DE60318706T2 - Marker für stammzellen und dessen verwendung - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Marker zum Isolieren und Identifizieren von mesenchymalen Stammzellen von Säugern. Sie betrifft des Weiteren Verfahren und Verwendungen eines solchen Markers sowie eine angereicherte Zellpopulation und eine die angereicherte Zellzusammensetzung enthaltende Zellzusammensetzung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Mesenchymale Stammzellen
  • Der adulte Körper beherbergt so genannte Stammzellen, die in der Lage sind, sich oft zu teilen und dabei außerdem Tochterzellen mit bestimmten phänotypischen Eigenschaften hervorbringen können. Im Körper liegen verschiedene Typen von Stammzellen vor, wozu embryonale Stammzellen, hämatopoetische Stammzellen und mesenchymale Stammzellen zählen. Mesenchymale Stammzellen können mesenchymales Gewebe, wie beispielsweise Knochen, Knorpel, Muskeln, Ligamentum, Fettgewebe und Knochenmarkstroma, bilden. 1 zeigt einen Ablaufplan von vermuteten, schrittweise ablaufenden Transitionen von putativen mesenchymalen Stammzellen (mesenchymal stem cells) (MSC) zu hoch differenzierten Phänotypen. Die mesenchymalen Stammzellen sind im Knochenmark, um Blutgefäße, in Fett, in der Haut, in Muskeln, in Knochen und in anderen Geweben anzutreffen. Ihre Anwesenheit trägt zum Reparaturvermögen dieser Gewebe bei.
  • Verwendung von MSC in der Medizin
  • Zur Zeit wird, was die Verwendung von MSC in der Medizin angeht, ihr Potenzial bei der Regeneration von Geweben untersucht, die der Körper auf natürlichem Wege nicht reparieren oder regenerieren kann, wenn es von ihm verlangt wird. Für derartige Untersuchungen werden MSC isoliert, in Kultur expandiert und zur Differenzierung in Bindegewebe, wie beispielsweise Knochen, Knorpel, Muskeln, Knochenmarkstroma, Sehnen, Fett und andere, stimuliert. Diese durch Tissue-Engineering erhaltenen Gebilde können anschließend wieder in den menschlichen Körper eingebracht werden, um verloren gegangenes oder geschädigtes Gewebe zu reparieren. Nach einem anderen Ansatz können MSC direkt in vivo stimuliert werden, um die Bildung bestimmter Gewebe in situ zu induzieren.
  • Nachdem MSC als potenzielle "Bausteine" für das Tissue-Engineering und die Transplantation definiert wurden, suchen Forscher nun nach Verbesserungen beim Identifizieren, Isolieren und Charakterisieren von MSC.
  • Alpha10
  • Alpha10beta1, ein neu entdecktes, Kollagen-bindendes Integrin, beinhaltet die Integrin-Untereinheit alpha10 (Camper et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 20383–20389). Das Integrin wird in Chondrozyten exprimiert und weist nach Reduktion, wenn es aus bovinen Chondrozyten durch Affinitätsreinigung mit Kollagen Typ II isoliert wurde, eine Mr von 160 kDa auf.
  • Durch Klonen und cDNA-Sequenzieren konnte gezeigt werden, dass seine allgemeine Struktur mit der anderen Integrin alpha-Untereinheiten übereinstimmt. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz besteht aus einem von 1167 Aminosäuren gebildeten reifen Protein, wobei hierin ein Signalpeptid (22 Aminosäuren), eine lange extrazelluläre Domäne (1098 Aminosäuren), eine transmembrane Domäne (22 Aminosäuren) und eine kurze zytoplasmische Domäne (22 Aminosäuren) enthalten sind. Im Gegensatz zu den meisten alpha-Integrin-Untereinheiten beinhaltet die zytoplasmische Domäne von alpha10 nicht die konservierte Sequenz KXGFF(R/K)R. Stattdessen lautet bei alpha10 die vorhergesagte Aminosäuresequenz KLGFFAH. Vermutlich spielt das GFFKR-Motiv in alpha-Ketten eine wichtige Rolle bei der Assoziation von Integrin-Untereinheiten und beim Transport des Integrins in die Plasmamembran (De Melker et al. (1997) Biochem. J. 328: 529–537).
  • Der extrazelluläre Anteil beinhaltet eine 7-mal wiederholte Sequenz, eine I-Domäne (199 Aminosäuren) und drei putative bivalente Kation-bindende Stellen. Die Sequenzanalyse hat gezeigt, dass die alpha10-Untereinheit am meisten verwandt ist mit der I-Domäne, die α Untereinheiten in höchster Übereinstimmung mit alpha1 (37%), alpha2 (35%) und alpha11 (42%) aufweist.
  • Alpha11
  • Das alpha11-Integrin wurde vor kurzem identifiziert, und ausweislich durch Klonen und Charakterisierung weist es eine I-Domäne auf, die beta1-assoziiertes Integrin enthält.
  • Der offene Leserahmen der cDNA kodiert einen aus 1.188 Aminosäuren bestehenden Präkursor. Das vorhergesagte reife, aus 1.166 bestehende Protein beinhaltet 7 konservierte FGGAP-Wiederholungen, eine I-Domäne mit einem MIDAS-Motiv, eine kurze transmembrane Region und eine charakteristische zytoplasmische Domäne aus 24 Aminosäuren mit der Sequenz GFFRS.
  • Alpha11 weist drei potenzielle bivalente Kation-bindende Stellen in den Wiederholungen 5 bis 7 auf. Von anderen Integrin alpha-Ketten unterscheidet sich die alpha11-Integrinkette durch das Vorhandensein von 22 in die extrazelluläre Stielportion eingefügte Aminosäuren (Aminosäuren 804 bis 826).
  • Aminosäuresequenzvergleiche haben gezeigt, dass mit 42% die höchste Identität mit der alpha10-Integrinkette besteht. Durch Immunopräzipitation mit alpha11-Integrin-spezifischen Antikörpern wurde ein 145-kDa-Protein abgetrennt, das deutlich größer ist als die ausweislich SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen 140 kDa große alpha2-Integrinkette.
  • Isolation und Identifikation von MSC
  • Die in situ-Identifikation von MSC wird dadurch behindert, dass keine monospezifischen und charakteristischen Molekularsonden existieren. Daher müssen mesenchymale Stammzellen weitergehend charakterisiert werden, um Sonden oder Sondenkombinationen ausfindig zu machen, die eine eindeutige Identifizierung mesenchymaler Stammzellen in Geweben ermöglichen. Derartige Marker werden außerdem nützlich bei der Isolation mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark (bone marrow) (BM) und aus Blutgeweben sein.
  • Von ungefähr einer Zelle aus 10.000 bis 100.000 kernhaltigen Knochenmarkaspirat-Zellen kann erwartet werden, dass es sich um eine mesenchymale Stammzelle handelt. Das derzeit wichtigste Verfahren zum Isolieren mesenchymaler Stammzellen aus Knochenmark basiert auf ihrer Eigenschaft, dass sie an Kunststoff-Kulturschalen anhaften und Kolonien bilden, während die Mehrzahl der Knochenmarkzellen hier nicht anhaften und keine Kolonien bilden. Diese Kolonien werden anschließend weitergehend expandiert und dann mit bestimmten Faktoren zur Differenzierung in spezifische mesenchymale Gewebe angeregt. Es ist jedoch nicht klar, ob die in dieser Weise isolierten mesenchymalen Stammzellen eine homogene Population darstellen. Es wird daher wichtig sein, Marker zu finden, die zur Identifikation von Unterklassen mesenchymaler Stammzellen mit spezifischen Differenzierungspotenzialen verwendet werden können.
  • In der US 6 200 606 wird die Isolation von Knorpel- oder Knochen-Präkursorzellen aus hämatopoetischen und nicht-hämatopoetischen Zellen unter Anwendung von CD34 als negativem Selektionsmarker und die weitere Verwendung isolierter Stammzellen in Prozessen zur Regeneration von Knochen und Knorpel beschrieben. Die Identifizierung bzw. Offenlegung eines spezifischen Markers für mesenchymale Stammzellen steht jedoch noch aus. Der CD34-Marker wird in frühen lymphohämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, Endothelzellen mit kleinem Gefäß, embryonalen Fibroblasten und einigen Zellen des fötalen und adulten Nervengewebes, in hämatopoetischen Vorläufern, die aus fötalen Dottersäcken, embryonaler Leber und extrahepatischen embryonalen Geweben einschließlich Aorta-assoziierten hämatopoetischen Vorläufern im 5 Wochen alten Embryo erhalten werden, exprimiert.
  • Pittenger at al. ((1999) Science 284: 143–147) haben zur Isolierung menschlicher MSC eine Dichtezentrifugation von menschlichem Knochenmark angewendet. Als Zellmarker für die MSC-Identifizierung werden SH-2, SH-3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a und CD124 verwendet.
  • Majumdar et al. ((2000) J. Cell. Physiol. 185: 98–106) haben CD105 als Marker zur Anreicherung menschlicher MSC aus Knochenmark verwendet.
  • Denni et al. ((2002) Cells Tissues Organs 170: 73–82) haben zur Anreicherung menschlicher MSC aus Knochenmark einen als Stro-1 bezeichneten Marker verwendet.
  • Alle bisher genannten Marker können zur Anreicherung von hMSC verwendet werden. Sie sind jedoch keine exklusiven MSC-Marker, und die isolierte Population bleibt heterogen, wenn die Anreicherung unter Verwendung dieser Marker durchgeführt wurde. Es gibt heute noch keine monospezifischen und eindeutigen Sonden für die hMSC-Identifizierung.
  • Des Weiteren werden Marker benötigt, um die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen in spezifische Typen mesenchymaler Zellen beobachten zu können. Dies wird insbesondere beim Wiedereinbringen dieser Zellen in den menschlichen Körper eine wichtige Rolle spielen, wenn verloren gegangenes geschädigtes mesenchymales Gewebe, beispielsweise Knochen oder Knorpel, ersetzt werden sollen.
  • Schließlich kann die Identifizierung spezifischer Zelloberflächenmarker für mesenchymale Stammzellen zur Isolierung dieser Zellen aus einer komplexen Zellmischung durch Zellsortierungstechniken, etwa Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (fluorescence activated cell sorting) (FACS), genutzt werden.
  • Angesichts der vorstehend diskutierten Probleme ist eine Identifizierung und Isolierung von MSC zwecks Weiterverwendung für die Reparatur von Knochen, Knorpeln, Muskeln, Knochenmark, Sehnen oder Bindegewebe in vivo oder in vitro sehr wünschenswert. Diese Bedürfnisse und Interessen werden von der vorliegenden Erfindung in dieser Hinsicht angesprochen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Angesichts der vorstehend besprochenen Nachteile des Stands der Technik im Hinblick auf die Isolierung und Identifizierung von MSC von Säugern stellt die vorliegende Erfindung einen Marker für Säuger-MSC bereit, der sich zur Identifizierung und Isolierung von MSC von Säugern in vitro eignet.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Identifizierung oder Isolierung von MSC von Säugern oder einer angereicherten Zellpopulation von MSC in vitro.
  • Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung von Verwendungen des erfindungsgemäßen Markers zur Identifizierung oder Isolierung von MSC von Säugern in vitro.
  • Die vorliegende Erfindung stellt somit einen Marker für mesenchymale Stammzellen von Säugern bereit. Der Marker umfasst eine Integrin alpha10-Kette und/oder Integrin alpha11-Kette, die auf der Zelloberfläche einer mesenchymalen Stammzelle oder intrazellulär in einer mesenchymalen Stammzelle exprimiert wird/werden.
  • Gemäß weiterer Ausführungsformen werden die Integrin alpha10- und/oder Integrin alpha11-Kette als ein Heterodimer in Kombination mit einer Integrin beta1-Kette exprimiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zur Identifizierung einer mesenchymalen Stammzelle von Säugern in vitro bereit. Ein derartiges Verfahren umfasst folgende Stufen:
    • a) Bereitstellen einer Probe, die eine mesenchymale Stammzelle umfasst,
    • b) Detektieren der Expression der Integrin alpha10- und/oder alpha11-Kette auf der Zelloberfläche einer mesenchymalen Stammzelle oder intrazellulär in einer mesenchymalen Stammzelle,
    • c) Punktbewertung der Expression der Integrin alpha10- und/oder alpha11-Kette und
    • d) Identifizieren der mesenchymalen Stammzelle entsprechend der Punktbewertung in obigem c).
  • Nach weiteren Ausführungsformen wird die Expression in obigem b) durch Detektieren der Expression des Proteins von Integrin alpha10 und/oder Integrin alpha11 detektiert.
  • Nach noch weiteren Ausführungsformen wird die Expression in obigem b) durch Detektieren der Expression der mRNA von Integrin alpha10 und/oder Integrin alpha11 detektiert.
  • Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung dessen bereit, ob eine Testverbindung eine Differenzierung mesenchymaler Stammzellen von Säugern in vitro moduliert.
  • Ein derartiges Verfahren umfasst folgende Stufen:
    • a) Bereitstellen einer mesenchymalen Stammzelle,
    • b) Inkontaktbringen der mesenchymalen Stammzelle mit einer Testverbindung und
    • c) Detektieren einer Änderung der Rate oder des Musters der Differenzierung der mesenchymalen Stammzelle als Anzeichen dafür, dass die Testverbindung die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen moduliert.
  • Noch darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion einer isolierten Population von Zellen von Säugern in vitro bereit, die bezogen auf eine Referenzpopulation an mesenchymalen Stammzellen angereichert sind. Ein derartiges Verfahren umfasst folgende Stufen:
    • a) Bereitstellen wenigstens einer Portion einer Zellpopulation oder einer Portion einer Referenzpopulation, die MSC und wenigstens eine andere Zelle als mesenchymale Stammzellen umfasst,
    • b) Einführen einer Verbindung in die Zellpopulation in obigem a), die die mesenchymalen Stammzellen identifiziert,
    • c) Selektieren und Isolieren der mesenchymalen Stammzellen aus der Zellpopulation in obigem b), wodurch eine an mesenchymalen Stammzellen angereicherte Zellpopulation produziert wird.
  • Nach weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können die mesenchymalen Stammzellen durch Detektion der Expression der Integrin alpha10- und/oder alpha11-Kettenexpression auf der Zelloberfläche besagter mesenchymaler Stammzellen in vitro gemäß dem in der vorliegenden Erfindung offengelegten Verfahren als eine mesenchymale Stammzelle identifiziert werden.
  • Darüber hinaus wird hierin eine angereicherte Zellpopulation mesenchymaler Stammzellen von Säugern beschrieben, die wenigstens eine intakte, lebensfähige mesenchymale Stammzelle umfasst. Bei dieser angereicherten Zellpopulation handelt es sich um eine Population, in der die mesenchymale Stammzelle dadurch gekennzeichnet ist, dass
    • a) eine Integrin alpha10-Kette und/oder Integrin alpha11-Kette auf der Zelloberfläche oder intrazellulär in besagter mesenchymaler Stammzelle exprimiert wird/werden,
    • b) sie im Wesentlichen keine Expression von Molekülen aufweist, die spezifisch für festgelegte lymphohämatopoetische Zellen oder nicht-festgelegte Stammzellen sind.
  • Außerdem wird hierin eine isolierte mesenchymale Stammzelle von Säugern beschrieben, die einen erfindungsgemäßen Marker exprimiert und durch das erfindungsgemäße Verfahren zur in-vitro-Produktion einer an mesenchymalen Stammzellen angereicherten Zellpopulation erhältlich ist.
  • Noch darüber hinaus wird hierin eine Säuger-Zellzusammensetzung beschrieben, die die angereicherte Zellpopulation oder die isolierte mesenchymale Stammzelle umfasst.
  • Außerdem werden in-vitro-Verwendungen eines erfindungsgemäßen Markers zur Identifizierung einer mesenchymalen Stammzelle von Säugern, zum Modulieren der Differenzierung einer mesenchymalen Stammzelle von Säugern und zum Isolieren einer mesenchymalen Stammzelle von Säugern bereitgestellt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 gibt eine schematische Darstellung einer vermuteten schrittweisen Transition von einer putativen mesenchymalen Stammzelle (MSC) zu hoch differenzierten Phänotypen (Quelle: Caplan, A. I. und Bruder, S. P., Trends Mol. Med. 2001, 7(6): 259–264).
  • 2 veranschaulicht, dass menschliche mesenchymale Stammzellen in der Kultur sowohl Integrin alpha10- als auch alpha11-Ketten auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. In der Figur gibt das obere Band in beiden Spuren alpha10 (in der linken Spur) und alpha11 (in der rechten Spur) an. Das untere Band gibt in beiden Spuren die beta1-Kette an.
  • 3 zeigt Histogramme nach Flusszytometrieanalyse. Wie in
  • 3E gezeigt, ist der Antikörper gegen alpha10 an die HEK293-Zellen, die mit der menschlichen alpha10 Integrin-Untereinheit transfiziert sind, gebunden. Der Antikörper gegen alpha10 wurde, wie in der mittleren Reihe gezeigt (rechts,. 3F), nicht an HEK293-Zellen, die mit der menschlichen alpha11 Integrin-Untereinheit transfiziert sind, oder an nicht-transfizierte HEK293-Zellen, wie in 3D gezeigt, gebunden. Wie in 3I gezeigt, ist der Antikörper gegen alpha11 an die HEK293-Zellen gebunden, die mit der menschlichen alpha11 Integrin-Untereinheit transfiziert sind. Der Antikörper gegen alpha11 wurde, wie in 3H gezeigt, nicht an HEK293-Zellen, die mit der menschlichen alpha10 Integrin-Untereinheit transfiziert sind, oder an nicht-transfizierte HEK293-Zellen, wie in 3G gezeigt, gebunden. 3A bis C zeigen einen Vergleich (sekundärer Antikörper allein), der an keine der für den Test verwendeten HEK293-Zellen gebunden wurde.
  • 4 zeigt Histogramme der Flusszytometrie. Nach 2 Wochen Behandlung mit FGF-2 exprimierten 96% der mit FGF-2 behandelten Zellen das Integrin alpha10 (untere Darstellung, 4b). Die obere Darstellung in 4a zeigt die Vergleichsergebnisse (sekundärer Antikörper allein).
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen
  • In dieser Beschreibung beziehen sich die Termini "Nagetier" und "Nagetiere" auf alle Vertreter der stammesgeschichtlichen Ordnung Rodentia.
  • Der Terminus "mausartig" bezieht sich auf alle und jeden beliebigen Vertreter der Familie Muridae einschließlich Ratten und Mäuse.
  • Der Terminus "im Wesentlichen frei von" meint hierin unterhalb der Detektionsgrenzen im verwendeten Assay, dadurch negativ erscheinend, d. h. frei von.
  • Der Terminus "festgelegt" ist hierin als bestimmt für oder ausgerichtet auf zu verstehen. Eine festgelegte Zelle ist somit eine Zelle, die für einen spezifischen Differenzierungsweg bestimmt oder auf einen spezifischen Differenzierungsweg ausgerichtet ist. Hieraus folgt, dass eine nicht-festgelegte Zelle für keinen spezifischen Differenzierungsweg bestimmt oder auf keinen spezifischen Differenzierungsweg ausgerichtet ist und ihr somit mehrere Optionen offen stehen.
  • Integrin alpha10 und Integrin alpha11 als MSC-Marker Wir haben überraschenderweise gefunden, dass die Integrine alpha10beta1 und alpha11beta1 auf menschlichen mesenchymalen Stammzellen vorliegen. Diese Integrine können daher zur Identifizierung, Differenzierung und Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus einer gemischten Zellpopulation genutzt werden und werden somit ein nützliches Werkzeug bei der Zelltherapie zur Reparatur geschädigter Gewebe sein.
  • Die Sequenz der menschlichen Integrin alpha10-Kette ist bekannt und der Öffentlichkeit unter der Zugangsnummer AF074015 bei der GenBankTM/EBI-Datenbank zugänglich. Die vorliegende Er findung legt somit neue Verwendungen und Verfahren für die Integrin alpha10-Kette offen.
  • Die Sequenz der menschlichen Integrin alpha11-Kette ist bekannt und der Öffentlichkeit unter der Zugangsnummer AF137378 bei der GenBankTM/EBI-Datenbank zugänglich. Die vorliegende Erfindung legt somit neue Verwendungen und Verfahren für die Integrin alpha11-Kette offen.
  • Wie oben beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Markers für mesenchymale Stammzellen (MSC) in vitro, wobei dieser eine Integrin alpha10-Kette und/oder Integrin alpha11-Kette, die auf der Zelloberfläche von MSC von Säugern oder intrazellulär in MSC von Säugern exprimiert wird/werden, umfasst..
  • In einer weitere Ausführungsform ist/sind die Integrin alpha10- und/oder Integrin alpha11-Kette als ein Heterodimer in Kombination mit einer Integrin beta1-Kette exprimiert.
  • MSC von Säugern werden im Allgemeinen aus Knochenmark, peripherem Blut, Nabelschnurblut, Leber, Knochen, Knorpeln, Perichondrium, Muskeln, Periosteum, Synovialmembran oder Fett isoliert. Die Isolierung kann darauf beruhen, dass die Zellen unter spezifischen Kulturbedingungen an Kunststoff-Kulturschalen anhaften und Kolonien bilden können, während die Mehrzahl der Knochenmarkzellen hier nicht anhaften und keine Kolonien bilden. Ein geeignetes Protokoll zur Isolierung von MSC von Säugern ohne Verwendung des erfindungsgemäßen Markers wird ausführlich in Mason, J. M. et al. (2000, Cartilage and bone regeneration using gene-enhanced tissue engineering. Clin. Orthop. 379S: S171–178), Chu, C. R. et al. (1997, Osteochondral repair using perichondrial cells in Clin. Orthop. 340: 220–229 (2000) und Dounchis, J. S. et al. (2000, Cartilage repair with autogenic perichondrium cell and polylactic acid grafts. Clin. Orthop. 377: 248–264) beschrieben. Es können daher bekannte Verfahren, jedoch unter Einbringung des/der erfindungsgemäßen Marker(s), angewendet werden.
  • Die Kolonien können weiter expandiert und dann, stimuliert mit spezifischen Faktoren, zu spezifischen mesenchymalen Geweben differenziert werden. Für Chondrozyten erfolgt die Kultur in Micromass-Pellets oder in Alginat ohne Serum und mit TGFbeta3, das als definierter Faktor zugesetzt wird. Für osteogene Zellen können Zellen in Gegenwart von Dexamethason, beta-Glycerylphosphat, Ascorbat und 10% FBS (foetal bovine serum) (fötales Rinderserum) kultiviert werden, und für Adipozyten können Zellen in Gegenwart von 1-Methyl-3-Isobutylxanthin, Dexamethason, Insulin und Indomethacin kultiviert werden.
  • Die in-vitro-Verwendung des/der erfindungsgemäßen Marker(s) in den Isolierungs- und Expandierungsprotokollen führt somit zu einer homogenen MSC-Population. Mesenchymale Stammzellen, die nicht in dieser Weise isoliert und expandiert wurden, liegen als homogene Population vor. Weitere Angaben zu geeigneten Faktoren, die Kulturen zur Expansion spezifischer MSC zugesetzt werden können, sind Caplan, A. I. (1991, Mesenchymal Stem Cells. J. Orthop. Res. 9: 641–650), Pittenger, M. F. et al. (1999, Mutlilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science. 284: 143–7) und Minguell, J. J., Erices, A. und Conget, P. (2001, Mesenchymal Stem Cells. Exp. Biol. Med. 226(6): 507–520 – Tabelle aller Faktoren, die zur Differenzierung von Zellen erforderlich sein können) zu entnehmen; diese Verweise sind durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
  • Menschliche MSC können aus Knochenmark, peripherem Blut, Nabelschnurblut, Leber, Knochen, Knorpeln, Perichondrium, Muskeln, Periosteum, Synovialmembran oder Fett isoliert werden. Die MSC können dann weiter durch Dichtezentrifugation isoliert werden, wo sie als Teil einer mononuklearen Zellfraktion bei einem Dichte-Interface von 1,073 g/ml (PercollTM, Pharmacia) zu finden sind. Geeignete Protokolle werden ausführlich in Vogel, W. et al. (2003, Heterogeneity among bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells) und in Nevo, Z. et al. (1998, The manipulated mesenchymal stem cells in re generated skeletal tissues. Cell Transplant 7: 63–70) angegeben; beide Verweise sind durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
  • Aus dieser mononuklearen Zellfraktion bilden 1/10.000 bis 1/100.000 Zellen auf Serumkultur in Kulturschalen Kolonien (Bruder, S. P. et al. (1997, Growth kinetics, self-renewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation. J. Cell. Biochem. 64: 278–294).
  • Das Einbringen einer Integrin alpha10-Kette und/oder Integrin alpha11-Kette einschließlich des hier beschriebenen Markers in bekannte Isolierungs- und Expansionsprotokolle sowie die alleinige Verwendung des/der Marker(s) ist somit von einem hohen Wert bei der weiteren Auswertung und Anreicherung der MSC-Population. Insbesondere ist außer dem erfindungsgemäßen Marker kein weiterer spezifischer und eindeutiger Marker für MSC von Säugern bekannt.
  • Verfahren zur in-vitro-Identifizierung von MSC
  • Die Erfindung legt ein Verfahren zur in-vitro-Identifizierung einer MSC von Säugern offen. Das Verfahren umfasst folgende Stufen:
    • a) Bereitstellen einer Probe, die MSC umfasst,
    • c) Punktbewertung der Expression der Integrin alpha10- und/oder alpha11-Kettenexpression und
    • d) Identifizieren der MSC entsprechend der Punktbewertung in obigem c).
  • Bei ausführlicher Darstellung kann das erfindungsgemäße Verfahren darüber hinaus folgende Stufen umfassen:
    • e) Bereitstellen einer Zellsuspension, die mesenchymale Stammzellen von Säugern umfasst,
    • f) Inkontaktbringen der Zellsuspension in e) mit einem monoklonalen Antikörper oder Fragmenten davon, die an Integrin alpha11beta1 oder alpha11beta1 binden, wobei besagter monoklonaler Antikörper oder Fragmente davon einen Antikörper-Antigen-Komplex mit der extrazellulären Domäne aus Integrin alpha1Obeta1/alpha11beta1 bilden,
    • g) Abtrennen von Zellen, die in f) an besagten monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon gebunden sind, und wahlweise
    • h) Gewinnen der Zellen, die in g) am monoklonalen Antikörper oder Fragmenten davon gebunden sind, wodurch eine Population von mesenchymalen Stammzellen von Säugern produziert wird, die wahlweise frei von besagtem Antikörper oder Fragmenten davon ist.
  • Die in obigem e) bereitgestellte, MSC von Säugern enthaltende Zellsuspension kann aus Knochenmark, peripherem Blut, Nabelschnurblut, Leber, Knochen, Knorpeln, Muskeln, Perichondrium, Periosteum, Synovialmembran, Fett oder einem beliebigen Gewebe, das MSCs enthält, isoliert werden. Die Zellsuspension kann außerdem aus Darmbeinkämmen, Femora, Tibia, Wirbelsäulen, Rippen oder anderen Markhöhlen von Säugern isoliert werden, solange sie nicht von einem menschlichen Embryo isoliert werden. Als weitere Quellen für menschliche MSCs stehen Dottersäcke, Plazentas und Nabelschnüre von nicht-menschlichen Embryonen zur Verfügung.
  • Bei dem Sammeln der Zellpopulation aus BM fallen nur 0,01 bis 0,001% der Ausgangspopulation oder "Rohpopulation" als MSCs an. Hierbei kann es je doch je nach Spender Schwankungen geben.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind die MSCs von Säugern menschliche MSCs.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind die MSCs von Säugern murine MSCs.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die obige Kultur eine 2 bis 4 Wochen kultivierte Kultur.
  • Nach einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Isolieren einer Population von MSCs des Weiteren folgende Stufen:
    • i) Sammeln eines von einem menschlichen Patienten stammenden Knochenmarkaspirats (5 bis 30 ml) in einer Spritze, die beispielsweise Heparin enthält, um Verklumpung zu verhindern,
    • j) Waschen der Markprobe mit beispielsweise Dulbeccos Phosphat gepufferter Salzlösung (Dulbecco's phosphate-buffered saline) (DPBS) oder einer beliebigen ähnlichen Salzlösung und Gewinnen der Zellen nach Zentrifugation bei 900 g und einmaliges Wiederholen dieser Prozedur,
    • k) Aufgeben der Zellen auf 25 ml Percoll mit einer Dichte von 1,073 g/ml in einer konischen 50-ml-Röhre und Abtrennen der Zellen durch 30 min Zentrifugation bei 1.100 g bei 20°C,
    • l) Sammeln der kernhaltigen Zellen von der Grenzfläche, Verdünnen mit 2 Volumina DPBS und Sammeln durch Zentrifugation bei 900 g. Resuspendieren der Zellen, wobei die Zellen gezählt werden, und Ausplattieren der Zellen mit der erforderlichen Dichte, geeigneterweise 200.000 Zellen/cm2,
    • m) Kultivieren der Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM) oder einem beliebigen anderen geeigneten Medium (niedriger Glucosegehalt), das 10% fötales Rinderserum (FBS) enthält,
    • n) Austauschen des Mediums nach 24 und 72 Stunden und danach jeden dritten oder vierten Tag und
    • o) Subkultivieren der hMSCs, die als symmetrische Kolonien in 10 bis 14 Tagen dadurch wachsen, dass sie 5 min lang mit 0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA behandelt werden, vom Substrat mit Serum-haltigem Medium abgespült werden und durch 5 min lange Zentrifugation bei 800 g gesammelt und mit einer Dichte von 5.000 bis 6.000 Zellen/cm2 in Kolben ausgesät werden.
  • Die Abtrennung von MSCs ist ein Selektions- und Isolierungsschritt, um die identifizierten MSCs abzutrennen. Zum Abtrennen der Zellen können diverse, dem Fachmann bekannte Techniken angewendet werden, wobei für andere Linien als MSCs bestimmte Zellen zunächst entfernt werden.
  • Bei der Verwendung eines Antikörpers oder von Fragmenten davon kann dieser auf einem festen Träger befestigt werden, um eine hochspezifische Trennung zu erreichen. Die angewendete spezifische Trennungsprozedur, wie beispielsweise Zentrifugation, mechanische Trennung, etwa mittels Säulen, Membranen oder magnetische Trennung, sollte die Lebensfähigkeit der zu sammelnden Fraktion maximieren. Dem Fachmann stehen diverse Techniken mit unterschiedlicher Wirksamkeit zur Verfügung. Die konkret angewendete Technik ist abhängig von der Trennungseffizienz, der Zytotoxizität der verwendeten Methode, der Leichtigkeit und Geschwindigkeit, mit der sie ausgeführt werden kann, und der Notwendigkeit anspruchsvoller Ausrüstungen und/oder technischer Fertigkeiten.
  • Für das Trennen von MSCs aus einer Zellsuspension verwendete, von dem erfindungsgemäßen in-vitro-Verfahren unterstützte Prozeduren können magnetische Trennung unter Nutzung beispielsweise Antikörper-beschichteter magnetischer Perlen, Affinitätschromatographie auf Basis des erfindungsgemäßen Antikörpers oder Fragmenten davon und "Schwenkung" mit einem Antikörper oder Fragmenten davon, die an einer festen Matrix, etwa einer Platte, angebunden sind, oder andere bequeme Techniken beinhalten.
  • Zu Techniken, die eine exakte Trennung liefern, zählen Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierer, in denen im erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise ein Antikörper oder Fragmente davon eingesetzt werden, wobei diese Techniken verschiedene Grade an Differenziertheit aufweisen können, wie beispielsweise eine Vielzahl von Farbkanälen, Detektionskanälen für die Lichtstreuung, Impedanzkanälen usw., die dem Fachmann bekannt sind.
  • In einer Ausführungsform wird ein erster Schritt zur Anreicherung von MSCs in der bereitgestellten Zellpopulation ausgeführt. Diese erste Selektion kann, ausgehend von der ursprünglichen Zellpopulation, eine negative Selektion der MSCs sein, d. h. andere Linien-festgelegte Zellen werden in ihrem Aufkommen vermindert oder entfernt.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist die erste Anreicherung eine positive Selektion von MSCs, die bis zum Erreichen der gewünschten Reinheit der MSCs wiederholt ausgeführt werden kann.
  • Wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, können die MSC durch Adhäsion an Kunststoff aus einer gemischten Zellpopulation isoliert werden, woran sich eine weitere optionale Expansion der Zellen mit definierten Faktoren anschließt, um eine Differenzierung zu diversen mesenchymalen Geweben zu erreichen. Für Chondrozyten kann die Kultur in Micromass-Pellets oder in Alginat mit oder ohne Serum und mit TGFbeta3, das als definierter Faktor zugesetzt wird, erfolgen. Für osteogene Zellen können Zellen in Gegenwart von Dexamethason, beta-Glycerylphosphat, Ascorbat und 10% FBS (fötales Rinderserum) kultiviert werden, und für Adipozyten können Zellen in Gegenwart von 1-Methyl-3-Isobutylxanthin, Dexamethason, Insulin und Indomethacin kultiviert werden. Noch geeignetere Faktoren werden von Minguell, J. J., Erices, A. und Conget, P. (2001) in Mesenchymal Stem Cells. Exp. Biol. Med. 226(6): 507–520 angegeben, welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können andere, weniger spezifische und nicht-eindeutige Marker für MSC von Säugern parallel zu dem hier beschriebenen Marker analysiert werden. Bei diesen Markern handelt es sich um SH-2, SH-3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124, CD105 und Stro-1, die MSC exprimieren können. Diese Marker sind jedoch nicht eindeutig für MSC von Säugern. Von MSC nicht exprimierte Marker sind CD14, CD34 und CD45, deren Expression oder mangelnde Expression in weiteren Ausführungsformen ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren ausgewertet werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die vorstehende Expression durch Detektieren der Expression des Proteins von Integrin alpha10 und/oder Integrin alpha11 detektiert.
  • Die Expression von alpha10/alpha11 kann in einer Ausführungsform durch Fluoreszenz-Zellsortierung analysiert werden, wozu beispielsweise ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (fluorescence activated cell sorter) (FACS®) oder beliebige andere hochspezifische Methoden verwendet werden können. Besonders bequem ist es, zusammen mit dem FACS Mehrfarbanalysen durchzuführen. Hierdurch können MSCs auf Grundlage des Färbungsniveaus für die jeweiligen Antigene abgetrennt werden.
  • In einer ersten Trennung können Antikörper für andere Marker verwendet werden, die mit einem oder mehreren Fluorochrom(en) markiert sind. In weiteren Ausführungsformen können SH-2, SH-3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124, CD105 und Stro-1 verwendbare Marker sein, die MSCs exprimieren können. Marker, die nicht in MSCs exprimiert werden, sind CD14, CD34 und CD45, deren Expression oder mangelnde Expression in weiteren Ausführungsformen ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren oder einem Fragment ausgewertet werden kann.
  • Wenn weitere Linien oder Zellpopulationen, die keine MSCs sind, in einem Schritt entfernt werden sollen, können diverse Antikörper gegen derartige Linien-spezifische Marker eingeschlossen werden.
  • Zu Fluorochromen, die in einer Mehrfarbanalyse verwendet werden können, zählen Phycobiliproteine, beispielsweise Phycoerythrin, und Allophycocyanine, Fluorescein, Texas-Red usw., die dem Fachmann wohl bekannt sind.
  • Die MSCs können von toten Zellen selektiert werden, wofür mit toten Zellen assoziierte Farbstoffe (Propidiumiodid, LDS) verwendet werden. Die Zellen können in einem Medium, das fötales Kälberserum enthält, gesammelt werden.
  • MSCs können außerdem in Kombination mit der Identifizierung unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Grundlage von Lichtstreuungseigenschaften und ihrer Expression diverser Zelloberflächen-Antigene selektiert werden.
  • Alternativ können MSCs durch Immunopräzipitation analysiert werden, wodurch die Expression der Integrin alpha10- und/oder alpha11-Kette detektiert und identifiziert wird. Ein geeignetes Immunopräzipitationsprotokoll wird im Folgenden kurz dargestellt. Selbstredend kann ein beliebiges anderes geeignetes Verfahren der Immunopräzipitation im erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden.
  • Das hier beschriebene Protokoll sieht Folgendes vor:
    • 1. Um spezifisch eine Immunopräzipitation der Integrine alpha10beta1 und alpha11beta1 aus Zelllysaten zu erreichen, können Antikörper gegen die zytoplasmischen Domänen der Integrin-Untereinheiten alpha10 bzw. alpha11 verwendet werden. Für die Immunopräzipitation von Integrin alpha10 oder alpha11 geeignete polyklonale Antikörper sind bekannt aus und veröffentlicht in J. Biol. Chem. (1998, 273: 20383–9).
    • 2. MSCs, die entweder die Integrin-Untereinheit alpha10 oder alpha11 exprimieren, können anschließend in einem geeigneten Zellkultur-Medium, beispielsweise DMEM, IMEM oder RPMI, vermehrt werden, wobei optional Serum und Wachstumsfaktoren zugesetzt sein können. Auf der Platte haftende Zellen werden einmalig mit PBS gewaschen und anschließend Oberflächen-biotinyliert, wozu beispielsweise 20 min lang 0,5 mg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) in 4 ml PBS auf Eis oder ein beliebiges anderes, dem Fachmann bekanntes geeignetes Biotinylierungsmittel verwendet werden kann.
    • 3. Anschließend werden Zellen einmalig mit PBS gewaschen, und für 5 min werden 10 ml 0,1 M Glycin/PBS auf Eis zugesetzt. Nach dem einmaligen Waschen mit PBS werden Zellen auf Eis in 1 ml Lysispuffer (1% NP-40, 10% Glycerin, 20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, Proteaseinhibitor-Cocktail Roche, pH 7,5) lysiert.
    • 4. Das Zelllysat wird 10 min lang mit 15,000 g geschleudert, und der Überstand wird entfernt und mit 1 μl α10/α11-Präimmunserum inkubiert; anschließend werden 20 μl Prot-G-Sepharose (Amersham) in 100 μl Lysispuffer zugesetzt.
    • 5. Nach 1 h Rotieren bei 4°C wird das Lysat 1 min lang mit 8.000 U/min zentrifugiert und der Überstand aufgefangen. Für jede folgende Immunopräzipitation werden 150 μl Zelllysat-Überstand in einen Eppendorf-Tubus pipettiert und 1 μl Antiserum oder monoklonale Antikörper-Lösung zugesetzt.
    • 6. Als Antikörper werden anti-humanes α10-Serum vom Kaninchen und anti-humanes α11-Serum vom Kaninchen verwendet (beides sind Sera gegen die zytoplasmischen Domänen der Integrins, veröffentlicht von Tiger et al. (Developmental Biology (2001) 237:116) für alpha11 und von Camper et al. (J. Biol. Chem. (2001) 306: 107–116) für alpha10.)
    • 7. Nach 2 h Rotation bei 4°C werden 20 μl Prot-G-Sepharose (Amersham) in 100 μl Lysispuffer zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 45 min rotiert. Die Sepharose-Beads werden anschließend kurz geschleudert und dreimal mit Lysispuffer gewaschen.
    • 8. Den Sepharose-Perlen werden 20 μl SDS-PAGE-Probenpuffer (einschließlich 100 mM DTT) zugesetzt, dann werden die Proben 5 min gekocht.
    • 9. 5 μl einer jeden Probe werden über 8%iges glattes Gel (Novex) geleitet und dann auf eine PVDF-Membran elektrotransferiert. Die Membran wird 1 h in 2% BSA/Tris-gepufferter Salzlösung mit 0,05% Tween blockiert, einmalig mit Tris-gepufferter Salzlösung mit 0,05% Tween gewaschen und dann mit 2 μl Extravidin-Peroxidase (Sigma) in 8 ml Blockierungspuffer inkubiert.
  • Nach 1 h wird die Extravidin-Peroxidase-Lösung entfernt und die Membran 3 × 20 min in TBST gewaschen. Danach können Oberflächen-biotinylierte Proteine beispielsweise mit ECL (Amersham) detektiert und auf einem photographischen Film visualisiert werden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Expression der Integrinkette alpha10 und/oder alpha11 auf der Zelloberfläche einer MSC oder intrazellulär in einer MSC detektiert. Hierbei können vorstehend genannte Verfahren, beispielsweise Flusszytometrie und Immunopräzipitation, angewendet werden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform wird die Expression in obigem b) mittels eines beliebigen Immunoassays, etwa den in Immunochemical protocols (Methods in molecular biology, Humana Press Inc.) beschriebenen Verfahren, detektiert. Die Detektion kann nach diversen Verfahren vorgenommen werden, beispielsweise beliebigen, dem Fachmann bekannten Immunomethoden, wozu Immunopräzipitation, Western Blotting oder flusszytometrische Verfahren, etwa Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), zählen. Antikörper, wie etwa monoklonale Antikörper oder Fragmente davon, erweisen sich bei der Identifizierung von Markern, Oberflächenmembranproteinen sowie intrazellulären Markern in Assoziation mit besonderen Zelllinien und/oder Differenzierungsstadien als besonders nützlich. Sie sind daher für die Identifizierung von Integrin alpha10 wie auch alpha11 geeignet. Dennoch kann die Identifizierung gleichermaßen mit einem beliebigen spezifischen Molekül vorgenommen werden, etwa einem Protein oder Peptid, das spezifisch an das Integrin alpha10- und/oder Integrin alpha11-Molekül bindet. Beispiele für derartige Proteine oder Peptide sind natürliche Liganden, die an das Integrin alpha10- und/oder Integrin alpha11-Molekül binden. Derartige natürliche Liganden sind durch Rekombination, chemische Synthese oder Reinigung, ausgehend von einer natürlichen Quelle, zugänglich. In noch einer weiteren Ausführungsform wird die obige Expression durch Detektieren der Expression der mRNA von Integrin alpha10 und/oder Integrin alpha11 detektiert. Das Detektieren der Expression der mRNA eines spezifischen Proteins ist dem Fachmann wohl bekannt und wird allgemein durch Sondierung der mRNA mit einer für die jeweilige mRNA spezifische DNA- oder RNA-Sonde unter Hybridisierungsbedingungen vorgenommen, unter denen die Sonde nicht an andere mRNA-Moleküle hybridisiert. Wie für einen Fachmann allgemein verständlich, können auch verschiedene Polymerasekettenreaktionen (polymerase chain reactions) (PCR) angewendet werden.
  • Ein geeignetes PCR-Verfahren wird im Folgenden angegeben. Angewendet werden können Polymerasekettenreaktionen (PCR).
  • RNA kann durch Standardverfahren, beispielsweise durch Nutzung von RNeasy Mini Kits (Qiagen Germany), aus menschlichen mesenchymalen Stammzellen oder chondrogenen Vorläuferzellen präpariert werden.
  • cDNA kann durch Superscript II reverse Transkriptasereaktion (Invitrogen, USA) gemäß Herstellerempfehlung mit Oligo-d(T)-Primern oder Gen-spezifischen Primern produziert werden.
  • Anschließend wird die cDNA durch PCR vervielfältigt. Der cDNA werden spezifische Primer für α10, Vorwärts-Primer 5' GCT CCA GGA AGG CCC CAT TTG TG 3' und Rückwärts-Primer 5'GTG TTT TCT TGA AGG GTG CCA TTT 3' oder, für α11, Vorwärts-Primer 5'GCT GCA GGC AGT GAC AGT A 3' und Rückwärts-Primer 5'GCG ATG GGA ATG GTG ATC T 3' zugefügt, dann wird das spezifische Produkt mittels Platinum Taq DANN-Polymerase (Invitrogen, USA) gemäß der Anbieterempfehlungen in 30 Zyklen bei 65°[C] vervielfältigt.
  • Die Punktbewertung der Expression des Integrin alpha10- und/oder des Integrin alpha11-Moleküls kann unter Bezug auf eine Referenzzellpopulation, die das Integrin alpha10- und/oder das Integrin alpha11-Molekül exprimiert, sowie in Bezug auf eine Zellpopulation, die das Integrin alpha10- und/oder das Integrin alpha11-Molekül nicht exprimiert, erfolgen. Beispielhaft für Zellen, die das Integrin alpha10 und alpha11 exprimieren, sind C2C12-Zellen, HEK293-Zellen, die mit alpha10- und alpha11-Integrin-Sequenzen transfiziert sind. Beispielhaft für Zellen, die alpha10 und alpha11 nicht exprimieren, sind nicht-transfizierte C2C12-Zellen und HEK293-Zellen.
  • Verfahren zur Produktion einer an MSC von Säugern in vitro angereicherten isolierten Zellpopulation
  • Die Erfindung legt ein Verfahren zur Produktion einer in Bezug auf eine Referenzpopulation an MSC von Säugern in vitro angereicherten isolierten Zellpopulation offen, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst:
    • a) Bereitstellen wenigstens einer Portion einer Zellpopulation oder wenigstens einer Portion einer Referenzpopulation, die MSC und wenigstens eine andere Zelle als eine MSC umfasst,
    • b) Einführen einer Verbindung in die Zellpopulation in obigem a), die die MSC identifiziert,
    • c) Selektieren und Isolieren der MSC aus der Zellpopulation in obigem b), wodurch eine an MSC angereicherte Zellpopulation produziert wird.
  • Das Bereitstellen einer Population wird in den vorstehenden Absätzen beschrieben und kann wie im Falle des Verfahrens zur Identifizierung von MSC ausgeführt werden. Bei dem Sammeln der Zellpopulation aus BM fallen ungefähr 0,01 bis 0,001% der Ausgangspopulation oder "Rohpopulation" als MSC an. Hierbei kann es jedoch je nach Spender Schwankungen geben.
  • Als Verbindung, die zwecks Identifizierung der MSC eingeführt wird, steht ein Protein, Peptid, monoklonaler Antikörper oder Teil davon oder polyklonaler Antikörper, der die MSC identifiziert, zur Verfügung. In einer Ausführungsform wird die MSC als eine MSC durch Detektion der Expression der alpha10 und/oder alpha11-Integrinkettenexpression auf der Zelloberfläche der besagten MSC gemäß dem oben beschriebenen Verfahren zur MSC-Identifizierung identifiziert.
  • Bei der Selektion und Isolation von MSC handelt es sich um einen Trennungsschritt, in dem die identifizierte MSC abgetrennt und somit isoliert wird. Zum Abtrennen der Zellen können diverse Techniken angewendet werden, wobei für andere Linien als MSC bestimmte Zellen zunächst entfernt werden. Monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Teile davon erweisen sich als besonders nützlich bei der Identifizierung von Markern – hier auf intakten, lebensfähigen Zellen –, wobei die Marker mit bestimmten Zelllinien und/oder Stadien der Differenzierung assoziierte Oberflächenmembranproteine sind. Die zur MSC-Identifizierung verwendete Verbindung kann auch im Trennungsschritt verwendet werden. Daher kann/können diese Verbindung(en), wie etwa Antikörper oder Teile davon, auf einem festen Träger befestigt werden, um eine erste grobe Trennung zu ermöglichen. Beispiele für feste Träger sind Perlen, etwa magnetische Perlen, Agarose- oder andere ähnliche, dem Fachmann bekannte Perlen-Typen. Für die Trennung von Zellen können be liebige Verfahren angewendet werden, solange sichergestellt ist, dass die Lebensfähigkeit einer Zelle nicht in übermäßiger Weise durch die Trennung beeinträchtigt wird.
  • Die verwendeten Trennungstechniken sollten zu einer maximalen Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der zu sammelnden Fraktion führen. Die Bewertung der Lebensfähigkeit wird im Folgenden beschrieben.
  • Kurz gefasst kann die Lebensfähigkeit beispielsweise durch Flusszytometrie bewertet werden. Hierbei kann nach dem Anfärben von Zellen, jedoch vor dem Aufgeben auf ein Flusszytometer, die im Folgenden angegebene Menge/Konzentration eines geeigneten Lebensfähigkeits-Farbstoffs zugesetzt werden, um zwischen lebenden und toten Zellen zu diskriminieren. Es gibt eine Reihe solcher Farbstoffe, und im Folgenden werden Beispiele für diese Farbstoffe und typische Verfahren zu ihrer Nutzung beschrieben. Die meisten dieser Farbstoffe funktionieren nach dem gleichen Prinzip: Diese Farbstoffe dringen in die Zellen ein, wenn die Zellmembran geschädigt ist; dies bedeutet, dass mit diesen Farbstoffen angefärbte Zellen tot sind und solche Zellen, die nicht angefärbt werden, als lebend gewertet werden können.
  • Beispiele für Farbstoffe sind:
    • a) Propidiumiodid (PI): Bereitstellung: 50 μg/μl in Ethanol/PBS Es werden 1 μl auf 100 μl Medium im Tubus zugesetzt.
    • b) 7-Aminoactinomycin D (7 AAD) Bereitstellung: 1 mg/ml in MeOH Es werden 1 μl auf 100 μl Medium im Tubus zugesetzt.
    • c) To-Pro3 Bereitstellung: 1 mM in DMSO Es werden 1 μl auf 500 μl 1 ml Lösung zugesetzt.
    • d) Ethidiummonoazid (EMA) Bereitstellung: 50 μg/ml in EtOH Es werden 5 μg/ml auf 1 × 106 Zellen zugesetzt.
  • Weitere Verfahren werden in Flow Cytometry and Cell Sorting (Springer Lab Manual) von A. Radbruch, Springer Verlag (2. Auflage, Januar 2000) beschrieben.
  • Die Zelllebendigkeit der gesammelten Fraktion liegt bei > 90%, vorzugsweise bei 95, 96, 97, 98, 99, 99,9 oder sogar 100%.
  • Die konkret zur Trennung von Zellen angewendete Technik im erfindungsgemäßen Verfahren ist abhängig von der Trennungseffizienz, der Zytotoxizität der verwendeten Methode, der Leichtigkeit und Geschwindigkeit, mit der sie ausgeführt werden kann, und der Notwendigkeit anspruchsvoller Ausrüstungen und/oder technischer Fertigkeiten.
  • Trennprozeduren können magnetische Trennung unter Nutzung beispielsweise Antikörper-beschichteter magnetischer Perlen, Affinitätschromatographie, zytotoxischer Mittel, die an einem monoklonalen Antikörper ansetzen oder in Konjunktion mit einem monoklonalen Antikörper angewendet werden, etwa Komplement und Zytotoxine, und "Schwenken" mit einem Antikörper, welcher an einer festen Matrix, etwa einer Platte, angebunden sind, oder andere bequeme Techniken beinhalten. Zu Techniken, die eine exakte Trennung liefern, zählen Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierer, die verschiedene Grade an Differenziertheit aufweisen können, beispielsweise eine Vielzahl von Farbkanälen, Detektionskanälen für die Lichtstreuung, Impedanzkanälen usw., und dem Fachmann bekannt sind.
  • Weitere Protokolle für zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Trennverfahren werden von Orfao, A. und Ruiz-Arguelles, A. ((1996) General Concepts about Cell Sorting Techniques. Clin Biochem. 29(1): 5–9) und von Herzenberg, L. A., De Rose, S. C. und Herzenberg, L. A. ((2000) Monoclonal Antibo dies and FACS: complementary tools for immunobiology and medicine. Immunol. Today. 21(8): 383–390) beschrieben.
  • Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet wenigstens eine Stufe zur Anreicherung von MSC von Säugern.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist die erste Stufe zur Anreicherung von MSC, ausgehend von der ursprünglichen Zellpopulation, eine negative Selektion der MSC, d. h. andere Linienfestgelegte Zellen werden in ihrem Aufkommen vermindert oder entfernt. Beispiele für derartige durch die negative Selektion zu entfernende Zellen werden von folgenden Markern identifiziert: CD14 (Monozyten, Granulozyten, dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen), CD34 (hämatopoetische Vorläuferzellen) und CD45 (Leukozyten). Diese und weitere für die negative Selektion von MSC von Säugern nützliche Marker werden ausführlich von Conget, P. A., Minguell, J. J. ((1999) Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells. J. Cell Physiol. 181: 67–73) und von Pittenger, M. F. et al. ((1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284: 143–7) dargestellt, die beide unter Bezugnahme hierin aufgenommen werden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist die erste Anreicherung eine positive Selektion von MSC, die bis zum Erreichen der gewünschten Reinheit der MSC wiederholt ausgeführt werden kann. Bei der positiven oder negativen Selektion können Proteine, Peptide, monoklonale oder polyklonale Antikörper als eine Verbindung verwendet werden, um in der oben beschriebenen Weise das Integrin alpha10- oder Integrin alpha11-Molekül zu identifizieren. Die Verbindung kann, um ein leichtes Trennen des in den vorstehenden Abschnitten genannten spezifischen Zelltyps zu ermöglichen, mit Mitteln zur Trennung konjugiert sein, beispielsweise an magnetische Beads, die eine direkte Trennung ermöglichen, an Biotin, das mittels Avidin entfernt werden kann, oder an Streptavidin, das an einen Träger gebunden ist, an Fluorochrome, die zusammen mit einem Fluoreszenz aktivierten Zellsortierer verwendet werden können, oder dergleichen. Beliebige andere Techniken können angewendet werden, durch die die Lebensfähigkeit der Zellen, die im Blickpunkt des Interesses stehen, d. h. der MSC, nicht übermäßig beeinträchtigt wird.
  • In einer Ausführungsform wird die Selektion durch Fluoreszenz-Zellsortierung vorgenommen, wofür beispielsweise ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer, etwa ein FACS®, oder beliebige andere ähnliche hochspezifische Methoden angewendet werden können. Besonders bequem ist es, den FACS mit Mehrfarbanalysen zu verwenden, was eine dem Fachmann auf dem Gebiet der Flusszytometrie wohl bekannte Technik darstellt. Die Zellen können auf Grundlage des Färbungsniveaus für die jeweiligen Antigene abgetrennt werden. In einer ersten Trennung können mit einem Fluorochrom markierte Antikörper für andere Marker verwendet werden, während die Antikörper für die anvisierten Linien, d. h. das Integrin alpha10 und/oder Integrin alpha11, mit (einem) anderen Fluorochrom(en) konjugiert sein können. In weiteren Ausführungsformen können SH-2, SH-3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124, CD105 und Stro-1 andere Marker sein, die MSC exprimieren kann. Marker, die nicht in MSC exprimiert werden, sind CD14, CD34 und CD45, deren Expression oder mangelnde Expression in weiteren Ausführungsformen zusammen mit dem erfindungsgemäßen Marker, beispielsweise der Expression von Integrin alpha10 und/oder Integrin alpha11, ausgewertet werden kann.
  • Wenn in diesem Schritt weitere Linien oder Zellpopulationen entfernt werden sollen, können diverse Antikörper für derartige Linien-spezifische Marker eingebracht werden. Zu Fluorochromen, die in einer Mehrfarbanalyse verwendet werden können, zählen Phycobiliproteine, beispielsweise Phycoerythrin, und Allophycocyanine, Fluorescein, Texas-Red usw.
  • Die Zellen können gegen tote Zellen selektiert werden, wozu mit toten Zellen assoziierte Farbstoffe, wie beispielsweise Propidiumiodid oder LDS-751 (Laser Dye Styryl-751 (6- dimethylamino-2-[4-[4-(dimethylamino)phenyl]-1,3-butadienyl]-1-ethyl quinoliniumperchlorat)), verwendet werden können. Die Zellen können in einem beliebigen geeigneten Medium zum Kultivieren von Zellen gesammelt werden, etwa in Iscoves modifiziertem Dulbeccos Medium (IMDM), oder in einer beliebigen, vorzugsweise gepufferten, physiologischen Kochsalzlösung, beispielsweise Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (phosphate buffer saline) (PBS), die optional fötales Kälberserum (foetal calf serum) (FCS) oder Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) (BSA) enthält. Es können weitere Techniken zur positiven oder negativen Selektion angewendet werden, die eine exakte Trennung ermöglichen, wozu Affinitätssäulen und dergleichen zählen, beschrieben bei Silvestri, F., Wunder, E., Sovalat, H., Henon, P., Serke, S. (in Positive selection of CD34+ cells: a short review of the immunoadsorption methods currently available for experimental and clinical use (Report an the "2nd European Workshop an stem Cell Methodology", Mulhouse, Frankreich, 3. bis 7. Mai 1993. J Hematother. 1993 Winter; 2(4): 473–81) und von Basch, R. S., Berman, J. W. und Lakow, E. in Cell separation using positive immunoselective techniques (J Immunol Methods. 1983 Feb 11; 56(3): 269–80).
  • Zellen können auf Grundlage von Lichtstreuungseigenschaften sowie auf ihrer Expression diverser Zelloberflächenantigene selektiert werden.
  • Es kann davon ausgegangen werden, dass die spezifische Reihenfolge der Trennschritte keine besondere Relevanz für die vorliegende Erfindung hat; die hier angegebene Reihenfolge stellt einen Weg zur Ausführung der Erfindung dar, dessen Funktionieren bekannt ist. Es wird somit vorgeschlagen, Zellen zunächst durch eine Grobtrennung, vorzugsweise eine negative Selektion, durch die unter Einsatz negativer Zellmarker, wie etwa CD14, CD34 und CD45, nicht für MSC bestimmte Zellen entfernt werden, zu trennen. Derartige Zellen sind negativ, was die Expression von Integrin alpha10 und/oder alpha11 anbelangt. Auf die negative Selektion folgt eine Feintrennung als positive Selektion, wobei zur positiven Selektion ein mit MSC assoziierter Marker und zur negativen Selektion Marker, die mit Linienfestgelegten Zellen und anderen, von MSC verschiedenen Stammzellpopulationen assoziiert sind, verwendet werden. Auf diese Trennung folgt anschließend eine Selektion einer Zellpopulation oder einer besagte Population umfassenden Zellzusammensetzung, die ein Multilinien-Potenzial, wie eine MSC, und ein verstärktes Vermögen der Selbstregeneration hat. Die Zusammensetzung wird im Folgenden genauer beschrieben.
  • Isolierte-MSC von Säugern
  • Hierin wird des Weiteren eine angereicherte Zellpopulation von MSC von Säugern beschrieben. Eine solche Zellpopulation umfasst intakte, lebensfähige MSC, wobei die MSC dadurch gekennzeichnet sind, dass sie
    • a) eine Integrin alpha10-Kette und/oder Integrin alpha11-Kette auf der Zelloberfläche besagter MSC oder intrazellulär in MSC exprimieren,
    • b) im Wesentlichen keine Expression von Molekülen aufweisen, die spezifisch für festgelegte hämatopoetische Zellen sind.
  • Ein Beispiel für Moleküle, die für festgelegte hämatopoetische Zellen spezifisch sind, ist CD45. Weitere Moleküle, von denen die MSC-Zellen im Wesentlichen frei sind, sind beispielsweise CD34 und CD14.
  • In weiteren Ausführungsformen beträgt die Anreicherung in einer derartigen Population ungefähr 70, 80, 90, 95, 98, 99, 99,9 oder sogar 100%. Die Lebensfähigkeit solcher Zellen wurde oben ausführlich diskutiert.
  • Die isolierten MSC können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion einer MSC-angereicherten Zellpopulation erhalten werden.
  • Zellzusammensetzung
  • Hierin wird des Weiteren eine Zellzusammensetzung von Säugern beschrieben. Eine derartige Zusammensetzung umfasst die erfindungsgemäße angereicherte Zellpopulation von Säugern oder die erfindungsgemäße isolierten MSC von Säugern.
  • Zusammensetzungen mit mehr als 90%, üblicherweise mehr als ungefähr 95%, wie beispielsweise 97, 98 oder 99,9% menschlicher MSC-Zellen können gemäß der offengelegten Verfahren zur MSC-Anreicherung erhalten werden. Derartige MSC können für die Zellregeneration und die Entwicklung von Vertretern aller unterschiedlichen MSC-Linien, beispielsweise Osteozyten, Chondrozyten, etwa hypertrophe Chondrozyten, Muskelzellen, Myotuben, Stromazellen, T/L-Fibroblasten, Adipozyten, Tenozyten, Hautzellen und andere Zellen, bereitgestellt werden. Dies geschieht im Allgemeinen in Kulturen unter Verwendung von zuvor beschriebenen spezifischen Faktoren.
  • Schließlich kann eine einzige Zelle aus einer MSC-Zusammensetzung erhalten und für die langlebige Wiederherstellung eines Säugers mit MSC-Mangel und/oder die Bildung oder Regeneration mesenchymaler Gewebe verwendet werden. Die MSC-Zusammensetzung sollte in therapeutisch wirksamer Dosis verabreicht werden, wobei die Dosis eine bestimmte Zellzahl ist, mit der besagter Säuger, beispielsweise ein Mensch, repopuliert werden kann. Diese Zellzahl kann von Spender zu Spender schwanken und kann bei Bedarf von Fall zu Fall von einem auf dem Gebiet der Zelltransplantation in Säuger, beispielsweise einen Menschen, bewanderten Fachmann empirisch bestimmt werden.
  • Für den Transfer und die Immobilisierung der MSCs und der MSC enthaltenden Zusammensetzung kommen diverse Prozeduren in Betracht, wozu die Injektion der isolierten Zellen in die Stelle des Skelettdefekts, beispielsweise in einen geschädigten Gelenkknorpel, das Inkubieren isolierter Zellen in einem geeigneten Gel und Implantieren, das Inkubieren mit einem bioresor bierbaren Gerüst oder die systematische Verabreichung von Infusionen usw. zählen. Es sind verschiedene Prozeduren hierfür bekannt, die beispielsweise beschrieben werden von Risbud, M. V. und Sittenger, M. ((2002) Tissue Engineering: advances in in vitro cartilage regeneration. Trends in Biotech. 20(8): 351–356), von Caplan, A. und Bruder, S. P. ((2001) Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7(6): 259–64), von Lazarus, H. M. et al. ((1995) Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): Implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant 16: 557–564) und von Koc, O. N. et al. ((2000) Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blond stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy. J. Clin. Oncol 18(2): 307–16).
  • Optional können MSCs mit einem Antikörper gegen das Integrin alpha10 oder alpha11 inkubiert werden, um die Zellen am Platz zu halten. So können Antikörper an einem bioresorbierbaren Gerüst konjugiert werden, wodurch die Zellen vor der Implantation an der geschädigten oder defizienten Stelle, beispielsweise an dem Ort eines Skelettdefekts, immobilisiert werden können. Das Gerüst ermöglicht eine dreidimensionale Immobilisierung von MSCs. Im Folgenden werden Beispiele für geeignete Gerüste aus Biomaterial gegeben. Durch die Angabe der Beispiele werden keine Einschränkungen hinsichtlich der Verwendung anderer geeigneter Gerüste gemacht, die ein Fachmann auswählen kann, wenn sie für die konkrete Anwendung geeigneter sein sollten.
  • Zu Typen von Gerüsten zählen bioresorbierbare Poly(α-hydroxyester)-Gerüste, wie etwa Polymilchsäure (polylactic α-cid) (PLLA), Polyglycolsäure (polyglycolic acid) (PGA) und deren Copolymer (PLGA).
  • Weitere Ausführungsformen beinhalten Gerüste, die von Polymergelen, beispielsweise Hyaluronsäure, Kollagen, Alginat und Chitosan, abgeleitet werden.
  • Weitere Ausführungsformen beinhalten Gerüste, die von porösen Trägern abgeleitet werden, beispielsweise Keramikblöcken aus Tricalciumphosphat und/oder Hydroxyapatit (Luyten, F. P., Dell'Accio, F. und De Bar, C. (2001) Skeletal tissue engineering: opportunities and challenges. Best Prac & Res. Clin. Rheum. 15(5): 759–770).
  • Die hier beschriebene Zellzusammensetzung kann zur Behandlung genetischer Krankheiten verwendet werden. Mit MSC assoziierte genetische Krankheiten können, um den Gendefekt zu korrigieren, durch genetische Modifikation autologer oder allogener MSC behandelt werden. So können beispielsweise Krankheiten, wie etwa verschiedene Bindegewebeerkrankungen, beispielsweise Osteogenesis imperfecta, Ehlers-Danlos-Syndrom, Chondrodysplasie und Alport-Syndrom, mittels Einbringen eines Wildtyp-Gens entweder durch homologe oder durch ungerichtete Rekombination in die MSC korrigiert werden. Verfahren zur homologen Rekombination für die Korrektur von Krankheiten sind bekannt und werden beschrieben von Hatada, S., Nikkuni, K., Bentley, S. A., Kirby, S., Smithies, O. ((2000) Gene correction in hematopoietic progenitor cells by homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A 97(25): 13807–11).
  • Mit allogenen MSC können normale Zellen, die einen Säuger derselben Spezies ohne den Gendefekt bilden, therapeutisch verwendet werden. Bei anderen Ausführungsformen der Gentherapie können Drug-Resistenzgene eingebracht werden, um normalen MSC einen Vorteil zu erschaffen und sie selektivem Druck auszusetzen; ein Beispiel hierfür ist das Multidrug-Resistenzgen (MDR). Eine ausführliche Darstellung hierzu geben Aran, J. M., Pastan, I., Gottesman, M. M. in (1999) Therapeutic strategies involving the multidrug resistance phenotype: the MDR1 gene as target, chemoprotectant, and selectable marker in gene therapy. (Adv Pharmacol 46: 1–42).
  • Andere als mit MSC assoziierte Krankheiten können ebenfalls behandelt werden, wenn die Krankheit Bezug zum Fehlen eines bestimmten Sekretionsprodukts, beispielsweise eines Hormons, Enzyms, Interferons, Faktors oder dergleichen, hat. Durch Nutzung einer geeigneten regulatorischen Initiationsregion kann eine induzierbare Produktion des fehlenden Proteins bewirkt werden, sodass die Produktion des Proteins parallel zur natürlichen Produktion ablaufen kann, auch wenn die Produktion in einem Zelltyp erfolgt, der nicht der Zelltyp ist, welcher üblicherweise ein derartiges Protein produziert. Außerdem ist es möglich, ein Ribozym, ein Antisense oder eine andere Nachricht einzuführen, um bestimmte Genprodukte oder die Anfälligkeit für Krankheiten, insbesondere des Bindegewebes, zu inhibieren.
  • Modulation von MSC in vitro
  • Die Erfindung legt ein Verfahren zur Feststellung, ob eine Testverbindung eine Differenzierung von MSC von Säugern in vitro moduliert, offen. Ein derartiges Verfahren umfasst folgende Stufen:
    • a) Bereitstellen einer MSC,
    • b) Inkontaktbringen der MSC mit einer Testverbindung und
    • c) Detektieren einer Änderung der Rate oder des Musters der Differenzierung der MSC als ein Anzeichen dafür, dass die Testverbindung die MSC-Differenzierung moduliert.
  • Das Bereitstellen der MSC kann in Form einer nach einem der offengelegten Verfahren angereicherten Zellpopulation, in Form der erfindungsgemäßen isolierten MSC oder in Form der erfindungsgemäßen Zellzusammensetzung erfolgen.
  • Die Testverbindung kann eine beliebige Verbindung sein, von der bekannt ist oder vermutet wird, dass sie MSC affiziert, wozu beispielsweise pharmazeutische Zusammensetzungen, Arzneimittel, polyklonale oder monoklonale Antikörper oder Teile davon, wie etwa Antikörper, die an Integrin alpha10 und/oder Integrin alpha11 oder an ein beliebiges anderes Molekül auf der MSC anbinden, Faktoren, die zur Anregung des MSC-Wachstums verwendet werden, beispielsweise FGF oder fötales Rinderserum (FBS), oder Faktoren, die zur Anregung der MSC-Differenzierung verwendet werden, beispielsweise Dexamethason, TGFbeta und Insulin, zählen.
  • Das Detektieren einer Änderung der Rate oder des Musters etwa der Differenzierung der MSC als ein Anzeichen dafür, dass die Testverbindung die MSC-Differenzierung moduliert, kann durch Flusszytometrie oder beliebige andere geeignete, dem Fachmann bekannte Verfahren, beispielsweise eine beliebige Immunomethode, vorgenommen werden. Die Änderung der Rate oder des Musters der Differenzierung kann durch kinetische, funktionelle oder phänotypische Untersuchungen der mit der Testverbindung modulierten MSC im Vergleich mit einer nicht oder zum Schein behandelten MSC-Population erfolgen. Sie kann außerdem durch Vergleich mit wenigstens einer zweiten Testverbindung vorgenommen werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die MSC durch Detektion der Expression der alpha10 und/oder alpha11-Integrinkettenexpression auf der Zelloberfläche besagter MSC oder intrazellulär in MSC gemäß dem hier offengelegten Verfahren zur MSC-Identifizierung als eine MSC identifiziert.
  • Verwendung der MSC von Säugern in vitro
  • Die hier bereitgestellten MSC von Säugern, beispielsweise die MSC von Menschen oder Mäusen, können einer Reihe von Anwendungen zugeführt werden. Beispiele für deren Anwendung sind 1) Regeneration eines Wirts mit MSC-Defekt, 2) Behandlung eines Wirts durch Re-Engraftment von MSC zur Regeneration von Knochen, Knorpel, Muskeln, Mark, Sehnen/Bändern und Bindegewebe bei einem Patienten, der dessen bedarf, 3) Detektieren und Bewerten von Wachstumsfaktoren, die bei der Selbstregeneration von MSC eine Rolle spielen, und 4) Entwicklung von MSC-Linien und Screening nach Faktoren, die mit ihrer Entwicklung und Differenzierung assoziiert sind.
  • Des Weiteren bestehen für das Integrin alpha10 und/oder alpha11 diverse Verwendungen. Beispiele für derartige Verwendungen sind das Identifizieren, Differenzieren und Isolieren von mesenchymalen Stammzellen von Säugern aus einer gemischten Zellpopulation als nützliche Werkzeuge bei der Zelltherapie mit dem Ziel der Reparatur von geschädigtem Gewebe.
  • Die Erfindung legt die Verwendung von erfindungsgemäßem Integrin alpha10 und/oder alpha11 zur Identifizierung von MSC in vitro offen.
  • Des Weiteren wird eine Verwendung von erfindungsgemäßem Integrin alpha10 und/oder alpha11 zum Modulieren der Differenzierung einer MSC in vitro offengelegt.
  • Darüber hinaus wird eine Verwendung von erfindungsgemäßem Integrin alpha10 und/oder alpha11 zum Isolieren einer MSC oder einer angereicherten MSC-Population in vitro offengelegt.
  • MSC von Säugern
  • Die in der vorliegenden Erfindung offengelegten Verfahren und Verwendungen legen MSC von Säugern, Zellpopulationen von Säugern und Zellzusammensetzungen von Säugern offen.
  • In besonderen Ausführungsformen kann der Säuger ein Mensch sein.
  • Bei noch weiteren Ausführungsformen ist der Säuger ein Nagetier, beispielsweise eine Ratte, eine Maus oder ein beliebiger anderer Vertreter der Familie Muridae.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Detektieren einer Integrin alpha10- und Integrin alpha11-Kette auf menschlichen MSC
  • Aufgabe
  • Dieses Beispiel hat zur Aufgabe, menschliche MSC im Hinblick auf die Expression von Integrin alpha10 und alpha11 auf dem Wege der Immunopräzipitation zu analysieren.
  • Materialien und Methoden
  • Menschliche mesenchymale Stammzellen (erhalten von In Vitro, Schweden, bei Passage 2) wurden in MSCBM-Medium (bereitgestellt von In Vitro, Schweden) bis Passage 4 kultiviert und dann Oberflächen-biotinyliert.
  • Auf der Platte anhaftende Zellen wurden einmalig mit PBS gewaschen und dann 20 min unter Verwendung von 0,5 mg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) in 4 ml PBS Oberflächen-biotinyliert. Zellen wurden anschließend einmalig mit PBS gewaschen und 5 min lang 10 ml 0,1 M Glycin/PBS zugesetzt.
  • Nach einmaligem Waschen mit PBS wurden Zellen in 1 ml Lysispuffer (1% NP40, 10% Glycerin, 20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, Proteaseinhibitor-Cocktail BM, pH 7,5) lysiert. Das Zelllysat wurde mit einem Kunststoffschaber gesammelt, in einen Eppendorf-Tubus pipettiert und 10 min bei 15,000 g geschleudert.
  • Der nach dem obigen Zentrifugationsschritt gesammelte Überstand wurde mit 2 Mikroliter alpha10-Präimmunserum inkubiert; anschließend wurden 20 μl Prot-G-Sepharose (Amersham) in 100 μl Lysispuffer zugesetzt.
  • Nach Rotation der Zellen im Lysispuffer über Nacht bei 4°C wurde das Lysat 1 min bei 8000 U/min zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Für jede folgende Immunopräzipitation wurden 150 μl Zelllysat in einen Eppendorf-Tubus pipettiert und 1 μl Antiserum zugesetzt. Als Sera wurden anti-humanes a10-Serum vom Kaninchen bzw. anti-humanes a11-Serum vom Kaninchen ver wendet (beides sind Sera gegen die zytoplasmischen Domänen der Integrine).
  • Nach 1 h Rotation bei 4°C wurden 20 μl Protein-G-Sepharose (Amersham) in 100 μl Lysispuffer zugesetzt und das Gemisch weitere 30 min rotiert.
  • Die Sepharose-Beads wurden anschließend kurz geschleudert und dreimal mit Lysispuffer gewaschen.
  • 20 μl SDS-PAGE-Probenpuffer (einschließlich 100 mM DTT) wurden den Sepharose-Beads zugesetzt, dann wurden die Proben 5 min gekocht. 5 μl einer jeden Probe wurden über 8%iges SDS-PAGE-Gel (Novex) geleitet und dann auf eine PVDF-Membran elektrotransferiert.
  • Die Membran wurde 1 h in 2% BSA/TBST (TBST: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) blockiert, einmalig mit TBST gewaschen und dann mit 2 μl Extravidin-Peroxidase (Sigma) in 8 ml Blockierungspuffer inkubiert.
  • Nach 1 h wurde die Extravidin-Peroxidase-Lösung entfernt und die Membran 3 × 20 min in TBST gewaschen. Danach wurden Oberflächen-biotinylierte Proteine mit ECL (Amersham) detektiert und auf einem photographischen Film visualisiert.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • 2 zeigt das Ergebnis der Immunopräzipitation. Mesenchymale Stammzellen von Menschen exprimieren in Kultur beide Integrine alpha10 und alpha11 auf ihrer Oberfläche. In der Figur gibt das obere Band alpha10 (in der linken Spur) und alpha11 (in der rechten Spur) an. Das untere Band gibt in beiden Spuren die beta1-Kette an.
  • Es wurde die Expression sowohl von Integrin alpha10 als auch von alpha11 identifiziert.
  • Beispiel 2: Identifizieren von Integrin alpha11beta1 und von alpha11beta1 exprimierenden HEK293-Zellen
  • Aufgabe
  • Dieses Beispiel hat zur Aufgabe, Antikörper gegen alpha10 und alpha11 zu verwenden, um HEK293-Zellen, die das Integrin alpha10beta1 und das Integrin alpha11beta1 exprimieren, zu identifizieren und zwischen HEK293-Zellen, die das Integrin alpha10beta1 und das Integrin alpha11beta1 exprimieren, zu differenzieren.
  • Materialien und Methoden
  • Mit Integrin alpha10 und alpha11 transfizierte HEK293-Zellen und nicht-transfizierte HEK293-Zellen wurden trypsinisiert, mit PBS gewaschen und dann 20 min mit Integrin-Antikörpern gegen alpha10 und alpha11 (1 μg/ml in PBS, ergänzt mit 1% BSA) inkubiert.
  • Markierte Zellen wurden zweimalig mit PBS/1% BSA gewaschen und anschließend 20 min mit PE-markiertem Ziege-anti-Maus Ig (Pharmingen, BD Biosciences), Konzentration 1 μg/ml in PBS/1% BSA, inkubiert.
  • Anschließend wurden Zellen zweimalig in PBS/1% BSA gewaschen und an einem FACSort® (Becton-Dickinson) analysiert, indem 10.000 Ereignisse mit dem Cell Quest®-Software-Programm (Becton-Dickinson) aufgenommen wurden.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse werden in 3A bis I als Histogramme nach der FACS-Analyse veranschaulicht.
  • Im FACS-Assay wurde der Antikörper gegen alpha10 ausweislich 3E an die mit der menschlichen alpha10-Integrin-Untereinheit transfizierten HEK293-Zellen gebunden. Dies kann anhand einer Rechtsverschiebung im FACS-Histogramm erkannt werden.
  • Der Antikörper gegen alpha10 wurde ausweislich der mittleren Reihe (rechts, 3F) an mit der menschlichen alpha11-Integrin-Untereinheit transfizierte HEK293-Zellen oder (ausweislich 3D) nicht-transfizierte HEK293-Zellen nicht gebunden.
  • Analog wurde der Antikörper gegen alpha11 an den mit menschlicher alpha11-Integrin-Untereinheit transfizierten HEK293-Zellen gebunden, was in 3I gezeigt ist. Dies kann anhand einer Rechtsverschiebung im FACS-Histogramm erkannt werden. Der Antikörper gegen alpha11 wurde an mit der menschlichen alpha10-Integrin-Untereinheit transfizierte HEK293-Zellen, wie in 3H gezeigt, oder nicht-transfizierte HEK293-Zellen, wie in 3G gezeigt, nicht gebunden.
  • Die 3A bis C zeigen einen Vergleich (sekundärer Antikörper allein), der an keine der für den Test verwendeten HEK293-Zellen gebunden wurde.
  • Zusammengefasst zeigt 3A bis I, dass HEK293-Zellen, die das Integrin alpha10beta1 und Integrin alpha11beta1 exprimieren, mittels FACS-Analyse spezifisch sortiert werden können, wenn Antikörper verwendet werden, die gegen diese Integrine gerichtet sind.
  • Beispiel 3: Identifizieren von Integrin alpha10 exprimierenden MSC in Kolonie-bildenden menschlichen Zellen, die aus menschlichem Knochenmark abgeleitet wurden
  • Aufgabe
  • Hier wird getestet, ob Kolonie-bildende Zellen, die aus menschlichem Knochenmark abgeleitet sind, das Integrin alpha10 exprimieren und eine Population mesenchymaler Stammzellen darstellen.
  • Materialien und Methoden
  • Menschliche mononukleare Knochenmarkzellen wurden durch Dichtezentrifugation aus Knochenmark isoliert.
  • 30 × 106 Zellen wurden in 20 ml Medium (MSCGM-Medium, bereitgestellt von Poietics und bezogen über Invitro, umfassend 440 ml MSCBM (Charge 017190), 2 × 25 ml MCGS (Charge 082295), L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin) in einem T75-Kolben aufgenommen und im Zellinkubator inkubiert.
  • Zellen wurden bis Tag 12 vermehrt (Medium wurde zweimalig ausgetauscht) und anschließend trypsinisiert und aufgeteilt (5.000 Zellen/cm2). Generell wurden Zellen bei Erreichen einer Konfluenz von 90% aufgeteilt.
  • Nach 3 weiteren Tagen Wachstum wurden Zellen erneut aufgeteilt (5.000 Zellen/cm2). Auf dieser Stufe wurde der Einfluss von FGF-2 auf die Expression von alpha10 in hMSC untersucht: Hierzu wurde eine Platte unter denselben Bedingungen wie oben im Medium wachsen gelassen, während eine andere Platte im Medium mit zugesetzten 5 ng/ml FGF-2 wachsen gelassen wurde. Nach zwei Wochen Kultivierung mit oder ohne FGF-2 (einschließlich einer Passage) wurden die Zellen mittels FACS analysiert, wobei für die Analyse der Zellen ein monoklonaler Antikörper gegen alpha10 verwendet wurde.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse werden in 4 als Flusszytometrie-Histogramme veranschaulicht.
  • Nach zweiwöchiger Behandlung mit FGF-2 hatten 96% der mit FGF-2 behandelten Zellen das Integrin alpha10 exprimiert (untere Reihe, 4b).
  • Die obere Reihe in 4a zeigt die Vergleichsergebnisse (sekundärer Antikörper allein). Zellen wurden mit nicht-MSC-Markern (CD34 und CD45) getestet; das Ergebnis war negativ (Ergebnisse nicht gezeigt).
  • Außerdem wurden Zellen morphologisch analysiert, und durch Lichtmikroskopie wurde festgestellt, dass die Zellen MSCs-typische Kolonien gebildet hatten.

Claims (13)

  1. Verwendung eines Markers, der eine Integrin alpha10-Kette oder eine Integrin alpha10-Kette und eine Integrin alpha11-Kette, die auf der Zelloberfläche einer mesenchymalen Stammzelle oder intrazellulär in einer mesenchymalen Stammzelle exprimiert werden, umfasst, als Marker für mesenchymale Stammzellen von Säugern in vitro.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Integrin alpha10-Kette oder die Integrin alpha10-Kette und die Integrin alpha11-Kette als Heterodimer(e) in Kombination mit einer Integrin beta1-Kette exprimiert wird/werden.
  3. Verfahren zur Identifizierung einer mesenchymalen Stammzelle von Säugern in vitro, wobei des Verfahren die folgenden Stufen umfasst: a) Bereitstellen einer Probe, die mesenchymale Stammzellen umfasst, b) Delektieren der Expression der Integrinkette alpha10 oder der Integrinkette alpha10 und alpha11 auf der Zelloberfläche einer mesenchymalen Stammzelle oder intrazellulär in einer mesenchymalen Stammzelle, c) Punktbewertung der Expression der Integrinkette alpha10 oder der Integrinkette alpha10 und alpha11 und d) Identifizieren der mesenchymalen Stammzelle entsprechend der Punktbewertung in obigem c).
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Expression in obigem b) durch Detektieren der Expression des Pro teins der Integrinkette alpha10 oder der Integrinkette alpha10 und alpha11 detektiert wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Expression in obigem b) durch Detektieren der Expression der mRNA von Integrin alpha10 oder Integrin alpha10 und Integrin alpha11 detektiert wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3–4, wobei die Expression in obigem b) durch einen Immunoassay detektiert wird.
  7. Verfahren zur Bestimmung, ob eine Testverbindung die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen von Säugern in vitro moduliert, wobei das Verfahren die Stufen a) des Bereitstellens einer mesenchymalen Stammzelle, die Integrin alpha10 oder Integrin alpha10 und Integrin alpha11 exprimiert, b) des Inkontaktbringens der mesenchymalen Stammzelle mit einer Testverbindung und c) des Detektierens einer Änderung der Rate oder des Musters der Differenzierung der mesenchymalen Stammzelle als Anzeichen dafür, dass die Testverbindung die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen moduliert, umfasst, wobei die Rate oder das Muster der Differenzierung durch Detektieren der Expression der Integrinkette alpha10 oder von Integrin alpha10 und Integrin alpha11 auf der Zelloberf1che der mesenchymalen Stammzelle oder intrazellulär in einer mesenchymalen Stammzelle gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 3–6 detektiert wird.
  8. Verfahren zur Produktion einer isolierten Population von Säugerzellen in vitro, die bezogen auf eine Refe renzpopulation an mesenchymalen Stammzellen angereichert ist, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: a) Bereitstellen von mindestens einer Portion einer Zellpopulation oder einer Portion einer Referenzpopulation, die eine mesenchymale Stammzelle und mindestens eine andere Zelle als mesenchymale Stammzellen umfasst, b) Einführen einer Verbindung, die eine Integrin alpha10-Kette oder Integrin alpha10 und Integrin alpha11-Kette, die auf der Zelloberfläche einer mesenchymalen Stammzelle oder intrazellulär in einer mesenchymalen Stammzelle exprimiert werden, identifiziert, in die Zellpopulation in obigem a), c) Selektieren und Isolieren der mesenchymalen Stammzellen aus der Zellpopulation in obigem b), wodurch eine an mesenchymalen Stammzellen angereicherte Zellpopulation produziert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die mesenchymalen Stammzellen durch Detektion der Expression von Integrin alpha10 oder Expression der Integrin alpha10 und alpha11-Kette auf der Zelloberfläche der mesenchymalen Stammzellen gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 3–6 als mesenchymale Stammzellen identifiziert werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8–9, wobei die Selektion in obigem c) durch Fluoreszenz-Zellsortierung durchgeführt wird.
  11. Verwendung eines Markers nach einem der Ansprüche 1–2 zur Identifizierung einer mesenchymalen Stammzelle von Säugern in vitro.
  12. Verwendung eines Markers nach einem der Ansprüche 1–2 zur Modulation der Differenzierung einer mesenchymalen Stammzelle von Säugern in vitro.
  13. Verwendung eines Markers nach einem der Ansprüche 1–2 zur Isolierung einer mesenchymalen Stammzelle von Säugern in vitro.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1068238T3 (da) 1998-04-02 2013-01-14 Xintela Ab Integrinheterodimer og subunit deraf
SE0301087D0 (sv) 2003-04-14 2003-04-14 Cartela Ab New monoclonal antibody
AU2004228605B2 (en) * 2003-04-14 2011-05-26 Xintela Ab New monoclonal antibody capable of binding integrin alpha 10 beta 1
US20060045872A1 (en) 2004-08-25 2006-03-02 Universidad Autonoma De Madrid Ciudad Universitaria de Cantoblanco Use of adipose tissue-derived stromal stem cells in treating fistula
ES2313805B1 (es) * 2004-10-04 2009-12-23 Cellerix, S.L. Identificacion y aislamiento de celulas multipotentes de tejido mesenquimal no osteocondral.
WO2006106823A1 (ja) * 2005-03-31 2006-10-12 Japan Science And Technology Agency 分子マーカーを用いた間葉系幹細胞の識別方法及びその利用
DE102006026191A1 (de) * 2006-05-26 2007-11-29 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Vorrichtung und Substanz zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)
WO2008099561A1 (ja) * 2007-02-14 2008-08-21 Japan Science And Technology Agency 抗菌性ペプチドを用いた細胞増殖促進剤及び該細胞増殖促進剤を含有する無血清培地を用いる細胞増殖促進方法
JP5429755B2 (ja) * 2008-04-18 2014-02-26 国立大学法人名古屋大学 間葉系幹細胞およびその生産方法
EP2377542A4 (de) * 2009-01-15 2013-04-03 Corestem Co Ltd Pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung der knochenerkrankung oder zur bekämpfung von entzündung, umfassend knorpelstammzellen als aktives prinzip
US20160000698A1 (en) * 2014-07-07 2016-01-07 Medipost Co., Ltd. Capability of small-sized stem cells to stimulate hair growth and use thereof
AU2016220535B2 (en) 2015-02-16 2021-05-27 Targinta Ab Detection and treatment of malignant tumours in the CNS
GB201604304D0 (en) 2016-03-14 2016-04-27 Tigenix S A U Adipose tissue-derived stromal stem cells for use in treating refractory complex perianal fistulas in crohn's disease
ES2908586T3 (es) 2016-08-17 2022-05-03 Xintela Ab Marcador para células madre neurales
LT3573630T (lt) * 2017-01-27 2021-05-25 Xintela Ab Kaulų ir kremzlių pažeidimų arba ligų prevencija ir gydymas
BR112020010079A2 (pt) * 2017-11-22 2020-11-03 Mesoblast International Sàrl composições celulares e métodos de tratamento i

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5837539A (en) * 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
US6200606B1 (en) 1996-01-16 2001-03-13 Depuy Orthopaedics, Inc. Isolation of precursor cells from hematopoietic and nonhematopoietic tissues and their use in vivo bone and cartilage regeneration
US5965436A (en) * 1996-11-15 1999-10-12 Osiris Therapeutics, Inc. Method of isolating mesenchymal stem cells associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes
DK1068238T3 (da) 1998-04-02 2013-01-14 Xintela Ab Integrinheterodimer og subunit deraf
SE9902056D0 (sv) 1999-06-03 1999-06-03 Active Biotech Ab An integrin heterodimer and an alpha subunit thereof
AU2003239030A1 (en) * 2002-06-17 2003-12-31 Cartela R & D Ab Methods and uses of the integrin alpha 10 chain, for preventing progression of atherosclerosis plaque formation
EP1996698A1 (de) * 2006-03-01 2008-12-03 Cartela R&D AB Expansion und differenzierung mesenchymaler stammzellen

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