KR102492243B1 - 배경 신호에 대한 보상에 의한 균질 면역검정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 샘플 및 시약에 내재하는 배경 신호의 보상을 가능하게 하는 동종 면역검정에 관한 것이다. 본 발명은 생물학적 샘플에서 대칭적인 디메틸 아르기닌(SDMA)의 존재 또는 양의 검출을 위한 동종 면역검정의 이용에 관한 것이다. 검정을 수행하기 위한 시약 및 키트에 관한 것이다.

Description

배경 신호에 대한 보상에 의한 균질 면역검정
배경
관련 출원
본 출원은 전문이 본원에 참조로서 포함되는 2015년 2월 20일 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/118,832호의 이익을 주장한다.
분야
본 개시 내용은 일반적으로 샘플 및 시약에 내재하는 배경 신호의 보상을 가능하게 하는 동종 면역검정에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 본 개시 내용은 생물학적 샘플에서 대칭적인 디메틸 아르기닌(SDMA)의 존재 또는 양의 검출을 위한 동종 면역검정의 이용에 관한 것이다.
배경
동종 면역검정은 다양한 분석물, 가장 주목할만하게는, 남용 약물에 대한 분석물의 결정을 위해 구현되었다. SDMA는, 예를 들어, 신장 기능, 심혈관 기능, 및 SLE의 평가를 위한 마커로서 생물학적 샘플에서 확인되었다. SDMA는 전형적으로 남용 약물에 대한 분석물에 비해 비교적 낮은 농도로 생물학적 샘플에 존재한다.
따라서, 본 발명자들은, 특히 생물학적 샘플에서 낮은 농도를 갖는 SDMA와 같은 분석물에 대해, 더욱 정확하고 민감한 동종 면역검정에 대한 필요성을 당 분야에서 확인하였다.
개요
한 양태에서, 본 개시 내용은 대칭적인 디메틸 아르기닌(SDMA)의 컨쥬게이트, 예를 들어 SDMA와 효소의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 개시 내용의 한 예에서, 컨쥬게이트는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)에 컨쥬게이션된 SDMA이다. 다양한 구체예에서, SDMA 및 효소는 5 내지 15개 원자 링커를 통해 컨쥬게이션된다. 유사하게, SDMA는 약 5-15 옹스트롬의 길이를 갖는 링커를 통해 효소에 컨쥬게이션될 수 있다. 본 개시 내용의 예시적인 컨쥬게이트는 하기를 포함한다:
Figure 112017090328947-pct00001
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 컨쥬게이트 및 유리 SDMA에 특이적인 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 다양한 구체예에서, 유리 SDMA에 특이적인 항체는 유리 SDMA에 대한 이의 반응성의 25% 미만의 반응성을 비대칭적인 디메틸아르기닌(ADMA)에 대해 가질 수 있다. 유사하게, 항체는 비대칭적인 디메틸아르기닌(ADMA), L-아르기닌, 및 N-메틸아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물과 교차반응성을 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않을 수 있다.
추가 양태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 컨쥬게이트 및 SDMA에 특이적인 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
다양한 양태에서, 본 개시 내용의 키트는 분석물을 함유하는 샘플에 대한 검정을 수행하기 위한 시약을 포함한다. 키트는 하기 구성요소를 포함할 수 있다:
(a) i. 항-분석물 항체 및 효소에 대한 신호 생성 기질을 포함하는 제1 시약, 및
ii. 분석물 및 효소의 컨쥬게이트를 포함하는 제2 시약을 포함하는 제1 검정을 수행하기 위한 제1 세트의 시약, 및
(b) i. 기질을 포함하는 제3 시약을 포함하는 제2 검정을 수행하기 위한 제2 세트의 시약.
키트에서, 제2 세트의 시약은 희석제 및 완충제 중 적어도 하나를 포함하는 제4 시약을 추가로 포함할 수 있다. 제4 시약은 또한 컨쥬게이트 또는 효소를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 키트의 시약 중 적어도 하나는 컨쥬게이트의 효소 이외의 효소에 대한 억제제를 포함한다. 구체예에서, 제1 시약의 컨쥬게이트의 농도는 제4 시약의 컨쥬게이트의 농도보다 약 5 내지 약 150배 더 높다. 키트는 또한 분석물이 제거된 샘플 용액에 희석된 공지된 양의 분석물을 포함하는 표준을 포함할 수 있다. 예를 들어, 분석물이 제거된 샘플 용액은 제거된 혈청, 제거된 혈장, 또는 전처리된 샘플일 수 있다. 제1 시약 및/또는 제2 시약은 전자 매개체 및 염료를 추가로 포함할 수 있고, 제3 시약 및/또는 제4 시약은 매개체 및 염료를 추가로 포함할 수 있고, 매개체는 기질로부터 전자를 받아 이를 염료로 이동시킨다.
또한 추가로, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 키트의 구성요소 및 SDMA를 포함할 것으로 의심되는 샘플을 포함하는 반응 혼합물에 관한 것이다.
또한 다른 구체예에서, 본 개시 내용은 샘플 중 유리 SDMA의 존재 또는 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 샘플을 유리 SDMA에 특이적인 항-SDMA 항체, 제 1항의 컨쥬게이트, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)를 포함하는 기질과 접촉시키고, NAD에서 NADH로의 전환을 측정하고, NAD에서 NADH로의 전환에 기반하여 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 결정하는 것을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 다양한 구체예에서, NAD에서 NADH로의 전환을 측정하는 것은 NAD에서 NADH로의 전환율을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, NAD에서 NADH로의 전환에 기반하여 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 결정하는 것은 NAD에서 NADH로의 전환율을 표준 곡선과 비교하는 것을 포함할 수 있거나, NAD에서 NADH로의 전환을 측정하는 것은 NAD에서 NADH로 전환되는 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다. NAD에서 NADH로의 전환에 기반하여 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 결정하는 것은 또한 NAD에서 NADH로 전환되는 양을 표준 곡선과 비교하는 것을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 또 다른 양태에서, 상기 방법은,
(a) i. 샘플을 항-분석물 항체, 분석물 및 효소를 포함하는 컨쥬게이트, 및 효소와 접촉시 신호를 생성하는 기질과 접촉시킴에 의해 샘플 제1 반응 혼합물을 형성하고,
ii. 샘플 제1 반응 혼합물로부터 신호를 측정하는 것을 포함하는 샘플 제1 반응 순서를 수행하는 단계;
(b) i. 샘플을 기질과 접촉시킴에 의해 샘플 제2 반응 혼합물을 형성하고,
ii. 샘플 제2 반응 혼합물로부터 신호를 측정하는 것을 포함하는 샘플 제2 반응 순서를 수행하는 단계;
(c) 단계 (a)로부터의 신호 양으로부터 단계 (b)로부터의 신호 양을 빼서 순 신호(net signal)를 제공하는 단계;
(d) 순 신호를 이용하여 샘플 중 분석물의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
본 개시 내용의 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(a) i. 공지된 양의 분석물을 포함하는 캘리브레이터 세트의 각 캘리브레이터를 항-분석물 항체, 분석물 및 효소를 포함하는 컨쥬게이트, 및 효소와 접촉시 신호를 생성하는 기질과 개별적으로 접촉시킴에 의해 캘리브레이터 제1 반응 혼합물을 형성하고,
ii. 각 캘리브레이터 제1 반응 혼합물로부터 신호를 측정하는 것을 포함하는 캘리브레이터 제1 반응 순서를 수행하는 단계;
(b) i. 캘리브레이터 세트의 각 캘리브레이터를 기질과 접촉시킴에 의해 캘리브레이터 제2 반응 혼합물을 형성하고,
ii. 캘리브레이터 제2 반응 혼합물로부터 신호를 측정하는 것을 포함하는 캘리브레이터 제2 반응 순서를 수행하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 신호 양으로부터 단계 (a)로부터의 신호 양을 빼서 각 캘리브레이터의 순 신호를 제공하는 단계;
(d) 캘리브레이터 중 2개 이상으로부터의 순 신호를 이용하여 표준 곡선을 생성하는 단계;
(e) 샘플로부터의 순 신호를 표준 곡선과 비교함에 의해 샘플 중 분석물의 양을 결정하는 단계.
본 개시 내용의 방법의 다른 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) i. 샘플을 항-분석물 항체, 분석물 및 효소를 포함하는 컨쥬게이트, 및 효소와 접촉시 신호를 생성하는 기질과 접촉시킴에 의해 샘플 제1 반응 혼합물을 형성하고,
ii. 샘플 제1 반응 혼합물로부터 신호를 측정하고;
iii. 샘플 제1 반응 혼합물과 관련된 배경을 고려하여 샘플 제1 반응 혼합물에 대한 반응 속도를 표준화하는 것을 포함하는 샘플 제1 반응 순서를 수행하는 단계;
(b) i. 샘플을 기질과 접촉시킴에 의해 샘플 제2 반응 혼합물을 형성하고,
ii. 샘플 제2 반응 혼합물로부터 신호를 측정하고;
iii. 샘플 제2 반응 혼합물과 관련된 배경을 고려하여 샘플 제2 샘플 반응 혼합물로부터 반응 속도를 표준화하는 것을 포함하는 샘플 제2 반응 순서를 수행하는 단계;
(c) 단계 (a)(iii)의 표준화된 속도로부터 단계 (b)(iii)의 표준화된 속도를 빼서 분석물을 함유하는 샘플에 대한 최종 반응 속도를 제공하는 단계;
(d) 최종 반응 속도를 이용하여 샘플 중 분석물의 양을 결정하는 단계.
본 개시 내용의 방법은 또한 하기 단계를 포함할 수 있다:
(a) i. 공지된 양의 분석물을 포함하는 캘리브레이터 세트의 각 캘리브레이터를 항-분석물 항체, 분석물 및 효소를 포함하는 컨쥬게이트, 및 효소와 접촉시 신호를 생성하는 기질과 개별적으로 접촉시킴에 의해 캘리브레이터 제1 반응 혼합물을 형성하고,
ii. 각 캘리브레이터 제1 반응 혼합물로부터 신호를 측정하고;
iii. 각 캘리브레이터 제1 반응 혼합물과 관련된 배경을 고려하여 각 캘리브레이터 제1 반응 혼합물로부터 반응 속도를 표준화하는 것을 포함하는 캘리브레이터 제1 반응 순서를 수행하는 단계;
(b) i. 캘리브레이터 세트의 각 캘리브레이터를 기질과 접촉시킴에 의해 캘리브레이터 제2 반응 혼합물을 형성하고,
ii. 캘리브레이터 제2 반응 혼합물로부터 신호를 측정하고;
iii. 캘리브레이터 제2 반응 혼합물과 관련된 배경을 고려하여 캘리브레이터 제2 반응 혼합물에서 각 캘리브레이터에 대한 반응 속도를 표준화하는 것을 포함하는 캘리브레이터 제2 반응 순서를 수행하는 단계;
(c) 단계 (a)(iii)의 표준화된 속도로부터 단계 (b)(iii)의 표준화된 속도를 빼서 각 캘리브레이터에 대한 최종 반응 속도를 제공하는 단계;
(d) 각 캘리브레이터에 대한 최종 반응 속도에 기반하여 표준화된 표준 곡선을 생성하는 단계;
(e) 샘플에 대한 표준화된 반응 속도를 표준화된 표준 곡선과 비교함에 의해 샘플 중 분석물의 양을 결정하는 단계.
본 개시 내용의 방법의 다양한 양태에서, 샘플 및 캘리브레이터 제2 반응 혼합물은 희석제, 완충제, 및 항-분석물 항체 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 샘플 제1 반응 혼합물 및/또는 캘리브레이터 제1 반응 혼합물과 관련된 배경에 대한 고려는 각 샘플 및/또는 캘리브레이터 제1 반응 혼합물에 대한 반응 속도의 결정과 관련된 복수의 신호 측정치 각각에서 배경을 빼는 것을 포함할 수 있다. 유사하게, 샘플 및/또는 캘리브레이터 제2 반응 혼합물과 관련된 배경에 대한 고려는 샘플 제2 반응 혼합물 및/또는 각 캘리브레이터 제2 반응 혼합물에 대한 반응 속도의 결정과 관련된 복수의 신호 측정치 각각에서 배경을 빼는 것을 포함한다.
본 개시 내용의 방법에서, 샘플은 생물학적 샘플, 예컨대 혈청, 혈장, 소변 또는 뇌척수액일 수 있다.
제 56항의 방법에서, 캘리브레이터는, 예를 들어 제거된 혈청 또는 혈장을 포함하는, 혈장 또는 혈청에 희석된 분석물을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 캘리브레이터는 전처리된 샘플일 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 추가 양태에서, 샘플 및/또는 캘리브레이터 제2 반응 혼합물은 컨쥬게이트를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플 또는 캘리브레이터 제1 반응 혼합물 중 컨쥬게이트는 샘플 또는 캘리브레이터 제2 반응 혼합물 중 컨쥬게이트의 농도보다 약 5 내지 약 150배 더 많게 존재할 수 있다.
또한 추가로, 본 개시 내용의 방법의 다른 양태에서, 임의의 반응 혼합물은 컨쥬게이트의 효소 이외의 효소에 대한 억제제를 포함할 수 있다. 또한, 임의의 반응 혼합물은 전자 매개체 및 염료를 추가로 포함할 수 있고, 매개체는 기질로부터 전자를 받아 이를 염료로 이동시킨다.
또한 다른 양태에서, 본 개시 내용은 동물에서 만성 신장병을 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 동물로부터의 생물학적 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 본 개시 내용의 방법에 따라 결정하고, 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양에 기반하여 동물에서 만성 신장병을 결정하는 것을 포함한다.
도 1은 정상 집단 및 만성 신장병(CKD)으로 고통받는 환자로부터의 인간 혈청 샘플에 대한 본 개시 내용의 검정 결과를 도시한다.
도 2는 G6PDH를 활성화시키기 위해 SIA를 이용하여 SDMA를 G6PDH에 컨쥬게이션시키는 절차의 개략도를 도시한다.
도 3은 G6PDH를 활성화시키기 위해 SBAP를 이용하여 SDMA를 G6PDH에 컨쥬게이션시키는 절차의 개략도를 도시한다.
도 4는 G6PDH를 활성화시키기 위해 SMCC를 이용하여 SDMA를 G6PDH에 컨쥬게이션시키는 절차의 개략도를 도시한다.
도 5는 염료를 감소시키고 염료의 흡광도를 이동시키기 위해 매개체가 전자를 염료로 통과시키는 매개체-염료 반응 메커니즘의 개략도이다.
도 6은 인간 혈청에 스파이킹되고 본 개시 내용의 방법에 따라 분석된 SDMA에 대한 캘리브레이션 곡선을 도시한다.
도 7은 인간 혈청에 스파이킹되고 본 개시 내용의 고정 계산 방법(fixed calculation method) 및 속도 계산 방법(rate calculation method)에 따라 분석된 SDMA에 대한 캘리브레이션 곡선을 도시한다.
도 8은 배경 신호를 빼지 않고 본 개시 내용에 따라 수행된 공지된 농도의 SDMA에 대한 검정 결과를 도시한다.
도 9, 10 및 11은 개(도 9), 고양이(도 10), 및 말(도 11) 제거된 혈청 캘리브레이터를 이용한 본 개시 내용에 따른 SDMA 검정 결과를 도시한다.
도 12는 완충제-기반 캘리브레이터를 이용한 본 개시 내용에 따른 SDMA 검정 결과를 도시한다.
설명
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 다수의 용어가 정의될 것이다. 본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
SDMA는 대칭적인 디메틸아르기닌이다. SDMA의 구조는 다음과 같다:
Figure 112017090328947-pct00002
.
SDMA의 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드에 존재할 수 있지만, "유리 SDMA"는 SDMA의 염을 포함하는, 폴리펩티드 사슬의 일부가 아닌 SDMA를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 일반적으로 수용체에 대해 분석물과 경쟁할 수 있는 분석물의 변형된 형태를 의미하고, 그 변형은 분석물을 또 다른 모이어티, 예컨대 라벨 또는 고체 지지체에 연결시키는 수단을 제공한다. 분석물 유사체는 분석물과 유사한 방식으로 항체에 결합할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 일반적으로 항원에의 노출에 반응하여 B 림프구 세포에 의해 생산되고 그 항원에 특이적으로 결합하는 당단백질을 의미한다. 용어 "항체"는 이의 가장 넓은 의미로 사용되며 구체적으로 이들이 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 모노클로날 항체(전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 "항-SDMA 항체," "항-SDMA 항체 부분" 또는 "항-SDMA 항체 단편" 및/또는 "항-SDMA 항체 변이체" 등은 비제한적으로 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 하나의 상보성 결정 영역(CDR), 프레임워크 영역, 또는 이의 임의의 일부와 같은, 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 이의 항원 결합 또는 가변 도메인을 의미한다. 구체적으로, 예를 들어, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아보디(diabodies); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터의 다중특이적 항체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항원"은 일반적으로, 적절한 조건 하에, 항원에 특이적인 항체와 반응할 수 있는 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "분석물"은 일반적으로 검출되고/거나 측정되는 샘플 중 물질, 또는 물질의 세트를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 일반적으로 인간 또는 동물로부터의 조직 또는 유체 샘플을 의미하고, 비제한적으로 전혈, 혈장, 혈청, 척수액, 예컨대 뇌척수액; 림프액, 복강액(복수), 피부의 외부 섹션, 호흡기, 장 및 비뇨생식관, 눈물, 타액, 소변, 혈액 세포, 종양, 기관, 조직, 및 시험관내 세포 배양 성분의 샘플을 포함한다.
본원에서 사용되는 "교차반응성"은 일반적으로 항체의 개별적인 항원 결합 부위가 하나 초과의 항원성 결정인자와 반응하는 능력 또는 항체 분자의 집단이 하나 초과의 항원과 반응하는 능력을 의미한다. 일반적으로, 교차 반응은 (i) 교차 반응하는 항원이 면역 항원과 공통으로 에피토프를 공유하거나 (ii) 이것이 면역 항원 상의 것과 구조적으로 유사한 에피토프를 갖기 때문에(다중특이성) 일어난다.
본원에서 사용되는 용어 "라벨"은 분석물 유사체, 예컨대 SDMA 유사체에 직접 또는 간접적으로(예컨대, 공유 또는 비공유 수단을 통해, 단독으로 또는 캡슐화) 컨쥬게이션될 수 있는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 예를 들어, 효소 라벨은 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매화할 수 있다. 본 개시 내용에 이용된 효소는 비제한적으로 알칼리 포스파타제(AP); 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소("G6PDH"); 베타 갈락토시다제(B GAL); 및 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 말레이트 탈수소효소(MDH)일 수 있었다. 본원에서 "G6PDH" 또는 "글루코스-6-포스페이트 탈수소효소"와 같은 효소의 임의의 설명은 또한 변이체, 아이소형 및 효소의 돌연변이체, 예를 들어 전문이 본원에 참조로서 포함된 US 6,455,288호에 기재된 아미노산 치환을 갖는 G6PDH를 포함한다. 라벨의 활용은 전자기 방사선의 검출 또는 직접적인 시각화와 같은 수단에 의해 검출될 수 있고, 임의로 측정될 수 있는 신호를 생성한다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 일반적으로 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 의미하고, 즉, 개별 항체 포함 집단은 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원성 부위에 대해 유도된다. 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제조물과 달리, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 에피토프에 대해 유도된다. 수식어 "모노클로날"은 단순히 항체의 특징을 나타내는 것이며 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 구체적으로, 예를 들어, 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있거나, 파지 항체 라이브러리로부터 공지된 기술을 이용하여 분리될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산의 서열을 갖는 분자를 의미한다. 이 용어는 단백질, 융합 단백질, 올리고펩티드, 사이클릭 펩티드, 및 폴리펩티드 유도체를 포함한다. 항체 및 항체 유도체는 상기에서 별도의 섹션에서 논의되었지만, 항체 및 항체 유도체는 본 발명의 목적상 폴리펩티드 및 폴리펩티드 유도체의 하위부류로서 취급된다.
"수용체"는 분자의 특정 공간 및 극성 조직, 예컨대 에피토프 또는 결정인자 부위를 인지할 수 있는 임의의 화합물 또는 조성물을 의미한다. 예시적인 수용체는 항체, Fab 단편 등을 포함한다.
"결합 특이성" 또는 "특이적 결합"은 제1 분자의 제2 분자, 예를 들어 분석물, 예컨대 SDMA, 및 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 또는 분석물에 특이적인 항체 단편(예컨대, Fv, 단일쇄 Fv, Fab', 또는 F(ab)2 단편)에 대한 실질적인 인지를 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 "특이성"은 일반적으로 개별 항체 결합 부위가 단 하나의 항원성 결정인자와 반응하는 능력 또는 항체 분자의 집단이 단 하나의 항원과 반응하는 능력을 의미한다. 일반적으로, 분석물-항체 반응에는 고도의 특이성이 존재한다. 항체는 (i) 분석물의 1차 구조, (ii) 분석물의 이성질체 형태, 및 (iii) 적용가능한 경우, 분석물의 2차 및 3차 구조에서의 차이를 구별할 수 있다. 높은 특이성을 나타내는 항체-분석물 반응은 낮은 교차반응성을 나타낸다.
"실질적인 결합" 또는 "실질적으로 결합한다"는 특정 검정 조건 하에 검정 혼합물의 분자들 간의 특이적 결합 또는 인지 정도를 의미한다. 이의 가장 넓은 양태에서, 실질적인 결합은 제1 분자가 제2 분자에 결합하거나 이를 인지하는 능력이 없고, 제1 분자가 제3 분자에 결합하거나 이를 인지할 수 있는 능력이 있는 것 사이의 차이에 관한 것이고, 이에 의해 그 차이는 분자의 상대적 농도 및 인큐베이션의 시간 및 온도를 포함하는 특정 세트의 검정 조건 하에 특이적 결합을 구별하는 의미있는 검정이 수행되도록 하기에 충분하다. 또 다른 양태에서, 한 분자는 교차반응성 의미에서 실질적으로 또 다른 분자에 결합하거나 이를 인지할 수 없고 이 때 제1 분자는 특정 세트의 검정 조건 하에 제3 분자에 대해 나타낸 반응성의 25% 미만, 예를 들어 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 반응성을 제2 분자에 대해 나타낸다. 특이적 결합은 면역조직화학 검정, 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA), 또는 웨스턴 블롯 검정과 같은 널리 공지된 다수의 방법을 이용하여 시험될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "염"은 화합물의 산 및 염기성 작용기 사이에 형성된 염을 의미한다. 예시적인 염은 비제한적으로 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루카로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함한다. 용어 "염"은 또한 산성 작용기, 예컨대 카르복실산 작용기를 갖는 화합물, 및 무기 또는 유기 염기 사이에 형성된 염을 의미한다. 적합한 염기는 비제한적으로 알칼리 금속, 예컨대 소듐, 포타슘, 및 리튬의 하이드록사이드; 알칼리 토금속, 예컨대 칼슘 및 마그네슘의 하이드록사이드; 다른 금속, 예컨대 알루미늄 및 아연의 하이드록사이드; 암모니아, 및 유기 아민, 예컨대 비치환되거나 하이드록시-치환된 모노-, 디-, 또는 트리알킬아민; 디사이클로헥실아민; 트리부틸 아민; 피리딘; N-메틸, N-에틸아민; 디에틸아민; 트리에틸아민; 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-하이드록시-저급 알킬 아민), 예컨대 모노-, 비스-, 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민, 2-하이드록시-3차-부틸아민, 또는 트리스-(하이드록시메틸)메틸아민, N,N,-디-저급 알킬-N-(하이드록시 저급 알킬)-아민, 예컨대 N,N,-디메틸-N-(2-하이드록시에틸)아민, 또는 트리-(2-하이드록시에틸)아민; N-메틸-D-글루카민; 및 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신 등을 포함한다.
이제 본 개시 내용으로 돌아가서, 일반적으로, 본 개시 내용은 분석물 이외의 샘플 및 시약 구성요소와 관련된 배경 신호를 처리하는 방식으로 샘플 중 분석물의 면역검출을 지시한다. 예를 들어, 분석물 이외의 샘플 구성요소는 서로 반응하거나 검정을 위한 시약의 구성요소와 반응할 수 있다. 그러한 반응은 검출 방법의 정확성을 방해할 수 있다. 생물학적 샘플은 검정에서 배경 노이즈를 생성할 수 있는 많은 구성요소를 포함하는 것으로 유명하다.
샘플은 EMIT®(Enzyme Multiplied Immunoassay Technique) 동종 면역검정 시스템에 기반하여 변형된 검정을 이용하여 분석될 수 있다. 전통적인 EMIT® 검정에서, 분석물을 함유하는 샘플을 항-분석물 항체, 분석물 및 효소의 컨쥬게이트, 및 효소와 접촉시 신호를 생성하는 기질과 접촉시킨다. 컨쥬게이트에 대한 항체의 결합은 효소 활성을 억제하거나 감소시킨다. 분석물이 샘플에 존재할 때, 샘플 분석물은 항체와의 결합에 대해 컨쥬게이션된 분석물과 경쟁하고, 이는 효소/기질로부터 더 많은 신호의 생성을 발생시킨다. 분석물이 존재하지 않을 때, 항체와 컨쥬게이트 사이에 더 많은 결합이 발생하여 신호 생성을 제한하거나 방지할 수 있다. 따라서, 분석물이 더 많이 존재할 때 더 많은 신호가 생성된다. 운동 검정은 샘플 중 분석물의 존재 또는 양의 지표로서 신호 생성 속도를 이용할 수 있다.
본 개시 내용의 한 양태에서, 전통적인 EMIT® 검정 포맷은 분석물 및 캘리브레이터 둘 모두에 대한 제1 반응 순서로 수행된다. 편의상, 이 제1 반응 순서는 본원에서 "컬러 검정(Color Assay)"으로서 확인될 수 있다. 그 후, 본 개시 내용의 변형된 검정에서, 제2 및 별도 검정이 샘플 및 캘리브레이터에 대한 제2 반응 순서로 수행된다. 편의상, 제2 반응 순서는 본원에서 "블랭크 검정(Blank Assay)"으로서 확인될 수 있다. 블랭크 검정의 시약은 항-분석물 항체를 함유하지 않고 전형적으로 컨쥬게이트를 함유하지 않는다. 따라서, 블랭크 검정은 샘플-의존성 배경 신호를 제공한다.
다양한 양태에서, 본 개시 내용은 분석물의 농도를 결정하기 위해 두 예시적인 방법에서 신호의 사용에 관한 것이다. 편의상, 예시적인 방법은 본원에서 "속도(Rate)" 방법 및 "고정(Fixed)" 방법으로서 언급된다. 두 방법 모두에서, 컬러 및 블랭크 검정에서 신호 또는 신호들의 양 사이의 차이가 이용된다. 한 양태에서, 신호는 당 분야에 널리 공지된 대로 효소/기질 시스템에 특이적인 파장에서의 흡광도로서 측정된다. 예를 들어, G6PDH/NAD 효소/기질 시스템의 경우 340 nm에서 흡광도의 측정은 G6PDH의 존재 하에 NAD에서 NADH로 전환되는 상대적인 양에 대한 값을 제공할 것이다. 상기 값을 이용하여 효소에 의한 기질의 전환을 반영하는 순 신호(고정 방법의 경우) 또는 반응 속도(속도 방법의 경우)를 제공할 수 있다. 대안적으로, 효소 기질 반응은 기질의 파장과 상이한 파장에서의 반응 속도의 측정을 가능하게 할 기질 및 다양한 전자 억셉터(예컨대, 염료) 사이의 전자 이동을 매개하는 전자 담체와 함께 이용될 수 있다.
고정 방법에서, 순 신호가 계산된다. 한 구체예에서, 순 신호는 모든 기질의 고갈에 의한 반응 완료일 수 있거나 아닐 수 있는 소정의 종말점에서 컬러 및 블랭크 검정 사이의 신호(예컨대, 흡광도)의 차이에 기반한다. 이는 다. 블랭크 및 컬러 검정의 종말점에서 측정된 신호의 차이의 양은 순 신호(예컨대, 순 신호 = [컬러 신호의 양] - [블랭크 신호의 양])를 제공하는데 이용될 수 있다. 대안적으로, 소정의 출발점(T1)(이는 모든 시약의 조합 완료시 또는 그 이후의 다른 소정의 시간일 수 있음) 및 소정의 종말점(T2) 사이의 신호의 양에서의 차이는 컬러 및 블랭크 검정 둘 모두에 대해 결정될 수 있다. 그 후 이들 결정으로부터의 신호의 양에서의 차이를 이용하여 순 신호를 결정할 수 있다(예컨대, 순 신호 = ([T2 컬러] - [T1 컬러]) - ([T2 블랭크] - [T1 블랭크)). 순 신호를 캘리브레이션 곡선과 비교하여 샘플 중 분석물의 양을 결정할 수 있다.
순 신호(net single)가 각 컬러 및 블랭크 검정으로부터의 단일 측정에 기반하여 계산될 때, 측정은 시약이 반응하기에 충분한 시간이 지난 후에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 각 검정에서의 단일 측정은 모든 시약을 조합시킨지 약 30초 내지 약 10분 후에 이루어질 수 있다. 보다 특히, 단일 측정은 모든 시약의 조합 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450, 480, 510, 540, 570 및 600초 중 하나에서 이루어질 수 있다. 각 블랭크 및 컬러 검정에서 2개의 신호가 측정될 때, 제1 측정(T1)은 검정 시작(샘플 및 모든 시약의 조합)으로부터 약 15초 내지 2분 후에 이루어진다. 이 시간은 시약의 농도 및 샘플의 예상 농도에 기반하여 조정될 수 있다. 특히, T1은 모든 시약을 조합시킨지 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 또는 120초 후일 수 있다. 제2 측정 (T2)은 T1의 15초 내지 수 분 후에 이루어질 수 있다. 예를 들어, T2는, 예를 들어, 제1 측정(T1)의 15초, 18초, 30초, 45초, 또는 1, 2, 3, 4, 또는 5분 후일 수 있다.
속도 방법에서, 규정된 간격으로 컬러 검정의 신호로부터 블랭크 검정으로부터의 신호를 빼서 반응 속도를 제공한다. 캘리브레이터의 반응 속도를 이용하여 캘리브레이션 곡선을 제공하며, 이를 이용하여 샘플에 대한 검정의 반응 속도에 대한 곡선을 캘리브레이션 곡선과 비교함에 의해 샘플 중 분석물의 양을 결정할 수 있다.
속도 방법에서, 반응 속도는 효소 매개된 반응 동안 복수의 시점에서의 신호(예컨대, 흡광도)를 측정함에 의해 결정될 수 있다. 신호 측정의 시간 및 간격의 결정은 시약의 농도 및 검정 온도를 고려할 때 당 분야의 기술범위 내에 있다. 예를 들어, 속도는 샘플(또는 캘리브레이터) 및 모든 시약을 실온에서 조합시킨지 약 2-10분 후부터 시작하여 추가 1-15분 동안 5-60초마다 측정하면서 흡광도를 측정함에 의해 결정될 수 있다. 반응 속도는 시간 경과에 따른 흡광도의 변화로서 표시될 수 있다. 예를 들어, 흡광도는 샘플(또는 캘리브레이터) 및 모든 시약을 조합시킨지 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10분 후에 시작하여 측정될 수 있다. 흡광도는 전형적으로 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15분 동안 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60초의 간격으로 측정된다. 이 각각의 시간은 반응 조건, 분석물, 및 시약에 따라 연장되거나 단축될 수 있다.
어느 하나의 고정 또는 속도 방법에서, 샘플 제1 반응 혼합물로부터의 배경은 표준화된 신호를 제공하기 위해 순 신호 또는 반응 속도의 계산에 고려될 수 있다. 한 구체예에서, 배경 흡광도는 샘플 대신에 사용된 캘리브레이터 매트릭스로부터 측정된다. 캘리브레이터 매트릭스의 흡광도는 초기에 모든 시약과 매트릭스의 조합시, 또는 그 후에 한정된 시간에 측정된다. 캘리브레이터 매트릭스는 임의의 분석물이 결여된 캘리브레이터 또는 대조 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 분석물이 결여된 캘리브레이터 매트릭스는 본원에서 추가로 기재된 다른 전처리 공정에 의해 또는 투석에 의해 분석물이 제거된 샘플일 수 있다. 한 구체예에서, 제거되거나 내인성 종 특이적 또는 비특이적 혈청, 혈장, 또는 다른 생물학적 유체가 캘리브레이터 매트릭스로서 이용될 수 있다. 본원에 추가로 기재된 다른 구체예에서, 캘리브레이터 매트릭스는 단백질 및/또는 다른 조성물(예컨대, PBS 중 BSA)을 함유하는 물 또는 희석제일 수 있다. 캘리브레이터 매트릭스는 컬러 검정 및 블랭크 검정 둘 모두에 대한 배경 신호를 제공하기 위해 두 검정 모두에서 샘플 대신 이용된다.
배경이 결정되었으면, 그 후 배경을 고정 방법에서 순 신호(또는 T1 및 T2에서의 측정치)에서 빼거나 속도 방법에서 샘플 반응 속도를 결정하기 위해 이용되는 각 측정치에서 뺀다. 예로서, 속도 방법에서, 캘리브레이터 매트릭스(시약 지님)의 흡광도를 샘플에 대한 반응 속도를 결정하기 위해 이용된 각 흡광도 측정치(즉, 시간 경과에 따른 흡광도의 변화)로부터 뺀다. 또 다른 양태에서, 배경율은 샘플 반응 속도와 유사한 방식으로 결정된다. 그 후 배경율을 샘플 반응 속도에서 빼서 제1 샘플 반응 혼합물에 대한 표준화된 반응 속도를 제공한다.
따라서, 본 개시 내용은 분석물에 대한 검정을 수행하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 샘플, 항-분석물 항체, 분석물 및 효소를 포함하는 컨쥬게이트, 및 효소와 접촉시 신호를 생성하는 기질을 포함하는 샘플 제1 반응 혼합물을 형성함에 의해 샘플에 대한 컬러 검정을 수행하는 단계를 포함한다(샘플 제1 반응 순서). 전형적으로, 샘플 제1 반응 혼합물은 먼저 샘플을 항체 및 기질과 접촉시킨 다음, 제2 단계에서 컨쥬게이트를 첨가함에 의해 형성된다. 그러나, 샘플은 먼저 항체 및 컨쥬게이트와 조합될 수 있고, 제2 단계에서 기질이 첨가될 수 있다. 한 양태에서, 효소 및 컨쥬게이트는 반응 순서가 시작할 준비가 될 때까지 분리된 채로 유지된다. 본원에서 사용되는 "접촉시키는"은 이의 가장 넓은 양태에서 본원에서 달리 명시되지 않는 한 시약들을 임의의 순서로 조합시키는 것을 나타내기 위해 이용된다. 샘플 제1 반응 혼합물이 형성되었으면, 신호의 양은 본 개시 내용의 고정 또는 속도 방법에서의 사용을 위해 즉시 또는 그 이후 하나 이상의 소정 시간에 혼합물로부터 측정될 수 있다.
본 개시 내용의 변형된 고정 및 속도 방법에서, 별도의 검정 순서(샘플 제2 반응 순서 또는 "블랭크 검정")는 샘플 제1 반응 순서와 유사한 방식으로 수행된다. 그러나, 샘플 제2 반응 순서의 시약은 항-분석물 항체를 함유하지 않는다. 전형적으로, 블랭크 검정의 시약은 컨쥬게이트를 함유하지 않지만, 소량의 컨쥬게이트 또는 효소가 첨가된 구체예가 본원에 기재된다. 특히, 샘플 제2 반응 혼합물은 샘플을 기질 및, 일부 경우에, 항-분석물 항체가 없는 컨쥬게이트와 접촉시킴에 의해 형성된다. 신호는 샘플 제2 반응 혼합물로부터 측정된다. 캘리브레이터 매트릭스로부터의 배경을 이용한 순 신호 또는 반응 속도는 샘플 제1 반응 순서와 동일한 방식으로 결정되어 샘플 제2 반응 순서에 대한 표준화된 순 신호 또는 표준화된 반응 속도를 제공한다.
속도 방법에서, 샘플에 대한 최종 반응 속도를 제공하기 위해, 샘플 제2 반응 순서의 표준화된 속도를 샘플 제1 반응 순서의 표준화된 반응 속도에서 뺀다. 최종 반응 속도를 이용하여 샘플 중 분석물의 존재 또는 양을 결정할 수 있다. 전형적으로, 이는 샘플에 대한 최종 반응 속도를 당 분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있는 표준 곡선과 비교함에 의해 수행된다.
캘리브레이터에 대한 컬러 및 블랭크 검정은 샘플에 대한 컬러 및 블랭크 검정과 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 일련의 캘리브레이터 제1 반응 순서(컬러 검정)는 공지된 양의 분석물을 포함하는 캘리브레이터 세트의 각 캘리브레이터를 항-분석물 항체, 분석물 및 효소를 포함하는 컨쥬게이트, 및 효소와 접촉시 신호를 생성하는 기질과 개별적으로 접촉시킴에 의해 캘리브레이터 제1 반응 혼합물을 형성함으로써 수행된다. 신호는 캘리브레이터 제1 반응 혼합물 및 표준화된 순 신호(고정 방법) 각각으로부터 측정되거나 캘리브레이터 제1 반응 혼합물 각각에 대한 표준화된 반응 속도(속도 방법)는 샘플 제1 반응 혼합물에 대해 상기 기재된 방식으로 캘리브레이터 제1 반응 혼합물 각각과 관련된 배경을 고려하여 생성된다. 캘리브레이터 중 하나는 배경을 결정하기 위해 이용되는 캘리브레이터 매트릭스(분석물을 함유하지 않음)일 수 있다.
별도의 반응 시리즈에서(블랭크 검정), 캘리브레이터 제2 반응 순서는 캘리브레이터 세트의 각 캘리브레이터를 항-분석물 항체 및, 전형적으로, 컨쥬게이트의 부재 하에 기질과 접촉시킴에 의해 캘리브레이터 제2 반응 혼합물을 형성함으로써 수행된다. 일부 경우에, 컨쥬게이트는 또한 본원에 추가로 기재된 대로 일반적으로 소량으로 존재할 수 있다. 신호는 캘리브레이터 제2 반응 혼합물 각각에 대해 측정되고, 각 혼합물에 대한 순 신호 또는 반응 속도는 상기 기재된 방식으로 캘리브레이터 제2 반응 혼합물과 관련된 배경을 고려하여 표준화된다.
따라서, 고정 방법에서 배경 신호를 고려하여, 블랭크 검정으로부터의 표준화된 순 신호를 컬러 검정으로부터의 표준화된 순 신호에서 뺀다. 속도 방법에서, 각 캘리브레이터에 대한 최종 반응 속도는 캘리브레이터 제1 반응 순서에서 각 캘리브레이터에 대한 표준화된 속도로부터 캘리브레이터 제2 반응 순서에서 캘리브레이터로부터의 표준화된 속도를 뺌으로써 결정된다. 그 후 각 캘리브레이터에 대한 최종 반응 속도에 기반하여 표준화된 표준 곡선을 만들고, 이를 이용하여 샘플에 대한 표준화된 반응 속도를 표준화된 표준 곡선과 비교함에 의해 샘플 중 분석물의 양을 결정할 수 있다.
한 구체예에서, 컬러 검정 및 블랭크 검정과 관련된 시약은 표 1에 제시되어 있다. 시약은 적절한 희석제 및/또는 완충제에서 조합된다. 표 1에 제시된 대로, 블랭크 검정 시약 2(R2)는 컨쥬게이트를 함유하지 않지만, 이것은 반응이 적절한 부피의 완충제를 갖도록 보장하기 본원에 추가로 기재된 바와 같이 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 블랭크 검정 R1은 블랭크 검정 R2가 사용되지 않는 경우 여분의 부피를 가질 수 있다. 한 구체예에서, 컬러 검정을 위한 시약은 항체 및 컨쥬게이트의 존재 또는 부재를 제외하고는 블랭크 검정을 위한 시약과 동일하다. R2가 블랭크 검정에서 임의의 컨쥬게이트를 함유하지 않을 때, 이것은 여전히 희석제, 완충제 및 컬러 검정을 위한 R2의 다른 구성요소를 함유한다.
표 1
Figure 112017090328947-pct00003
일부 구체예에서, 블랭크 검정 R1은 또한 항-분석물 항체를 함유할 수 있다.
컬러 검정에서 캘리브레이터 및 시험 샘플은 일반적으로 반응 혼합물에 첨가되는 분석물-효소 컨쥬게이트에 기인한 흡광도의 증가를 가져올 것으로 예상될 수 있다. 많은 샘플은 또한 블랭크 검정에서 시험될 때 양성 반응을 일으키는데, 그 이유는 내인성 기질 또는 R1의 기질과 반응성인 내인성 효소가 심지어 컨쥬게이트가 존재하지 않아도 흡광도의 증가를 가져올 것이기 때문이다. 그러나, 종종, 샘플 및 캘리브레이터는 블랭크 검정에서 시험될 때 반응 혼합물이 흡광도를 거의 내지 전혀 변화시키지 않도록 일반적으로 작은 배경 신호가 추가로 약화되는 정도까지 희석된다. 흡광도의 변화가 검출기의 민감성 범위 아래로 떨어질 수 있기 때문에, 자동화 분석기 상에서 캘리브레이션 곡선 실패로 이어질 수 있다.
이러한 문제를 피하기 위해, 흡광도에서의 작은 양성 변화가 생기지 않도록 보장하면서(캘리브레이터 또는 샘플 거동에도 불구하고) 효소 또는 분석물-효소 컨쥬게이트가 블랭크 검정에 첨가될 수 있다. 따라서, 표 2는 이 구체예에 존재하는 시약을 제시한다.
표 2
Figure 112017090328947-pct00004
R2에서 효소 또는 컨쥬게이트의 농도는 전형적으로 캘리브레이터 매트릭스에 대한 검정에서 불필요한 노이즈를 방지하도록 낮게 유지된다. 예를 들어, 효소가 G6PDH일 때, 약 1-15 ng/mL의 효소(컨쥬게이션되거나 컨쥬게이션되지 않음)가 블랭크 검정에 첨가될 수 있다. 특히, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 ng/ml가 첨가될 수 있다. 더 큰 분석물은 동일한 양의 효소를 제공하기 위해 더 많은 양의 컨쥬게이트를 필요로 할 것이므로, R2에서 컨쥬게이트의 양은 분석물의 크기에 의존적이다. 한 구체예에서, 컬러 검정을 위한 R2에서의 효소(단독이거나 컨쥬게이션됨) 농도는 블랭크 검정을 위한 R2에서의 효소 농도보다 약 10 내지 약 150배 더 높다. 다양한 구체예에서, 컬러 검정에서 컨쥬게이트의 농도는 블랭크 검정을 위한 시약에서의 효소의 농도보다 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 및 150배 더 높다. 컨쥬게이션된 경우, 효소의 활성은 컨쥬게이션되지 않은 효소의 활성보다 전형적으로 더 낮다. 예를 들어, 컨쥬게이션된 효소의 활성은 컨쥬게이션되지 않은 효소의 활성과 크게 다르며, 예를 들어 컨쥬게이트 효소의 활성은 컨쥬게이션되지 않은 효소의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다. 따라서, 블랭크 검정을 위한 R2에 컨쥬게이션되지 않은 효소가 이용될 때, 이것은 컨쥬게이트였을 때보다 소량으로 사용될 수 있고 여전히 컨쥬게이션된 효소와 동일한 활성을 제공할 수 있다.
기질, 또는 효소가 하나 초과의 기질을 지닐 때 기질들은 시약에 과량으로 존재할 수 있다.
일부 양태에서, 검정 시약은 검정 시약의 안정화제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 신호 생성 효소가 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)일 때, 글루코스-6-포스페이트(G6P), 또는 NAD는 효소-분석물 컨쥬게이트를 안정화하기 위해 컨쥬게이트 함유 시약에 첨가될 수 있다.
혈청은 배경의 원인이 될 수 있는 여러 효소를 함유한다. 따라서, 시약 희석제에 특이적 효소 억제제의 첨가는 검정 정확성을 더욱 개선시킬 수 있다. 억제제는 컬러 및 블랭크 검정에서 간섭 노이즈의 일부를 제거하는데 도움이 된다. 따라서, 다양한 양태에서, 반응 구성요소는 내인성 샘플 효소의 억제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 소듐 옥사메이트는 NAD 및/또는 NADP의 효소인 락테이트 탈수소효소(LDH)의 공지된 억제제이다. 소듐 옥사메이트는 LDH가 샘플의 NAD 또는 검정과 관련된 효소-기질 시스템의 일부(예컨대, G6PDH/NAD)일 수 있는 NAD를 턴오버시키는 것을 방지함으로써 내인성 샘플 LDH와 관련된 배경 신호를 방지한다. 30개가 넘는 혈청 효소 및 효소 억제제 조합물이 알려져 있고 억제제는 이들 중 다수에 이용가능하다.
한 양태에서, 캘리브레이터는 샘플 대신 사용되는 캘리브레이션 매트릭스를 제공하기 위해 공지된 양의 분석물(또는 캘리브레이터 매트릭스의 경우 없음)을 탈이온수 또는 염수에 포함한다. 다른 양태에서, 제거된 혈청이 물 또는 염수 대신 사용된다. 투석된 혈청은, 예를 들어, 투석 과정에서 분석물을 제거한 천연의 종 특이적 또는 비특이적 혈청 또는 혈장이다. 수많은 다른 샘플 전처리 공정이 분석물을 제거하거나 불활성화시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 각 구체예에서, 용액을 공지된 양의 분석물로 스파이킹하여 샘플 중 예상되는 분석물 농도 범위에 걸쳐 일련의 캘리브레이터를 제공한다. 또한 다른 구체예에서, 캘리브레이션 용액은 PBS 중 1-7% BSA와 같은 단백질 기반 용액이다. 이 구체예에서, 제거되고 스파이킹된 혈청 캘리브레이터에 대해 BSA 캘리브레이터를 교정해야 할 수도 있다.
전형적으로, 블랭크 검정은 내인성 단백질, 효소 또는 배경 신호의 원인이 되는 다른 큰 분자 구성요소를 보상하기 위해 의도되었기 때문에, 비록 많은 경우에 생물학적 샘플에 대한 캘리브레이터 용액으로서 물 또는 염수의 사용에 의해 충분한 특이성을 얻을 수 있을지라도, 물 또는 염수는 비-생물학적 샘플에 더욱 적합하다. 또한, 자동화 분석기의 캘리브레이터 매트릭스에 물 또는 염수 완충제를 사용하면 완충제 사용과 관련된 반응 속도가 혈청과 비교하여 유의하게 증가할 수 있기 때문에 캘리브레이터 매트릭스에 대한 오류 메세지를 생성하는 경향이 있을 수 있다. 이러한 상황에서, 캘리브레이션 매트릭스의 흡광도 값을 빼면 음성 속도가 발생할 수 있었다. 이러한 속도는 혈청-기반 캘리브레이터 매트릭스에 대해 표준화될 수 있지만, 자동화 분석기는 이러한 상황에서 전형적으로 오류 메세지를 생성할 것이다.
본 개시 내용의 한 구체예에 따르면, 분석물은 SDMA이고 효소-컨쥬게이트 시스템은 G6PDH/NAD이다. 이 구체예에서, 인간, 고양이 및 개와 같은 동물로부터의 혈청 또는 혈장 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 결정하기 위해 SDMA의 유사체는 G6PDH에 컨쥬게이션되고 컬러 및 블랭크 검정에서 컨쥬게이트로서 이용된다. 이 구체예의 한 양태에서, 캘리브레이터는 공지된 양의 SDMA를 캘리브레이터 매트릭스(제거된 혈청 또는 혈장)와 조합시킴에 의해 제조된다. 컬러 및 블랭크 검정은 표 3에 기재된 예시적인 양의 하기 시약을 이용하여 상기 기재된 대로 수행된다:
표 3
Figure 112017090328947-pct00005
특히, 항-SDMA 항체는 약 4 내지 약 10 μg/mL, 예를 들어, 약 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 μg/mL의 컬러 검정의 R1에서의 농도를 가질 수 있다. 컬러 검정 또는 블랭크 검정의 R1에서, G6P 및 NAD는 약 8-75 mM, 보다 특히 약 10-65 mM, 또는 약 20-55 mM, 및 보다 특히 약 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ,45 50, 55, 60, 65, 70 mM의 농도를 가질 수 있다. 컬러 검정의 R2에서, SDMA-G6PHD 컨쥬게이트는 약 0.25 내지 약 0.75 μg/mL, 보다 특히 약 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.65, 0.70 또는 0.75 μg/mL의 농도를 가질 수 있다. 블랭크 검정의 R2에서, 컨쥬게이트의 농도는 약 5-30 ng/mL, 보다 특히 약 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 ng/mL일 수 있다.
G6P는 효소를 안정화하기 위해 R2 시약에 존재한다. 대안적으로, NAD가 이용될 수 있었다. 기질을 안정화시키는 것은 선택적이다.
시약은 컬러 및 블랭크 검정을 위해 하기 부피의 샘플 및 캘리브레이터와 조합될 수 있으나, 부피는 상이한 분석물 및 반응 조건을 수용하도록 조정될 수 있다:
샘플: 5-20 μL
R1: 20-60 μl
R2: 20-150 μL
한 특정 구체예에서, 반응 혼합물은 10 μl의 샘플, 40 μl의 R1 및 125μL의 R2를 함유한다.
컬러 및 블랭크 검정에서 상기 시약을 이용하여, 캘리브레이션 곡선을 만들고, 이를 이용하여 혈청 또는 혈장 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 결정할 수 있다. 도 1은 Beckman AU680® 임상 화학 분석기에 의해 정상 및 만성 신장병 인간 혈청 샘플에서 SDMA의 결정을 위한 속도 방법을 이용한 결과를 도시한다. 결과는 금-표준 LC-MS 값에 비해 SDMA 농도의 정확한 결정을 보여준다. 인간 혈청(제거되지 않음)은 캘리브레이터 매트릭스로서 이용되었다. 따라서, 본 개시 내용은 인간, 및, 예를 들어, 가정, 농장, 및 동물원 동물을 포함하는 동물에서 만성 신장병을 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 개시 내용의 방법에 따라 동물 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 SDMA 농도를 결정하고, 농도를 표준 곡선 또는 건강한 대상체 및 만성 신장병으로 고통받는 대상체에서 대상체와 동일한 종으로부터의 샘플 중 SDMA의 양을 갖는 다른 모델과 비교하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 본 개시 내용은 샘플 중 분석물의 존재 또는 양을 결정하기 위한 시약을 함유하는 키트에 관한 것이다. 예를 들어, 키트는 컬러 검정을 수행하기 위한 제1 세트의 시약, 예컨대 항-분석물 항체 및 효소에 대한 신호 생성 기질을 포함하는 제1 시약, 및 분석물 및 효소의 컨쥬게이트를 포함하는 제2 시약을 포함할 수 있다. 키트는 또한 기질을 함유하는 제3 시약을 포함하는 제2 세트의 시약을 포함할 수 있다. 제2 세트의 시약은 또한 완충제/희석제, 및 임의로 컨쥬게이트를 함유하는 제4 시약을 포함할 수 있다. 완충제/희석제만을 함유하는 제4 시약의 목적은 제2 세트의 시약과 관련된 반응이 적절한 부피로 수행되도록 보장하는 것이다. 제2 세트의 시약이 제4 시약을 포함하지 않을 때, 제3 시약의 부피는 그에 따라 조정되어야 한다. 또한, 제3 또는 제4 시약은 항-분석물 항체를 함유할 수 있다.
각 시약에서 구성요소의 농도 및 양은 컬러 및 블랭크 검정 각각에서 R1 및 R2에 대해 상기 기재된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, 제1 시약에서 컨쥬게이트의 농도는 제4 시약의 컨쥬게이트의 농도보다 약 5 내지 약 150배 더 높다. 한 양태에서, 키트의 시약 중 적어도 하나는 컨쥬게이트의 효소 이외의 효소에 대한 억제제를 포함한다. 키트는 또한 적절한 희석제, 예컨대 물, 염수, 또는 제거되거나 처리된 혈청 또는 혈장(예컨대, 전처리된 샘플)에 희석된 공지된 양의 분석물을 포함하는 표준 또는 표준의 세트(캘리브레이터)를 포함할 수 있다.
분석물이 SDMA일 때, 예시적인 키트는 제1 시약에 항-SDMA 항체(폴리클로날 또는 모노클로날) 및 기질(들), 예컨대 NAD 및 G6P를 포함한다. 제2 시약은 효소에 대한 안정화제로서 SDMA 유사체 및 G6PDH의 컨쥬게이트를 포함한다. 제3 시약은 SDMA-G6PDH 컨쥬게이트 및, 임의로 제4 시약을 포함한다. 제4 시약은 희석제 또는 완충제만을 함유하거나, 컨쥬게이트를 함유할 수 있다.
키트에 추가하여, 본 개시 내용은 키트로부터의 시약 및 SDMA를 함유할 것으로 의심되는 샘플을 포함하는 반응 혼합물에 관한 것이다. 예를 들어, 반응 혼합물은 샘플 또는 캘리브레이터, 항-SDMA 항체, SDMA-G6PDH 컨쥬게이트, NAD, 및 G6P를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 각 키트, 방법 및 반응 혼합물에서, 다수의 효소/기질 시스템이 G6PDH/NAD 대신 이용될 수 있다. 다른 예로서, 말레이트 탈수소효소는 G6PDH와 유사한 NAD+에서 NADH로의 환원을 이용하여 말레이트에서 옥살로아세테이트로의 산화를 촉매화하는 효소이다. 또한, 효소의 신호 또는 안정성을 향상시키는 많은 효소 돌연변이체가 알려져 있다. 예컨대, 미국 특허 6,455,288호를 참조하라.
분석물-효소 컨쥬게이트는 다양한 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이용되는 방법 및 시약의 선택은 분석물 및 효소 사이에 다양한 길이의 링커를 제공할 수 있다. 링커 길이는 효소 활성을 억제하고 이에 따라 검정 민감도에 영향을 주기 위해 항체의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 전형적으로, 약 5-15개 원자, 또는 2-20 옹스트롬의 링커가 이용될 수 있다. 분석물에 대한 효소의 컨쥬게이션은 본 개시 내용에 따라 검출될 수 있는 많은 분석물에 대해 당 분야의 기술범위 내에 있다.
예를 들어, 도 2는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)에 대한 화학식 1(하기)의 SDMA 유사체의 컨쥬게이션을 도시한다. G6PDH는 컨쥬게이션 전에 석신이미딜 아이오도아세테이트(SIA)로 활성화된다. SIA에 의한 활성화는 SDMA와 효소 사이에 5개 원자 링커를 발생시키고(-C-C-S-C-C(O)-), 이는 SDMA의 유도체화 동안 산소를 질소로 대체하여 생기는 비천연 질소를 SDMA 상에 포함하지 않는다.
도 3은 9개 원자 링커(비천연 질소는 세지 않음)(-C-C-S-C-C(O)-C-N-C-C(O)-)를 발생시키는 석신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트(SBPA)를 이용한 G6PDH로의 화학식 1의 SDMA 유사체의 컨쥬게이션을 도시한다.
도 4는 12개 원자 링커를 발생시키는 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)를 이용한 G6PDH로의 화학식 1의 SDMA 유사체의 컨쥬게이션을 도시한다.
링커 길이는 G6PDH를 다른 시약으로 변형시키거나 다른 SDMA 유사체를 컨쥬게이션 반응에 이용함에 의해 조정되어, 예를 들어, 약 5 내지 약 15개 원자, 특히 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 원자의 링커 길이를 제공할 수 있다. 따라서, 본 개시 내용은 SDMA와 효소 사이의 최단 경로의 일부가 아닌 링커 분자의 측쇄, 치환기, 또는 고리의 임의의 원자를 제외하고 최단 경로를 통해 링커의 사슬에 직접 있는 원자만을 포함하는 5-15개 원자의 링커를 통한 SDMA와 효소의 컨쥬게이트에 관한 것이다.
링커 길이는 약 2 옹스트롬 내지 약 20 옹스트롬, 특히 약 5 내지 약 15 옹스트롬, 보다 특히 약 6-10 옹스트롬의 범위일 수 있다.
한 구체예에서, SDMA는 G6PDH 기질 글루코스-6-포스페이트(G6P) 및/또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)의 존재 하에 G6PDH에 컨쥬게이션된다. 최적 컨쥬게이트-효소 활성 및 항체에 의한 그 활성의 억제는 효소, 기질 및 SDMA의 비를 조정함에 의해 수득될 수 있다.
G6PDH에 컨쥬게이션하기 적절한 SDMA의 여러 유사체는 전문이 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 8,481,690호에 기재되어 있다. SDMA와 G6PDH 사이의 링커의 요망되는 길이에 따라, 하기 유사체 중 하나가 이용될 수 있다:
Figure 112017090328947-pct00006
상기 식에서, x 및 y는 1 내지 5 범위의 정수이다.
화학식 A, B 및 C는 적절한 "티올-반응성 부위", 즉, 티올기와 반응할 부위를 포함하는 컨쥬게이션 표적과 반응할 수 있는 이용가능한 티올을 제공한다. 예를 들어, 말레이미드, 알킬 및 아릴 할라이드, 및 알파-할로아실은 티올과 반응하여 티오-에테르를 형성할 수 있는 예시적인 티올-반응성 부위이다. 유사하게, 피리딜 디설파이드는 티올과 반응하여 혼합된 디설파이드를 형성할 수 있다. SIA, SBAP, 또는 SMCC로 활성화된 G6PDH는 적절한 티올 반응성 부위를 제공한다. X=1일 때, 화학식 A와 SIA-활성화된 G6PDH의 컨쥬게이션은 SDMA와 G6PDH 사이에 5개 원자 링커를 제공한다. 화학식 A(X=1)와 SMCC의 컨쥬게이션은 12개 원자 링커를 발생시킨다. X를 변경하여 다른 링커 길이를 수득할 수 있다.
X=1인 한 특정 구체예에서, SDMA 유사체는 하기 화학식(화학식 1)을 갖는다:
Figure 112017090328947-pct00007
화학식 1은 하기 예시적인 합성 도식 (1)에 의해 SDMA(Gibbstown, NJ의 EMD Chemicals Inc.로부터 시판됨)로부터 제조될 수 있다:
도식 1:
Figure 112017090328947-pct00008
SDMA의 1차 및 2차 아미노기는 SDMA를 디-3차-부틸디카르보네이트(Boc2O)와 반응시킴에 의해 보호된다. 그 후 생성된 3차-부톡시카르보닐(BOC) 보호된 SDMA((Boc3)-SDMA, 1)를 수지에 결합시킨다. 예를 들어, (Boc3)-SDMA (1)을 디메틸 포름아미드(DMF) 중 2-(1H-7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우라늄 헥사플루오로포스페이트 메탄아미니늄(HATU) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)의 존재 하에 수지와 접촉시켜 수지 결합된 (Boc3)-SDMA 시스타미드 (2)를 제공함으로써 (Boc3)-SDMA (1)는 시스테아민-4-메톡시 트리틸 수지(EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ)에 결합될 수 있다. 수지 결합된 (Boc3)-SDMA 시스타미드 (2) 상의 BOC 보호기를 제거하고, 생성된 수지 결합된 SDMA 시스타미드를, 예를 들어, 디클로로메탄 중 트리플루오로아세트산을 이용하여 수지로부터 절단하여 SDMA 시스타미드 (3)를 제공하고, 이를 염산과의 반응에 의해 하이드로클로라이드 염 (4)으로 전환시켰다.
전통적인 EMIT® 검정은 340 nm에서의 흡광도를 모니터함에 의해 NADH(또는 NADPH)의 축적을 측정한다. 본 개시 내용의 또 다른 구체예에서, 컬러 변경 염료 및 전자 매개체를 시약에 첨가하는 것은 흡광도가 340 nm 이외의 흡광도에서 측정될 수 있게 한다. 한 특정 예에서, 염료는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)이고 매개체는 1-메톡시 페나진 메토설페이트(PMS)이다. 도 5에 묘사된 대로, PMS는 NADP로부터 전자를 취해 이를 MTT로 이동시키고, 이는 MTT를 환원시켜 약 650 nm에서 흡광도를 제공한다.
항-SDMA 항체는 미국 특허 8,481,690호에 기재된 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생산하는 방법은 당 분야의 기술범위 내에 있다. 한 구체예에서, 항체는 하기 구조를 갖는 SDMA-KLH 컨쥬게이트에 대해 생성된 모노클로날 항체이다:
Figure 112017090328947-pct00009
다양한 양태에서, 본 개시 내용의 변형된 검정에 이용된 항-SDMA 항체는 SDMA에 높은 특이성을 지닐 수 있고 비대칭적인 디메틸아르기닌(ADMA), L-아르기닌, 및 N-메틸아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 교차반응성을 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 항-SDMA 항체는 특정 세트의 검정 조건 하에 SDMA에 대해 나타낸 반응성의 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만의 반응성을 ADMA, L-아르기닌, 및 N-메틸아르기닌에 대해 나타낸다.
상기 기재된 모든 구성요소는 샘플 중 유리 SDMA의 존재 또는 양을 결정하는 방법에 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 샘플을 항-SDMA 항체, SDMA 및 G6PDH를 포함하는 컨쥬게이트, 및 NAD 및 G6P를 포함하는 기질(들)과 접촉시키는 것을 포함한다. 본원에 기재된 대로 NAD에서 NADH로의 전환율을 측정하고 표준 곡선과 비교하여 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 결정한다. SDMA는 본원에 기재된 대로 5-15개 원자 링커(2-10 옹스트롬)에 의해 G6PDH에 컨쥬게이션된다. 항-SDMA 항체는 ADMA, L-아르기닌, 및 N-메틸아르기닌에 대해 반응성을 갖지 않거나 실질적으로 반응성을 갖지 않는 모노클로날 항체일 수 있다.
또한 다른 구체예에서, 본 개시 내용은 유리 SDMA를 유도체화하고 유도체에 관한 항체를 이용하는 것을 포함하는 샘플 중 SDMA를 결정하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 전문이 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 공개 2004/0214252호는 SDMA의 구아니디노 질소의 변형 방법 및 변형된 SDMA에 관한 항체를 기재하고 있다. 따라서, 한 구체예에서, 샘플 중 SDMA는 본원의 개시 내용에 따른 방법에서의 결정 이전에 변형된다. 이 구체예에서, 항-SDMA 항체는 적합한 검정을 제공하기 위해 변형된 SDMA 및, 또한 변형될 수 있는 컨쥬게이트의 SDMA 둘 모두에 충분한 친화력으로 결합하여야 한다.
실시예
실시예 1: 제거된 혈청의 제조
미처리된 시판 개 혈청(500 mL)을 두발 SNAKESKIN™ 투석 튜브(3.5 K MWCO, 35 mm Dry I.D.)(Thermo Scientific)에 부하시키고 20 g 탄소 분말을 지닌 PBS 완충제(20 L)에 대해 4℃에서 적어도 6시간 동안 투석시켰다. 완충제 및 탄소를 교환함에 의해 상기 공정을 3회 반복하였다.
혈청 중 SDMA 농도를 투석 전과 후에 LC/MS에 의해 측정하였다. 투석 전 혈청에서, SDMA는 9.89 μg/dL이었다. 투석 후에, SDMA는 0.02 μg/dL이었다.
숯처리된 제거된 개 혈청을 사용을 위해 -80℃에 저장하였다.
실시예 2: SDMA 표준 제조:
SDMA.HCl(ChemBio)을 1000 μg/ml의 SDMA의 최종 농도로 탈이온수에 용해시켰다. 200 μl의 SDMA 수용액을 20 μg/ml의 SDMA 농도를 갖는 최종 원액을 위해 10 ml의 제거된 혈청에 첨가하였다. 용액을 -80℃에 저장하였다. 280 μl의 SDMA 원액을 10 ml의 제거된 혈청으로 옮겨 56 μg/dL의 표준 SDMA를 제조하였다. 원액을 제거된 혈청에서 연속하여 희석시킴에 의해 28.0, 14.0, 7.0, 및 3.75 μl/dL의 용액을 제공함으로써 다른 SDMA 표준을 제조하였다. 표준은 LC/MS에 의해 검증될 수 있다.
실시예 3: 희석제의 제조
희석제 제형 R1 및 R2는 표 4에서 확인된 구성요소를 함유하였다. 소듐 옥사메이트는 본원에 달리 기재된 바와 같은 선택적 구성요소이다.
표 4
Figure 112017090328947-pct00010
희석제 제조 프로토콜
R1 희석제(1 L 규모). 하기 구성요소를 500 ml의 탈이온수에 첨가하였다:
10 g의 BSA
50 ml의 1M TRIS, pH8.0
0.372 g의 EDTA 소듐
4 ml의 Brij-35 (30%)
4ml의 Proclin 150
0.96 g의 PEG 6000
17.6 g의 NaCl
10 ml의 마우스 혈청
1.665 g의 소듐 옥사메이트(선택적)
용액은 느린 속도의 교반 막대를 이용하여 잘 혼합되었다. 분말이 완전히 용해되면, pH를 필요에 따라 10N NaOH 또는 3N HCl로 7.0으로 조정하였다. 용액을 눈금 실린더에 첨가하고 탈이온수를 이용하여 1 L의 최종 부피로 만들었다. 잘 혼합한 후, 용액을 부드럽게 잘 혼합시키고, 0.2 μm 셀룰로스 니트라이드 필터 유닛을 통해 여과하고 사용 전에 4℃에 저장하였다.
R2 희석제(1 L 규모): 하기 구성요소를 500 ml의 탈이온수에 첨가하였다:
10 g의 BSA
100 ml의 1M TRIS, pH8.0
2 ml의 0.5M EDTA (pH8.0)
4 ml의 Brij-35 (30%)
4 ml의 Proclin 150
0.96 g의 PEG 6000
17.6 g의 NaCl
10 ml의 마우스 혈청
G6P 0.56 g
1.665 g의 소듐 옥사메이트(선택적)
용액은 느린 속도의 교반 막대를 이용하여 잘 혼합되었다. 분말이 완전히 용해되면, pH를 필요에 따라 10N NaOH 또는 3N HCl로 8.0으로 조정하였다. 용액을 눈금 실린더에 첨가하고 탈이온수를 이용하여 1 L의 최종 부피로 만들었다. 잘 혼합한 후, 용액을 부드럽게 잘 혼합시키고, 0.2 μm 셀룰로스 니트라이드 필터 유닛을 통해 여과하고 사용 전에 4℃에 저장하였다.
실시예 4: 검정 시약의 제조
R1 시약 및 R1 블랭크의 제조
R1 시약 및 R1 블랭크는 R1 희석제에 NAD(35 mM), G6P(56 mM)를 함유하였다. R1 시약은 또한 항체(10.5 μg/ml)를 포함하였다. G6P는 컨쥬게이트에 대한 안정화제이고 선택적인 것이다.
시약을 제조하기 전에 희석제 및 다른 물질은 실온이 되게 하였다. 4.644g의 NAD, 및 3.160g의 소듐 글루코스-6-포스페이트(G6P)를 R1 희석제에 첨가함에 의해 2X 기질 작업 용액(100 ml)을 제조하였다. 부드러운 혼합에 의해 분말을 완전히 용해시키고 pH를 10M NaOH 또는 3 M HCl에 의해 7.0으로 조정하였다. 용액을 눈금 실린더에 첨가하고, 추가 R1 희석제를 첨가하여 100 mL의 최종 부피를 제공하였다. 이 용액을 롤러 상에서 부드럽게 회전시켜 잘 혼합시키고 0.2 μm 셀룰로스 니트라이드 필터 유닛을 통해 여과시켰다.
항체 스톡(6.6 mg/ml)을 R1 희석제에 1:10배로 미리-희석시켜 660 μg/ml의 항체 용액을 제공함에 의해 4X 항체 작업 용액(25 ml)을 제조하였다. 1.59 ml의 미리-희석된 항체 용액(660 μg/ml)을 23.41 ml의 R1 희석제에 첨가하여 42 μg/ml 농도의 항체 작업 용액(4X)을 제조하였다.
40 ml의 기질 작업 용액(2X), 20 ml의 항체 작업 용액(4X), 및 20 ml의 R1 희석제를 혼합시킴에 의해 R1 시약을 제조하였다. 용액을 부드럽게 혼합시키고, 알루미늄 호일로 덮고, 사용 전에 4℃에 저장하였다.
40 ml의 기질 작업 용액(2X) 및 40 ml의 R1 희석제를 혼합시킴에 의해 R1 블랭크를 제조하였다. 용액을 부드럽게 혼합시키고, 알루미늄 호일로 덮고, 사용 전에 4℃에 저장하였다.
R2 시약 및 R2 블랭크의 제조
R2 시약은 R2 희석제에 SDMA-G6PDH 컨쥬게이트(0.42 μg/ml)를 함유하였다. R2 블랭크는 R2 희석제에 SDMA-G6PDH 컨쥬게이트(0.014 μg/mL)를 함유하였다.
0.3 ml의 컨쥬게이트 스톡(Lot #5616-80-2, 770 μg/ml)을 29.7 ml의 R2 희석제에 첨가하여 컨쥬게이트를 1:100배로 미리-희석시킴으로써 7.7 μg/ml의 최종 농도를 제공하였다.
21.8 ml의 미리-희석된 컨쥬게이트 용액을 378.2 ml의 R2 희석제에 첨가하여 R2 시약을 제조하였다.
0.73 ml의 미리-희석된 컨쥬게이트 용액을 399.27 ml의 R2 희석제에 첨가하여 R2 블랭크를 제조하였다.
용액을 잘 혼합시키고, 사용 전에 4℃에 저장하였다.
실시예 5: SDMA 유사체 N,N'-디메틸아르기닌 티올(SDMA-SH)의 제조
물질:
- 시스테아민 4-메톡시트리틸 수지: 0.7 mmol/g 수지 부하 및 200-400 메쉬 코폴리머 매트릭스 (Novabiochem).
- Fmoc-SDMA(Boc)2ONa: MW 624.7, 순도≥95%, (Novabiochem)
- HATU: MW 380.3 (Novabiochem).
- N,N-디이소프로필 에틸아민: Sigma로부터 99.5%, 재증류에 의해 정제됨.
- DMF(무수): Sigma로부터 순도≥99.8%.
- 피페리딘: 무수 DMF 중 20%.
절차:
20 mL 바이알에 시스테아민 4-메톡시트리틸 수지(1.2 g, 0.46 mmol), Fmoc-SDMA(Boc)2ONa(0.9 g, 1.4 mmol, 3.0 당량), HATU(0.54 g, 1.4 mmol, 3.0 당량), 디이소프로필 에틸아민(0.4 mL, 2.3 mmol, 5.0 당량) 및 무수 DMF(18 mL)를 첨가하였다. 혼합물을 캡핑하고 실온에서 16시간 동안 뒤집어 두었다. 액체를 유리 피펫을 이용하여 바이알로부터 제거하였다. 그 후 수지를 DMF(18 mL, 4회)에 이어 메탄올(18 mL, 4회)로 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘에서 실온에서 15분 동안 뒤집어 두었다(18 mL, 3회). 그 후 수지를 DMF(18 mL, 4회)에 이어 메탄올(18 mL, 4회)로 세척하고, 1시간 동안 동결건조기에서 건조시켰다. 그 후 황색/연분홍색 수지를 4℃에 저장하거나 절단하여 SDMA-SH를 제공할 수 있다.
수지(50 mg)로부터 SDMA-SH를 절단하기 위해 트리플루오로아세트산(3 mL) 중에 실온에서 1시간 동안 뒤집어 두었다. 그 후 진한 적색 슬러리를 여과하고, 아세토니트릴(1 mL)로 세정하여 투명한 황색 용액을 수득하였다. 이어서 용액을 동결건조시켜 SDMA-SH(7 mg)를 진한 황색 오일로서 수득하였다. 티올의 산화로 인해, 화합물은 즉시 사용되거나 -80℃에 저장되어야 한다(-80℃에서의 저장은 2개월 후 <10% 산화를 발생시킴). SDMA-SH(화학식 1)는 LC/MS 및 NMR에 의해 확인되었다.
화학식 1
Figure 112017090328947-pct00011
실시예 6: SDMA 및 G6PDH의 컨쥬게이션
SDMA 유사체 SDMA-SH를 NAD 및 G6P의 존재 하에 SIA, SBPA 또는 SMCC로 활성화된 G6PDH와 컨쥬게이션시킴에 의해 SDMA 및 G6PDH의 컨쥬게이트를 제조하였다. SDMA 및 G6PDH 사이의 링커 길이는 도 2, 3 및 4에 도시된 대로 활성화에 이용되는 시약을 선택함에 의해 다양해질 수 있었다.
SIA에 의한 효소 전활성화: 한 바이알의 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)(12 mg)를 3 ml MES 완충제(50 mM, pH 8.0)에 용해시키고, 효소가 완전하 용해되는 것을 보장하기 위해 1시간 동안 회전시켰다. 효소 용액을 필요할 때까지 얼음 위에 유지하였다. 추가 4.5 ml MES 완충제(50 mM, pH 8.0)를 효소 용액에 첨가하고, 볼텍싱을 통해 잘 혼합시키고(5초), 10분 동안 얼음 위에 유지하였다. 100mg G6P를 1 ml 탈이온수에 용해시키고, 10분 동안 얼음 위에 유지하였다. 200 mg NADH를 1 ml 탈이온수에 용해시키고, 10분 동안 얼음 위에 유지하였다. 0.68 ml G6P 용액 및 0.34 ml NADH 용액을 효소 용액에 첨가하고, 볼텍싱을 통해 잘 혼합시키고(5초), 10분 동안 얼음 위에 유지하였다. 한 바이알의 SIA(50 mg)를 0.5 ml DMSO(100 mg/ml)에 용해시켰다. 0.14 ml의 SIA 용액을 효소 용액에 첨가하고, 볼텍싱을 통해 잘 혼합시키고(5초), 알루미늄 호일로 덮고, 실온에서 2시간 동안 회전시켰다. 용액을 G2 Slide-A-Lyzer 투석 카세트로 옮기고 PBS 완충제(4 L)에 대해 4℃에서 암실에서 5시간 동안 투석하였다. 완충제를 새로운 PBS(4 L)로 교체하고, 용액을 4℃에서 밤새 암실에서 투석하였다. 투석 완충제를 MES(4 L, 25 mM, pH 8.0)로 교체하고, 용액을 3시간 동안 4℃에서 투석하였다. 12.5 ml의 효소 용액을 투석 카세트로부터 제거하고, 0.32 ml MES 완충제(1 M, pH 8.0) 및 0.32 ml EDTA(0.2M, pH 8.0)를 첨가하여 용액의 최종 농도가 50 mM MES 및 5 mM EDTA가 되게 하였다. 필요한 경우, 효소 용액이 12.5 ml 미만이면, MES 및 EDTA의 부피는 그에 따라 조정될 수 있다. 용액을 5분 동안 아르곤으로 탈기시켰다.
SBPA에 의한 효소 전활성화: 1 ml MES 완충제(50 mM, pH 8.0) 중 2 mg의 G6PDH에, 11.3 mg G6P 및 16.8 mg NADH를 첨가하고, 잘 혼합시키고, 10분 동안 얼음 위에 유지하였다. SBPA(50 mg)를 0.5 ml DMSO(100 mg/ml)에 용해시켰다. 0.025 ml SBAP를 효소 용액에 첨가하고, 볼텍싱을 통해 잘 혼합시키고(5초), 알루미늄 호일로 덮고, 실온에서 2시간 동안 회전시켰다. 용액을 G2 Slide-A-Lyzer 투석 카세트로 옮기고 PBS 완충제(2 L)에 대해 4℃에서 암실에서 5시간 동안 투석하였다. 완충제를 새로운 PBS(2 L)로 교체하고, 용액을 4℃에서 밤새 암실에서 투석하였다. 투석 완충제를 MES(2 L, 25 mM, pH 8.0)로 교체하고, 용액을 3시간 동안 4℃에서 투석하였다. 2.5 ml의 효소 용액을 투석 카세트로부터 제거하고, 0.060 ml MES 완충제(1 M, pH 8.0) 및 0.025 ml EDTA(0.5M, pH8.0)를 첨가하여 용액의 최종 농도가 50 mM MES 및 5 mM EDTA가 되게 하였다.
SMCC에 의한 효소 전활성화: 1 ml MES 완충제(50 mM, pH 8.0) 중 2 mg의 G6PDH에, 11.3 mg G6P 및 16.8 mg NADH를 첨가하고, 잘 혼합시키고, 10분 동안 얼음 위에 유지하였다. 50 mg 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)를 0.5 ml DMSO(100 mg/ml)에 용해시켰다. 0.035 ml SMCC 용액을 효소 용액에 첨가하고, 볼텍싱을 통해 잘 혼합시키고(5초), 알루미늄 호일로 덮고, 실온에서 2시간 동안 회전시켰다. 용액을 G2 Slide-A-Lyzer 투석 카세트로 옮기고 PBS 완충제(2 L)에 대해 4℃에서 암실에서 5시간 동안 투석하였다. 완충제를 새로운 PBS(2 L)로 교체하고, 용액을 4℃에서 밤새 암실에서 투석하였다. 투석 완충제를 MES(2 L, 25 mM, pH 8.0)로 3시간 동안 4℃에서 교체하였다. 2.5 ml의 효소 용액을 투석 카세트로부터 제거하고, 0.060 ml MES 완충제(1 M, pH 8.0) 및 0.025 ml EDTA(0.5M, pH8.0)를 첨가하여 용액의 최종 농도가 50 mM MES 및 5 mM EDTA가 되게 하였다.
SDMA 및 전활성화된 G6PDH의 컨쥬게이션: 새롭게 제조된 SDMA-SH(화학식 1)를 전활성화된 효소 용액에 하기 양으로 첨가하였다: SIA-활성화된 G6PDH의 경우 0.35 ml(100 mg/ml) 및 SBAP 또는 SMCC-활성화된 G6PDH의 경우 0.065ml (100mg/ml). 용액을 잘 혼합시키고, 혼합물을 36시간 동안 4℃에서 회전시켰다. 반응 혼합물을 G2 Slide-A-Lyzer 투석 카세트(Thermo Scientific)를 이용하여, PBS(2 또는 4 L)에 대해 4℃에서 투석하였다(3 또는 4 사이클). Tris HCl 완충제(25mM, pH 8.0)에 대해 4시간 동안 4℃에서 투석시킴에 의해 SDMA-효소 컨쥬게이트 용액을 평형화시켰다. 용액을 0.45 μm 원심분리 필터(10분 동안 1500*g)를 이용하여 여과시켰다.
표 5는 링커 길이 및 각 컨쥬게이트의 활성 및 컨쥬게이트의 G6PDH를 억제하는 항체의 능력을 제시한다. 링커 길이는 화학식 1의 SDMA 유도체에 비천연 질소를 포함하지 않는다. SIA의 존재 하에 G6PDH의 전활성화는 SBPA 또는 SMCC로 제조된 컨쥬게이트보다 양호한 효소 활성을 발생시켰다.
표 5
Figure 112017090328947-pct00012
실시예 7: 항-SDMA 모노클로날 항체의 제조
모노클로날 항체를 생산하는 방법은 당 분야의 기술범위 내에 있다. 한 구체예에서, 항체는 하기 구조를 갖는 SDMA-KLH 컨쥬게이트에 대해 생성된 모노클로날 항체이다:
Figure 112017090328947-pct00013
항-SDMA 항체의 정제는 다음과 같이 수행되었다:
물질:
· 2 x 2L의 항-SDMA
· 항-SDMA IgG 정제 전용 역상(rPA) 컬럼(5ml)(GE Healthcare)
· Pierce IgG 정제 완충제
· IgG 결합 완충제
· IgG 저 pH 용리 완충제
· 투석용 PBS, pH 7.4
· 2 x 4L @ 4C
프로토콜:
· rPA 컬럼(5 ml)을 3 ml/분의 결합 완충제에서 평형화시켰다
1. 흐름은 OD 280 nm에 의해 모니터됨
· 1000 ml의 항-SDMA를 같은 부피의 Pierce IgG 결합 완충제로 희석시켰다
1. 공정은 추가 1000 ml에 대해 반복됨
· rPA 컬럼 상에 6 ml/분으로 부하된 희석된 항-SDMA
1. OD는 280 nM에 의해 모니터됨
· rPA 컬럼을 ...까지 PBS/IgG 결합 완충제 1:1 @ 3ml/분으로 세척하였다
1. OD 280 nM이 기준선에 도달함
· 항-SDMA IgG를 IgG 저 pH 용리 완충제 @ 3 분/ml를 이용하여 용리시켰다
1. 피크를 수동으로 수집하였다
· 항-SDMA IgG를 4 L PBS의 2회 교체에 대해 즉시 투석하였다
1. 30 ml 10k MWCO 카세트(들)
2. 부피를 풀링시키고 OD 280 nm을 이용하여 IgG 농도 결정
항체를 미국 특허 8,481,690호에 기재된 대로 SDS Page, SEC 및 플레이트-기반 면역검정에 의해 분석하였다.
실시예 8: 검정 절차
본 개시 내용의 변형된 검정을 개, 고양이 및 인간 샘플에서 SDMA에 대해 수행하였다.
시약 구성요소는 표 5에 제시되어 있다.
표 5
Figure 112017090328947-pct00014
상기 기재된 대로 제조된 시약에 대한 피펫팅 부피는 컬러 검정 및 블랭크 검정에 대해 동일하였다:
부피(μl)
샘플 또는 캘리브레이터 10
R1 40
R2 125
샘플 및 캘리브레이터에 대한 컬러 및 블랭크 검정 및 관련 계산을 Beckman AU680® 자동화 분석기 상에서 수행하였다. 캘리브레이터 매트릭스(제거된 개 혈청)에 56.0, 28.0, 14.0, 7.0, 및 3.75 및 0 μg/dL의 SDMA를 함유하는 캘리브레이션 표준을 고양이 및 개 둘 모두에 이용하였다. 분석기는 다음과 같이 컬러 및 블랭크 검정을 수행하도록 프로그래밍되었다: 샘플 및 캘리브레이터를 시약 R1에 첨가하고, R2의 첨가 전에 3-4분 동안 인큐베이션시켰다. R2의 첨가 후 약 36초에서의 출발을 이용하여 OD를 340 nm에서 측정하였다. 흡광도를 4회 추가의 18초 사이클 동안 18초마다 측정하였다. 캘리브레이터 매트릭스(0 μg/dL SDMA)의 흡광도 값을 컬러 및 블랭크 검정의 반응 속도(흡광도의 변화/분)를 계산하기 위해 이용된 각 측정치에서 빼서 표준화된 컬러 및 블랭크 반응 속도를 제공하였다.
표준 곡선에 대한 속도를 결정하기 위해, 블랭크 검정의 각 캘리브레이터에 대한 표준화된 속도를 컬러 검정의 각 캘리브레이터에 대한 표준화된 속도에서 뺐다. 최종 샘플 반응 속도를 제공하기 위해 컬러 검정에서 샘플에 대한 표준화된 속도로부터 블랭크 검정에서의 샘플에 대한 표준화된 속도를 빼서 샘플 SDMA 농도를 결정하고, 이를 최종 표준 곡선과 비교하였다.
표 6은 컬러 검정 단독을 이용할 때("빼기를 하지 않음") 및 블랭크 검정 속도를 컬러 검정 속도에서 뺐을 때("빼기를 함") 고양이 및 개 혈청에 대한 SDMA 검정의 결과를 제시한다. 샘플 편향은 LC/MS 결과 및 위의 절차를 사용한 결과 사이의 차이를 반영한다.
표 6
Figure 112017090328947-pct00015
표 7은 제거된 개 혈청에서 공지된 양의 SDMA를 이용하여 빼기를 하고 및 빼기를 하지 않고 제조한 캘리브레이션 곡선을 제시한다. 다른 종에 대해 유사한 곡선이 만들어졌다.
표 7
Figure 112017090328947-pct00016
표 8은 상기 기재된 속도 검정 절차를 이용하여 SDMA로 스파이킹된 제거되지 않은 인간 혈청을 이용한 도 6에 도시된 캘리브레이션 곡선에 대한 값을 제시한다(즉, 빼기를 한 컬러 및 블랭크 검정).
표 8
Figure 112017090328947-pct00017
곡선을 이용하여 도 1에 도시된 대로 정상 및 만성 신장병 인간 혈청 샘플에서의 농도를 결정하였다.
실시예 9: 효소 억제제의 이용
락테이트 탈수소효소 억제제 소듐 옥사메이트를 실시예 3에서 상기 기재된 대로 블랭크 시약 희석제 및 시약에 첨가하였다. 억제제의 이용은 표 9에 제시된 대로 검정의 정확성을 개선시킬 수 있다.
표 9
Figure 112017090328947-pct00018
이 예에서, 개 혈청에 대한 표준 곡선은 표 10에 제시된 대로 소듐 옥사메이트와 함께 및 소듐 옥사메이트 없이 만들어졌다. 유사한 곡선이 다른 종에 대해 마련될 수 있다.
표 10
Figure 112017090328947-pct00019
실시예 10: 제거되고 제거되지 않은 인간 혈청 캘리브레이터에 의한 인간 혈청 샘플 시험
내인성 및 숯 제거된 인간 혈청을 캘리브레이터 매트릭스로서 이용하여 인간 혈청 샘플에서 SDMA의 회수를 결정하였다. 이 실험에서 수집된 데이터를 이용하여 속도 및 고정 캘리브레이션 방법으로 캘리브레이션 곡선을 만들 수 있다.
검정 시약은 표 11에 제시된 대로 제조하였다.
표 11
Figure 112017090328947-pct00020
항-SDMA mAb를 실시예 7에서와 같이 제조하였고 1.5μg/mL의 검정 농도로 이용하였다.
SDMA-G6PDH를 실시예 6에서와 같이 제조하였고 0.3μg/mL의 검정 농도로 이용하였다.
캘리브레이터는 하기 SDMA 농도(μg/dL)를 갖는 숯 제거된 인간 혈청으로 제조되었다: LC/MS에 의해 결정시 0.0, 4.7, 15.0, 29.0, 59.0 및 111.0.
속도 방법을 실시예 8에 따라 수행하였다.
고정 방법에서, 반응 개시 후 1분 내지 3분 사이에 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정하도록 Beckman 기계를 설정하였다.
SDMA 농도의 결정을 위한 고정 및 속도 계산 방법의 결과를 도 7에 도시한다.
실시예 11: 완충제 캘리브레이터에 의한 제거되지 않은 인간 캘리브레이터 용량
SDMA 검정을 완충제-기반 캘리브레이터(1% BSA를 갖는 PBS 완충제 중 0, 6, 11, 24, 46, 및 95 μg/dL SDMA)를 이용하여 교정하고, 회수를 결정하기 위해 제거되지 않은 인간 혈청 표준을 시험하는데 이용하였다. 이 실험은 기계 사이클 12 및 16에서 340nm에서의 흡광도의 변화를 계산하기 위해 고정 방법을 이용하였고, 각 사이클은 18초이다(T1 = 216초, T2 = 288초). 시약 블랭크(diH2O)로부터의 흡광도를 순 흡광도에서 빼지 않았다.
검정을 실시예 9에 제시된 바와 같이 진행시켰다. 결과를 도 8에 도시한다.
실시예 12: 수동 및 자동화 배경 차감의 비교
자동화 배경 차감 방법 온-보드 Beckman AU680® 분석기를 시험하여 온-보드 용액의 효과를 결정하였다. SDMA 검정을 온 보드 지시에 따라 진행시키고 검정을 별도로 진행시키고 결과를 오프라인 방법을 대조군으로서 이용하여 계산하였다.
숯 제거된 개 혈청 캘리브레이터를 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 시약 구성요소는 표 12에 제시된다.
표 12
Figure 112017090328947-pct00021
반응 부피는 다음과 같았다:
샘플 부피: 17 μL
시약 1 부피: 25 μL
시약 2 부피: 125 μL
컬러 및 블랭크 검정은 온-보드 분석기에 결합되지 않는다. 데이터는 각 검정에 대해 별도로 생성되고 기계에서 처리된다. 블랭크 검정 반응 OD를 캘리브레이터 및 샘플에 대한 컬러 검정 반응 OD에서 뺀다. 곡선을 캘리브레이션 데이터에 맞추고 최적 곡선의 방정식을 이용하여 차감된 반응 OD로부터 샘플 농도를 결정한다.
표 13은 고정 반응 방법에서 캘리브레이터에 대한 흡광도의 순 변화를 제시한다.
표 13
Figure 112017090328947-pct00022
표 14는 표 13에 제시된 캘리브레이터로부터 생성된 표준 곡선을 이용한 샘플 중 SDMA의 측정을 보여준다.
표 14
Figure 112017090328947-pct00023
실시예 12: 상이한 종으로부터의 캘리브레이터 매트릭스의 분석
다양한 동물 종의 풀링된 혈청으로부터 제조된 캘리브레이터 세트를 분석하여 상이한 종으로부터의 혈청을 지닌 캘리브레이터를 사용할 때 SDMA 검정의 견고성을 결정하였다.
인간 SDMA에 대한 검정을 실시예 10에서와 같은 고정 방법을 이용하여 개, 고양이, 및 말로부터의 제거된 또는 내인성(제거되지 않은) 혈청으로 제조된 캘리브레이터에 대해 수행하였다. 검정 결과는 도 8, 9 및 10에 도시된다.
실시예 13: 완충제-기반 캘리브레이션
PBS 중 1% BSA를 캘리브레이션 매트릭스로서 이용하여 표 13의 캘리브레이션 농도에 대한 캘리브레이션 곡선을 만들었다. 결과는 도 12에 도시된다.
실시예 14: 블랭크 시약에 컨쥬게이트가 첨가되지 않은 SDMA 검정
SDMA 검정을 실시예 8의 속도 절차를 이용하여 표 5의 시약 농도로 진행하였고, 단, 컨쥬게이트가 R2에 첨가되지 않은 것이 예외였다. 검정을 Beckman 분석기 상에서 진행시켰다. 결과는 표 15에 제시된다.
표 15
Figure 112017090328947-pct00024
본 개시 내용의 다양한 특정 구체예가 본원에 기재되었으나, 이 개시 내용은 그러한 정확한 구체예에 한정되지 않으며 다양한 변경 또는 수정이 본 개시 내용의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 당업자에 의해 그 안에서 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
상기 주어진 실시예는 단지 예시적인 것이며 본 개시 내용의 가능한 모든 구체예, 응용 또는 변형의 철저한 목록을 의미하는 것은 아니다. 따라서, 본 개시 내용의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경은 본 개시 내용의 범위 및 사상을 벗어나지 않으며 당업자에게 자명할 것이다. 비록 본 개시 내용이 특정 구체예에 관해 기재되었으나, 청구된 바와 같은 개시 내용은 그러한 특정 구체예로 부당하게 제한되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 분자생물학, 면역학, 화학, 생화학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 개시 내용을 수행하기 위해 기술된 방식의 다양한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
본원에 인용된 임의의 수치 값은 임의의 더 낮은 값 및 임의의 더 높은 값 사이에 적어도 2개 단위의 분리가 존재하는 경우, 한 단위의 증분으로 낮은 값에서 높은 값까지의 모든 값을 포함한다. 예로서, 구성요소의 농도 또는 예를 들어, 크기, 각 크기, 압력, 시간 등과 같은 공정 변수의 값이, 예를 들어, 1 내지 90, 특히 20 내지 80, 보다 특히 30 내지 70인 것으로 진술된 경우, 15 내지 85, 22 내지 68, 43 내지 51, 30 내지 32 등과 같은 값이 본 명세서에 분명히 열거된 것으로 의도된다. 1보다 작은 값의 경우, 한 단위는 적절한 경우 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1으로 간주된다. 이들은 구체적으로 의도된 것의 예일 뿐이며 열거된 최저값 및 최고값 사이의 수치 값의 모든 가능한 조합은 유사한 방식으로 본 출원에 분명히 언급된 것으로 간주되어야 한다.

Claims (80)

  1. 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)에 컨쥬게이션된 대칭적인 디메틸 아르기닌(SDMA)을 포함하며, SDMA가 5 내지 9개 원자 링커를 통해 G6PDH에 컨쥬게이션된 컨쥬게이트.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, SDMA가 5-15 옹스트롬의 길이를 갖는 링커를 통해 G6PDH에 컨쥬게이션된 컨쥬게이트.
  4. 제 1항에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 컨쥬게이트:
    Figure 112022061418941-pct00040
    , 및
    Figure 112022061418941-pct00041
    .
  5. 제 1항의 컨쥬게이트 및 유리 SDMA에 특이적인 항체를 포함하는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 유리 SDMA에 특이적인 항체가 유리 SDMA에 대한 이의 반응성의 25% 미만의 반응성을 비대칭적인 디메틸아르기닌(ADMA)에 대해 갖는 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 항체가 비대칭적인 디메틸아르기닌(ADMA), L-아르기닌, 및 N-메틸아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물과 교차반응성을 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않는 조성물.
  8. 제 1항의 컨쥬게이트 및 SDMA에 특이적인 항체의 구성요소를 포함하는 키트.
  9. 제 8항에 있어서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)의 구성요소를 추가로 포함하는 키트.
  10. 제 8항의 키트의 구성요소 및 SDMA를 포함할 것으로 의심되는 샘플을 포함하는 반응 혼합물.
  11. (a)i. 항-분석물 항체 및 G6PDH에 대한 신호 생성 기질을 포함하는 제1 시약, 및
    ii. 분석물 및 G6PDH의 컨쥬게이트를 포함하는 제2 시약으로서, 컨쥬게이트가 5 내지 9개 원자 링커를 통해 G6PDH에 컨쥬게이션된 SDMA를 포함하는 제2 시약을 포함하는 제1 검정을 수행하기 위한 제1 세트의 시약, 및
    (b)i. 기질을 포함하는 제3 시약을 포함하는 제2 검정을 수행하기 위한 제2 세트의 시약을 포함하는,
    분석물을 함유하는 샘플에 대해 검정을 수행하기 위한 시약을 포함하는 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 제2 세트의 시약이 희석제 및 완충제 중 적어도 하나를 포함하는 제4 시약을 추가로 포함하는 키트.
  13. 제 12항에 있어서, 제4 시약이 컨쥬게이트 또는 G6PDH를 추가로 포함하는 키트.
  14. 제 12항에 있어서, 시약 중 적어도 하나가 G6PDH 이외의 효소에 대한 억제제를 포함하는 키트.
  15. 제 12항에 있어서, 제1 시약의 컨쥬게이트의 농도가 제4 시약의 컨쥬게이트의 농도보다 5 내지 150배 더 높은 키트.
  16. 제 11항에 있어서, 분석물이 제거된 샘플 용액에 희석된 공지된 양의 분석물을 포함하는 표준를 추가로 포함하는 키트.
  17. 제 16항에 있어서, 분석물이 제거된 샘플 용액이 제거된 혈청, 제거된 혈장, 또는 전처리된 샘플인 키트.
  18. 제 11항에 있어서, 제1 시약 및 제2 시약 중 적어도 하나가 전자 매개체 및 염료를 추가로 포함하고, 제3 시약이 매개체 및 염료를 추가로 포함하고, 매개체가 기질로부터 전자를 받아 이를 염료로 이동시키는 키트.
  19. 제 18항에 있어서, 제1 시약 및 제2 시약 중 적어도 하나가 전자 매개체 및 염료를 포함하고, 제3 시약 중 적어도 하나 및 제4 시약 중 하나가 매개체 및 염료를 포함하고, 매개체가 기질로부터 전자를 받아 이를 염료로 이동시키는 키트.
  20. 제 11항에 있어서, 분석물이 유리된 대칭적인 디메틸 아르기닌(SDMA)인 키트.
  21. 제 20항에 있어서, 항-분석물 항체가 유리 SDMA에 특이적인 항체인 키트.
  22. 제 21항에 있어서, 항체가 유리 SDMA에 대한 이의 반응성의 25% 미만의 반응성을 비대칭적인 디메틸아르기닌(ADMA)에 대해 갖는 키트.
  23. 제 22항에 있어서, 항-분석물 항체가 ADMA, L-아르기닌, 및 N-메틸아르기닌에 대해 반응성을 갖지 않거나 실질적으로 반응성을 갖지 않는 키트.
  24. 삭제
  25. 제 11항에 있어서, 컨쥬게이트가 5 내지 15 옹스트롬의 길이를 갖는 링커에 의해 G6PDH에 컨쥬게이션된 SDMA를 포함하는 키트.
  26. 제 11항에 있어서, 기질이 NAD를 포함하는 키트.
  27. 제 11항에 있어서, 제2 시약이 글루코스-6 포스페이트(G6P)를 추가로 포함하는 키트.
  28. (a) 샘플을 유리 SDMA에 특이적인 항-SDMA 항체, 제 1항의 컨쥬게이트, 및 NAD를 포함하는 기질과 접촉시키는 단계,
    (b) NAD에서 NADH로의 전환을 측정하는 단계, 및
    (c) NAD에서 NADH로의 전환에 기반하여 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함하는,
    샘플 중 유리 SDMA의 존재 또는 양을 결정하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, NAD에서 NADH로의 전환을 측정하는 단계가 NAD에서 NADH로의 전환율을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, NAD에서 NADH로의 전환에 기반하여 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 결정하는 단계가 NAD에서 NADH로의 전환율을 표준 곡선과 비교하는 것을 포함하는 방법.
  31. 제 28항에 있어서, NAD에서 NADH로의 전환을 측정하는 단계가 NAD에서 NADH로 전환되는 양을 측정하는 것을 포함하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, NAD에서 NADH로의 전환에 기반하여 샘플 중 SDMA의 존재 또는 양을 결정하는 단계가 NAD에서 NADH로 전환되는 양을 표준 곡선과 비교하는 것을 포함하는 방법.
  33. 제 28항에 있어서, 샘플이 혈청, 혈장, 소변 또는 뇌척수액인 방법.
  34. 제 28항에 있어서, 컨쥬게이트가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 방법:
    Figure 112022061418941-pct00042
    , 및
    Figure 112022061418941-pct00043
    .
  35. 제 28항에 있어서, 유리 SDMA에 특이적인 항-SDMA 항체가 유리 SDMA에 대한 이의 반응성의 25% 미만의 반응성을 비대칭적인 디메틸아르기닌(ADMA)에 대해 갖는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 항-SDMA 항체가 ADMA, L-아르기닌, 및 N-메틸아르기닌에 대해 반응성을 갖지 않거나 실질적으로 반응성을 갖지 않는 방법.
  37. 삭제
  38. 제 28항에 있어서, SDMA가 5 내지 15 옹스트롬의 길이를 갖는 링커를 통해 G6PDH에 컨쥬게이션된 방법.
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
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  80. 삭제
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102492243B1 (ko) 2015-02-20 2023-01-25 아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드 배경 신호에 대한 보상에 의한 균질 면역검정
CA3079011A1 (en) * 2017-10-19 2019-04-25 Idexx Laboratories, Inc. Detection of symmetrical dimethylarginine
US10745492B1 (en) 2019-04-03 2020-08-18 Ark Diagnostics, Inc. Antibodies to symmetrically dimethylated arginine analytes and use thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130280740A1 (en) * 2008-08-07 2013-10-24 Idexx Laboratories, Inc. Methods for Detecting Symmetrical Dimethylarginine
US20140221616A1 (en) * 2012-08-21 2014-08-07 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Haptens of quetiapine

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3875011A (en) * 1972-11-06 1975-04-01 Syva Co Enzyme immunoassays with glucose-6-phosphate dehydrogenase
US4341866A (en) * 1980-06-02 1982-07-27 Syva Company Antienzyme termination in enzyme immunoassays
DE3134787A1 (de) 1981-09-02 1983-03-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Creatinin-antikoerper
IT1199088B (it) 1984-03-09 1988-12-30 Miles Italiana Saggio di legame specifico mediante impiego di anti-g6pdh come marcante
US4818703A (en) 1985-10-23 1989-04-04 Pizzolante John M Stabilized alkaline picrate reagent for jaffe creatinine determination
US6461825B1 (en) * 1987-09-30 2002-10-08 Sanofi (Societe Anonyme) Immunometric assay kit and method applicable to whole cells
EP0356160A3 (en) 1988-08-24 1991-09-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Capillary device
EP0399127A1 (en) * 1989-05-23 1990-11-28 Pharmacia ENI Diagnostics Inc. Homogeneous immunochemical method for determining haptens by means of ion selective electrodes
US5726010A (en) 1991-07-31 1998-03-10 Idexx Laboratories, Inc. Reversible flow chromatographic binding assay
US6455288B1 (en) * 1993-04-08 2002-09-24 Dade Behring Marburg Gmbh Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphate dehydrogenases
US5972703A (en) * 1994-08-12 1999-10-26 The Regents Of The University Of Michigan Bone precursor cells: compositions and methods
US5804452A (en) 1995-04-27 1998-09-08 Quidel Corporation One step urine creatinine assays
AU7269098A (en) 1997-05-01 1998-11-24 Cooke Pharma, Inc. Cardiovascular disease risk assessment
US6736957B1 (en) 1997-10-16 2004-05-18 Abbott Laboratories Biosensor electrode mediators for regeneration of cofactors and process for using
US6358699B1 (en) 1999-02-05 2002-03-19 Cooke Pharma Assay for asymmetrical NG, NG dimethyl-l-arginine
AU2452301A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Research Foundation Of The State University Of New York, The Protein methylarginine-specific antibodies
AU2001275870A1 (en) 2000-07-06 2002-01-21 Fal Diagnostics Methods and kits for the detection of arginine compounds
AU2001293699A1 (en) 2000-07-12 2002-01-21 Werner Naser Direct assessment of analyte to reference molecule ratios
DE10040904A1 (de) 2000-08-18 2002-02-28 Boeger Rainer H Verfahren und Mittel zum Nachweis einer Wahrscheinlichkeit zukünftigen Fortschreitens von Gefässerkrankungen
US6601006B2 (en) * 2000-12-22 2003-07-29 Idexx Laboratories, Inc. Methods for the calibration of analyte assays
US7241856B2 (en) 2003-06-02 2007-07-10 Pentron Clinical Technologies Llc Dental resins, dental composite materials, and method of manufacture thereof
FR2824825B1 (fr) 2001-05-15 2005-05-06 Servier Lab Nouveaux derives d'alpha-amino-acides, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
JP4214271B2 (ja) 2002-10-15 2009-01-28 アークレイ株式会社 クレアチニン測定用試験片
US7501053B2 (en) 2002-10-23 2009-03-10 Abbott Laboratories Biosensor having improved hematocrit and oxygen biases
AU2003290784A1 (en) 2002-11-15 2004-06-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for detecting asymmetric dimethylarginine in a biological sample
US20050148029A1 (en) 2003-09-29 2005-07-07 Biosite, Inc. Methods and compositions for determining treatment regimens in systemic inflammatory response syndromes
US6991911B2 (en) 2003-12-15 2006-01-31 Dade Behring Inc. Assay for entactogens
US7813880B2 (en) 2004-03-25 2010-10-12 University Of Maryland, Baltimore Apparatus and method for providing optimal concentrations for medication infusions
CA2561343C (en) 2004-03-30 2013-01-22 Whatman, Inc. Lateral flow assay on a single hydrophilic monolithic matrix made of a network of fibres
US7220842B2 (en) 2004-04-05 2007-05-22 Dade Behring Inc. Immunoassays for buprenorphine and norbuprenorphine
US20060046273A1 (en) 2004-08-27 2006-03-02 Lin-Zhi International Inc. Homogeneous enzyme immunoassay for oral fluid
ES2332218T3 (es) 2004-11-04 2010-01-29 Germediq Forschungs- Und Entwicklungsgesellschaft Mbh Metodo para la determinacion de arginina, argininas metiladas y sus derivados.
CA2495138C (en) * 2005-01-20 2012-10-23 Alison Jane Basile Multiplexed analysis for determining a serodiagnosis of viral infection
US7879979B2 (en) * 2005-01-21 2011-02-01 Alere International Arginine analogs, and methods for their synthesis and use
US7723127B2 (en) 2005-03-03 2010-05-25 Novx Systems Inc. Immunoassay with extended dynamic range
DE112006000731T5 (de) * 2005-03-30 2008-06-26 Ucl Biomedica P.L.C. Assay zur Messung von asymmetrischem Methylarginin in einer biologischen Probe
ES2609919T3 (es) 2005-04-28 2017-04-25 Ventana Medical Systems, Inc. Enzimas conjugados con anticuerpos mediante un conector de PEG heterobifuncional
WO2007051069A2 (en) 2005-10-27 2007-05-03 Yale University Urinary proteomic biomarker patterns in preeclampsia
DE102005060057A1 (de) 2005-12-15 2007-06-28 Kellner, Karl-Heinz, Dr. Sandwich-Immunoassay für kleine Haptenmoleküle
JP2007176872A (ja) 2005-12-28 2007-07-12 Sentan Seimei Kagaku Kenkyusho:Kk アシンメトリックジメチルアルギニンを認識する抗体及びその製造方法並びに翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法
AU2007224240B2 (en) * 2006-03-02 2013-07-25 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Methods for distinguishing isomers using mass spectrometry
WO2008154457A1 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Ark Diagnosties, Inc. Topiramate immunoassays
FR2919063B1 (fr) 2007-07-19 2009-10-02 Biomerieux Sa Procede de dosage du leucocyte elastase inhibitor pour le diagnostic in vitro du cancer colorectal.
ES2547307T3 (es) 2007-12-05 2015-10-05 King's College London Procedimiento de ayuda al diagnóstico de un trastorno
US8168756B2 (en) 2008-10-24 2012-05-01 Ark Diagnostics, Inc. Levetiracetam immunoassays
RU2559569C2 (ru) 2009-06-02 2015-08-10 Байокрейтс Лайф Сайенсиз Аг Новые биомаркеры для оценки болезней почек
CN101587118B (zh) 2009-07-03 2012-09-12 长春迪瑞医疗科技股份有限公司 肌酐尿液分析试纸及制备方法
CN101598727B (zh) 2009-07-09 2012-10-10 上海科华生物工程股份有限公司 定量测定人体血液尿素含量的干化学试纸
CN101865911A (zh) 2010-03-16 2010-10-20 苏州市玮琪生物科技有限公司 一种尿肌酐定量检测卡
US8329424B2 (en) * 2010-06-25 2012-12-11 Siemens Healthcare Diagnostics Reduction in false results in assay measurements
EP2612147B1 (de) 2010-11-17 2016-03-30 Karl-Heinz Kellner Automatenfähiger immunoassay für biogene amine
JP2012112785A (ja) 2010-11-24 2012-06-14 Tohoku Univ 透析膜の評価方法
CN102154444B (zh) * 2010-12-30 2013-09-25 北京九强生物技术股份有限公司 测定不对称二甲基精氨酸浓度的方法及诊断试剂盒
US8394647B2 (en) 2011-02-17 2013-03-12 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Reducing non-covalently bound polysaccharide on supports
CN102628868B (zh) 2011-12-30 2014-09-17 北京九强生物技术股份有限公司 检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CA2857522C (en) 2012-01-10 2020-04-14 Idexx Laboratories, Inc. Immunoassay test slide
WO2013124478A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Universität des Saarlandes Symmetric dimethylarginine (sdma) modifies high density lipoprotein (hdl) to induce endothelial dysfunction
US9074482B2 (en) * 2012-04-24 2015-07-07 United Technologies Corporation Airfoil support method and apparatus
US20140038203A1 (en) 2012-07-09 2014-02-06 Musc Foundation For Research Development Methods for detecting or predicting kidney disease
EP2945942B1 (en) 2013-01-18 2018-05-09 ARK Diagnostics, Inc. Voriconazole immunoassays
ES2674704T3 (es) 2013-02-13 2018-07-03 Ark Diagnostics, Inc. Inmunoensayos de posaconazol
EP3041576B1 (en) 2013-09-05 2019-06-19 IDEXX Laboratories, Inc. Methods for detecting renal disease
WO2015094852A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Preparation of multi-hapten mutant g6pdh conjugates and their use for detection of multiple analytes
KR102492243B1 (ko) 2015-02-20 2023-01-25 아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드 배경 신호에 대한 보상에 의한 균질 면역검정
CN105753969A (zh) * 2016-04-06 2016-07-13 苏州博源医疗科技有限公司 非对称二甲基精氨酸免疫原、抗体和检测试剂及制备方法
CA3079011A1 (en) * 2017-10-19 2019-04-25 Idexx Laboratories, Inc. Detection of symmetrical dimethylarginine
US10745492B1 (en) * 2019-04-03 2020-08-18 Ark Diagnostics, Inc. Antibodies to symmetrically dimethylated arginine analytes and use thereof
US20230243852A1 (en) * 2022-01-26 2023-08-03 Idexx Laboratories, Inc. Methods and compositions for differentiating progressive chronic kidney disease from stable chronic kidney disease

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130280740A1 (en) * 2008-08-07 2013-10-24 Idexx Laboratories, Inc. Methods for Detecting Symmetrical Dimethylarginine
US20140221616A1 (en) * 2012-08-21 2014-08-07 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Haptens of quetiapine

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