptomicina). Las células pueden filtrarse a través de una malla de nailon de 40 |im.

Las células se cultivan en un recipiente de cultivo de tejidos adecuado que comprende una superficie adecuada para la adherencia de las ASC, por ejemplo, el plástico. Las células no adherentes se eliminan, por ejemplo, lavando en un tampón adecuado, para proporcionar una población aislada de células estromales adherentes (por ejemplo, ASC). Las células aisladas de esta manera pueden sembrarse (preferiblemente 2-3x104 células/cm2) en frascos de cultivo de tejidos y expandirse a 37°C y el 5% de CO2, cambiando el medio de cultivo cada 3-4 días. Las células se separan preferiblemente de la superficie adherente (por ejemplo, por medio de tripsina) y se pasan (“se hacen pasar”) a un nuevo matraz de cultivo (1.000 células/cm2) cuando los cultivos alcanzan aproximadamente el 90% de confluencia.

El aislamiento celular se lleva a cabo preferiblemente en condiciones estériles o BPF.

En una realización, un método comprende: (a) recoger tejido adiposo de un sujeto; (b) obtener una suspensión celular por digestión enzimática; (c) sedimentar la suspensión celular y resuspender las células en un medio de cultivo; (d) cultivar las células durante al menos aproximadamente 10 días; y (g) expandir las células durante al menos dos pases de cultivo.

Las células madre estromales derivadas de tejido adiposo son alogénicas, es decir, no están aisladas del tejido adiposo del sujeto en el que va a introducirse la composición final que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo.

Las células pueden cultivarse durante al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20 días, al menos aproximadamente 25 días o al menos aproximadamente 30 días. Normalmente, la expansión de células en cultivo mejora la homogeneidad del fenotipo celular en la población de células, de manera que se obtiene una población sustancialmente pura u homogénea.

Las células pueden expandirse en cultivo por al menos tres pases de cultivo o “pasarse al menos tres veces”. En otras realizaciones, las células se pasan al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos siete veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces o al menos diez veces. Es preferible que las células se pasen más de tres veces para mejorar la homogeneidad del fenotipo celular en la población de células. De hecho, las células pueden expandirse en cultivo indefinidamente siempre que se mejore la homogeneidad del fenotipo celular y se mantenga la capacidad diferencial.

Las células pueden multiplicarse en cultivo por al menos tres duplicaciones de población. En determinadas realizaciones, las células se expanden en cultivo durante al menos cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15 ó 20 duplicaciones de población. En determinadas realizaciones, las células se expanden en cultivo por menos de siete, ocho, nueve, diez, 15 ó 20 duplicaciones de población. En determinadas realizaciones, las células se expanden en cultivo por entre aproximadamente 5 y 10 duplicaciones de población. En determinadas realizaciones, las células se expanden en cultivo por entre aproximadamente 10 y 15 duplicaciones de población. Las células pueden expandirse en cultivo por entre aproximadamente 15 y 20 duplicaciones de población, por ejemplo, aproximadamente 16 duplicaciones de población.

Las células pueden cultivarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica para el cultivo de células madre. La descripción de diversas técnicas de cultivo, así como la ampliación a escala de las mismas, pueden encontrarse en Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4a edición, Wiley-Liss 2000. Las células pueden expandirse usando frascos de cultivo o biorreactores adecuados para la expansión a gran escala. Los biorreactores adecuados para la expansión a gran escala de células estromales mesenquimatosas están disponibles comercialmente y pueden incluir biorreactores de expansión tanto 2D (es decir, sustancialmente planos) como 3D. Los ejemplos de tales biorreactores incluyen, pero no se limitan a, un biorreactor de flujo pistón, un biorreactor de perfusión, un biorreactor de tanque con agitación continua, un biorreactor de lecho estacionario. En determinadas realizaciones, las células se cultivan mediante cultivo en monocapa. En una realización, las células se cultivan y pasan tal como se describe en el ejemplo A a continuación.

Puede usarse cualquier medio que puede soportar células estromales en cultivo de tejidos. Las formulaciones de medios que apoyarán el crecimiento de fibroblastos incluyen, pero no se limitan a, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo alfa modificado (alpha.MEM) y medio de Roswell Park Memorial Institute 1640 (medio RPMI 1640) y similares. Normalmente, se añadirá suero bovino fetal (FBS) del 0 al 20% o suero de caballo del 1 al 20% a los medios anteriores para apoyar el crecimiento de células estromales y/o condrocitos. Sin embargo, puede usarse un medio definido si se identifican los factores de crecimiento, las citocinas y las hormonas necesarios en FBS para las células estromales y los condrocitos y se proporcionan en las concentraciones adecuadas en el medio de crecimiento. Los medios útiles en los métodos pueden contener uno o más compuestos de interés incluyendo, pero sin limitarse a, compuestos antibióticos mitógenos o diferenciadores para células estromales. Las células se cultivarán a temperaturas de entre 31°C y 37°C en una incubadora humidificada. El contenido de dióxido de carbono se mantendrá entre el 2% y el 10% y el contenido de oxígeno entre el 1% y el 22%. Las células pueden permanecer en este ambiente durante periodos de hasta 4 semanas.

Los antibióticos que pueden complementarse en el medio incluyen, pero no se limitan a, penicilina y estreptomicina. La concentración de penicilina en el medio de cultivo químicamente definido es de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 unidades por ml. La concentración de estreptomicina en el medio de cultivo químicamente definido es de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 ug/ml.

Las células madre estromales derivadas de tejido adiposo pueden transfectarse o transducirse de manera estable o transitoria con un ácido nucleico de interés usando una estrategia de plásmido, viral o vector alternativo. Los ácidos nucleicos de interés incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican para productos génicos que mejoran la producción de componentes de la matriz extracelular que se encuentran en el tipo de tejido que va a repararse, por ejemplo, pared intestinal o pared vaginal.

La transducción de vectores virales que portan genes reguladores en las células madre estromales puede realizarse con vectores virales (adenovirus, retrovirus, virus adenoasociados u otro vector) purificados mediante bandas de cloruro de cesio u otro método en una multiplicidad de infecciones (unidades virales: célula) de entre 10:1 a 2000:1. Las células se expondrán al virus en medio libre de suero o que contenga suero en ausencia o presencia de un detergente catiónico tal como polietilenimina o Lipofectamine.TM. durante un periodo de 1 hora a 24 horas (Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502; Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int.

64:45-49).

Otros métodos adecuados para transferir vectores o plásmidos a células madre incluyen complejos de lípidos/ADN, tales como los descritos en las patentes estadounidense n.os 5.578.475; 5.627.175; 5.705.308; 5.744.335; 5.976.567; 6.020.202; y 6.051.429. Los reactivos adecuados incluyen Lipofectamine, una formulación de liposomas 3:1 (p/p) del lípido policatiónico trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA) (nombre del registro de resúmenes químicos: trifluoroacetato de N-[2-(2,5-bis[(3-aminopropil)amino]-1-oxpentil}amino)etil]-N,N-dimetil-2,3-bis(9-octadeceniloxi)-1-propanaminio) y el lípido neutro dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) en agua filtrada por membrana. Un ejemplo es la formulación Lipofectamine 2000TM (disponible de Gibco/Life Technologies n.° 11668019). Otros reactivos incluyen: reactivo de transfección FuGENE™ 6 (una mezcla de lípidos en forma no liposomal y otros compuestos en etanol al 80%, que puede obtenerse de Roche Diagnostics Corp. n.° 1814443); y reactivo de transfección LipoTAXI™ (una formulación lipídica de Invitrogen Corp., n.° 204110). La transfección de células madre puede realizarse por electroporación, por ejemplo, tal como se describe en ML Roach y J.D. McNeish (2002) Methods in Mol. Biol.

185:1. Los sistemas de vectores virales adecuados para producir células madre con alteraciones genéticas estables pueden basarse en adenovirus y retrovirus, y pueden prepararse usando componentes de virus disponibles comercialmente.

La transfección de vectores plasmídicos que portan genes reguladores en las células madre estromales puede introducirse en las células en cultivos monocapa mediante el uso de precipitación de ADN con fosfato de calcio o métodos de detergente catiónico (Lipofectamine.TM, DOTAP) o en cultivos tridimensionales mediante la incorporación de vectores de ADN plasmídicos directamente en el polímero biocompatible (Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5:753-759).

Para el rastreo y la detección de proteínas funcionales codificadas por estos genes, los vectores de ADN virales o plasmídicos contendrán un gen marcador fácilmente detectable, tal como la proteína verde fluorescente o la enzima beta-galactosidasa, los cuales pueden rastrearse por medios histoquímicos.

4. Tratamiento de fístulas perianales complejas

La invención se refiere al tratamiento de fístulas perianales complejas en pacientes con enfermedad de Crohn, usando células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas. Las células madre estromales derivadas de tejido adiposo normalmente comprenden una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo descrita en el presente documento, a veces denominada “Cx601”. Sin embargo, pueden usarse otras preparaciones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo en los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, tales como las descritas en las patentes estadounidenses n.os 6.777.231 y 6.555.374 y la solicitud de patente estadounidense n.° 2006-0073124 A1 “Identification and Isolation of Multipotent Cells From Non-Osteochondral Mesenchymal Tissue”, presentada el 25 de febrero de 2005.

Los ejemplos muestran que las eASC alogénicas son una terapia sorprendentemente eficaz para fístulas perianales complejas en pacientes con enfermedad de Crohn, donde una sola administración puede proporcionar un efecto terapéutico rápido y sostenido incluso en las fístulas muy complejas más difíciles de tratar que no han respondido a tratamientos previos. Por ejemplo, se observa el beneficio generalmente en aproximadamente 6 semanas, y dicho beneficio generalmente se mantiene hasta las 24 semanas desde la terapia.

En una realización, un método para tratar una fístula perianal resistente compleja en un paciente con enfermedad de Crohn comprende inyectar intralesionalmente 120 millones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas, en todos los trayectos de la fístula. Para evitar dudas, en esta realización se administran al paciente 120 millones de células en un solo procedimiento, recibiendo cada trayecto de la fístula al menos una proporción de esta dosis. Aproximadamente la mitad de la dosis se inyecta en el tejido que rodea la orificio u orificios internos. La otra mitad se inyecta en las paredes de la fístula (no más profundas de 2 mm) a lo largo del/de los trayecto(s) de la fístula, formando varias microampollas. Los datos de los ejemplos muestran que esta administración única puede proporcionar una remisión combinada en el plazo de 24 semanas o menos, incluso en el plazo de aproximadamente 6 semanas o en el plazo de aproximadamente 8 semanas. Por consiguiente, en una realización, el tratamiento consiste en esta única administración intralesional de 120 millones de eASC.

La inyección intralesional normalmente se lleva a cabo como en el ensayo clínico ejemplificado, donde la suspensión de células se inyecta a través del/ de los orificio(s) interno(s) (entrando la jeringa por el ano) y a través de las paredes del tracto de la fístula (entrando la jeringa por el orificio externo de la fístula).

El paciente puede ser hombre o mujer. El paciente es normalmente un adulto.

En una realización, en primer lugar se retira cualquier setón que pueda estar presente. Normalmente, la fístula se raspa antes de la administración de las eASC. Los orificios internos pueden suturarse opcionalmente. Luego, las eASC se administran con una aguja fina y larga. Tal como se indicó anteriormente, aproximadamente la mitad de la dosis se inyecta en el tejido que rodea el/los orificio(s) intemo(s) suturado(s). La otra mitad se inyecta en las paredes de la fístula (no más profundas de 2 mm) a lo largo del/de los trayecto(s) de la fístula, formando varias microampollas.

Antes de la terapia según la invención, puede realizarse una resonancia magnética pélvica durante la selección para guiar los procedimientos quirúrgicos. Los pacientes también pueden someterse a raspado de la fístula y colocación de setón según esté clínicamente indicado >2 semanas antes de la administración del producto en investigación (figura 1). Si se colocó un setón, se retira inmediatamente antes de la administración del producto en investigación.

El paciente que va a tratarse tiene la enfermedad de Crohn, normalmente la enfermedad de Crohn luminal. Normalmente, el paciente ha tenido enfermedad de Crohn luminal no activa o levemente activa, por ejemplo, según lo definido por un índice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI) de <220 A24. El paciente puede haber tenido la enfermedad de Crohn durante al menos 6 meses.

El paciente tiene al menos una fístula perianal compleja. En una realización, la paciente no tiene fístula rectovaginal, estenosis rectal, estenosis anal, proctitis grave activa (definida por la presencia de úlceras superficiales o profundas), estomas de derivación, o un absceso o acumulaciones > 2 cm que no fueron resueltos por el procedimiento de preparación quirúrgica.

Los pacientes son resistentes a al menos un tratamiento farmacológico previo. La terapia anterior puede ser un fármaco de molécula pequeña o un medicamento biológico. Normalmente, el paciente ha recibido dicho tratamiento durante al menos aproximadamente 4, 6, 12, 18, 24 ó 36 semanas y aún presenta síntomas de enfermedad activa. En otras palabras, incluso después de un tratamiento de al menos aproximadamente 4, 6, 12, 18, 24 ó 36 semanas, la gravedad de la fístula no mejora. La terapia previa puede ser terapia con antibióticos tales como ciprofloxacina o metronidazol, terapia con inmunosupresores (por ejemplo, un análogo de purina tal como azatioprina o 6-mercaptopurina, un análogo de pirimidina tal como fluorouracilo o un análogo de ácido fólico tal como metotraxato), o terapia con agentes anti-TNF tal como adalimumab (Humira), certolizumab (Cimzia), etanercept (Enbrel), golimumab (Simponi) o infliximab (Remicade). Los pacientes elegibles suelen ser resistentes (sin respuesta) a al menos uno de los siguientes tratamientos: después de 1 mes de antibióticos (por ejemplo, ciprofloxacina, metronidazol); y/o después de 3 meses de inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina, 6-mercaptopurina); y/o de inducción o mantenimiento de terapias con agentes anti-TNF (por ejemplo, infliximab, etanercept, adalimumab, certolizumab, golimumab) a una dosis estable.

En una realización, el paciente es resistente al tratamiento con un inmunosupresor (por ejemplo, azatioprina, 6-mercaptopurina) y un inhibidor de TNF-a (por ejemplo, infliximab o adalimumab).

Por tanto, un paciente típico tiene enfermedad de Crohn luminal no activa (CDAI <220) diagnosticada durante al menos seis meses, con una fístula perianal compleja que tiene 1 ó 2 orificios internos y 2 ó 3 orificios externos, que ha mostrado una respuesta inadecuada a uno o más de antibióticos, inmunosupresores o terapias con agentes anti-TNF. Una fístula con 1 ó 2 orificios internos y 3 orificios externos es muy compleja y hasta ahora ha sido muy difícil de tratar. En una realización adicional, en el momento del tratamiento según la invención, el paciente está recibiendo (a) ninguna terapia con agentes anti-TNF ni terapia con inmunosupresores, o (b) tanto una terapia con agentes anti-TNF como una terapia con inmunosupresores. Es especialmente sorprendente que las eASC puedan mejorar significativamente la remisión combinada (en la semana 24) en pacientes que reciben terapia con agentes anti-TNF y terapia con inmunosupresores, que son las mejores terapias disponibles actualmente (véase la figura 3C).

La fístula perianal compleja tiene al menos dos orificios externos, por ejemplo, 3 o más orificios externos. Algunas fístulas pueden tener 4 ó 5 orificios externos.

La fístula perianal compleja normalmente tiene múltiples trayectos, al menos dos orificios internos o tres orificios externos. La fístula puede comprender opcionalmente dos o tres de estas características, por ejemplo: múltiples trayectos y al menos dos orificios internos; múltiples trayectos y tres orificios externos; al menos dos orificios internos y tres orificios externos; o múltiples trayectos, al menos dos orificios internos y tres orificios externos. En una realización, la fístula perianal compleja contiene no más de dos orificios internos y tres orificios externos, por ejemplo, la fístula consiste en 1 ó 2 orificios internos y 2 ó 3 orificios externos (por ejemplo, 1IO (orificio interno)/2EO (orificio externo), 1IO/3EO, 2IO/2EO, o 2IO/3EO).

Tras la administración de eASC, los pacientes pueden tratarse opcionalmente con antibióticos durante no más de 4 semanas. Los inmunosupresores y los agentes anti-TNF pueden mantenerse en dosis estables durante todo el tratamiento, por ejemplo, hasta respuesta, remisión clínica o remisión combinada.

Se excluyen generalmente pacientes que no habían recibido tratamiento previo para la enfermedad de Crohn fistulizante perianal, incluyendo antibióticos, y aquellos que se sometieron a una cirugía previa para la fístula activa distinta del drenaje o la colocación de setones. Normalmente, los pacientes no son elegibles para el tratamiento si han recibido glucocorticosteroides en el plazo de las 4 semanas inmediatamente anteriores al tratamiento con eASC. Puede permitirse un curso de esteroides para tratar las reapariciones de enfermedad luminal durante el seguimiento con una dosis inicial de 40 mg vendada durante un máximo de 12 semanas. Cuando la primera entrega de células es insuficiente, el tratamiento puede comprender además una administración adicional de eASCS. Esta administración adicional puede comprender: (c) entregar una segunda dosis de al menos 20 x 106 células, al menos 30 x 106, o al menos 40 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, 120 millones de células, por ejemplo, en una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso según la invención, al orificio interno (suturado opcionalmente cerrado) y las paredes de la fístula.

Un método para tratar una fístula perianal compleja resistente en un sujeto comprende: (a) cerrar el orificio interno con una sutura que comprende eASC alogénicas. Dichas suturas recubiertas con células en las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo objeto se describen con detalle en la solicitud de patente estadounidense n.° 11/056.241, presentada el 14 de febrero de 2005.

Los métodos pueden comprender además: rapar de manera profunda al menos un trayecto de la fístula; y/o rellenar dicho trayecto de la fístula con un material. El método puede comprender además la entrega de al menos aproximadamente 10 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, de una composición celular en cuestión, al material. Normalmente, el material es un polímero o adhesivo a base de fibrina, tal como un pegamento o gel de fibrina. La dosis de al menos aproximadamente 10 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo ya pueden estar incluidas dentro del material, por ejemplo, de manera que el material comprenda la composición que contiene células madre derivadas de tejido adiposo.

Un método para tratar una fístula en un sujeto comprende:

(i) raspar de manera profunda al menos un trayecto de la fístula

(ii) cerrar el orificio interno del tracto raspado con una sutura

(iii) entregar 120 millones de células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas a un orificio interno (suturado opcionalmente cerrado) y las paredes de la fístula,

por ejemplo, en una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo para su uso según la invención.

No se requiere una administración adicional de células y puede excluirse opcionalmente. Sin embargo, el método puede comprender además:

(iv) entegar una segunda dosis de al menos 20 x 106 células, al menos 30 x 106, o al menos 40 x 106 células madre estromales derivadas de tejido adiposo, por ejemplo, 120 millones de eASC, normalmente a un orificio interno suturado cerrado,

La etapa (i) se lleva a cabo normalmente raspando profundamente todos los trayectos de la fístula que van a tratarse, por ejemplo, se introduce una aguja de raspado en el trayecto de la fístula y se produce un sangrado inducido raspando las paredes de la fístula para obtener fibrina natural que llenará el trayecto de la fístula. Estudios clínicos previos de los inventores sugieren que la fibrina natural producida por este método de raspado es una opción preferida en comparación con el uso de selladores de fibrina artificial, por lo que pueden no rellenarse los trayectos de la fístula que van a tratarse con dicho material.

La etapa (iv) se lleva a cabo mediante la entrega local de las células, por ejemplo, una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo, mediante inyección en las paredes de la fístula a lo largo del trayecto de la fístula. Por ejemplo, múltiples inyecciones de 10 millones de células a lo largo de 3 cm del trayecto de la fístula.

Puede accederse a la fístula para la reparación quirúrgica a través de cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, a través de una incisión, un catéter, etc.

Los métodos descritos anteriormente pueden comprender además la administración de un agente terapéutico al sujeto que está tratándose, por ejemplo, sistémica o localmente en el sitio de la sutura. En determinadas realizaciones, las células madre estromales derivadas de tejido adiposo se formulan en una composición que contiene células madre estromales derivadas de tejido adiposo que contiene un agente terapéutico, tal como se describió anteriormente. En otras realizaciones, el agente terapéutico se administra por separado, por ejemplo, simultáneamente con los métodos, antes de que se lleve a cabo el método, o después de que se lleve a cabo el método. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra al sujeto antes, durante y después de realizar los métodos en el sujeto. Los agentes terapéuticos a modo de ejemplo se describen anteriormente. En realizaciones preferidas, se administran al sujeto agentes terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn. Los agentes terapéuticos a modo de ejemplo para la enfermedad de Crohn son agentes antiinflamatorios tales como agentes que comprenden mesalamina, agentes inmunosupresores tales como 6-mercaptopurina y azatioprina; agentes biológicos tales como infliximab (Remicade®), antibióticos y agentes antidiarreicos tales como difenoxilato, loperamida y codeína.

Puede ser necesario un tratamiento de apoyo. Por ejemplo, los inmunosupresores pueden administrarse antes, durante y/o después del tratamiento para prevenir la EICH, según métodos conocidos en la técnica. Antes de la administración, las células también pueden modificarse para suprimir una reacción inmunitaria del sujeto a las células o viceversa, según métodos conocidos en la técnica.

La dosificación de cualquier agente terapéutico variará dependiendo de los síntomas, la edad y el peso corporal del paciente, la naturaleza y gravedad del trastorno que va a tratarse o prevenirse, la vía de administración y la forma del agente. Cualquiera de las formulaciones en cuestión puede administrarse en una sola dosis o en dosis divididas. Las dosis de los agentes terapéuticos pueden determinarse fácilmente mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica o tal como se enseña en el presente documento. Además, pueden administrarse mezclas de más de un agente terapéutico, o pueden administrarse múltiples agentes terapéuticos en composiciones separadas.

El tiempo preciso de administración y la cantidad de cualquier agente en particular que producirán el tratamiento más efectivo en un paciente dado dependerá de la actividad, farmacocinética y biodisponibilidad de un compuesto en particular, condición fisiológica del paciente (incluyendo edad, sexo, tipo de enfermedad y estadio, estado físico general, capacidad de respuesta a una dosificación dada y tipo de medicamento), vía de administración, y similares. Las pautas presentadas en el presente documento pueden usarse para optimizar el tratamiento, por ejemplo, determinar el momento y/o cantidad óptimos de administración, que requerirán no más de experimentación de rutina que consiste en monitorizar el sujeto y ajustar la dosificación y/o momento.

Mientras el sujeto está tratándose, la salud del paciente puede monitorizarse midiendo uno o más de los índices relevantes en momentos predeterminados durante un periodo de 24 horas. El tratamiento, incluyendo el complemento, las cantidades, los tiempos de administración y la formulación, puede optimizarse según los resultados de dicha monitorización. El paciente puede reevaluarse periódicamente para determinar el grado de mejoría midiendo los mismos parámetros, la primera reevaluación de este tipo se produce normalmente al final de las cuatro semanas desde el inicio de la terapia, y las posteriores reevaluaciones se producen cada de cuatro a ocho semanas durante la terapia y luego cada tres meses después. La terapia puede continuar durante varios meses o incluso años, siendo un mínimo de un mes la duración típica de la terapia para seres humanos. Pueden hacerse ajustes a la(s) cantidad(es) de agente administrado y posiblemente al tiempo de administración basándose en estas reevaluaciones.

La remisión combinada de la fístula ejemplificada en el presente documento comprende remisión tanto clínica como radiológica. La evaluación radiológica de la remisión se realiza normalmente mediante IRM, que es una técnica bien conocida. Como alternativa, pueden usarse otras técnicas de obtención de imágenes, por ejemplo, ultrasonografía endorrectal. Estas técnicas de obtención de imágenes valoran la existencia de abscesos o acumulaciones.

El tratamiento puede iniciarse con dosificaciones más pequeñas que son menores que la dosis óptima del compuesto. Posteriormente, la dosificación puede aumentarse en pequeños incrementos hasta lograr el efecto terapéutico óptimo.

El uso combinado de varios agentes terapéuticos puede reducir la dosis requerida para cualquier componente individual porque el inicio y la duración del efecto de los diferentes componentes pueden ser complementarios. En tal terapia combinada, los diferentes agentes activos pueden administrarse juntos o por separado, y simultáneamente o en diferentes momentos del día.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos en cuestión pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL⁵⁰y la DE⁵⁰. Se prefieren las composiciones que presentan grandes índices terapéuticos. Aunque pueden usarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de entrega que dirija los agentes al sitio deseado para reducir los efectos secundarios.

Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y los estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de cualquier agente terapéutico o, alternativamente, de cualquier componente en el mismo, se encuentra normalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante en plasma que incluya la CI⁵⁰(es decir, la concentración del compuesto de prueba que consigue una inhibición semimáxima de los síntomas) tal como se determina en cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.

5. Respuesta y remisión clínicas

Las eASC alogénicas para su uso según la invención son sorprendentemente eficaces en el tratamiento de fístulas perianales complejas resistentes en pacientes con enfermedad de Crohn. El criterio de valoración principal, la remisión combinada en la semana 24, se cumple estadísticamente; Cx601 es estadísticamente superior al placebo. Ambos criterios de valoración secundarios clave, la remisión y respuesta clínicas en la semana 24, alcanzan una significación estadística marginal (p=0,064 y p=0,054 en la población ITT; p=0,057 y 0,045 en la población mITT, respectivamente).

Los datos indican que los pacientes que reciben una sola administración de eASC tienen un 30% más de posibilidades de lograr la remisión clínica que el placebo. Los datos también indican que los pacientes que reciben eASC tienen aproximadamente un 35% más de posibilidades de lograr una respuesta clínica que el placebo.

En determinadas realizaciones, la remisión clínica se logra en el plazo de 24 semanas, normalmente en el plazo de 18 semanas. La remisión clínica puede lograrse en el plazo de 12 semanas o menos, por ejemplo, en el plazo de 10 semanas o en el plazo de 8 semanas. La remisión clínica puede lograrse opcionalmente después de 6 semanas. Los datos muestran que la mediana del tiempo hasta la remisión clínica es aproximadamente 2 veces más corta con Cx601 que con el placebo (6,7 semanas frente a 14,6 semanas). Por consiguiente, en una realización, la remisión clínica se logra en el plazo 14 semanas.

La remisión combinada se logra en el plazo de 24 semanas, generalmente en el plazo de 18 semanas. La remisión combinada puede lograrse opcionalmente en el plazo de 12 semanas, o menos, por ejemplo, en el plazo de 10 semanas o en el plazo de 8 semanas. La remisión combinada puede lograrse opcionalmente después de 6 semanas.

La respuesta clínica se logra en el plazo de 11 semanas o menos. Los datos muestran que la mediana del tiempo hasta la respuesta clínica también es aproximadamente 2 veces más corta que con el placebo (6,3 semanas frente a 11,7 semanas). En determinadas realizaciones, el tiempo hasta la respuesta clínica puede ser de 10 semanas o menos, 9 semanas o menos, 8 semanas o menos. El tiempo hasta la respuesta clínica puede ser opcionalmente de 7 semanas o menos, por ejemplo, aproximadamente 6 semanas.

Estos resultados son particularmente sorprendentes cuando se observa que estas mejoras se observan después de una sola administración de las eASC.

El índice de actividad de la enfermedad perianal “PDAI” comprende cinco categorías: secreción, dolor, restricción de la actividad sexual, tipo de enfermedad perianal y grado de induración. Cada categoría se califica en una escala de cinco puntos, que van desde ausencia de síntomas (puntuación 0) hasta síntomas graves (puntuación 4). Se observa que una mejora en la puntuación del índice de actividad de la enfermedad perianal es significativamente mayor para las eASC que para el placebo en las semanas 6, 12 y 18. Por tanto, en determinadas realizaciones, se logra una mejora en el PDAI en el plazo de 6 semanas, en el plazo de 12 semanas o en el plazo de 18 semanas. La mejora en PDAI puede ser opcionalmente una mejora superior a 1,5 puntos PDAI, opcionalmente al menos dos puntos PDAI. La mejora en PDAI puede ser opcionalmente una disminución (mejora) en cada uno de los cinco componentes del índice.

6. Kits

En otras realizaciones, la divulgación contempla kits que incluyen las composiciones que contienen células madre estromales derivadas de tejido adiposo y, opcionalmente, instrucciones para su uso. Los kits que comprenden las composiciones farmacéuticas y los biomateriales de la presente divulgación también están dentro del alcance de la divulgación. Los componentes del kit pueden empaquetarse para la práctica manual o parcial o totalmente automatizada de los métodos anteriores. Tales kits pueden tener una variedad de usos que incluyen, por ejemplo, terapia, reparación, preparación de biomateriales y otras aplicaciones.

Ejemplos

La invención que se describe hasta ahora de manera general se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos que se incluyen simplemente con fines ilustrativos de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención y no se pretende que limiten la invención.

ENSAYO CLÍNICO DE FASE III

El estudio actual es el primer estudio de fase 3 controlado con placebo que evalúa la eficacia y seguridad de Cx601 sola o añadida a la terapia médica actual para las fístulas perianales complejas resistentes al tratamiento en pacientes con enfermedad de Crohn.

En general, los resultados demuestran que las eASC alogénicas están indicadas para el tratamiento de fístula(s) perianal(es) compleja(s) en pacientes adultos con enfermedad de Crohn luminal inactiva/levemente activa, cuando la(s) fístula(s) ha(n) mostrado una respuesta inadecuada a al menos una terapia convencional o biológica.

Métodos

Supervisión del estudio

Este estudio de fase 3, aleatorizado, de doble ciego, de grupos paralelos, controlado con placebo (NCT01541579; EUDRACT 2011-006064-43) se llevó a cabo en 49 centros médicos en 7 países europeos e Israel desde julio de 2012 hasta julio de 2015. El protocolo fue aprobado por un comité de ética central o local. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito.

El estudio fue diseñado e implementado por el Comité Directivo de ADMIRE (véase el anexo complementario). El patrocinador recopiló los datos, que fueron analizados por el Departamento de Bioestadística de Chiltern International, y el patrocinador junto con el Comité Directivo interpretaron los datos. Todos los autores tuvieron pleno acceso a los datos, estuvieron de acuerdo con la decisión de presentar el manuscrito final para su publicación y garantizaron la exactitud e integridad de los datos informados. El manuscrito fue redactado por el primer autor y todos los autores contribuyeron a los borradores posteriores.

Pacientes

Los pacientes elegibles eran adultos de 18 años o más, con enfermedad de Crohn luminal inactiva o levemente activa durante >6 meses, definida por un índice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI) de <220 A24, y con fístulas perianales complejas (definidas como una o más de las siguientes: origen interesfinteriano, transesfinteriano, extraesfinteriano o supraesfinteriano alto; >2 orificios externos; o acumulaciones asociadas) con un máximo de 2 orificios internos y 3 externos, que habían estado drenando durante >6 semanas antes de la inclusión. Se excluyó a los pacientes si presentaban fístulas rectovaginales, estenosis rectal y/o anal y/o proctitis grave activa (definida por la presencia de úlceras superficiales o profundas), estomas de derivación, o absceso o acumulaciones > 2 cm que no se resolvieran con el procedimiento de preparación quirúrgica. Los pacientes elegibles debían ser resistentes a al menos uno de los siguientes tratamientos documentados como sin respuesta después de 1 mes de antibióticos (ciprofloxacina, metronidazol) y/o después de 3 meses de inmunosupresores (azatioprina, 6-mercaptopurina) y/o de inducción o mantenimiento de terapias con agentes anti-TNF a una dosis estable. Los pacientes resistentes solo a los antibióticos debían representar <25% de la población total.

Tras la administración del producto en investigación, los pacientes podían tratarse con antibióticos durante no más de 4 semanas. Los inmunosupresores y los agentes anti-TNF se mantuvieron en dosis estables durante todo el estudio. No se permitió el inicio o el aumento de la dosis de estos agentes.

También se excluyeron los pacientes que no habían recibido tratamiento previo para la enfermedad de Crohn fistulizante perianal, incluyendo antibióticos, y aquellos que se sometieron a una cirugía previa para la fístula activa que no fuera drenaje o colocación de setón. Los pacientes no eran elegibles si habían recibido glucocorticosteroides en el plazo de las 4 semanas anteriores. Se permitió un curso de esteroides para tratar las reapariciones de enfermedad luminal durante el seguimiento con una dosis inicial de 40 mg vendada durante un máximo de 12 semanas.

Aleatorización y tratamiento

Se realizó una resonancia magnética pélvica en la selección para guiar los procedimientos quirúrgicos y las acumulaciones evaluadas con lectura de enmascaramiento central. Además, los pacientes se sometieron a un examen bajo anestesia, raspado de la fístula y colocación de setón según indicación clínica >2 semanas antes de la administración del producto en investigación (figura 1). Si se colocaba un setón, debía retirarse inmediatamente antes de la administración del producto en investigación.

Los pacientes se asignaron al azar en una razón de 1:1 a Cx601 o placebo después de la visita de preparación de la fístula >2 semanas antes de la administración del producto en investigación (figura 1). Los pacientes se estratificaron en función de la medicación concomitante en el momento de la aleatorización (agentes anti-TNF y/o inmunosupresores o ninguno). Los tratamientos se asignaron usando una lista de aleatorización preestablecida generada por el Departamento de Bioestadística, Linical.

Los pacientes en el grupo de Cx601 recibieron una sola inyección de 120 millones de Cx601 distribuidas intralesionalmente en los trayectos de la fístula. El aislamiento y la expansión de Cx601 se realizaron tal como se describió anteriormente. A23 Los pacientes del grupo de placebo recibieron un volumen idéntico de solución salina. Los tratamientos del estudio se administraron con una aguja larga y fina después de retirar el/los setón/setones, si lo(s) había(n), y raspar la fístula. La mitad de la dosis se inyectó en el tejido que rodeaba el/los orificio(s) interno(s) suturado(s). La otra mitad se inyectó en las paredes de la fístula (no más profundas de 2 mm) a lo largo del/de los trayecto(s) de la fístula, formando varias microampollas.

No fue posible el enmascaramiento de los tratamientos ya que la suspensión celular era claramente diferente a la solución salina. El diseño del estudio doble ciego se mantuvo mediante la administración del tratamiento por parte de un cirujano que conocía el tratamiento y un gastroenterólogo y radiólogo que conocían el tratamiento y que evaluaron la respuesta.

Procedimientos y seguimiento del estudio

El cierre de la fístula se evaluó clínicamente en las semanas 6, 12, 18 y 24 por el investigador que examinó la presencia de drenaje espontáneo y después de una suave compresión con los dedos en los orificios externos tratados, A12 y se evaluó radiológicamente mediante una resonancia magnética pélvica enmascarada con lectura central en la semana 24; a los lectores centrales se les proporcionaron cifras para identificar las fístulas tratadas, pero no conocían los datos de los pacientes, el orden de los exámenes y el tratamiento recibido. Los acontecimientos adversos emergentes del tratamiento (AAET) se evaluaron en todas las visitas del estudio. La gravedad de la enfermedad de Crohn perianal se evaluó al inicio del estudio y en todas las visitas del estudio con el índice de actividad de la enfermedad perianal (PDAI). A25 La calidad de vida se evaluó con el cuestionario de enfermedad inflamatoria intestinal (IBDQ) A26 al inicio del estudio y en la semana 24 al igual que CDAI. A24 Criterios de valoración de eficacia y seguridad

El criterio de valoración principal fue la remisión combinada en la semana 24 definida como la evaluación clínica del cierre de todos los orificios externos tratados que estaban drenando al inicio del estudio y la ausencia de acumulaciones >2 cm de las fístulas perianales tratadas en >2 de 3 dimensiones, confirmada por lectura central de IRM enmascarada (Bioclinica GmbH, Múnich, Alemania). La evaluación clínica del cierre se definió como la ausencia de drenaje a pesar de la compresión suave con los dedos. A12

Hubo dos criterios de valoración de eficacia secundarios clave: remisión clínica (es decir, cierre de todos los orificios externos tratados que drenaban al inicio del estudio a pesar de la compresión suave con los dedos) y respuesta (es decir, cierre de >50% de todos los orificios externos tratados que drenaban al inicio del estudio) en la semana 24. Otros criterios de valoración de eficacia secundarios incluyeron el tiempo hasta la remisión clínica, el tiempo hasta la respuesta, las puntuaciones PDAI, CDAI e IBDQ hasta la semana 24.

Los AAET se codificaron según el Medical Dictionary for Regulatory Activities versión 17.0.

Análisis estadístico

El tamaño de muestra planificado para el cribado fue de 278 pacientes con el fin de aleatorizar >208 pacientes (104 para cada grupo). El tamaño de la muestra fue suficiente para detectar una diferencia mínima del 25% en el porcentaje de pacientes con remisión combinada entre Cx601 y placebo (las tasas mínimas de remisión combinada anticipadas fueron del 50% para Cx601 y del 25% para placebo A8, A12, A23, A27) con un error alfa de 0,025 y una potencia del 80%, y permitió que el 20% de los pacientes abandonaran el estudio.

Los análisis de eficacia se realizaron en la población con intención de tratar (ITT) que incluía a todos los pacientes aleatorizados, la población ITT modificada (mITT) que incluía a todos los pacientes aleatorizados que recibieron el tratamiento del estudio y tenían >1 evaluación de eficacia posterior al inicio del estudio, y la población por protocolo (PP) que incluía a todos los pacientes tratados sin desviaciones importantes del protocolo. Los AAET se analizaron en la población de seguridad definida como todos los pacientes que recibieron el tratamiento del estudio.

El criterio de valoración principal se analizó mediante una prueba estratificada de Cochran-Mantel-Haenszel, ajustando los estratos de aleatorización (es decir, los tratamientos de la enfermedad de Crohn en la aleatorización). El análisis principal se realizó usando la población ITT. También se proporcionan resultados para la población mITT ya que su definición se parece más a la población ITT en otros ensayos clínicos aleatorizados y proporciona una estimación más fiable de los efectos del tratamiento. Los datos faltantes se imputaron usando el método de la última observación realizada (LOCF). Se imputó una falta de respuesta/falta de remisión si no se realizó una evaluación clínica o una resonancia magnética tras el nivel inicial en la semana 24. También se imputó una falta de respuesta/falta de remisión si se produjo un acontecimiento de rescate antes de la semana 24. Los efectos de los acontecimientos de rescate y las convenciones de datos faltantes sobre la eficacia se exploraron en los análisis de sensibilidad del criterio de valoración principal.

Para abordar el problema de la multiplicidad, los dos criterios de valoración secundarios clave (remisión clínica y respuesta en la semana 24) se agruparon en una familia a corto plazo, con un método de control mediante el procedimiento de prueba de Hochberg A28 para controlar el error de tipo I general, actuando el criterio de valoración de eficacia principal como control. La significación estadística se evaluó con un nivel de error de tipo I bilateral de 0,05. No se realizó ningún ajuste estadístico por multiplicidad para los criterios de valoración secundarios no clave. Los porcentajes y las diferencias entre tratamientos se expresaron con intervalos de confianza (IC) del 95% calculados con el método asintótico de Wald. El tiempo hasta la remisión clínica y la respuesta se analizaron con estimaciones de Kaplan-Meier. Los resultados de seguridad se presentaron con estadísticas descriptivas.

Para los análisis estadísticos se utilizó SAS System versión 9.1.3 o versión posterior (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).

Resultados

Se cribaron un total de 289 pacientes, y de estos, 212 se aleatorizaron a Cx601 o placebo (figura 2). Las características de nivel inicial de los 2 grupos fueron similares (tabla 1). La mayoría de los pacientes habían recibido >1 tratamiento para la enfermedad de Crohn en los últimos 6 meses. Una mayor proporción de pacientes en el grupo de Cx601 tenía fístulas de múltiples trayectos en comparación con el grupo de placebo (46,6% y 30,4%, respectivamente). Un total de 171 pacientes (80,7%) completaron el seguimiento de 24 semanas. Durante el estudio, 1 paciente en el grupo de Cx601 y 4 pacientes en el grupo de placebo recibieron esteroides debido a la reaparición de la enfermedad de Crohn.

Eficacia

Una proporción significativamente mayor de pacientes tratados con Cx601 alcanzó el criterio de valoración principal de remisión combinada en la semana 24 frente a placebo en la ITT (49,5% y 34,3%, respectivamente; diferencia [IC 97,5%]: 15,2% [0,2-30,3]; p= 0,024]) y las poblaciones mITT (51,5% y 35,6%; 15,8% [0,5-31,2]; p=0,021; figuras 3A y B). Estos resultados se confirmaron en las poblaciones PP y en análisis de sensibilidad adicionales (tabla S1). El efecto de Cx601 fue mayor que el del placebo en los 4 estratos de aleatorización, y el mayor efecto numérico de Cx601 se observó en pacientes que recibieron tanto la terapia con agentes anti-TNF como la terapia con inmunosupresores o ninguna de las mismas en la aleatorización (diferencia de tratamiento de 33,1% y 20,0%, respectivamente; figura 3C).

En la población mITT, una proporción numéricamente mayor de pacientes en el grupo de Cx601 frente a grupo de placebo logró la remisión clínica (55,3% y 42,6%, respectivamente; diferencia [IC del 95%]: 12,8% [-0,8-26,4]; p=0,057) y tuvo respuesta (68,9% y 55,4%, respectivamente; 13,5% [0,3-26,7] p=0,045) en la semana 24.

La mediana del tiempo hasta la remisión clínica fue aproximadamente 2 veces más corta con Cx601 que con el placebo (6,7 [IC del 95%, 6,4-11,9] semanas y 14,6 [11,9-22,9] semanas), al igual que la mediana del tiempo hasta la respuesta (6,3 [6,0-6,6] semanas y 11,7 [6,7-12,9] semanas).

La mejora en PDAI con Cx601 en la población mITT fue significativamente mayor que con placebo en la semana 6 (cambio de la diferencia de tratamiento inicial [IC del 95%]: -1,0 [-1,7 a -0,3]), la semana 12 (-1,2 [-2,0 a -0,4]) y la semana 18 (-1,2 [-2,0 a -0,3]), pero no en la semana 24 (-0,8 [-1,8 a 0,2]). Para las puntuaciones totales y de subdominio IBDQ y CDAI, no hubo diferencias significativas entre los grupos de tratamiento (tabla S2).

Seguridad

El porcentaje de pacientes en los grupos de Cx601 y de placebo que experimentaron AAET fue similar (66,0% y 64,7%, respectivamente; tabla 2). Los AAET informados con mayor frecuencia fueron proctalgia, absceso anal y nasofaringitis. Una mayor proporción de pacientes en el grupo de placebo frente a Cx601 experimentó AAET relacionados con el tratamiento (29,4% y 17,5%, respectivamente), de los cuales los más comunes fueron absceso anal y proctalgia. La mayoría de los AAET fueron de intensidad leve o moderada. Pocos pacientes se retiraron del estudio debido a los AAET (4,9% y 5,9%), mientras que una proporción ligeramente mayor de pacientes en el grupo de Cx601 experimentó AAET graves (17,5% y 13,7%). El AAET grave más frecuente fue el absceso anal (Cx601: 8,7%; placebo: 6,9%). No hubo muertes.

Descripción y visión general

Este es el primer estudio clínico a gran escala, aleatorizado y controlado con placebo del tratamiento de fístulas perianales resistentes a terapias complejas en pacientes con enfermedad de Crohn. En la población de estudio difícil de tratar de pacientes que tenían fístulas perianales complejas con la terapia convencional o biológica sin éxito, 1 de cada 2 pacientes tratados con Cx601 sola o añadida a la terapia médica actual logró una remisión clínica y radiológica combinada en la semana 24. Este resultado fue coherente en todas las poblaciones estadísticas, a pesar de que los pacientes del grupo de Cx601 tenían más fístulas de múltiples trayectos. Por tanto, los resultados del estudio muestran que Cx601 ofrece a los pacientes resistentes al tratamiento una primera alternativa de cierre real para las fístulas perianales complejas con respecto a las aproximaciones quirúrgicas radicales.

El criterio de valoración principal de la remisión clínica y radiológica combinada es más estricto que el usado en otros estudios clínicos aleatorizados de tratamientos para las fístulas perianales en la enfermedad de Crohn, que normalmente evaluaron las respuestas clínicas (es decir, >50% de reducción en el número de fístulas drenantes) o remisión clínica. A8, A12 Este es el primer ensayo clínico aleatorizado a gran escala que utiliza la evaluación clínica del cierre de la fístula y la evaluación por resonancia magnética de la ausencia de abscesos, tal como se recomienda en las pautas de la Organización Europea de la enfermedad de Crohn y la colitis. A29

Los análisis de eficacia secundarios refuerzan el beneficio clínico de Cx601. Con Cx601, el tiempo hasta la remisión clínica y la respuesta fue rápido, produciéndose en la mitad del tiempo que en el grupo de placebo. La diferencia en las tasas de remisión clínica entre los grupos de Cx601 y de placebo no alcanzó significación estadística debido a un efecto “placebo” considerablemente mayor (42,6%) de lo esperado y observado en estudios previos (13-19%). A8, A12, A27 Los efectos placebo según los estratos de aleatorización (es decir, el más alto con el uso concomitante de agentes anti-TNF e inmunosupresores [46,7%] y el más bajo sin ningún tratamiento [21,1%]) sugiere que el efecto placebo más alto en este estudio puede haberse impulsado por el uso concomitante de medicamentos. El drenaje quirúrgico y el cierre del orificio interno también pueden haber aumentado la respuesta al placebo. Mientras que se observaron mejoras beneficiosas en las puntuaciones de PDAI en el grupo de Cx601, no hubo diferencias en las puntuaciones de IBDQ y CDAI entre los grupos de tratamiento. Esto probablemente se debió al CDAI bajo (un criterio de inclusión) y al IBDQ alto de iniciar el estudio.

Los datos de seguridad muestran que Cx601 fue bien tolerado en la población del estudio según los resultados del estudio anterior de fase 1/2a. A23 Los AAET relacionados con el tratamiento se produjeron con mayor frecuencia en el grupo de placebo y, por tanto, pueden estar relacionados con el curso natural de la enfermedad o los procedimientos quirúrgicos del estudio. El perfil de seguridad favorable puede representar una ventaja sobre las terapias con agentes anti-TNF que están asociadas con varios problemas de seguridad graves que resultan de la inmunogenicidad del fármaco y un mayor riesgo de infecciones, incluyendo tuberculosis. A30, A31

Los resultados de este estudio son alentadores, considerando la necesidad de nuevas opciones de tratamiento efectivas y bien toleradas para pacientes con enfermedad de Crohn y fístulas perianales complejas. Este estudio también tiene implicaciones importantes para el cuidado de los pacientes con enfermedad de Crohn con fístulas perianales complejas resistentes al tratamiento, ya que muchos de ellos deben someterse a cirugía repetida con el riesgo de dañar los músculos del esfínter, lo que resulta en incontinencia fecal. Como resultado, el 12-38% de los pacientes con enfermedad fistulizante perianal requieren proctectomía. A32 Por el contrario, la administración de Cx601 es mínimamente invasiva y puede realizarse de manera ambulatoria.

Las limitaciones de este ensayo fueron la exclusión de pacientes con más de 2 orificios internos y 3 externos, así como aquellos con cirugía previa distinta del drenaje y la colocación de setones. Además, no se estableció si los AAET estaban relacionados con el procedimiento quirúrgico.

En conclusión, Cx601 es una terapia eficaz y segura para las fístulas perianales complejas en la enfermedad de Crohn que no respondieron a los tratamientos convencionales y/o biológicos.

Tabla 1. Características de los pacientes (población de seguridad).

Variable Cx601 Placebo (N=103) (N=102) Edad - años 38,9 (13,1) 37,6 (13,2) Masculino sexo - n.° (%) 57 (55,3) 54 (52,9) Etnia - n.° (%)

Caucásico 96 (93,2) 93 (91,2) Negro 4 (3,9) 1 (1,0) Otro 0 1 (1,0) Faltante 3 (2,9) 7 (6,9) Peso-kg 73,3 (14,4) 71,4 (15,0) EC duración - años 11,8 (9,8) 11,4 (9,0) Previo Medicación para la EC en los últimos 6 meses - n.° (%)

Antibióticos 78 (75,7) 72 (70,6) Inmunosupresores 87 (84,5) 74 (72,5) Agentes anti-TNF 80 (77,7) 82 (80,4) Uso concomitante de medicamentos para la EC (factor de estratificación) - ■ n.°

(%)

Agentes anti-TNF 36 (35,0) 32 (31,4) Inmunosupresores 16 (15,5) 21 (20,6) Agentes anti-TNF inmunosupresores 27 (26,2) 30 (29,4) Ninguna 24 (23,3) 19 (18,6) Índice de actividad de la enfermedad de Crohn perianab 6,7 (2,5) 6,5 (2,9) Orificios de fístula - n.° (%)

0 interno 1 externo 0 1 (1,0) 1 interno 1 externo 55 (53,4) 70 (68,6) 1 interno 2 externos 23 (22,3) 17 (16,7) 1 interno 3 externos 4 (3,9) 3 (2,9) 2 internos 1 externo 3 (2,9) 2 (2,0) 2 internos 2 externos 14 (13,6) 8 (7,8) 2 internos 3 externos 4 (3,9) 1 (1,0) Índice de actividad de la enfermedad de Crohnf 87,8 (48,3) 92,5 (55,3) Cuestionario de enfermedad inflamatoria intestinal^ 173,5 (31,6) 169,8 (36,2) Proteína C reactiva - mg/l 7,9 (11,5) 6,3 (9,5) Hemoglobina - mmol/l 8,3 (0,8) 8,3 (0,8)

EC, enfermedad de Crohn; Cx601, células madre derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas; TNF, factor de necrosis tumoral.

Los datos son medias (desviación estándar) a menos que se indique lo contrario.

•Las puntuaciones del índice de actividad de la enfermedad de Crohn perianal pueden oscilar entre 0 y 20; las puntuaciones más altas indican una enfermedad más grave.

fLas puntuaciones del índice de actividad de la enfermedad de Crohn pueden oscilar entre 0 y 600; las puntuaciones más altas indican una enfermedad más grave.

fLas puntuaciones del cuestionario de enfermedad inflamatoria intestinal pueden oscilar entre 32 y 224; las puntuaciones más altas indican una mejor calidad de vida.

Tabla 2. Acontecimientos adversos emergentes del tratamiento hasta la semana 24 (población de seguridad).

AAET - n.° (%) Cx601 (N=103) Placebo (N=102) En general 68 (66,0) 66 (64,7) AAET que conducen a la retirada del estudio 5 (4,9) 6 (5,9) AAET graves 18 (17,5) 14 (13,7) AAET en >5,0% de los pacientes^

Proctalgia 13 (12,6) 11 (10,8) Absceso anal 12 (11,7) 13 (12,7) Nasofaringitis 10 (9,7) 5 (4,9) Diarrea 7 (6,8) 3 (2,9) Dolor abdominal 4 (3,9) 6 (5,9)

Fístula 3 (2,9) 6 (5,9) AAET relacionados con el tratamiento 18 (17,5) 30 (29,4) AAET relacionados con el tratamiento en >2,0% de los

pacientes*

Absceso anal 6 (5,8) 9 (8,8) Proctalgia 5 (4,9) 9 (8,8) Dolor procedimental 1 (1,0) 2 (2,0) Secreción de fístula 1 (1,0) 2 (2,0) Induración 0 2 (2,0) AAET, acontecimiento adverso emergente del tratamiento; Cx601, células madre derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas; *En cualquier grupo de tratamiento.

Tabla S1. Análisis de apoyo y de sensibilidad para el criterio de valoración principal: remisión combinada.*

Tipo de Conjunto Detalles del manejo de datos faltantes Cx601 Placebo Diferencia valor análisis de análisis (%) (%) (%) (IC del de p 97,5%) Apoyo ITT Se imputa la falta de respuesta/falta de 48,6 32,4 16,2 (1,3 0,014 remisión para todos los datos faltantes y 31,1) después de la terapia de rescate (sin LOCF)

Apoyo PP1f Se imputa la falta de respuesta/falta de 57,0 36,9 20,1 (3,3 0,010 remisión con LOCF aplicada después de la 36,9) terapia de rescate

Apoyo PP2f Se imputa La falta de respuesta/falta de 63,2 39,7 23,4 (5,6 0,005 remisión después de la terapia de rescate 41,3) Sensibilidad ITT Faltante = la falta de respuesta/la falta de 49,5 34,3 15,2 (0,2 0,024 remisión después de aplicar LOCF. La 30,3) medicación de rescate no se considera un

fracaso

Sensibilidad ITT Faltante = la falta de respuesta/falta de 49,5 34,3 N/A 0,017 remisión después de aplicar LOCF. Análisis

logístico que incluye el factor de

estratificación y el número de orificios

externos de referencia como factores

IC: intervalo de confianza; Cx601, células madre derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas; ITT: intención de tratar; LOCF, última observación realizada; NA, no aplicable; PP, por protocolo; TNF, factor de necrosis tumoral.

La terapia de rescate se define como corticoides a 40 mg de equivalente de prednisona durante >12 semanas; agente anti-TNF nuevo en comparación con la terapia de nivel inicial durante >8 semanas; nuevo inmunosupresor en comparación con la terapia de nivel inicial durante >12 semanas; o intervención quirúrgica para la fístula tratada.

*Evaluación clínica del cierre de todos los orificios externos tratados que estaban drenando al inicio del estudio, y la ausencia de acumulaciones >2 cm de las fístulas perianales tratadas en >2 de 3 dimensiones en la evaluación de resonancia magnética enmascarada centralmente en la semana 24. La evaluación clínica del cierre se definió como ausencia de drenaje a pesar de la compresión suave con los dedos.

fLa población PP1 incluye aquellos sin desviaciones importantes del protocolo (Cx601, n=86; placebo, n=84).

fLa población PP2 incluye pacientes PP1 que completaron la visita de la semana 24 (Cx601, n=76; placebo, n=73).

Tabla S2. Resultados informados por los pacientes del índice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI)* y puntuaciones del cuestionario de enfermedad inflamatoria intestinal (IBDQ)f hasta la semana 24 (población mITT).

CDAI Cx601 (N=103) Placebo (N=101) Diferencia de tratamiento (IC del 95%)

Total

Nivel inicial 87,8 (48,3) 93,3 (55,0)

Semana 24 92,5 (66,5) 94,1 (76,1)

Cambio con respecto al nivel inicial 5,7 (62,2) 2,2 (65,5) 1,8 (-16,0 a 19,7) N.° de heces líquidas

Nivel inicial 9,8 (12,3) 9,3 (9,4)

Semana 24 9,5 (12,6) 10,0 (12,6)

Cambio con respecto al nivel inicial -0,0 (9,5) 0,9 (10,7) -0,7 (-3,4 a 2,1) Dolor abdominal

Nivel inicial 1,6 (2,9) 2,0 (3,1)

Semana 24 2,7 (4,5) 3,0 (4,1)

Cambio con respecto al nivel inicial 1,1 (4,4) 0,9 (4,0) -0,1 (-1, 2 a 1,1) Bienestar general

Nivel inicial 2,7 (3,7) 3,2 (4,1)

Semana 24 3,1 (4,6) 3,3 (4,7)

Cambio con respecto al nivel inicial 0,6 (4,5) 0,3 (4,5) 0,1 (-1,1 a 1,3) IBDQ Cx601 (N=103) Placebo (N=101) Diferencia de tratamiento (IC del 95%)

Total

Nivel inicial 173,5 (31,6) 169,4 (36,1)

Semana 24 178,3 (34,6) 174,7 (36,2)

Cambio con respecto al nivel inicial 3,8 (25,5) 4,0 (25,6) 0,3 (-6,6 a 7,3) Función intestinal

Nivel inicial 57,1 (9,2) 56,6 (9,9)

Semana 24 57,2 (10,2) 56,4 (9,8)

Cambio con respecto al nivel inicial 0,0 (7,6) -0,6 (8,2) 0,5 (-1,6 a 2,7) Estado emocional

Nivel inicial 62,9 (14,5) 61,4 (15,2)

Semana 24 64,7 (15,6) 63,9 (15,3)

Cambio con respecto al nivel inicial 1,7(11,3) 2,1 (11,2) -0,3 (-3,3 a 2,7) Síntomas sistémicos

Nivel inicial 25,8 (5,2) 24,9 (6,5)

Semana 24 26,2(5,9) 25,6 (6,3)

Cambio con respecto al nivel inicial 0,3 (4,7) 0,6 (5,1) -0,1 (-1, 4 a 1,2) Función social

Nivel inicial 27,7 (6,9) 26,5 (8,4)

Semana 24 29,5 (7,3) 28,4 (8,0)

Cambio con respecto al nivel inicial 1,6 (6,4) 1,7 (6,0) 0,3 (-1,3 a 2,0) IC: intervalo de confianza; Cx601, células madre derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas; mITT, intención de tratar modificada.

Los datos son medias (desviación estándar).

*Las puntuaciones del índice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI) pueden oscilar entre 0 y 600; las puntuaciones más altas indican una enfermedad más grave.

fLas puntuaciones del cuestionario de enfermedad inflamatoria intestinal (IBDQ) pueden oscilar entre 32 y 224; las puntuaciones más altas indican una mejor calidad de vida.

Bibliografía

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente estadounidense n.°: 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

1. American Gastroenterological Association Medical Position Statement: Perianal Crohn's Disease. Gastroenterology (2003) 125:1503-1507.

2. Levy C, Tremaine WJ. Inflamm Bowel Dis (2002) 8(2): 106-11.

3. Pennincke F, D'Hoore A, Filez L. Acta Gastroenterol Belg (2001) 64(2):223-226.

4. Rius J, Nessim A, Nogueras JJ, Wexner SD. Eur J Surg (2000) 166(3):218-222.

5. Mizuno H, Zuk PA, Zhu M, Lorenz HP, Benhaim P, Hedrick MH. Plastic Reconstr Surg (2002) 109(1): 199-209.

6. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Tissue Eng (2001) 7(2): 211-228.

7. Garcia-Olmo D, Garcia-Arranz M, Gomez-Garcia L et al. Int J Colorectal Dis (2003) 18: 451-454.

8. Abkowitz JL. New Engl J Med (2002) 346(10): 770-772.

9. Matsubara H. Lancet (2004) 363:746-747.

10. Cowan CM, Shi YY, Aalami 00, et al. Nat Biotechnol. (2004) 22(5):560-7

11. Garcia-Olmo D, Garcia-Olmo MA. New Eng J Med (2003) 349: 1480-1481.

12. Osawa M., Hanada K., Hanada H. y Nakauchi H. (1996) Science 273, 242-245.

13. Morrison S.J., Uchida N. y Weissman I.L. (1995) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 35-71.

14. Ivanova N.B., Dimos J.T., Schaniel C., Hackney J. A., Moore K.A., Lemischka* I.R. (2002) Science 298, 601 604.

15. Phillips RL. (2000) Curr Top Microbiol Immunol. 251, 13-19.

16. Ramalho-Santos M, Yoon S, Matsuzaki Y, Mulligan RC, Melton DA. (2002) Science 298, 597-600.

17. De Ugarte DA, Morizono K, Elbarbary, AAlfonso Z, Zuk PA, Zhu M, Dragoo JL, Ashjian P, Thomas B, Benhaim P, Chen I, Fraser J, Hedrick MH. (2003) Cells Tissues Organs 174 (3), 101-109.

18. Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN, Exp Hematol. Septiembre (1976);4(5):267-74.

19. Caplan AIJ Orthop Res. Septiembre (1991);9(5):641-50

20. Pittenger, M.F. et al. (1999) Science 284: 143-147

21. Beresford JN, Bennett JH, Devlin C, Leboy PS, Owen ME, J Cell Sci. Junio (1992); 102 (Pt 2):341-51 22. Yoo JU, Johnstone B, Clin Orthop. Octubre (1998);(compl. 355):S73-81

23. Wakitani S. et al. (1995) Muscle Nerve 18: 1417-1426.

24. Haynesworth SE, Goshima J, Goldberg VM, Caplan AI, Bone. 1992; 13(1):81-8.

25. Sanchez-Ramos J, Song S, Cardozo-Pelaez F, Hazzi C, Stedeford T, Willing A, Freeman TB, Saporta S, Janssen W, Patel N, Cooper DR, Sanberg PR, Exp Neurol. Agosto (2000);164(2):247-56.

26. Rogers JJ, Young HE, Adkison LR, Lucas PA, Black AC Jr, Am Surg. Marzo (1995);61(3):231-6.

27. Jiang Y, Vaessen B, Lenvik T, Blackstad M, Reyes M, Verfaillie CM, Exp Hematol. Agosto (2002);30(8):896-904.

28. Caplan AI, Bruder SP, Trends Mol Med. Junio (2001);7(6):259-64.

29. Stanford, C.M. et al. (1995) J Biol Chem 270: 9420-9428.

Bibliografía “A”

A1. Baumgart DC, Sandborn WJ. Crohn's disease. Lancet 2012;380:1590-605.

A2. Schwartz DA, Loftus EV, Jr., Tremaine WJ, et al. The natural history of fistulizing Crohn's disease in Olmsted County, Minnesota. Gastroenterology 2002; 122:875-80.

A3. Eglinton TW, Barclay ML, Gearry RB, Frizelle FA. The spectrum of perianal Crohn's disease in a populationbased cohort. Dis Colon Rectum 2012;55:773-7.

A4. Hellers G, Bergstrand O, Ewerth S, Holmstrom B. Occurrence and outcome after primary treatment of anal fistulae in Crohn's disease. Gut 1980;21:525-7.

A5. Scharl M, Rogler G. Pathophysiology of fistula formation in Crohn's disease. World J Gastrointest Pathophysiol 2014;5:205-12.

A6. Nielsen OH, Rogler G, Hahnloser D, Thomsen OO. Diagnosis and management of fistulizing Crohn's disease. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2009;6:92-106.

A7. Bell SJ, Williams AB, Wiesel P, Wilkinson K, Cohen RC, Kamm MA. The clinical course of fistulating Crohn's disease. Aliment Pharmacol Ther 2003;17:1145-51.

A8. Sands BE, Anderson FH, Bernstein CN, et al. Infliximab maintenance therapy for fistulizing Crohn's disease. N Engl J Med 2004;350:876-85.

A9. Thia KT, Mahadevan U, Feagan BG, et al. Ciprofloxacin or metronidazole for the treatment of perianal fistulas in patients with Crohn's disease: a randomized, double-blind, placebo-controlled pilot study. Inflamm Bowel Dis 2009;15:17-24.

A10. Present DH, Korelitz BI, Wisch N, Glass JL, Sachar DB, Pasternack BS. Treatment of Crohn's disease with 6-mercaptopurine. A long-term, randomized, double-blind study. N Engl J Med 1980;302:981-7.

A11. Pearson DC, May GR, Fick GH, Sutherland LR. Azathioprine and 6-mercaptopurine in Crohn disease. A meta-analysis. Ann Intern Med 1995;123:132-42.

A12. Present DH, Rutgeerts P, Targan S, et al. Infliximab for the treatment of fistulas in patients with Crohn's disease. N Engl J Med 1999;340:1398-405.

A13. Domenech E, Hinojosa J, Nos P, et al. Clinical evolution of luminal and perianal Crohn's disease after inducing remission with infliximab: how long should patients be treated? Aliment Pharmacol Ther 2005;22:1107-13.

A14. Goldstein ES, Marion JF, Present DH. 6-Mercaptopurine is effective in Crohn's disease without concomitant steroids. Inflamm Bowel Dis 2004;10:79-84.

A15. Korelitz BI, Present DH. Favorable effect of 6-mercaptopurine on fistulae of Crohn's disease. Dig Dis Sci 1985;30:58-64.

A16. Brandt LJ, Bernstein LH, Boley SJ, Frank MS. Metronidazole therapy for perineal Crohn's disease: a followup study. Gastroenterology 1982;83:383-7.

A17. Solomon MJ, McLeod RS, O'Connor BI, Steinhart AJ, et al. Combination ciprofloxacin and metronidazole in severe perianal Crohn's disease. Can J Gastroenterol 1993;7:571-3.

A18. Molendijk I, Nuij VJ, van der Meulen-de Jong AE, van der Woude CJ. Disappointing durable remission rates in complex Crohn's disease fistula. Inflamm Bowel Dis 2014;20:2022-8.

A19. Gecse K, Khanna R, Stoker J, et al. Fistulizing Crohn's disease: Diagnosis and management. United European Gastroenterol J 2013;1:206-13.

A20. Singer NG, Caplan AI. Mesenchymal stem cells: mechanisms of inflammation. Annu Rev Pathol 2011;6:457-78.

A21. DelaRosa O, Dalemans W, Lombardo E. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents of inflammatory and autoimmune diseases. Curr Opin Biotechnol 2012;23:978-83.

A22. Garcia-Olmo D, Guadalajara H, Rubio-Perez I, Herreros MD, De La Quintana P, Garcia-Arranz M. Recurrent anal fistulae: limited surgery supported by stem cells. World J Gastroenterol 2015;21:3330-6.

A23. de la Portilla F, Alba F, Garcia-Olmo D, Herrerias JM, Gonzalez FX, Galindo A. Expanded allogeneic adipose-derived stem cells (eASCs) for the treatment of complex perianal fistula in Crohn's disease: results from a multicenter phase I/IIa clinical trial. Int J Colorectal Dis 2013;28:313-23.

A24. Best WR, Becktel JM, Singleton JW, Kern F, Jr. Development of a Crohn's disease activity index. National Cooperative Crohn's Disease Study. Gastroenterology 1976;70:439-44.

A25. Irvine EJ. Usual therapy improves perianal Crohn's disease as measured by a new disease activity index. McMaster IBD Study Group. J Clin Gastroenterol 1995;20:27-32.

A26. Guyatt G, Mitchell A, Irvine EJ, et al. A new measure of health status for clinical trials in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1989;96:804-10.

A27. Colombel JF, Schwartz DA, Sandborn WJ, et al. Adalimumab for the treatment of fistulas in patients with Crohn's disease. Gut 2009;58:940-8.

A28. Hochberg Y. A sharper Bonferroni procedure for multiple tests of significance. Biometrica 1988;75:800-2.

A29. Van Assche G, Dignass A, Reinisch W, et al. The second European evidence-based Consensus on the diagnosis and management of Crohn's disease: Special situations. J Crohns Colitis 2010;4:63-101.

A30. Schwartz DA, Herdman CR. Review article: The medical treatment of Crohn's perianal fistulas. Aliment Pharmacol Ther 2004;19:953-67.

A31. American Gastroenterological Association medical position statement: perianal Crohn's disease. Gastroenterology 2003;125:1503-7.

A32. Geltzeiler CB, Wieghard N, Tsikitis VL. Recent developments in the surgical management of perianal fistula for Crohn's disease. Ann Gastroenterol 2014;27:320-30.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso en un método de tratamiento de una fístula perianal compleja resistente en un paciente que tiene la enfermedad de Crohn, en las que:

(i) la fístula comprende múltiples trayectos;

(iii) la terapia induce la remisión clínica en el plazo de 24 semanas.

2. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según la reivindicación 1, en las que la fístula comprende 2 orificios internos.

3. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en las que la fístula comprende 2 ó 3 orificios externos.

4. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en las que la terapia induce la remisión clínica en el plazo de 18 semanas, en el plazo de 12 semanas o en el plazo de 10 semanas.

5. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según la reivindicación 4, en las que la terapia induce la remisión clínica en el plazo de 8 semanas.

6. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según la reivindicación 5, en las que la terapia induce la remisión clínica en el plazo de 6 semanas.

7. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según cualquier reivindicación anterior, en las que la remisión clínica se mantiene hasta 24 semanas desde la terapia.

8. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según cualquier reivindicación anterior, en las que la terapia induce la remisión combinada en el plazo de 24 semanas, en el plazo de 18 semanas, en el plazo de 12 semanas, en el plazo de 10 semanas, en el plazo de 8 semanas o en el plazo de 6 semanas.

9. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo expandidas alogénicas para su uso según cualquier reivindicación anterior, en las que se logra una mejora en el índice de actividad de la enfermedad perianal (PDAI) en el plazo de 24 semanas, en el plazo de 18 semanas, en el plazo de 12 semanas, en el plazo de 10 semanas, en el plazo de 8 semanas o en el plazo de 6 semanas.

10. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según la reivindicación 9, en las que la mejora en PDAI es una mejora de más de 1,5 puntos PDAI, opcionalmente una mejora de al menos dos puntos PDAI.

11. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según cualquier reivindicación anterior, en las que la fístula es resistente a uno o más de (i) antibiótico, (ii) inmunosupresor y (iii) terapia con agentes anti-TNF.

12. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según cualquier reivindicación anterior, en las que el paciente recibe tanto la terapia anti-TNF como la terapia inmunosupresora o ninguna de las mismas.

13. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según cualquier reivindicación anterior, en las que el paciente:

(a) tiene enfermedad de Crohn inactiva o levemente activa; y/o

(b) enfermedad de Crohn luminal.

14. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según cualquier reivindicación anterior, en las que la fístula se monitoriza mediante obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM).

15. Células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas para su uso según cualquier reivindicación anterior, en las que al menos el 90% o al menos el 95% de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas expresan los marcadores de superficie HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 y CD105 y/o en las que menos del 5% de las células madre estromales derivadas de tejido adiposo alogénicas expandidas expresan los marcadores de superficie HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD34, CD80 y CD86.