ES2936294T3 - Inmunoensayo homogéneo con compensación para señal de fondo - Google Patents

Abstract

Inmunoensayos homogéneos que permiten la compensación de señales de fondo inherentes a muestras y reactivos. El uso de inmunoensayos homogéneos para la detección de la presencia o cantidad de Dimetil Arginina simétrica (SDMA) en muestras biológicas. Reactivos y kits para realizar los ensayos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoensayo homogéneo con compensación para señal de fondo

Campo de la invención

La descripción se refiere en general a los inmunoensayos homogéneos que permiten la compensación de las señales de fondo, inherentes en las muestras y reactivos. En realizaciones particulares, la divulgación se refiere al uso de inmunoensayos homogéneos para la detección de la presencia o cantidad de dimetilarginina simétrica (SDMA) en muestras biológicas.

Antecedentes

Los inmunoensayos homogéneos se han implementado para la determinación de una variedad de analitos, más notablemente analitos para drogas. La SDMA se ha identificado en muestras biológicas como marcador para la evaluación de, por ejemplo, función renal, función cardiovascular y SLE. La SDMA está presente normalmente en muestras biológicas en una concentración relativamente baja en comparación con los analitos para drogas. El documento US2013/280740 divulga un método de detección de SDMA en muestras biológicas usando un anticuerpo específico para SDMA libre y un análogo de SDMA conjugado con un marcador.

Por consiguiente, los inventores han identificado la necesidad en la técnica de inmunoensayos homogéneos más precisos y sensibles, en particular para analitos tal como SDMA que tiene baja concentración en muestras biológicas.

Sumario

La presente invención se define en su sentido más amplio mediante las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la divulgación se refiere a conjugados de dimetilarginina simétrica (SDMA), por ejemplo conjugado de SDMA y una enzima. En un ejemplo de la divulgación, el conjugado es SDMA conjugada con glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH).

En diversas realizaciones, la SDMA y la enzima se conjugan a través de un ligador de 5 a 15 átomos. De manera similar, la SDMA puede conjugarse con la enzima a través de un ligador que tiene una longitud de aproximadamente 5-15 Angstrom. Los conjugados a modo de ejemplo de la divulgación incluyen los siguientes:

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una composición que incluye conjugados de la divulgación y un anticuerpo específico para SDMA libre. En diversas realizaciones, el anticuerpo específico para SDMA libre puede tener reactividad para dimetilarginina asimétrica (ADMA) de menos del 25% de su reactividad para SDMA libre. De manera similar, el anticuerpo puede no tener o sustancialmente no tener reactividad cruzada con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en dimetilarginina asimétrica (ADMA), L-arginina y N-metilarginina.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a kits que incluyen un conjugado de la divulgación y un anticuerpo específico para SDMA.

En diversos aspectos, los kits de la divulgación incluyen reactivos para realizar un ensayo en una muestra que contiene un analito. Los kits pueden incluir los siguientes componentes

(a) primer conjunto de reactivos para realizar un primer ensayo, incluyendo:

i. un primer reactivo que incluye un anticuerpo anti-analito y un sustrato productor de señal para una enzima, y ii. un segundo reactivo que incluye un conjugado del analito y la enzima, y

(b) un segundo conjunto de reactivos para realizar un segundo ensayo, que incluye

i. un tercer reactivo que incluye el sustrato.

En los kits, el segundo conjunto de los reactivos puede incluir además un cuarto reactivo que incluye al menos uno de un diluyente y un tampón. El cuarto reactivo también puede incluir además el conjugado o la enzima. Además, al menos uno de los reactivos en los kits incluye un inhibidor para una enzima diferente a la enzima del conjugado. En una realización, la concentración del conjugado en el primer reactivo es de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 veces más que la concentración del conjugado en el cuarto reactivo. Los kits también pueden incluir un patrón que incluye una cantidad conocida del analito diluido en una disolución de muestra que se ha separado del analito. Por ejemplo, la disolución de muestra que se ha separado del analito puede ser suero separado, plasma separado o una muestra pretratada. El primer reactivo y/o el segundo reactivo puede incluir además un mediador de electrones y un tinte, y el tercer reactivo y/o el cuarto reactivo puede incluir además el mediador y el tinte, en donde el mediador acepta un electrón del sustrato y lo transfiere al tinte.

Aún más, la divulgación se refiere a mezclas de reacción que incluyen los componentes de los kits de la divulgación y una muestra sospechosa de incluir SDMA.

En aún otra realización, la divulgación se refiere a un método para determinar la presencia o cantidad de SDMA libre en una muestra. El método incluye poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-SDMA específico para SDMA libre, el conjugado de la reivindicación 1, y un sustrato que incluye nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), medir la conversión de NAD a NADH, y determinar la presencia o cantidad de SDMA en la muestra basándose en la conversión de NAD a NADH.

En diversas realizaciones de los métodos de la divulgación, la medición de la conversión de NAD a NADH puede incluir medir la velocidad de conversión de NAD a NADH. Por ejemplo, la determinación de la presencia o cantidad de SDMA en la muestra basándose en la conversión de NAD a NADH puede incluir comparar la velocidad de la conversión de NAD a NADH con una curva de calibración, o la medición de la conversión de NAD a NADH puede incluir medir una cantidad de conversión de NAD a NADH. La determinación de la presencia o cantidad de SDMA en la muestra basándose en la conversión de NAD a NADH también puede incluir comparar la cantidad de la conversión de NAD a NADH con una curva de calibración.

En otro aspecto de los métodos de la divulgación, los métodos incluyen las siguientes etapas:

(a) realizar una primera secuencia de reacción de la muestra que incluye:

i. formar una primera mezcla de reacción de la muestra poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo antianalito, un conjugado que incluye el analito y una enzima, y un sustrato que produce una señal cuando está en contacto con la enzima, y

ii. medir la señal de la primera mezcla de reacción de la muestra;

(b) realizar una segunda secuencia de reacción de la muestra que incluye,

i. formar una segunda mezcla de reacción de la muestra poniendo en contacto la muestra con el sustrato, ii. medir la señal de la segunda mezcla de reacción de la muestra;

(c) restar una cantidad de señal de la etapa (b) de una cantidad de señal de la etapa (a) para proporcionar una señal neta,

(d) utilizar la señal neta para determinar la cantidad del analito en la muestra.

Los métodos de la divulgación pueden incluir además las siguientes etapas:

(a) realizar una primera secuencia de reacción del calibrador que incluye:

i. formar las primeras mezclas de reacción del calibrador poniendo en contacto individualmente cada calibrador de un conjunto de calibradores que incluyen cantidades conocidas del analito con un anticuerpo anti-analito, un conjugado que incluye el analito y una enzima, y un sustrato que produce una señal cuando está en contacto con la enzima, y

ii. medir la señal de cada una de las primeras mezclas de reacción del calibrador;

(b) realizar una segunda secuencia de reacción del calibrador que incluye,

i. formar las segundas mezclas de reacción del calibrador poniendo en contacto cada calibrador del conjunto de calibradores con el sustrato, y

ii. medir la señal de las segundas mezclas de reacción del calibrador;

(c) restar una cantidad de la señal de la etapa (a) de una cantidad de señal de la etapa (b) para proporcionar una señal neta para cada uno de los calibradores,

(d) utilizar la señal neta de los dos o más de los calibradores para generar una curva de calibración,

(e) determinar la cantidad del analito en la muestra comparando la señal neta de la muestra con la curva de calibración.

En otras realizaciones del método de la divulgación, los métodos pueden incluir las siguientes etapas:

(a) realizar una primera secuencia de reacción de la muestra que incluye:

i. formar una primera mezcla de reacción de la muestra poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo antianalito, un conjugado que incluye el analito y una enzima, y un sustrato que produce una señal cuando está en contacto con la enzima, y

ii. medir la señal de la primera mezcla de reacción de la muestra;

iii. normalizar una velocidad de reacción para la primera mezcla de reacción de la muestra teniendo en cuenta el fondo asociado con la primera mezcla de reacción de muestra,

(b) realizar una segunda secuencia de reacción de la muestra que incluye,

i. formar una segunda mezcla de reacción de la muestra poniendo en contacto la muestra con el sustrato, ii. medir la señal de la segunda mezcla de reacción de la muestra;

iii. normalizar una velocidad de reacción de la segunda mezcla de reacción de la muestra teniendo en cuenta el fondo asociado con la segunda mezcla de reacción de la muestra,

(c) restar la velocidad normalizada de la etapa (b)(iii) de la velocidad normalizada de la etapa (a)(iii) para proporcionar una velocidad de reacción final para la muestra que contiene el analito,

(d) utilizar la velocidad de reacción final para determinar la cantidad del analito en la muestra.

Los métodos de la divulgación también pueden incluir las siguientes etapas:

(a) realizar una primera secuencia de reacción del calibrador que incluye:

i. formar las primeras mezclas de reacción del calibrador poniendo en contacto individualmente cada calibrador de un conjunto de calibradores que incluyen cantidades conocidas del analito con un anticuerpo anti-analito, un conjugado que incluye el analito y una enzima, y un sustrato que produce una señal cuando está en contacto con la enzima, y

ii. medir la señal de cada una las primeras mezclas de reacción del calibrador;

iii. normalizar una velocidad de reacción de cada una de las primeras mezclas de reacción del calibrador teniendo en cuenta el fondo asociado con cada una de las primeras mezclas de reacción del calibrador,

(b) realizar una segunda secuencia de reacción del calibrador que incluye,

i. formar las segundas mezclas de reacción del calibrador poniendo en contacto cada calibrador del conjunto de calibradores con el sustrato,

ii. medir la señal de las segundas mezclas de reacción del calibrador;

iii. normalizar una velocidad de reacción para cada calibrador en las segundas mezclas de reacción del calibrador teniendo en cuenta el fondo asociado con las segundas mezclas de reacción del calibrador,

(c) restar las velocidades normalizadas de la etapa (b)(iii) de las velocidades normalizadas de la etapa (a)(iii) para proporcionar una velocidad de reacción final para cada uno de los calibradores,

(d) generar una curva de calibración normalizada basándose en la velocidad de reacción final para cada uno de los calibradores,

(e) determinar la cantidad de analito en la muestra comparando la velocidad de reacción normalizada para la muestra con la curva de calibración normalizada.

En diversos aspectos de los métodos de la divulgación, las segundas mezclas de reacción de la muestra y calibrador pueden incluir cualquiera de uno o más de un diluyente, un tampón y un anticuerpo anti-analito. Además, tener en cuenta el fondo asociado con la primera mezcla de reacción de la muestra y/o la primera mezcla de reacción del calibrador puede incluir restar el fondo de cada una de una pluralidad de mediciones de señal asociadas con la determinación de una velocidad de reacción para cada una de las primeras mezclas de reacción de la muestra y/o calibrador. De manera similar, tener en cuenta el fondo asociado con las segundas mezclas de reacción de la muestra y/o calibrador incluye restar el fondo de cada una de una pluralidad de mediciones de señal asociadas con la determinación de una velocidad de reacción para la segunda mezcla de reacción de la muestra y/o cada segunda mezcla de reacción del calibrador.

En los métodos de la divulgación, la muestra puede ser una muestra biológica, tal como suero, plasma, orina o líquido cefalorraquídeo.

En el método de la divulgación, el calibrador incluye el analito diluido en plasma o suero, que incluye por ejemplo un suero o plasma separado. En otra realización, el calibrador puede ser una muestra pretratada.

En aspectos adicionales de los métodos de la divulgación, las segundas mezclas de reacción de la muestra y/o calibrador pueden incluir además el conjugado. Por ejemplo, el conjugado en las primeras mezclas de reacción de la muestra o calibrador pueden estar presentes en aproximadamente 5 a aproximadamente 150 veces más que la concentración del conjugado en las segundas mezclas de reacción de la muestra o calibrador.

Aún más, en otros aspectos de los métodos de la divulgación, cualquiera de las mezclas de reacción puede incluir un inhibidor para una enzima diferente de la enzima del conjugado. Además, cualquieras de las mezclas de reacción puede incluir además un mediador de electrones y tinte, en las que el mediador acepta un electrón del sustrato y lo transfiere al tinte.

En aún otro aspecto, la divulgación se refiere a un método para determinar nefropatía crónica en un animal. El método incluye determinar la presencia o cantidad de SDMA en una muestra biológica de un animal según los métodos de la divulgación, y determinar nefropatía crónica en el animal basándose en la presencia de la cantidad de DMA en la muestra.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra los resultados del ensayo de la divulgación en las muestras de suero humano de una población normal y de pacientes que padecen de nefropatía crónica (CKD).

La figura 2 muestra una representación esquemática de un procedimiento para conjugar SDMA con G6PDH utilizando SIA para activar la G6PDH.

La figura 3 muestra una representación esquemática de un procedimiento para conjugar SDMA con G6PDH utilizando SBAP para activar la G6PDH.

La figura 4 muestra una representación esquemática de un procedimiento para conjugar SDMA con G6PDH utilizando SMCC para activar la G6PDH.

La figura 5 es una representación esquemática de un mecanismo de reacción del mediador-tinte en el que un mediador pasa un electrón a un tinte para reducir el tinte y cambiar la absorbancia del tinte.

La figura 6 muestra una curva de calibración para SDMA enriquecida en sueros humanos, y analizada según el método de la divulgación.

La figura 7 muestra curvas de calibración para SDMA enriquecida en suero humano, y analizada según un método de cálculo fijo y el método de cálculo de velocidad de la divulgación.

La figura 8 muestra los resultados de un ensayo para concentraciones conocidas de SDMA, realizado según la divulgación sin restar la señal de fondo.

Las figuras 9, 10 y 11 muestran los resultados de un ensayo de SDMA según la divulgación utilizando calibradores de suero separados caninos (figura 9), felinos (figura 10) y equinos (figura 11).

La figura 12 muestra los resultados de un ensayo de SDMA según la divulgación utilizando un calibrador a base de tampón.

Descripción

Antes de describir la presente invención con detalle, se definirán varios términos. Tal como se usan en el presente documento, las formas singulares “un/uno”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera.

SDMA es dimetilarginina simétrica. La estructura de la SDMA es:

Mientras que uno o más residuos de aminoácido de SDMA pueden estar presentes en un polipéptido, “SDMA libre” se refiere a SDMA que no es parte de una cadena polipeptídica, incluyendo sales de SDMA.

El término “análogo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a una forma modificada del analito que puede competir con el analito por un receptor, proporcionando la modificación un medio para unir el analito a otro resto, tal como un marcador o soporte sólido. El análogo de analito puede unirse a un anticuerpo de una manera similar al analito.

El término “anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a una glicoproteína producida por células de linfocito B en respuesta a la exposición a un antígeno y se une específicamente a ese antígeno. El término “anticuerpo” se utiliza en su sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo anti-SDMA”, “porción de anticuerpo anti-SDMA” o “fragmento de anticuerpo anti-SDMA” y/o “variante de anticuerpo anti-SDMA” y similares incluyen cualquier proteína o péptido que contenga una molécula que incluya al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero sin limitarse a, una región determinante de complementariedad (CDR) de una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región de entramado, o cualquier porción de las mismas.

El término “fragmento de anticuerpos”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una porción de un anticuerpo de longitud completa, en general el dominio variable o de unión a antígeno del mismo. Específicamente, por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden incluir los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos, anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos de fragmentos de anticuerpos.

El término “antígeno”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a una sustancia que es capaz, en condiciones apropiadas, de reaccionar con un anticuerpo específico para el antígeno.

El término “analito”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a la sustancia, o conjunto de sustancias en una muestra que se detectan y/o se miden.

El término “muestra biológica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a una muestra de tejido o líquido de un humano o animal incluyendo, pero sin limitarse a, sangre completa, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo; líquido linfático, líquido abdominal (ascitis), las secciones externas de la piel, aparatos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, orina, glóbulos sanguíneos, tumores, órganos, tejido, y muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro.

El término “reactividad cruzada” tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a la capacidad de un sitio de unión a antígeno individual de un anticuerpo para reaccionar con más de un determinante antigénico o la capacidad de una población de moléculas de anticuerpo para reaccionar con más de un antígeno. En general, las reacciones cruzadas surgen debido a (i) el antígeno de reacción cruzada comparte un epítopo en común el antígeno de inmunización o (ii) tiene un epítopo que es estructuralmente similar a uno en el antígeno de inmunización (multiespecificidad).

El término “marcador”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición detectables que puede conjugarse directa o indirectamente (por ejemplo, a través de medios covalentes o no covalentes, solos o encapsulados) a un análogo de analito, por ejemplo, un análogo de SDMA. Por ejemplo, un marcador enzimático puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición del sustrato que es detectable. Las enzimas empleadas en la presente divulgación podrían ser, pero no se limitan a: fosfatasa alcalina (AP); glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (“G6PDH”); beta galactosidasa (B GAL); y peroxidasa de rábano picante (HRP), malato deshidrogenasa (MDH). Cualquiera de las relaciones de una enzima, tal como “G6PDH” o “glucosasfosfato deshidrogenasa” en el presente documento, también incluyen variantes, isoformas y mutantes de la enzima, por ejemplo G6PDH que tienen las sustituciones de aminoácidos tal como se describe en el documento US 6.455.288. La utilización de un marcador produce una señal que puede detectarse por medios tal como detección de radiación electromagnética o visualización directa, y puede medirse opcionalmente.

El término “anticuerpo monoclonal”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que incluyen la población son idénticos. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un único sitio antigénico. Al contrario que las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único epítopo en el antígeno. El modificador “monoclonal” se refiere simplemente al carácter del anticuerpo y no va a considerarse o requerirse la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Específicamente, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden fabricarse mediante metodologías de hibridoma, o pueden fabricarse mediante métodos de ADN recombinante, o pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos en fago utilizando técnicas conocidas.

El término “polipéptido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a una molécula que tiene una secuencia de aminoácidos unida por enlaces peptídicos. Este término incluye proteínas, proteínas de fusión, oligopéptidos, péptidos cíclicos y derivados de polipéptidos. Los anticuerpos y derivados de anticuerpos se describieron anteriormente en una sección independiente, pero los anticuerpos y derivados de anticuerpos, son para propósitos de la divulgación, tratados como una subclase de los polipéptidos y derivados de polipéptidos.

“Receptor” se refiere a cualquier compuesto o composición capaz de reconocer una organización espacial y polar particular de una molécula, por ejemplo, sitio epitópico o determinante. Los receptores ilustrativos incluyen anticuerpos, fragmentos Fab, y similares.

“Especificidad de unión” o “unión específica” se refiere al reconocimiento sustancial de una primera molécula por una segunda molécula, por ejemplo un analito, tal como SDMA, y un anticuerpo policlonal o monoclonal, o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo un fragmento Fv, Fv de cadena sencilla, Fab' o F(ab')2) específico para el analito. Por ejemplo, “especificidad”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a la capacidad de un sitio de combinación de anticuerpo individual para reaccionar con sólo un determinante antigénico o la capacidad de una población de moléculas de anticuerpo para reaccionar con sólo un antígeno. En general, existe un alto grado de especificidad en las reacciones de analito-anticuerpo. Los anticuerpos pueden distinguir diferencias en (i) la estructura primaria de un analito, (ii) formas isoméricas de un analito, y (iii) si es aplicable, la estructura secundaria y terciaria de un analito. Las reacciones de anticuerpo-analito que muestran alta especificidad presentan baja reactividad cruzada.

“Unión sustancial” o “se une sustancialmente” se refiere a una cantidad de unión o reconocimiento específicos entre las moléculas en una mezcla de ensayo en condiciones de ensayo particulares. En su aspecto más amplio, la unión sustancial se refiere a la diferencia entre la incapacidad de una primera molécula de unirse o reconocer a una segunda molécula, y la capacidad de la primera molécula para unirse o reconocer a una tercera molécula, de modo que la diferencia es suficiente para permitir que se realice un ensayo significativo para distinguir la unión específica en un conjunto particular de condiciones de ensayo, que incluye las concentraciones relativas de las moléculas y el tiempo y temperatura de una incubación. En otro aspecto, una molécula es sustancialmente incapaz de unirse o reconocer a otra molécula en un sentido de reactividad cruzada donde la primera molécula presenta una reactividad por una segunda molécula que es de menos del 25%, por ejemplo, menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 1% de la reactividad presentada hacia una tercera molécula en un conjunto particular de condiciones de ensayo. La unión específica puede someterse a prueba utilizando varios métodos ampliamente conocidos, por ejemplo, un ensayo inmunohistoquímico, un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunotransferencia de tipo Western.

El término “sal”, tal como se usa en el presente documento, significa una sal formada de un ácido y un grupo funcional básico de un compuesto. Las sales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, ioduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). El término “sal” también se refiere a una sal formada entre un compuesto que tiene un grupo funcional ácido, tal como un grupo funcional ácido carboxílico, y una base inorgánica u orgánica. Las bases adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hidróxidos de metales alcalinos tales como sodio, potasio, y litio; hidróxidos de metal alcalinotérreo tales como calcio y magnesio; hidróxidos de otros metales, tales como aluminio y zinc; amoniaco y aminas orgánicas, tales como mono-, bis-, o trialquilaminas no sustituidas o sustituidas con hidroxilo; diciclohexilamina; tributilamina; piridina; N-metil-N-etilamina; dietilamina; trietilamina; mono-, bis-, o tris-(2-hidroxi-alquilaminas inferiores), tales como mono-, bis-, o tris-(2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-terc-butilamina o tris-(hidroximetil)metilamina, N,N-di-alquil inferior-N-(hidroxi-alquil inferior)-aminas, tales como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina, o tri-(2-hidroxietil)amina; N-metil-D-glucamina; y aminoácidos tales como arginina, lisina, y similares.

Volviendo ahora a la divulgación, en general, la divulgación se refiere a la inmunodetección de analitos en muestras de una manera que aborda la señal de fondo asociada con los componentes de muestra y reactivo diferentes al analito. Por ejemplo, los componentes de muestra diferentes del analito pueden reaccionar entre sí o con componentes de los reactivos para los ensayos. Tales reacciones pueden conducir a interferencia con la precisión del método de detección. Las muestras biológicas son conocidas por incluir muchos componentes que pueden crear ruido de fondo en los ensayos.

Las muestras pueden analizarse utilizando un ensayo modificado basándose en el sistema de inmunoensayo homogéneo EMIT® (técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas). En un ensayo EMIT® tradicional, una muestra que contiene el analito se pone en contacto con un anticuerpo anti-analito, un conjugado del analito y una enzima, y un sustrato que produce una señal cuando está en contacto con la enzima. La unión del anticuerpo al conjugado inhibe o reduce la actividad enzimática. Cuando el analito está presente en la muestra, el analito de muestra compite con el analito de conjugado por la unión al anticuerpo, que da como resultado la generación de más señales de la enzima/sustrato. Cuando ningún analito está presente, puede producirse más unión entre el anticuerpo y el conjugado para limitar o prevenir la generación de señal. Por tanto, se genera más señal cuando está presente más analito. Los ensayos cinéticos pueden utilizar la velocidad de generación de señal como un indicador de la presencia o cantidad del analito en una muestra.

En un aspecto de la divulgación, el formato de ensayo EMIT® tradicional se lleva a cabo en una primera secuencia de reacción para tanto el analito como para los calibradores. Por conveniencia, esta primera secuencia de reacción puede identificarse en el presente documento como el “ensayo de color”. Luego, en el ensayo modificado de la divulgación, se realiza un segundo ensayo independiente en una segunda secuencia de reacción para la muestra y los calibradores. Por conveniencia, la segunda secuencia de reacción puede identificarse en el presente documento como el “ensayo en blanco”. Los reactivos del ensayo en blanco no contienen anticuerpo anti-analito y no contienen normalmente conjugado. Por tanto, el ensayo en blanco proporciona una señal de fondo dependiente de la muestra.

En diversos aspectos, la divulgación se refiere al uso de la señal en dos métodos de ejemplo para determinar la concentración de un analito. Por conveniencia, los métodos de ejemplo se denominan en el presente documento método de “velocidad” y método “fijo”. En ambos métodos, se utiliza la diferencia entre una cantidad de señal o señales en los ensayos de color y en blanco. En un aspecto, la señal se mide como absorbancia a una longitud de onda específica para un sistema de enzima/sustrato tal como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, la medición de la absorbancia a 340 nm para un sistema de enzima/sustrato G6PDH/NAD proporcionará un valor para la cantidad relativa de conversión de NAD a NADH en presencia de G6PDH. El valor puede utilizarse para proporcionar una señal neta (para el método fijo) o una velocidad de reacción (para el método de velocidad) que refleja la conversión del sustrato por la enzima. Como una alternativa, la reacción de enzima-sustrato puede utilizarse junto con un portador de electrones que media la transferencia de electrones entre el sustrato y diversos aceptores de electrones (por ejemplo, un tinte) que permitirá la medición de la velocidad de reacción en una longitud de onda diferente que la del sustrato.

En el método fijo, se calcula una señal neta. En una realización, la seña neta se basa en la diferencia en la señal (por ejemplo, absorbancia) entre los ensayos de color y en blanco en un punto final predeterminado, que puede o no ser la terminación de la reacción por el agotamiento de todo el sustrato. La cantidad de la diferencia en la señal medida en el punto final de los ensayos en blanco y de color pueden utilizarse para proporcionar una señal neta (por ejemplo, señal neta = [cantidad de señal de color] -[cantidad de señal en blanco]). De manera alternativa, la diferencia en la cantidad de señal entre un punto de partida predeterminado T1) (que puede ser en la terminación de la combinación de todos los reactivos u otro tiempo predeterminado después de eso) y el punto final predeterminado (T2) puede determinarse para tanto los ensayos de color como en blanco. La diferencia en la cantidad de señales de estas determinaciones entonces puede utilizarse luego para determinar la señal neta (por ejemplo, señal neta = ([color en T2] -[color en T1]) -([blanco en T2] -[blanco en T1)). La señal neta puede compararse con una curva de calibración para determinar la cantidad de analito en la muestra.

Cuando la señal neta se calcula basándose en una medición individual de cada uno de los ensayos de color y en blanco, las mediciones pueden tomarse después de que los reactivos han tenido un tiempo suficiente para reaccionar. Por ejemplo, la medición individual en cada ensayo puede tomarse en aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 10 minutos después de la combinación de todos los reactivos. De manera más particular, la medición individual puede tomarse en uno de 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450, 480, 510, 540, 570 y 600 segundos después de la combinación de todos los reactivos. Cuando las dos señales se miden en cada uno de los ensayos en blanco y de color, la primera medición (T1) se toma después de aproximadamente 15 segundos a dos minutos desde el inicio del ensayo (combinación de la muestra y todos los reactivos). Esto puede ajustarse basándose en la concentración de reactivos y la concentración inesperada de la muestra. En particular, T1 puede ser 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 ó 120 segundos después de la combinación de todos los reactivos. La segunda medición (T2) puede tomarse desde 15 segundos hasta varios minutos después de T1. Por ejemplo, T2 puede ser por ejemplo, 15 segundos, 18 segundos, 30 segundos, 45 segundos o 1, 2, 3, 4 ó 5 minutos, después de la primera medición (T1).

En el método de velocidad, la señal del ensayo en blanco se resta de la señal del ensayo de color a intervalos definidos para proporcionar una velocidad de reacción. Las velocidades de reacción de los calibradores se utilizan para proporcionar una curva de calibración que puede utilizarse para determinar la cantidad de analito en la muestra comparando la curva con la velocidad de reacción del ensayo en la muestra con la curva de calibración.

En el método de velocidad, la velocidad de reacción puede determinarse midiendo la señal (por ejemplo absorbancia) en una pluralidad de puntos de tiempo durante la reacción mediada por enzimas. La determinación del tiempo e intervalo de la medición de señal está dentro de la experiencia en la técnica teniendo en cuenta la concentración de los reactivos y la temperatura del ensayo. Por ejemplo, una velocidad puede determinarse midiendo la absorbancia que comienza aproximadamente 2-10 minutos después de la combinación de la muestra (o calibrador) y todos los reactivos a temperatura ambiente y se mide cada 5-60 segundos durante 1-15 minutos adicionales. La velocidad de reacción puede expresarse como el cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la absorbancia puede medirse comenzando a aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 minutos después de combinar la muestra (o calibrador) y todos los reactivos. La absorbancia se mide normalmente en intervalos de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ó 60 segundos durante aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 minutos. Cada uno de estos tiempos puede extenderse o acortarse, dependiendo de las condiciones de reacción, analito y reactivos.

En ya sea los métodos fijos o de velocidad, el fondo de la primera mezcla de reacción de la muestra puede tenerse en cuenta en el cálculo de la señal neta o la velocidad de reacción para proporcionar una señal normalizada. En una realización, la absorbancia de fondo se mide de una matriz de calibrador utilizada en lugar de la muestra. La absorbancia de la matriz de calibrador se mide inicialmente tras la combinación de todos los reactivos con la matriz, o en un tiempo finito después de eso. La matriz de calibrador puede ser una mezcla de calibrador o control que carece de cualquier analito. Por ejemplo, una matriz de calibrador que carece de analito puede ser la muestra que se ha separado del analito mediante diálisis o mediante otro procedimiento de pretratamiento tal como se describe adicionalmente en el presente documento. En una realización, las especies separadas o endógenas específicas o no específicas de suero, plasma u otro líquido biológico pueden utilizarse como la matriz de calibración. En otras realizaciones tal como se describe adicionalmente en el presente documento, la matriz de calibrador puede ser agua o un diluyente que contiene proteínas y/u otras composiciones (por ejemplo, BSA en PBS). La matriz de calibrador se utiliza en lugar de la muestra tanto en el ensayo de color como el ensayo en blanco para proporcionar una señal de fondo para ambos ensayos.

Si se ha determinado el fondo, luego se resta el fondo de la señal neta en el método fijo (o mediciones en T1 y T2) o de cada medición utilizada para determinar la velocidad de reacción de la muestra en el método de velocidad. Como un ejemplo, en el método de velocidad, la absorbancia de la matriz de calibrador (con reactivos) se resta de cada medición de absorbancia que se utiliza para determinar la velocidad de reacción para la muestra (es decir, el cambio en la absorbancia a lo largo del tiempo). En otro aspecto, la velocidad de fondo se determina de una manera similar a la velocidad de reacción de la muestra. Luego se resta la velocidad de fondo de la velocidad de reacción de la muestra para proporcionar una velocidad de reacción normalizada para la primera mezcla de reacción de la muestra. Por consiguiente, la divulgación se refiere a métodos para realizar un ensayo para un analito. El método incluye realizar el ensayo de color en la muestra (primera secuencia de reacción de la muestra) formando una primera mezcla de reacción de la muestra que incluye la muestra, un anticuerpo anti-analito, un conjugado que incluye el analito y una enzima, y un sustrato que produce una señal cuando está en contacto con la enzima. Normalmente, la primera mezcla de reacción de la muestra se forma primero poniendo contacto la muestra con el anticuerpo y el sustrato, y luego en una segunda etapa añadiendo el conjugado. Sin embargo, en primer lugar la muestra puede combinarse con el anticuerpo y el conjugado, y el sustrato se añade en una segunda etapa. En un aspecto, la enzima y el conjugado se mantienen separados hasta que la secuencia de reacción esté lista para comenzar. “Poner en contacto” tal como se usa en el presente documento se utiliza en su aspecto más amplio para referirse a combinar reactivos en cualquier orden a menos que se especifique de otra manera en el presente documento. Una vez que la primera mezcla de reacción de la muestra se ha formado, puede medirse una cantidad de señal de la mezcla inmediatamente o en uno o más tiempos predeterminados después de eso para el uso en los métodos fijos o de velocidad de la divulgación.

En los métodos fijos y de velocidad modificados de la divulgación, una secuencia de ensayo independiente (segunda secuencia de reacción de la muestra o “ensayo en blanco”) se realiza de una manera similar a la primera secuencia de reacción de la muestra. Sin embargo, los reactivos de la segunda secuencia de reacción de la muestra no contienen anticuerpo anti-analito. Normalmente, los reactivos del ensayo en blanco no contienen conjugado, pero se describen en el presente documento realizaciones donde se añade una pequeña cantidad de conjugado o enzima. En particular, una segunda muestra de reacción de la muestra se forma poniendo en contacto la muestra con el sustrato y, en algunos casos, el conjugado pero no un anticuerpo anti-analito. La señal se mide a partir de la segunda mezcla de reacción de la muestra. La señal neta o velocidad de reacción que utiliza el fondo de la matriz de calibrador se determina de una manera idéntica a la primera secuencia de reacción de la muestra para proporcionar una señal neta normalizada o una velocidad de reacción normalizada para la segunda secuencia de reacción de la muestra.

En el método de velocidad, para proporcionar una velocidad de reacción final para la muestra, la velocidad normalizada de la segunda secuencia de reacción de la muestra se resta de la velocidad de reacción normalizada de la primera secuencia de reacción de la muestra. La velocidad de reacción final puede utilizarse para determinar la presencia o cantidad del analito en la muestra. Normalmente, esto se hace comparando la velocidad de reacción final para la muestra con una curva de calibración, que puede prepararse según los métodos conocidos en la técnica.

Los ensayos de color y en blanco para los calibradores pueden realizarse de una manera similar a los ensayos de color y en blanco para la muestra. Por consiguiente, se realiza una serie de primeras secuencias de reacción del calibrador (ensayos de color) formando las primeras mezclas de reacción del calibrador poniendo en contacto individualmente cada calibrados de un conjunto de calibradores incluyendo las cantidades conocidas del analito con un anticuerpo anti-analito, un conjugado que incluye el analito y una enzima, y un sustrato que produce una señal cuando está en contacto con la enzima. La señal se mide a partir de cada una de las primeras mezclas de reacción del calibrador y una señal neta normalizada (método fijo) o velocidad de reacción normalizada (método de velocidad) para cada una de las primeras mezclas de reacción del calibrador que se genera teniendo en cuenta el fondo asociado con cada una de las primeras mezclas de reacción del calibrador de la manera descrita anteriormente para las primeras mezclas de reacción de la muestra. Uno de los calibradores puede ser la matriz de calibrador (que no contiene analito) que se utiliza para determinar el fondo.

En una serie de reacciones independientes (ensayos en blanco), la segunda secuencia de reacción de calibrador se realiza formando las segundas mezclas de reacción del calibrador poniendo en contacto cada calibrador del conjunto de calibradores con el sustrato en ausencia del anticuerpo anti-analito y, normalmente, el conjugado. En algunos casos, el conjugado también puede estar presente, habitualmente en una pequeña cantidad tal como se describe adicionalmente en el presente documento. La señal se mide para cada una de las segundas mezclas de reacción del calibrador, y la señal neta o velocidad de reacción para cada mezcla se normaliza teniendo en cuenta el fondo asociado con las segundas mezclas de reacción del calibrador de la manera descrita anteriormente.

Por consiguiente, al tener en cuenta la señal de fondo en el método fijo, la señal neta normalizada del ensayo en blanco se resta de una señal neta normalizada del ensayo de color. En el método de velocidad, se determina una velocidad de reacción final para cada uno de los calibradores restando la velocidad normalizada de los calibradores en las segundas secuencias de reacción del calibrador de la velocidad normalizada para cada uno de los calibradores en las primeras secuencias de reacción del calibrador. Luego puede prepararse una curva de calibración normalizada basándose en la velocidad de reacción final para cada uno de los calibradores y utilizarse para determinar la cantidad del analito en la muestra comparando la velocidad de reacción normalizada para la muestra con la curva de calibración normalizada.

En una realización, los reactivos asociados con el ensayo de color y los ensayos en blanco se muestran en la tabla 1. Los reactivos se combinan en el diluyente y/o tampones apropiados. Tal como se muestra en la tabla 1, el reactivo 2 (R2) del ensayo en blanco no contiene el conjugado, aunque puede estar presente tal como se describe adicionalmente en el presente documento para asegurar que la reacción tenga el volumen apropiado de tampón. En algunos aspectos, el R1 del ensayo en blanco puede tener volumen extra en caso de que no se utilice el R2 del ensayo en blanco. En una realización, los reactivos para el ensayo de color son idénticos a los reactivos para el ensayo en blanco excepto por la presencia o ausencia del anticuerpo y conjugado. Cuando R2 no contiene ningún conjugado en el ensayo en blanco, todavía contiene el diluyente, tampón y otros componentes de R2 para el ensayo de color.

Tabla 1

En algunas realizaciones, el R1 del ensayo en blanco también puede contener el anticuerpo anti-analito.

Puede esperarse habitualmente que los calibradores y las muestras de prueba en el ensayo de color produzcan un aumento en la absorbancia debido al conjugado analito-enzima que se añade a la mezcla de reacción. Muchas muestras también producen una reacción positiva cuando se somete a prueba en el ensayo en blanco debido a que las enzimas endógenas reactivas con los sustratos endógenos o con el sustrato de R1 producirán un aumento en la absorbancia aún sin conjugado presente. Frecuentemente, sin embargo, las muestras y calibradores se diluyen hasta el punto de que una señal de fondo habitualmente pequeña se debilita además de modo que las mezclas de reacción producirán poco o nada de cambio en la absorbancia cuando se someten a prueba en el ensayo en blanco. Debido a que el cambio de absorbancia puede estar por debajo del intervalo de sensibilidad de un detector, puede conducir a un fallo de la curva de calibración en los analizadores automatizados.

A fin de evitar este problema, la enzima o conjugado analito-enzima puede añadirse a los ensayos en blanco para asegurar que se produzca un cambio positivo pequeño en la absorbancia (sin considerar el comportamiento del calibrador o la muestra). Por consiguiente, la tabla 2 muestra los reactivos presentes en esta realización.

Tabla 2

La concentración de la enzima o conjugado en R2 se mantiene normalmente baja para impedir el ruido innecesario en el ensayo para la matriz de calibración. Por ejemplo, cuando la enzima es G6PDH, puede añadirse aproximadamente 1-15 ng/ml de la enzima (ya sea conjugada o no conjugada) al ensayo en blanco. En particular, pueden añadirse aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 ng/ml. La cantidad del conjugado en R2 depende del tamaño del analito, ya que los analitos más grandes requerirán mayores cantidades de conjugado para proporcionar la misma cantidad de enzima. En una realización, la concentración de la enzima (ya sea sola o conjugada) en R2 para el ensayo de color es de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 veces más que la concentración de la enzima en R2 para el ensayo en blanco. En diversas realizaciones, la concentración del conjugado en el ensayo de color es 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 y 150 veces más que la concentración de la enzima en los reactivos para el ensayo en blanco. Cuando se conjuga, la actividad de la enzima es normalmente menor que la de la enzima no conjugada. Por ejemplo, la actividad de la enzima conjugada varía ampliamente de la actividad de la enzima no conjugada, por ejemplo la actividad de la enzima conjugada es del 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80% ó el 90% de la enzima no conjugada. Por tanto, cuando la enzima no conjugada se utiliza en R2 para el ensayo en blanco, puede utilizarse en menor cantidad que si se conjugara y todavía proporciona la misma actividad que la enzima conjugada.

El sustrato o sustratos cuando la enzima tiene más de un sustrato, pueden estar presentes en los reactivos en exceso.

En algunos aspectos, los reactivos de ensayo pueden incluir estabilizadores para los reactivos de ensayo. Por ejemplo, cuando la enzima productora de señal sea glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH), glucosa-6-fosfato (G6P) o NAD, puede añadirse al conjugado que contiene reactivo para estabilizar el conjugado enzima-analito. El suero contiene varias enzimas que pueden contribuir al fondo. Por tanto, la adición de los inhibidores de enzimas específicos a los diluyentes de reactivo puede mejorar adicionalmente la precisión del ensayo. Los inhibidores ayudan a eliminar una parte del ruido de interferencia en los ensayos de color y en blanco. Por consiguiente, en diversos aspectos, los componentes de reacción pueden incluir inhibidores de enzimas endógenas de muestra. Por ejemplo, el oxamato de sodio es un inhibidor conocido de lactato-deshidrogenasa (LDH), que es una enzima de NAD y/o NADP. El oxamato de sodio impide la señal de fondo asociada con la LDH endógena de muestra impidiendo que la LDH se cambie a NAD en la muestra que puede ser parte del sistema de enzima-sustrato asociado con el ensayo (por ejemplo, G6PDH/NAD). Se conocen más de una treintena de combinaciones de enzima e inhibidores de enzima en suero y están disponibles inhibidores para muchas de ellas.

En un aspecto, los calibradores incluyen cantidades conocidas del analito (o ninguna para la matriz de calibrador) en agua desionizada o disolución salina para proporcionar la matriz de calibración que se utiliza en lugar de la muestra. En otros aspectos, se utiliza suero separado en lugar de agua o disolución salina. El suero dializado es suero o plasma específico o no específico de especies del que se ha separado el analito en, por ejemplo, un procedimiento de diálisis. Numerosos otros procedimientos de pretratamiento de muestra son conocidos por retirar o inactivar el analito. En cada una de estas realizaciones, las disoluciones se enriquecen con cantidades conocidas del analito para proporcionar una serie de calibradores sobre el intervalo esperado de concentración del analito en la muestra. En aún otra realización, las disoluciones de calibración son una disolución a base de proteínas tal como el 1-7% de BSA en PBS. En esta realización, puede requerirse calibrar los calibradores de BSA con respecto a los calibradores de suero separados y enriquecidos.

Normalmente, debido a que se propone que el ensayo en blanco compense las proteínas endógenas, las enzimas u otros componentes de molécula grande que contribuyen a la señal de fondo, agua o disolución salina son más adecuadas para las muestras no biológicas, aunque puede obtenerse especificidad suficiente con el uso del agua o disolución salina como disolución de calibrador para las muestras biológicas en muchos casos. También, el uso de agua o tampón salino para la matriz de calibrador en los analizadores automatizados puede tener la tendencia de crear un mensaje de error para la matriz de calibrador debido a que la velocidad de reacción asociada con el uso del tampón pueda dar por resultado velocidades de reacción significativamente aumentadas en comparación con el suero. En esta situación, la resta del valor de absorbancia de la matriz de calibración podría dar como resultado una velocidad negativa. Mientras que estas velocidades pueden normalizarse frente a las matrices de calibrador basadas en suero, los analizadores automatizados crearán normalmente un mensaje de error en esta situación.

Según una realización de la divulgación, el analito es SDMA y el sistema de enzima-conjugado es G6PDH/NAD. En esta realización, un análogo de SDMA se conjuga con G6PDH y se utiliza como el conjugado en los ensayos de color y en blanco para determinar la presencia o cantidad de SDM^a en las muestras de suero o plasma de animales tal como humanos, gatos y perros. En un aspecto de esta realización, se preparan calibradores combinando cantidades conocidas de SDMA con la matriz de calibrador (suero o plasma separado). Los ensayos de Color y en blanco se realizan tal como se describió anteriormente utilizando los siguientes reactivos en cantidades a modo de ejemplo tal como se describe en la tabla 3:

Tabla 3

____________

En particular, el anticuerpo anti-SDMA puede tener una concentración en R1 del ensayo de color de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 ug/ml, por ejemplo, de aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 ug/ml. En R1 del ensayo de color o el ensayo en blanco, G6P y NAD pueden tener una concentración de aproximadamente 8­ 75 mM, de manera más particular de aproximadamente 10-65 mM, o aproximadamente 20-55 mM, y de manera más particular de aproximadamente 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ,45, 50, 55, 60, 65, 70 mM. En R2 del ensayo de color, el conjugado SDMA-G6PHD puede tener una concentración de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,75 ug/ml, de manera más particular de aproximadamente 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,65, 0,70 ó 0,75 ug/ml. En R2 del ensayo en blanco, la concentración del conjugado puede ser de aproximadamente 5-30 ng/ml, de manera más particular de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25 ó 30 ng/ml.

G6P está presente en los reactivos R2 para estabilizar la enzima. De manera alternativa, podría utilizarse NAD. El sustrato de estabilización es opcional.

Los reactivos pueden combinarse con la muestra y los calibradores en los siguientes volúmenes para los ensayos de color y en blanco, aunque los volúmenes pueden ajustarse para adaptar diferentes analitos y condiciones de reacción:

Muestra: 5-20 ul

R1: 20-60 |il

R2: 20-150 |il

En una realización particular, la mezcla de reacción contiene 10 |il de muestra, 40 |il de R1 y 125 |il de R2.

Utilizando los reactivos anteriores en los ensayos de color y en blanco, puede prepararse una curva de calibración y utilizarse para determinar la presencia o cantidad de SDMA en las muestras de suero o plasma. La figura 1 muestra los resultados utilizando el método de velocidad para la determinación de SDMA en muestras de suero humano normales o con nefropatía crónica con un analizador de bioquímica clínica AU680® de Beckman. Los resultados muestran la determinación precisa de la concentración de SDMa cuando se compara con los valores de CL-EM de un método de referencia. Se utilizó suero humano (no separado) como matriz de calibrador. Por consiguiente, la divulgación se refiere a un método de determinación de nefropatía crónica en animales, incluyendo humanos, y, por ejemplo, animales domésticos, de granja y de zoológico. El método incluye determinar la concentración de SDMa en una muestra biológica de un sujeto animal según un método de la divulgación y comparar la concentración con una curva de calibración u otro modelo con la cantidad de SDMA en las muestras de la misma especie que el sujeto en sujetos sanos y un sujeto que padece nefropatía crónica.

En una realización, la divulgación se refiere a un kit que contiene reactivos para determinar la presencia o cantidad de analitos en las muestras. Por ejemplo, el kit puede incluir un primer conjunto de reactivos para realizar el ensayo de color, tal como un primer reactivo que incluye un anticuerpo anti-analito y un sustrato productor de señal para una enzima, y un segundo reactivo que incluye un conjugado de analito y enzima. El kit también puede incluir un segundo conjunto de reactivos que incluye un tercer reactivo que contiene el sustrato. El segundo conjunto de reactivos también puede incluir un cuarto reactivo que contiene el tampón/diluyente, y opcionalmente el conjugado. El propósito del cuarto reactivo que contiene sólo el tampón/diluyente es asegurar que la reacción asociada con el segundo conjunto de reactivos se produzca en el volumen apropiado. Cuando el segundo conjunto de reactivos no incluye el cuarto reactivo, el volumen del tercer reactivo debe ajustarse en consecuencia. Además, ya sea el tercer o cuarto reactivo puede contener el anticuerpo anti-analito.

Las concentraciones y cantidades de los componentes en cada reactivo pueden ser tal como se describió anteriormente para R1 y R2 en cada uno de los ensayos de color y en blanco. Por ejemplo, la concentración del conjugado en el primer reactivo es de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 veces más que la concentración del conjugado en el cuarto reactivo. En un aspecto, al menos uno de los reactivos en el kit incluye un inhibidor para una enzima diferente a la enzima del conjugado. El kit también puede incluir un patrón o conjunto de patrones (calibradores) que incluye una cantidad conocida del analito diluido en un diluyente apropiado, tal como agua, disolución salina, o suero o plasma separado o procesado (por ejemplo, una muestra pretratada).

Cuando el analito es SDMA, un kit a modo de ejemplo incluye en el primer reactivo un anticuerpo anti-SDMA (policlonal o monoclonal) y sustrato(s) tal como NAD y G6P. El segundo reactivo incluye un conjugado de un análogo de SDMA y G6PDh como estabilizador para la enzima. El tercer reactivo incluye el conjugado SDMA-G6PDH y, opcionalmente un cuarto reactivo. El cuarto reactivo puede contener sólo diluyente o tampón, o puede contener el conjugado.

Además de los kits, la divulgación se refiere a una mezcla de reacción que incluye reactivos de los kits y una muestra sospechosa de contener SDMA. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede incluir la muestra o el calibrador, el anticuerpo anti-SDMA, el conjugado SDMA-G6PDH, NAD y G6P.

En cada uno de los kits, métodos y mezclas de reacción de la divulgación, pueden utilizarse varios sistemas de enzima/sustratos en lugar de G6PDH/NAD. Como otro ejemplo, la malato-deshidrogenasa es una enzima que cataliza la oxidación del malato a oxaloacetato utilizando la reducción de NAD+ a NADH similar a G6PDH. Además, se sabe que muchos mutantes de enzimas mejoran la señal o estabilidad de las enzimas. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense 6.455.288.

Los conjugados analito-enzima pueden prepararse mediante una variedad de métodos conocidos. La selección de los métodos y los reactivos empleados puede proporcionar ligadores de diversas longitudes entre el analito y la enzima. La longitud del ligador puede tener un efecto sobre la capacidad del anticuerpo para inhibir la actividad enzimática y por tanto de afectar la sensibilidad del ensayo. Normalmente, los ligadores pueden tener aproximadamente 5-15 átomos, o 2-20 Angstrom. En la presente invención se conjuga SDMA con G6PDH a través de un ligador que tiene una longitud de 5, 6, 7, 8 ó 9 átomos. La conjugación de las enzimas con analitos está dentro de la experiencia en la técnica para muchos analitos que pueden detectarse según la divulgación.

Por ejemplo, la figura 2 muestra la conjugación del análogo de SDMA de fórmula 1 (abajo) con la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). La G6PDH se activa con yodoacetato de succinimidilo (SIA) antes de la conjugación. La activación con SIA da como resultado un ligador de cinco átomos entre la SDMA y la enzima (-C-C-S-C-C(O)-), que no incluye el nitrógeno no nativo en la SDMA que resulta del reemplazo de oxígeno con nitrógeno durante la derivatización de SDMA.

La figura 3 muestra la conjugación del análogo de SDMA de fórmula 1 con G6PDH utilizando 3-(bromoacetamido)propionato de succinimidilo (SBAP) que da como resultado un ligador de nueve átomos (sin contar el nitrógeno no nativo) (-C-C-S-C-C(O)-N-C-C-C(O)-).

La figura 4 muestra la conjugación del análogo de SDMA de fórmula 1 con G6PDH utilizando el 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (SMCC) que da como resultado un ligador de doce átomos.

La longitud del ligador puede ajustarse modificando la G6PDH con otros reactivos o utilizando otros análogos de SDMA en la reacción de conjugación para proporcionar longitudes del ligador de, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 átomos, en particular de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 átomos. Por consiguiente, la divulgación se refiere a un conjugado de SDMA y una enzima a través de un ligador de 5-15 átomos, que no es parte de la invención, cuyos ligadores incluyen sólo aquellos átomos en directamente una cadena del ligador a través de la ruta más corta que excluye cualquiera de los átomos de las cadenas laterales, sustituyentes, o anillo en la molécula de ligador que no son parte de la ruta más corta entre la SDMA y la enzima. Las longitudes del ligador pueden variar de aproximadamente 2 Angstrom a aproximadamente 20 Angstrom, en particular de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 Angstrom, de manera más particular de aproximadamente 6-10 Angstrom.

En una realización, la SDMA se conjuga con G6PDH en presencia de sustratos de G6PDH glucosa-6-fosfato (G6P) y/o nicotinamida adenina dinucleótido (NADH). La actividad del conjugado-enzima óptima y la inhibición de esa actividad por el anticuerpo puede obtenerse ajustando las razones de la enzima, sustratos y SDMA.

Varios análogos de SDMA que son apropiados para conjugación con G6PDH se describen en la patente estadounidense n.° 8.481.690. Dependiendo de la longitud deseada del ligador entre la SDMA y la G6PDH, puede utilizarse uno de los siguientes análogos:

en las que x e y son números enteros que oscilan entre 1 y 5.

Las fórmulas A, B y C proporcionan un tiol disponible que puede reaccionar con una diana de conjugación que incluye un “sitio reactivo a tiol” apropiado, es decir, un sitio que reaccionará con un grupo tiol. Por ejemplo, las maleimidas, haluros de alquilo y arilo, y alfa-haloacilos son ilustrativos de los sitios reactivos a tiol que pueden reaccionar con tioles para formar tio-éteres. De manera similar, los disulfuros de piridilo pueden reaccionar con tioles para formar disulfuros mixtos. La G6PDH activada con SIA, SBAP o SMCC proporciona un sitio reactivo a tiol apropiado. Cuando X=1, la conjugación de fórmula A con G6PDH activada con SIA proporciona un ligador de cinco átomos entre la SDMA y G6PD^h . La conjugación de fórmula A (X=1) con SMCC da como resultado un ligador de doce átomos. Otras longitudes del ligador pueden obtenerse variando X.

En una realización particular cuando X=1, el análogo de SDMA tiene la siguiente fórmula (fórmula 1):

La fórmula 1 puede prepararse a partir de SDMA (disponible comercialmente de EMD Chemicals Inc. de Gibbstown, NJ) mediante el siguiente esquema de síntesis ilustrativo (1):

Los grupos aminos primarios y secundarios de SDMA se protegen haciendo reaccionar la SDMA con di-terc-butildicarbonato (Boc20). Luego se une la SDMA protegida con ferc-butoxicarbonilo (BOC) resultante ((Boc3)-SDMA, 1) a una resina. Por ejemplo, (Boc3)-SDMA (1) puede unirse a una resina de cisteamina-4-metoxitritilo (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) poniendo en contacto la (Boc3)-SDMA (1) con la resina en presencia de metanamininio de hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uranio (HATU) y N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) en dimetilformamida (DMF) para proporcionar (Boc3)-SDMA-cistamida unida a resina (2). Se retiran los grupos protectores BOC en (Boc3)-SDMA-cistamida unida a resina (2) y la SDMA-cistamida unida a resina se escinde de la resina utilizando, por ejemplo, ácido trifluoroacético en diclorometano, para proporcionar SDMA-cistamida (3), que se convirtió en la sal de clorhidrato (4) mediante reacción con ácido clorhídrico.

Los ensayos EMIT® tradicionales miden la acumulación de NADH (o NADPH) monitorizando la absorbancia a 340 nm. En otra realización de la divulgación, la adición de un tinte que cambie de color y un mediador de electrones a los reactivos puede permitir que la absorbancia se mida en una absorbancia diferente a 340 nm. En un ejemplo particular, el tinte es bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) y el mediador es metosulfato de 1-metoxifenacina (PMS). Tal como se representa en la figura 5, la PMS toma un electrón de NADP y lo transfiere al MTT, que reduce el MTT para proporcionar la absorbancia a aproximadamente 650 nm.

Los anticuerpos anti-SDMA pueden ser policlonales o monoclonales tal como se describe en la patente estadounidense n.° 8.481.690. Métodos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales dentro de la experiencia en la técnica. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido contra un conjugado SDMA-KLH que tiene la siguiente estructura:

En diversos aspectos, los anticuerpos anti-SDMA utilizados en el ensayo modificado de la divulgación pueden tener alta especificidad para SDMA y nada o sustancialmente nada de reactividad cruzada con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en dimetilarginina asimétrica (ADMA), L-arginina y N-metilarginina. Por ejemplo, el anticuerpo anti-SDMA presenta una reactividad para ADMA, L-arginina y N-metilarginina que es de menos del 25%, menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, o menos del 1% de la reactividad presentada hacia SDMA en un conjunto particular de condiciones de ensayo.

Todos los componentes descritos anteriormente pueden utilizarse en un método para determinar la presencia o cantidad de SDMA libre en una muestra. Por ejemplo, el método incluye poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-SDMA, un conjugado que incluye SDM^a y G6PDH, y sustrato(s) que incluyen NAD y G6P. Tal como se describe en el presente documento la velocidad de conversión de NAD a NADh , se mide y se compara con una curva de calibración para determinar la presencia o cantidad de SDMA en la muestra. La SDMA se conjuga con la G6PDH con un ligador de 5-15 átomos (2-10 Angstrom) tal como se describe en el presente documento. El anticuerpo anti-SDMA puede ser un anticuerpo monoclonal que no tiene reactividad o sustancialmente nada de reactividad para ADMA, L-arginina y N-metilarginina.

En aún otra realización, la divulgación se refiere a un método para determinar SDMA en una muestra que incluye derivatizar SDMA libre y utilizar un anticuerpo dirigido al derivado. Por ejemplo, la publicación de patente estadounidense 2004/0214252 describe un método para la modificación de los nitrógenos de guanidino de SDMA y los anticuerpos con respecto a la SDMA modificada. Por consiguiente, en una realización, la SDMA en una muestra se modifica antes de la determinación en el método según la divulgación en el presente documento. En esta realización, el anticuerpo anti-SDMA debe unirse tanto a la SDMA modificada como a la SDMA del conjugado, que también puede modificarse, con suficiente afinidad para proporcionar un ensayo adecuado.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de suero separado

Se cargó suero canino comercial no tratado (500 ml) a un tubo de diálisis SNAKESKINTM de dos pies (MWCO de 3,5 K, D.I. seco de 35 mm)(Thermo Scientific) y se dializó contra tampón de PBS (20 l) con 20 g de polvo de carbono a 4°C durante al menos seis horas. Se repitió el procedimiento tres veces cambiando el tampón y el carbono.

Se midió la concentración de SDMA en el suero mediante CL/EM antes y después de la diálisis. En el suero antes de la diálisis, la SDMA era de 9,89 |ig/dl. Después de la diálisis la SDMA era de 0,02 de |ig/dl.

Se almacenó el suero canino separado con carbón a -80°C para su uso.

Ejemplo 2: Preparación de patrones de SDMA:

Se disolvió SDMA.HCl (ChemBio) en agua desionizada hasta una concentración final de SDMA de 1000 |ig/ml. Se añadieron 200 |il de la disolución acuosa de SDMA en 10 ml del suero separado para una disolución madre final que tenía una concentración de SDMA de 20 |ig/ml. Se almacenó la disolución a -80°C. Se transfirieron 280 |il de la disolución madre de SDMA a 10 ml de suero separado para preparar la SDMA patrón a 56 |ig/dl. Se prepararon otros patrones de SDMA diluyendo en serie la disolución madre en suero separado para proporcionar las disoluciones de 28,0, 14,0, 7,0 y 3,75 |il/dl. Los patrones pueden validarse mediante CL/EM.

Ejemplo 3: Preparación de diluyentes

Las formulaciones de diluyentes R1 y R2 contenían los componentes identificados en la tabla 4. El oxamato de sodio es un componente opcional tal como se describe en otra parte en el presente documento.

Tabla 4

Protocolos de preparación del diluyente

Diluyente de R1 (escala 1 l). Se añadieron los siguientes componentes a 500 ml de agua desionizada:

10g de BSA

50 ml de TRIS 1M, pH 8,0

0,372 g de EDTA de sodio

4 ml de Brij-35 (30%)

4 ml de Proclin 150

0,96 g de PEG 6000

17.6 g de NaCl

10 ml de suero de ratón

1.665 g de oxamato de sodio (opcional)

Se mezcló bien la disolución utilizando un agitador a baja velocidad. Una vez que el polvo se disolvió completamente, se ajustó el pH a 7,0 con NaOH 10 N o HCl 3 N según fuera necesario. Se añadió la disolución a una probeta y se llevó a un volumen final de 1 l utilizando agua desionizada. Después de mezclar bien, se mezcló suavemente bien la disolución, y se filtró a través de una unidad filtro de nitruro de celulosa de 0,2 |im y se almacenó a 4°C antes de su uso.

Diluyente de R2 (escala 1 l). Se añadieron los siguientes componentes a 500 ml de agua desionizada:

10 g de BSA

50 ml de TRIS 1 M, pH 8,0

2 ml de EDTA 0,5 M (pH 8,0)

4 ml de Brij-35 (30%)

4 ml de Proclin 150

0,96 g de PEG 6000

17.6 g de NaCl

10 ml de suero de ratón

G6P 0,56 g

1.665 g de oxamato de sodio (opcional)

Se mezcló bien la disolución utilizando un agitador a baja velocidad. Una vez que el polvo se disolvió completamente, se ajustó el pH a 8,0 con NaOH 10 N o HCl 3 N según fuera necesario. Se añadió la disolución a una probeta y se llevó a un volumen final de 1 l utilizando agua desionizada. Después de mezclar bien, se mezcló suavemente bien la disolución, y se filtró a través de una unidad filtro de nitruro de celulosa de 0,2 |im y se almacenó a 4°C antes de su uso.

Ejemplo 4: Preparación de los reactivos de ensayo

Preparación del reactivo R1 y el R1 en el blanco

El reactivo R1 y el R1 en el blanco contenían NAD (35 mM), G6P (56 mM) en diluyente de R1. El reactivo R1 también incluyó anticuerpo (10,5 |ig/ml). G6P es un estabilizador para el conjugado y es opcional.

Se llevaron el diluyente y otros materiales a temperatura ambiente antes de preparar los reactivos. Se preparó una disolución de trabajo de sustrato 2X (100 ml) añadiendo 4,644 g de NAD y 3,160 g de glucosa-6-fosfato (G6P) de sodio al diluyente de R1. Se disolvieron completamente los polvos mezclando suavemente y se ajustó el pH a 7,0 con NaOH 10 M o HCl 3 M. Se añadió la disolución a una probeta y se añadió el diluyente de R1 adicional para proporcionar un volumen final de 100 ml. Se mezcló bien la disolución haciéndola girar suavemente sobre un rodillo y se filtró a través de una unidad filtro de nitruro de celulosa de 0,2 |im.

Se preparó una disolución de trabajo de anticuerpo 4X (25 ml) diluyendo previamente la disolución madre de anticuerpo (6,6 mg/ml) en diluyente de R1 1:10 veces para proporcionar una disolución de anticuerpo de 660 |ig/ml. Se añadieron 1,59 ml de disolución de anticuerpo diluida previamente (660 |ig/ml) a 23,41ml del diluyente de R1 para preparar la disolución de trabajo de anticuerpo (4X) en una concentración de 42 |ig/ml.

Se preparó el reactivo R1 mezclando 40 ml de disolución de trabajo del sustrato (2X), 20 ml de disolución de trabajo de anticuerpo (4X) y 20 ml del diluyente de R1. Se mezcló suavemente la disolución, se cubrió con una lámina de aluminio, y se almacenó a 4°C antes de su uso.

Se preparó el R1 en el blanco mezclando 40 ml de disolución de trabajo del sustrato (2X) y 40 ml del diluyente de R1. Se mezcló suavemente la disolución, se cubrió con una lámina de aluminio, y se almacenó a 4°C antes de su uso.

Preparación del reactivo R2 y R2 en el blanco

El reactivo R2 contenía el conjugado SDMA-G6PDH (0,42 |ig/ml) en diluyente de R2. El R2 en el blanco contenía el conjugado SDMA-G6PDH (0,014 |ig/ml) en diluyente de R2.

Se añadieron 0,3 ml de disolución madre del conjugado (Lot #5616-80-2, 770 |ig/ml) a 29,7 ml del diluyente de R2 para diluir previamente el conjugado 1:100 veces proporcionando una concentración final de 7,7 |ig/ml

Se añadieron 21,8 ml de la disolución del conjugado diluida previamente en 378,2 ml del diluyente de R2 para preparar el reactivo R2.

Se añadieron 0,73 ml de la disolución del conjugado diluida previamente en 399,27 ml del diluyente de R2 para preparar el R2 en el blanco.

Se mezclaron bien las disoluciones y se almacenaron a 4°C antes de su uso.

Ejemplo 5: Preparación del análogo de SDMA N.N'-dimetilarginina tiol (SDMA-SH)

Materiales:

- Resina de 4-metoxitritil-cisteamina: cargar 0,7 mmol/g de resina y matriz de copolímero de 200-400 de malla (Novabiochem).

- Fmoc-SDMA(Boc)2ONa: PM 624,7, pureza >95%, (Novabiochem)

- HATU: PM 380,3 (Novabiochem).

- N,N-Diisopropiletilamina: purificada mediante redestilación, 99,5% de Sigma.

- DMF (anhidra): pureza > 99,8% de Sigma.

- Piperidina: 20% en DMF anhidra.

Procedimiento:

A un vial de 20 ml se añadió resina de 4-metoxitritil-cisteamina (1,2 g, 0,46 mmol), Fmoc-SDMA(Boc)2ONa (0,9 g, 1,4 mmol, 3,0 equivalentes), HATU (0,54 g, 1,4 mmol, 3,0 equivalentes), diisopropiletilamina (0,4 ml, 2,3 mmol, 5,0 equivalentes) y DMF anhidra (18 ml). Se tapó la mezcla y se invirtió a temperatura ambiente durante 16 horas. Se retiró el líquido del vial utilizando una pipeta de vidrio. Luego se lavó la resina con DMF (18 ml, 4 veces) después con metanol (18 ml, 4 veces). Se invirtió la resina en piperidina al 20% en DMF a temperatura ambiente durante 15 minutos (18 ml, 3 veces). Luego se lavó la resina con DMF (18 ml, 4 veces) después metanol (18 ml, 4 veces) y se secó en el liofilizador durante 1 hora. Luego puede almacenarse la resina amarilla/rosa pálido a 4°C o escindirse para proporcionar SDMA-SH.

Para escindir SDMA-SH de la resina (50 mg) se invirtió en ácido trifluoroacético (3 ml) a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se filtró la suspensión rojo oscuro y se enjuagó con acetonitrilo (1 ml) para proporcionar una disolución amarilla transparente. Luego se liofilizó la disolución para proporcionar SDMA-SH (7 mg) como un aceite amarillo espeso. Debido a la oxidación del tiol, el compuesto debe utilizarse inmediatamente o almacenarse a -80°C (almacenamiento a -80°C da como resultado <10% de oxidación después de 2 meses). Se confirmó el SDMA-SH (fórmula 1) mediante CL/EM y RMN.

Fórmula 1

Ejemplo 6: Conjugación de SDMA y G6PDH

Se prepararon conjugados de SDMA y G6PDH conjugando el análogo de SDMA SDMA-SH con G6PDH activada con o bien SIA, SBAP o SMCC en presencia de Na D y G6P. La longitud del ligador entre la SDMA y G6PDH podría variarse seleccionándose el reactivo utilizado para la activación tal como se muestra en las figuras 2, 3 y 4.

Preactivación enzimática con SIA: se disolvió un vial de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G6PDH) (12 mg) en 3 ml de tampón MES (50 mM, pH8,0) y se hizo girar durante 1 hora para asegurar que la enzima se disolviera completamente. Se mantuvo la disolución de enzimas sobre hielo hasta que fuera necesario. Se añadieron 4,5 ml adicionales de tampón MES (50 mM, pH 8,0) a la disolución de enzimas, se mezclaron bien a través de agitación con vórtex (5 segundos) y se mantuvo sobre hielo durante 10 minutos. Se disolvieron 100 mg de G6P en 1 ml de agua desionizada y sobre hielo durante 10 minutos. Se disolvieron 200 mg de NADH en 1 ml de agua desionizada y se mantuvieron sobre hielo durante 10 minutos. Se añadieron 0,68 ml de disolución de G6P y 0,34 ml de disolución de NADH a la disolución de enzimas, se mezclaron bien a través de agitación con vórtex (5 segundos) y se mantuvieron sobre hielo durante 10 minutos. Se disolvió un vial de SIA (50 mg) en 0,5 ml de DMSO (100 mg/ml). Se añadieron 0,14 ml de la disolución de SIA a la disolución de enzimas, se mezclaron bien a través de agitación con vórtex (5 segundos), se cubrió con una lámina de aluminio, y se hizo girar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se transfirió la disolución a un casete de diálisis G2 Slide-A-Lyzer y se dializó durante cinco horas contra el tampón PBS (4 l) a 4°C en la oscuridad. Se cambió el tampón a PBS recién preparado (4 l) y se dializó la disolución a 4°C durante la noche en la oscuridad. Se cambió el tampón de diálisis a MES (4 l, 25 mM, pH 8,0) y se dializó la disolución durante 3 horas a 4°C. Se retiraron 12,5 ml de la disolución de enzimas del casete de diálisis y se añadieron 0,32 ml de tampón MES (1 M, pH 8,0) y 0,32 ml de EDTA (0,2 M, pH 8,0) para llevar la concentración final de la disolución a MES 50 mM y EDTA 5 mM. Si es necesario, si la disolución de enzimas es de menos de 12,5 ml, los volúmenes de MES y EDTA pueden ajustarse en consecuencia. Se desgasificó la disolución con argón durante 5 minutos.

Preactivación enzimática con SBAP: a 2 mg de G6PDH en 1 ml de tampón MES (50 mM, pH 8,0), se le añadieron 11,3 mg de G6P y 16,8 mg de NADH, se mezclaron bien y se mantuvieron sobre hielo durante 10 minutos. Se disolvió el SBAP (50 mg) en 0,5 ml de DMSO (100 mg/ml). Se añadieron 0,025 ml de SBAP a la disolución enzimática, se mezclaron bien a través de agitación con vórtex (5 segundos), se cubrieron con una lámina de aluminio, y se hicieron girar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se transfirió la disolución a un casete de Diálisis G2 Slide-A-Lyzer y se dializó durante cinco horas contra tampón PBS (2 l) a 4°C en la oscuridad. Se cambió el tampón a PBS recién preparado (2 l), y se dializó la disolución a 4°C durante la noche en la oscuridad. Se cambió el tampón de diálisis a MES (2 l, 25 mM, pH 8,0) y se dializó la disolución durante 3 horas a 4°C. Se retiraron 2,5 ml de la disolución enzimática del casete de diálisis y se añadieron 0,060 ml de tampón MES (1 M, pH 8,0) y 0,025 ml de EDTA (0,5 M, pH 8,0) para llevar la concentración final de la disolución a MES 50 mM y EDTA 5 mM.

Preactivación enzimática con SMCC (no es parte de la presente invención): A 2 mg de G6PDH en 1 ml de tampón MES (50 mM, pH 8,0), se le añadieron 11,3 mg de G6P y 16,8 mg de NADH, se mezclaron bien y se mantuvieron sobre hielo durante 10 minutos. Se disolvieron 50 mg de 4-(W-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (SMCC) en 0,5 ml de DMSO (100 mg/ml). Se añadieron 0,035 ml de disolución de SMCC a la disolución enzimática, se mezclaron bien a través de agitación con vórtex (5 segundos), se cubrieron con una lámina de aluminio y se hicieron girar a temperatura ambiente durante 2 horas. Se transfirió la disolución a un casete de diálisis G2 Slide-A-Lyzer y se dializó durante cinco horas contra tampón PBS (2 l) a 4°C en la oscuridad. Se cambió el tampón a PBS recién preparado (2 l), y se dializó la disolución a 4°C durante la noche en la oscuridad. Se cambió el tampón de diálisis a ^m E^s (2 l, 25 mM, pH 8,0) durante 3 horas a 4°C. Se retiraron 2,5 ml de la disolución enzimática del casete de diálisis y se añadieron 0,060 ml de tampón MES (1 M, pH 8,0) y 0,025 ml de EDTA (0,5 M, pH 8,0) para llevar la concentración final de la disolución a MES 50 mM y EDTA 5 mM.

Conjugación de SDMA y G6PDH activada previamente: Se añadió SDMA-SH recién preparada (fórmula 1) a disoluciones enzimáticas activadas previamente en las siguientes cantidades: 0,35 ml (100 mg/ml) para G6PDH activada con SIA y 0,065ml (100 mg/ml) para SBAP o G6PDH activada con SMCC. Se mezclaron bien las disoluciones, y se hizo girar la mezcla durante 36 horas a 4°C. Se dializó la mezcla de reacción (3 ó 4 ciclos) utilizando un casete de diálisis G2 Slide-A-Lyzer (Thermo Scientific), contra PBS (2 ó 4 l) a 4°C. Se equilibró la disolución de conjugado SDMA-enzima dializándola contra el tampón Tris HCl (25 mM, pH 8,0) durante 4 horas a 4°C. Se filtró la disolución utilizando un filtro de centrifuga de 0,45 |im (1500*g durante 10 minutos).

La tabla 5 muestra la longitud del ligador y la actividad de cada uno de los conjugados y la capacidad del anticuerpo para inhibir G6PDH de los conjugados. La SDMA-SMCC-G6PDH no es parte de la presente invención y sirve sólo como referencia. La longitud del ligador no incluye el nitrógeno no nativo en el derivado de SDMA de fórmula 1. La activación previa de la G6PDH en presencia de SIA dio como resultado mejor actividad enzimática que los conjugados preparados con SBAP o SMCC.

Tabla 5

Ejemplo 7: Preparación de anticuerpo monoclonal anti-SDMA

Los métodos de producción de anticuerpos monoclonales están dentro de la experiencia en la técnica. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido contra un conjugado SDMA-KLH que tiene la siguiente estructura:

La purificación del anticuerpo anti-SDMA se realizó de la siguiente manera:

Materiales:

• 2 x 2 l de anti-SDMA

• Columna (5 ml) de fase inversa (rPA) (GE Healthcare) dedicada para la purificación de IgG anti-SDMA

• Tampones de purificación de IgG de Pierce

• Tampón de unión a IgG

• Tampón de elución de bajo pH de IgG

• PBS, pH 7,4 para diálisis

• 2 x 4 l a 4°C

Protocolo:

• Se equilibró una columna de rPA (5 ml) en el tampón de unión a 3 ml/min

1. flujo monitorizado mediante DO 280 nm

• Se diluyeron 1000 ml de anticuerpo anti-SDMA en un volumen igual al tampón de unión a IgG de Pierce

1. Procedimiento repetido para 1000 ml adicionales

• Anticuerpo anti-SDMA diluido cargado en una columna de rPA a 6 ml/min

1. DO monitorizada por 280 nm

• Columna de rPA lavada con tampón PBS/de unión a IgG 1 : 1 a 3 ml/min hasta que

1. la DO a 280 nm alcanzo el nivel inicial

• Se eluyó la IgG anti-SDMA utilizando el tampón de elución de bajo pH de IgG a 3 min/ml

1. Se recogió manualmente el máximo

• Se dializó inmediatamente la IgG anti-SDMA contra 2 cambios de 4 l de PBS

1. 30 ml de casete(s) de MWCO de 10 k

2. Volumen agrupado y DO a 280 nm utilizados para determinar la concentración de IgG

Se analizó el anticuerpo mediante SDS Page, SEC y un inmunoensayo basado en placa tal como se describe en la patente estadounidense n.° 8.481.690.

Ejemplo 8: Procedimientos del ensayo

El ensayo modificado de la divulgación se llevó a cabo para determinar SDMA en muestras caninas, felinas y humanas.

Los componentes de reactivos se muestran en la tabla 5 A.

Tabla 5 A

Los volúmenes del pipeteo para los reactivos preparados tal como se describió anteriormente eran idénticos para el ensayo de color y el ensayo en blanco:

Volumen (ul)

Muestra o calibrador 10

R1 40

R2 125

Los ensayos de color y en blanco para la muestra y los calibradores y los cálculos relacionados se realizaron en un analizador automatizado AU680® de Beckman. Se utilizaron patrones de calibración que contenían SDMA a 56,0, 28,0, 14,0, 7,0 y 3,75 y 0 ug/dl en la matriz de calibrador (suero canino separado) tanto para gatos como para perros. Se programó el analizador para realizar los ensayos de color y en blanco de la siguiente manera: se añadieron la muestra y los calibradores al reactivo R1 y se incubaron durante 3-4 minutos antes de la adición de R2. Se midió la DO a 340 nm comenzando aproximadamente 36 segundos después de la adición de R2. Se midió la absorbancia cada 18 segundos durante 4 ciclos adicionales de 18 segundos. Se restó el valor de la absorbancia de la matriz de calibrador (0 ug/dl de SDMA) de cada una de las mediciones utilizadas para calcular las velocidades de reacción (cambio de absorbancia/min) de los ensayos de color y en blanco para proporcionar las velocidades de reacción de color y en blanco normalizadas.

Para determinar la velocidad para una curva de calibración, se restó la velocidad normalizada para cada calibrador del ensayo en blanco de las velocidades normalizadas para cada calibrador en los ensayos de color. Se determinó la concentración de SDMA de la muestra restando la velocidad normalizada para la muestra en el ensayo en blanco a partir de la velocidad normalizada para la muestra en el ensayo de color para proporcionar una velocidad de reacción de muestra final, que se comparó con la curva de calibración final.

La tabla 6 muestra los resultados de los ensayos de SDMA para suero felino y canino utilizando el ensayo de color sólo (“sin resta”) y cuando la velocidad del ensayo en blanco se restó de la velocidad de ensayo de color (“con resta”). El sesgo de la muestra refleja la diferencia entre el resultado de la CL/EM y el resultado utilizando el procedimiento anterior.

Especie |CL/EM [SDMAll Ensayo de SDMA | Ensayo de SDMA | Sesgo de |Sesgo de muestra siñ|

La tabla 7 muestra curvas de calibración preparadas con y sin resta, utilizando cantidades conocidas de SDMA en suero canino separado. Se prepararon curvas similares para las otras especies.

Tabla 7

La tabla 8 muestra los valores para la curva de calibración mostrados en la figura 6 utilizando sueros humanos no separados enriquecidos con SDMA utilizando el procedimiento de ensayo de velocidad descrito anteriormente (es decir, ensayos de color y en blanco con resta).

Tabla 8

La curva se utilizó para determinar la concentración en muestras de suero humano normales y de nefropatía crónica tal como se muestra en la figura 1.

Ejemplo 9: Uso de inhibidores enzimáticos

Se añadió inhibidor de lactato-deshidrogenasa oxamato de sodio al diluyente de reactivos en blanco y reactivos tal como se describió anteriormente en el ejemplo 3. El uso del inhibidor puede mejorar la precisión del ensayo tal como se muestra en la tabla 9.

Tabla 9

En este ejemplo, la curva de calibración para el suero canino se preparó con y sin oxamato de sodio tal como se muestra en la tabla 10. Puede prepararse una curva similar para otras especies.

Tabla 10

Ejemplo 10: Prueba de muestras de suero humano con calibradores de suero humano separado y no separado Se determinó la recuperación de la SDMA en muestras de suero humano utilizando suero humano endógeno y separado con carbón como matrices de calibrador. Los datos recogidos en este experimento pueden utilizarse para preparar las curvas de calibración con los métodos de calibración de velocidad y fijo.

Los reactivos de ensayo se prepararon tal como se muestra en la tabla 11.

Tabla 11

Se preparó el AcM anti-SDMA como en el ejemplo 7 y se utilizó a una concentración de 1,5 |ig/ml en el ensayo Se preparó SDMA-G6PDH como en el ejemplo 6 y se utilizó a una concentración de 0,3 |ig/ml en el ensayo Se prepararon los calibradores con suero humano separado con carbón con las siguientes concentraciones de SDMA (|ig/dl): 0,0, 4,7, 15,0, 29,0, 59,0 y 111,0 determinadas mediante CL/EM.

El método de velocidad se realizó según el ejemplo 8.

En el método fijo, se ajustó el instrumento de Beckman para medir un cambio en absorbancia a 340 nm entre un minuto y tres minutos después del comienzo de la reacción.

Los resultados de los métodos de cálculo fijo y de velocidad para la determinación de la concentración de SDMA se muestran en la figura 7.

Ejemplo 11: Dosis de calibrador humano no separado con calibradores de tampón

Se calibró un ensayo de SDMA utilizando calibradores a base de tampón (0, 6, 11, 24, 46 y 95 ug/dl de SDMA en tampón PBS con BSA al 1%) y se utilizaron para someter a prueba los patrones de suero humano no separado para determinar la recuperación. Este experimento utilizó el método fijo para calcular el cambio en la absorbancia a 340 nm en los ciclos de instrumentos 12 y 16, donde cada ciclo es de 18 segundos (T1 = 216 segundos, T2 = 288 segundos). La absorbancia de un blanco de reactivo (diH2O) no se restó de la absorbancia neta.

El ensayo se ejecutó tal como se muestra en el ejemplo 9. Los resultados se muestran en la figura 8.

Ejemplo 12: Comparación de la resta de fondo manual y automatizada

Los métodos de resta de fondo automatizados incorporados en el analizador AU680® de Beckman se sometieron a prueba para determinar la efectividad de las disoluciones incorporadas. Se ejecutó un ensayo de SDMA incorporado en la instrucción y se ejecutó el ensayo por separado y se calcularon los resultados utilizando los métodos sin conexión como control.

Se prepararon calibradores de suero canino separado con carbón como en el ejemplo 1. Los componentes de los reactivos se muestran en la tabla 12.

Tabla 12

Los volúmenes de reacción eran los siguientes:

Volumen de muestra: 17 pl,

Volumen de reactivo 1: 25 pl,

Volumen de reactivo 2: 125 pl

El ensayo de color y en blanco no se vincularon en el analizador. Los datos se generaron para cada ensayo por separado y se procesaron fuera del instrumento. La DO de la reacción del ensayo en blanco se restó de la DO de la reacción del ensayo de color para los calibradores y las muestras. Se ajustó una curva a los datos de calibración y la ecuación de la mejor curva de ajuste se utilizó para determinar la concentración de muestra a partir de la DO de reacción restada.

La tabla 13 muestra el cambio neto en la absorbancia para los calibradores en el método de reacción fijo:

Tabla 13

La tabla 14 muestra la medición de SDMA en una muestra que utiliza una curva de calibración generada a partir de los calibradores mostrados en la tabla 13.

Tabla 14

Ejemplo 12: Análisis de matrices de calibrador de diferentes especies

Los conjuntos de calibradores fabricados a partir de suero agrupado de especies animales variadas se analizaron para determinar la consistencia de los ensayos de SDMA cuando utilizan calibradores con suero de diferentes especies.

Los ensayos para SDMA humana se llevaron a cabo utilizando el método fijo como en el ejemplo 10 en los calibradores fabricados con suero separado o endógeno (no separado) de perros, gatos y caballos. Los resultados de los ensayos se muestran en las figuras 8, 9 y 10

Ejemplo 13: Calibración a base de tampón

Se elaboró una curva de calibración utilizando BSA al 1% en PBS como una matriz de calibración para las concentraciones de calibración en la tabla 13. Los resultados se muestran en la figura 12.

Ejemplo 14: Ensayo de SDMA sin conjugado añadido a los reactivos en el blanco

Los ensayos de SDMA se ejecutaron utilizando el procedimiento de velocidad del ejemplo 8 con las concentraciones de reactivos de la tabla 5, excepto que no se añadió el conjugado a R2. Los ensayos se ejecutaron en el analizador de Beckman. Los resultados se muestran en la tabla 15.

Tabla 15

Cualquiera de los valores numéricos citados en el presente documento incluye todos los valores desde el valor inferior hasta el valor superior en incrementos de una unidad con la condición de que existe una separación de al menos dos unidades entre cualquier valor inferior y cualquier valor superior. Como ejemplo, si se establece que la concentración de un componente o valor de una variable de procedimiento tal como, por ejemplo, tamaño, tamaño de ángulo, presión, tiempo y similares, es, por ejemplo, desde 1 hasta 90, específicamente desde 20 hasta 80, de manera más específica desde 30 hasta 70, se propone que los valores tal como de 15 a 85, de 22 a 68, de 43 a 51, de 30 a 32, etc., se enumeran expresamente en esta memoria descriptiva. Los valores que son menores de uno, una unidad se considera que es 0,0001, 0,001, 0,01 ó 0,1 según sea apropiado. Estos son sólo ejemplos de lo que se propone específicamente y todas las posibles combinaciones de valores numéricos entre el valor más bajo y el valor más alto enumerado van a ser considerados para ser establecidos expresamente en esta solicitud de una manera similar.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Conjugado que comprende dimetilarginina simétrica (SDMA) conjugada con glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa (G6PDH) a través de un ligador que tiene una longitud de 5, 6, 7, 8 ó 9 átomos.

2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que la SDMA se conjuga con la G6PDH a través de un ligador que tiene la fórmula A

A

3. Conjugado según la reivindicación 1, en el que la SDMA se conjuga con la G6PDH a través de un ligador que tiene la fórmula B

B

4. Composición que comprende el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un anticuerpo específico para SDMA libre, preferiblemente en la que el anticuerpo tiene reactividad para dimetilarginina asimétrica (ADMA) de menos del 25% de su reactividad para SDMA libre, más preferiblemente en la que el anticuerpo no tiene o no tiene sustancialmente reactividad cruzada con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en dimetilarginina asimétrica (ADMA), L-arginina y N-metilarginina.

5. Kit que comprende los siguientes componentes: el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un anticuerpo específico para SDMA libre.

6. Kit según la reivindicación 5, que comprende además el siguiente componente: nicotinamida adenina dinucleótido (NAD).

7. Mezcla de reacción que comprende los componentes del kit según la reivindicación 5 y una muestra sospechosa de comprender ^s D^mA.

8. Kit según la reivindicación 6, en el que el kit es para realizar un ensayo en una muestra que contiene dimetilarginina simétrica (SDMA) libre, en el que los reactivos están comprendidos en el kit de la siguiente manera:

(a) un primer conjunto de reactivos para realizar un primer ensayo, que comprende

i. un primer reactivo que comprende un anticuerpo específico para SDMA libre y NAD, y

ii. un segundo reactivo que comprende un conjugado según las reivindicaciones 1-3, y

(b) un segundo conjunto de reactivos para realizar un segundo ensayo, que comprende

i. un tercer reactivo que comprende el sustrato.

9. Método para determinar la presencia o cantidad de SDMA libre en una muestra, que comprende

(a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo anti-SDMA específico para SDMA libre, el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un sustrato que comprende nAd ,

(b) medir la conversión de NAD a NADH, y

(c) determinar la presencia o cantidad de SDMA libre en la muestra basándose en la conversión de NAD a NADH.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la medición de la conversión de NAD a NADH comprende medir la velocidad de conversión de NAD a NADH, en el que opcionalmente,

o bien

la determinación de la presencia o cantidad de SDMA en la muestra basándose en la conversión de NAD a NADH comprende comparar la velocidad de la conversión de NAD a NADH con una curva de calibración, o bien

la determinación de la presencia o cantidad de SDMA libre en la muestra basándose en la conversión de NAD a NADH comprende comparar la cantidad de la conversión de NAD a NADH con una curva de calibración.

11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el que la medición de la conversión de NAD a NADH comprende medir la cantidad de conversión de NAD a NADH.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que la muestra es suero, plasma, orina o líquido cefalorraquídeo.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en el que el anticuerpo anti-SDMA específico para SDMA libre tiene reactividad para dimetilarginina asimétrica (ADMA) de menos del 25% de su reactividad para SDMA libre, preferiblemente en el que el anticuerpo anti-SDMA no tiene reactividad o no tiene sustancialmente reactividad para ADMA, L-arginina y N-metilarginina.

14. Método para determinar una nefropatía crónica en un animal, que comprende determinar la presencia o cantidad de SDMA libre en una muestra biológica de un animal según un método según las reivindicaciones 9-13, y determinar una nefropatía crónica en el animal basándose en la presencia o cantidad de SDMA libre en la muestra.

15. Conjugado según la reivindicación 1, en el que la SDMA y el ligador forman un grupo de fórmula

16. Conjugado según la reivindicación 1, en el que la SDMA y el ligador forman un grupo de fórmula