DE69534847T2

DE69534847T2 - Knochen-vorläufer-zellen: zusammensetzungen und methoden

Info

Publication number: DE69534847T2
Application number: DE69534847T
Authority: DE
Inventors: Michael W. Northville LONG; Kenneth G. Shelburne MANN
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1994-08-12
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2015-08-12
Also published as: EP0804551B1; US6740493B1; ATE319812T1; DE69534847D1; CA2200197A1; WO1996005290A1; AU712247B2; EP0804551A1; US20040214241A1; US5972703A; AU3244295A; US7498170B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren, mit denen Knochenvorläuferzellen erhalten werden, und Zusammensetzungen, die solche Zellen enthalten. Die Erfindung umfasst Verfahren zur Anreicherung der Population von Knochenvorläuferzellen in Knochenmarkszellen, die aus Säugerzellen oder aus peripherem Blut gewonnen wurden. Ferner werden Verfahren zur Differenzierung von Knochenvorläuferzellen zu Osteoblasten bereitgestellt.
Hintergrund der Erfindung
Die Quote der Knochenfrakturen in den Vereinigten Staaten beträgt geschätzt 6.000.000 Individuen pro Jahr. In 1984 (Holbrock et al. 1984) ergaben diese Verletzungen direkte Kosten (d.h. ausgenommen Einkommensverlust) von $17.000.000.000 pro Jahr. Wenn ein Knochen vollständig gebrochen ist, erfordert eine signifikante Zahl von Frakturen eine medizinische Intervention, die über eine einfache Immobilisierung (Gipsen) hinausgehen, insbesondere solche, bei denen ein Trauma involviert ist. Ein Hauptproblem in solchen Fällen ist die fehlende Nähe der beiden Knochenenden (was als Nicht-Einheit (non-union) bezeichnet wird). Dies resultiert in einem ungeeigneten und verlängerten Wiederherstelleungsprozess, der die Erneuerung verhindern kann.
Die durchschnittliche Zeitdauer des Körpers, um eine Fraktur wieder herzustellen, beträgt 25–100 Tage für eine moderate Tragelast, und ein Jahr für eine vollständige Wiederherstellung. Somit würden sowohl einfache Frakturen als auch medizinische komplizierte Brüche von neuen therapeutischen Modalitäten profitieren, die den Wiederherstellungsprozess beschleunigen und/oder vervollständigen. Das Gleiche trifft für die Knochenerkrankungen (als Osteopenien bezeichnet) zu, die in einem Dünnerewerden der Knochen, wovon das primäre Symptom häufige Ermüdungsbrüche sind.
Primäre Osteoporose ist ein zunehmender progressiver Knochenverlust, der den Alterungsprozess begleitet. Als solcher stellt sie ein signifikantes Gesundheitsrisiko in den Vereinigten Staaten dar, wobei mehr als 15 Millionen Amerikaner unter primärer (idiopathischer) Osteoporose leiden, was in direkten Kosten von $6,000,000,000 pro Jahr resultiert (Holbrock et al. 1984). Primäre Osteoporose ist die häufigste der metabolischen Knochenerkrankungen, und etwa 40.000 bis 50.000 in Verbindung mit Frakturen stehende Todesfälle werden von dieser Erkrankung begleitet. Diese Mortalitätsrate ist größer als die von Brustkrebs und Gebärmutterkrebs zusammen. Bezeichnenderweise ist diese Krankheit, die eine der Osteopenien ist, symptomlos, bis eine Knochenfraktur auftritt. Betroffenen Individuen brechen sich typischerweise die Speiche, der Oberschenkelkopf und kollabierte Wirbel.
Osteoporose hat einen größeren Einfluss auf die weibliche Bevölkerung, wobei eine größere Zahl von Frauen als von Männer von dieser Krankheit betroffen werden, und eine signifikante Quote der Osteoporose tritt nach der Menopause auf. Die Geschwindigkeit der Osteoporose wird durch eine Östrogenersatztherapie verlangsamt aber nicht gelindert. In der Tat gibt es keinen überzeugenden medizinischen Beweis, dass irgendeine Behandlung bei der Wiederherstellung der Knochenmasse in irgendeiner Art erfolgreich ist. Wenn man die Alterung der amerikanische Bevölkerung berücksichtigt, stellen Patienten mit Osteoporose auch eine signifikante Zielbevölkerung für wirksam und neu Knochentherapien dar.
Der Vorgang des Alterns ist im Allgemeinen mit einer progressiven Verminderung der Knochenanhäufungskapazität, insbesondere im Trabeculaknochen, assoziiert (Nimi et al. 1993). Diese verminderte strukturelle Integrität ist mit einer Anzahl von Veränderungen in den Knochenproteinen, der Osteoidbildung, dem Calciumverlust etc., verbunden, was zu einer Osteopenie führt (Nimni, et al., 1993; Fedarko et al., 1992; Termine, 1990). Die genauen zellulären Mechanismen, die solchen Änderungen in der Knochenstruktur und – funktionen zu Grunde liegt, ist unklar. Zentral für alle diese Änderungen sind die Zellen der Osteoblastenlinie.
Eine Verminderung der Osteoblastenfunktion oder -zahl führt notwendigerweise zum Verlust der Knochenbildungskapazität. Es ist bekannt, das einige Aspekte der Osteblastenfunktion mit dem Alter deutlich abnimmt (Termine, 1990). Insgesamt nimmt die Gesamtproteinsynthese und die Synthese spezifischer Proteoglykane deutlich ab (Fedarko et al. 1992), wohingegen Kollagen und andere Proteine, wie Fibronektin und Thrombospondin abgebaut werden (Termine, 1990).
Knochenzellen aus älteren Individuen haben in vitro die Fähigkeit, auf Wachstumsfaktoren zu reagieren, aber ihre synthetische und proliferative Kapazität ist vermindert (Termine, 1990), vermutlich wegen einer verminderten Ansprechempfindlichkeit auf verschiedene osteogene Wachstumsfaktoren (Pfeilschifter et al., 1993). Dies resultiert in einer verminderten Zahl von Knochenvorläuferzellen und von Osteoblasten (Nimni et al. 1993).
Es gibt keine geläufige Behandlung für einen Verlust der Knochenmasse, einschließlich verschiedener Wachstums-fördernder Proteine und Vitamin D₃. In ähnlicher Weise gibt es keinen wirksamen Ersatz oder Implantat für nicht verbundene Frakturen oder Bruchverletzungen der Knochen. Gegenwärtig werden bei dem letzten Typ von Verletzung bovine (Kuh) oder humane Leichenknochen verwendet, die chemisch behandelt sind (um Proteine zu entfernen), um eine Abstoßung zu verhindern. Während solche Knochenimplantate mechanische wichtig sind, sind sie biologisch tot (sie enthalten keine Knochen-bildenden Zellen, Wachstumsfaktoren oder andere regulatorische Proteine). Somit beeinflussen sich den Heilungsprozess nicht wesentlich. Alle diese Bedenken zeigen den große Bedarf für neue Formen der Knochentherapie.
Die Knochenentwicklung resultiert aus der Proliferation der Mesenchymzellen, ihrer Differenzierung in Osteogene Progenitorzellen, und schließlich zu Calcifizierung des Knorpels und der extrazellulären Knochenmatrix (Urist et al., 1983). Humanes Knochenmark enthält eine distinkte Zellpopulation, die Knochenproteine exprimieren und auf den Wachstumsfaktor β1 (TGF-β) aber nicht auf den hämatopoetischen Wachstumsfaktor anspricht (Long et al., 1990).
Es gibt wenig Informationen bezüglich der Wachstumsfaktoren oder der Cytokine, die die Entwicklung der Knochenvorläuferzellen (Osteoprogeniturzellen und Präosteoblaste) in ihre differenzierte Nachkommenschaft, die Osteoblasten. In ähnlicher Weise betreffen wenige Studien den Einfluss der extrazellulären Matrixmoleküle (ECM) auf dieser Stufe der Entwicklung humaner Knochenzellen, oder den Einfluss des Alterns auf beide dieser Gebiete. In der Vergangenheit war es technisch schwierig, humane Knochenzellen (sowohl Vorläuferzellen als auch Osteoblasten) zu gewinnen, und es gab wenig Studien und Protokolle zur Reinigung/Charakterisierung. Zusätzlich sind die geläufigen in vitro Modelle der Knochenbildung beschränkt, da die Verwendung von post-fetalen Mesenchymgewebes, um Knochenzellen zu erzeugen, oft in einer Chondrogenese resultiert, aber für die Osteogenese ungeeignet ist (Urist et al. 1983). Somit sind Informationen bezüglich der zellulären Aktivierungssignale, der Differenzierung und der Knochenmatrixproduktion währen der frühen Phase der Entwicklung der humanen Knochenzellen bestenfalls beschränkt.
Die Regulation der chondro-osteogenen Genaktivierung wird währen der Knochenmorphogenese durch Akkumulierung extrazellulärer und intrazellulärer Signale induziert (Urist et al., 1983). Bedeutsam ist, dass von extrazellulären Signalen bekannt ist, dass sie sowohl von Cytokinen als auch extrazellulären Matrixmolekülen auf reagierende Zelloberflächenrezeptoren übertragen werden (Urist et al., 1983), was schließlich in der Knochenbildung resultiert. Die Knochenbildung erfolgt über zwei Mechanismen. Direkte Entwicklung der Knochen aus Mesenchymzellen (wird als intramembrane Ossifikation bezeichnet; wie es bei der Schädelbildung beobachtet wird) erfolgt, wenn Mesenchymzellen direkt in Knochengewebe differenzieren. Der zweite Typ der Knochenbildung (die endochondrale Knochenbildung der Skelettknochen) erfolgt über ein intervenierendes Knorpelmodel.
Die Entwicklung und das Wachstum der langen Knochen resultiert somit aus der Proliferation der Mesenchymzellen, ihre Differenzierung in osteogene Progenitorzellen, und (dann) Osteoblasten, Knorpelabscheidung und schließlich Kalkbildung des Knorpels und/oder der Knochenmatrix. Gleichzeitig wird der Knochen umgebaut, um einen tubulären Knochenraum zu bilden, in dem die hämatopoetische Zelldifferenzierung erfolgt.
Interessanterweise scheint die Zahl der Osteoprogenitorzellen in Knochen Erwachsener zu klein zu sein, um die gesamte große Knochenmasse zu ersetzen, die normalerweise währen des Alterungsprozesses des Skeletts umgebaut wird (Urist et al., 1983). Weitere Beobachtung (vide infra) bestätigen dieses Konzept indem gezeigt wird, dass eine (unerwartete) Quelle der Osteoprogenitorzellen das Knochenmark ist. Die verminderte Zahl der Progenitorzellen impliziert auch, dass eine Disassoziierung der Erholung der Knochenprogeniturzellen von der nachfolgenden osteogenen Aktivierung und Knochenablagerung vorliegt, und weiter werden multiple Stufen der Regulation dieses Prozesses vermutet.
Einer der zentralen Punkte bezüglich der Knochenbildung betrifft die Entwicklungslinie der Knochenzelltypen, nämlich Osteoblasten und Osteoclasten. Es gibt adäquate Hinweise, die vermuten lassen, dass Osteoblasten aus lokalen Mesenchymellpopulationen entstehen, und dass Osteoclasten von im Blut entstandenen Monozyten/Makrophagen-Zellen stammen.
Fishman und Haye zeigten zuerst, dass Monozyten fusionieren, um beim Regenerieren von Molchgliedern Osteoblasten zu bilden (Fishman et al., 1962). Obwohl die Rolle der Makrophagenfusion kontrovers bleibt (Hattersley et al., 1989 und Horton et al., 1985), wurden weitere Hinweise für den im Blut gebildeten Ursprung der Osteoclasten in bahnbrechenderweise von LeDourarin unter Verwendung eines Huhns gefunden: Wachtelchimären, in der die Zellmorphologie eine klare Unterscheidung der Zellabstammung ermöglicht. Diese Studien zeigen überzeugend, dass Osteoblasten und Osteozyten von Gliedmaßknospen des Mesenchyms stammen, wohingegen Osteoclasten aus im Blut gebildeten hämatopoetischen Zellen entstehen (Joterau et al., 1978 und Le Douarin, 1973). Die Bedeutung dieser Beobachtungen wurde nachfolgend durch die erfolgreiche Heilung (durch Osteocalsten) der Osteoporose unter Verwendung von Knochenmarkstransplantationen in sowohl Tieren (Ash et al., 1980) als auch Menschen (Coccia et al., 1980) gezeigt. Während solche Daten überzeugend den hämatogenen Ursprung der Osteoclasten zeigt, existieren wenig Kenntnisse über die Natur und den Ort der Stammzellpopulation(en), die zur Differenzierung in die Knochen-bildenden Osteoblasten fähig sind.
Long et al. beschreibt in einem im Journal of Bone Mineral Research 8(1) auf Seite 363 veröffentlichten Abstrakt die immunologische Trennung von Knochenmark-NALD-Zellen unter Verwendung von Antikörpern gegen Knochenproteinen. Simmons et al. beschreibt die Isolierung eines CD34-cDNA-Klons, der für ein Sialomucin der humanen hämatopoetischen Stammzellen kodiert, aus KG-1-RNA. Malaval et al., (1994) J. Cell Physiol. 158(3): 555–572 beschreibt zeitliche und räumliche Änderungen in der Expression von Osteoblastenmarkern. In kürze dargestellt wurde für Osteocalcin mRNA-Niveaus beobachtet, um zusammen mit der Entwicklung der Knochenknötchen und Zellen in frühen Kulturen wurden gefunden, dass sie schlecht mit Osteonectin gefärbt werden. Chiba und Matsuyama (1993) Nippon Seikeigeka Gakki Zasshi 67(5):463–472 vermuten eine Beteiligung von Osteonectin bei der Calcifizierung von normalen und tumorösen Knorpelgewebe. Turksen et al. (1992) offenbart monoklonale Antikörper gegen alkalische Phosphatase, die sowohl Präosteoblasten als auch Osteoblasten identifiziert.
Wie anderes sich entwickelndes Gewebe, reagieren Knochen auch Knochen-spezifische und andere lösliche Wachstumsfaktoren. TGF-β ist ein Mitglied der Familie der Polypeptidwachstumsregulatoren, die das Zellwachstum und die Differenzierung während des Entwicklungsprozesses beeinflussen; wie Embryogenese und Gewebewiederherstellung (Sporn et al., 1985) TGF-β inhibiert die Proliferation normaler und von Tumor-stammenden Epithelzellen stark, blockiert Adipogenese, Myogenese und Hämatopoese (Sporn et al., 1985). Im Knochen ist TGF-β jedoch ein positiver Regulator.
TGF-β ist im aktiven Zentrum der Knochendifferenzierung (Knorpelkanäle und Osteozyten) lokalisiert (Massague, 1987), und TGF-β wird in großen Mengen in Knochen gefunden, was vermuten läss, dass Knochen die größte Gesamtmenge an TGF-β enthalten (Massague, 1978 und Gehron Robey et al., 1987). Währen der Knochenbildung erhöht TGF-β auch die Chondrogenese (Massague, 1987), ein Effekt, der vermutlich auf seine Fähigkeit bezogen ist die Ablagerung der Extrazellulärmatrix(ECM)-Komponenten zu stimulieren (Ignotz et al., 1986). Neben der Stimulierung der Knorpelbildung wird TGF-β in Knochenzellkulturen synthetisiert und abgesondert, und es stimuliert das Wachstum der sub-confluenten Schichten fetaler boviner Knochenzellen, womit gezeigt wird, dass es ein autokriner Regulator der Knochenzellentwicklung ist (Sporn et al., 1985).
Zusätzlich zu TGF-β sind andere Wachstumsfaktor oder Cytokine an der Knochenentwicklung beteiligt. Urist und Mitarbeiter waren in der Lage, verschiedene regulatorische Proteine zu isolieren, die sowohl in vivo als auch in vitro Modellen funktionieren (Urist, et al., 1983). Knochenmorphogene Proteine (BMP), ursprünglich ein Extrakt der deminerslisierten humanen Knochenmatrix, wird nun kloniert (Wozney et al., 1988), und wenn sie in vivo implantiert werden, ergeben sie eine Abfolge von Ereignissen, die zur funktionalen Knochenbildung führen (Wozney et al., 1988 und Muthukumaran et al., 1985). Der Implantation von BMP folgt die Mesenchymzellmigration in Gebiete des Implantats, die Differenzierung in Knochenprogenitorzellen, Ablagerung neuer Knochen und nachfolgender Knochenumbau, wodurch die Anlage von Knochenmark ermöglicht wird (Muthukumaran et al., 1985).
Es existiert eine Anzahl zusätzlicher Wachstumsfaktoren, die die Knochenentwicklung regulieren. Insbesondere stimuliert der vom Konchen stammende Wachstumsfaktor (bonederived growth factor (BDGF)) Knochenzellen zum Proliferieren in Serum-freiem Medien (Hanamura et al., 1980 und Linkhart et al., 1986). Diese Faktoren scheinen jedoch bei verschiedenen Niveaus von BMP zu wirken (Urist et al., 1983).
Die Extrazellulärmatrix (ECM) variiert in seiner Gewebezusammensetzung im Körper, wobei es aus verschiedenen Bestandteilen, wie Kollagen, Proteoglycan und Glykoprotein, besteht (Wicha et al., 1982). Eine Vielzahl von Studien zeigen den Einfluss von ECM bei der Begünstigung der zellulären Entwicklung. Gospodarowicz et al., zeigen, dass ECM, die natürliche Substanz, die die Zellen in vivo umgibt, deutlich die Cornealepithelzellproliferation in vitro beeinflusst (Gospodarowicz und Ill, 1980 und Gospodarowicz et al., 1980). Untersuchungen von Reh et al., zeigen, dass die extrazellulären Komponenten, wie Laminin, bei der induktiven Interaktion beteiligt sind, die die Retina und das Retina-pigmentiert Endothel bilden. Die Differenzierung und das Wachstum der Brustepithelzellen werden deutlich durch ECM-Komponenten beeinflusst, und Brust-Zellwachstum in vivo und in vitro erfordert Kollagen vom Typ IV (Wicha et al., 1982). Schließlich zeigen Untersuchungen von einem der Laboratorien der Erfinder, dass ECM von Knochenmark eine bedeutende Rolle bei der Hämatopoese dahingehend spielen, dass komplexe ECM-Extrakte deutlich die Zellproliferation verbessern (Campbell et al., 1985), und dass vom Mark stammende ECM spezielle Cytoadhäsionsmoleküle enthalten (Campbell et al., 1987; Campbell et al., 1990, Long und Dixit, 1990; Long et al., 1990 und Long et al., 1992).
Eine Anzahl nicht-kollagener Matrixproteine, die aus demineralisierten Knochen isoliert wurden, sind an der Knochenbildung beteiligt. Von Osteonectin ist ein 32 kDa Protein, das an Calcium, Hydroxylapatit und Kollagen bindet, von ihm wird angenommen, dass es die Nukleation während der Mineralphase der Knochenlagerung initiiert (Termine et al., 1981). In vivo Analyse des Osteonectin-Signals zeigte seine Anwesenheit in einer Vielzahl von entwickelnden Gewebe (Nomura et al., 1988 und Holland et al., 1987). Es liegt jedoch in den größten Mengen in Knochen des axialen Skeletts, des Schädels und den Blutplättchen (Megakaryozyten) vor (Nomura et al., 1988).
Das Knochen-gla-Protein (BGP, Osteocalcin) ist ein Vitamin K-abhängiges, 5700 Da Calcium-bindendes Knochenprotein, das für Knochen spezifisch ist und die Ca²⁺- Ablagerung (Termine et al., 1981; Price et al., 1976 und Price et al., 1981) regulieren kann. Andere Knochenproteine scheinen als Cytoadhäsionsmoleküle zu funktionieren (Oldberg et al., 1981 und Somerman et al., 1987) oder haben unaufgeklärte Funktionen (Reddi, 1981).
Während die Knochenmorphogenese ECM-abhängig ist, enthalten Knochen-ECM auch eine Anzahl an üblicheren mesenchymalen Wachstumsfaktoren, wie PDGF, basische und saure Fibroblastenwachstumsfaktoren (Urist et al., 1983; Linkhart et al., 1986; Hauschka et al., 1986 und Canalis et al., 1985). Diese Aktivitäten sind dazu fähig, die Proliferation mesenchymaler Zielzellen (BALB/c 3T3 Fibroblasten, kapillare Endothelzellen und fetale Rattenosteoblasten) zu stimulieren. Des weiteren existieren knochenspezifische Proliferationsaktivitäten, wie BMP in Knochen-ECM.
Während diese allgemeinen und spezifischen Wachstumsfaktoren unzweifelhaft eine Rolle bei der Knochenbildung spielen, wird wenig bezüglich der direkten induktiven/permissiven Kapazität von Knochen-ECM oder Knochenproteinen selbst auf humane Knochenzellen oder ihre Vorläufer verstanden. Noch wird die Rolle von Knochen-ECM in vorliegenden Wachstumsfaktoren verstanden – so können „Matricin"(Faktor: ECM)-Wechselwirkungen eine fundamentale Wichtigkeit bei der Knochenzellenentwicklung haben, aber sie wurden nicht gut charakterisiert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Isolation, Reinigung und Charakterisierung von Vorläufern der Osteoblasten bereit. Immunologische Trennung von nicht-adhärenten Knochenmarkszellen niedriger Dichte ergibt eine deutliche Anreicherung der Knochenvorläuferzellen, die Osteocalcin, Osteonectin und alkalische Phosphatase expimieren.
Nachfolgend bezieht sich jeder Verweis auf Stammzellen nicht auf embryonale Stammzellen.
Die Knochenvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung sind, auch wenn sie aus Knochenmark isolierbar sind, nicht Teil des Knochenmarkstromazellkompartiments, noch sind sie eine Komponente der hämatopoetischen Zelllinie. Das Fehlen der Natur als Stommzellen wird durch gezeigt, dass das Isolieren dieser Zellen aus humanen Stromazellisolaten und physikalische Zelltrennung durch Dichtezentrifugation fehl schlägt. Diese Zellen sind nicht hämatopoetisch, was dadurch gezeigt wird, dass die Expression des pan-hämatopoetischen Zellantigens CD34 und das Ansprechen auf hämatopoetische Wachstumsfaktoren fehl schlägt.
Zusätzlich zu anderen unterscheidenden Faktoren, ist die vorliegende Erfindung vom Stand der Technik dahingehend verschieden, dass die Untersuchungen im Stand der Technik im Allgemeinen auf osteogene Kulturen beschränkt sind, in denen Knochenzellen in vom Knochenmark stammenden Stromazellenpopulationen beobachtet werden (Gronthos et al., 1994; Friedenstein et al., 1987; Luria et al., 1987; Turksen und Aubin, 1991; Van Vasselaer et al., 1994). Ausgehend von der kombinierten physikalischen und immunologischen Trennung, die hier offenbart ist, stellt die vorliegende Population von Knochenvorläuferzellen eher eine frühe Stufe der Knochenvorläufer als die des Standes der Technik dahingehend dar, dass die vorliegended immun-isolierten Zellen nicht eng mit der Endostealoberfläche des Trabeculas des Kochenmarks assoziiert ist.
Durchflusszytrometrische Analysen zeigen, dass verschiedene Zellsubpopulationen unter diesen isolierten Zellen existieren. Der Hauptteil des Knochenproteins, der Antigen-positiven Zellen, sind Präosteoblasten, etwa in der Größe einer Lymphozyte, wohingegen andere Antikörper-getrennte Subpopulationen aus Osteoblasten und Osteoprogenitorzellen bestehen. In Serum-freien Kulturen stimuliert TGF-β die kleinen, Antigen-positiven Zellen, wodurch sie Osteoblasten werden, da diese Zellen sowohl in der Größe als auch in der zellulären Komplexität zunehmen und erhöhte Mengen Osteocalcin und alkalische Phosphatase exprimieren.
Antikörper-getrennte Zellen enthalten auch eine getrennte Population von Progenitorzellen, die Kolonien von Osteoblastenzellen bilden, wenn sie in Serum-freiem, halb festen Medium kultiviert werden. Zwei Arten dieser Osteoprogenitorzellen weden beobachtet: eine Kolonie-bildende Zelle (CFC), die mehrere hundert Antigen-positive Knochenzellen bildet, und eine eher reife Cluster-bildende Zelle, die ein geringeres Proliferationspotential besitzt und somit Cluster von 20–50 Antigen-positive Zellen bildet.
Osteopoetische Kolonie-bildende Zellen und Cluster-bildende Zellen haben ein obligatorisches aber verschiedenes Erforderniss für oeteogene Wachstumsfaktoren. Die CFCs reagieren auf TGF-β, den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), das Knochen-morphogenes Protein-2 (BMP-2) und 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 (1,25-OH D3). Im Unterschied zu den Kolonie-bildenden Zellen, werden die Cluster-bildenden Zellen hauptsächlich durch 1,25-OH D3 und TGF-β reguliert, aber sie reagieren nicht auf bFGF.
Die Erfinder definierten somit, dass humanes Knochenmark eine nicht-hämatogene heterogene Population von Knochenvorläuferzellen enthält, unter denen eine Population proliferierender Osteoprogenitorzellen existiert. Die vorliegende Bestimmung dieser Knochenvorläuferzellpopulation in ausreichender Zahl erlaubt die Bewertung ihrer Rolle bei der Osteogenese sowohl bei Gesunden als auch bei Kranken.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer angereicherten Population von Knochenvorläuferzellen bereit. Das Verfahren umfasst die in den Ansprüchen spezifizierten Schritte:

(a) Erhalten einer Zellpopulation, die Knochenvorläuferzellen umfasst;
(b) Anreichern der Population für Knochenvorläuferzellen durch Aussetzen der Zellpopulation einem Knochenvorläuferzell-Antikörper, der mit einem Knochenvorläuferzell-Antigen immunreaktiv ist, und
(c) Entfernen der Zellpopulation, die mit den Knochenvorläuferzell-Antikörper nicht immunreagiert.

Die Zellpopulation, die die Knochenvorläuferzellen umfasst, kann eine Population von Knochenvorläuferzellen, eine Population von aus Knochen isolierten Zellen oder eine Population peripherer Blutzellen sein.
Knochenvorläuferzellen könne weiterhin durch Gleichgewichtsdichtezentrifugation der Population des Knochenmarks oder der peripheren Blutzellen angereichert werden. Gleichgewichtsdichtezentrifugation der Zellpopulation stellt Knochenmarkszellen niedriger Dicht bereit, die mit Knochenvorläuferzellen mit einer Dichte zwischen etwa 1,050 und etwa 1,090 m/cm³, vorzugsweise zwischen 1,060 und 1,085 m/cm³.
In einem anderen Aspekt können Stromazellen, die vorliegen, z.B. in Knochenmarkszellen, dadurch entfernt werden, dass die Knochenmarkszellen einer adhärenten Oberfläche, typischerweise eine Zellkulturplastik oder ein Zellkulturglass, ausgesetzt werden.
In einem noch anderen Aspekt wird die angereicherte Population an Knochenvorläuferzellen weiter nach der Größe fraktioniert. In einer Ausführungsform kann die Grössenfraktionierung durch Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrie, Geschwindigkeitssedimentation oder Gegenfluss-Zentrifugation-Elutration erfolgen. Knochenvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung haben im allgemeinen durchschnittliche Durchmesser von zwischen etwa 8 μm bis etwa 70 μm, und vorzugsweise von zwischen etwa 10 μm und etwa 20 μm.
Antikörper werden verwendet, um die Population der Knochenvorläuferzellen anzureichern. Geeignete Antikörper umfassen jeden mit Knochenvorläuferzellen immunreaktiven Antikörper. Knochenvorläuferzellen-Antikörper, die von der vorliegenden Erfindung erwogen werden, umfassen Anti-Osteocalcin, Anti-Osteonectin und Anti-alkalische Phosphatase aus Knochen.
Physiko-chemische Trenntechniken, wie Gleichgewichtsdichtezentrifugation, kann eingesetzt werden, um eine moderate Anreicherung der Knochenvorläuferzellen zu erhalten, z.B. auf ein Niveau von etwa 6–7 % Reinheit. Dichtetrennung und Anhaften an Plastik werden eingesetzt, um die Reinheit solcher Zellen weiter zu erhöhen.
Einen signifikanten Beitrag der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Immuntrenntechniken, um im wesentlichen gereinigte Populationen zu erhalten. Der Einsatz der Immunadhärenztrennung erzeugt im wesentlichen reine Populationen humaner Knochenvorläuferzellen. Wie es hier verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck „im wesentlichen rein" eine Population von Knochenvorläuferzellen, die zwischen etwa 60 % und etwa 80 % rein sind. Eine immunmagnetische Trennung, vorzugsweise unter Verwendung von Anti-Osteonectin- und Anti-Osteocalcin-Antikörper, ergibt eine nahezu homogene oder im wesentliche reine Population von Knochenvorläuferzellen. Der Ausdruck „im wesentlichen rein", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Population von Knochenvorläuferzellen, die etwa 95 % rein ist.
Unter Verwendung eines zweiten Antikörpers, der mit einem Knochenvorläuferzell-Antikörper immunreaktiv ist, wird somit eine erhöhte Anreicherung der Population der Knochenvorläuferzellen erreicht. In einer Ausführungsform werden Antikörper an ein festes Substrat, einschließlich Zellkulturplastik, Agarose oder andere Plastiks, Polyacrylamid oder magnetische Teilchen konjugiert.
Eine Population von Knochenvorläuferzellen, die etwa 100-fach oder mehr gegenüber dem Ausgangsmaterial angereichert ist, d.h. gegenüber den Knochenmarkszellen oder den peripheren Blutzellen, die die Knochenvorläuferzellen umfassen, wird beschrieben. Bevorzugter ist die Population der Knochenvorläuferzellen zwischen etwa 1 000-fach und etwa 2 000-fach oder zwischen etwa 2 000-fach und etwa 3 000-fach, oder zwischen etwa 3 000-fach und etwa 4 000-fach gegenüber der Ausgangszellpopulation angereichert, wobei eine Anreicherung von bis zu 4 800-fach erreichbar ist.
In einer Ausführungsform werden Knochenvorläuferzellen aus Säugern durch die vorliegend Erfindung in Betracht gezogen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Knochenvorläuferzellen von humanen Knochenvorläuferzellen in Betracht gezogen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, die Knochenvorläuferzellen umfasst. Knochenvorläuferzellen, wie die hier bereitgestellten, haben die folgenden Eigenschaften:

(a) sie sind immunreaktiv gegen Knochenvorläuferzell-Antikörper;
(b) sie haben einen durchschnittliche Zelldurchmesser von 8 μm bis 70 μm, und
(c) sie differenzieren in Osteoblasten nach Aussetzen mit dem Gewebewachstumsfaktor β, 1,25-OH Vitamin D3, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor oder Knochen-morphogenes Knochenprotein-2.

In einem Aspekt kann die Knochenvorläuferzellen umfassende Zusammensetzung, wie sie vorstehend beschrieben ist, aus Säugerknochen, Knochenmark oder peripheren Blutzellen hergestellt werden. Knochenvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung umfassen immunreaktive Anti-Osteocalcin-, Anti-Osteonectin- oder Anti-alkalische Phosphatase-Zellen aus Knochen. In einer Ausführungsform exprimieren die Knochenvorläuferzellen Osteocalcin, Osteonectin oder alkalische Phosphatase, aber kein pan-hämatopoetisches Antigen CD34. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Knochenvorläuferzellen Osteoprogenitrozellen und Prästeoblasten.
In einem noch anderen Aspekt wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Differenzieren einer Knochenvorläuferzelle in einen Osteoblasten bereitgestellt. Das Verfahren umfasst im allgemeinen folgende Schritte:

(a) Erhalten einer Population von Knochenvorläuferzellen gemäß dem in Übereinstimmung mit Anspruch 15 vorstehend beschriebenen Verfahren;
(b) Aussetzen der Knochenvorläuferzelle einem Wachstumsfaktor, und
(c) Kultivieren der Knochenvorläuferzellen unter Serum-freien Bedingungen, wodurch die Knochenvorläuferzelle in Osteoblaste differenzieren.

In Betracht gezogene Wachstumsfaktoren umfassen den Transformationswachstumsfaktor β, den Insulin-like Wachstumsfaktor (IGF) und den Platelet-abgeleiteten Wachstumsfaktor (AA-, A/B- und BB-Isoformen), 1,25-OH-Vitamin D3, basischen Fibroplastenwachstumsfaktor oder das Knochen-motphogenes Protein. In einer Ausführungsform wird eine Knochenvorläuferzelle einem einzelnen Wachstumsfaktor ausgesetzt. Alternativ kann eine Knochenvorläuferzelle zwei oder mehr Wachstumsfaktoren ausgesetzt werden.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Differenzieren einer Knochenvorläuferzelle in Osteoblasten weiterhin das Kultivieren der Knochenvorläuferzelle in Gegenwart von Kollagen vom Typ I, Fibrinogen, Fibrin, Virtonectin, Thrombospondin, Osteocalcin oder Osteonectin. In einer Ausführungsform weden die Konchenvorläuferzellen in Gegenwart von typ I-Kollagen, Fibrinogen und Fibrin kultiviert. In einer alternativen Ausführungsform werden die Knochenvorläuferzellen in Gegenwart von Kollagen vom Typ I, Fibrinogen, Fibrin, Vitronectin, Thrombospondin, Osteocalcin und Osteonectin kultiviert.
Diagnostische und prognostische Verfahren werden ebenso beschrieben wie Verfahren zum Identifizieren eines Subjekts bezüglich des Risikos, eine altersbezogene Knochenkrankheit zu entwickeln, wobei das Verfahren im allgemeinen die Schritte umfasst:

(a) Erhalten einer Population von Zellen des Subjekts, wobei die Population an humanen Knochenvorläuferzelle angereichert wird und
(b) Quantifizieren der Menge eines Knochenvorläufer-bezogenen Proteins, wie z.B. Osteocalcin oder Osteonectin, die von den Knochenvorläuferzellen exprimiert werden, wobei eine erhöhte oder anderweitig veränderte Proteinmenge im Vergleich zu der Menge innerhalb der Knochenvorläuferzelle eines jungen oder mittelalten Subjekts das Risiko eines Subjekts anzeigt, eine altersbezogene Knochenerkrankung, wie Osteoporose, zu entwickeln.

Ein Beispiel dieses Verfahrens umfasst die Schritte:

(a) Erhalten einer Population von Zellen aus dem Subjekt, wobei die Population an humanen Knochenvorläuferzellen angereichert ist und
(b) Quantifizieren der Menge an Osteocalcin oder Osteonectin, die von den Knochenvorläuferzellen exprimiert werden, wobei eine erhöhte Menge an Osteocalcin oder Osteonectin im Vergleich zu der Menge in den Knochenvorläuferzellen eines jungen oder mittelalten Subjekts das Risiko anzeigt, eine altersbezogene Knochenerkrankung, wie Osteoporose, zu entwickeln.

Diese Verfahren beruhen im Allgemeinen auf dem Ergebnis, dass Osteonectin- und Osteocalcin-Antigenexpression durch humane Präosteoblastenzellen sich mit zunehmenden Alter in einer statistisch signifikanten Weise erhöht. Die Osteonectinexpression ist insbesondere in älteren Subjekten (ein Anstieg von 59 auf 89 arbiträren Log-Einheiten) erhöht.
Verfahren zur Diagnose einer besonderen Gruppe oder einer Subgruppe älterer Subjekte, die bestimmte Arten von Knochenerkrankungen oder -störungen aufweisen oder ein Risiko zur Entwicklung dafür besitzen, insbesondere Osteoporose oder Osteopenie oder eine andere aus der Gruppe der Knochenstörungen, die mit einem zunehmenden Alter verbunden sind, werden beschrieben. Diese Verfahren umfassen im allgemeinen:

(a) Erhalten einer Population von Zellen aus älteren Subjekten, wobei die Population an humanen Knochenvorläuferzellen angereichert ist, und
(b) Quantifizieren der Menge des Osteocalcins oder des Osteonectins, das von den Knochenvorläuferzellen exprimiert wird, wobei eine verminderte Menge an Osteocalcin oder Osteonectin im Vergleich zur durchschnittlichen Menge in den Knochenvorläuferzellen von älteren Subjekten anzeigt, dass ein älteres Subjekt eine besondere Art der Osteoporose, Osteopenie oder mit dem Alter verbundene Änderungen der Knochenbildung hat

Über vermindert Mengen an Osteocalcin und Osteonectin und besonders verminderte Mengen an Osteonectin in älteren Subjekten wurde gefunden, dass sie für ältere Subjekt mit einer besonderen Art von Osteoporose, Osteopenie oder einer anderen Störung anzeigt, die mit mit dem Alter verbundenen Änderungen in der Knochenbildung assoziiert ist, wie die Individuen, die eine ernstere Form der Osteoporose haben.
Dies basiert auf der Entdeckung der Erfinder, dass der Hauptteil der Knochenvorläuferzellen einer bestimmten Untergruppe von älteren Subjekten zu einer antigenschwachen Population gehört. Da ältere Subjekt mit Knochenstörungen allgemein in zwei Hauptgruppen charakterisiert werden können und da die erfindungsgemäßen Verfahren im Allgemeinen es ermöglichen, zwei Hauptypen von Knochenvorläuferzelle zu identifizieren (eine davon ist die antigenschwache Population), ist der diagnostische Nutzen der Erfindung bei der Unterscheidung zwischen diesen Gruppen evident.
In jeder der diagnostischen und prognostischen Verfahren wird die Zusammensetzung, die die Knochenvorläuferzelle enthält, im Allgemeinen wie vorstehend beschrieben hergestellt und kann aus humanem Knochenmark oder peripheren Blutproben erhalten werden. Der Anreicherungsschritt des Zellpreparationsverfahrens wird vorzugsweise eine signifikant gereinigte humane Knochenvorläuferzellpopulation bereitstellen, wird noch bevorzugter einen immunmagnetischen Reinigungsschritt umfassen, und wird am bevorzugtesten einen immunmagnetischen Reinigungsschritt unter Verwendung von Anti-Osteocalcin- und/oder Anti-Osteonectin-Antikörper einschließen.
Das bevorzugteste Verfahren zur Quantifizierung der Menge der Osteocalcin- und Osteonectin-Expression ist die Verwendung der Fluoreszenz-aktivierten Durchflusszytometrie. Die Verwendung anderer immunologischer Verfahren, wie RIA und ELISA und dergleichen werden sicherliche erwogen; so wie die Verwendung molekularbiologischer Methoden, die auf der Hybridisierung von DNA-Segmenten, Sonden und Primern, die Osteocalcin- oder Osteonectin-Sequenzen umfassen, basieren.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die folgenden Abbildungen sind Teil der vorliegenden Beschreibung und sind enthalten, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung weiter zu zeigen. Die Erfindung kann besser unter Bezugnahme auf eine oder mehrere der Zeichnungen in Verbindung mit der detailliert Beschreibung der hier vorliegenden spezifischen Ausführungsformen verstanden werden.
1 zeigt in vier Abbildungen die Durchflusszytometrieanalyse immun-adhärenter vom Knochenmark abgeleiteter Knochenvorläuferzelle. Die eingekreisten Gebiete stellen größere Osteoblasten dar. 1A zeigt Zellen, die Osteocalcin exprimieren. 1B zeigt Zellen, die alkalische Phosphatase aus Knochen exprimieren. 1C zeigt die Differenzierung von Knochenvorläuferzellen, die Osteocalcin in Osteoblasten exprimieren. 1D zeigt die Differenzierung von Knochenvorläuferzellen, die alkalische Phosphatase aus Knochen exprimieren.
2 zeigt in zwei Abbildungen die in vitro Expansion von TGF-β-stimulierten Osteoblasten, die vom Knochenmark stammen. 2A zeigt die Zunahme der Häufigkeit der Osteoblasten nach sieben Tagen in Kultur in Gegenwart von TGF-β. 2B zeigt die Zunahme der Gesamtzahl der Osteoblasten nach sieben Tagen in Kultur in Gegenwart von TGF-β.
3 zeigt in zwei Abbildungen zwei Photographien Osteoprogenitorkolonien, die von humanem Knochenmark stammen. 3A ist eine Photographie der Nachkommen der Osteoprogenitorcluster-bildenden Zellen. 3B ist eine Photographie der Nachkommen von Osteoprogenitorkolonie-bildenden Zellen.
4 zeigt in zwei Panelen das Ansprechender der Kolonie-bildenden und der Cluster-bildenden Osteoporgenitorzellen auf verschiedene Wachstumsfaktoren. 4A zeigt den Effekt der markierten Wachstumsfaktoren auf Cluster-bildende Osteoprogenitorzellen. 4B zeigt den Effekt der markierten Wachstumsfaktoren auf die Kolonie-bildenden Osteoprogenitorzellen.
5 zeigt in drei Abbildungen die immunphänotypische Charakterisierung humaner Präosteoblasten- und Osteoblasten-Zellen. Humane Knochenvorläuferzellen wurden durch immunadhärente oder immunmagnetische Trennung isoliert. Zur Rückauswertung wurden die antigenpositiven Zellen elektronisch markiert (angezeigt durch die quadratischen Bereiche in der Figur), und antigennegative oder schwache Zellen werden in ähnlicher Weise markiert (was durch Kreise in der Figur angezeigt ist; untere Unterabbildung rechts und links). Diese markierten Populationen wurden dann sichtbar gemacht, um ihren Durchlasswinkel(„forward angel")-Charkteristik und die Seitenstreu(„side scatter")-Charakteristik zu zeigen.
5A zeigt in vier Unterabbildungen die Durchlasswinkel-Charkteristik und die Seitenstreu-Charakteristik von nicht induzierten und mit TGF-β induzierten humanen Knochenvorläuferzellen, die durch Immunadhärenz isoliert wurden. Obere Unterabbildunge: Tag 0 (nicht induzierte) immunadhärente Zellen und differenzierte Zellen nach 7 Tagen TGF-β-Stimulation (linke bzw. rechte Unterabbildung). Horizontal gestrichelte Linien repräsentieren die obere Grenze der nicht-spezifischen Fluoreszenz (ungeeignete Antikörper), vertikale Linien repräsentieren die obere 95 % Größengrenze für Input-NALD-Zellen, die beide wie in Long et al., (1995) definiert sind. Untere Unterabbildungen: Rückauswertung antigenmarkierter Zellen, um ihre Durchlasswinkel-Charkteristik und die Seitenstreu-Charakteristik zu zeigen.
5B zeigt in zwei Abbildungen die Durchlasswinkel-Charakteristik und die Seitenstreu-Charakteristik immunmagnetisch gereinigter humaner Knochenvorläuferzelle. Immunmagnetisch getrennte Zellen wurden zwei Farbanalysen der Osteonectin- und Osteocalcin-Expression und einer Rückauswertung unterzogen. Gestrichelte Linien stellen die obere Grenze einer nicht spezifischen Fluoreszenz (ungeeignete Antikörper), wie vorstehend beschrieben, dar und wurden durch Einzelfarbanalyse jedes einzelnen Fluoreszenzsignals bestimmt, was beides hier und in Long et al., (1995) definiert ist.
In 5C zeigt in zwei Abbildungen die Knochenproteinexpression und phänotypische Analyse humaner Knochenvorläuferzellen aus einer Unterpopulation älterer Individuen. Unter den 17 Individuen im Alter ≥ 60 Jahre waren 3 Frauen (im Alter von 60, 88 und 89 Jahren) und 1 Mann, die ein deutlich verschiedenes Präosteoblastenantigenprofil zeigten. Diese Individuen zeigten eine vorwiegende Zellpopulation, die antigenschwach war (linke Abbildung). Die Rückauswertung dieser Zelle zeigte jedoch, dass sie ähnliche Durchlasswinkel-Charakteristik und die Seitenstreu-Charakteristik bezüglich humaner Knochenvorläuferzelle aus einer altersabgestimmten Kohorte haben, wobei aber hohe Zahlen der ON⁺⁺ und OC⁺⁺-Glanz(„bright")-Zellen fehlen. Ein einzelnes Individuum (Alter 89) aus der Gruppe ist gezeigt.
6 zeigt in zwei Abbildungen die Coexpression von Osteonectin und Osteocalcin durch eine gereinigte Population humaner Knochenvorläuferzelle. Humane Knochenvorläuferzellen wurden mittels einer kombinierten physiko-chemischen Trennung (Dichte und Plastikadhärenz) und immunmagnetische Trennung gereinigt und dann simultan mit Antikörper gegen Osteonectin und Osteocalcin inkubiert. 6A zeigt, dass die zwei ersten physikalischen aus einem Trennschritte in einer moderaten Anreicherung der gegen Knochenantigen-positiven Zellen resultiert. 6B zeigt, dass die immunmagnetische Trennung in eine im wesentlichen Antigen-reine Zellpopulation resultiert, die Osteonectin und Osteocalcin coexprimiert. 6A und 6B sind in vier Quadranten geteilt, die im Text nummeriert sind und auf die Bezug genommen wird.
7 zeigt in zwei Abbildungen die Expression von Osteonectin und Osteocalcin in jüngeren und älteren Individuen. 7A zeigt gereinigte humane Knochenvorläuferzelle, die hinsichtlich Osteocalcin beurteilt wurden. 7B zeigt gereinigte humane Knochenvorläuferzellen, die hinsichtlich Osteonectin beurteilt wurden. Knochenproteinexpression durch humane Präosteoblastenzellen aus einem einzelnen repräsentativen jungen Individuum (9 Jahre alt) wird durch das offene Profil und ein repräsentatives älteres Individuum durch ein schattiertes Profil angezeigt. Diese Individuen wurden als repräsentativ ausgewählt, da ihre mittlere spezifische und Peak-Fluoreszenzwerte mit dem Durchschnitt ihrer Alterskohorte identisch waren, und ihre Varianzkoeffizienten waren ähnlich.
8 zeigt in einer einzigen Abbildung altersabhängige Änderungen in der mittlere spezifischen Fluoreszenz von Osteonectin und Osteocalcin. Einzelne Farbantigeneprofile der gereinigten humanen Knochenvorläuferzellpopulation wurden verwendet, um die mittleren spezifische Fluoreszenz zu bestimmen. * = p ≤ 0,05, Student's t-Test, zweifach ausgeführt.
9 zeigt in einer einzelnen Abbildung die altersbezogenen Änderungen in der Knochenproteinexpression. Die mittlere spezifische Fluoreszenz wurde gegen das Alter für jede Gruppe Junger (≤ 25 Jahre alt, mittleres Alter 16,4 +/– 7 (S.D.) Jahre, Bereich 1,5 bis 24 Jahre, n = 15), mittelalte Individuen (mittleres Alter 36,6 +/– 5 Jahre alt, Bereich 26 bis 45 Jahre alt, n = 9) und Ältere (≥ 50 Jahre alt, mittleres Alter 68,8 +/– 7 Jahre, Bereich 53–89 Jahre, n = 13). Kreise: Osteocalcin (BGP), umgekehrte Dreiecke: Osteonectin.
10 zeigt in zwei Abbildungen das Markieren und die Adhäsion humaner Knochenvorläuferzellen gegen Extrazellulärmatrixproteine und Cytokine. Humane Knochenvorläuferzellen wurden durch immunmagnetische Trennung, wie in 6A und 6B beschrieben, gereinigt. Die Zellen wurden dann mit einem „caged" Fluorochrom (Calcein, ein Acetylmethylester-Derivat von Fluorisothiocyanat) markiert. 10A zeigt eine Standardkurve der linearen Beziehung zwischen Fluoreszentintensität und Zellzahl. 10B zeigt die Anbindung humaner Knochenvorläuferzellen, die durch immunmagnetische Trennung gereinigt wurden, die mit Calcein markiert wurden und an Plastik-immobilisierte Proteine anhaften. Die prozentuale Anbindung wurde durch Auslesen der Fluoreszenzsignale der angebundenen Zellen an der Standardkurve von 10A bestimmt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer angereicherten Population von Knochenvorläuferzellen bereit. Das Verfahren umfasst im Allgemeinen die in den Ansprüchen definierten Schritte:

(a) Erhalten einer Population von Zellen, die Knochenvorläuferzellen umfassen;
(b) Anreichern der Population der Knochenvorläuferzelle durch Aussetzten der Zellpopulation gegenüber einem Knochenvorläuferzelleantikörper, der mit einem Knochenvorläuferzelleantigen immunreaktiv ist, und
(c) Entfernen der Zellen der Population, die nicht mit den Knochenvorläuferzelleantikörper immunragieren.

In einer Ausführungsform werden erfindungsgemäß Knochenvorläuferzellen von Säugern in Erwägung gezogen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Knochenvorläuferzelle aus humanen Knochenmarkszellen in Betracht gezogen.
In bestimmten Ausführungsformen können die Knochenvorläuferzelle aus einer Population von Knochenmarkszellen gewonnen werden. In einer anderen Ausführungsform können die Knochenvorläuferzellen aus einer Population von peripheren Blutzellen erhalten werden.
Wie hier verwendet, ist eine Knochenvorläuferzellen jede Zelle, die in der Lage ist, in Osteoblastenzellen zu differenzieren oder zu expandieren. Eine Knochenvorläuferzelle der vorliegenden Erfindung ist nicht hämatopooetisch und exprimiert somit kein pan-hämatopoetisches Antigen CD34. Bevorzugte Knochenvorläuferzellen umfassen Osteoprogenitorzellen, sowohl vom Kolonie-bildenden Zelltyp als auch vom Cluster-bildenden Zelltyp, und Präosteoblastenzellen. Wie in Beispiel 1 beschrieben, kommen die Kolonie-bildenden Osteoprogenitorzellen im Differenzierungsprozess früher als die Cluster-bildenden Osteoprogenitorzellen und Präosteoblastenzell vor.
Knochenvorläuferzellen könne weiter durch Gleichgewichtsdichtezentrifugation der Ausgangszellpopulation angereichert werden. Gleichgewichtsdichtezentrifugation solcher Zellen stellt Zellen niedriger Dichte bereit, die an Knochenvorläuferzellen mit einer Dichte von zwischen etwa 1,050 und etwa 1,090 g/cm³ angereichert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Dichte der Knochenvorläuferzellen zwischen etwa 1,060 und etwa 1,085 g/cm³. In einer Ausführungsform kann die Gleichgewichtsdichtezentrifugation vor dem vorstehenden Antikörperreinigungsschritt (b) durchgeführt werden. In dieser Ausführungsform wird der Antikörperreinigungsschritt an Knochenmarkszellen mit einer Dichte zwischen etwa 1,050 und etwa 1,090 durchgeführt werden. In einer zweiten Ausführungsform kann die Gleichgewichtsdichtezentrifugation nach dem vorstehenden Antikörperreinigungsschritt (b) durchgeführt werden. Alternativ kann der Gleichgewichtsdichtezentrifugations-Reinigungsschritt zweimal durchgeführt werden, einmal vor dem vorstehenden Antikörperreinigungsschritt (b) und einmal nach dem Antikörperreinigungsschritt.
In einem anderen Aspekt kann die Population der Knochenvorläuferzellen durch Entfernen von vorliegenden Stromazellen angereichert werden, z.B. in Knochenmarkszellen. Das Entfernen der Stromazellen kann durch Exponieren z.B. der Knochenmarkszellen gegenüber adhärenten Oberflächen, typischerweise Gewebekulturplastik oder -glass, ausgeführt werden. Stromazellen adhärieren an Gewebekulturplastik oder -glass, während dies Knochenvorläuferzellen nicht tun. Stromazellen könne vor oder nach dem Immunreinigungsschritt entfernt werden. Vorzugsweise werden Stromazellen vor dem Immunreinigugsschritt entfernt. Die Verwendung fester Oberflächen, wie Gewebekulturplastik oder -glass ist wohl bekannt im Stand der Technik. Gewebekulturplasik und -glass kann behandelt werden (z.B. Silikon, Nitrocellulose, Nickel etc.), um die Zelladhäsion zu erhöhen oder zu inhibieren. Behandelte und unbehandelte Oberflächen sind kommerziell erhältlich.
In einem anderen Aspekt wird die angereicherte Population der Knochenvorläuferzelle nach der Größe weiter fraktioniert. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Größenfraktionierung durch Fluoreszenz-aktiviert Durchflusszytometrie erreicht werden. Die Knochenvorläuferzelle der vorliegenden Erfindung besitzen einen durchschnittlichen Durchmesser von zwischen etwa 8 μm und etwa 70 μm. Vorzugsweise haben die Knochenvorläuferzellen einen durchschnittlichen Durchmesser von zwischen etwa 10 μm und etwa 20 μm.
Bemerkenswerterweise zeigt die Verwendung der Multiparameter-Durchflusszytometrie, dass zwei Größenpopulationen unter den immunadhärenten Zellen vorliegen, und der TGF-β-induzierte Differenzierungsprozess ergibt eine Verschiebung zwischen kleinen und großen Zellkompartimenten. Um die Entwicklungseigenschaften dieser Zellen weiter zu untersuchen, wurden nicht induzierte und induzierte Zellen elektronisch in kleine und große Zellkompartimente geteilt und rückausgewertet, um die Seitenstreucharakteristiken von jeder zu bestimmen. Zur Rückauswertung wurden Anigen-positive oder negative-Zellen elektronisch markiert und diese markierten Populationen wieder analysiert, um, dass ihre Durchlasswinkel(d.h. die Zellgröße)- und die Seitenstreuung (d.h. der Zellgehalt)-Charakteristikenzu zeigen.
Diese Daten zeigen, dass die größeren Osteoblastenzellen auch den höchsten Grad intrazellulärer Organisation (Seitenstreucharakteristiken) haben. Dies wurde sowohl in nicht induzierten Zellen (in denen die Zellen in der Osteoblastengröße etwa 5 % des Isolats darstellen) als auch in induzierten Zellen beobachtet. Somit resultiert die TGF-β-induzierte Differenzierung der humanen Knochenvorläuferzellen in einer Erhöhung des antigenen Gehalts, der Zellgröße und einer Erhöhung der intrazellulären Komplexität. Isolierte Zellen enthalten auch eine Zellpopulation, in denen die Antigendichte sich wenig von nicht spezifischen Antikörperkontrollen unterscheidet. Rückauswertung dieser Population zeigt folgerichtig, dass diese Zellen einen niedrigen Grad der Seitenstreuung haben. Diese Charakteristika (d.h. niedrige Seitenstreuung und geringe Größe) stimmen mit der restlichen Population der Lymphoidenähnlichen überein, die keine nachweisbaren Knochenantigene tragen.
Es wird eine angereicherte Population der Knochenvorläuferzellen von etwa 100-fach über dem Ausgangsmaterial des Knochenmarks oder der peripheren Blutzellen beschrieben, die die Knochenvorläuferzellen umfassen. Eine Anreicherung von zwischen etwa 1 000-fach und etwa 2 000-fach, zwischen etwa 2 000-fach und etwa 3 000-fach, zwischen etwa 3 000-fach und etwa 4000-fach über dem ursprünglichen Knochenmark oder peripheren Blutzellen ist möglich, wobei eine Anreicherung von bis zu 4 800 hier beschrieben wird.
Knochenvorläuferzellen der vorliegenden Erfindung sind immunreaktiv mit Knochenvorläuferzellantikörpern. Ein Knochenvorläuferzellantikörper wir eingesetzt, um die Population der Knochenvorläuferzellen anzureichern. Knochenvorläuferzellantikörper, die von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, umfassen Anti-Osteocalcin, Anti-Osteonectin und Anti-alkalische Phosphatase aus Knochen. Anti-Osteocalcin, Antiosteonectin und Anti-alkalische Phosphatase aus Knochen werden in Shull et la., 1984 beschrieben, die unter Bezugnahme hier aufgenommen ist. Wie Knochenvorläuferzellen weiter charakterisiert sind, können andere Antikörper, die mit den Knochenvorläuferzellen immunreagieren, vom Fachmann hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Knochenvorläuferzellantikörper an ein festes Substrat konjugiert. Das feste Substrat liegt vorzugsweise in Gewebekultur- oder einer Petrischale vor. Die Verwendung einer festen Oberfläche, wie Gewebekulturplastik oder -glass, ist im Stand der Technik gut bekannt. Gewebekulturplastik und -glass können behandelt sein (z.B. Silikon, Nitrocellulose, Nickel etc.) um Proteinadhäsion zu fördern oder zu inhibieren. Behandelte und unbehandelte Oberflächen sind kommerziell erhältlich.
Wie detailliert in Beispiel 1 diskutiert werden wird, werden mit Antikörpern überzogene Kulturschalen verwendet, um die Knochenvorläuferzellen auszuwaschen („to pan"). Kurz gesagt werden die Knochenmarkszellen, die Knochenvorläuferzellen enthalten, auf Antikörper-überzogenen Schalen inkubiert. Knochenvorläuferzellen haften an Antikörpern an, während alle anderen Zellen nicht an der Schale anhaften. Nach der Inkubation werden die nicht an die Schale anhaftenden Zellen durch sanftes Waschen der Schalen mit Medium entfernt. Knochenvorläuferzellen werden von der Schale entfernt und weiter analysiert, gereinigt oder in Osteoplasten differenziert.
In einer anderen Ausführungsform kann ein zweiter mit einem Knochenvorläuferzellantikörper immunreaktiver Antikörper verwendet werden, um die Population der Knochenvorläuferzellen anzureichern. Die Verwendung eines zweiten Antikörpers ist allgemein im Stand der Technik bekannt. Typischerweise sind die zweiten Antikörper Antikörper, die mit der konstanten Region des ersten Antikörpers immunreaktiv sind. Bevorzugte zweite Antikörper umfassen Anti-Hase, Anti-Maus, Anti-Ratte, Anti-Ziege und Anti-Pferd und sind kommerziell erhältlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Sekundärantikörper an ein festes Substrat konjugiert, einschließlich Gewebekulturschalen, Agarose, Polyacrylamid und magnetische Teilchen. In dieser Ausführungsform wird zuerst ein Knochenvorläuferzellantikörper gegen eine Knochenvorläuferzelle immunreagiert. Die Knochenvorläuferzelle mit dem angebundenen Antikörper wird als nächstes dem Sekundärantikörper ausgesetzt, der an ein festes Substrat konjugiert ist. Die Anreicherung der Vorläuferzellen wird nur wegen der Zellen bewirkt, die einen Knochenvorläuferzellantikörper präsentieren, der mit dem Sekundärantikörper immunreagiert. Ein kommerziell erhältlicher Kit stellt Sekundärantikörper bereit, die an magnetische Teilchen konjugiert sind. In diesem System werden Knochenvorläuferzellen, die einen Knochenvorläuferzellantikörper präsentieren durch Exposition gegen ein magnetisches Feld gereinigt.
Obwohl die physiko-chemische Trennung (Gleichgewichtsdichtezentrifugation) in einer moderaten Anreicherung der Knochenvorläuferzell auf ein Niveau von 6 bis 7 % Reinheit resultiert und die Dichtetrennung gefolgt von der Adhärenz an Plastik die Reinheit weiter erhöht, sind Immuntrenntechniken besonders bevorzugt, um im wesentlichen gereinigte Populationen zu erhalten. Der Einsatz der Immunadhärenztrennung erzeugt im wesentlichen reine (- 60–80 %) Populationen von humanen Knochenvorläuferzellen. Immunmagnetische Trennung basierend auf Osteonectin- und Osteocalcin-Antigenen ergibt eine nahezu homogene, d.h. etwa 95 % reine Zellpopulation. Dies stellt eine etwa 4 800- fach Reinigung gegenüber unfraktioniertem Knochenmark dar.
Immunmagnetisch getrennte Zellen wurden einer zweifarbigen fluoreszenzaktivierten Zytometrie unterzogen, um die Expression von Osteonectin und Osteocalcin zu untersuchen. Diese Daten zeigen, dass die isolierten Zellen beide Proteine coexpremieren. Des weiteren zeigt der Antigendichte-Konturplot, dass diese Antigene in einer einzigen Zellpopulation coexpremiert werden, so dass keine verschiedene Unterpopulation von Einzelantigen-positiven Zellen nachgewiesen wird. Es bleibt aber eine kleine Population der antigenschwachen Zellen.
Verschieden von der antigenen Nullpopulation, die in Zellen gesehen wird, die durch Immunadhärenz getrennt werden, haben die magnetisch getrennten Antigen-niedrigen oder schwachen Zellen die gleiche Seitenstreucharakteristik wie die doppelt positive Zellpopulation. Geht man davon aus, dass diese Zellen nach zwei Passagen durch die magnetische Isolationssäule wieder gewonnen werden, ist es unwahrscheinlich, dass diese verunreinigten lymphoiden Zellen (wie sie in der auf Immunanhaftung basierenden Trennung gesehen werden) sind. Eher repräsentieren sie Zellen mit ausreichender (wenn auch niedriger) Antigendichte (wenn auch eine niedrige Dicht), um sie auf der Säule in Gegenwart des magnetischen Feldes zu halten.
Die Herstellung von Knochenvorläuferzellantikörpern wurde von Shull et al., 1989 berichtet. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper werden von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Mittel zur Herstellung und Charakterisierung von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt (vgl. z.B. Antibodies A Laboratory Manual, E. Harlow und D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Kurz gesagt werden polyklonale Antikörper durch Immunisieren eines Tiers mit einem Immunogen hergestellt, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfasst, und Sammeln der Antiseren aus dem immunisierten Tier. Ein weiter Bereich von Tierspezien kann für die Herstellung von Anitseren verwendet werden. Typischerweise ist ein für die Herstellung von Antiseren eingesetztes Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Schaaf oder ein Meerschwein. Wegen der einfachen Verwendung und relativ großen Blutvolumen von Kaninchen, sind Kaninchen die bevorzugte Wahl zur Herstellung polyklonaler Antikörper.
Ein monoklonaler Antikörper kann leicht durch Verwendung gut bekannter Techniken hergestellt werden, wie die im US-Patent Nr. 4 196 265 exemplifizierten.
Typischerweise umfasst eine Technik zuerst das Immunisieren eines geeigneten Tieres mit einem ausgewählten Antigen (z.B. Osteocalcin Osteonectin oder alkalische Phosphatase aus Knochen) in einer Art, die ausreicht, eine Immunantwort zu ergeben. Nach einer ausreichenden Zeit, um eine Immunantwort zu induzieren, werden Milzzellen aus dem immunisierten Tier dann mit Zellen einer immortalen Myelomzelle fusioniert. Eine Anzahl immortaler Myelomzellen stehen zur Verfügung, und die Wahl der immortalen Zellen liegt im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns. Immortalen Myelomzellen fehlt der Wiedergewinnungsweg zum Synthetisieren von Nukleotiden.
Die fusionierten Milz/Myelomzellen werden in einem selektiven Medium kultiviert, um die fusionierten Milz/Myelomzellen von den Elternzellen zu selektieren. Fusionierte Zellen werden aus einem Gemisch von nicht-fusionierten Elternzellen durch Zugabe von Mitteln getrennt, die die de novo Synthese von Nucleotiden im Gewebekulturmedium blockiert. Unfusionierte Myelomzellen fehlen die Enzyme, die notwendig sind, Nucleotide aus dem Wiedergewinnungsweg zu synthetisieren, und sie werden selektiv in dem selektiven Medium getötet. Nicht fusionierte Lymphozyten wachsen in der Gewebekultur auch nicht weiter. Somit können nur Zellen, die erfolgreich fusioniert haben (Hybridomazellen) in dem Selektionsmedium wachsen. Die Hybridomazellen erzeugen monoklonale Antikörper.
Die vorliegene Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung bereit, die Knochenvorläuferzellen enthält. Die Knochenvorläuferzellen wie sie hier bereitgestellt werden, haben die folgenden Eigenschaften:

(a) sie sind immunreaktiv mit Knochenvorläuferzellantikörper;
(b) der durchschnittlicher Teilchendurchmesser beträgt von zwischen 8 μm und 70 μm, und
(c) sie Differenzieren in Osteoblasten nach Aussetzen gegen Gewebewachstumsfaktor β, 1,25-OH-Vitamin D3, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor oder Knochen-morphogenetischem Protein.

Zusätzlich haben Knochenvorläuferzellen eine geringe Seitenstreuung(rechtwinklige Lichtstreuung)-Charakteristiken durch Durchflsszytometrie.
In einer Ausführungsform kann die Knochenvorläuferzellen-umfassende Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben aus humanen Knochenmarkzellen hergestellt werden. Knochenvorläuferzellen umfassen Zellen, die gegen Osteocalcin, gegen Osteonetin und gegen alkalische Phosphatase aus Kochen immunreaktiv sind. In einer Ausführungsform exprimieren die Knochenvorläuferzellen Osteocalcin, Osteonectin oder alkalische Phosphatase, aber sie exprimieren kein pan-hämatopoetisches Antigen CD34. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Knochenvorläuferzellen Osteoprogenitorzellen oder Präosteoblasten.
Die Differentierungskaskade der Knochenvorläuferzellen in einen Osteoblasten ist wie folgt:
Kolonie-bildende Zelle → Cluster-bildende Zelle → Präosteoblast → Osteoblaste.
Osteoprogenitorzellen werden hier als Zellen definiert, die prolifierieren, um differenzierte Knochenzellen (Präosteoblasten oder Osteoblasten) als ihre Nachkommsnschaft zu ergeben. Die Osteoprogenitorzellen gibt es in zwei Typen: Kolonie-bildende Zellen und Cluster-bildende Zellen. Eine Cluster-bildende Zelle ist eine Progenitorzelle mit einem limitierten Proliferationspotential. Wie in Beispiel 1 diskutier wird, differenziert eine Cluster-bildende Zelle in eine Kolonie von 20–50 Knochenproteinantigen-positiven Zellen (z.B. Osteocalcin) nach etwa 7 Tagen Inkubation.
Eine Kolonie-bildende Zelle ist eine Progenitorzelle mit einem erhöhten Proliferationspotential. Nach rund 7 Tagen Inkubation differenziert eine Kolonie-bildende Zelle in mehrere hundert höchst Knochenartigen-positive Zellen.
Ein Präosteoblast ist eine Zelle, die in einen Osteoblasten differenziert.
Es soll verstanden werden, dass dieses Entwicklungsstufen nicht präzise definiert werden können. Wie es hier verwendet wird, ist eine Knochenvorläuferzelle jede Zelle, die fähig ist, in einen Osteoblasten zu differenzieren oder zu expandieren. Eine Knochenvorläuferzelle der vorliegenden Erfindung umfasst Osteoprogenitorzellen, Kolonie-bildende Zellen, Cluster-bildende Zellen und Präosteoblasten.
Obwohl kein Mittel der Definition können humane Knochenpräosteoblastenzellen als kleine Zellen in der Größe von Lymphozyten mit einer niedrigen Seitenstreucharakteristik (SSC) charakterisiert werden. Humane Präosteoblasten könne auch charakterisiert werden als OC¹⁰, ON¹⁰, AP¹⁰, CD34^–, SSC¹⁰, und FAS¹⁰. Humane Osteoblastenzellen können als OC⁺⁺, ON⁺⁺, AP⁺⁺, CD34^–, SSC^hi, FAS^hi charakterisiert werden.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zu Differenzierung einer Knochenvorläuferzelle in einen Osteoblasten durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Dieses Verfahren umfasst im Allgemeinen die Schritte:

(a) Erhalten einer Population von Knochenvorläuferzellen nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren;
(b) Aussetzen der Knochenvorläuferzellen einem Wachstumsfaktor, und
(c) Kultivieren der Knochenvorläuferzellen unter Serum-freien Bedingungen, wodurch die Knochenvorläuferzelle in einen Osteoblasten differenziert.

Wachstumsfaktoren umfassen den transformierenden Wachstumsfaktor β, 1,25-OH-Vitamin D3, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor oder Knochen-morphogenetisches Protein. In einer Ausführungsform wird die Knochenvorläuferzelle einem einigen Wachstumsfaktor ausgesetzt. Alternativ kann eine Knochenvorläuferzelle zwei oder mehreren Wachstumsfaktoren exponiert werden.
Nach dem Aussetzen gegen einen Wachstumsfaktor differenziert die Knochenvorläuferzelle in einen Osteoblasten. Kultivieren der Vorläuferzell währen sieben Tagen in Gegenwart eines Wachstumsfaktors verursacht eine Zell-Vergrößerung um das etwa 3-fache (1A, 1B, 1C, 1D). Auch eine 5-fache Erhöhung des Antigengehalts der Zelle liegt vor. Des weiteren wird die Gesamtzahl der Osteoblasten um das etwa 4-5-fache erhöht (2). Diese Ergebnisse werden im Detail in Beispiel 1 diskutiert.
In einer noch anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Differenzieren einer Knochenvorläuferzelle in einen Osteoblasten weiterhin das Kultivieren der Knochenvorläuferzellen in Gegenwart von Typ I-Kollagen, Fibrinogen, Fibrin, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Osteocalcin oder Osteonectin. In einer Ausführungsform werden die Knochenvorläuferzellen in Gegenwart von Typ I-Kollagen, Fibrinogen und Fibrin kultiviert. In einer Ausführungsform wird Typ I-Kollagen, Fibrinogen, Fibrin, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Osteocalcin oder Osteonectin alleine in Gegenwart eines Wachstumsfaktors verwendet. In einer alternativen Ausführungsform werden die Knochenvorläuferzellen in Gegenwart von Typ I-Kollagen, Fibrinogen, Fibrin, Osteocalcin und Osteonectin kultiviert. Es soll verstanden werden, dass jede Kombination der vorstehend in diesem Absatz aufgelisteten Verbindungen von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden.
Knochenvorläuferzellen, die in Gegenwart von Typ I-Kollagen, Fibrinogen, Fibrin, Osteocalcin und Osteonectin kultiviert werden, ergeben eine Extrazellulärmatrix, die einem Knochen ähnlich ist. Diese Kulturen ergaben eine positive von Kossa Reaktion und waren zur Calciumablagerung in der Extrazellulärmatrix in der Lage. Knochenvorläuferzellen, die in einer Kollagen/Fibrin-Matrix kultiviert wurden, waren für therapeutische Anwendungen geeignet.
Erfindungsgemäß wird ein Zellprodukt aus isolierten gereinigten tierischen Knochenvorläuferzellen und die Mittel bereitgestellt, um diese Knochenzellen als Transplantationstherapie für Osteopenien zu expandieren. Bei dieser Art können eigene Knochenvorläuferzellen des Tieres oder solche eines Histocompatilitätsdonors entfernt und falls nötig in Kultur expandiert werden. Als Nächstes werden diese Zellen oder eine ex vivo expandiert Zahl dieser Knochen-bildenden Zellen in Tiere mit Knochenbildungsdefiziten transplantiert. Die Verwendung eines autologen tierischen Knochenvorläuferzell-Transplantats verhindert Abstoßungsreaktionen. Autologe oder allogene Knochenzell-Transplantationen werden von therapeutischer Wichtigkeit in der Behandlung der Osteopenien werden. Beim Großteil dieser Störungen ist das enge verbundene Gleichgewicht von Knochenbildung und Knochenreabsorption zerstört, wobei die Reabsorption vorherrscht. Das Einführen einer großen Zahl von Knochen-bildenden Zellen wird somit die Knochenbildung bei Krankheiten, wie Osteoporose, verbessern.
Im folgenden werden Behandlungsverfahren beschrieben, die als solche nicht beansprucht werden. Die Beschreibung unterstützt die medizinische Verwendung bestimmter Zusammensetzungen.
Es wird auch beschrieben, dass gereinigte tierische Knochenvorläuferzellen ein ideales Ziel für die Tiergenthearpie für Knochenstörungen ist, bei denen ein bekannter spezifischer molekularer Defekt in einer abnormalen Knochenbildung resultiert. Es wird auch beschrieben, dass die Fähigkeit, Knochenvorläuferzellen zu isolieren und deren Teilung zu stimulieren, zeigt, dass sie als Zielzellen für die Gentherapie congenitaler Knochendefekte verwendet werden können.
Eine andere Verwendung von tierischen Knochenvorläuferzellen ist als Zell-basierte biologische Matrix, die in Tiere implantiert wird, die irgendeine Form der Knochenwiederherstellung oder der Knochenverbindung benötigen. Dieses Produkt wird umfasst von Knochenzellen, die in einer biologisch aktiven Proteinmatrix eingebettet sind. Die Biomatrix besteht aus definierten Knochenproteinen (z.B. Typ I-Kollagen, Osteonectin, Fibrinogen, Fibrin und Osteocalcin), und spezifischen Knochenwachstumsfaktoren (vorstehend), die die Knochenzellproliferation stimulieren. Alternativ kann auch Polyglycolsäure und/oder Polymilchsäure vorliegen. Die Biomatrix bekommt seine Konsistenz (die eines festen Gels) und Form durch Aktivierung des Fibrinogens als Proteinpolymer und des nachfolgenden Gelübergangs des Kollagens.
Die in dem gesamten biologischen Transplantat verwendeten Zellen sind die eigenen Knochenvorläuferzellen des Tieres (d.h. die Zellen sind autolog und werden deshalb nicht abgestoßen, siehe vorstehend), die isoliert und (falls erforderlich) in Gewebekultur expandiert werden. Diese Expansion resultiert in einer Population von frühen Knochenbildenden Zellen, die dann in der Biomatrix durch Polymerisation des Gelproteins eingebetten weden. Das Ergebnis ist ein „Prä-Knochen"-Implantat, das die eigenen Knochenzellen des Tiers enthält, die das Implantat schnell reorganisieren und es mineralisieren. Ferner wird die Gel-Phase es ermöglichen, diesen Knochenersatz in jeder notwendigen Form zu bilden, womit der Ersatz von kleinen Knochen, seine Verwendung in periodontalen Gewebe und kosmetische Wiederherstellungen erleichtert werden.
Knochenvorläuferzellen können nach einer Vielzahl von Verfahren auf immunologischer Basis erhalten werden. Diese umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: Fluoreszenz-aktivierte Durchflußzytometrie, Säulenchromatographie auf immunologischer Basis, Antikörper-konjugierte Sepharose-Kügelchen (oder andere inerte Kügelchen) oder andere Anwendungen auf immunologischer Basis (z.B. immunmagnetische Trennung). Diese Verfahren definieren jedoch nicht die Population der tierischen Knochenvorläuferzellen, sondern führen eher zu ihrer Isolierung. Andere physikalische Trennverfahren können vor oder nach der Antigenreinigung angewendet werden. Diese werden umfasst von, wobei sie nicht darauf beschränkt sind, Gleichgewichtsdichtezentrifugation, Geschwindigkeitssedimentation oder Gegenflußzentrifugation-Elutration.
Ferner können andere antigene Marker verwendet werden, um die weiter definierten Zellen positiv oder negativ zu definieren. Diese werden umfasst von, wobei sie nicht darauf beschränkt sind, Antigene des tierischen Majorhistokompatilitätsort (insbesondere HLA-DRA) hämatopoetische Antigene (z.B. CD33, CD8, CD10, CD14, CD9, CD20) oder andere Knochenproteine.
Die tierischen Knochenvorläuferzellen, die hier beschrieben sind, werden aus tierischem Knochenmark gewonnen. Quellen von solchem Mark sind die flachen Knochen des axialen Skeletts (Rippen, Hüfte, Sternum) sowie Oberschenkelknochen, Speiche, Elle, Schienbein und Wadenbein. Zusätzlich können diese Zellen aus anderem nicht vom Mark stammenden Quellen erhalten werden, einschließlich aber nicht eingeschränkt Periosteum, Knochentrabecula, Spongiosa oder Endosteum.
Des weiteren haben die vorliegenden Erfinder gezeigt, dass tierische Knochenvorläuferzellen zirkulieren, wodurch es möglich wird, diese Zellen aus tierischem peripheren Blut wieder zu gewinnen und zu reinigen. Tatsächlich wurden humane Knochenvorläuferzellen jetzt aus humanem peripheren Blut isoliert, und sie haben ähnliche Durchflusszytometriecharakteristiken wie die des Knochenmarks.
Ein Verfahren zum Identifizieren/Screenen neuer Knochenwachstumsfaktoren wird beschrieben. In Frage kommende Knochenwachstumsfaktoren oder Cytokine werden gescreent unter Verwendung einer angereicherten Population von Knochenvorläuferzellen gescreent. Knochenvorläuferzellen werden stimuliert, damit sie in Gegenwart eines Knochenwachstumsfaktors differenzieren. Neu identifizierte Knochenwachstumsfaktoren oder Cytokine werden zur Behandlung von Osteopenien, Frakturen verwendet und können in den vorstehend genannten Knochenzell-Biomatrix-Implantaten eingesetzt werden.
Es wird ferner offenbart, dass Knochenvorläuferzellen zur Behandlung von osteogenesis imperfecta eingesetzt werden kann. Osteogensesis imperfecta ist eine Erkrankung mit einem identifizierten genetischen Defekt. Es wird des weiteren offenbart, dass Knochenvorläuferzellen von Patienten mit Osteogenesis imperfecta isoliert werden. Eine Kopie des Gens ohne Mutation wird in die Knochenvorläuferzellen mittels gut bekannter Transfektions/Transformations-Techniken eingeführt. Knochenvorläuferzellen, die das korrigierte Gen enthalten werden in den Patienten wieder eingeführt oder zuerst in vitro expandiert und dann in den Patienten wieder eingeführt. Dieses Verfahren kann als heterologes oder autologes Verfahren durchgeführt werden, vorteihafterweise als ein autologes Verfahren.
Diagnostische Verfahren, die verwendet werden können, um die altersbezogenen Änderungen in humanen Knochenvorläuferzellen durch Beurteilung der Knochenproteinexpression zu evaluieren, werden beschrieben. Diese Verfahren wurden entwickelt nach einer Serie von durchflußzytometrischen Untersuchungen über die immunmagnetisch-getrennten Knochenvorläuferzellen, die zeigt, dass die altersbezogenen Änderungen in der Knochenproteinexpression mit zunehmenden Alter (siehe z.B. Beispiel 4) auftritt.
Diese Studien wurden bei insgesamt 41 Individuen in drei Altersgruppen durchgeführt: ≤ 25 jahre alt (mittleres Alter 16,4 +/– 7 (S.D.) Jahre, Bereich 1,5 bis 24 Jahre, n = 15), 50 Jahre alt (mittleres Alter 36,6 +/– 5 Jahre alt, Bereich 26 bis 45 Jahre, n = 9) und Individuen ≥ 50 Jahre alt (mittleres Alter 70,1 +/– 12 Jahre, Berreich 53–89 Jahre, n = 17).
Humane Knochenvorläuferzellen werden isoliert und gereinigt aus Individuen in den angegebenen Altersgruppen und einer Multiparameter-Durchflusszytometrieanalyse unterzogen. Wie erwartet, coexpremieren die antigengereinigten humanen Knochenvorläuferzellen aus diesen drei Alterspopulationen sowohl Osteonectin als auch Osteocalcin. Ineressanterweise erhöht sich die Antigenexpression durch humane Präosteoblastenzellen mit zunehmendem Alter.
Die Durchflusscytrometriedaten zeigen deutlich, dass die humanen Knochenvorläuferzellen in älteren Individuen (d.h. im Alter von ≥ 50 Jahren) höhere Mengen dieser zwei Proteine exprimieren als es jüngere Individuen (d.h. ≤ 25 Jahren) tun. Die Profile der Individuen mittleren Alters waren zwischen dem der anderen zwei Altersgruppen.
Um zu bestimmen, ob die Änderungen statistisch signifikant für die gesamte Population ist, wurde die mittlere spezifische und die Peak-Fluoreszenz für jedes Individuum in jeder Altersgruppe bestimmt. Eine signifikante (p ≤ 0,05) altersbezogene Erhöhung wurde sowohl bei der mittleren spezifischen Fluoreszent für Osteocalcin (BGP) und Osteonectin sowie in der Peakfluoreszenz von jedem der Antigene bemerkt. Osteocalcin zeigte eine moderate aber signifikante Änderung in der mittleren Fluoreszenz, ein Ansteigen um 21 arbiträre Log-Einheiten. Im Gegensatz erhöht sich die Osteonectin-Expression in einem größeren Maß in der Population der älteren Individuen (eine Zunahme von 59 auf 89 arbiträre Log-Einheiten).
Die Erfinder analysierten weiter diese Erhöhung in den Knochenproteinlevels durch Untersuchung der Beziehung zwischen Alter und Antigenexpression. Obwohl die Zahl der Individuen im mittleren Alter niedriger als die der anderen zwei Alters-Kohorten ist, scheint es nichts desto weniger, dass die Majorität der Zunahme der Osteonectin- und Osteocalcin-Levels in humanen Knochenvorläuferzellen zwischen dem Alter 15–16 und 35–40 Jahren auftritt.
Die Beobachtung, dass Osteonectin- und Osteocalcin-Expression in gereinigten Populationen humaner Knochenpräosteoblasten-Zellen mit zunehmenden Alter zunimmt, ist in Übereinstimmung mit Berichten, die zeigen, dass die Serumosteocalcin-Expression im Alter in sowohl Männern als auch in Frauen zunimmt (Delmas et al., 1983; Orwoll und Deftos, 1990). Die Beobachtung der Erfinder zeigt, dass die zelluläre Basis der berichteten Serumzunahme von Osteocalcin, d.h. des Knochenvorläuferzellen selbst, ein erhöhtes Osteocalcin (sowie Osteonectin) ausdrückt.
Die altersbezogene Erhöhung der Expression von Osteonectin in gereinigten Populationen humaner (nicht adhärenter) Präosteoblasten, die in dieser Erfindung gefunden wurde, steht im Gegensatz zu dem von Fedarko et al., (1992) berichteten. Diese Forscher dokumentierten eine progressive Abnahme in den Osteonectin-Levels nach einem Alter von 15 Jahren. Ein Vergleich der Isoltionsverfaren zwischen dem vorliegenden Bericht und dem von Fedarko zeigt, dass deutlich verschiedene Zellpopulationen isoliert wurden.
Das Trennverfahren der Erfinder isolierte eine Zellpopulation durch physiko-chemische und immunologische Mittel. Im Gegensatz dazu untersuchte die Fedarko-Studie Präosteoblasten/Osteoblasten, die enzymatisch (Kollagenase) aus einer mineralisierten Matrix freigesetzt wurden, wodurch sie deutlich von denen des vorliegenden Berichts verschieden sind. Somit betreffen die vorliegende Erfindung und die Fedarko-Studie möglicherweise Zellen bei verschiedenen Entwicklungsstufen. Beispielsweise können frühe Präosteoblasten, die eng mit der Endostealoberfläche assoziiert sind, wenn sie so adherieren, auf regulatorische Signale in der mineralisierten extrazellulären Knochenmatrix ansprechen, was in der down-Regulierung der Expression/Synthese der spezifischen Knochenproteine resultiert.
Von den untersuchten 17 Individuen, die älter als 60 Jahre waren, zeigten vier (drei Frauen im Alter von 64, 88 und 89 und ein Mann im Alter von 59 Jahren) keine immunphänotypischen Charakteristiken der humanen Knochenvorläuferzellen, wie vorstehend beschrieben. Vielmehr ist die Majorität (80–90 %) der angenommenen Präosteoblasten, die aus diesen Individuen isoliert wurden, im Antigengehalt mit der antigenschwachen der vorstehend beschriebenen Zellen ähnlich. Diesen Individuen fehlt somit die predominante Osteocalcin-positive/Osteocalcin-negative (OC⁺⁺/ON⁺⁺) Glanz(„bright")population, die in allen anderen Individuen (n = 37), einschließlich die altersbezogene Kohorte (sowohl Männer als auch Frauen) beobachtet wurden.
Unter. der gegebenen Erhaltung dieser Zellen auf der Säule und dass der Durhlasswinkel- und die Seitenstreuungs-Charakteristiken dieser Zellen identisch zu der der antigenschwachen Zellsubpopulation ist, folgerten die Erfinder, dass diese Individuen eine Population von Präosteoblasten besitzen, die deutlich in ihrer Antigenexpression verschieden ist. In Übereinstimmung damit sind die mittlere Fluoreszenz und die Peakfluoreszenz von sowohl Osteonectin als auch Osteocalcin deutlich vermindert, selbst wenn sie mit der jüngsten Alters-Kohorte verglichen werden (Tabelle 2).
Diese Daten lassen vermuten, dass eine getrennte Subpopulation von Individuen mit einem deutlich verschiedenen (niedrigen) humanen Knochenvorläuferzell-Antigengehalt existiert. Diese Subpopulation von älteren Leuten, in der nur eine predominante Population von antigenschwachen Präosteoblast-Zellen vorliegt, könnte Subjekte mit einer Differenzierungs-Blockade oder alternativ einen Verlust (oder Maskierung) von Antigenen in den Präosteoblasten repräsentieren.
Frühere Beobachtungen lassen vermuten, dass dieser Aspekt der Erfindung einen diagnostischen und vielleicht einen prognostischen Nutzen in Verbindung mit bestimmten Knochenstörungen hat. Beispielsweise kann die Verwendung von Mulitparameter-Durchflusszytometrie und Immunphänotypisierung die Diagnose und die Vorhersage der Folge (Prognose) von verschiedenen Knochenstörungen erlauben, wie primäre Osteoporose. Es gibt zwei Arten primärer Osteoporose. Typ 1-Osteoporose trifft Frauen in den ersten zwei Dekaden nach der Menopause, wohingegen Typ 2-Osteoporose sowohl Männer als auch Frauen in der 6. oder 7. Dekade des Lebens beeinflusst. Das Muster der Antigenexpression in humanen Knochenvorläuferzellen, die von den Erfindern beobachtet wurden, zeigen, dass ältere Individuen (≥ 60 Jahre) 2 Typen aufweisen: solche mit einem statistisch hohen Knochenantigengehalt und solche mit einem statistisch niedrigen Antigengehalt (verglichen mit der bezüglich des Alters übereinstimmenden Kontrolle). Dies lässt Annehmen, dass diese Werte den Krankheitsstatus der Knochenfunktion der beeinflussten Individuen wieder gibt.
Somit stellen die auf immunphänotypische Reinigung und die Multiparameter-Durchflusszytrometrie basierende Charakterisierung von humanen Knochenvorläuferzellen ein wichtiges Mittel zur Definition der zellulären und biochemischen Basis von sowohl altersbezogenen und vielleicht auch Krankheits-vermittelten Änderungen in den Knochenzellen und ihrer Vorläufer dar. Weiterhin kann die Erfindung benutzt werden, um die Folgen der Tranplantation von humanen Knochenvorläuferzellen in Patienten mit Knochenbildungsdefizienzen zu überwachen.
Die folgenden Beispiele wurden aufgenommen, um die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Dies sollte vom Fachmann so beurteilt werden, dass die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken die Techniken darstellen, die von den Erfindern als bei der Durchführung der Erfindung gut funktionierend gefunden wurden, und sie können somit bevorzugte Arten ihrer Durchführung darstellen.
Beispiel 1: Herstellung der Knochenvorläuferzellen
Herstellung von Knochenmarkzellen und -kultur. Aspirate von humanem Knochenmark wurde von normalen Freiwilligen gewonnen. Die Knochenmarkszellen wurden Adhärenzzell-Verminderung und Dichtetrenn-Techniken, wie früher beschrieben (Long et al., 1988), unterzogen. Kurz dargestellt wurden nicht adhärente Zellen niedriger Dichte (NADL) dadurch hergestellt, dass Zellen zuerst einer Gleichgewichtsdichtezentrifugation (Ficoll) unterzogen wurde. Die resultierende mononuklearen Zellen niedriger Dicht wurden als nächstes zwei Runden einer Plastikadhärenz unterworfen, und die nicht adhärenten Zellen niedriger Dichte (NADL) wurden dann einer Immunadhärenz-Isolation unterzogen (vide infra). Knochenzellen wurden in ergänztem McCoy's 5A-Medium (Long et al., 1988) mit 1% ITS+ (Collaborative Research, Bedford, MA) wie früher beschrieben (Long et al., 1990) kultiviert.
Antikörper, Immunadherenz und Immunchemie. Die Expression von Knochenproteinantigenen wurde durch Fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie oder durch Immunzytochemie unter Verwendung des Avidin-Biotin-Systems wie früher beschrieben (Long et al., 1990, Long und Heffner, 1988) bestimmt. Die Antikörper sind bezüglich ihrer Antigene spezifisch und zeigen keine Kreuzreaktion mit anderen Matrixproteinen (Stenner et al., 1984 und Shull et al., 1989). Die monoklonalen Antikörper gegen alkalische Phosphatase (SAOS2-P80) wurden gegen Osteosarcomzellen (Shull et al., 1989) gezüchtet. Dieser Antikörpern bewährte sich, um alkalische Phosphatase-Aktivität durch Immunprätipitation und durch direkte Proteinsequenz-Analyse des präzipitierten Antigens zu detektieren. Für die Immunadhärenz wurden monoklonale Antikörper gegen Osteocalcin und Osteonectin auf Gewebekulturplastik unter Verwendung eines früher beschriebenen Verfahrens (Long et al., 1992) immobilisiert. Etwa 2,5 – 6,5 × 10⁵ NADL-Zellen pro cm² wurden in Antikörper-überzogenen Schalen währen l Stunde bei 37° C inkubiert. Nachfolgend wurden nicht adhärente Zellen mit drei Runden von sanftem Waschen unter Verwendung Serum-freien McCoy's Medium mit 1% BSA entfernt. Die immunadhärenten Zelle wurden mit Hilfe eines Kunststoffgeräts („rubber policeman") entfernt und bezüglich Durchflusszytometrie (als Input-Zellen) analysiert oder während sieben Tagen in situ in Gegenwart oder Abwesenheit eines osteogenen Wachstumsfaktors kultiviert.
Durchflusszytometrie-Analyse. Durchflusszytometrie-Analysen wurde unter Verwendung einer Becton-Dickinson FACSAN-Systems durchgeführt, und die Daten wurden mit dem BD Lysis-Softwareprogramm analysiert. Die Kontrollen bestanden aus Autofluoreszenz und nicht spezifischer Fluoreszenz, die mit dem isotyp-spezifischen Murin-monoklonalen Antikörper gegen das schlüsselloch-Lympethämocyanin detektiert wurde, das von Becton Dickinson erhalten wurde. Die humane Osteoblastenzelllinie (MG63, SAO2) wurde mit monoklonalen Antikörpern gegen Osteocalcin bzw. alkalische Phosphatase kontrastiert, und bezüglich der Fluoreszentintensität versus der Größe (Durchlasswinkelstreuung) versus zellulärer Komplexität (Seitenstreuung) analysiert, um unabhängig die Position der Osteoblastenzellen in der immunisolierten Knochenmarkzellpopulation abzubilden. Die Häufigkeit der Osteoblastenzellen, die als Zahl der in der Osteoblastenregion auftrettenden Zellen (wie vorstehend definiert, Kreise in 1A, 1B, 1C, 1D) definiert ist, wird als Prozent der gesamten Knochenantigen-positiven Zellen ausgedrückt.
Osteogene Kolonie-bildende Zellen. Um die Osteoprogenitrozellen in immunadherenten Kulturen zu quantifizieren, wurden adhärente Zellen in situ in einem Fibrinkoagulatsystem kultiviert. Plasminogen-freies Fibrinogen (Hematologic Technologies, Burlingto VT; 2 mg/ml) wurden mit humanem Thrombin (1 Einheit/ml) behandelt, um ein Fibrinkoagulat zu bilden. Die bekannte Kapazität der Osteoblasten zur Produktion von proteolytischen Enzymen und somit zur Lyse von Koagulaten wurde durch Verwendung epsilon-Aminocapronsäure in einer Konzentration von 5 mM überwunden, und die Überfülle mit mehr Fibrinogen wurde benötigt. Die Immunzytochemie für die Osteocalcinexpression wurde durchgeführt wie früher beschrieben (Long et al., 1990) mit der Ausnahme, dass die Diaminobenzadin-Konzentration 3 mg/ml betrug und die Substrat-Inkubationsdauer auf 2 Stunden erhöht wurde. Immunzytochemische Kontrollen bestand aus einem ungeeigneten Antikörper, nur eine Sekundärantikörper, und nur Dimaniobenzadin (um die endogene Peroxidase-Aktivität zu untersuchen). Die Kontrollen waren einheitlich negativ.
Isolation und Anreicherung der Knochenproten-expremierenden Zellen. Eine Anzahl nicht kollagener Proteine spielen eine Rolle bei der Knochenbildung. Monoklonale Antikörper wurden gegen zwei dieser zwei Knochenproteine benutzt, Osteocalcin und Osteonectin, beide als Phänotypmarker der Knochenzellentwicklung und als Mechanismus zur Isolierung der Knochenprotein-expremierenden Zellen in vitro. Osteonectin (auch als SPARC bekannt), liegt in hoher Konzentration in Knochen des axialen Skeletts und des Schädels vor (Nomura et al., 1988 und Holland et al., 1987) Osteonectin bindet an Calciumhydroxylapatit und Kollagen, und somit kann es die Mineralablagerungen in der Knochenmatrix regulieren (Termine et al., 1981). Ein anderes Knochenprotein, Osteocalcin (auch als Knochen-gla-Protein oder BGP bekannt) ist ein Vitamin K-abhängiges Protein, dass spezifisch für Knochen ist und auch Calcium bindet (Termine et al., 1981; Hauschka et al., 1975; Price et al., 1976 und Price et al., 1981) Die Erfinder benutzten auch einen monoklonalen Antikörper gegen alklische Phosphatase aus Knochen als Phänotypmarker für Knochenzelle.
Die früheren Daten der Erfinder zeigten, dass vom Mark abgeleitete Osteoblasten die Extrazellulärmatrix in einer osteogenen Art modifizierten (Long et al., 1990). Gekoppelt mit den vorliegenden Daten der antigenen Phänotypisierung und in vitro Expansion, definieren die Erfinder die vom Mark abgeleiteten Zellen als kleine, die proliferierenden Zellen (Lymphozytengröße), die geringe Mengen an Knochenproteinantigenen exprimieren, wohingegen die vom Mark abgeleiteten Zellen die größeren sind, wobei die differenzieten die Nachkommen dieser Zellen, die große Mengen Antigen expremieren und mit längeren Kulturen erzeugen eine osteoide Matrix. 1A, 1B, 1C und 1D zeigen die durchflusszytrometrische Analyse humaner nicht adhärenter Knochenmarkszellen niedriger Dicht (NALD), die an Antikörper-beschichteten Gewebekulturschalen inkubiert wurden. Immunadherente Knochenzellpopulationen wurden bezüglich der Expression der Knochenproteine sowie der Zellgröße (Durchlasswinkellichtstreuung FAS).
1A zeigt Osteocalcin-positive Zellen und 1B zeigt positive Zellen der alkalischen Phosphatase aus Knochen. Antigen-positive Zellen werden identifiziert als die Zellen, die mehr Fluoreszenz haben als das obere Limit der nicht-spezifischen Fluoreszent, die in Antikörper-Kontrollen (schattierte Flächen) gesehen wurden. Osteoblastenzellen (Kreise) wurden als die Knochenproteinantigen-positiven Zellen identifiziert, die deutlich größer als die oberen 95 % des Zellgrößenlimits für die Input-NALD-Zellen (gestrichelte Linie) sowie parallele Analysen humaner Osteoblasten sind.
Monoklonale Antikörper gegen Osteocalcin und Osteonectin (Stenner et al., 1984 und Shull et al., 1989) wurden benutzt, um die Knochenprotein-expremierenden NADL-Zellen unter Verwendung konventioneller Immunadhärenz-Technologie zu fangen („pan") (Wysocki et al., 1978 und Mage et al., 1992). Immunadhärenz-Isolation produziert ein deutlich angereicherte Zellpopulation, die zu 40 bis 60 % Knochenprotein-Antigen positiv ist. Subpopulationen dierser Zellen wurden weiter aufgelöst, wobei die Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrie eingesetzt werden.
Die erste Subpopulation umfasst die Majorität der Zellen und wird als Gruppe von Knochenantigen-positiven Präosteoblasten mit etwa der Größe der Lymphozyten unterschieden. Eine zweite Population der Antigen-positiven Osteoblasten ist größer als das obere 95 % Limit der unfraktionierten NALD-Zellpopulation und umfasst etwa 2–4% der immunadhärenten Zellpopulation (1A und 1B). Beide, Antigen-positive kleine und große Zellen exprimieren Osteocalcin, alkalische Phosphatase aus Knochen (obere rechte und linke Abbildung), und Osteonectin. Die exakten Entwicklungslevel, bei denen die Knochenvorläuferzellen diese Antigene expremieren, ist nicht bekannt. Zweifarbige Fluoreszenzzytometrie-Studien zeigen jedoch, dass der Hauptteil (≥ 90 %) der Immun-isolierten Zellen sowohl Osteonectin und BGP (vide infra) coexpremieren.
In vitro Ausdehnung und Differenzierung der vom Knochenmark abgeleiteten Knochenzellen. Immunisolierte Knochenvorläuferzellen wurden unter Serum-freien Bedingungen in Gegenwart vonTGF-β1 kultiviert. Multiparameter-Durchflusszytometrie zeigt, dass die TGF-β-Behandlung die Differenzierung der kleinen Zellen in große Knochenproteinantigen-positive Zellen bewirkt (1C und 1C). In den follgenden 7 Tagen nach der Serum-freien Kultur, zeigt die Majorität der Immun-isolierten Zellen eine etwa 3-fache Zunahme der Zellgröße (wie sie durch die Durchlasswinkellichtstreuung definiert ist), und eine koordinierte Zunahme in ihren Antigengehalten, wie durch eine 0,5 bis 1,0-log Zunahme der relative Fluoreszenz gezeigt wird.
1C und 1D zeigen die Durchflusscytometrieanalyse der Knochenvorläuferzellen, die währen 7 Tagen in Gegenwart von 25 pm TGF-β kultiviert wurden. 1C zeigt die Differenzierung der Osteocalcin-positiven Zellen in Osteoblasten. 1D zeigt die Differenzierung der Zellen mit alkalischer Phosphatase aus Knochen in Osteoblasten.
Diese Beobachtungen zeigen, dass unfraktionierte Mark-NALD-Zellen Knochenvorläuferzellen enthalten, die langfristig in Serum-vollen Kulturen die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Osteoblasten erwerben (Long et al., 1990). Somit produzieren diese Osteoblasten Knochenproteine und scheiden diese Proteine in der extrazellulären Matrix ab, die nachfolgend anfängt zu mineralisieren (was durch die zelluläre Abscheidung des Calciums in die Matrix und positive Von Kossa Färbung gezeigt wird) (Long et al., 1990).
Die Untersuchung solcher Osteoblasten demonstriert, dass ihre Häufigkeit um etwa das 4 bis 5-fache in Gegenwart von TGF-β (2A) zunimmt. Diese zugenommene Zellhäufigkeit entsteht wegen der erhöhten Proliferation der Knochenproteinantigen-positiven Zellen. Untersuchung der gesamten Zellularität pro Kultur zeigt eine etwa 3-4-fache in vitro Ausdehnung der gesamten Anzahl der Osteoblasten während einer 7-tägigen Zeitspanne (2B), während die Anzahl der Antigen-negativen Zellen unverändert oder vermindert bleibt. Dies trifft sowohl für BGP-exprimierende Zellen als auch auf alkalische Phosphatase-positive Zellen zu.
Es ist hochgradig unwahrscheinlich, dass Knochenvorläuferzellen in Kultur absterben, währen die größeren Osteoblasten proliferieren, um die vorherrschende Zellpopulation zu werden, da Osteoblasten wenn überhaupt eine niedrige Proliferationskapazität haben. Die Immunselektion der auf Knochenproteinantigen-positiven Zellen ergibt eine auf TGF-β ansprechende Population kleiner Knochenvorläuferzellen, die zur Differenzierung in Osteoblasten fähig sind.
In vitro Entwicklung humaner Osteoprogenitor-Zellen. Es gibt unter den immunisolierten Knochenvorläuferzellen eine wahre Knochenprogenitor-Zelle, d.h. Vorläuferzellen, die in der Lage sind, eine klonale Ausdehnung in differenzierte Nachkommen einzugehen. Die klonale Natur und die in vitro Charakteristiken der Progenitorzellen in anderen Systemen sind gut beschrieben: Progenitorzellwachstum und -entwicklung erfordert die Gegenwart von mindestens einen mitogenen Wachstumsfaktor, und das Zellwachstum in einer inerten, halb-festen 3-dimensionalen Matrix, die in der klonalen Bildung von Zellkolonien durch eine Einschränkung des Auswachsens der differenzierten Nachkommen (Metcalf et al., 1989) resultiert. Um die Osteoprogenitor-Zellen nachzuweisen, wurden immunisolierte NALD-Zellen mit einem chemisch definiertem Serum-freien Medium mit Fibrinogen überschichtet, die nachfogend mit Thrombin behandlet werden, um das ein Fibrin-Koagulat zu bilden. Zellen wurden während 7 Tagen unter Serum-freien Bedingungen in Gegenwart von TGF-β (oder einem anderen Wachstumsfaktor vide infra) kultiviert. Nachfolgend wurde das Fibrin-Koagulat zu einem Film getrocknet, und die Kultur einer immunzytochemischen Analyse unterzogen.
Zwei Arten von Kolonien, die von Progenitor-Zellen stammen, werden nach 7 Tagen beobachtet. Ein Koloniephänotyp besteht aus kleinen Clustern von Zellen, die 20 bis 50 Osteocalcin-positive Zellen enthält (3A). Durch Übereinkunft wird dieser Typ von Progenitorzelle als Cluster-bildende Zelle (Metcalf et al., 1989, Metcalf et al., 1983) bezeichnet, und stellt eine Progenitorzelle mit beschränktem Proliferationspotential dar. immunadhärente gegen Knochenantigen positive Zellen wurden in Serum-freien Gewebekulturmedium (Long et al.,) mit Plasminogen-freiem Fibrinogen kultiviert, das mit Thrombin behandelt wurde (Briddell et al., 1990), um ein Fibrin-Koagulat zu bilden. Nach 7 Tagen Kultur wurden die Fibrin-Koagulate zu einem Film getrocknet und einer immunozytochemischen Analyse unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen humanes BGP (Osteocalcin), wie anderswo beschrieben (Stenner et al., 1984)„ unterzogen.
Der zweite Typ von osteogenem Zellwachstum besteht aus Kolonie-enthaltenden einigen hundert intensiv Osteocalcin-positiven Zellen (3B). Dieser letzte Typ der Kolonie-bildenden Zellen (CFC) stellt somit eine Osteoprogenitrozelle mit einem erhöhten Proliferationspotential dar. Unter geeigneten Wachstumsfaktor-Bedingungen (siehe nachstehend) liegt dieser Typ von Progenitorzell mit 20 bis 50 CFC pro 10⁵ gesamten immunadhärenten Zellen vor. Diese zwei Typen von Progenitorzell-Wachstum ist konsisten mit früheren Beobachtungen in anderen Systemen, in denen die Kolonie-bildenden Zellen als primitiver als die Cluster-bildenden Zellen angesehen werden (Metcalf et al., 1989 und Metcalf et al., 1983) Daher stellen die Cluster-bildenden Zellen eine spätere (natürlichere) Stufe der Knochenzellentwicklung dar, als die Kolonie-bildenden Zellen (d.h. die CFC-Kolonie liegt entwicklungsmäßig vor dem CFC-Cluster).
Sowohl die Cluster-bildenden als auch die Kolonie-bildenden Osteoprogenitorzellen zeigen ein obligates Erfordernis für Wachstumsfaktoren und eine differentielle Ansprechbarkeit gegen Knochen regulierende Cytokine (4A und 4B). Beide Progenitrozelltypen entwickeln sich in Abwesenheit von osteogenen Wachstumsfaktoren (Mediumkontrolle, 4A und 4B) nicht, wohingegen die Zugabe rekombinanter humaner Wachstumsfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie die Osteoblasten regulieren (Urist et al., 1983; Hauschka et al., 1986; Noda er al., 1989; Rodan et al., 1989 und Wozney et al., 1988) sowohl die Cluster- als auch die Kolonie-Bildung stimuliert. Die Kolonie-bildenden Progenitorzellen reagieren gleich gut auf TGF-β und bFGF, wobei etwa 40 bis 60 Kolonien pro 10⁵ Zellen (4B) erzeugt werden. In ähnlicher Weise stimulieren sowohl 1,25-OH D3 als auch BMP-2 die Kolonie-bildenden Zellen, aber in einem geringeren Ausmaß als das mit TGF-β oder bFGF beobachtete.
Die reiferen Cluster-bildenden Osteoprogenitorzellen sprechen am besten auf 1,25-OH Vitamin D3 (Vit. D3, Werte sind negative Logaritmen der Molarität), gut zwischen sowohl dem Knochen-morphogenetischen Protein (BMP-2, Wert sind pM) und dem transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β, Werte sind pM) liegend; aber sie reagieren nicht auf den basischen Fibroplastenwachstumsfaktor (bFGF, Werte in ng/ml) (4). Säulen, die mit „Medium" markiert sind, sind immunadhärente Zellen, die unter Serumfreien Bedingungen ohne Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren kultiviert wurden. Interessanterweise legt die Beobachtung, dass bFGF versagt, die Bildung osteogener Cluster anzutreiben, eine Rolle dieses Wachstumsfaktors nur in der frühen Phase bei der Entwicklung der Knochenprogenitorzellen nahe.
Eine der Schwierigkeiten bei der Präparation von Zell-Abstammungslinien ist die Notwendigkeit, die Entwicklungsstufe präzise zu definieren. Die Erfinder kombinierten Immunisolierung, Durchflusszytometrie-Multiparameteranalyse und funktionelle Assays (Kolonie-Bildung und Ansprechbarkeit auf Wachstumsfaktoren), um humane vom Mark stammende Knochenvorläuferzellen zu charakterisieren. Somit besteht die proliferative Komponente dieser Abstammunglinie aus zwei Typen von Osteoprogenitorzellen (die Kolonie-bildenen und die Cluster-bildenden Zellen) sowie die Präosteoblasten, die jede durch ihre Zellgröße, Ansprechbarkeit auf Wachstumsfaktoren und proliferatives Potential charakterisiert sind. Die verbleibenden isolierten Knochenzellen sind die Osteoblastenzellen, die erhöhte Mengen von Knochenprotein als Antwort auf TGF-β 1 exprimieren, ein geringes Proliferationspotential (wenn überhaupt) haben und ein Kollagen und eine nicht-kollagene Knochenprotein-enthaltende Extrazellulärmatrix hervorbringt und mineralisiert (Long et al., 1990). Diese Untersuchungen zeigen, dass Osteoprogenitorzellen in der folgenden Differzierungskaskade vor den Knochen-bildenden Zellen sind:
Kolonie-bildende Zellen → Cluster-bildende Zelle → Präosteoblasten → Osteoblast
Knochenvorläuferzellen coexistieren unter einer Population von hämatopoetischen Progenitorzellen, die von ihrer differenzierten Nachkommenschaft durch physikalische Methoden getrennte werden können (z.B. Gleichgewichtsdichtetrennung, Plastikadhärenz). Vom Knochenmark abgeleitete Knochenvorläuferzellen sind nicht hämatogenen Ursprung, so wie diese Zellen das panhämatopoetische Zelloberflächenantigen CD34 nicht expremieren und nicht auf der hämatopoetische Wachstumsfaktor ansprechen (Long et la., 1990). Weiterhin, anders als das Murinsystem, können humane Knochenmark-initiierte Knochenzellkulturen nicht von Knochenmark-Stromazellen abgeleitet werden (Long et al., 1990).
Schließlich erzeugen in der späteren Phase der Differenzierung (d.h. in Serum-haltigen langfristigen Kulturen) die vom Knochenmark abgeleiteten Osteoblasten eine Extrazellulärmatrix, die Typ I-Kollagen, Osteonectin, Osteocalcin enthält und in der Von Kossa-Reaktion positiv ist; diese Knochenzellen sind auch in der Lage, Calcium (⁴⁵Ca⁺⁺) in die Extrazellulärmatrix abzuscheiden (Long et al., 1990). Diese Beobachtungen und die vorliegenden Daten zeigen, dass es eine getrennte Linie osteopoetischer Zellen im humanen Knochenmark gibt. Die Daten zeigen auch, dass bei einigen Stufen während der Ontogenität, Knochenvorläuferzellen, wie Präosteoblasten und insbesondere die Osteoprogenitorzellen, nicht eng mit der Endostealoberfläche der Knochen assoziiert sind. Vielmehr können diese Zellen in das Endosteum migrieren, nachdem sie bestimmte Entwicklungscharakteristiken erworben haben, wie die Expression von Kochenprotein(oder andere Extrazellulärmatrix)-Rezeptoren. Osteogene Vorläufer existieren somit als Reservoir der Knochen-bildenden Zellen im Knochenmark.
Beispiel 2: Änderungen in der Ansprechbarkeit der Osteoprogenitorzellen gegen Cytokine während des Alterungsprozesses
Der Alterungsprozess ist mit einer progressiven Verminderung der Knochenbildungskapazität, insbesondere im Trabecula-Knochen (Roholl et al., 1994 und Nimni et al., 1993) verbunden. Dieser Prozess ist mit einer Anzahl von Änderungen in den Knochenproteinen, der Osteoidbildung, Calciumverlust etc. assoziiert, was zur Osteopenie führt. Zentral für all dies ist der Osteoblast. Eine Verminderung der erforderlichen Osteoblastenzahl führt zum Verlust der Knochenbildungskapazität. Ein potentieller Mechanismus für eine solche Verminderung der Osteoblastenzahl ist eine verminderte Ansprechbarkeit der Osteoprogenitorzellen gegen mitotische Aktivierung. Im Ergebnis kann eine Differerzierungsblockade irgendwo zwischen der Osteoprogenitorzellen und dem Osteoblasten existieren. Eine solche Blockade wurde in einem Rattenmodellsystem gezeigt, in dem eine morphometrische Analyse sowohl eine Verminderung im Volumen des Trabecula-Knochens als auch eine (morphologisch) 10-fache Zunahme der Osteoblastenzahl im Alter (Roholl et al., 1994) gezeigt wird.
In ähnlicher Weise zeigt eine morphologische Studie in Menschen auch eine altersbezogene Abnahme der Osteoblastenzahl (Nimni et al., 1993). Andere Studien haben gezeigt, dass Osteoblastenzellen eine verminderte Ansprechbarkeit gegen osteogene Wachstumsfaktoren in sowohl Menschen (Pfeilschifter et al., 1993) als auch Mäusen (Wong et al., 1992) zeigen. Wiederum fehlen Informationan bezüglich der Cytokinansprechbarkeit der humanen Osteoprogenitorzelle oder Präosteoblasten. Die Verminderung der Anzahl der humanen Osteoblasten wird wahrscheinlich durch eine altersbezogene Verminderung der Ansprechbarkeit der Osteoprogenitorzellen verursacht.
Mit der Fähigkeit der Erfinder, zwei Arten von Osteoprogenitorzelle, Präosteoblasten und Osteoblasten, zu quantifizieren, können die Erfinder den Level, bei dem eine solche Blockade für humane Zellen auftritt, quantitativ definieren. Wenn eine Blockade zwischen den Osteoprogenitorzellen und den Präosteoblasten vorliegt, wird die Anzahl der ersteren in der Häufigkeit zunehmen mit einer begleitenden Verminderung in der Anzahl der Präosteoblasten. Eine ähnliche Änderung in den Zellverhältnissen ist nachweisbar, wenn die Blockade zwischen dem Präosteoblast und dem Osteoblast vorliegt.
Altersbezogene Änderungen in der Zellproliferation werden durch Stimulieren der Knochenvorläuferzellen durch verschiedene osteogene Cytokine beurteilt. Bestimmte Wachstumsfaktoren (oder Cytokine), insbesondere TGF-β und bFGF, stimulieren differentiell die frühe Phase der Osteoprogenitorzellproliferation. Die Rolle der differierenden Cytokine bei der Proliferation der Knochenvorläuferzellen in zwei Altersgruppen, 18–25 und ≥ 50, sind von Interesse. Osteoprogenitro-, Präosteoblast- und Osteoblast-Kulturen von beiden Altersgruppen mit verschiedenen Konzentrationen osteogener Wachstumsfaktoren werden kultiviert. Unter den gegebenen Umständen des Effekts auf die Proliferation werden die Wachstumsfaktoren TGF-β, BMP2, bFGF und 1, 25-OH-Vitamin D3 eingesetzt. Andere Wahstumsfaktoren, wie PTH oder andere Mitglieder der BMP-Familie waren auch Gegenstand der Untersuchung. Ein Vergleich des Zellwachstums für beide Altersgruppen benutzt all die vorstehend beschriebenen quantitativen Verfahren. Zusätzlich zur Konzentrationsabhängigkeit wurden altersbezogene Unterschiede in der zeitlichen Ansprechbarkeit der Wachstumsfaktoren untersucht.
Die Differenzierungseffekt für verschiedene Cytokine in der frühen und der späten Phase der Knochenvorläuferzell-Proliferation (z.B. TGF-β bzw 1,25-OH-Vitamin D3) wurden untersucht. Eine synergistische Interaktion kann auftreten, wenn die Knochenvorläuferzellen gleichzeitig mit diesen zwei Klassen von Wachstumsfaktoren kultiviert werden. Die Erfinder werden somit eine Anzahl relevanter Kombinationen von Wachstumsfaktoren beurteilen, z.B. TGF-β + BMP, TGF-β + D3, bFGF + BMP und bFGF + D3.
Diese Studien über die Cytokin-Kontrolle der Osterprogenitorzell-Proliferation erlaubt die präzise Bestimmung jeder altersbezogener Änderung der Cytokinansprechbarkeit. Zusätzlich ergeben diese Studien wichtige Informationen bezüglich der kombinatorischen Cytokin-Kontrolle der Knochenzellentwicklung. Die Fähigkeit der Erfinder, die Osteoprogenitorzellen, Präosteoblasten und Osteoblasten, zu untersuchen, bestimmt die exakten Entwicklungslevels genau, bei denen die Änderungen, wie eine Differenzierungsblockade, auftritt. Beispielsweise können alstersbezogene Änderungen zeigen, dass, währen die Osteoprogenitorzell-Proliferation äquivalent ist, eine verminderte Ansprechbarkeit der Präosteoblasten vorliegt, die einen Defekt bei diesen Entwicklungslevel anzeigt. Somit macht jede dieser drei Testarten alternative Levels der Differenzierung bezüglich Defekte zugänglich. Jedes der Bestandteile der osteogenen Mikroumgebung, gereinigte Zielzellen, gereinigte (und/oder) rekombinante Cytokine/Wachstumsfaktoren und gereinigte Extrazellulärmatrixmoleküle, ist verfügbar, und ihre Interaktionen werden in einer systematischen, kontrollierten Weise untersucht. Daher können sowohl positive als auch negative Ergebnisse leicht in allen Schritten der Knochenvorläuferzell-Proliferation in beiden Altersgruppen nachgewiesen werden. Dieses Studien sind dahingehend begrenzt, dass die keine anderen Arten der Kontrolle, wie ECM-Proteine oder Versagen der Osteoblastenproliferation beurteilen. Diese werden nachstehend im Beispiel 3 angesprochen.
Beispiel 3: Zelluläre Interaktion während der Osteoprogenitorzell-Proliferation und – Differenzierung, und wie sie während des Alterns moduliert werden.
Wie es bei anderen Gewebetypen zutrifft, tritt die Knochzellentwicklung in einer spezifischen Mikroumgebung auf, in der entwickelnde Knochenzellen miteinander, der Extrazellulärmatrix und mit dem Matrix:Cytokin-Komplex interagieren.
Eine wichtige aber wenig verstandene Komponente der osteogenen Mikroumgebung ist die Extrazellulärmatrix. Wie erwähnt, enthält die extrazelluläre Knochenmatrix sowohl kollagene als auch nicht kollagene Proteine. Wenn Knochenvorläuferzellen mit bestimmten nicht kollagenen Proteinen kultiviert werden, zeigen sie ein erhöhte Prolifeation und Knochenzellen-Antigenexpression. Weiterhin haben die Erfinder unter Verwendung des hämopoetische Systems als Modell gezeigt, dass die Subpopulation der primitiven Progenitorzellen sowohl mitogene Cytokine als auch spezifische Extrazellulärmatrix(ECM)-Moleküle benötigen, um zu proliferieren (Long et al., 1992). Tatsächlich vesagen ohne dem obligaten Matrix:Cytokin („matricine")-Signal die meisten primitiven Blutvorläuferzellen in vitro sich zu entwickeln (Long et al., 1992) Obwohl es wenig verstanden ist, ist es wahrscheinlich, dass ein ähnliches Erfordernis für humane Knochenvorläuferzellen existiert. Die vollständige Beurteilung der osteogenen Änderungen, die mit dem Alter auftreten, erfordern ein Verständnis der Rolle der ECM-Moleküle bei der Knochenvorläuferzell-Proliferation.
Wie vorstehend erwähnt, interagiert sich entwickelnde Gewebezellen mit einer großen Vielzahl von Regulatoren während ihrer Ontogenie. Jede dieser Wechselwirkungen wird mittels definierter spezifischer Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen vermittelt, die für beides, die Zellproliferation und/oder die Beweglichkeit, notwendig ist. Ferner existieren sowohl chemische und/oder Extrazellulärmatrixgradienten, die den Zellen signalisieren, in eine definierte Mikroumgebung sich zu bewegen (z.B. in den Bereich einer Knochenfraktur). Außerdem dienen hohe Konzentrationen des Lockmittels oder andere Signale als nächstes dazu, die Zellen zu „lokalisieren", um die nicht zufällige Bewegung zu stoppen. Signale, die Zellen in geeigneten Microumgebungen stoppen und/oder regionalisieren werden wenig verstanden.
Die Erfinder haben auch im hämatopoetischen System gezeigt, dass Komplexe der Cytokine und der Extrazellulärmatrix-Moleküle dazu dienen, die Progenitorzellen zu lokalisieren (Long et al., 1992). Eine ähnliche Mobilität (chemotactil) oder Lokalisierungssignal gibt es für Knochenvorläuferzellen, und vermitteln ihre Bewegung in eine osteogene Region (wie eine Fraktur). Bedeutsamerweise haben sich die Erfinder Mittel ausgedacht, um dieses Phänomen zu untersuchen. Quantitative Assays für die Zelladhäsion stellen die minimalen Erfordernisse für die Zelllokalisation bereit. Quantitative Assays zur Beurteilung sowohl der Chemotaxie als auch der Chemokinese werden benutzt.
Zell: Zell-Interaktion, die für die Knochenvorläuferzelle-Proliferation erfordert wird. Die Effekte der Alterung humaner Knochenvorläuferzellen wird durch Untersuchen der Zell:Zell- und Zell:ECM-Wechselwirkung in verschiedenen Stufen der Entwicklung untersucht. Die Rolle des Alterns auf die Expression der bekannten Zelladhäsionsmoleküle wird beurteilt, insbesondere unter Fokusierung auf die β1- und β3-Integrine. Die Mitglieder der Integringensuperfamilie dienen als Rezeptoren für sowohl andere Zellen als auch Extrazellulärmatrix-Proteine (Giancotti et al., 1990). Die Zellbindung an Integrine ist schnell (innerhalb von Minuten) und tritt eher als Ergebnis einer erhöhten Avidität als einer erhöhten Expression auf (Lawrence et al., 1991). Der Ligand für die meisten aber nicht alle Integrine ist das als Arginin-Glycin-Asparagin (RGD) sequenzierte Tripeptid (Ruoslahti et al., 1987).
Strukturell weisen Integrine zwei Membran-überspannende alpha- und beta-Ketten auf. Die alpha-Untereinheit enthält drei bis vier hintereinander folgende Wiederholungen des divalenten, ionenbindenden Motifs und benötigt Magnesium oder Calcium um zu funktionieren. Die alph-Ketten sind (für die meisten Teile) verschieden und binden mit gemeinsamen oder verwandten β-Einheiten, um funktionelle Rezeptoren zu ergeben (Giancotte et al., 1990). Die β-Ketten scheinen eine funktionelle Bedeutung zu haben, und Integrin kann basierend auf dem Vorliegen spezifischer beta-Ketten subklassifiziert werden. Somit sind Familienmitglieder, die β1- und β2-Ketten enthalten hauptsächlich der Zell:Extrazellulärmatrix-Wechselwirkung förderlich, wohingegen Moleküle, die die β2-Untereinheit enthalten, hauptsächlich in der Leukozyten:Leukozytqen-Wechselwirkung funktionieren.
Die Studien fokusieren sich somit auf die Rolle von β1- und β3-Integrine bei der Vermittlung der Bildung von Kolonien humaner Knochenvorläuferzellen und der Präosteoblastenproliferation. Zwei alternative Ansätze werden verwendet. Erstens werden Antikörper gegen spezifische Integrine (die VLA-Proteine 1–6, Fibronectinrezeptor, Typ I-Kollagenrezeptor und Vitronectinrezeptor sowie zwei Nicht-Integrinadhäsionsmoleküle ICAM 1 und 2) als Sonden für die Integrinexpression von humanen Knochenvorläuferzellen durch Durchflusszytometrie verwendet.
Wenn einmal die relevanten Moleküle identifiziert wurden, wird ihre Rolle bei sowohl der Proliferation als auch der Differenzierungsbildung mit den Knochenzellassays der Erfinder beurteilt werden. In diesen Untersuchungen werden humane Knochenvorläuferzelle-Assays (wie vorstehend) eingerichtet und mit Antikörpern (sowie isotyp spezifische Kontrollen) behandelt, um die Rolle dieser Rezeptoren bei der Koloniebildung (d.h. Zell:Zell-Interaktion bei den Osteoprogenitor-Zellen zum Präosteoblasten-Level) und in Präosteoblasten-Kulturen (um ihre Rolle bei der Proliferation und im Schritt von Präosteoblast zu Osteoblast zu untersuchen) zu bestimmen. Alternativ werden diese Kulturen mit Peptiden behandelt, die die RGD-Sequenz enthalten, um die Integrinvermittelte Funktion zu inhibieren. Kontrol-Kulturen werden mit Peptiden in äquivalenter Größe behandelt, denen das RGD-Motif fehlt.
Knochenvorläuferzellen: Extrazellulärmatrix-Interaktion. Die Erfinder haben die Wichtigkeit der drei Knochen-ECM-Proteine beim Wachstum humaner Knochenzellen gezeigt: Osteonectin, Osteocalcin und Typ I-Kollagen (Long et al., 1990 und Long et al., 1994). Diese und vier zusätzliche Matrix-Proteine werden hinsichtlich Änderungen beurteilt, die während des Alterns auftreten: Knochensialoprotein, Osteopontin, Fibronectin und Thrombospondin (Nomur et al., 1988 und Oldberg et al., 1986). Knochensialoprotein und Osteopontin sind wahrscheinlich bei der Knochenbildung involviert, aber ihre Rolle bei der Proliferation ist unbekannt. Die zwei letzten Proteine (Thrombospondin und Fibronectin) wurden wegen ihrem Vorkommen in der Knochenextrazellulärmatrix aufgenommen, und ihre Wichtigkeit als Cytoadhäsonsmolekül in sich entwickelnden Gewebe wurde gezeigt (Weiss et al., und Clezardin et al., 1989).
Um die Wirkung dieser ECM-Moleküle auf die Zellproliferation zu untersuchen, wurden gereinigte Knochen-ECM-Moleküle zu den Cytokin-gesteuerten Knochenvorläuferzell-Kulturen gegeben. Verschieden Mengen exogener ECM-Moleküle wurden in Gegenwart eines einzelnen Wachstumsfaktors (z.B. 25 pM TGF-β oder die vorstehend ausgeführte optimale Faktorkonzentration) zugegeben, um eine präzise Beurteilung des Entwicklungseffekt von jeder der Extrazellulärmatrix-Moleküle zu erlauben. Der kombinierte Effekt der relevanten Cytokine und der Matrixmoleküle auf die Ausdehnung der humanen Knochenvorläuferzellen in vitro wurde bestimmt.
Knochenvorläuferzell-Cytoadhäsion und Gewebelokalisierung. Ein Cytoadhäsionsassay, der Gerüstfluorochrome („caged fluorochromes) einsetzt, um die isolierten Progenitorzellen für die nachfolgende Adhäsion zu markieren, wurde entwickelt. In diesem Assay wurden Acetylmethylester-Derivate von FITC verwendet. Um die Zellen lebensfähig zu markieren. Nach Internalisierung spalten intrazelluläre Esterasen das AM-Ester-Derivat, wobei das freigesetzt Fluorochrom relativ impermeabel bleibt. Bedeutsamerweise ist das Fluoreszenzsignal linear bezüglich der Zellzahl, und so wenig wie mehrere hundert Zellen können nachgewiesen werden. Der Cytoadhäsions-Assay besteht aus der Adhäsion der mit dem Gerüstfluorochrom markierten Zellen an gereinigten und/oder rekombinanten Proteinen, die an Gewebekulturplastik imobilisiert ist, wie früher beschrieben (Long und dixit, 1990 und Long et al., 1992), dem Entfernen der nicht-adhärenten Zellen und der Quantifizierung in einem Fluoreszentplattenlesegerät. Die resultierende Sensitivität des Assays ist etwa 100 mal größer als die anderer Cytoadhäsionsassays, über die berichtet wurde (Long und Dixit, 1990; Long et al., 1992; Campbell et al., 1990) Die Erfinder benutzten diesen Assay in vorläufigen Studien über gereinigte humane Knochenvorläuferzellen (aus jungen Individuen), um die Anbindung an Extrazellulärmatrixmoleküle zu untersuchen. Diese Daten zeigen, dass Knochenvorläuferzellen differentielle Anbindungskapazitäten in sowohl immobilisierten Knochen-ECM-Molekülen als auch immobilisierten Cytokinen exprimieren. Diese Beobachtungen sind ähnlich mit denen einer früheren Arbeit aus dem Labor der Erfinder, bei der gezeigt wurde, dass hämatopoetische Progenitorzellen sowohl an Wachstumfaktoren als auch an ECM-Moleküle binden (Long und Dixit, 1990; Long et al., 1992 und Campbell et al., 1990
Somit zeigen als divergente Zellphänotypen sowohl Knochen- als auch hämatopoetische Zellen duale Anforderungen an die Matrix und Cytokinmoleküle beim Lokalisierungsprozess (Adhäsion). Bemerkenswerterweise zeigt das Binden von Progenitorzellen an immobilisierte solitäre Cytokine weiter, dass die Gegenwart eines Wachstumsfaktors (die oft selbst in der Extrazellzlärmatrix immobilisiert sind (Long, 1992)) zumindest teilweise für die Abstammungslinien-spezifische Lokalisierung der Zellen verantwortlich ist. Nichts desto weniger festigt die Gegenwart spezifischer ECM-Moleküle ohne Zweifel den Lokalisierungsprozess.
Um diese Untersuchungen durchzuführen, wurden Kulturen von proliferierenden Knochenvorläuferzellen sowie Osteoblastenzellen unter optimalen Cytokin-Bedingungen etabliert (wie vorstehend). Die Kapazität der Knochenvorläuferzellen mit den Knochenzell-Regulatorcytokinen (bFGF, TGF-1 und BMP und Extrazellulärmoleküle (Osteonectin, Osteocalcin, Knochensialoprotein, Osteopontin, Fibronectin und Thrombospondin) zu interagieren (anhaften), wurden beurteilt. Diese Proteine wurden einzeln und in Kombination untersucht, um ihren relativen oder synergistischen Beitrag zur Knochenzelladhäsion zu bestimmen. Diese Studien sind sowohl bestärkende als auch ausgedehnte Studien, in denen ECM-Cytokinmoleküle exogen zur Kultur gegeben wurde, um den Proliferationseffekt zu bewerten.
Knochenvorläuferzelle-Chemotaxi. In einer ähnlichen Art wird der Effekt des Altern auf den Beweglichkeitsmechanismus der entwickelnden Knochenvorläuferzellen untersucht. In diesen Studien, werden verschieden Knochen-bezogene Wachstumsfaktoren beurteilt hinsichtlich ihrer Kapazität zur direkten nicht-zufälligen Bewegung (Cytokinese) und nicht zufälligen Migration (Chemotaxi). Wie erwähnt besitzen frühe Knochenvorläuferzellen die Fähigkeit, aktiv in das Gebiet der Knochenverletzung zu migrieren, wo sie in Knochenbildende Zellen differenzieren. Es gibt aber keine Informationen über die Faktoren oder Ereignisse, deren Signal für den Migrationsprozess wichtig ist oder wie er während des Alterns geändert werden kann. Ein Fluoreszenz-basierender Assay, der sowohl Chemokinese als auch Chemotaxi bewertet, steht zur Verfügung (Deforge et al., 1992).
Um die Effekte des Alters auf die Migrationsfähigkeit der Knochenvorläuferzellen zu bewerten, wurde ein Panel bekannter Leukozyten-chemotaktischer Faktoren, osteogener Faktoren und ECM-Protein in direktem Vergleich von Zellen aus den zwei Altersgruppen benutzt. Knochenvorläuferzellen aus Individuen aus beiden Altersgruppen wurden hinsichtlich der Ansprechbarkeit auf beide bekannten chemotaktischen Faktoren (Chemokine, d.h. Interleukin-8, GM-CSF, M-CSF) und hinsichtlich der mutmaßlichen Rolle des osteogenen Wachstumsfaktors bei der Stimulierung entweder der Chemokinese oder der Chemotaxi bewertet. Insbesondere wurden bFGF und TGF-1, beide leistungsstarke Regulatoren der Knochenzellproliferation sowie BMP2, PTH und 1,25-OH-Vitamin D3 bewertet. Die Chemokine sind Mitglieder der chemotaktischen Cytokin-Supergenfamilie (Oppenheim et al., 1991).
Die „chemokinen" Cytokine werden umfasst von Molekülen mit ihren ersten zwei Cysteinen, die durch eine Amniosäure (C-X-C) unterbrochen sind, und werden von solchen Molekülen repräsentiert, wie Interleukin-8 (IL8) und Platletfaktor 4 (PF4). MCP-1 und RANTES sind Vertreter der „chemokinen" Subfamilie und durch ein nicht unterbrochenes C-C-Arrangement charakterisiert. Die Verwendung von IL-8 und MCP-1 ermöglicht die Verwendung von chemotaktischen Faktoren, die bekannt sind, dass sie die Migration eines breiten Spektrums von Zellen induzieren (Oppenheim et al., 1991).
Die bewerteten ECM-Proteine sind vorstehend beschrieben. Diese Studien bestimmen (Urist et al., 1983) das geeignete Cytokin und/oder die Cytokin-Kombination für das Knochenvorläuferzell-Wachstum (Fishman et al., 1962), die Rolle der Zell:Zell-Interaktionen und (Hattersley et al., 1989) die relevanten ECM-Moleküle, die für die humane Knochenvorläuferzell-Proliferation notwendig sind. Diese Studien über die Integrinexpression schildern genau den Mechanismus wie humane Knochenvorläuferzellen miteinander und den ECM interagieren und wie diese Interaktionen während des Alterns modifiziert werden können. Studien der ECM-Moleküle bestimmen, welche die relevanten Komponenten sind, die bei der Proliferation und/oder Migration involviert sind und ob die Ansprechbarkeit gegen eine dieser mit dem Alter verloren geht.
Zusätzlich ist es wahrscheinlich, dass überschüssige Konzentrationen des/der gegebenen Cytokins(e) oder ECM-Proteins(e) ein altersbezogenes Defizit überwindet, womit gezeigt wird, dass der Altersdefekt für die Zelle exogen ist. Diese Studien wurden so entworfen, dass eine komplexe osteogene Mikroumgebung auf eine schrittweise Beurteilung von jeder ihrer relevanten Komponenten vermindert wird. Diese Studien definieren sowohl die minimalen wesentlichen Bedingungen für die Proliferation der humanen Knochenvorläuferzellen als auch die altersbezogenen Änderungen.
Beispiel 4: Altersbezogene Änderungen in der Knochenproteinexpression durch eine gereinigte Population humaner Knochenvorläuferzellen
Das vorliegende Beispiel betrifft die weiter immunologische Reinigung und Charakterisierung der Knochenantigen-positiven humanen Trabecula- Knochenvorläuferzellen und zeigt, dass voneinander verschiedene altersbezogene Änderungen in der zellulären Expression von Osteonectin und Osteocalcin in diesen Zellentypen auftritt.
MATERIAL UND METHODEN
Knochenvorläuferzell-Präparation und Kultur. Aspirate humanen Knochemarks wurden aus normalen Freiwilligen nach Aufklärung und Zustimmung erhalten. Es sollte beachtet werden, dass Proben von jungen Individuen (≤ 18 Jahren) aus verworfenen Teilen des Knochenmarks kam, die im pädiatrischen hämatologischen/ontologischen Dienst für die allogene Knochenmarkstransplantation erhalten wurden, für die die nach Aufklärung erfolgte Zustimmung von den Eltern kam. Knochenmarkproben aus Individuen ≥ 18 Jahren wurden nach Aufklärung gegebener Zustimmung durch Routineknochenmarks-Aspiration erhalten.
Als Alternative wurden auch Mark von älteren Individuen aus Rippenfragmenten erhalten, die im Verlauf eines Thoraxeingriffes verworfen wurde (bis jetzt haben die Erfinder keine ortsabhängigen Unterschiede in den Durchflusszytometrie-Parametern der humanen Knochenvorläuferzellen festegstellt).
Nicht adhärente Knochenmarkszellen niedriger Dichte (NADL) wurden durch Adhärenzzellverarmung und Dichtetrenntechniken, wie bei Long et al., (1988) und in Beispiel 1 beschrieben, erhalten. NALD-Zellen wurden dann einer Immunadhärenzisolieruung oder einer immunmagnetischen Reinigung unterzogen.
Antikörper, Immunadhärenz und Induktion der Differenzierung. Die Expression von Knochenproteinantigenen wurde durch Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrie unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen humanes Osteonectin, alkalische Phosphatase oder Osteocalcin, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.
Immunadhärenzisolierung aus humanen Trabecula-Knochenvorläuferzellen und ihre Induktion zur Osteoblastendifferenzierung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Die Induktion der Osteoblastendifferenzierung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung von 25 pM TGF-β durchgeführt.
Immunmagnetische Reinigung humaner Knochenvorläuferzellen. Reinigung humaner Knochenvorläuferzellen wurde unter Verwendung der immunmagnetischen Trennung durchgeführt. Diese wurde via magnetische aktivierte Zellsortierung (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA) mit den Anweisungen des Herstellers, wobei sie aber wie nachstehend modifiziert wurde, ausgeführt.
Für die MACS-Trennung wurden die NALD-Zellen einmal gewaschen und gleichzeitig mit FITC-konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen Osteocalcin und mit biotynilierten anti-Osteonectin (beide wie vorstehend) markiert, beide mit 10 μg/ml in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 1 % BSA, pH 7,6. Die Antikörper-markierten Zellen werden dann zweimal gewaschen und mit anti-Maus IgG von der Ziege (spezifisch auf schwere und leichte Ketten, Milteny), die an superparamagnetische Nanokügelchen konjugiert sind. Die Antikörper werden mit 180 μl pro 10⁸ NALD-Zellen pro 1,0 ml während 30 Minuten bei 4 °C inkubiert.
Das Anti-IgG-Markieren wird in einem Säulen-beladenden Puffer (0,5% BSA, 0.1% Glucose in PBS), modifiziert um 0,5 μg/ml Aprotinin, 0,5 μg/ml Leupeptin und 5 μg/ml Sojabohnentrypsininhibitor und 500 U/ml DNase (Sigma) zu enthalten, durchgeführt. Die Proteaseinhibitoren wurden zugegeben, um früheren Studien zu folgen, die einen progressiven Antigenverlust mit zunehmender Trennzeit zeigen; die DNase wurde zugegeben; um eine Zellklumpung auszuschalten (Long et al., 1988).
Eine magnetische Miltenyi-Säule, die mit einem 26g-Flussrestrictor (Miltenyi) bei 1 × 10⁸ Zellen/ml in 1,0 ml-Inkrementen ausgestattet war, wobei 0,5 ml Ladepuffer nach jedem Inkrement liefen, wurde mit 100 – 300 × 10⁶ Zellen beladen. Antigen-negative Zellen werden mit 1,0 ml eines Elutionspuffers (Ladepuffer mit DNase und Proteaseinhibitor um Faktor 4 erhöht) eluiert. Nach der Elution werden Antigen-positive Zellen durch Entfernen des Magneten gewonnen und mit 1,0 ml Elutionspuffer eluiert. Diese Antigen-positiven Zellen werden dann in einer zweiten magnetischen Säule unter Verwendung des gleichen Verfahrens wieder isoliert.
Durchflusszytometrische Analyse. Durchflusszytometrische Analyse wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei ein Becton-Dickinson (San Jose, CA) verwendet wurde. FACSCAN-System und -Daten wurden mit dem BD LysLys-Softwareprogramm analysiert. Kontrollen bestanden aus Autofluoreszenz sowie nicht-spezifischer Fluoreszenz, die mit isotyp-spezifischem monoklonalen Antikörper gegen Murin detektiert wurde, um das von Becton Dickinson erhaltene Lymphethämocyanin (KLH) einzupassen.
Für die Zweiantigen-(Zweifarben)-Analyse, werden die magnetisch isolierten Zellen dann während 15 Minuten bei 4 °C mit einem Strep-Avidin, das an PerCP (Becton Dickinson) konjugiert ist, inkubiert, um die Osteonectinantigen-Determinante zu visualisieren. Immunmagnetisch gereinigte Zellen werden hinsichtlich der Fluoreszenzintensität versus Größe (Durchlasswinkelstreuung) sowie intrazellulärer Komplexität (Seitenstreuung) analysiert.
Um die zellulären Charakteristiken der Präosteoblasten- und Osteoblasten-Zellen in Immun-isolierten Populationen abzubilden, wurden zweifarbige Fluoreszenzprofile rückausgewertet (Given et al., 1992), um die Größe und die Seitenstreuprofile zu bestimmen.
ERGEBNISSE
Osteoblastendifferenzierung der Präosteoblasten. Die Erfinder zeigten früher, dass die Immunadhäsion, die durch Antikörper an humane Knochenmatrixproteine vermittelt wurde, in der Isolierung der Population humanem Knochenmarks resultiert, das auf osteogenen Cytokine reagiert, aber die Ansprechbarkeit auf hämatopoietischen Wachstumsfaktoren (Beispiel 1) fehlt.
Um die Knochenvorläuferzellen weiter zu charakterisieren, isolierten die Erfinder humane Knochenvorläuferzellen durch Immunadhärenz und unterzogen die erhaltene Zellpopulation einer Multiparameter-Durchflusszytometrie, um die zellulären Unterschiede zwischen isolierten Präosteoblasten und Osteoblasten zu charakterisieren.
Unter Bestätigung und Ausdehnung der früheren Daten ergab die Immunadhäsion eine Population von Knochenantigen-positiven Zellen, die hauptsächlich die Größe von Lymphozyten haben, die, wenn sie mit TGF-β stimuliert werden, eine deutliche Erhöhung der Antigendichte und der Zellgröße (5A, 5B und 5C) zeigen. Bemerkenswerterweise gibt es zwei Größenpopulationen (wie durch die Parameter „Durchlasswinkelstreuung" in 5 gezeigt) unter den immunadhärenten Zellen, und die TGF-β-induzierte Differenzierung ergibt eine Verschiebung zwischen den kleinen und großen Zellkompartimenten (5A obere linke und rechte Abbildungen).
Um die Entwicklungscharakteristiken dieser Zellen weiter zu untersuchen, wurden isolierte, nicht induzierte und induzierte Zellen elektronisch in kleine und große Zellkompartimente geteilt und rückuntersucht, um die Seitenstreucharakteristik von jeder (5A untere linke und rechte Unterabbildungen) bestimmt.
Diese Daten zeigen, dass die größeren Osteoblastzellen (d.h. die, die in das skizzierte Quadrat in den Figuren fallen) auch einen höheren Grad intrazellulärer Organisation (Seitenstreucharakteistik) haben. Das wurde sowohl in nicht induzierten Zellen (in denen die Zellen in der Größe der Osteoblasten etwa 5 % des Isolats ausmachen) und induzierten Zellen (5, linke bzw. rechte Unterabbildung) gesehen. Somit ergibt die TGF-β-induzierte Differenzierung humaner Knochenvorläuferzellen eine Erhöhung im Antigengehalt, der Zellgröße und einer Erhöhung der intrazellulären Komplexität. Dies trifft sowohl auf Osteocalcin(BGP)-positive Zellen, wie in 5A, 5B und 5C gezeigt, und auf alkalische Phosphatase-positive Zellen zu.
Isolierte Zellen enthalten auch eine Zellpopulation (Kreise in 5A), in denen die Antigendichte wenig von den nicht spezifischen Antikörperkontrollen verschieden ist. Rückauswertung dieser Population zeigt übereinstimmend, dass diese Zellen einen geringen Grad der Seitenstreuung haben. Diese Charakteristiken (d.h. geringe Seitenstreuung und gering Größe) sind in Übereinstimmung mit der verbleibenden Population Lymphoidähnlicher, die keine nachweisbaren Knochenantigene tragen.
Immunmagnetische Reinigung humaner Knochenvorläuferzellen. Die immunadhärente Isolierung humaner Knochenvorläuferzellen basiert auf der Coimmobilisierung monoklonaler Antikörper gegen sowohl Osteonectin als auch Osteocalcin (Beispiel 1). Dieses Verfahren ergibt eine gereinigte Population an Knochenvorläuferzellen, die Osteocalcin, Osteonectin und alkalische Phosphatase exprimieren. Dieses Verfahren erlaubt aber nicht, zwischen individuellen Subpopulationen der Zellen, die diese Antigene exprimieren, oder Zellen die Osteonectin, alkalische Phosphatase und Osteocalcin in der selben Zelle coexprimieren, zu unterscheiden.
Um dies zu untersuchen, führten die Erfinder weitere Reinigungen dieser Zellen durch, wobei die magnetisch aktivierte Zellsortierung benutzt wurde. Die Isolierung dieser Zellen benutzte somit eine physikalische Trennung (Gleichgewichtsdichtezentrifugation), Plastikadhäsion (um Knochenmarksstromazellen zu entfernen) und immunmagnetische Trennung.
Intersanterweise ergibt die physiko-chemische Trennung (Dichte) eine moderate Anreicherung dieser Zellen auf ein Niveau von 6–7 % Reinheit (6A; Tabelle 1). Im Gegensatz dazu ergibt die immunmagnetische Trennung, die auf Osteocalcin- und Osteonectin-Antikörper beruht, eine 95% reine Zellopulation (6B), die eine etwa 4 800-fache Reinigung gegenüber unfraktioniertem Knochenmark darstellt (Tabelle 1).
TABELLE 1
Reinigung humaner Knochenvorläuferzellen durch kombinierte physiko-chemische und immunologische Verfahren.

Häufigkeit ist die Zahl der Osteocalcin-positiven Zellen, die durch Durchflusszytometrie bestimmt wurden.
^A Unfraktionierts Knochenmark ist die Häufigkeit der Osteocalcin-positiven Zellen in nicht getrenntem Knochenmark, aus denen RBCs durch Geschwindigkeitssedimentation entfernt werden, und die reslutierenden WBC werden der Durchflusscytometrie und Rückauswertung wie im Text unterzogen.
^B Immunadhärenz und immunmagnetische Trennungsreinigung sind keine sequenziellen Schritte. Vielmehr zeigen diese zwei Reihen die relativ-fache Reinigung jeder Technik.
BM = Knochenmark, EDC = Gleichgewichtsdichtezentrifugation, HBPC = humane Knochenvorläuferzellen, N.A. = nicht anwendbar, NALD = Nichtadhärent niedrige Dichte. Ein typisches Trennungsverfahren wird dargestellt.

Immunmagnetisch getrennte Zellen wurden einer zweifarbigen Fluoreszenz-aktivierten Zytometrie unterzogen, um die Expression von Ostonectin und Osteocalcin zu untersuchen. Diese Daten zeigen, dass die isolierten Zellen beide Proteine coexprimieren (8B). Weiterhin demonstrieren die Antigendichte-Konturplots, dass diese Antigene in einer einzelnen Zellpopulation coexprimiert werden, so dass keine verschiedenen Subpopulationen der Einzelantigen-positiven Zellen nachgewiesen werden.
Es bleibt jedoch eine Population Antigen-schwacher Zellen (Quadrant 3 in 6B). Ungleich der antigenen Null-Population, die in den durch Immunadhärenz getrennten Zellen gesehen wurde, haben jedoch die magnetisch getrennten Antigen-niedrigen oder schwachen Zellen die gleiche Seitenstreucharakteristik wie die doppel-positive Zellpopulation (vgl. 5B, mit einem Kreis dargestellte Population rechts und links). Davon ausgehend, dass diese Zellen nach zwei Durchgängen durch die magnetische Isolationssäule wieder gewonnen werden, ist es unwahrscheinlich, dass diese kontaminierende Lymphoidzellen sind (wie sie in der auf immunadhärenz basierenden Trennung gesehen werden). Vielmehr stellen sie Zellen mit ausreichender (wenn auch niedriger) Antigendichte (wenn auch eine niedrige Dicht) dar, um sie in Gegenwart eines magnetischen Feldes zurück zu halten.
Zunehmendes Donoralter ist mit Änderungen in der Knochenproteinexpression humaner Knochenvorläuferzellen assoziiert. Eine Serie von durchflusszytometrischen Untersuchungen an immunmagnetisch getrennten Knochenvorläuferzellen demonstrierte, dass die altersbezogenen Änderungen in der Knochenproteinexpression mit zunehmenden Alter auftritt. Diese Studien wurden bei insgesamt 41 Individuen in drei Altersgruppen durchgeführt: ≤ 25 Jahre alt (mittleres Alter 16,4 +/– 7 (S.D.) Jahre, Bereich 1,5 bis 24 Jahre, n = 15), 50 Jahre alt (mittleres alter 36,6 +/– 5 Jahre alt, Bereich 26 bis 45 Jahre, n = 9) und Individuen ≥ 50 Jahre alt (mittleres Alte 70,1 +/– 12 Jahre, Bereich 53 bis 89 Jahre, n = 17).
Humane Knochenvorläuferzellen wurden isoliert und gereinigt aus Individuen der angegebenen Altersgruppen und einer Multiparameter-Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen. Unter Bestätigung der vorstehenden Beobachtungen coexprimieren Antigengereinigte humane Knochenvorläuferzellen aus diesen drei Alterspopulationen sowohl Osteonectin als auch Osteocalcin.
Interessanterweise erhöht sich die Antigenexpression von Osteonectin und Osteocalcin durch humane Preosteoblasten-Zellen mit zunehmenden Alter. Um diese Verschiebung der Antigendicht sichtbar zu machen, wurden Zytometrie-Profile von zwei repräsentativen Individuen (eine im Alter von 60 Jahren, ein im jungen Alter von 9) überlagert (7A und 7B). Diese Profile wurden als repräsentativ definiert, da ihre Werte der mittleren Fluoreszen und der Peakfluoreszenz mit dem für die entsprechende Alterskohorte bestimmten Mittelwert identisch sind und ihre Variationskoeffizienten ähnlich waren.
7A und 7B zeigen deutlich, dass die humanen Knochenvorläuferzellen in älteren Individuen (d.h. ≥ 50 Jahre alt) höhere Mengen dieser zwei Knochenproteine als junge Individuen exprimieren (d.h ≤ 25 Jahre alt). Die Profile mittelalter Individuen lagen zwischen den zwei anderen Altersgruppen.
Um zu bestimmen, ob diese Änderungen statistisch signifikant für die gesamte Population waren, wurde die mittlere spezifische Fluoreszenz und die Peakfluoreszenz für jedes Individuum in jeder Altersgruppe bestimmt. Eine signifikante (p ≤ 0,05) altersbezogene Zunahme wurde beobachtet bei sowohl der mittleren spezifischen Fluoreszent für Osteocalcin und Osteonectin (8) als auch bei der Peakfluoreszenz von jedem Antigen.
Osteocalcin zeigt eine moderate aber signifikante Änderung der mittleren Fluoreszenz, die um 21 arbiträren Log-Einheiten zunahm. Im Gegensatz dazu nahm die Osteonectin-Expression in einem größeren Maß in der Population der älteren Individuen zu (eine Zunahme von 59 auf 89 arbiträren Log-Einheiten; 10).
Die Erfinder analysierten diese unerwartete Zunahme der Knochenproteinlevels weiter durch Untersuchung der Beziehung zwischen dem Alter und der Antigenexpression (9) Es ist zu beachten, dass bei diesen Daten die Anhzahl der mittelalten Individuen niedriger ist, als bei den anderen zwei Alterskohorten. Nichtsdestoweniger scheint es, dass die Majorität den Zunahme der Osteonectin- und Osteocalcin-Levels in humanen Knochenvorläuferzellen zwischen dem Alter von 15–16 und 35–40 auftritt.
Von den 17 beurteilten Individuen, die älter als 60 Jahre waren, zeigten vier (drei Frauen mit 64, 88 und 89 Jahren und ein Mann mit 59) keine immunophänotypische Charakterisierung der humanen Knochenvorläuferzellen, wie vorstehend beschrieben (5C). Vielmehr sind die Majorität (80–90 %) der angenommenen Präostoblasten, die aus diesen Individuen isoliert wurden, im Antigenghalt ähnlich der Antigen-schwachen Population der in 5B (linke Abbildung, kreisförmig dargestellte Population) beschriebene Zellen.
Diesen Individuen fehlt somit die prädominante Osteocalcin-positive/Osteonectin-positive (OC⁺⁺/ON⁺⁺) Glanz(„bright")-population, die in allen anderen Individuen (n = 37) beobachtet wurde, einschließlich der altersbezogenen Kohorte (sowohl männlich als auch weiblich). Unter der gegebenen immunmagnetischen Retention dieser Zellen an der Säule und dass die Durchlasswinkel- und die Seitenstreu-Charakteristiken dieser Zelle identisch mit denen der Antigen-schwachen Subpopulation sind, schlossen die Erfinder, dass diese Individuen eine Präosteoblasten-Population besitzen, die sich deutlich in ihrer Antigenexpression unterscheidet.
In Übereinstimmung damit, ist die mittlere Fluoreszenz und die Peakfluoreszenz von sowohl Osteonectin als auch Osteocalcin signifikant vermindert, selbst wenn sie mit der jüngsten Alterskohorte verglichen wird (Tabelle 2). Diese Daten lassen vermuten, dass eine getrennte Subpopulation von Individuen mit deutlich verschiedener (niedrigerer) humaner Knochenvorläuferzell-Antigenität existiert.
Die physiologische und klinische Bedeutung solcher Änderungen kann sein, dass der Immunphänotyp dieser zwei Populationen älterer Individuen den Status ihrer Knochenzellfunktion wieder gibt. In der sechsten-siebten Lebensdecade zeigen die meisten Individuen (männliche und weibliche) verschiedene Grade von Osteoporose. Somit zeigt die Identifikation der Änderungen in der Knochenproteinexpression ohne Zweifel die Basis für bekannte Beurteilungen dieser Proteins (Osteocalcin (BGP) und Osteonectin) im Plasma älterer Individuen. Die Identifikation einer Subpopulation von älteren Individuen mag somit eine Gruppe von Individuen mit ernsteren Erkrankungen anzeigen. TABELLE 2 Vergleich der Knochenproteinexpression unter älteren Individuen

* = p ≤ 0,001 (Student's t-Test, zweiseitig), verglichen mit der altersbezogenen Kohorte,
F1 = Fluoreszenz, Summenwerte sind Mittelwerte +/– S.E.M.

Beispiel 5: Präparation von Knochenvorläuferzellen aus peripherem Blut
Das vorliegende Beispiel betrifft die weitere Präparation von Knochenvorläuferzellen aus peripherem Blut.
Die Erfinder fanden, dass tierische Knochenvorläuferzellen zirkulieren, womit es möglich gemacht wird, diese Zellen aus tierischem peripheren Blut wieder zu gewinnen und zu reinigen.
Humane Knochenvorläuferzellen wurden aus humanem menschlichen Blut durch Venenpunktur isoliert. Blut wurde in Konservierungsmittel-freies Heparin gegossen, um Koagulation zu verhindern, und hinsichtlich humaner Knochenvorläuferzellen verarbeitet, wobei das gleiche Protokoll, wie vorstehend für die Knochenmarks-Isolierung durch immunomagnetische Trennung beschrieben, verwendet wurde. Kurz dargestellt erfordert dies die Gleichgewichtsdichte-Zentrifugation (Ficoll) und Plastikadhärenz, um NALD-Zellen zu generieren, ihre Markierung mit monoklonalen Antikörpern gegen Osteocalcin (BGP) und Osteonectin, und die Verarbeitung zur immunmagnetischen Trennung und Reinigung. Die resultierenden Zellen wurden durch Multiparameter-Durchflusszytometrie, wie vorstehend beschrieben, analysiert.
Über die humanen Knochenvorläuferzellen, die aus peripherem Blut isoliert wurden, wurde gefunden, dass sie ähnliche Durchflusszytometrie-Eigenschaften wie die des Knochenmarks haben.
Beispiel 6: Der Effekt des Alterns auf die Fähigkeit der Knochenvorläuferzellen in Osteoblastenzellen zu differenzeeren, und die Kapazität solcher Osteoblasten, eine osteoide Extrazellulärmatrix zu entwickeln
Die vollständige Beurteilung der Knochenzellentwicklung erfordert die Untersuchung von sowohl Knochenvorläuferzellen (Osteoprogenitor-Zellen und Präosteoblasten), als auch ihre differenzierten Nachkommen, die Osteoblasten. Es sind die Osteobalsten, die für die Entwicklung und Mineraliseirung der Knochenmatrix und die nachfolgende Knochenbildung verantwortlich sind. Wie früher erwähnt, lassen morphologische und morphometrisch Berichte vermuten, dass ein Differenzierungsblockade während des Alterungsprozesses in einer reduzierten Osteoblastenzahl auftreten kann (Roholl et al., 1994 und Nimni et al., 1993). Es gibt aber auch andere Hinweise, die vermuten lassen, dass die Osteoblasten älterer Individuen eine verminderte Funktion dahingehend haben, dass die eine verringerte Ansprechbarkeit gegenüber mitogenen Stimuli haben (Pfeilschifter et al., 1993 und Wong et al., 1992), und verringerte Mengen von Knochenmatrixproteinen (Liang et al., 1992) und Osteoid (Nimni et al., 1993) erzeugen.
Es ist wichtig, die Kapazität der Präosteoblasten, in Osteoblasten zu differenzieren, und die Kapazität solcher Osteoblasten, normal zu funktionieren, zu beurteilen. Bedeutsamerweise können solche Studien nicht in ausgewchsenen Kulturen des humanen Trabecula-Knochens wegen einer Vielzahl von Gründen (beschränkende Zellzahl, Fehlen gereinigter Zellen, Heterogenität des vorliegenden Zelltyps etc.) und wegen des prinzipiellen altersbezogenen Defekts, der ein früheres Versagen im Osteoblastendifferenzierungsweg sein kann, durchgeführt werden. Das heißt, die Zellentwicklung kann nicht von Osteoprogenitorzellen zu Präosteoblasten oder von Präosteoblasten zu Osteoblasten vorangehen. Daher ist es am besten, dieses Problem in einem System zu untersuchen, in dem das ganze Spektrum der humanen Knochenzell-Proliferation/Differenzierung beurteilt werden kann.
Regulierung der Osteoblastenzelldifferenzierung. Wie vorstehend beschrieben, haben die Erfinder ein System entwickelt, in dem isolierte und gereinigte Knochenvorläuferzellen in Osteoblasten proliferieren und differenzieren. Insbesondere haben die Erfinder gezeigt, dass der Prozess des Übergehens von Serum-freiem Medium zu TGF-β gesteuerten Serum-haltigen Kulturen in einer Differenzierung von Präosteoblasten in Osteoblasten-Zellen resultiert (Long et al., 1990).
Wichtigerweise erzeugen die Osteoblasten eine osteoide Extrazellulärmatrix, in der nicht kollagene Knochenproteine abgeschieden werden, und die Zellen calzifizieren die Extrazellulärmatrix (Long et al., 1990). Der Effekt des Altern bei sowohl der Differenzierung der Präosteoblasten in Osteoblasten und der nachfolgenden Änderung in der differenzierten Zell(Osteoblast)-Funktion wird untersucht. Als solches wird das hier beschriebene Zellkultivierungsprotokoll modifiziert, um die Osteoblasten-Zelldifferenzierung zu umfassen.
In diesen Studien, werden Kulturen der Knochenvorläuferzellen in zwei Phasen betrieben. Die erste Phase (7–10 Tage) ist ein Proliferationsschritt, der Serum-freie Kulturen mit entweder TGF-β oder besser eine Wachstumsfaktor/Matrix-Kombination für die Generierung einer maximalen Anzahl von Knochenvorläuferzellen benutzt. Während dieser Phase der Kultur wird nur die Zellulartität und die Antigenexpression als Index der Kulturbedingungen überwacht. Bei optimaler Zelldichte werden diese Kulturen auf Serum-haltige TGF-β-haltige Bedingungen umgeschaltet.
Nachfolgende Studien (über zusätzliche 7 bis 10 Tage) beurteilen die Osteoblastendifferenzierungs-Muster und die funktionellen Kapazitäten. Wie hier beschrieben, haben die Erfinder eine Multiparameter-Durchflusszytometrie-Analyse der Osteoblasten-Zelldifferenzierungsmarker definiert; diese Zellen nehmen in der Zellgröße, der Zellkomplexität und der Expression multipler Marker der Knochenzelldifferenzierung zu. Die Kapazität der Präosteoblasten in Osteoblastenzellen zu differenzieren, wurde unter Verwendung dieser Multiparameter-Durchflusszytometrie bestimmt.
Insbesondere wurde die Expression der Knochenproteine Osteocalcin und Osteonectin plus zwei weiter biochemische Marker der Knochendifferenzierung, alkalische Phosphatase und Typ I-Kollagen, bestimmt. Wie erwähnt, wird alkalische Phosphatase durch sowohl Durchflusszytometrie als auch Zytochemie der alkalischen Phosphatase (EC 3.1.3.1) (Reddi, 1981) kontrolliert. Dieses letztere Verfahren unterscheidet alkalische Phosphatase aus Knochen von der aus Leber, basierend auf der Sensitivität gegen Hitze und Harnstoff. Als bestätigende Studie wird die Produktion und Abscheidung der Extrazellulärematrix-Moleküle des Knochens durch Osteoblastenzellen aus beiden Altersgruppen durch metabolisches Markieren und Immunpräzipitation unter Verwendung von ³⁵S-Methionin bestimmt.
Extrazellulärmatrix-Calcifizierung. Studie über die Kapazität der Osteoblastenzellen, ihre umgebende (Knochen) ECM zu mineralisieren, verwendet zwei alternative Herangehensweisen: metabolisches Markieren mit ⁴⁵Ca⁺⁺ und histochemische Analyse unter Verwendung des von Kossa-Färbeverfahrens. Für die Calciummarkierungs-Studien wurden zwei Aspekte des Knochenzell-Calcium-Metabolismus beurteilt: die Fähigkeit, Calcium aufzunehmen und die Fähigkeit, Calcium in der Extrazellulärmatrix abzulagern.
Wie früher gezeigt, werden die Osteoblastenzellen aus der Kultur entfernt und (eine Stunde) mit ⁴⁵Ca⁺⁺ Gleichgewichts-markiert (Long et al., 1990 und Long et al., 1993). Kurz gefasst, Osteoblasten werden währen 3, 5, 7, 14 und 21 Tagen nach Serum- oder Serum-freier Wachstumsfaktorstimulierung entfernt und 3 mal mit Calcium-freien PBS gewaschen, und metabolisch mit 50 Ci ⁴⁵Ca⁺⁺ während 60 Minuten bei 37 °C markiert. Nach der ⁴⁵Ca⁺⁺-Calcium-Equilibrierung werden die markierten Zellen an nicht eingebautem Calcium frei gewaschen, in Serum-freien Gewebekulturmedium resuspendiert und in den original Kulturschalen wieder etabliert. Ein Aliquot der Ca⁺⁺-Zellen werden sofort auf den ⁴⁵Ca⁺⁺-Gehalt hin analysiert. Die Quantifizierung der Menge der ⁴⁵Ca⁺⁺-Aufnahme pro Zelle zeigt die altersbezogenen Differenzen in der Calcium-Aufnahme, wohingegen der Matrixcalciumgehalt Änderungen in der Abscheidung anzeigt.
Zur Matrix-Abscheidung lässt man Gleichgewichts-markierte Zellen zelluläre ⁴⁵Ca⁺⁺ in ECM inkorporieren. Ausgehend davon, dass sowohl Osteocalcin (BGP) als auch Osteonectin Calcium binden, schließt dieses exogene Zellmarkierungs-Verfahren das Fluidphasen-Binden von ⁴⁵Ca⁺⁺ an früher synthetisierte Matrix-Pröteine aus. Nachfolgend werden Zellen/ECM mit (knapp) Trypsin/EDTA entfernt, Zellen werden durch Zentrifugation pelletisiert, und der ⁴⁵Ca⁺⁺-Einbau in das mit Trypsin/EDTA extrahierbare ECM wird durch Scintillationszählung bestimmt. Trypsin-resistentes ECM wird dann mit TritonX-100-Extraktion, wie früher beschrieben (Gospodarowicz und Ill, 19080; Long et al., 1990) entfernt und in ähnlicher Weise gezählt. Um die zurückbleibende Zellenverunreinigung zu kontrollieren, werden ECM-Extrakte hinsichtlich des DNA-Gehalts und der Calcium-Abscheidung in die Matrix überwacht, berechnet als gesamt extrahierbares ⁴⁵Ca⁺⁺, korrigiert um das der kontaminierenden Zellen.
Die vorstehenden Calciumbeladungsstudien beurteilen präzise die Aufnahme und Abscheidung von humanen Osteoblastenzellen während ihrer Differenzierung. Die histochemische Identifizierung der Matrixcalciumabscheidung, die die von Kossa-Farbreaktion (Long et al., 1990; Heeley et al., 1973 und Puchtler et al., 1978) benutzt, wird beurteilt. Die Erfinder korrelierten früher das Vorliegen einer positiven von Kossa-Reaktion mit der Fähigkeit der Osteoblastenzellen, die aus (unfrakionierten) Vorläuferzellen generiert wurden, metabolisch Calcium in der Extrazellulärmatrix abzuscheiden (Long und Dixit, 1990). Diese Kulturen wurden hinsichtlich einer von Kossa-Reaktivität zum gleichen Zeitpunkt der Calciuminkorporation/Abscheidung-Studien untersucht. Diese kinetischen Untersuchungen sind somit miteinander korreliert und demonstrieren die Validität der Von Kossa-Reaktion als Indikator der frühen Phase der Calcifizierung primärer humaner Zellen.
Chondrogenes Potential der Knohenkulturen. Knochenvorläuferzellen werden hinsichtlich ihrer funktionellen Kapazität untersucht, eine chondrogene Differenzierung einzugehen. Diese Studien sprechen ein alternatives Konzept an, dass die altersbezogene Differenzierungsblockade die Chondrogenese eher als die Osteogenese fördern kann. Dies ist insbesondere wichtig, wenn die Osteoprogenitorzellen ein chondrogenes Potential besitzen, ein Konzept, das oft diskutiert aber nie definitiv bewiesen wurde. Einige Vermutungen davon existieren in einer Studie mit Rattenosteoprogenitorzellen (Taniguchi et al., 1993). In dieser Studie stimulierte eine peri-osteale Injektion von TGF-β neonatale Osteoprogenitorzellen, wohingegen in Erwachsenen die Differenzierung in Chondrozyten induziert wird. Der Einbau von ³⁵SO₄ in Proteoglycan sowie die Immunzytochemie der Chondrozyten (detailliert in den vorläufigen Ergebnissen angegeben) wird zur Untersuchung der Chondrogenese verwendet.
Reddi und Mitarbeiter haben gezeigt, dass ³⁵SO₄ in Proteoglycan während der Knorpelphase der Knochenmatrix-induzierten Chondrogenese (Reddi, 1981) eingebaut wird. Knochenzellkulturen von beiden Altersgruppen werden metabolisch mit ³⁵SO₄ markiert, und der Einbau der Markierung in das Proteoglycan durch Detektion der Chondroitinase ABC (EC 4.2.2.4) überwacht – sensitiver Radiomarkierungs-Einbau. Für Studien des ³⁵SO₄-Einbaus werden Osteoblastenzellen wie vorstehend differenziert, und metabolisch mit ³⁵SO₄ markiert (6–12 Stunden). Danach werden die Zellen freigesetzt und ECM mit Chondoitinase ABC behandelt und enzymatisch freigesetzt Markierungen durch Scintillationszählung überwacht.
Die Knochenproteinsynthese, alkalische Phosphatase-Expression, ³⁵SO₄-Einbau (gering) und ⁴⁵Ca⁺⁺-Abscheidung zeigen alle deutlich das Vorliegen knochenbildender Zellen. Aber sie unterscheiden nicht definitiv zwischen Chondrobalsten und Osteoblasten. Beispielsweise enthalten die meisten, wenn nicht alle Zellen Oberflächen-Proteoglycane, und die kontaminierenden Zellen können somit empfindlich gegen die Chondroitinase-Freisetzung von ³⁵SO₄ sein. Ferner beweist der Nachweis der zellulären Ca⁺⁺-Abscheidung während die osteogene Organisation der Matrix eindeutig gezeigt wird, nicht das Vorliegen von Hydoxylapathit.
Ein besserer Indikator der Knorpel/Knochen-Unterschiede ist das Muster der Kollagenabscheidung während der Knochenbildung (Knochen bilden Typ I und Knorpel Typ II-Kollagen). Diese Studien verwenden das Kollagenpeptidmapping (via CNBr-Spaltung) (Baresh et al., 1980). In diesem Verfahren wird die Kollagensynthese durch metabolisches Markieren unter Verwendung von ³H-Prolin (100 Ci/ml, L2, 3, 4, 5 3H-Prolin, Amersham, spz. Akt. 120 Ci/mM) überwacht. Zellen werden in Gegenwart von 50 g/ml Na-Ascorbat vor-inkubiert, gewaschen und metabolisch währen 16–24 Stunden markiert. Nachfolgend werden die Zellen zerstört, das Lysat gegen 1 mM NH₄CO₃ dialysiert und mit 100 g Pepsin in 0,5 M HAc verdaut und dann in einem PAGE-Polyacrylamid-Gel (Baresh et al., 1980) einer Spaltung unterzogen.
Es ergeben sich mehrere Ergebnisse der obigen Studie. Eines ist, dass altersabhängige Änderungen die Knochenmatrix oder die Knochenprotein-Produktion direkt beeinflussen kann. Umgekehrt kann das Fehlen der „normalen" Knochen-ECM oder Knochenproteinproduktion durch Präosteoblasten tatsächlich wegen der „down-regulierten" Expression wichtiger Knochenzellmarker erfolgen, die als Vorläufer der Knochen-ECM-Mineralisation benötigt werden. Die hier beschriebenen Studien unterscheiden zwischen Defekten auf dem Level der Differenzierung von Präosteoblasten in Osteoblasten und die Änderungen, die in der Osteoblastenfunktion auftreten.
Die Erfinder können die Entwicklung humaner Knochenvorläuferzellen in multiplen Altersgruppen (z.B. 18–25, 26–49 und > 50) von dem Level der Osteoprogenitorzellen zur Stufe der Osteoblastezellen-Abscheidung und Calcifizierung osteoider ECM beurteilen. Somit werden wichtige Informationen bezüglich der Rolle der altersinduzierten Änderungen der Knochenzelldifferenzierung und Funktion erhalten, insbesondere soweit es den Calciummetabolismus betrifft. Diese Daten ermöglichen ein vollständigeres Verstehen der Ereignisse, die die Knochenzellentwicklung in sowohl älteren als auch jüngeren Individuen regulieren.
Beispiel 7: Osteogene Gene, die differenziell während des Alterns modifiziert werden
Die obigen Beispiele wurden so gestaltet, um die Natur und den Grad der Änderungen zu bestimmen, die durch den Alterungsvorgang humaner Knochenvorläuferzellen und ihrer Nachkommen, den Osteoblasten, induziert werden. Sie untersuchen jedoch nicht die molekulare Basis der altersinduzierten Änderungen bei der zellulären Entwicklung. Die genetischen Änderungen, die in diesen Zellen während des Alterns auftreten, werden in diesem Beispiel untersucht. Die Proliferations- und Differenzierungs-Protokolle, die diskutiert werden, werden verwendet, um die molekulare Kontrolle der Proteine, die speziell geändert werden, zu beurteilen. Diejenigen Gene, die einzigartig in der Expression während des Alterns geändert werden, werden identifiziert.
Analyse der Knochenprotein-Messenger-RNA. Der Effekt des Alterns auf die Regulation der Knochenprotein-mRNA (für beide Grade der Expression und die temporale Expression) wird durch Northern-Analyse und in situ Hybridisierung analysiert. Osteonectin-, Osteocalcin-, alkalische Phosphatase- und Osteopontin-mRNA werden als Sonden für Matrixmoleküle verwendet. Die Northern-Analyse (oder der empfindlichere S1-Nuclease-Assay) wird wie früher von den Erfindern beschrieben durchgeführt (Long et al. 1990).
Als Alternative können Knochenvorläuferzellen oder Progenitorzell-Kolonien von beiden Altersgruppen fixiert und die Messenger-Expression durch in situ Hybridisierung beurteilt werden. Dieses letztere Verfahren wird unter Verwendung von biotinylierten cDNA-Sonden durchgeführt. Nicht isotope in situ Hybridisierung wird wie bei Singer et al. (Singer et al., 1986) beschrieben, durchgeführt. Dieses Verfahren ergibt ein Signal-Rausch-Verhältnis, das mit der Autoradioggraphie äquvialent ist, während es eine exzellente morphologische Identifizierung (Lawrence et al., 1986) erlaubt. Die cDNA-Sonden werden unter Verwendung von Randomprimer-Inkorporation von biotinylierter ATP (BRL; Gaithersburg, MD) oder anderer biotinylierter dNTPs (Photobiotin Labeling, BRL) hergestellt.
Kurzgefasst werden die Paraformaldehyd-fixierten Zellen in 1 % Levisamol inkubiert, um die endogene alkalische Phosphatase zu inhibieren (Schmetzer et al., 1987), und während 4 Stunden bei 37 °C hybridisiert. Nach der Hybridisierung an zellulärer RNA, wird die biotinylierte Sonde an Streptavidin konjugiert, das Streptavidin an Biotin-konjugierte alkalische Phosphatase gebunden und mit Bromchlorindolyl-Phosphat und Nitroblau-Tetrazolium inkubiert, um ein blaues Präzipitat an der Stelle der cDNA-Hybridisierung zu ergeben. Diese Untersuchungen bestimmen die temporale Expression von bekannter mRNA von Knochenproteinen in Osteoprogenitorzellen (mit RT-PCR und in situ Hybridisierung), Präosteoblasten und Osteoblasten-Zellen (beide mit Northern oder S1). Für Osteoprogenitorzell-Kolonien wurden diese zu verschiedenen Zeiten während der Koloniebildung (1, 3, 5, und 7 Tage) zur auf reverser Transkriptase beruhender Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) herausgepickt oder zur in situ Hybridisierung fixiert. Präosteoblasten- und Osteoblasten-Kulturen erzeugen eine ausreichende Anzahl von Zellen für Northern oder S1-Analyse.
Während eine Vielzahl von Verfahren zum Identifizieren differenziell expremierter Gene existieren, vertrauen die meisten der subtraktiven Hybridisierungstechnik (Liang et al., 1992). Solche Verfahren neigen aber dazu, technisch beeindruckend und anfällig für experimentelle Fehler zu sein. Kürzlich haben Pardee und Mitarbeiter eine Fingerabdruck-Technik für den Vergleich von differenziell exprimierter mRNA entwickelt (Linag et al., 1992).
Dieses als „Differential Message Display" (DMD) bezeichnete Verfahren ermöglicht die Trennung und schnelle Klonierung individueller mRNA mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR). DMD benutzt ein Set von Oligonukleotidprimern, in denen der 3'-Primer an den Polyadenylat-Schwanz dieses Untersets der RNA verankert ist, und der 5'-Primer ist eine kurze, willkürliche Sequenz. Nach der auf reverse Transkriptase basierenden Generation von cDNA, wird die mRNA-Population, die durch diese zwei Primer definiert ist, durch PCR in Gegenwart radio-markierter dNTP amplifiziert, und in einem DNA-Sequenzierungs-Gel aufgetrennt. Somit resultiert die Verwendung einer Anzahl verschiedener Primer-Paare im Nachweis differentiell exprimierter Messenger (z.B. in jungem gegenüber älterem Knochenzell-DMD-Altersvergleich).
Nachfolgend wurde gezeigt, dass die Anzahl der verankerten Primer von 12 auf 4 unter Verwendung einer degenerierten Base am vorletzten 3'-Ende (Liang et al., 1994) vermindert werden kann.
In einer anderen Ausführungsform können genetische Änderungen, die mit dem Alterungsprozess assoziert sind, oder Erkrankungen, durch das Screenen von cDNA-Bibliotheken älteren Individuen bestimmt werden. Bei diesem Verfahren werden cDNA-Bibliotheken älteren Individuen (von einer oder beiden der vorstehend beschriebenen antigen verschiedenen Gruppen) hinsichtlich der exprimierten Gene beurteilt, die in jüngeren Individuen nicht gefunden werden.
Um dies zu erreichen, werden humane Knochenvorläuferzellen aus jeder Altersgruppe (z.B. < 25 Jahre und > 60 Jahre) gereinigt und cDNA-Bibliotheken aus jeder konstruiert. cDNA von jüngeren Individuen werden gepoolt, radiomarkiert und verwendet, um die cDNA-Bibliothek screenen, die aus humanen Knochenvorläuferzelle der ältesten Individuen erhalten wurden. Die cDNA, die zwischen den älteren und den jüngeren Individuen gemeinsam ist, wird miteinander hybidisieren (womit sie durch Autoradiographie nachgewiesen werden kann), wohingegen die die für Ältere einzigartig ist, dies nicht wird. Diese letzter cDNA repräsentiert die Gene, die in jüngeren Individuen nicht exprimiert wird.
In ähnlicher Weise kann unter Verwendung radiomarkierter cDNA aus älteren Individuen die cDNA-Bibliothek jüngeren Individuen hinsichtlich der Gegenwart von Genen gescreent werden, die nur in Knochenzellen von jüngeren Individuen exprimiert wird (somit sind sie Gene, deren Expression während des Alterns verloren geht). Andere vorgestellte aber nicht darauf beschränkte Vergleiche kontrastieren zwischen jungen, alten und mittelalten Individuen, oder kontrastieren verschieden Typen der Osteoporose und Knochenkrankheiten mit gesunden Individuen.
Schließlich zeigten die Erfinder, dass die molekulare Basis der Unterschiede in normalen gegenüber Tumorzellen leicht mittels DMD visualisiert werden kann (Liang et al., 1992). Die Erfinder benutzten DMD, um Gene zu identifizieren, die einzigartig durch das Altern modifiziert werden. In diesen Untersuchungen werden Präosteoblasten und Osteoblasten aus beiden Altersggruppen durch DMD beurteilt. Differenziell esprimierte Genfragmente werden direkt aus den PCR-Produkten (in den pCR1000-Vektor, Invitrogen) subkloniert und als Sonden zur Isolierung der cDNA in voller Länge aus geeigneten Libraries verwendet. Weiterhin identifizieren das Sequenzieren und die Genbanksuche, da die meisten der subklonierten Fragmente 400–1000 bp lang sind, die Sequenzen oder ihre Homologie mit anderen Genen.
Die Bedeutung der mRNA-Studien liegt darin, dass die Zunahme des Verständnisses der Erfinder über die Regulation der Knochenproteinexpression während des Alterns zunimmt. Der Vergleich dieser Daten bestimmt den Level der Regulation (d.h. die Transkription der Genexpression oder Translation in das Protein), womit der biochemische Kontrollmechanismus mit der molekularen Kontrolle der Genexpression verbunden wird. Die mRNA-Studien bestätigen die immunologisch basierten Beobachtungen über die Knochenproteinexpression und dehnen diese Daten auf den RNA-Level aus.
Die Erfinder schlagen eine Isotopen-RNA-Analyse hinsichtlich ihrer Sensitivität, und eine nicht-isotopische in situ Markierung wegen der leichten Durchführbarkeit, der Aufrechterhaltung der Morphologie und der Beständigkeit der Aufnahmen vor. Der Vergleich der Northern (oder S1)-Analyse mit der in situ Hybridisierung wird die exakte Beurteilung der Menge der mRNA sowie der Identifizierung des Zelltyps, die eine gegebene Message exprimieren, ermöglichen. Ein Problem mit der in situ Hybridisierung ist, dass sie nur mRNA einer relativ oft vorkommenden Kopiezahl detektiert. Somit kann mRNA von Knochenproteinen in niedriger Kopiezahl undetektiert bleiben. Um diese Beschränkung zu überwinden, wird die RT-PCR verwendet. Unter Verwendung von Antisense-RNA-Primern, reverser Transkriptase und 30 PCR-Zyklen, können Signale von mRNA in geringen Kopien bis zum 109-fachen amplifiziert werden.
Beispiel 8: Die Determinanten der Proliferation humaner Knochenvorläuferzellen mit niedriger Scherung
Die physikalische Anforderung für optimale Knochenvorläuferzellen (d.h. Osteoprogenitorzellen und Präosteoblasten)-Proliferation sowohl in vivo als auch in vitro werden wenig verstanden. In vivo tritt die Knochenbildung am häufigsten in einem intervenierenden Knorpel-Model (d.h. endochondrale Ossifikation) auf. Diese gut verstandene Knochenhistogenese ist eine der embryonalen und post-natalen Chondrogenesen, die für die Form der Knochen zählt, und die nachfolgende Modifizierung und Calcifizierung der Knochenzell-ECM durch Osteoblasten. Dieser Prozess resultiert in der Bildung und Verlängerung der Knochen während des Wachstums und der Entwicklung der Kinder.
Es gibt aber keinen Hinweis, dass die Trabecularknochenbildung bei Erwachsenen (die vorherrschende Stelle des Calciummetabolismus) in einer identischen Art auftritt. Beispielsweise migrieren bei der traumatischen Knochenwiederhersellung mesnchymale Zellen in und organisieren das Hämatom, das um die Fraktur herum auftritt. Im Ergebnis bildet sich ein großer irregulär gebildeter knöchriger Kallus (umfassend „gewebte" („woven") Knochen), die nachfolgend in die Form des ursprünglichen Knochens umgeformt wird. Eine Rolle der Chondrocyten wurde in diesem Prozess nicht beschrieben. Andere Hinweise (von dieser Gruppe) stützt das Konzept, dass die Trabecularknochenbildung vom klassischen Endochondral-Model verschieden ist.
Wie vorstehend beschrieben, proliferieren und organisieren Trabecular-Knochenvorlläuferzellen ihre Extrazellulärmatrix in einer osteogenen Weise – ohne eines scheinbaren intervenierenden Knorpel-Modells. Die Erfinder haben gezeigt, dass die Trabecularknochen von den kompaten Knochen in der Zusammensetzung der Extrazellulärmatrixproteine unterschiedlich sind, was Unterschiede in der Funktion der Trabecularosteoblasten nahe legt (Ninomya et al., 1990). Nichtsdestoweniger ist es wahrscheinlich, dass die Trabecularknochen-Bildung in Erwachsenen eine drei-dimensionale (osteoid) Matrix erfordert, die von den Osteoblasten selbst entwickelt werden. Weiterhin haben die Erfinder gezeigt, dass das Wachstum der Osteoprogenitorzellen in Gegenwart eines drei-dimensionalen Fibrinkoagulats (interessanterweise eines der Hauptproteine in einem Hämatom) in einer deutlichen Zunahme der Progenitorzell-Zellularität, der Expression der antigenen Knochenprotein-Marker, der Zellgröße und der Zellkomplexität resultiert.
Die Proliferation humaner Knochenvorläuferzellen wird wahrscheinlich hinsichtlich des Wachstums durch eine stimulierte Mikrogravitätsumgebund verstärkt. Dies beruht auf der Proliferation der Knochenvorläuferzellen von der Differenzierung in Studien von Weltraumflügen von Ratten, wie vorstehend diskutiert (Klement und Spooner, 1993). Zusätzlich haben Goodwin und Assiociates eine bemerkenswerte Verbesserung der Zellproliferation in mit niederer Scherung rotierende Gefäßwände (RWV) in Bioreaktortypen dokumentiert. Ihre Daten zeigen, dass mesenchyme Zelltypen im Durchschnitt eine drei- bis sechs-fache Zunahme der Zelldicht in diesen Bioreaktoren zeigen, wobei eine Zellularität von etwa 10⁷ Zellen/ml erreicht wurde. Wichtigerweise war diese Zunahme in der Zelldichte mit einer 75% Verminderung in der Glukose-Nutzung sowie eine etwa 85% Reduktion in den enzymatischen Markern des anabolen zellulären Metabolismus (SGOT und LDH) assoziiert. Eine weitere Arbeit von Goodwin et al zeigt, dass das Wachstum der mesenchymalen Zellen (Niere und Chondrocyten) unter Bedingungen einer geringen Scherung zur Bildung von Gewebe-ähnlichen Zellaggregaten führt, die durch Wachstum dieser Zellen auf einem mit Kollagen beschichteten Mikrocarrier erhöht wird.
Physikalische Anforderungen für die Knochenvorläuferzell-Proliferation. Die physikalischen Anforderungen für das Wachstum von Knochenvorlläuferzellen an rotierenden Gefäßwänden wird durch Vergleich der Suspensionsphase und dem Mikrocarrier-basierenden Zellwachstum beurteilt. Vier Knochenzell-Kulturbedingungen werden benutzt. Die zwei Arten der stimulierten Mikrogravitäts-Kulturen bestehen nur aus Knochenvorlläuferzellen in Suspensionsphase und simulierte Mikrogravitationskulturen mit Vorläuferzellen plus Mikrocarrier-Kügelchen. Diese Kulturen werden mit Kontrollzellen kontrastiert, die in Einheitgravitätsbedingungen kultiviert werden (Einheitgravitätskulturen werden in Gewebekulturgefäße mit gleichen Volumen und Medium-Zusammensetzungen durchgeführt, d.h. sowohl Zellen in Kultur als auch Zellen, die auf Mikrocarier kultiviert werden). Interessanterweise haben die Erfinder kürzlich gezeigt, dass das Einheitgravität-Knochenvorläuferzellwachstum in Typ I-Kollagen-Gelen auftritt. Kollagen-beschichtete Mikrocarrier (Cytodex-3 Kügelchen) werden benutzt; wie sie in den Studien der Erfinder beschrieben werden.
Diese Studien evaluieren, ob humane Knochenvorlläuferzellen die Zell:Zell-Interaktion benötigen (wie es in dem Suspensionsphasen-Vergleich der stimulierten Mikrogravität und der Einheitgravitätskultur evident ist). Ob humane Knochenvorlläuferzellen sowohl den Zell:Zell-Kontakt und/oder Zell:ECM-Interaktionen benötigen, wird bestimmt. Diese Möglichkeit wird in auf Mikrocarrier basierenden Studien bestimmt, in denen Zellen sowohl miteinander als auch mit dem Überzug aus Typ I-Kollagen der Carrier-Kügelchen interagieren. Es soll verstanden werden, dass während humane Knochenvorlläuferzellen sich selbst zu Aggregaten bei der stimulierten Mikrogravität-Suspensionsphasenkultur zusammen bauen könne, zeigen andere Zelltypen (Lymphozyten und Lymphozytenzelllinien) eine verminderte Proliferation. Dabei handelt es sich um hämatopoetische Zellen, die kein festes Gewebe erzeugen, wie Knorpel und Knochen.
Quantitative Beurteilung der Entwicklung humaner Knochenvorläuferzellen. Humane Knochenvorläuferzellen werden während verschiedener Zeitspannen unter stimulierten Mikrogravitätsbedingungen. Basierend auf der Entwicklungsperiode, die Benutzt werden, um die Knochenzelldaten zu generieren, wurde die Knochenzellentwicklung in den RWV an den Tagen drei, fünf, sieben, neun, zwölf, vierzehn und 30 beurteilt. Die gesamte Zellularität wird durch Zellzählung, Zelldichtebestimmung und Beurteilung der Häufigkeit von Gewebe-ähnlichen Aggregaten in diesen Kulturen beurteilt. Für Mikrocarrier-Kulturen werden die Aggregate ausgezählt und die Zellen behandelt, um sie von den Mikrocarrier-Kügelchen zu entfernen. Kulturen wurden von den Zellen mittels des Verfahrens von Gospodarowicz (Gospodarowicz und Ill, 1980 und Gospodarowicz et al., 1980) abgezogen, was eine von Zellen abgeleitete Extrazellulärmatrix (ECM) und/oder Kügelchen zurück läßt. Frühere Arbeiten haben auch gezeigt, dass dieses Verfahren leicht Mesenchymzellen aus den Cytodexkügelchen freisetzt und nicht mit der Knochenantigenexpression interferiert (Long et al., 1995).
Multiparameter-Durchflusscytometrie-Charakteisierung von Präosteoblasten und Osteoblasten. Einzell-Zell-suspensionen, die zu speziellen Zeitpunkten entnommen werden, werden hinsichtlich der Entwicklungsmarker mit Multiparameter-Durchflusszytometrie beurteilt. Zwei- und Drei-Farbfluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrie wird verwendet, um die Coexpression einer Anzahl von humanen Knochenproteinmarkern zu beurteilen: Osteonectin, Osteocalcin, alkalische Phosphatase, Knochensialoprotein und Osteopontin. Die Expression dieser Proteine ist auch mit der Änderungen der Zellgröße (wie durch die Durchlasswinkellichtstreuung angezeigt) und die Zellkomplexität (wie durch die rechtwinklige Lichtstreuung angezeigt) korreliert: Diese Studien ermöglichen die Beurteilung der quantitativen Unterschiede in sowohl dem Phänotyp als auch der Frequenz der Präosteoblasten und Osteoblasten, wie sie durch ihre Durchflusszytometrie-Charakteristiken definiert sind.
Osteoprogenitorzellen. Änderungen in der Frequenz der Osteoprogenitorzellen während der simulierten Mikrogravitätsexpositon wird beurteilt. Zu den vorstehend angegebenen Zeiten werden Zellproben aus den Kulturen entfernt und die Osteoprogenitorzellzahl im Fibrin-Koagulations-Assay evaluiert. Diese Studien bestimmen, ob die Häufigkeit oder das Proliferationspotential der zwei Klassen der Osteoprogenitorzellen (hoch proliferierende Kolonie-bildende Progenitorzellen vs. gering proliferierende Cluster-bildende Progenitorzellen) unter den Bedingungen einer geringen Scherung verschieden moduliert werden. Die Beurteilung der Koloniezellularität (Zellen/Kolonie) bestimmt auch das Proliferationspotential von jeder dieser Progenitorzelltypen.
Wie erwähnt, wurden Hinweise für eine Differenzierungsblockade während der realen Mikrogravitätsexposition gefunden (Klement und Spooner, 1993). Das genaue Niveau diese Blockade ist aber unbekannt. Mit der Möglichkiet der Erfinder, Knochenvorläuferzellen zu quantifizieren, können die Erfinder das Niveau lokalisieren, bei dem eine solche Blockade für humane Zellen auftritt. Wenn beispielsweise eine Blockade zwischen den Osteoprogenitorzellen und den Präosteoblasten existiert, sollte die Anzahl der ersteren in der Häufigkeit zunehmen, mit einer begleitenden Abnahme der Anzahl der Präosteoblasten. Eine Ähnliche Änderung in den Zellverhältnissen ist nachweisbar, wenn die Blockade zwischen den Präosteoblasten und den Osteoblasten vorliegt.
Biochemische und metabolische Beurteilung der Knochenzellentwicklung. Um den metabolischen Status der entwickelnden Knochenvorläuferzellen zu beurteilen, werden simulierte Mikrogravitations- und Kontrollkulturen bezüglich Änderungen in der Glukose-Nutzung, SGOT, LDH-Enzym-Produktion, wie früher beschrieben (Goodwin et al., 1993) untersucht. Diese Untersuchungen ergeben Informationen über die Effizienz der Glukose-Nutzung, die Gluconeogenese und der Level der zellulären Schäden.
Änderungen in der zellulären Expression der Knochenproteine, wie sie mittels Durchflusscytometrie (vorstehend) in zwei alternativen Verfahren beurteilt wurden. Die Knochenproteinproduktion von sowohl kollagenen als auch nicht-kollagenen Proteinen werden durch metabolisches (³⁵S-Methionin)-Markieren und nachfolgende Immunpräzipitation der relevanten Proteine, wie beschrieben bei Greenberg et al., 1990, Kozawa et al., 1989, Tracey et al., 1990 bestimmt. Die Quantität der Knochenproteine wird unter Verwendung einer Anzahl von unabhängigen Assays überwacht. Sezernierende Freisetzung von Knochenproteinen wird durch RIA in löslicher Phase bestimmt. Zelluläre Proteinsynthese wird durch Immunpräzipitation metabolisch markierter Zellen überwacht.
Kurz dargestellt werden humane Knochenvorlläuferzellen werden während verschiedener Zeitspannen, wie vorstehend beschrieben, kultiviert, und die Kulturmedien für Methionin freies Medium (Gibco) mit 10 μCi ³⁵S-Methionin (4 Stunden bei 37°C) ausgetauscht. Zellen werden von nicht eingebautem Label frei gewaschen, mit Triton X-100 lysiert und mit kaltem TCA immunpräzipitiert. Die Proteine im finalen Präzipitat werden in PAGE aufgelöst und durch autoradiographie visualisiert. ¹²⁵I-markierte gereinigte Knochenproteine werden als Kontrolle laufen gelassen. Diese Proteisynthesestudien werden mit immunzytochemischen Analysen korreliert, die unter Verwendung eines Avidin-Biotin-Peroxidase-Markierungssystems, beschrieben bei Long et al., (Long und Heffner, 1988, Long und Dixit, 1990) durchgeführt wird.
Zusätzlich werden Informationen über die Mikrostruktur der Knochenzellaggregate durch ultrastrukurelle Analysen gewonnen. Sowohl die scannende Elektronenmikroskopie als auch die Transmissionselektronenmikroskopie werden verwendet, um die Qualität und den Grad der Organisation zu analysieren, die in den Knochengewebe-ähnlichen Aggregaten, wie früher beschrieben, auftritt.
Beispiel 9: Cytokin- und ECM-Kontrolle der Knochenvorlläuferzellproliferation in Mikroumgebungen mit niedriger Scherung
Wenn einmal die optimalen physikalischen/geometrischen Erfordernisse für eine humane Knochenvorläuferzell-Expansion in einer simulierten Mikrogravität bestimmt wurde, wird der Mechanismus und/oder die weitere Expansion dieser Zellen durch verschiedene osteogene Cytokine bestimmt. Bestimmte Wachstumsfaktoren (oder Cytokine), insbesondere TGF-β1 und bFGF, stimulieren die frühe Phase der Osteoprogenitorzellproliferation. Ein potentieller Mechanismus der erhöhten ex vivo Expansion der Knochenvorläuferzellen in einer simulierten Mikrogravität ist die geänderte Ansprechbarkeit auf mitogene Aktivierung.
Wie vorstehend diskutiert, nimmt der Glukosemetabolismus ab, während die Zelldichte und die Gewebeaggregat-Bildung unter den Bedingungen der simulierten Mikrogravität zunehmen (Goodwin et al., 1993). Ein Grund dafür ist, dass einer erhöhte Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren und Nährstoffen während des durch die Corioliskraft-getriebenen Mischens in den rotierenden Gefäßwänden auftritt. Ein Korrelat davon ist, dass die Ansprechbarkeit dieser Zellen scheinbar bei einer gegebenen Konzentration der Wachstumsfaktoren (d.h. wegen der verbesserten Verfügbarkeit) erhöht ist.
Die Rolle der differenzierenden Cytokine in der Expansion der Knochenvorläuferzellen in der simulierten Mikrogravität wird ermittelt. Kulturen mit variierenden Konzentrationen der osteogenen Wachstumsfaktoren wird initiiert. Unter dem gegebenen Effekt ihrer Proliferation werden TGF-β und bFGF, sowohl alleine als auch in Kombination, getestet. Der Vergleich des Zellwachstums in der simulierten Mikrogravität und die Einheitsgravitätskulturen benutzten all die vorstehend beschriebenen quantitativen Methoden. Die Erfinder dokumentierten auch Differenzierungseffekte für verschiedene Cytokine in der frühen und der späten Phase der Knochenvorläuferzellproliferation (z.B. TGF-β bzw. 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3). Eine synergistische Interaktion tritt wahrscheinlich auf, wenn Knochenvorläuferzellen simultan mit diesen zwei Klassen von Wachstumsfaktoren unter simulierten Mikrogravitationsbedingungen kultiviert werden. Die Erfinder ermittelten vier relevante Kombinationen von Wachstumsfaktoren: TGF-β + BMP, TGF-β + D3, bFGF + BMP und bFGF + D3. Die quantitative Beurteilung dieser Kombinationen wird wie vorstehend dargestellt durchgeführt.
Eine anderer Bestandteil der osteogenen Mikroumgebung ist die Extrazellulärmatrix. Wie erwähnt, enthält die Extrazellulärmatrix sowohl kollagene als auch nicht kollagene Proteine. Wenn die Knochenvorläuferzellen in bestimmten nicht-kollagenen Proteinen kultiviert werden, zeigen sie eine Zunahme der Proliferation der Knochenzellexpression. Weiterhin haben die Anmelder unter Verwendung des hämatopoietischen Modells gezeigt, dass Subpopulationen der primitiven Progenitorzellen sowohl mitogene Cytokine als auch ein spezifisches Extrazellulärmatrix(ECM)-Molekül benötigen, um zu proliferieren (Long et al., 1992). Ohne dieses obligate Matrix:Cytokin(Matricin)-Signal versagen in der Tat die meiseten primitiven Blutvorläuferzellen, sich in vitro zu entwickeln (Long et al., 1992). Es ist wahrscheinlich, dass es ein ähnliches Erfordernis für humane Knochenvorläuferzellen gibt. Weiterhin ist es wahrscheinlich, dass die osteogene Entwicklung in einer simulierten Mikrogravität die Zugabe von exogenen ECM-Molekülen erfordern kann.
Die Erfinder haben die Wichtigkeit der drei Knochen-ECM-Proteine in humanem Zellwachstum bei Einheitsgravität gezeigt: Osteonectin, Osteocalcin und Typ I-Kollagen (Long und Ashcraft, 1994). Zwei zusätzliche Matrixmoleküle sind wichtig: Knochensialoprotein und Osteopontin (Oldberg et al., 1986, Nomura et al., 1988). Von diesen zwei Proteinen wird angenommen, dass sie in der Knochenbildung involviert sind, aber ihre Rolle ist unbekannt.
Die Funktion dieser ECM-Moleküle, lösliche gereinigte ECM-Proteine, werden in einer simulierten Mikrogravität und in Kontrollkulturen untersucht. Variierende Mengen der exogenen ECM-Moleküle werden in Gegenwart eines einzelnen Wachstumsfaktors (z.B. 25 pM TGF-β oder die optimale Faktor/Konzentration, die für die simulierte Mikrogravitätsumgebung vorstehend ausführlich definiert wurde), um die genaue Beurteilung der Entwicklungseffekte von jedem Extrazellulärmatrixmolekül zu ermöglichen. Die kombinierten Effekte der relevanten Cytokine und Matrixmoleküle auf die Expansion der humanen Knochenvorläuferzellen in der simulierten Mikrogravität wird bestimmt. Jedes der wirksamen Cytokine in den definierten Matrixmolekülen wird bei optimalen Konzentrationen zugegeben und die Zellproliferation wie vorstehend ausgeführt beurteilt.
Die vorstehenden Studien zeigen in einer schrittweisen Art: (1) die korrekten physikalischen/geometrischen Erfordernisse für das Zellwachstum der Knochenprogenitorzellen in einer simulierten Mikrogravität, (2) das geeignete Cytokin oder Cytolin-Kombinationen und (3) die relevanten ECM-Moleküle, die für die humane Knochenvorläuferzellproliferation erforderlich sind. Eine komplexe osteogene Mikroumgebung wird somit zu einer schrittweisen Evaluierung und Optimalisierung jeder der relevanten Komponenten reduziert. Diese Studien definieren die minimalen essentiellen Bedingungen für die ex vivo Expansion der humanen Knochenvorläuferzellen in simulierter Mikrogravität.
Beispiel 10: Die Ansprechbarkeit der entwickelnden Knochenvorläuferzellen auf andere Mikroumgebungssignale in einer simulierten Mikrogravität
Entwickelnde Gewebezellen interagieren mit einer großen Vielzahl von Regulatoren während ihrer Ontogenität. Somit interagieren Zellen miteinander, mit Wachstumsfaktoren und mit Extrazellulärmatrixmolekülen. Jede dieser Interaktionen wird durch definierte spezifische Rezeptorligandeninteraktionen, die sowohl zum Stimulieren der Zellproliferation und/oder Motilität notwendig sind, vermittelt. Beide, chemische und/oder Extrazellulärmatrixgradienten, existieren, die der Zellen signalisieren, sich in eine definierte Mikroumgebung zu bewegen. Ferner dienen als nächstes hohe Konzentrationen des Lockstoffs oder andere Signale dazu, die Zellen zu lokalisieren, womit ihre nicht zufälligen Bewegungen gestoppt werden. Signale, die Zellen in geeigneten Mikroumgebungen stoppen oder regionalisieren, werden wenig verstanden.
Die Erfinder haben gezeigt, dass im hämatopoietischen System Komplexe der Cytokine und Extrazellulärmatrixmoleküle dazu dienen, die Progenitorzellen zu lokalisieren (Long et al., 1992). Es ist wahrscheinlich, dass ähnliche Mobilitäts(chemotactile)- oder Lokalisierungssignale für Knochenvorlläuferzellen vorliegen, und ihre Bewegung in eine osteogene Region (wie eine Fraktur) vermitteln. Die Modulation dieser physiologischen Prozesse in simulierten Mikrogravitätsbedingungen wird untersucht.
Eine Vorläuferzellrytoadhäsion und Gewebelokalisierung. Kürzlich habe die Erfinder einen Cytoadhäsionsassay entwickelt, der Cage(„caged")-Fluorochrome verwendet, um isolierte Progenitorzellen für die nachfolgenden Adhäsionsstudien zu markieren. In diesem Assay werden Acetylmethylester-Derivate von FITC verwendet, um die Zellen lebensfähig zu markieren. Nach Internalisierung hält die intrazelluläre Esterspaltung die AM-Esterderivate die freigesetzten Fluorochrome relativ impermeabel. Bedeutsamerweise ist das Fluoreszenzsignal bezüglich der Zellzahl linear, und so wenig wie mehrere hundert Zellen können detektiert werden (10A). Der Zytoadhäsionsassay besteht dann aus der adhäsion der Cage-Fluorochrom-markierten Zellen gegen die gereinigten und/oder rekombinanten Proteine, die auf der Gewebekulturplastik immobilisiert sind (wie früher beschrieben (Long und Dixit, 1990; Long et al., 1992)), dem Entfernen der nicht-adhärenten Zellen und der Quantifizierung in einem Fluoreszenzplattenauslesegerät.
Die resultierende Sensitivität dieses Assays ist etwa 100 mal größer als der anderer Cytoadhäsionsassays, die früher von diesem Labor berichtet wurden (Long et al., 1992, Long und Dixit 1990; Campbell et al., 1990). Die Erfinder benutzten diesen Assay in vorläufigen Studien von gereinigten humanen Knochenvorlläuferzellen, um die Anbindung an Extrazellulärmatrixmolekülen zu beurteilen. Diese Daten zeigen, dass die Knochenvorläuferzellen differenzierte Anbindungsakapazitäten gegen sowohl immobilisierte Knochen-ECM-Moleküle als auch immobilisierte Cytokine (10B) zeigen. Frühere Arbeiten zeigten, dass hämatopoietische Prognitorzellen an sowohl Wachstumsfaktoren als auch ECM-Moleküle banden (Long et al., 1992; Long und Dixit, 1990; Campbell et al., 1990).
Somit zeigen eben so divergente zelluläre Phänotypen wie Knochen und hämatopoietische Zellen die dualen Anforderungen für Matrix- und Cytokin-Moleküle beim Lokalisierungs(Adhäsions)prozess. Bemerkenswerterweise zeigt das Binden der Progenitorzellen an immobilisierte, solitäre Cytokine weiter, dass das Vorliegen von Wachstumsfaktoren (die oft selbst in der Extrazellulärmatrix immobilisiert sind (Long, 1992)) zumindest teilweise für die abstammungsspezifische Lokalisierung der Zellen verantwortlich ist. Nichtsdestoweniger ist es wahrscheinlich, dass das Vorliegen der spezifischen ECM-Moleküle den Lokalisierungsprozess verstärkt.
Um die Rolle der Cytoadhäsion in der Knochenvorläuferzellproliferation zu beurteilen, wird der ungewöhnliche Aspekt einer simulierten Mikrogravitation benutzt, in der die adhäsive Interaktion vermindert werden kann (im Fall einer simulierten Mikrogravitätsgewebekultur in Abwesenheit eines Mikrocarriers) oder differenziell vergrößert wird (mit Mikrocarriern). Um diese Studien durchzuführen, wurden Kulturen von proliferierenden Knochenvorläuferzellen unter optimalen Cytokinbedingungen, wie vorstehend definiert, etabliert oder (als Ausgangspunkt) wie bei den Einheitsgravitätsbedingungen definiert. Die Kapazität der unter simulierter Mikrogravität kultivierten Zellen, mit Knochenzellregulatorcytokinen (bFGF, TGF-β1 und BMP-2) und extrazellulären Molekülen (Osteonectin, Osteocalcin, Knochensialoprotein, Osteopontin, Fibronectin und Thrombospondin) zu interagieren (adhärieren) wird untersucht. Die letzten zwei Proteine (Thrombospondin und Fibronectin) liegen in der Knochenzellulärmatrix vor und sind als Cytoadhäsionsmoleküle für entwickelndes Gewebe wichtig (Weiss und reddi, 1980, Clezardin et al.,, 1989).
Knochenvorläuferzellchemotaxi. In einer ähnlichen Art werden die Effekte der simulierten Mikrogravität auf die Motilitätsmaschinerie der entwickelnden Knochenvorläuferezellen untersucht. Verschieden auf Knochen bezogene Wachstumsfaktoren werden hinsichtlich ihrer Kapazität für direkte nicht zufällige Bewegung (Cytokinese) und nicht-zufällige Migration (Chemotaxi) beurteilt. Wie früher erwähnt, besitzen frühere Knochenvorläuferzellen die Fähigkeit, aktiv in die Gegend von Knochenverletzungen zu migrieren, wo sie in knochenbildende Zellen differenzieren. Allerdings gibt es keine Informationen über die Faktoren oder Ereignisse, die diesen wichtigen Migrationsprozess steuern.
Die simulierten Mikrogravitäts-kultivierten Zellen und Kontrollzellen werden für ihre Ansprechbarkeit für sowohl bekannte chemotactile Faktoren (Chemokine, d.h. Interleukin-8, GM-CSF, M-CSF) und für die Rolle der osteogenen Wachstumsfaktoren bei der Stimulierung entweder der Chemokinese oder der Chemotaxi bewertet. Insbesondere bFGF und TGF-β1, beides wirksame Regulatoren der Knochenprogenitotzellproliferation, werden beurteilt. Um diesen Effekt der Mikrogravität auf die Migrationsfähigkeit von Knochenvorläuferzellen zu untersuchen, wird eine Gruppe bekannter Leukozytenchemotaxifaktoren und osteogene Faktoren im direkten Vergleich der Einheitsgravitätskontrollzellen verwendet.
Die Chemokine sind Mitglieder einer Supergenfamilie von chemotactilen Cytokinen (Oppenheim et al., 1991). Die chemokinen α-Cytokine werden umfasst von Molekülen mit ihren ersten zwei Cysteinen, die von einer Aminosäure (C-X-C) unterbrochen werden, und werden repräsentiert von solchen Molekülen wie Interleukin-8 (IL-8) und Platelet-Faktor 4 (PF4). MCP-1 und RANTES sind repräsentativ für die Chemokin-β-Subfamilie, und sie werden durch eine nicht unterbrochene C-C-Anordnung charakterisiert. Die Verwendung von IL-8 und MCP-1 ermöglicht den Einsatz von chemotactilen Faktoren, die bekannt sind, die Migration in einem breiten Spektrum von Zellen zu induzieren (Oppenheim et al., 1991).
Beispiel 11: Fähigkeit der Knochenvorläuferzellen in Osteoblastenzellen zu differenzieren oder die Kapazität der Osteoblasten zu beeinflussen, eine osteoide Extrazellulärmatrix in simulierter Mikrogravität zu entwickeln
Die vollständige Beurteilung der Knochenzellentwicklung erfordert die Untersuchung von bekannten Knochenvorläuferzellen (Osteoprogenitorzellen und Präosteoblasten) sowie ihre differenzierte Nachkommenschaft, die Osteoblasten. Es sind die Osteoblasten, die für die Entwicklung und Mineralisierung der Knochenmatrix und die nachfolgende Knochenbildung verantwortlich sind. Wie erwähnt, zeigen Studien bei Weltraumflügen und bei (Bettlägrigkeits)-Modellen des Gewichtsverlustes, dass die differenzierte Funktion von Osteoblasten unter Mirkogravitätsbedingungen beeinträchtigt wird. Im Ergebnis kommt es zu einem Calcium- und Knochenverlust sowohl in der Periosteal- als auch Trabekular-Region, wobei letzter vorherrscht.
Auf zellulärem Level vermindern oder verlieren die Osteoblasten ihre Kapazität, die Osteoidmatrix zu bilden (Klement und Spooner, 1993), wobei wenig Änderungen in der Osteoclastenaktivität auftreten. Schließlich induziert die Mikrogravität eine Disassoziierung zwischen Knochenvorläuferzellproliferation und Differenzierung, was in einer Differenzierungsblockade resultiert, die eine erhöhte Anzahl von Vorläuferzellen relativ zur Anzahl der differenzierten Osteoblasten hervorruft (Klement und Spooner, 1993).
Die meisten der quantitativen Daten über den Mikrogravitäts-induzierten Knochenverlust stammt von Studien mit ganzen Tieren, und sie tendieren dazu, vorherrschend morphometrisch und von retrospektiver Art zu sein. Somit können sie Stellen der biochemischen/molekularen Defekte, die zum Knochenverlust führen, nur in simulierten Mikrogravitätsstudien gezeigt werden. Wichtigerweise können solche Studien nicht mit Trabeculaknochenauswachskulturen wegen einer Vielzahl von Gründen (limitierende Zellzahl, Fehlen gereinigter Zellen, Heterogenität der vorliegenden Zelltypen etc.) und durchgeführt werden, und weil der prinzipielle Defekt kann ein Versagen der Osteoblastendifferenzierungsweges sein kann. Das bedeutet, die Zellentwicklung nicht von den Osteoprogenitorzelln zu den Präosteoblasten oder von den Präosteoblasten zu den Osteoblasen voranschreiten kann. Daher ist es am besten, dieses Problem in einem System zu untersuchen, in dem das volle Spektrum der humanen Knochenzellproliferation/Differenzierung beurteilt werden kann.
Regulation der Osteoblastenzelldifferenzierung. Wie hier beschrieben, habe die Erfinder ein System entwickelt, mit dem isolierte und gereinigte Knochenvorlläuferzellen in Osteoblastenzellen proliferieren und differenzieren. Insbesondere habe die Erfinder bewiesen, dass das Verfahren des Umstellens von Serum-freien Kulturen auf mit TGF-β gesteuerten Serum-haltige Kulturen eine Differenzierung von Präosteoblasten in Osteoblastenzellen ergibt. Wichtigerweise generieren die Osteoblastenzellen eine ostoide Extrazellulärmatrix, in der nicht-kollagene Knochenproteine abgeschieden und die Zellen die Extrazellulärmatrix calzifizieren.
Der Effekt der stimulierten Mikrogravität auf sowohl die Differenzierung der Präosteoblasten in Osteoblasten als auch die nachfolgend Änderung in differenzierte Zell(Osteoblasten)-Funktion wird beurteilt. Als solche wird das vorstehend beschriebene Kulturverfahren modifiziert, um die Osteoblastenzelldifferenzierung zu induzieren. In diesen Untersuchungen wird die simulierte Mikrogravitätskultur humaner Knochenvorläuferzellen in zwei Phasen betrieben. Die erste Phase ist eine ex vivo Expansions-Schritt, der Serum-freie Kulturen benutzt, die eine Wachstumsfaktoren/Matrix-Kombination (wie vorstehend definiert) enthält, um eine maximale Anzahl von Knochenvorläuferzellen zu generieren.
Während dieser Kulturphase wird nur die Zellularität und die Aggregat-Bildung als Index der Kulturbedingungen überwacht. Bei optimaler Zelldichte werden die Kulturen auf Serum-haltige TGF-β-enthaltende Bedingungen umgestellt. Nachfolgende Untersuchungen (über zusätzliche 7–10 Tage) evaluieren die Osteoblasetendifferenzierungsmuster und funktionellen Kapazitäten.
Wie hier beschrieben, haben die Erfinder eine Multi-Parameter-Durchflusszytometrieanalyse der Osteoblastenzelldifferenzierungsmarker definiert; diese Zellen nehmen in der Zellgröße, der Zellkomplexität und der Expression der multiplen Marker der Knochenzelldifferenzierung zu. Die Erfinder beurteilen die Kapazität der Präosteoblasten, in Osteoblastenzellen unter Verwendung dieser Mulitparameter-Durchflusszytrometrieanalyse zu differenzieren.
Insbesondere wurde die Expression der Knochenproteine, wie vorstehend diskutiert, und zwei zusätzliche Marker der Knochendifferenzierung, alkalische Phosphatase und Typ-I-Kollagen, beurteilt. Alkalische Phosphatase (EC 3.1.3.1) wird mittels sowohl Durchflusszytometrie als auch Cytochemie der alkalischen Phosphatase (Reddi 1981) überwacht. Letzteres Verfahren unterscheidet alkalische Phosphatase aus Knochen von der aus Leber basierend auf der Sensitivität von Hitze und Harnstoff. Die Produktion und Abscheidung der Knochenextrazellulärmatrixmolekül-Mikrogravität-gesteuerten Osteoblastenzellen wird bestimmt durch metabolisches Markieren und Immunpräzipitation mit ³⁵S-Methionin-Immunpräzipitation.
Extrazellulärmatrixcalcifizierung. Studien über die Kapazität der simulierten Mikrogravitation und Kontrollkulturosteoblastenzellen, um ihre umgebende (Knochen)-ECM zu mineralisieren, verwendet zwei alternative Zugänge: metabolisches Markieren mit ⁴⁵Ca⁺⁺ und histochemische Analyse unter Verwendung des von Kossa-Färbeverfahrens. Für die Calciummarkierungsuntersuchungen werden zwei Aspekte des Calciummetabolismus in Knochenzellen beurteilt: ihre Fähigkeit, Calcium aufzunehmen, und ihre Fähigkeit, Calcium in der Extrazellulärmatrix abzuscheiden.
In diesen Untersuchungen werden simulierte Mikrogravitäts-expandierte Osteoblasten von den rotierenden Gefäßwänden entfernt und (kurz gesagt eine Stunde) mit ⁴⁵Ca⁺⁺ gleichgewichtsmarkiert, wie vorstehend beschrieben. Kurz dargestellt werden Osteoblasten, die in simulierter Mikrogravität (an den Tagen 3, 5, 7, 14 und 21 nach der Serum-Stimulation) differenziert sind, entfernt, und 3 mal mit Calcium-freien PBS gewaschen und metabolisch mit 50 μCi ⁴⁵Ca⁺⁺ (als CaCl₂; Amersham, Arlington Heights, IL; spez. Akt. 733 mBq/mg) während 60 Minuten bei 37 °C markiert. Nach der ⁴⁵Ca⁺⁺-Calcium-Äquilibrierung, werden die markierten Zellen von nicht eingebautem Calcium frei gewaschen, in Serum-freiem Gewebekulturmedium resuspendiert und in den ursprünglichen Kulturschalen oder unter simulierten Mikrogravitätsbedingungen reetabliert. Ein Aliquot von Ca⁺⁺-markierten Zellen wird unverzüglich auf den ⁴⁵Ca⁺⁺-Gehalte hin analysiert. Die Quantifizierung der pro Zelle aufgenommenen Mengen von ⁴⁵Ca⁺⁺ zeigt die durch Mikrogravitation induzierten Differenzen in der Calcium-Aufnahme, wohingegen das Matrixcalcium die Abscheidung anzeigt.
Für die Matrixabscheidung, läßt man Gleichgewichts-markierte Zellen zelluläres ⁴⁵Ca⁺⁺ in ECM einbauen. Ausgehend davon, dass sowohl Osteocalcin (BGP) als auch Osteonectin Calcium binden, schließt dieses exogene Zellmarkierungsverfahren das ⁴⁵Ca⁺⁺-Binden in Fluidphase an vorher synthetisierten Matrixproteinen aus. Nachfolgend werden Zellen/ECM mit Trypsin/EDTA entfernt, Zellen mittels Zentrifugation pelletisiert und der ⁴⁵Ca⁺⁺-Einbau in das mit Trypsin/EDTA-extrahierbare ECM mittels Scintillationszählung bestimmt. Trypsin-resistentes ECM wird mit Triton X-100-Extraktion wie früher beschrieben (Gospodarawicz und Ill, 1980; Gospodarowicz et al., 1980) entfernt und in ähnlicher Weise gezählt. Um die verbleibende Zellkontamination zu kontrollieren, werden Extrakte hinsichtlich des DNA-Gehalts und der Calcium-Abscheidung in der Matrix als gesamtes extrahierbares ⁴⁵Ca⁺⁺ berechnet, korrigiert um das durch die kontaminierenden Zellen.
Die Calciumbeladungsstudien evaluieren präzise die Aufnahme und die Abscheidung des Calciums durch humane Osteoblastenzellen während ihrer Differenzierung in der simulierten Mikrogravität und den Einheitsgravitätsbedingungen. Die histochemische Idnetifizierung der Matrixcalciumabscheidung unter Verwendung der von Kossa-Färbungsreaktion wird auch beurteilt (Heeley und Irving, 1973; Puchtler und Meloan, 1978). Die Erfinder korrelierten früher das Vorliegen einer positiven von Kossa Reaktion mit der Fähigkeit der Osteoblastenzellen, die bei der Einheitsgravität erzeugt wurden, metabolisch Calcium in der Extrazellulärmatrix abzuscheiden. Als Einleitung zu aktuellen Weltraumflug-Untersuchungen, werden die simulierte Mikrogravität und die Kontrollkulturen für die von Kossa-Reaktivität zu den gleichen Zeitpunkten der Studien über die Inkorporation/die Abscheidung von Calcium evaluiert. Diese kinetischen Studien werden miteinander korreliert, und sollte die Validität der von Kossa-Reaktion als Indikator der Calcifizierung unter simulierten Mikrogravitätsbedingungen demonstrieren.
Alle Zusammensetzungen und Verfahren, die hier offenbart und beansprucht werden, können im Licht der vorliegenden Offenbarung ohne unnötige Experimente gemacht und ausgeführt werden. Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung wurden als bevorzugte Ausführungsformen beschrieben. Insbesondere ist es offensichtlich, dass bestimmte Agenzien, die sowohl chemisch als auch physiologisch sein können; gegen die Agenzien ausgetauscht werden können, die hier beschrieben sind, wobei die gleichen oder ähnliche Ergebnisse erhalten werden.
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Claims

Ex-vivo-Verfahren zum Herstellen einer angereicherten Population von Knochenvorläuferzellen, ausgehend von einer Population von Zellen, die Knochenvorläuferzellen einschließt, umfassend den Schritt: Anreichern der Population von Zellen auf Knochenvorläuferzellen durch Aussetzen der Zellen einem Knochenvorläuferzell-Antikörper, der immunreaktiv mit Osteocalcin oder Osteonectin ist, und Entfernen von Zellen der Population, die nicht mit dem Antikörper immunreagieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population von Zellen, die Knochenvorläuferzellen einschließt, eine Säugerzellpopulation ist, insbesondere eine menschliche Zellpopulation.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population von Zellen, die Knochenvorläuferzellen einschließt, eine Population von Knochenmarkzellen oder eine Population von Zellen des periphären Bluts ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend Gleichgewichtsdichte-Zentrifugation der Population von Zellen, um Zellen mit einer Dichte von zwischen 1,050 und 1,090 g/cm³, vorzugsweise von zwischen 1,060 und 1,085 g/cm³, bereitzustellen.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Entfernen von anhaftenden Stroma-Zellen durch Aussetzen besagter Population von Zellen einer adherenten Oberfläche.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die adherente Oberfläche Zellkulturplastik oder Zellkulturglas ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Fraktionieren der angereicherten Population von Knochenvorläuferzellen nach Zellgröße, um Zellen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von zwischen etwa 8 μm und etwa 70 μm, vorzugsweise zwischen etwa 10 μm und etwa 20 μm zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Fraktionieren der angereicherten Population von Knochenvorläuferzellen nach Zellgröße durch Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrie, Geschwindigkeitssedimentation oder Gegenfluss-Zentrifugation-Elutriation.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die angereicherte Population von Knochenvorläuferzellen zwischen 1000-fach bis 4800-fach über der Ausgangspopulation von Zellen auf Knochenvorläuferzellen angereichert ist, bestimmt durch durchflusszytometrische Bestimmung von Osteocalcin-positiven Zellen, insbesondere zwischen etwa 1000fach und etwa 2000fach, im Besonderen zwischen etwa 2000fach und etwa 3000fach, stärker bevorzugter zwischen etwa 3000fach und etwa 4000fach und am stärksten bevorzugt 4800fach.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Knochenvorläuferzell-Antikörper an ein festes Substrat konjugiert ist, vorzugsweise an eine Plastikoberfläche, Glasoberfläche, Agarose, Acrylamid, Lectin oder ein magnetisches Teilchen, insbesondere an ein magnetisches Teilchen.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend das Aussetzen der Population von Zellen, die immunreaktiv mit dem Knochenvorläuferzell-Antikörper sind, einem zweiten Antikörper, der immunreaktiv mit dem Knochenvorläuferzell-Antikörper ist, und Entfernen der Zellen der Population, die nicht mit dem Knochenvorläuferzell-Antikörper immunreagieren.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der zweite Antikörper an ein festes Substrat konjugiert ist, bevorzugt an eine Plastikoberfläche, Glasoberfläche, Agarose, Polyacrylamid, Lectin oder ein magnetisches Teilchen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Knochenvorläuferzellen Osteocalcin, Osteonectin oder alkalische Phosphatase aus Knochen exprimieren, aber nicht das pan-hämatopoietische Antigen CD34 exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Knochenvorläuferzellen Osteoprogenitorzellen oder Prä-Osteoblasten sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population von Zellen auf Knochenvorläuferzellen angereichert wird durch Aussetzen der Zellen einem Anti-Osteocalcin-Antikörper und einem Anti-Osteonectin-Antikörper.
Eine angereicherte Population von Knochenvorläuferzellen, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 15.
Zusammensetzung, enthaltend eine angereicherte Population von Knochenvorläuferzellen nach Anspruch 16, wobei die angereicherte Population von Knochenvorläuferzellen Zellen einschließt, die die folgenden Eigenschaften haben: – immunreaktiv mit einem Knochenvorläuferzell-Antikörper zu sein; – einen durchschnittlichen Zelldurchmesser von zwischen etwa 8 μm und etwa 70 μm zu haben; und – in Osteoblasten zu differenzieren nach Ausgesetztsein von transformierendem Wachstumsfaktor β, 1,25-OH-Vitamin-D3, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder Knochen-morphogenetischen Proteine.
Zusammensetzung von Anspruch 17, wobei die Knochenvorläuferzellen aus Knochenmarkzellen oder Zellen des periphären Bluts erhalten werden.
Zusammensetzung von Anspruch 17, wobei die Knochenvorläuferzellen immunreaktiv mit einem Anti-Osteocalcin- und/oder Anti-Osteonectin-Antikörper sind.
Zusammensetzung von einem beliebigen der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Knochenvorläuferzellen Osteocalcin, Osteonectin oder alkalische Phosphatase aus Knochen exprimieren, aber nicht das pan-hämatopoietische Antigen CD4 exprimieren.
Zusammensetzung von einem beliebigen der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Knochenvorläuferzellen Osteoprogenitor-Zellen oder Prä-Osteoblasten sind.
Verfahren zum Differenzieren von Knochenvorläuferzellen, vorzugsweise Säugerknochenvorläuferzellen oder menschlichen Knochenvorläuferzellen, in Osteoblasten, umfassend die Schritte: – Erhalten einer angereicherten Population von Knochenvorläuferzellen nach Anspruch 16; – Aussetzen der Knochenvorläuferzellen einem Wachstumsfaktor; und – Kultivieren der Knochenvorläuferzellen unter serumfreien Bedingungen, um die Knochenvorläuferzellen zu Osteoblasten zu differenzieren.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Knochenvorläuferzellen transformierendem Wachstumsfaktor β, 1,25-OH-Vitamin-D3, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder Knochen-morphogenetischen Proteinen ausgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, weiter umfassend das Kultivieren der Knochenvorläuferzellen in Gegenwart von Typ-I-Kollagen, Fibrinogen, Fibrin, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Osteocalcin oder Osteonectin, vorzugsweise in der Gegenwart von Polyglycolsäure und Polymilchsäure oder in der Gegenwart von Typ-I-Kollagen, Fibrinogen und Fibrin oder in der Gegenwart von Typ-I-Kollagen, Fibrinogen, Fibrin, Osteocalcin und Osteonectin.
Verwendung einer angereicherten Population von Knochenvorläuferzellen nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Osteopenie.
Verwendung von Anspruch 25, wobei die Osteopenie Osteoporose ist.
Verwendung einer angereicherten Population von Knochenvorläuferzellen nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Knochenwiederherstellung, zur Knochenverbindung, zum Ersetzen kleiner Knochen oder in der Behandlung einer parodontalen Krankheit.
Verwendung von Anspruch 27, wobei die zu verabreichende angereicherte Population von Knochenvorläuferzellen in eine biologische Matrix eingebettet ist, die die Konsistenz eines starken Gels hat.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die biologische Matrix aus definierten Knochenproteinen und Knochenwachstumsfaktoren besteht, gegebenenfalls auch enthaltend Polyglycolsäure und/oder Polymilchsäure.