BR112016004839B1 - Método para estimar a taxa de filtração glomerular (gfr) em uma amostra de um indivíduo animal, para diagnosticar uma doença renal ou uma disfunção renal em uma amostra de um indivíduo animal, para predizer a morte prematura ou determinar a mortalidade associada a uma doença renal em um indivíduo animal a partir de uma amostra do mesmo, dispositivo e kit - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE DOENÇAS RENAIS. A invenção refere-se a métodos e aparelhos para a determinação, o diagnóstico, a evolução e o prognóstico de uma doença renal e mortalidade associada à doença renal. A invenção inclui um método para determinar a função renal, em particular para estimar a taxa de filtração glomerular (GFR), em um animal. A GFR pode ser útil no diagnóstico e no tratamento de doenças ou disfunções renais. Em vários aspectos, a invenção refere-se ao uso de dimetilarginina simétrica (SDMA) livre e creatinina em amostras de sangue de animaos, em particular gatos e cachorros, para determinar a taxa de filtração glomerular e doenças renais.

Description

Pedido Relacionado

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente US Provisório N° 61/874,011 depositado em 5 de setembro de 2013.

Campo da Invenção

[002] A invenção refere-se de modo geral à determinação da função renal. Mais particularmente, a invenção refere-se a métodos para estimar a taxa de filtração glomerular e diagnosticar, prognosticar e determinar a evolução de doenças renais.

Arte Relacionada

[003] É importante poder medir a função renal de forma rápida e precisa. Por exemplo, a dosagem de drogas deve ser adaptada para pacientes com insuficiência renal. Portanto, fazer uma avaliação precisa da função renal é uma exigência na medicina clínica. No entanto, o diagnóstico de insuficiência renal é atrasado pela falta de marcadores confiáveis da taxa de filtração glomerular (GFR) e/ou testes diagnósticos disponíveis. Uma medição amplamente da GFR é a depuração de inulina, mas este teste é embaraçoso e dispendioso, o que essencialmente reduz sua utilidade na prática clínica. Isto também se aplica para testes de depuração de radioisótopos. Portanto, na prática clínica, a creatinina sérica é tipicamente usada para avaliar a função renal. O uso da creatinina sérica, no entanto, sofre de imprecisão, uma vez que os dados podem estar indivíduos a um grau relativamente alto de variabilidade.

[004] Por conseguinte, os inventores identificaram na técnica uma necessidade de métodos de avaliação da função renal com precisão aumentada.

Sumário

[005] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para estimar a taxa de filtração glomerular (GFR) em um indivíduo animal. O método inclui medir a concentração de SDMA livre em uma amostra de sangue do indivíduo, medir a concentração de creatinina em uma amostra de sangue do indivíduo; e comparar o valor resultante de uma equação compreendendo o produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre com um ou mais valores padrão que são correlacionados com a taxa de filtração glomerular no indivíduo animal.

[006] Em várias modalidades exemplificativas do método descrito nesta invenção, a equação compreende o inverso do produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre. Também, a concentração de creatinina e/ou a concentração são SDMA livre e podem ser ponderadas no cálculo. A etapa de comparação pode ser efetuada usando um microprocessador. O método também inclui determinar a função renal, uma doença renal ou uma disfunção renal por comparação da GFR no indivíduo com a FGR em um ou mais indivíduos saudáveis.

[007] Em ainda uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método para diagnosticar uma doença renal ou uma disfunção renal em um indivíduo animal. O método inclui medir a concentração de SDMA livre no soro do indivíduo; medir a concentração de creatinina no soro do indivíduo; e comparar o produto de um primeiro valor ponderado baseado na concentração de creatinina e um segundo valor ponderado baseado na concentração de SDMA livre com um ou mais valores padrão que são correlacionados com a doença renal ou disfunção renal.

[008] Em modalidades exemplificativas particulares, o produto de um primeiro valor ponderado baseado na concentração de creatinina e um segundo valor ponderado baseado na concentração de SDMA livre é representado pela fórmula PROD = (CRE)P x(SDMA)Q onde PROD é o produto, CRE é a concentração de creatinina, SDMA é a concentração de SDMA, P fornece o peso para dar a CRE na fórmula, e Q fornece o peso para dar a SDMA na fórmula. O um ou mais valores padrão podem ser correlacionados com o inverso do produto.

[009] Um outro aspecto da invenção refere-se a um método para calcular um valor associado ao diagnóstico de uma doença renal ou uma disfunção renal em um indivíduo animal. O método inclui executar instruções legíveis em máquina para calcular o produto de um primeiro valor ponderado baseado na concentração de creatinina em uma amostra de sangue do indivíduo e um segundo valor ponderado baseado na concentração de SDMA livre em uma amostra de sangue do indivíduo.

[0010] Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para determinar se um indivíduo tem uma doença renal. O método inclui medir as concentrações de SDMA [SDMA] e creatinina [CRE] em uma amostra de soro do indivíduo, calcular uma relação [SDMA] / SDMACUT, calcular uma relação [CRE] / CRECUT , calcular um valor combinado: C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT, e determinar que o indivíduo tem uma doença renal se C for maior que CCUT, onde, SDMACUT é o valor de corte para SDMA, CRECUT é o valor de corte para creatinina, e CCUT é o valor de corte para o valor combinado.

[0011] Um método de acordo com a invenção inclui determinar se um indivíduo tem uma doença renal. O método inclui medir as concentrações de SDMA [SDMA] e creatinina [CRE] em uma amostra de soro do indivíduo, calcular uma relação [SDMA] / SDMACUT, calcular uma relação [CRE] / CRECUT, calcular um valor combinado: C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT, e determinar que o indivíduo tem uma doença renal se C for maior que CCUT, onde SDMACUT é o valor de corte para SDMA, CRECUT é o valor de corte para CRE e CCUT é o valor de corte para o valor combinado.

[0012] Adicionalmente, a invenção refere-se a um método para predizer a morte prematura em um indivíduo animal, o método inclui medir a concentração de SDMA livre no soro do indivíduo, medir a concentração de creatinina no soro do indivíduo, calcular uma relação [SDMA]/[CRE], e determinar que o indivíduo vai sofrer morte prematura se a relação foi superior a um valor de corte.

[0013] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para a determinação da mortalidade associada a doenças renais. O método inclui mediar a SDMA livre em uma amostra de sangue de um paciente, por exemplo um paciente canino ou felino, e determinar que o paciente tem uma probabilidade de morte aumentada associada a uma doença renal quando o paciente tiver uma concentração sanguínea de SDMA superior a um nível limítrofe. O método pode incluir ainda a etapa de medir a creatinina na amostra de sangue, calcular a relação [SDMA]/[CRE], onde aquele paciente tem uma probabilidade aumentada de morte associada a uma doença renal quando o paciente tiver uma relação [SDMA]/[CRE] no sangue superior a um valor limítrofe.

[0014] Em um outro aspecto, a invenção também se refere a um dispositivo para determinar a função renal em um indivíduo animal. O dispositivo inclui uma primeira fase sólida tendo ligada à mesma um análogo de SDMA, ou um anticorpo específico para SDMA que tem nenhuma ou substancialmente nenhuma reatividade cruzada com um ou mais compostos selecionados dentre dimetilarginina assimétrica (ADMA), L- arginina, e N-metilarginina; e uma segunda fase sólida tendo ligada à mesma um reagente sensor de creatinina ou um anticorpo específico para creatinina.

[0015] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um kit para a determinação da função renal em um indivíduo animal. O kit inclui um ou mais reagentes detectores de creatinina e um ou mais reagentes detectores de SDMA, e opcionalmente inclui um conjunto de um ou mais valores padrão associados à função renal baseados no produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA em uma ou mais amostras de sangue dos animais.

[0016] Adicionalmente, a invenção refere-se a um dispositivo de computação tendo um armazenamento de dados na memória compreendendo instruções de software que, quando executado, calcula o inverso do produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre. O armazenamento de dados na memória também pode incluir instruções de software para comparar o resultado do cálculo com um ou mais valores padrão representando a taxa de filtração glomerular em um indivíduo animal.

Breve Descrição dos Desenhos

[0017] Os desenhos em anexo, que estão incluídos para oferecer uma melhor compreensão da invenção, estão incorporados neste relatório e constituem parte do mesmo, ilustram modalidades da invenção e junto com a descrição detalhada servem para explicar os princípios da invenção. Não foi feita qualquer tentativa de mostrar detalhes estruturais da invenção de forma mais detalhada do que aquela que é necessária para uma compreensão fundamental da invenção e várias maneiras por meio das quais ela pode ser colocada em prática.

[0018] A FIGURA 1 é um gráfico comparando os resultados de um método ELISA de detecção de SDMA com espectroscopia de massas.

[0019] A FIGURA 2 é um gráfico de concentrações de SDMA em cães saudáveis e cães com câncer, doença cardíaca, ou doença cardiorrenal. A barra horizontal representa o valor de corte (determinado como a concentração de SDMA média mais 2 desvios padrão de uma população de cães saudáveis).

[0020] A FIGURA 3 é um gráfico de concentrações de SDMA gatos saudáveis e fatos com doença renal ou câncer. A barra horizontal representa o valor de corte (determinado como a concentração de SDMA média mais 2 desvios padrão de uma população de gatos saudáveis).

[0021] A FIGURA 4 é um gráfico da absorvência a 280 nm vs. número da fração para eluição de um conjugado SDMA cistamida proteína, onde a proteína é KLH (♦) ou BSA (■), de uma coluna de filtração em gel Sephadex G-25M como descrito nos Exemplos.

[0022] A FIGURA 5 é um gráfico da concentração de creatinina vs. GFR para um conjunto de amostras de soro canino, como descrito no Exemplo 6.

[0023] A FIGURA 6 é um gráfico da concentração de SDMA vs. GFR para um conjunto de amostras de soro canino, como descrito no Exemplo 6.

[0024] A FIGURA 7 é um gráfico de [Creatinina]*[SDMA] vs. GFR para um conjunto de amostras de soro canino, como descrito no Exemplo 6.

[0025] A FIGURA 8 mostra gráficos, usando um ajuste linear, de creatinina vs. GFR, 1/SDMA vs. CGF e 1/[Creatinina0.37]*1/[SDMA0.43] vs. Creatinina para um conjunto de amostras de soro canino, como descrito no Exemplo 6.

[0026] A FIGURA 9 é um gráfico da concentração de SDMA vs. GFR para um conjunto de amostras de soro felino, como descrito no Exemplo 7.

[0027] A FIGURA 10 é um gráfico da concentração de creatinina vs. GFR para um conjunto de amostras de soro felino, como descrito no Exemplo 7.

[0028] A FIGURA 11 é um gráfico de [Creatinina]*[SDMA] vs. GFR para um conjunto de amostras de soro felino, como descrito no Exemplo 7.

[0029] A FIGURA 12 mostra gráficos, usando um ajuste linear, de [Creatinina] vs. GFR, 1/SDMA vs. CGF, e 1/[Creatinina1.2]*1/[SDMA0.39] vs. creatinina para um conjunto de amostras de soro canino, como descrito no Exemplo 7.

[0030] A FIGURA 13 é um gráfico mostrando a especificidade e sensibilidade melhoradas em um método para determinação de doenças renais.

[0031] A FIGURA 14 mostra a correlação entre SDMA (μg/dL) e creatinina (mg/dL) em cachorros.

[0032] A FIGURA 15 mostra a concentração sérica de creatinina e SDMA em uma população de gatos.

[0033] A FIGURA 16 mostra a concentração sérica de creatinina e SDMA em um gato durante um período de vários anos.

[0034] A FIGURA 17 mostra a concentração sérica de creatinina e SDMA em um gato durante um período de vários anos.

[0035] A FIGURA 18 mostra a concentração sérica de creatinina e SDMA em um gato durante um período de vários anos.

[0036] A FIGURA 19 é uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier que mostra que gatos tendo uma concentração sérica de SDMA inferior a 14 μg/dL sobrevivem aproximadamente 1,6 vezes mais que gatos com concentrações superiores a 14 μg/dL.

[0037] A FIGURA 20 é uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier que mostra que cachorros tendo uma concentração sérica de SDMA inferior a 14 μg/dL sobrevivem aproximadamente 2,6 vezes mais que cachorros com concentrações superiores a 14 μg/dL.

Descrição

[0038] Em seus vários aspectos, a invenção refere-se à determinação, diagnóstico, evolução e prognóstico de uma doença renal e mortalidade associada à doença renal. A invenção inclui um método para determinar a função renal, em particular para estimar a taxa de filtração glomerular (GFR), em um animal. GFR pode ser útil no diagnóstico e no tratamento de doenças ou disfunções renais.

[0039] Em vários aspectos, a invenção refere-se ao uso de dimetilarginina simétrica livre (SDMA) e creatinina em amostras de sangue de animais, em particular gatos e cachorros para determinar a taxa de filtração glomerular e a doença renal. Em um aspecto, o produto das concentrações de creatinina e SDMA livre em amostras de sangue de um animal pode ser correlacionado à GFR e doença renal. Por exemplo, o inverso do produto das concentrações de creatinina e SDMA livre (por exemplo, 1/[creatinina][SDMA]) é usado e resulta inesperadamente em uma precisão muito maior para a medição da taxa de filtração glomerular do que o uso de qualquer uma das medições isoladamente. Por conseguinte, a invenção inclui um método para medir a concentração de SDMA livre em uma amostra de sangue do indivíduo animal; medir a concentração de creatinina em uma amostra de sangue do indivíduo animal; e determinar a taxa de filtração glomerular do indivíduo animal por comparação do inverso do produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre com um ou mais valores padrão for taxa de filtração glomerular no indivíduo animal. Outros aspectos da invenção incluem o uso da concentração de SDMA isoladamente ou em uma relação da concentração de SDMA para a concentração de creatinina para a determinação de uma doença renal como descrito neste relatório.

[0040] SDMA é o isômero estrutural do inibidor de óxido nítrico sintetase (NOS) endógena dimetilarginina assimétrica (ADMA). Tanto a ADMA quanto a SDMA derivam da metilação intranuclear de resíduos L-arginina e são liberadas no citoplasma depois da proteólise. A SDMA é produzida pela proteína arginina metiltransferase 5 (PRMT 5) e PRMT 7. Proteínas carregando metilargininas, tais como SDMA, monometilarginina e ADMA, desempenham um papel no processamento de RNA, transporte de proteínas do núcleo para o citoplasma e transdução de sinais (Bedford e Richard, Mol. Cell, 2005, Apr 29, 18(3):263-72). A SDMA livre resultante da degradação de tais proteínas metiladas é principalmente eliminada por excreção renal, enquanto que a ADMA é grandemente metabolizada. A ADMA está fortemente correlacionada com fatores de risco para doenças arteriais coronarianas (CAD) tais como hipertensão, hipercolesterolemia, hiper- homocisteinemia, resistência à insulina, idade, e pressão arterial média. A SDMA está correlacionada com parâmetros da função renal, tais como taxa de filtração glomerular (GFR), depuração de inulina, e depuração de creatinina.

[0041] Por conseguinte, um aspecto da invenção refere-se a um método para estimar a taxa de filtração glomerular de um indivíduo animal usando os valores tanto da concentração de SDMA livre quanto da concentração de creatinina no soro. O inverso do produto dos valores (por exemplo, 1/([creatinina][SDMA]) é linearmente correlacionado com GFR de forma mais precisa que a concentração de creatinina ou SDMA isoladamente.

[0042] Inúmeros termos estão definidos abaixo:

[0043] Ab é anticorpo.

[0044] ADMA é dimetilarginina assimétrica. A estrutura de ADMA é:

[0045] BUN é ureia nitrogenada no sangue.

[0046] BSA é albumina sérica bovina.

[0047] CMIA é imunensaio magnético quimioluminescente.

[0048] DCM é diclorometano.

[0049] DIPEA é N,N-di-isopropiletilamina.

[0050] DMF é dimetil formamida.

[0051] EIA é imunoensaio enzimático.

[0052] ELISA é ensaio imunoabsorvente ligado à enzima.

[0053] ESI-MS é espectroscopia de massas com ionização por "electrospray".

[0054] FPIA é imunoensaio de fluorescência polarizada.

[0055] GFR é taxa de filtração glomerular.

[0056] HATU é hexafluorofosfato de (1H-7-azabenzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametil urânio metanamínio.

[0057] KLH é hemocianina de lapa com perfuração.

[0058] MEIA é imunoensaio enzimático de micropartículas.

[0059] NOS é óxido nítrico sintase.

[0060] PBS é solução salina tamponada com fosfato.

[0061] RIA é radioimunoensaio.

[0062] SDMA é dimetilarginina simétrica. A estrutura da SDMA é:

[0063] SDMA livre refere-se à SDMA que não faz parte de uma cadeia polipeptídica. Um ou mais resíduos aminoacídicos da SDMA podem estar presentes em um polipeptídio.

[0064] SLE é lúpus eritematoso sistêmico.

[0065] TFA é ácido trifluoracético.

[0066] A estrutura da arginina é:

[0067] N-MMA é N-monometilarginina, ou simplesmente N- metilarginina. A estrutura da N-monometilarginina é:

[0068] O termo "análogo", conforme usado neste relatório, refere-se em geral a um composto no qual um ou mais átomos individuais foram substituídos por átomos diferentes ou por grupos funcionais diferentes. Por exemplo, um análogo pode ser uma forma modificada do analito que pode competir com o analito por um receptor, a modificação proporcionando um meio de unir o analito a uma outra porção, tal como um marcador ou suporte sólido. O análogo de analito pode ligar-se a um anticorpo de maneira similar ao analito.

[0069] O termo "anticorpo", conforme usado neste relatório, refere- se em geral a uma glicoproteína produzida por linfócitos B em resposta à exposição a um antígeno e liga-se especificamente àquele antígeno. O termo "anticorpo" é usado em seu sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento inteiro), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.

[0070] Conforme usado neste relatório, um "anti-SDMA", "porção de anticorpo anti-SDMA", ou "fragmento de anticorpo anti-SDMA" e/ou "variante de anticorpo anti-SDMA" e similares incluem qualquer molécula contendo proteína ou peptídeo que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina, tal como, porém sem limitação, uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma região constante de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região de esqueleto, ou qualquer porção das mesmas.

[0071] O termo "fragmento de anticorpo", conforme usado neste relatório, refere-se a uma porção de um anticorpo de comprimento inteiro, geralmente o domínio variável ou de ligação de antígeno do mesmo. Especificamente, por exemplo, fragmentos de anticorpo podem incluir fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos oriundos de fragmentos de anticorpo.

[0072] O termo "antígeno", conforme usado neste relatório, refere- se em geral a uma substância que é capaz, em condições apropriadas, de reagir com um anticorpo específico para o antígeno.

[0073] O termo "analito", conforme usado neste relatório, refere-se em geral à substância, ou conjunto de substâncias em uma amostra que são detectadas e/ou medidas.

[0074] O termo "animal", conforme usado neste relatório, refere-se em geral a qualquer animal, por exemplo, um ser humano, ou um animal não humano tal como um gato, um cachorro, ou um cavalo.

[0075] O termo "amostra de sangue", conforme usado neste relatório, refere-se em geral a qualquer amostra de fluido derivado de sangue, incluindo, porém sem limitação, sangue total, plasma e soro. Para fornecer soro para uso nos métodos da invenção, uma ou mais amostras de soro são obtidas do indivíduo animal. As amostras de soro podem ser obtidas, por exemplo, do indivíduo animal como amostras de sangue, e então separadas para fornecer soro. Em certas modalidades, o soro pode ser medido sem separação do sangue. Como o especialista na técnica vai apreciar, uma única amostra obtida pode ser dividida ou de outra forma usada para medir ambas as concentrações. Alternativamente, uma pluralidade de amostras pode ser obtida do indivíduo animal, com (pelo menos) uma amostra sendo medida quanto à concentração de creatinina, e (pelo menos) uma amostra sendo medida quanto à concentração de SDMA livre. Em alguns desses casos, as amostras são obtidas do animal aproximadamente ao mesmo tempo (por exemplo, dentro de 60 minutos, dentro de 30 minutos, ou ainda dentro de 10 minutos uma da outra).

[0076] O termo "reatividade cruzada", conforme usado neste relatório, refere-se em geral à capacidade de um sítio de ligação de antígeno individual de um anticorpo para reagir com mais de um determinante antigênico ou à capacidade de uma população de moléculas de anticorpo para reagir com mais de um antígeno. Em geral, reações cruzadas surgem porque (i) o antígeno de reatividade cruzada compartilha um epítopo em comum com o antígeno imunizante ou (ii) ele possui um epítopo que é estruturalmente similar a um epítopo no antígeno imunizante (multiespecificidade).

[0077] O termo "imunoensaio", conforme usado neste relatório, refere-se em geral a um teste que emprega complexos de anticorpo e antígeno para gerar uma resposta mensurável. Um "complexo anticorpo:antígeno" pode ser usado intercambiavelmente com o termo "imunocomplexo". Imunoensaios, em geral, incluem imunoensaios não- competitivos, imunoensaios competitivos, imunoensaios homogêneos, e imunoensaios heterogêneos. Nos "imunoensaios competitivos", o analito (ou antígeno) não marcado na amostra de teste é medido quanto a sua capacidade para competir com o antígeno marcado no imunoensaios. O antígeno não marcado bloqueia a capacidade do antígeno marcado para se ligar porque o sítio de ligação no anticorpo já está ocupado. Nos "imunoensaios competitivos", a quantidade de antígeno presente na amostra de teste é inversamente relacionada com a quantidade de sinal gerado a partir do marcador. Ao contrário, nos "imunoensaios não-competitivos", também conhecidos como imunoensaios "tipo sanduíche", o analito é ligado entre dois anticorpos reagentes altamente específicos para formar um complexo e a quantidade de antígeno é diretamente proporcional à quantidade de sinal associado ao complexo. Imunoensaios que requerem separação dos complexos anticorpo:antígeno ligados geralmente são chamados de "imunoensaios heterogêneos", e imunoensaios que não requerem separação dos complexos anticorpo:antígeno geralmente são chamados de "imunoensaios homogêneos". O especialista na técnica vai entender facilmente os vários formatos de imunoensaio.

[0078] O termo "imunocomplexos", conforme usado neste relatório, refere-se em geral aos complexos formados pela ligação de moléculas de antígeno e de anticorpo, com ou sem fixação complementar. Quando um dentre o anticorpo e o antígeno é marcado, o marcador é associado ao imunocomplexo como resultado da ligação entre o antígeno e o anticorpo. Portanto, quando o anticorpo é marcado, o marcador fica associado ao antígeno como resultado da ligação. Similarmente, quando o antígeno é marcado (por exemplo, um análogo de analito tendo o marcador), o marcador fica associado ao anticorpo como resultado da ligação entre o antígeno e o anticorpo.

[0079] O termo "marcador", conforme usado neste relatório, refere- se a um composto, composição, ou suporte sólido detectável, que pode ser conjugado direta ou indiretamente (por exemplo, via meios covalentes ou não covalentes, isoladamente ou encapsulado) a um anticorpo, análogo de SDMA, ou antígeno da invenção. O marcador pode ser detectável por si só (por exemplo, marcadores radioisotópicos, corantes quimioluminescentes, marcadores eletroquímicos, quelatos metálicos, partículas de látex, ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável (por exemplo, enzimas tais como peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, entre outras). O marcador empregado na presente invenção pode ser, porém sem limitação: fosfatase alcalina; glicose-6-fosfato desidrogenase ("G6PDH"); peroxidase de raiz-forte (HRP); quimioluminescentes tais como isoluminol, fluorescentes tais como compostos do tipo fluoresceína e rodamina; ribozimas; e corantes. O marcador também pode ser uma molécula de ligação específica que pode ser detectável (por exemplo, biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina, maltose, oligo-histidina, 2, 4-dinitrobenzeno, fenilarsenato, ssDNA, dsDNA, entre outras). O marcador pode ser ligado a uma outra molécula ou suporte sólido e que é escolhido por características específicas que permitem a detecção da molécula marcada. A utilização de um marcador produz um sinal que pode ser detectado por meios tais como detecção de radiação eletromagnética ou visualização direta, e que pode ser opcionalmente medido.

[0080] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado neste relatório, refere-se em geral a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Em contraste com preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem anticorpos diferentes direcionados contra epítopos diferentes, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único epítopo no antígeno. O modificador "monoclonal" refere-se meramente ao caráter do anticorpo e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Especificamente, por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos por metodologias do hibridoma, ou podem ser feitos por métodos de DNA recombinante, ou podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos em fagos usando técnicas conhecidas.

[0081] O termo "polipeptídio", conforme usado neste relatório, refere-se em geral a uma molécula tendo uma sequência de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Este termo inclui proteínas, proteínas de fusão, olipeptídeos, peptídeos cíclicos, e derivados de polipeptídios. Anticorpos e derivados de anticorpos estão discutidos acima em uma seção separada, mas anticorpos e derivados de anticorpos são, para os efeitos da invenção, tratados como uma subclasse dos polipeptídios e derivados de polipeptídios.

[0082] O termo "suporte sólido", conforme usado neste relatório, refere-se a uma matriz não aquosa à qual o anticorpo ou análogo de SDMA da presente invenção pode aderir. Exemplos de suporte sólido incluem suportes formados parcialmente ou totalmente de vidro (por exemplo, vidro de poro controlado), polímeros sintéticos e naturais, polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, polivinil álcoois e silicones, partículas magnéticas, partículas de látex, fitas cromatográficas, placas de poliestireno para microtitulação, ou qualquer outra substância que permita que antígenos e/ou anticorpos ligados sejam lavados ou separados dos materiais não ligados. Em certas modalidades, dependendo da aplicação, o suporte sólido será o poço de uma placa de ensaio ou pode ser uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia por afinidade).

[0083] "Receptor" refere-se a qualquer composto ou composição capaz de reconhecer uma organização espacial e polar particular de uma molécula, por exemplo, um sítio epitópico ou determinante. Receptores ilustrativos incluem anticorpos, fragmentos Fab, entre outros.

[0084] "Especificidade de ligação" ou "ligação específica" referem- se ao substancial reconhecimento de uma primeira molécula para uma segunda molécula, por exemplo, um polipeptídio e um anticorpo policlonal ou monoclonal, ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, um fragmento Fv, Fv de cadeia simples, Fab’, ou F(ab’)2) para o polipeptídio. Por exemplo, "especificidade", conforme usado neste relatório, refere-se em geral à capacidade de um sítio de combinação de anticorpo individual para reagir com apenas um determinante antigênico ou a capacidade de uma população de moléculas de anticorpo para reagir com apenas um antígeno. Em geral, existe um alto grau de especificidade em reações entre antígeno-anticorpo. Os anticorpos podem perceber diferenças (i) na estrutura primária de um antígeno, (ii) nas formas isoméricas de um antígeno, e (iii) na estrutura secundária e terciária de um antígeno. As reações entre anticorpo- antígeno que exibem alta especificidade exibem baixa reatividade cruzada.

[0085] "Ligação substancial" ou "ligam-se substancialmente" referem-se a uma quantidade de ligação ou reconhecimento específico entre moléculas em uma mistura de ensaio em condições de ensaio particulares. Em seu aspecto mais amplo, ligação substancial refere-se à diferença entre a capacidade de uma primeira molécula para se ligar ou reconhecer uma segunda molécula, e a capacidade da primeira molécula para se ligar ou reconhecer uma terceira molécula, de forma que a diferença é suficiente para permitir que seja conduzido um ensaio significativo distinguindo a ligação específica em um conjunto particular de condições de ensaio, que inclui as concentrações relativas das moléculas, e o tempo e a temperatura de incubação. Em um outro aspecto, uma molécula é substancialmente incapaz de se ligar ou reconhecer uma outra molécula no sentido de reatividade cruzada onde a primeira molécula exibe uma reatividade para uma segunda molécula que é inferior a 25%, inferior a 10%, inferior a 5% ou inferior a 1% da reatividade exibida em relação a uma terceira molécula em um conjunto particular de condições de ensaio. A ligação específica pode ser testada usando-se inúmeros métodos amplamente conhecidos, por exemplo, um ensaio de imuno-histoquímica, um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA), ou um ensaio de análise da mancha ocidental.

[0086] O termo "sal", conforme usado neste relatório, significa um sal formado entre um ácido e um grupo funcional básico de um composto. Sais ilustrativos incluem, porém sem limitação, sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartarato, oleato, tanato, pantotenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato, e pamoato (isto é, 1,1’-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). O termo "sal" também se refere a um sal formado entre um composto tendo um grupo funcional ácido, tal como um grupo funcional ácido carboxílico, e uma base inorgânica ou orgânica. Bases adequadas incluem, porém sem limitação, hidróxidos de metais alcalinos tais como sódio, potássio, e lítio; hidróxidos de metais alcalinos-terrosos tais como cálcio e magnésio; hidróxidos de outros metais, tais como alumínio e zinco; amônia, e aminas orgânicas, tais como monoalquilaminas, dialquilaminas ou trialquilaminas não-substituídas ou hidroxi- substituídas; diciclo-hexilamina; tributil amina; piridina; N-metil, N- etilamina; dietilamina; trietilamina; mono-, bis-, ou tris-(2-hidroxi-alquil inferior aminas), tais como mono-, bis-, ou tris-(2-hidroxietil)amina, 2- hidroxi-ter-butilamina, ou tris-(hidroximetil)metilamina, N, N,-di-alquil inferior-N-(hidróxi alquil inferior)-aminas, tais como N,N,-dimetil-N-(2- hidroxietil)amina, ou tri-(2-hidroxietil)amina; N-metil-D-glucamina; e aminoácidos tais como arginina, lisina, entre outros.

[0087] Em certos métodos descritos neste relatório, a taxa de filtração glomerular do indivíduo animal é determinada por comparação dos resultados de uma equação que considera o produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre em amostras de sangue de um indivíduo animal. Por exemplo, para determinar a GFR, o inverso do produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre pode ser comparado com um ou mais valores padrão que são correlacionados com a taxa de filtração glomerular no indivíduo animal. Como descrito mais detalhadamente no Exemplo 6, abaixo, há uma relação linear entre a GFR e o inverso do produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre. Assim sendo, o especialista na técnica consegue estabelecer uma equação linear entre GFR e 1/([creatinina][SDMA]) para o indivíduo animal (por exemplo, usando outros animais da mesma espécie ou tipo), e usar aquela equação para fornecer os valores padrão para comparação com o inverso do produto das concentrações medidas. Como será apreciado pelo especialista na técnica, a comparação com valores padrão pode incluir simplesmente o uso da equação para calcular a GFR a partir do valor de 1/([creatinina][SDMA]). Alternativamente, é possível determinar um conjunto de valores padrão do inverso do produto das concentrações de creatinina e SDMA livre para um conjunto de valores de GFR conhecidos; e a GFR do indivíduo animal pode ser determinada comparando-se o inverso do produto das concentrações medidas de creatinina e SDMA livre com os valores padrão. Em certas modalidades, a etapa de determinação é realizada usando-se um microprocessador programado para comparar o inverso do produto das concentrações de creatinina e SDMA livre com a equação ou com o um ou mais valores padrão. O microprocessador usualmente é um componente de um dispositivo de computação contendo armazenamento de dados na memória contendo instruções de software que, quando executadas, realizam a função de calcular a equação e fazer a comparação com base nos dados de entrada provenientes de um operador ou de um dispositivo detecção.

[0088] Como será apreciado pelo especialista na técnica, comparação do inverso do produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre com um ou mais valores padrão para o inverso do produto que são correlacionados com a taxa de filtração glomerular também inclui comparações numéricas que são matematicamente equivalentes a tal comparação. Por exemplo, comparações usando valores que são representativos de {constante x (1/([creatinina][SDMA])} e/ou [constante x GFR ] também são contempladas. Por exemplo, a comparação pode ser feita com base no produto isoladamente ([creatinina][SDMA]). Além disso, o especialista na técnica vai perceber que a inserção de um fator no denominador e/ou numerador do quociente (1/([creatinina][SDMA]) não vai alterar a força de sua relação com a GFR (por exemplo, 2/([SDMA][creatinina]), 1/(2[SDMA][creatinina]) ou 5/(3[SDMA][creatinina]). Similarmente, a relação de ([creatinina][SDMA]) com 1/GFR é igualmente contemplada.

[0089] Em um outro aspecto, a invenção refere-se para estimar a GFR usando a fórmula:

[0090] Com base nos resultados experimentais, esta fórmula tem um coeficiente de correlação (R-quadrado) de cerca de 0,8347. Quando a equação é generalizada como a seguir: os expoentes (P e Q) que maximizam o coeficiente de correlação são P = -1,551102 e Q = -0,2204409. O R-quadrado para este conjunto de expoentes é 0,9116. Como sabe o especialista na técnica, P e Q são fatores de ponderação que podem ser ajustados para maximizar o coeficiente de correlação.

[0091] Alterar ligeiramente os expoentes não parece afetar o R- quadrado de forma significativa. Por exemplo, quando para P = -1,5 e Q = -0,25, o R-quadrado é 0,9114. A título de simplicidade, uma transformação de energia ideal para os níveis de creatinina e SDMA em relação ao nível de GFR assume a forma:

[0092] Em várias modalidades, os fatores de ponderação P e Q podem ser ajustados ainda mais. Por exemplo, P pode variar de cerca de -5 a menos de quase 0 (por exemplo, -0,01). Em outras palavras, P pode variar de cerca de -5 a qualquer valor entre -5 e 0, mas não inclui zero. Em exemplos não limitativos específicos, P pode variar de cerca de -4,0 a -0,1, cerca de -3,0 a -0,5, cerca de -2,0 a -1,0., e cerca de -1,0 a 0, mas não inclui 0). Independentemente, Q pode variar de -2,5 a quase 0 (por exemplo, -0,01). Em outras palavras, Q pode variar de cerca de -2,5 a qualquer valor entre -2,5 e 0, mas não inclui zero. Em exemplos não limitativos específicos, Q pode variar de cerca de -2,0 a 0,1, cerca de -1,5 a -0,15, cerca de -1,0 a -0,2, cerca de -1,5 a -0,5, cerca de -1,2 a -0,8, e cerca de -1,0 a 0, mas não inclui 0.

[0093] Em certas modalidades, a taxa de filtração glomerular é usada para determinar a função renal do indivíduo animal. Por exemplo, a taxa de filtração glomerular pode ser usada para diagnosticar uma doença ou disfunção renal no indivíduo animal. Doenças e distúrbios renais (por exemplo, enfraquecimento renal, insuficiência renal, doença renal crônica, glomerulonefrite, nefropatia diabética, nefrite intersticial, doença renal policística, e doença do rim hipertenso) tendem a diminuir a função renal global, inclusive a GFR, e podem ser diagnosticadas pelo uso dos métodos descritos nesta invenção. Por exemplo, a taxa de filtração glomerular em um animal que sabidamente tem ou está sob suspeita de ter uma doença pode ser comparada com a taxa de filtração glomerular em um ou mais, por exemplo, uma população de indivíduos saudáveis. Doenças e distúrbios renais podem ser preditos quando a taxa do indivíduo é menor que a taxa dos indivíduos saudáveis. Em certas modalidades, se a taxa de filtração glomerular for estatisticamente significativamente menor que o valor médio para uma população de animais saudáveis da mesma espécie (isto é, segundo estimado usando a correlação com [creatinina]P[SDMA]Q), é possível diagnosticar uma doença ou disfunção renal. Em um exemplo não limitativo, a GFR do animal em questão é estatisticamente significativamente menor que a GFR média da população saudável quando a diferença é maior que dois desvios padrão.

[0094] Em um aspecto a invenção refere-se a uma coleção de valores padrão para a equação que são correlacionados com a GFR ou com uma doença ou disfunção renal. A coleção pode ser associada a uma curva padrão que correlaciona o valor da equação com a GFR como mostrado na Figura 7. Em outras modalidades, os valores ou curva padrão são associados a uma doença ou disfunção renal. Os valores padrão podem ser representados na forma de uma tabela ou diagrama que é referenciado por um profissional da área de saúde ou nas instruções legíveis em máquina associadas a um dispositivo de computação como descrito neste relatório.

[0095] Em um outro aspecto, doenças ou distúrbios renais podem ser diagnosticados a partir de uma equação que inclui o produto das concentrações de creatinina e SDMA como já descrito acima sem a etapa intermediária de determinara a GFR. Por conseguinte, usando a equação para gerar um valor, o valor pode ser comparado com um valor padrão ou com um conjunto de valores padrão que são sabidamente associados à doença ou disfunção. Em um aspecto, o cálculo é conduzido em um laboratório de referência e o valor da equação pode ser apresentado a um médico, veterinário, ou outro profissional da área de saúde animal. O profissional pode comparar o valor com um ou mais conjuntos de valores conhecidos que são correlacionados com uma doença ou disfunção renal. Em um outro aspecto, o laboratório de referência pode conduzir a comparação, por exemplo em um dispositivo de computação, e apresentar o resultado final ao médico.

[0096] Em um outro aspecto, a invenção refere-se ao diagnóstico de uma doença ou distúrbio renal, tal como doença renal crônica (CKD) combinando os valores associados às concentrações de SDMA e creatinina em amostras retiradas de animais, por exemplo amostras de soro. A fórmula usa valores de corte para SDMA e creatinina derivados de concentrações limítrofes de amostras que são indicativas de doença renal. As concentrações de corte ou limítrofres podem ser determinadas fazendo-se uma amostragem de uma população de animais e relacionando-se as concentrações de SDMA e creatinina nas populações a um estado patológico como sabido na técnica. Em várias modalidades, o corte para SDMA (SDMACUT) pode variar entre cerca de 10 e cerca de 20 μg/dL, mais particularmente cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 μg/dL, e ainda mais particularmente, cerca de 14 μg/dL. O corte para creatinina pode variar entre cerca de 1,3 e cerca de 2,5 ou entre cerca de 1,7 e cerca de 2,8 mg/dL, mais particularmente cerca de 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, e 2,8 mg/dL. Uma vez determinados os valores de corte, um valor (C) representando uma combinação das concentrações de SDMA e creatinina em uma amostra de um paciente comparado com os valores de corte para SDMA e creatinina pode ser obtido com a seguinte fórmula: C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT. Se C for maior que CCUT, o paciente é diagnosticado com doença renal.

[0097] CCUT é determinado escolhendo-se um valor tendo uma sensibilidade e especificidade combinadas ótimas para o ensaio. A Figura 13 ilustra como diferentes valores de CCUT afetam a especificidade e/ou sensibilidade. A CCUT pode ser escolhida de forma a acomodar um nível desejado de especificidade e/ou sensibilidade para a detecção de uma doença renal. Por exemplo, para o conjunto de dados mostrados na Figura 13, tanto a sensibilidade quanto a especificidade de detecção excedem 90% quando CCUT = 1,6. Tipicamente, valores mais altos de CCUT resultam em especificidade mais alta porém sensibilidade mais baixa. Ao contrário, valores mais baixos de CCUT tipicamente vão resultar em especificidade mais baixa porém sensibilidade mais alta.

[0098] A invenção também se refere a um dispositivo de computação para fazer o cálculo descrito acima, para determinar a GFR, ou para diagnosticar uma doença ou disfunção renal. O dispositivo de computação inclui armazenamento de dados na memória para instruções de software que, quando executadas, calculam um valor de uma equação incluindo o produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre.

[0099] Em uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método de prognóstico para predizer morte prematura ou precoce em um paciente ou indivíduo animal. De acordo com o método, gatos apresentam um risco aumentado de morte precoce quando há uma divergência incomum entre [SDMA] e [CRE], de modo que o valor de SDMA é muito mais elevado que o valores de CRE, em relação aos seus respectivos valores de corte normais. Em uma modalidade, o método oferece o prognóstico de morte precoce quando a relação [SDMA]/[CRE] no soro é superior a um certo valor limítrofe T.

[00100] Por exemplo, quando [SDMA] é expressa em μg/dL (microgramas/decilitro) e [CRE] é expressa em mg/dL (miligramas/decilitro), T pode assumir um valor de cerca de 4 a cerca de 10 (isto é, cerca de 4 μg/dL SDMA:1 mg/dL creatinina a cerca de 10 μg/dL SDMA:1 mg/dL creatinina). Em várias modalidades, o valor limítrofe T pode variar entre cerca de 7 e 20, mais particularmente cerca de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. O especialista na técnica vai entender que se a concentração de CRE e/ou SDMA forem expressas em unidades de medição diferentes das unidades dadas acima, o valor limítrofe de [SDMA]/[CRE] deve variar correspondente e proporcionalmente, sem afetar o espírito e a utilidade de prognóstico do método.

[00101] Além disso, o risco de morte prematura pode aumentar com valores crescentes da relação [SDMA]/[CRE]. Por exemplo, um indivíduo tendo uma [SDMA]/[CRE] = 40 pode ter um risco de morte prematura maior que um indivíduo com uma [SDMA]/[CRE] = 12.

[00102] Além disso, um aumento incomumente repentino em [SDMA] é prognóstico para um risco aumentado de morte precoce. Similarmente, valores incomumente altos de [SDMA] são prognósticos para um risco aumentado de morte precoce. Por exemplo, valores incomumente altos de [SDMA] em gatos podem ser valores acima de cerca de 25 μg/dL, acima de cerca de 30 μg/dL, ou acima de cerca de 30 μg/dL.

[00103] Em um aspecto, a invenção refere-se à concentração de SDMA no soro que é preditiva de mortalidade. Por exemplo, como mostrado nas Figuras 19 e 20, foi mostrado que concentrações de SDMA no soro superiores a 14 μg/dL foram associadas à mortalidade em gatos e cachorros. Por conseguinte, a invenção refere-se à identificação de um valor de corte apropriado para a concentração de SDMA que seja o mais preditivo de mortalidade. Em um aspecto, o valor de corte varia na faixa de cerca de 10-20 μg/dL, mais particularmente cerca de 12-18 μg/dL, ou cerca de 14-16 μg/dL. A identificação de uma concentração de corte apropriada pode ser determinada, por exemplo, medindo-se a concentração de SDMA no soro em cada membro de um grupo de cachorros ou gatos, e repetindo-se a mediação durante um período de vários meses ou anos até a morte de cada membro do grupo. Opcionalmente, todos os cachorros ou gatos no grupo foram diagnosticados com CKD. Diferentes candidatos a valores limítrofes dos valores de corte para a concentração de SDMA foram testados quanto a sua capacidade de predizer um tempo de sobrevida reduzido. Tal teste pode ser realizado, por exemplo, através do uso de curvas de sobrevida de Kaplan-Meier.

[00104] As curvas de sobrevida de Kaplan-Meier podem ser usadas para representar a predição de mortalidade. As curvas de sobrevida de Kaplan-Meier são uma maneira genérica de lidar com tempos de sobrevida diferentes (tempos até o evento), especialmente quando nem todos os indivíduos permanecem no estudo. Cada indivíduo é caracterizado por três variáveis: seu tempo serial, sua condição no fim do seu tempo serial (ocorrência ou censura do evento); o grupo de estudo ao qual eles pertencem (por exemplo, SDMA < ou > 14). O evento usualmente é um desfecho clínico tal como morte, desaparecimento de um tumor, etc. O tempo de estudo é o período de tempo em que é provável que o evento de interesse ocorra a partir do ponto inicial. O fim do estudo é atingido antes que todos os participantes apresentem este evento, mesmo que o desfecho dos participantes restantes seja desconhecido. As Figuras 19 e 20 são curvas de sobrevida de Kaplan-Meier que mostram que gatos e cachorros com concentrações de SDMA no soro inferiores a 14 μg/dL sobrevivem aproximadamente 1,6 e 2,6 vezes mais (respectivamente) que gatos e cachorros com concentrações maiores ou iguais a 14 μg/dL. Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para determinar a relação de creatinina para SDMA em animais saudáveis e doentes, e ao uso da relação para a determinação de uma doença renal e da mortalidade associada à doença renal. Por exemplo, em animais saudáveis, a concentração de SDMA (μg/dL) e creatinina (mg/dL) geralmente está em uma relação que varia de cerca de 4:1 a 10:1 (ug/dL:mg/dL). No entanto, em alguns pacientes com doença renal crônica, os valores de SDMA são significativamente mais altos que os valores de creatinina correspondente, o que pode indicar a evolução da doença. Por conseguinte, uma divergência na relação SDMA:creatinina pode ser preditiva de mortalidade nos animais. Como mostrado na Figura 14, existe uma forte correlação entre SDMA e creatinina, e a relação normal é inferior a 10 (μg/dL:mg/dL). Entretanto, uma relação da concentração de SDMA (μg/mL) para creatinina (mg/dL) maior que 10 indica doença renal avançada, frequentemente levando à morte.

[00105] Por conseguinte, o uso da relação da concentração de SDMA para a concentração de creatinina no soro é preditivo de doença e/ou mortalidade. Portanto, a invenção inclui um método para determinar ou prognosticar uma doença renal ou morte associada a uma doença renal. O método inclui determinar a concentração de SDMA e creatinina em uma amostra de sangue, por exemplo, soro, de animais, em particular gatos e cachorros. Uma vez determinadas a concentração uma relação de SDMA e creatinina pode ser comparada com uma relação de corte para determinar a presença, extensão ou evolução de uma doença renal e a probabilidade de morte como resultado da doença renal. A relação de corte pode ser cerca de 5-15 (μg/dL SDMA : mg/dL creatinina), mais particularmente cerca de 7-13 ou cerca de 9-11, e ainda mais particularmente cerca de 10. Animais tendo uma relação de SDMA:creatinina superior a 10 podem ser caracterizados como tendo uma probabilidade aumentada de morte prematura. Geralmente, quanto mais a alta a relação, maior a probabilidade de morte iminente. Por exemplo, a Figura 15 mostra a relação SDMA:creatinina para uma população de gatos. Dois gatos tinham relações de cerca de 19 e 34, e cada um deles morreu durante o período do estudo. As Figuras 16, 17 e 18 mostram o resultado de um estudo longitudinal de três gatos que morreram dentro de cerca de dois anos depois que suas relações foram identificadas como superiores a cerca de 10. Um desses gatos morreu dentro de cerca de um mês depois de a relação ser identificada como superior a 20 (Fig. 18).

[00106] Depois de a doença ou disfunção renal ser diagnosticada, o método pode incluir tratar o indivíduo animal para a doença ou disfunção renal. Os tratamentos podem incluir, por exemplo, diálise, transplante de rim, terapia com antibióticos (por exemplo, de a disfunção renal for devido a uma infecção subjacente), prescrição de dieta; tratamento de uma doença inflamatória, infecciosa, ou neoplásica sistêmica subjacente (por exemplo, se a disfunção renal for devido à nefropatia por perda de proteína); administração de fomepazole ou etanol (por exemplo, em casos de toxicidade por etileno glicol); administração de inibidores de ACE, dieta com restrição moderada de proteínas e/ou suplementação com ácido graxo ômega-3 (por exemplo, em caso de proteinúria); administração de fixadores de fosfato e/ou uma dieta com restrição de fósforo (por exemplo, em casos de hiperfosfatemia); tratamento com fluidos IV, terapia com fluidos subcutâneos, dieta com baixo teor de proteína e/ou antagonistas do receptor de H2 (por exemplo, em casos de azotemia); amlodipina, atenolol e/ou inibidores de ACE (por exemplo, em casos de hipertensão sistêmica); bicarbonato e/ou citrato (por exemplo, para acidose); administração de análogos de vitamina D tais como calcitriol ou 1,25-di-hidroxivitamina D), fixadores de fosfato (preferivelmente não à base de Ca) e/ou uma dieta com restrição de fósforo (por exemplo, em casos de hiperparatireoidismo secundário renal); e/ou administração de antagonistas do receptor de H2 e/ou eritropoietina recombinante humana) possivelmente com suplementação de ferro) (por exemplo, em casos de anemia).

[00107] Em certas modalidades, a concentração de SDMA livre é determinada usando-se os métodos imunológicos, dispositivos e kits descritos no Pedido de Patente US Provisório série n° 61/086,870 depositado em 7 de agosto de 2008, Pedido de Patente US série n° 12/512,479, depositado em 30 de julho de 2009, e Publicação de Pedido de Patente US n° 2010/0035274, publicado em 11 de fevereiro de 2010, todos aqui incorporados em sua integridade a título de referência. O método pode incluir controles, calibradores ou padrões compreendendo um ou mais análogos de SDMA. Em particular, o método pode ser realizado usando-se técnicas de imunoensaio bastante conhecidos pelos especialistas na técnica, incluindo, porém sem limitação, o uso de microplacas e dispositivos de fluxo lateral. Indivíduos animais dos quais amostras são obtidas para detecção de SDMA incluem animais humanos e não humanos (por exemplo, animais de estimação, gado etc.). A determinação de estados patológicos associados à presença ou quantidade de SDMA pode ser conduzida tanto para indivíduos humanos como para indivíduos não humanos.

[00108] O formato de ensaio em fase sólida é uma técnica de ensaio de ligação comumente usada. Existem inúmeros dispositivos e procedimentos de ensaio onde a presença de um analito é indicada pela ligação do analito a um conjugado e/ou um membro de ligação complementar imobilizado. Em um aspecto particular, o membro de ligação imobilizado (por exemplo anticorpo anti-SDMA) é ligado, ou ligase durante o ensaio, a uma fase sólida tal como um poço de reação, vareta de medição, fita de teste, disco de escoamento ("flow-through pad"), papel, matriz de fibra ou outro material em fase sólida adequado. A reação de ligação entre a SDMA livre na amostra e o anticorpo imobilizado é determinada adicionando-se à amostra uma quantidade de um análogo de SDMA, que inclui SDMA conjugada a um marcador. Depois de colocar a mistura da amostra e do análogo de SDMA em contato com a fase sólida, a mistura e a fase sólida são incubadas para permitir a ligação entre o anticorpo imobilizado, a SDMA e o análogo de SDMA. Subsequente à incubação, os reagentes não ligados são removidos da fase sólida. A quantidade de marcador que se associa ao anticorpo através da ligação do anticorpo ao análogo é medida. A quantidade do marcador associada ao anticorpo é inversamente proporcional à quantidade de SDMA livre na amostra.

[00109] Imobilização de um ou mais anticorpos para SDMA sobre um dispositivo ou suporte sólido é efetuada para que os anticorpos não sejam removidos pela amostra, diluente e/ou procedimentos de lavagem. Um ou mais anticorpos podem ser presos a uma superfície por adsorção física (isto é, sem o uso de ligadores químicos) ou por ligação química (isto é, com o uso de ligadores químicos). Ligação química pode ser ligação mais forte de anticorpos a uma superfície e proporcionar orientação e conformação definidas das moléculas ligadas à superfície.

[00110] Em uma outra modalidade, anticorpos para SDMA produzidos em uma espécie particular são ligados a um suporte sólido por interação com um anticorpo anti-espécie que é ligado ao suporte. Em um aspecto particular, anticorpos anti-SDMA foram produzidos em coelhos, e o suporte ligou a si mesmo o anticorpo anti-coelho que reconhece o anticorpo anti-SDMA produzido em coelhos. Neste aspecto, o anticorpo pode estar na forma de anti-soro obtido da espécie. Os anticorpos anti-SDMA podem ser aplicados à fase sólida tendo o anticorpo anti-espécie antes da adição da amostra à fase sólida, ou os anticorpos anti-SDMA podem ser misturados com a amostra antes da adição da amostra à fase sólida. Em qualquer dos casos, os anticorpos anti-SDMA ligam-se à fase sólida através da ligação ao anticorpo anti- espécie na fase sólida.

[00111] Em uma outra modalidade, um ou mais anticorpos marcados podem ser misturados com uma amostra de teste antes da aplicação da mistura a um suporte sólido. Neste caso, um análogo de SDMA pode ser preso ao suporte sólido para que o análogo não seja removido pela amostra, diluente e/ou procedimentos de lavagem. Os anticorpos marcados na amostra ligam-se à SDMA na amostra e, portanto, não estão disponíveis para ligação com o análogo de SDMA no suporte sólido. Depois da aplicação da mistura ao suporte sólido, e uma incubação apropriada, a mistura é removida do suporte sólido. Os anticorpos que não se ligaram à SDMA na amostra ligam-se ao análogo de SDMA no suporte sólido. A presença ou quantidade de SDMA na amostra é inversamente proporcional à quantidade de anticorpo que se ligou ao análogo de SDMA. O sinal associado ao marcador no anticorpo pode ser medido pelo método apropriado.

[00112] A Figura 1 mostra uma comparação de um método ELISA de detecção de SDMA em soro canino coagulado enriquecido com SDMA e a detecção de SDMA usando espectroscopia de massas. Como mostrado, os valores das concentrações de SDMA obtidos usando o ELISA descrito neste relatório estão fortemente correlacionados com aqueles obtidos usando MS.

[00113] A detecção dos complexos anticorpo:antígeno pode ser obtida através de uma variedade de técnicas bastante conhecidas na literatura, tais como, por exemplo, turbidimetria, marcação enzimática, radiomarcação, luminescência, ou fluorescência. Metodologias de imunoensaio são conhecidas pelos especialistas na técnica e incluem, porém sem limitação, radioimunoensaio (RIA), imunoensaios enzimáticos (EIA), imunoensaios de fluorescência polarizada (FPIA), imunoensaio enzimático de micropartículas (MEIA), ensaios da tecnologia do imunoensaio enzimático de multiplicação (EMIT), imunoensaios turbidométricos ou de aglutinação, imunoensaios à base de ouro coloidal incluindo dispositivos de fluxo lateral e imunoensaios magnéticos quimioluminescentes (CMIA). No RIA, um anticorpo ou antígeno é marcado com radioatividade e usado em um formato competitivo ou não-competitivo. No EIA, um anticorpo ou antígeno é marcado com uma enzima que converte um substrato em um produto com um sinal resultante que é medido, tal como uma alteração na cor. No FPIA, um antígeno é marcado com um marcador fluorescente e compete com um antígeno não marcado do espécime. A quantidade de analito medida é inversamente proporcional à quantidade de sinal medida. No MEIA, uma micropartícula em fase sólida é revestida com anticorpos contra um antígeno de interesse e é usada para capturar o analito. O anticorpo para detecção é marcado com uma enzima como no método de EIA. A concentração de analito medida é proporcional à quantidade de sinal medida. No CMIA, um marcador quimioluminescente é conjugado ao anticorpo ou antígeno, e produz luz quando combinado com seus substrato. O CMIA pode ser configurado em um formato competitivo ou não-competitivo, e produz resultados que são inversamente ou diretamente proporcionais à quantidade de analito presente, respectivamente.

[00114] O uso de fitas de teste impregnadas com reagente em ensaios de ligação específica também é bastante conhecido. Em tais procedimentos, uma amostra de teste é aplicada a uma porção da fita de teste e é deixada migrar pelo material da tira ou atravessar ("wick through") o mesmo. Dessa forma, o analito a ser detectado ou medido passa através ou ao longo do material, possivelmente com a ajuda de um solvente de eluição que pode ser a própria amostra de teste ou uma solução adicionada separadamente. O analito migra para uma zona de captura ou detecção na fita de teste, onde um membro de ligação complementar para o analito é imobilizado. O grau de ligação do analito na zona de detecção pode ser determinado com o auxílio do conjugado que também pode ser incorporado na fita de teste ou que pode ser aplicado separadamente. Em uma modalidade, um anticorpo específico para SDMA é imobilizado em um suporte sólido em uma localização distinta. Subsequente à adição da amostra, a detecção de complexos de SDMA-anticorpo no suporte sólido pode ser feita por qualquer meio conhecido na literatura. Por exemplo, a Patente US N° 5,726,010, que está aqui incorporada em sua integridade a título de referência, descreve um exemplo de um dispositivo de fluxo lateral, o dispositivo de imunoensaio SNAP® (IDEXX Laboratories).

[00115] Outras tecnologias de detecção empregam partículas magnéticas ou micropérolas, por exemplo, pérolas de polímero impregnadas com óxido de ferro superparamagnético. Essas pérolas estão associadas, por exemplo, a um parceiro de ligação específico para o analito. As pérolas ligam-se aos analitos alvo na amostra sendo testada e são então tipicamente isoladas ou separadas da solução magneticamente. Depois de ocorrido o isolamento, outro teste pode ser conduzido, incluindo observar imagens ou marcadores particulares, seja por visualização direta ou por meio de uma câmera.

[00116] Em uma outra modalidade, análogos de SDMA, particularmente análogos de SDMA contendo tiol, contendo hidroxila, contendo amino, e contendo carboxilato, permitem que a SDMA seja ligada a uma outra molécula (alvo de conjugação), tal como uma proteína ativada, para formar um conjugado de SDMA. O análogo de SDMAs descrito nesta invenção permite que a SDMA seja ligada a um alvo de conjugação tal como uma proteína, polipeptídio, marcador detectável, suporte sólido, entre outros, para dar o conjugado de SDMA. Os conjugados de SDMA descritos nesta invenção podem ser usados para produzir anticorpos para uso em imunoensaios específicos para SDMA. Os anticorpos têm pouca ou nenhuma reatividade cruzada com arginina, ADMA, e/ou monometilarginina. O análogo de SDMAs também pode ser conjugado a um marcador para uso em imunoensaios específicos para SDMA.

[00117] Os análogos de SDMA podem ter, por exemplo, as seguintes estruturas: onde x e y são inteiros variando de 1 a 5.

[00118] De acordo com uma modalidade, os análogos de SDMA têm a fórmula geral que se segue:

[00119] onde R1 pode ser um grupo tiol (ou tiol protegido), um grupo hidroxila (ou hidroxila protegida), um grupo amino (ou amino protegido), ou um grupo carboxilato (incluindo ácido carboxílico) ou um grupo carboxilato protegido.

[00120] Grupos protetores de tiol, hidroxila, amino, e carboxilato adequados são conhecidos pelos especialistas na técnica tais como aqueles descritos, por exemplo, em T.W. Greene, et al. Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed. (1999).

[00121] Em uma modalidade particular, o análogo de SDMA é um composto de fórmula (3):

[00122] ou um sal do mesmo. O composto de fórmula (3) fornece um tiol disponível que pode reagir com um alvo de conjugação que inclui um "sítio reativo com tiol" apropriado, isto é, um sítio que vai reagir com um grupo tiol. Por exemplo, maleimidas, alquil e aril halogenetos, e alfa- haloacilas são ilustrativos de sítios reativos com tiol que podem reagir com tióis para formar tioéteres. Similarmente, piridil dissulfetos podem ser reagir com tióis para formar dissulfetos mistos.

[00123] Em uma outra modalidade, R1 é X-R2, onde X é -S-, -O-, -N-, ou -COO- e R2 é um marcador tendo um grupo reativo com tiol, hidroxila, amino, ou carboxilato.

[00124] Em uma modalidade, R1 é X-R2, onde X é -S-, -O-, -N-, ou - COO- e R2 é uma proteína que fora funcionalizada para incluir um grupo reativo com tiol, hidroxila, amino, ou carboxilato.

[00125] Em uma modalidade, a SDMA é conjugada a uma proteína carreadora para formar um imunógeno "carreador de hapteno" que pode ser usado para estimular uma resposta imunológica para um epítopo que inclui SDMA. Proteínas imunogênicas exemplificativos incluem, porém sem limitação, BSA, KLH, e ovalbumina. Protocolos para conjugar haptenos a proteínas imunogênicas são conhecidos na literatura (vide, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow e D. Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, NY, 1988) págs. 78-87).

[00126] Em uma modalidade, o análogo de SDMA é conjugado a uma proteína ativada com maleimida, tal como, por exemplo, proteína de lapa com perfuração (KLH) ativada com maleimida ou albumina sérica bovina (BSA) ativada com maleimida.

[00127] Em uma modalidade, o composto de fórmula (3) é conjugado a uma proteína ativada com maleimida, tal como, por exemplo, proteína de lapa com perfuração (KLH) ativada com maleimida ou albumina sérica bovina (BSA) ativada com maleimida.

[00128] Assim sendo, em uma modalidade específica, um conjugado de um composto de fórmula (3) e proteína ativada com maleimida tem a fórmula: onde m é um inteiro.

[00129] Tipicamente, m é maior que 5. No entanto, o valor de m é variável. Por exemplo, m é cerca de 15 grupos maleimida por proteína em BSA ativada com maleimida comercialmente disponível na Sigma- Aldrich de St. Louis, MO; m é cerca de 80 grupos maleimida por proteína em KLH ativada com maleimida comercialmente disponível na Sigma- Aldrich; m varia em uma faixa de cerca de 15 a cerca de 25 grupos maleimida por proteína em BSA ativada com maleimida comercialmente disponível na Thermo Scientific Pierce Protein Research Products of Rockford, IL; m é maior que cerca de 400 grupos maleimida por proteína em KLH ativada com maleimida comercialmente disponível na Thermo Scientific Pierce Protein Research Products; e m varia em uma faixa de cerca de 150 a cerca de 300 grupos maleimida por proteína em KLH ativada com maleimida comercialmente disponível na A. G. Scientific fr San Diego, CA. Em geral, m é limitado pelo número de grupos amina disponíveis presentes em uma proteína imunogênica. O número de aminas disponíveis pode ser aumentado conjugando-se a proteína imunogênica a poliaminas.

[00130] Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m é maior que cerca de 5. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m é maior que cerca de 10. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m é maior que cerca de 25. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m é maior que cerca de 50. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m é maior que cerca de 75. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m varia em uma faixa de cerca de 5 a cerca de 80. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m é maior que cerca de 75. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m varia em uma faixa de cerca de 10 a cerca de 80. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m é maior que cerca de 75. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m varia em uma faixa de cerca de 20 a cerca de 80. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m é maior que cerca de 75. Em uma modalidade, PROTEIN é BSA e m varia em uma faixa de cerca de 30 a cerca de 80.

[00131] Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 5. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 50. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 100. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 200. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 300. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 400. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 500. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 600. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 700. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m é maior que cerca de 800. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m varia em uma faixa de cerca de 5 a cerca de 800. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m varia em uma faixa de cerca de 5 a cerca de 600. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m varia em uma faixa de cerca de 5 a cerca de 400. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m varia em uma faixa de cerca de 5 a cerca de 200. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m varia em uma faixa de cerca de 5 a cerca de 100. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m varia em uma faixa de cerca de 100 a cerca de 200. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m varia em uma faixa de 100 a cerca de 300. Em uma modalidade, PROTEIN é KLH e m varia em uma faixa de cerca de 100 a cerca de 400. Em vários aspectos, PROTEIN é KLH e m varia em uma faixa de cerca de 100 a cerca de 500, cerca de 100 a cerca de 600, cerca de 100 a cerca de 700, cerca de 100 a cerca de 800, ou cerca de 100 a cerca de 1.000.

[00132] O conjugado de um composto de fórmula (3) e proteína ativada com maleimida pode ser caracterizado usando-se métodos bastante conhecidos pelos especialistas na técnica (vide, por exemplo, Sigma-Aldrich Technical Bulletin for Maleimide Activated BSA, KLH Conjugation Kit (catálogo n° MBK1)).

[00133] Em uma modalidade alternativa, o análogo de SDMA é ligado a um marcador detectável através do grupo tiol, hidroxila, amino, ou carboxilato. O marcador pode ser detectável por ele mesmo (por exemplo, marcadores radioisotópicos, corantes quimioluminescentes, marcadores eletroquímicos, quelatos metálicos, partículas de látex, ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, ele pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável (por exemplo, enzimas tais como peroxidase de raiz-forte, fosfatase alcalina, entre outras). O marcador pode ser uma molécula de ligação específica que pode ser detectável (por exemplo, biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina, maltose, oligo-histidina, 2, 4-dinitrobenzeno, fenil arsenato, ssDNA, dsDNA, etc.). A SDMA pode ser ligada a um marcador detectável usando-se métodos bastante conhecidos pelos especialistas na técnica. Como um exemplo ilustrativo, o análogo de SDMA pode ser ligado à peroxidase ativada com maleimida, proveniente de pó liofilizado de raiz-forte, com mais de cerca de 200 unidades/mg de proteína (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° P1709) seguindo-se as instruções no manual do produto).

[00134] O análogo de fórmula (3) pode ser preparado a partir de SDMA (comercialmente disponível na EMD Chemicals Inc. de Gibbstown, NJ) pelo esquema de síntese (1) ilustrativo que se segue: Esquema 1:

[00135] Os grupos amino primário e secundário da SDMA são protegidos por reação da SDMA com di-ter-butildicarbonato (Boc2O). A SDMA protegida com ter-butoxicarbonil (BOC) ((Boc3)-SDMA, 1) é então ligada a uma resina. Por exemplo, a (Boc3)-SDMA (1) pode ser ligada a uma resina cisteamina-4-metóxi tritil (comercialmente disponível na EMD Chemicals, Inc. de Gibbstown, NJ) por contato da (Boc3)-SDMA (1) com a resina na presença de hexafluorofosfato de 2- (1H-7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil urânio metanaminínio (HATU) e N,N-di-isopropiletilamina (DIPEA) em dimetil formamida (DMF) para dar a (Boc3)-SDMA cistamida (2) ligada à resina. Os grupos protetores de BOC na(Boc3)-SDMA cistamida (2) ligada à resina são removidos e a SDMA cistamida ligada à resina resultante é clivada a partir da resina usando-se, por exemplo, ácido trifluoroacético em diclorometano, para dar a SDMA cistamida (3), que foi convertida no sal de cloridrato (4) por reação com ácido clorídrico.

[00136] Os análogos de fórmula A-D, descritos acima, podem ser feitos usando-se metodologias similares àquela descrita no Esquema 1.

[00137] A proteína ativada com maleimida pode ser então reagida com SDMA cistamida (3) para dar um conjugado SDMA cistamida proteína como descrito abaixo no Esquema II: Esquema II: onde n é um inteiro variando de 1 a 3 e m é um inteiro já definido acima.

[00138] O conjugado resultante pode ser purificado usando-se métodos conhecidos pelos especialistas na técnica incluindo, por exemplo, cromatografia de coluna, por exemplo, usando cromatografia de coluna de filtração em gel com Sephadex (por exemplo, Sephadex G-25M) como o suporte sólido (comercialmente disponível na Sigma- Aldrich).

[00139] Conjugados dos análogos A-D podem ser feitos usando-se metodologias similares àquela descrita no Esquema 2.

[00140] O conjugado do análogo de fórmula A-D e KLH ativada com maleimida ou BSA ativada com maleimida pode ser usado como um imunógeno para gerar anticorpos que se ligam substancialmente à SDMA (isto é, anticorpos anti-SDMA) e mostram nenhuma ou substancialmente nenhuma reatividade cruzada com ADMA, L-arginina, e/ou N-metilarginina. O conjugado do análogo de fórmula (3) e KLH ativada com maleimida ou BSA ativada com maleimida pode ser usado como um imunógeno para gerar anticorpos que se ligam substancialmente à SDMA (isto é, anticorpos anti-SDMA). Tais anticorpos mostram nenhuma ou substancialmente nenhuma reatividade cruzada com ADMA, L-arginina, e/ou N-metilarginina.

[00141] Anticorpos anti-SDMA úteis nos métodos, dispositivos e kits da invenção são caracterizados por uma ligação de alta afinidade à SDMA com pouca ou nenhuma reatividade cruzada com ADMA, arginina, e/ou monometilarginina. Assim sendo, estão descritos neste relatório anticorpos anti-SDMA isolados, recombinantes, sintéticos, e/ou produzidos in vivo, assim como métodos para fazer e usar tais anticorpos, incluindo composições, métodos, e dispositivos de diagnóstico e terapêuticos. Os anticorpos anti-SDMA descritos nesta invenção são úteis, por exemplo, como um marcador para diagnóstico da função renal, tal como enfraquecimento renal, insuficiência renal, taxa de filtração glomerular (GFR), depuração de inulina, e depuração de creatinina, e para distúrbios/doenças renais, tais como doença renal crônica, glomerulonefrite, nefropatia diabética, nefrite intersticial, doença renal policística, doença do rim hipertenso.

[00142] Em uma modalidade, os anticorpos gerados são capazes de detectar SDMA livre (isto é, SDMA que não faz parte de uma cadeia polipeptídica) e mostram nenhuma ou substancialmente nenhuma reatividade cruzada com ADMA, L-arginina, e/ou N-metilarginina. Como mostrado nos Exemplos, os anticorpos descritos nesta invenção mostram menos de 1% de reatividade cruzada com ADMA, L-arginina e/ou N-metilarginina, com base em concentrações iguais dos antígenos. Como geralmente entendido na técnica, o impacto da reatividade cruzada vai depender da abundância relativa do antígeno de reação cruzada (por exemplo, ADMA, L-arginina e/ou N-metilarginina) em comparação com o antígeno imunizante (SDMA) em uma amostra de teste. Por exemplo, uma reatividade cruzada tão alta quanto 50% pode ser aceitável se a concentração do antígeno imunizante for 100 vezes maior que aquela do antígeno de reação cruzada. Ao contrário, uma reatividade cruzada tão baixa quanto 1% pode ser problemática se a concentração do antígeno de reação cruzada for 100 vezes aquela do antígeno imunizante. Assim sendo, o impacto da reatividade cruzada deve ser levado em consideração no contexto das abundâncias relativas de quaisquer antígenos de reação cruzada e do antígeno imunizante, na amostra a ser analisada. Nos vários aspectos da invenção, a reatividade cruzada não afeta a ligação substancial de SDMA ou análogo de SDMA a um anticorpo anti-SDMA.

[00143] Os métodos para fazer os anticorpos podem incluir o uso de um ou mais conjugados de SDMA como um imunógeno para estimular uma resposta imunológica. Os métodos incluem administrar um ou mais conjugados de SDMA a um animal usando um protocolo de imunização adequado, e separar um anticorpo apropriado de um fluido corporal ou fluidos corporais do animal, como descrito, por exemplo, no Exemplo 3, infra. Alternativamente, os conjugados de SDMA podem ser usados em métodos de exibição de fagos para selecionar fagos exibindo em sua superfície um anticorpo apropriado, seguido por separação de sequências de ácidos nucleicos codificando pelo menos uma região de domínio variável de um anticorpo apropriado. Métodos de exibição de fagos são bastante conhecidos pelos especialistas na técnica. (Vide, por exemplo, Antibody Phage Display; Methods in Molecular Biology, Vol. 178, O’Brien, Philippa M.; Aitken, Robert (Eds.) 2002). Anticorpos monoclonais para SDMA podem ser preparados por métodos geralmente conhecidos na literatura.

[00144] Os análogos de SDMA descritos nesta invenção podem ser ligados a um marcador para resultar em um conjugado detectável para uso em ensaios de ligação de receptor, tais como imunoensaios para SDMA. Similarmente, os anticorpos anti-SDMA podem ser ligados a um marcador para resultar em anticorpos anti-SDMA detectáveis para uso em ensaios de ligação de receptor, tais como imunoensaios para SDMA. Os análogos de SDMA e anticorpos anti-SDMA podem ser ligados a um marcador usando-se métodos bastante conhecidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, Immunochemical Protocols; Methods in Molecular Biology , Vol. 295, edited de R. Burns (2005)). O conjugado de SDMA detectável ou os anticorpos anti-SDMA detectáveis podem ser usados em vários formatos de ensaio homogêneos, do tipo sanduíche, competitivos, ou não-competitivos, para gerar um sinal que está relacionado com a presença ou quantidade de uma SDMA em uma amostra de teste.

[00145] Em uma modalidade específica, as metodologias de imunoensaio são imunoensaios competitivos para detecção de anticorpos anti-SDMA. O imunoensaio competitivo pode ser realizado da maneira ilustrativa a seguir. Uma amostra, de um fluido corporal de um animal, potencialmente contendo anticorpos anti-SDMA, é colocada em contato com um análogo de SDMA conjugado a um suporte sólido e com um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador detectável. Os anticorpos anti-SDMA de interesse, presentes na amostra, competem com o anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador detectável pela ligação com o análogo de SDMA conjugado a um suporte sólido. A quantidade do marcador associado ao suporte sólido pode ser determinada depois da separação dos anticorpos não ligados e do suporte sólido. Em uma modalidade alternativa, o imunoensaio competitivo é realizado da maneira ilustrativa a seguir. Uma amostra, de um fluido corporal de um animal, potencialmente contendo anticorpos anti-SDMA, é colocada em contato com um análogo de SDMA ligado a um marcador detectável e em seguida com um anticorpo conjugado a suporte sólido. Os anticorpos anti-SDMA na amostra competem com os anticorpos anti-SDMA no suporte sólido pela ligação com o conjugado de SDMA ligado a um marcador detectável. Em qualquer dos casos, o sinal obtido está inversamente relacionado com a quantidade do anticorpo para SDMA de interesse presente na amostra.

[00146] Naturalmente, outros métodos para medir a SDMA livre podem ser usados nos métodos descritos neste relatório. A própria SDMA pode ser preditiva de uma doença (vide Figs. 2 e 3).

[00147] A concentração de creatinina no soro pode ser medida de várias maneiras, como sabe o especialista na técnica. Por exemplo, um Analisador de Química Clínica Catalyst DxTM ou um Analisador de Química Clínica VetTest® pode ser usado com lâminas secas adaptadas para testar a creatinina, por exemplo, aqueles comercialmente disponíveis no IDEXX Laboratories. Outros analisadores e lâminas, tais como o analisador VITROS® 950 e as lâminas VITROS® CREA disponíveis na Ortho Clinical Diagnostics, também podem ser usados. Ensaios enzimáticos por via úmida também podem ser usados. Por exemplo, o especialista na técnica pode usar um método de química enzimática por via úmida em um analisador Integra 800. Um ensaio particular baseia-se em um sistema creatininase/creatinase/sarcosina com detecção a 552 nm e bloqueio de absorvência a 659 nm. O especialista na técnica também pode usar métodos colorimétricos, por exemplo, aqueles baseados em picrato tal como o ensaio de Jaffe. Outros métodos conhecidos pelo especialista na técnica, tais como aqueles descritos na Publicação de Patente US n° 2005/0266574 e na Patente US n° 4,818,703, ambas aqui incorporadas em sua integridade a título de referência, também podem ser usados para medir a concentração de creatinina. Em certas modalidades, a medição da concentração de creatinina é feita usando-se espectrometria de massas com diluição de isótopos.

[00148] Vários métodos de determinação da GFR são conhecidos. Por exemplo, a GFR pode ser determinada como a depuração renal de 125I-iotalamato, como descrito por Perrone et al., Am. J. Kidney Disease, vol. 16, págs. 224-35 (1990) e Levey et al., J. Am. Soc. Nephrol., vol. 4, págs. 1159-71 (1993), ambos aqui incorporados em sua integridade a título de referência. Outros métodos baseados na coleta de urina também podem ser usados, incluindo medir a depuração renal de outras substâncias exógenas, por exemplo 51Cr-EDTA, 99Tc-DTPA, iohexol, ou inulina. Os valores da GFR obtidos por qualquer um desses métodos pode ser correlacionado com o produto inverso das concentrações de creatinina e SDMA livre para amostras coletadas aproximadamente ao mesmo tempo para fornecer uma curva de calibração ou valores padrão para uso nos métodos nesta invenção.

[00149] Os exemplos a seguir são oferecidos a título exemplificativo apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção descrita em termos amplos acima. Todas as referências citadas neste relatório estão aqui incorporadas a título de referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: Síntese da SDMA cistamida (3) e do sal cloridrato de SDMA cistamida (4)

[00150] SDMA cistamida (3) foi preparada de acordo com a rota de síntese descrita no Esquema 1.

[00151] (BOC)3-SDMA (1): A uma solução de 4,36 g (20 mmol) de di- ter-butildicarbonato (Boc2O) em 20 mL de dioxano foram adicionados em gotas 550 mg (2,0 mmol) de dicloridrato de N, N-dimetilarginina (SDMA) (comercialmente disponível na EMD Chemicals Inc. de Gibbstown, NJ) dissolvidos em 10 mL de NaOH 5,0 N durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação. A mistura reacional resultante foi agitada por uma noite. 30 mL de diclorometano (DCM) e 30 mL de água foram então acrescentados à mistura reacional e o pH foi ajustado em 6,5 com ácido acético (AcOH). A camada de DCM foi separada, lavada com salmoura, e secada sobre Na2SO4 anidro. O DCM foi então removido à pressão reduzida para dar um sólido. O sólido resultante foi lavado 2 vezes com 10 mL de hexano. O sólido foi então secado a vácuo para dar 800 mg de um sólido amarelo claro. As reações subsequentes não exigiram purificação adicional. O sólido foi caracterizado por espectroscopia de massas. ESI-MS: 525,7 (M + Na)+, 503,6 (M + 1)+, 403,5 (M - Boc + 1)+, 303,5 (M - 2Boc + 1)+.

[00152] (Boc)3-SDMA-cistamina-resina (2): A uma mistura de 600 mg (1,2 mmol) de (Boc)3-SDMA (1) e 627 mg (1,6 mmol) de hexafluorofosfato de 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil urônio metanamínio (HATU) em 15 mL de dimetilformamida (DMF) foram acrescentados 420 μL (2,4 mmol) de N,N-di-isopropiletilamina (DIPEA). A mistura resultante foi então agitada por 20 minutos em em uma atmosfera de N2 seco. Separadamente, a resina cistamina 4-metóxi tritil (1,0 g) (comercialmente disponível na EMD Chemicals, Inc. de Gibbstown, NJ) foi intumescida e lavada com DMF. A resina intumescida foi então acrescentada à mistura reacional e a mistura reacional foi delicadamente agitada em uma atmosfera de N2 por três horas. A resina foi então recolhida por filtração, e lavada consecutivamente com 5 mL de DMF, 5 mL de metanol, e 5 mL de DCM.

[00153] SDMA-cistamida (3): À resina modificada foram acrescentados 15 mL de ácido trifluoroacético a 90% (TFA), e a mistura resultante foi agitada delicadamente por duas horas, e filtrada. A resina foi lavada duas vezes com 3 mL de TFA/DCM (1:1 (v/v)). O filtrado e as lavagens foram combinados e acrescentados a 200 mL de éter frio para dar um precipitado. O precipitado resultante foi recolhido por centrifugação e secado à pressão reduzida para dar 300 mg de SDMA- cistamida (3). A SDMA-cistamida (3) foi caracterizada por espectroscopia de massas. EIS-MS: 262,4 (M + 1)+, 132,0 (M + 2)+.

[00154] Sal de cloridrato de SDMA-cistamida (4): SDMA-cistamida 3 (300 mg) foi reconstituída em 5 mL de HCl 1,0 N e a mistura resultante foi liofilizada para dar um sólido amarelo claro como uma espuma.

[00155] O mesmo procedimento geral que aquele descrito acima pode ser usado para preparar outros análogos de SDMA.

Exemplo 2: Conjugação de SDMA cistamida (3) com proteína ativada com maleimida

[00156] A. Procedimento geral para conjugar a SDMA cistamida (3) com KLH ativada com maleimida:

[00157] 1. Abrir lentamente um frasco de KLH ativada com maleimida (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° K0383)) para liberar o vácuo.

[00158] 2. Reconstituir o conteúdo do frasco com 1 mL de água para dar uma solução a 5 mg/mL de KLH ativada com maleimida em 20 mM de tampão fosfato de sódio com 230 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, e 80 mM de sacarose, pH 6,6.

[00159] 3. Preparar uma solução de tampão de conjugação de 20 mM de tampão fosfato de sódio com 100 mM de EDTA e 80 mM de sacarose, pH 6,6 reconstituindo o tampão de conjugação (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° C3957)) com 10 mL de água.

[00160] 4. Dissolver aproximadamente 0,8 mg de hapteno (isto é, SDMA cistamida (3)) em 0,5 mL de tampão de conjugação. Reservar 50 μl da solução de peptídeos resultante para determinação da eficiência de acoplamento (hapteno total). A solução de hapteno reservada foi armazenada a 2-8°C.

[00161] 5. A solução de hapteno da etapa 4 foi imediatamente misturada com a solução de KLH ativada com maleimida da etapa 2 em um frasco de reação equipado com uma barra de agitação. A mistura resultante foi degaseificada enquanto era agitada em uma leve corrente de nitrogênio por cerca de 1-2 minutos.

[00162] 6. O frasco de reação foi tampado e a agitação continuou à temperatura ambiente por 2 horas ou por uma noite a 2-8 °C.

[00163] 7. 100 μl da reação de conjugação da etapa 6 (hapteno livre) foram reservados para determinação da eficiência de acoplamento.

[00164] B: Procedimento geral para conjugar a SDMA cistamida (3) com BSA ativada com maleimida:

[00165] 1. Abrir lentamente um frasco de BSA ativada com maleimida (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° B7542)) para liberar o vácuo.

[00166] 2. Reconstituir o conteúdo do frasco com 1 mL de água para dar uma solução a 5 mg/mL de BSA ativada com maleimida em 20 mM de tampão fosfato de sódio com 230 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, e 80 mM de sacarose, pH 6,6.

[00167] 3. Dissolver 5 mg de hapteno (isto é, SDMA cistamida (3)) em 0,5 mL de tampão de conjugação (preparado da maneira descrita acima na etapa A3). Reservar 50 μl da solução de peptídeos resultante para determinação da eficiência de acoplamento (hapteno total). A solução de hapteno retida foi armazenada a 2-8 °C.

[00168] 4. A solução de hapteno da etapa 3 foi imediatamente misturada com a solução de BSA ativada com maleimida da etapa 2 em um frasco de reação equipado com uma barra de agitação. A mistura resultante foi degaseificada enquanto era agitada em uma leve corrente de nitrogênio por cerca de 1-2 minutos.

[00169] 5. O frasco de reação foi tampado e a agitação continuou à temperatura ambiente por 2 horas ou por uma noite a 2-8 °C.

[00170] 6. 100 μl da reação de conjugação da etapa 5 (hapteno livre) foram reservados para determinação da eficiência de acoplamento.

[00171] C: Isolamento de conjugados de KLH ou BSA:

[00172] 1. Dissolver o conteúdo de uma embalagem de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° P3813)) em 1 litro de água.

[00173] 2. Apoiar uma coluna de filtração em gel Sephadex G-25M (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° B4783)) sobre um béquer.

[00174] 3. Remover a tampa do topo da coluna, fazer um corte na ponta inferior da coluna, e deixar o excesso de líquido escorrer. Não deixar a coluna secar.

[00175] 4. Equilibrar a coluna com 30 mL de PBS.

[00176] 5. A mistura reacional do Exemplo 2A ou 2B foi aplicada à coluna.

[00177] 6. A coluna foi eluída com PBS, usando um volume total de cerca de 10 mL e frações de cerca de 0,5-1,0 mL foram coletadas. A presença de proteínas nas frações foi monitorada medindo-se a absorvência de cada fração a 280 nm.

[00178] 7. As frações contendo proteína foram combinadas. A FIG. 4 representa graficamente a absorção vs. número da fração de um perfil de eluição ilustrativo para as proteínas KLH (♦) e BSA (■).

[00179] 8. As frações contendo proteína foram divididas em pequenas alíquotas que foram armazenadas congeladas a -20°C.

[00180] D. Ensaio para determinar a eficiência de acoplamento:

[00181] 1. Ensaio Padrão de Cisteína - Para estimar a eficiência de acoplamento do análogo ao peptídeo cisteína, foi preparada uma curva padrão usando concentrações conhecidas de cisteína. O ensaio baseou-se na reação de 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB ou reagente de Ellman) que reagem com grupos sulfidrila a um pH 8,0 para produzir um cromóforo com absorção máxima a 412 nm. O procedimento a seguir foi seguido:

[00182] a. Um tampão DTNB foi preparado por dissolução do conteúdo do frasco do tampão DTNB (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° D4179) em 10 mL de água.

[00183] b. Reagente de DTNB (comercialmente disponível na Sigma- Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° D8130)) foi então dissolvido em 5 mL do tampão DTNB da etapa a.

[00184] c. Imediatamente antes do uso, uma solução de cisteína foi preparada por dissolução de 32 mg de cloridrato de L-cisteína mono- hidratada (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° C7880)) em 1 mL de água. A solução resultante de cloridrato de L-cisteína foi consecutivamente diluída com água para produzir soluções de estoque diluídas na faixa de 0,4-0,04 mg/mL. As soluções de estoque diluídas foram usadas imediatamente.

[00185] d. A tubos de ensaio marcados foram acrescentados 50 μL das soluções de estoque diluídas. Um tubo de ensaio contendo 50 μL de água foi usado como um branco.

[00186] e. A cada tubo de ensaio foram então acrescentados 0,1 mL de água, 0,75 mL de tampão DTNB, pH 8,0, e, imediatamente, 0,1 mL da solução de reagente de DTNB (1 mg/mL) para produzir uma solução de ensaio padrão de cisteína final com um volume de 1 mL.

[00187] f. Misturar o conteúdo de cada tubo de ensaio.

[00188] g. A absorvência de cada solução de ensaio padrão de cisteína foi determinada a 412 nm. Se a absorvência fosse superior a 1,4, as amostras eram diluídas e o ensaio, repetido.

[00189] h. A absorvência a 412 nm foi plotada contra a concentração de cisteína (mg/mL) para dar uma curva padrão. A parte linear da curva padrão, com concentrações de cisteína variando de 2-20 μg/ml, foi usada para determinar o hapteno total e o hapteno livre.

[00190] 2. Ensaio de Hapteno - Nota: Se as amostras gerassem valores superiores ao padrão de cisteína mais alto no ensaio padrão de cisteína, as amostras eram diluídas e o ensaio, repetido.

[00191] a. A tubos de ensaio marcados de forma apropriada foram acrescentados 50 μl das seguintes soluções de:

[00192] (i) Tampão DTNB (branco)

[00193] (ii) Amostra de peptídeo diluída (hapteno total, da etapa A4 de conjugação à KLH do Exemplo 2)

[00194] (iii) hapteno-KLH (hapteno livre, da etapa A7 de conjugação à KLH do Exemplo 2)

[00195] (iv) Amostra de peptídeo diluída (hapteno total, da etapa B3 de conjugação à BSA do Exemplo 2)

[00196] (v) hap-BSA (hapteno livre, da etapa B6 de conjugação à BSA do Exemplo 2)

[00197] b. A cada tubo marcado da etapa (a) foi acrescentado 0,1 mL de água, 0,75 mL de tampão DTNB, pH 8,0, e, imediatamente, 0,1 ml de solução de reagente de DTNB (1 mg/mL), para dar uma solução de ensaio de hapteno final com um volume de 1 mL.

[00198] c. Misturar o conteúdo de cada tubo.

[00199] d. A absorvência da solução em cada tubo marcado foi determinada a 412 nm. Se a absorvência fosse superior a 1,4, as amostras eram diluídas e o ensaio, repetido.

[00200] e. A concentração de hapteno total foi então determinada a partir da absorvência medida usando a curva padrão obtida da maneira descrita acima na seção 1H. A absorvência medida para o tubo (ii) e para o tubo (iv) foi usada para determinar o hapteno total para KLH e BSA, respectivamente. Absorbância medida para o tubo (iii) e i tubo (v) foi usada para determinar o hapteno livre para KLH e BSA, respectivamente. A concentração de peptídeo na solução não diluída e a eficiência de acoplamento foram então calculadas da maneira descrita na seção cálculos.

3. Cálculos

[00201] Para estimar as concentrações de peptídeo e a eficiência de acoplamento, foi preparada uma curva padrão usando concentrações conhecidas de cisteína já descritas acima (ensaio padrão de cisteína). Neste cálculo, um mol de cisteína é equivalente a um mol de hapteno contendo sulfidril.

[00202] Foram usadas as seguintes fórmulas:

[00203] eficiência de acoplamento % = {(Hap (conjugado) / Hap (total)} x 100 = [{Hap (total) - Hap (livre)} / Hap (total)] x 100

[00204] Hap (total) = Peptídio (total) μmoles/ml

[00205] Hap (livre) = Peptídio (livre) μmoles/ml

[00206] Hap (conjugado) = Hap (total) - Hap (livre)

[00207] (Vide, também, Sigma-Aldrich Technical Bulletin for Maleimide Activated BSA, KLH Conjugation Kit (catálogo n° MBK1)). Este mesmo procedimento geral descrito nos Exemplos 2A-D pode ser usado para a eficiência da conjugação de outros análogos de SDMA à KLH e à BSA.

Exemplo 3: Método para gerar anticorpos anti-SDMA

[00208] O protocolo de imunização para gerar os anticorpos anti- SDMA foi efetuado de acordo com o seguinte protocolo. Seis coelhos da raça Califórnia foram imunizados com um conjugado de SDMA. Três dos seis coelhos foram imunizados com SDMA conjugada à BSA (coelhos # 155, 156 e 157) e os outros três coelhos foram imunizados com SDMA conjugada à KLH (coelhos # 152, 153 e 154) (preparada da maneira descrita no Exemplo 2). Para as imunizações primárias, cada coelho recebeu uma injeção de 0,5 mg do conjugado de SDMA em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) misturado com 1 ml de adjuvante completo de Freund. Cada coelho recebeu 20-30 injeções intradérmicas no dorso raspado. Cada coelho recebeu um reforço de 0,25 mg de imunógeno em 1 ml de PBS misturado com igual volume de adjuvante incompleto de Freund nas pernas traseiras. As doses de reforço foram dadas mensalmente depois da injeção primária. Sangrias de teste de 5 ml de sangue foram coletadas de cada coelho 7-10 dias depois de cada reforço. Sangrias de produção de 40 ml foram coletadas de cada coelho depois da terceira dose de reforço, quando o título de antissoro era maior que 1:2000. Título de antissoro é a diluição de antissoro que gera a curva de calibração mais acentuada para o ensaio.

Exemplo 4: Caracterização de anticorpos anti-SDMA

[00209] Para avaliar a especificidade dos anticorpos obtidos pelos procedimentos descritos no Exemplo 3 acima, sua reatividade para SDMA, ADMA, L-arginina, e/ou N-metilarginina foi medida em um ensaio ELISA competitivo (Tabela 1).

[00210] ADMA-2HCl, SDMA-2HCl, acetato de N-metilarginina (Sigma, Cat. No. M7033) ou L-arginina (Sigma, Cat. No. A5006) foram, cada um deles, dissolvidos em PBS para fazer soluções de estoque a 1 mg/ml. A partir destas soluções de estoque, soluções de trabalho a 100 μg/ml, 10 μg/ml e 1 μg/ml foram preparadas em PBS.

[00211] 50 μl do conjugado SDMA-HRP (descrito no Exemplo 5 abaixo), 50 μl de ADMA, SDMA, N-metilarginina ou L-arginina (a concentrações de 1-100 μg/ml como descrito acima), e 50 μl de anticorpo anti-SDMA de coelho em soro (título de 1:3000) foram sequencialmente acrescentados a um poço individual de uma placa de micropoços de poliestireno com 96 poços, pré-revestida com IgG anticoelho de ovelha (comercialmente disponível na Beacon Analytical Systems Inc. de Portland, ME). Depois de um período de incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, os poços foram lavados 4 vezes com PBST (solução salina tamponada com fosfato, 0,05% de Tween).

[00212] 100 μl de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (comercialmente disponível na Promega Corporation de Madison, WI) foram subsequentemente acrescentados. Depois de um período de incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, 100 μl de solução de interrupção (HCl 1 N) foram acrescentados e a absorvência foi medida a 450 nm usando uma leitora de placa BioTek ELX 808 (Winooski, VT). Os dados foram submetidos à quantificação usando-se o software Softmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

[00213] Os valores de absorvência obtidos com 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, e 100 μg/mL de ADMA, SDMA, N-metilarginina ou L-arginina, respectivamente, foram determinados e plotados. A concentração de SDMA à qual o valor de absorvência foi reduzido em 50% (em relação à absorvência máxima a 0 μg/mL SDMA; isto é, IC50) foi dividido por cada uma das concentrações de ADMA, N-metilarginina ou L-arginina, respectivamente, à qual o valor de absorvência foi reduzido em 50% (IC50). O valor resultante foi multiplicado por 100 para obter o valor "reatividade cruzada %". Onde uma redução na absorvência de < 50% foi observada foi observada a concentrações de até e inclusive 100 μg/mL, uma reatividade cruzada de <1% foi notada (vide Tabela 1).

[00214] Como mostrado na Tabela 1, todos os 6 soros anti-SDMA de coelho tiveram reatividades cruzadas de <1% para ADMA, N- metilarginina ou L-arginina, respectivamente. Tabela 1

[00215] Uma experiência similar àquela descrita nos Exemplos 1-4, porém onde ADMA foi usada no lugar de SDMA, também gerou anticorpos. O uso de um conjugado ADMA-proteína para gerar anticorpos, no entanto, produziu anticorpos que não eram específicos para ADMA livre e não foram úteis em um ensaio para mediar a ADMA.

[00216] Em uma outra experiência, usando apenas anticorpo policlonal do Coelho N°. 154, a especificidade do anticorpo foi determinada com mais rigor pelo método descrito acima. Estes dados (vide Tabela 2) mostram que a especificidade para o anticorpo do Coelho N° 154 é ainda maior que aquela mostrada na Tabela 1, acima. Tabela 2

Exemplo 5: Imunoensaio competitivo para detectar in vivo níveis de SDMA

[00217] Amostras de soro foram fornecidas por clínicas/laboratórios veterinários provenientes de animais que foram submetidos a um exame físico de rotina e a um perfil químico de rotina.

[00218] Um conjugado SDMA-HRP foi preparado de acordo com o seguinte procedimento:

[00219] 1. Pó liofilizado de peroxidase de raiz-forte ativada com maleimida, >200 unidades/mg de proteína (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO Product n° P1709)) foi reconstituído para atingir 2-5 mg/mL em 0,15 M de NaCl, 0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,0. O tampão foi desaerado e purgado com nitrogênio ou argônio antes do uso e a água usada para preparar o tampão era livre de metais pesados- traço e de outros agentes oxidantes. O acoplamento foi efetuado em um frasco âmbar para proteger a reação contra a luz.

[00220] 2. O análogo de SDMA (3) foi dissolvido no mesmo tampão que aquele usado na etapa 1 para dar uma solução com uma concentração de 2-5 mg/mL. Em geral, foram usados 1-2-moles de peroxidase por mol de composto sufidrílico. O peso molecular da peroxidase é cerca de 40,000.

[00221] 3. A solução da etapa 1 foi combinada com a solução da etapa 2 e a solução resultante foi agitada delicadamente por 3 horas à temperatura ambiente. Os grupos maleimida não reagidos foram então bloqueados por adição de 1 M de 2-mercaptoetanol (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO.(catálogo n° M 6250)) para dar uma concentração final de 0,0015 M de 2-mercaptoetanol e a solução resultante foi agitada por cerca de 15 minutos.

[00222] 4. Os grupos sulfidrila não reagidos foram então bloqueados por adição de 0,3 M de N-etilmaleimida (comercialmente disponível na Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° D 8654)) à solução da etapa 3 para dar uma concentração final de 0,003 M de N-etilmaleimida.

[00223] 5. A solução resultante do conjugado SDMA-HRP foi então transferida para PBS por cromatografia (usando o mesmo procedimento que aquele descrito acima no Exemplo para conjugar o análogo de SDMA à KLH e BSA ativadas com maleimida) ou diálise em PBS (Spectra/Por3, MWCO 3500 Spectrum Labs, Rancho Dominguez, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A solução resultante foi liofilizada.

[00224] Vide, também, Lin, F. T., et al., Biochemistry, 18(4), 690 (1979); Kitagawa, T., et al., Chem. Pharm. Bull., 29(4), 1131 (1981); Duncan, R. J. S., et al., Anal. Biochem., 132, 68 (1983); e Palmer, J. L., et al., J. Biol. Chem., 238(7), 2393 (1963).

[00225] 50 μl do conjugado SDMA-HRP, 50 μl de amostra de soro (ou calibrador, SDMA 2 HCl, comercialmente disponível na Calbiochem de San Diego, CA), e 50 μl de anticorpo anti-SDMA de coelho em soro (1:3000 titer) foram sequencialmente acrescentados a um poço individual de uma placa de micropoços de poliestireno com 96 poços, pré-revestida com IgG anti-coelho de ovelha (comercialmente disponível na Beacon Analytical Systems Inc. de Portland, ME). Depois de um período de incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, os poços foram lavados 4 vezes com PBST (solução salina tamponada com fosfato, 0,05% de Tween).

[00226] 100 μl de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina (comercialmente disponível na Promega Corporation de Madison, WI) foram subsequentemente acrescentados. Depois de um período de incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, 100 μl de solução de interrupção (HCl 1 N) foram acrescentados e a absorvência foi medida a 450 nm usando uma leitora de placa BioTek ELX 808 (Winooski, VT). Os dados foram submetidos à quantificação usando-se o software Softmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Uma curva de calibração foi gerada fazendo-se uma série de padrões de SDMA (por exemplo, 0, 0,05 μg/mL, 0,15 μg/mL, 0,45 μg/mL, e 1,35 μg/mL). As amostras desconhecidas foram quantificadas usando a curva de calibração. Os resultados estão resumidos na Tabela 3. Tabela 3

[00227] Na Tabela 3, a condição "Doença Renal" indica que a amostra coletada do animal mostrou valores de creatinina e de ureia nitrogenada no sangue (BUN) acima da faixa de referência normal e a condição "Saudável" indica que a amostra coletada do animal mostrou valores normais (faixa de referência) de creatinina e de ureia nitrogenada no sangue (BUN). Para os caninos, o limite superior da faixa de referência normal era 27 mg/dL para BUN e 1,8 mg/dL para creatinina. Para os felinos, o limite superior da faixa de referência normal era 34 mg/dL para BUN, e 2,3 mg/dL para creatinina.

[00228] Os resultados na Tabela 3 mostram que os níveis de SDMA eram elevados em cachorros e gatos com função renal comprometida. Portanto, a SDMA pode ser usada como um marcador para diagnosticar doenças renais em animais.

Exemplo 6: Análise da taxa de filtração glomerular canina com concentração de creatinina e concentração de SDMA livre.

[00229] Amostras de soro foram coletadas de cadelas heterozigóticas (portadoras) (n=20) com nefropatia hereditária ligada ao cromossoma X (XLHN). A XLHN é causada por uma mutação no gene COL4A5, que nas cadelas causa uma expressão em mosaico dos peptídeos colágeno tipo IV e o aparecimento de proteinúria glomerular entre 3 e 6 meses de idade. (Nabity et al., J Vet Intern Med 2007; 21:425-430). As concentrações de creatinina e SDMA foram medidas em cada amostra.

[00230] A concentração de creatinina nas amostras foi medida usando-se a tecnologia da lâmina seca IDEXX descrita acima.

[00231] As concentrações de SDMA livre foram determinadas da seguinte maneira: As fases móveis de LCMS foram (A) 10 mL de ácido propiônico e 250 μL de ácido trifluoroacético em 1 L de água; e (B) 10 mL de ácido propiônico e 250 μL de ácido trifluoroacético em 1 L de acetonitrila. Um padrão interno de 2,5 ng/mL de dimetil arginina assimétrica deuterada (d-ADMA) em água foi preparado. A curva (padrão) STD foi feita em soro canino desagregado ("stripped") incorporando-se ("spiking") uma solução de SDMA a 20 mg/mL, seguido por diluições para obter uma curva STD de 9 pontos variando em concentrações de 1,56 mg/dL a 100 mg/dL. Para fazer as medições, 100 μL da amostra a ser medida (isto é, uma amostra de soro ou uma solução padrão) foram transferidos para tubos de microcentrífuga. 10 μL da solução de padrão interno e 200 μL de fase móvel B foram acrescentados a cada tubo. Os tubos foram turbilhonados para misturar e deixar descansar por 30 minutos, e em seguida centrifugados a 13000g por 20 minutos a 25°C. Os sobrenadantes foram transferidos para frascos de HPLC âmbar de 2 mL, e as amostras foram analisadas por LCMS. A LCMS foi efetuada em HPLC e API-4000 da ABSciex, operada com MRM tipo scan, polaridade positiva, modo turbo spray scan, resolução Q1 = unidade e resolução Q3 = unidade. A coluna foi uma coluna 150x4,6 PVA SIL, o fluxo foi de 1 mL/min e o gradiente foi isocrático 90:10 B:A. Os cromatogramas foram executados por 9 minutos à temperatura ambiente.

[00232] A GFR efetiva dos animais foi medida pelo método de depuração de iohexol. Os indivíduos receberam injeções de iohexol.

[00233] Amostras de sangue foram coletadas em vários intervalos de tempo, e o iohexol sérico foi medido por HPLC.

[00234] Três pontos de dados foram coletados para cada cachorro. Um gráfico logístico de quatro parâmetros (4PL) da concentração de creatinina (mg/dL) vs. GFR (ml/min/kg) está mostrado na FIG. 5. O valor de R2 para esses dados é 0,94 com um erro padrão de 0,12 em uma faixa de concentrações de 0,5-3,0 mg/dl, que representa aproximadamente 5% da faixa total.

[00235] A Figura 6 mostra os resultados da concentração de SDMA (μg/dl) vs. GFR (ml/min/kg). O ajuste de 4A PL para a relação SDMA- GFR dá um valor de R2 de 0,95, com um erro padrão de 1,7 em uma faixa de 5-40 μg/dL para SDMA. Este erro representa aproximadamente 5% da faixa total.

[00236] A Figura 7 mostra os resultados da combinação dos valores de creatinina e dos valores de SDMA usando simples multiplicação dos valores, o que mostra uma melhora para a relação para GFR em relação à creatinina isoladamente ou SDMA isoladamente. O ajuste de 4PL da relação [Creatinina]*[SDMA]--GFR dá um valor de R2 de 0,98, com um erro padrão de 2,8 em uma faixa de 0-90 μg/dL para [Creatinina]*[SDMA]. Este erro representa aproximadamente 3% da faixa total para a relação para GFR para esses cachorros.

[00237] A Figura 8 mostra a análise de 1/[Creatinina]P*1/[SDMA]Q, usando ajuste linear. Usando regressão linear, P foi 0,37 e Q foi 0,43. O R2 para a combinação deu um valor de 0,87, em comparação com 0,83 para 1/[Creatinina] isoladamente e 0,85 para 1/[SDMA] isoladamente.

Exemplo 7: Análise da taxa de filtração glomerular felina com concentração de creatinina e concentração de SDMA livre.

[00238] Dez gatas com 1 a 4 pontos de dados cada foram usadas para avaliar se a combinação multiplicativa dos valores de SDMA e de creatinina eram melhor correlacionados com a GFR do que os valores do marcador individual isoladamente. As SDMA, creatinina e GFR foram medidas da maneira descrita acima.

[00239] A Figura 9 mostra os resultados da concentração de SDMA (μg/dl) vs. GFR (ml/min/kg). Um ajuste de 4 PL para a relação SDMA- GFR dá um valor de R2 de 0,73, com um erro padrão de 2,3 em uma faixa de 15 μg/dL para SDMA. Este erro representa aproximadamente 15% da faixa total.

[00240] A Figura 10 mostra os resultados da concentração de creatinina (mg/dl) vs. GFR (ml/min/kg). Um ajuste de 4 PL para a relação Creatinina-GFR dá um valor de R2 de 0,82, com um erro padrão de 0,15 em uma faixa de 1,5 mg/dL. Este erro representa aproximadamente 10% da faixa total.

[00241] A Figura 11 mostra os resultados da combinação dos valores de creatinina e dos valores de SDMA usando simples multiplicação dos valores, o que mostra uma melhora para a relação para GFR em relação à creatinina isoladamente ou SDMA isoladamente. O ajuste de 4PL da relação [Creatinina]*[SDMA]-GFR dá um valor de R2 de 0,89, com um erro padrão de 3,9 em uma faixa de 40 μg/dL para [Creatinina]*[SDMA]. Este erro representa aproximadamente 10% da faixa total.

[00242] A Figura 12 mostra a análise de 1/[Creatinina]P*1/[SDMA]Q, usando ajuste linear. Usando regressão linear, P foi 1,2 e Q foi 0,95. O R2 para a combinação deu um valor de 0,95, em comparação com 0,44 para 1/[Creatinina] isoladamente e 0,65 para 1/[SDMA] isoladamente.

Exemplo 8: Melhora da sensibilidade e/ou especificidade no diagnóstico de doenças renais através de uma combinação dos valores de corte de CRE e SDMA.

[00243] A condição doença renal de 113 gatos foi determinada e classificada de acordo com o Algoritmo para Classificação de Doença Renal Crônica (CDK) em cachorros e gatos estabelecida pela International Renal Interest Society (IRIS). Para cada gato, 1 a 6 amostras de soro coletadas em vários pontos do tempo foram analisadas quanto à creatinina [CRE] e/ou SDMA. 194 amostras vieram de 61 gatos normais (isto é, sem CKD). 182 amostras vieram de 55 gatos sofrendo de CKD.

[00244] Neste Exemplo, os valores de corte para SDMA e CRE foram determinados e usados para determinar a CKD. O valor de corte representa a concentração sérica limítrofe acima da qual o indivíduo é diagnosticado tendo uma doença renal para este teste particular. SDMACUT é o valor de corte para SDMA. [SDMA] e SDMACUT são medidas em μg/dL (microgramas/decilitro). Por exemplo, SDMAcuTpode ser cerca de 14 μg/dL, ou entre cerca de 10 e 20 μg/dL.

[00245] CRECUT é o valor de corte para CRE. CRE e CRECUT são medidas em mg/dL. Por exemplo, CRECUT pode variar entre cerca de 2,0 mg/dL e 2,4 mg/dL, ou entre cerca de 1,7 e 2,8 mg/dL.

[00246] Para SDMA isoladamente, um valor de corte (SDMACUT) foi estipulado em 14 μg/dL. Usando este valor, ocorreram 10,3% de taxas falso positivas para gatos normais, e 26,9% de taxas falso positivas para gatos com CKD (vide Tabela 4). Tabela 4

[00247] Para creatinina isoladamente, um valor de corte (CRECUT) foi estipulado em 2,4 mg/dL. Usando este valor, ocorreram 0,0% de taxas falso positivas para gatos normais, e 43,4% de taxas falso negativas para gatos com CKD (vide Tabela 5). Tabela 5

[00248] CCUT é o valor de corte para o valor combinado C. Os valores de Creatinina e SDMA foram combinados de acordo com a fórmula:

[00249] CCUT não tem unidade de medição. Por exemplo, CCUT pode ser 1,5, 1,7 ou 2,0, ou variar entre 1,3 e 2,5.

[00250] Quando CCUT foi estipulada em 1,5, ocorreram 12,4% de taxas falso positivas para gatos normais, e 1,6% de taxas falso negativas para gatos com CKD (vide Tabela 6). Quando CCUT foi estipulada em 1,7, ocorreram 3,5% de taxas falso positivas para gatos normais, e 14,3% de taxas falso negativas para gatos com CKD (vide Tabela 7). Quando CCUT foi estipulada em 2,0, ocorreram 3,5% de taxas falso positivas para gatos normais, e 33,5% de taxas falso negativas para gatos com CKD (vide Tabela 8). Tabela 6 Tabela 7 Tabela 8

[00251] A sensibilidade e especificidade estimadas do valor combinado foram plotadas contra CCUT para determinar valores adequados para CCUT (vide Figura 13). Se C for maior que (>) CCUT , o indivíduo é diagnosticado como tendo uma doença renal. Por conseguinte, combinar os valores de SDMA e CRE com base em seus respectivos valores de corte para diagnóstico leva à sensibilidade e/ou especificidade de detecção melhoradas de uma doença renal em animais.

Exemplo 9: Determinação da Relação de Creatinina para SDMA em animais saudáveis e doentes.

[00252] Em animais saudáveis, a relação da concentração de SDMA (μg/dL) e creatinina (mg/dL) geralmente varia de cerca de 4:1 a 10:1 (μg/dL:mg/dL). Em alguns pacientes com doença renal crônica, esta relação excede 10:1, o que pode indicar a evolução da doença.

[00253] Neste estudo, foi observada uma tendência longitudinal de SDMA e creatinina em cachorros com CKD. Vinte e quatro cachorros com CKD foram incluídos no estudo tendo por base os seguintes critérios: Idade (9,4-18,3 anos); persistentemente azotêmico (> 3 meses); GFR; exame físico; creatinina sérica, e urinálise.

[00254] Todos os cachorros foram mantidos com cuidados de qualidade incluindo nutrição ideal, cuidados veterinários, e exercícios diários. Depois de diagnosticados com CKD, os cachorros foram alimentados com a ração para cães PRESCRIPTION DIET® k/d® (Hill’s Pet Nutrition, Inc., Topeka, Kansas).

[00255] Amostras foram regularmente coletadas desses cachorros (2-3 vezes ao ano). As amostras eram congeladas e armazenadas. A creatinina foi medida por colorimetria enzimática usando-se o analisador COBAS®. A SDMA foi medida por LCMS como descrito acima exceto que as amostras de soro foram precipitadas com acetonitrila, e que foi usada uma coluna Waters XBridge C18 5mm 4,6* 30. A fase móvel A consistia em 0,5mM de ácido perfluoro-heptanoico em 0,1% de ácido fórmico em água e a fase móvel B era 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila com um gradiente de 100% de B a 100% de A com um tempo de operação de de 4 minutos. A correlação entre SDMA (μg/dL) e creatinina (mg/dL) está mostrada na Fig. 14.

Exemplo 10: Divergência entre os valores de SDMA e Creatinina em alguns gatos com CKD

[00256] Uma divergência na relação SDMA:creatinina pode ser preditiva de mortalidade em animais. Por exemplo, em gatos com CKD, os valores de SDMA observados eram altos em relação às concentrações esperadas com base nos valores de creatinina correspondentes. Como mostrado na Figura 14, havia forte correlação entre SDMA e creatinina, e a relação normal foi menor que 10 (μg/dL:mg/dL). Neste estudo, a relação foi determinada em 26 gatos com CKD. Esses 26 gatos foram diagnosticados com CKD com base em exame físico, creatinina sérica, e urinálise. Como mostrado na Figura 15, dois dos 26 gatos tinham uma relação SDMA:creatinina maior que 10 e morreram durante o período de acompanhamento, embora não tenha sido documentado se esses gatos sofreram eutanásia ou sucumbiram à doença.

Exemplo 11: Relação SDMA: creatinina na predição de mortalidade em gatos com CKD

[00257] Neste estudo, foi observada uma tendência longitudinal de SDMA e creatinina em gatos com CKD. Dezoito gatos com CDK foram incluídos no estudo com base nos seguintes critérios: persistentemente azotêmico por pelo menos 3 meses; ou não azotêmico com uma redução de >30% na GFR em relação à GFR média de gatos normais; ou pedras de oxalato de cálcio nos rins.

[00258] Todos os gatos foram mantidos com cuidados de qualidade incluindo nutrição ideal, cuidados veterinários, e exercícios diários, e oportunidades regulares de enriquecimento ambiental e comportamental. Depois de diagnosticados com CKD, os gatos foram alimentados com a ração PRESCRIPTION DIET® k/d® (Hill’s Pet Nutrition, Inc., Topeka, Kansas).

[00259] Amostras de sangue e urina desses gatos foram coletadas em vários pontos do tempo, congeladas e armazenadas. A creatinina foi medida por colorimetria enzimática usando-se o analisador COBAS®. A SDMA foi medida por LCMS como descrito acima.

[00260] Quando a concentração de SDMA atingiu pela primeira vez ou excedeu 14 μg/dL em cada um dos 18 gatos, 12 gatos tinham uma relação SDMA:creatinina maior que 10:1, e 6 gatos tinham uma relação SDMA:creatinina que era igual a 10:1 ou menos. Para cada gato, o tempo a partir da data em que a concentração de SDMA atingiu pela primeira vez ou excedeu 14 μg/dL até a data de morte foi observado, à exceção de dois gatos. Esses dois gatos ainda estavam vivos quando o estudo foi concluído; assim sendo, a data final do estudo foi substituída pela data da morte desses dois gatos.

[00261] Os 12 gatos que tinham uma relação SDMA: creatinina maior que 10:1, tiveram um tempo de sobrevida médio de 13,9 meses (média = 18,7; faixa = 1,8-47,4). Os 6 gatos que tinham uma relação SDMA:creatinina de 10:1 ou menos tiveram um tempo de sobrevida médio de 18,7 meses (média = 18,9; faixa = 8,7-28,7). Assim sendo, os gatos que tinham uma relação SDMA:creatinina maior que 10:1, tiveram uma mortalidade maior que a dos gatos que tinham uma relação SDMA:creatinina de 10:1. As Figuras 16, 17 e 18 mostram o curso do tempo das relações SDMA:creatinina para três gatos do estudo, com relações SDMA:creatinina excedendo 10 (gato #13, gato #8 e gato #14), durante o curso de vários anos. O gato #13 morreu em 27,2 meses, o gato # 8 morreu em 29,4 meses, e o gato #14 morreu em 12,3 meses, depois da data em que a concentração sérica de SDMA atingiu pela primeira vez pelo menos 14 μg/dL. Na última medição durante a necrópsia, as relações para os três gatos variaram de aproximadamente 17 a 34.

Exemplo 12: Predição de mortalidade usando SDMA e Creatinina

[00262] As Figuras 19 e 20 mostram uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier para gatos (do estudo descrito no Exemplo 11) e para cachorros (do estudo descrito no Exemplo 9) usando um valor de corte de SDMA de 14 μg/dL. A Figura 19 mostra que os gatos tendo uma concentração de SDMA sérica de pelo menos 14 μg/dL tiveram o tempo de sobrevida reduzido e risco de mortalidade aumentado. Os gatos com SDMA sérica inferior a 14 μg/dL sobreviveram aproximadamente 1,6 vezes mais tempo que os gatos tendo uma SDMA sérica igual ou maior que 14 μg/dL. Neste estudo, a creatinina não conseguiu predizer a mortalidade nos gatos (corte de referência 2,1 mg/dL).

[00263] A Figura 20 mostra uma curva de sobrevida de Kaplan- Meier para cachorros tendo concentração de SDMA sérica maior ou menor que 14 μg/dL. Neste estudo, os cachorros com SDMA <14 μg/dL sobreviveram 2,6 vezes mais tempo que os cachorros com SDMA =14 μg/dL. A creatinina não conseguiu predizer a mortalidade (corte de referência 1,5 mg/dL).

[00264] Os exemplos dados acima são meramente ilustrativos e não pretendem ser uma lista exaustiva de todas as modalidades, aplicações ou modificações possíveis da invenção. Assim sendo, vários modificações e variações dos métodos e sistemas descritos da invenção serão aparentes para os especialistas na técnica sem se afastarem do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrito em relação a modalidades específicas, deve ficar entendido que a invenção reivindicada não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. Na verdade, várias modificações dos modos de realização da invenção descrito são óbvias para o especialista na técnica.

[00265] Deve ficar entendido que a invenção não está limitada às metodologias, protocolos, e reagentes, etc. particulares descritos neste relatório, uma vez que estes podem variam como será percebido pelo especialista na técnica. Também deve ficar entendido que a terminologia usada neste relatório é usada apenas com a finalidade de descrever modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da invenção. Também deve ser observado que, conforme usado neste relatório e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", e "o/a" incluem a referência no plural a menos que nitidamente indicado pelo contexto. Assim sendo, por exemplo, uma referência a "um ligador" é uma referência a um ou mais ligadores e equivalentes dos mesmos conhecidos pelos especialistas na técnica.

[00266] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste relatório têm o significado comumente conhecido pelo especialista no campo à qual a invenção pertence. As modalidades da invenção e os vários aspectos e detalhes vantajosos das mesmas estão explicados de forma mais completa com referência às modalidades não limitativas e/ou ilustradas nos desenhos em anexo e detalhadas na descrição que se segue. Deve ser observado que os aspectos ilustrados nos desenhos não estão necessariamente desenhados em escala, e os aspectos de uma modalidade podem ser empregados com outras modalidades como será percebido pelo especialista na técnica, mesmo que não explicitamente mencionado neste relatório.

[00267] Quaisquer valores numéricos apresentados neste relatório incluem todos os valores desde o limite inferior até o limite superior em incrementos de uma unidade desde que haja uma separação de pelo menos duas unidades entre qualquer limite inferior e qualquer limite superior. Como um exemplo, onde especificado que a concentração de um componente ou o valor de uma variável do processo tal como, por exemplo, tamanho, ângulo, pressão, tempo entre outros, varia, por exemplo, de 1 a 90, especificamente de 20 a 80, mais especificamente de 30 a 70, considera-se que valores tais como 15 a 85, 22 a 68, 43 a 51, 30 a 32, etc. estão expressamente enumerados neste relatório. Para valores que são menores que um, uma considerada é considerada igual a 0,0001, 0,001, 0,01 ou 0,1 conforme apropriado. Estes são apenas exemplos daquilo que é especificamente pretendido e todas as combinações possíveis de valores numéricos entre o limite inferior e o limite superior enumerados são considerados como expressamente especificados neste pedido de maneira similar.

[00268] Métodos, dispositivos, e materiais particulares estão descritos, embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste relatório possam ser usados na prática ou teste da invenção. As descrições de todas as referências e publicações citadas acima estão expressamente incorporadas em sua integridade a título de referência como se cada uma delas estivesse individualmente incorporada a título de referência.

Claims (14)

1. Método para estimar a taxa de filtração glomerular (GFR) em uma amostra de um indivíduo animal, caracterizado pelo fato de que compreende: medir a concentração de SDMA livre em uma amostra de sangue do indivíduo; medir a concentração de creatinina em uma amostra de sangue do indivíduo; e comparar o valor resultante de uma equação compreendendo o produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre com um ou mais valores padrão que são correlacionados à taxa de filtração glomerular no indivíduo animal, em que, opcionalmente, a equação compreende o inverso do produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA livre, ou pelo menos uma dentre a concentração de creatinina e a concentração são SDMA livre é ponderada no cálculo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto de um primeiro valor ponderado baseado na concentração de creatinina e um segundo valor ponderado baseado na concentração de SDMA livre é representado pela fórmula PROD = [CRE]P x[SDMA]Q onde PROD é o produto, [CRE] é a concentração de creatinina, [SDMA] é a concentração de SDMA, P fornece o peso para dar a [CRE] na fórmula, e Q fornece o peso para dar a [SDMA] na fórmula, opcionalmente, em que, o um ou mais valores padrão estão correlacionados com o inverso do produto, P=-1 e Q=-1, P é -1,5 e Q = -0,025, P está entre cerca de -5 e 0, mas não inclui 0, ou Q está entre cerca de -2,5 e 0, mas não inclui 0.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda determinar a partir de uma amostra a função renal, uma doença renal ou uma disfunção renal por comparação da GFR na amostra do indivíduo com a FGR em uma ou mais amostras de indivíduos saudáveis.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a medição da concentração de SDMA livre compreende: colocar a amostra em contato com um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador e com um análogo de SDMA; e detectar a presença ou a quantidade do marcador associado ao análogo de SDMA, dessa forma determinando a presença ou a quantidade de SDMA na amostra.

5. Método para diagnosticar uma doença renal ou uma disfunção renal em uma amostra de um indivíduo animal, caracterizado pelo fato de que compreende: medir a concentração de SDMA livre na amostra de soro do indivíduo; medir a concentração de creatinina na amostra de soro do indivíduo; e comparar o produto de um primeiro valor ponderado baseado na concentração de creatinina e um segundo valor ponderado baseado na concentração de SDMA livre com um ou mais valores padrão que são correlacionados à doença renal ou disfunção renal, sendo que o produto de um primeiro valor ponderado baseado na concentração de creatinina e um segundo valor ponderado baseado na concentração de SDMA livre é representado pela fórmula PROD = [CRE]P x[SDMA]Q onde PROD é o produto, [CRE] é a concentração de creatinina, [SDMA] é a concentração de SDMA, P fornece o peso para dar a CRE na fórmula, e Q fornece o peso para dar a SDMA na fórmula, em que, opcionalmente, o um ou mais valores padrão estão correlacionados com o inverso do produto, P=-1 e Q=-1, P é -1,5 e Q = -0,025, P está entre cerca de -5 e 0, mas não inclui 0, ou em que Q está entre cerca de -2,5 e 0, mas não inclui 0.

6. Método para diagnosticar uma doença renal ou uma disfunção renal em uma amostra de um indivíduo animal, caracterizado pelo fato de que compreende: medir a concentração de SDMA livre na amostra de soro do indivíduo; medir a concentração de creatinina na amostra de soro do indivíduo; comparar o produto de um primeiro valor ponderado com base na concentração de creatinina e um segundo valor ponderado com base na concentração de SDMA livre para um ou mais valores padrão que se correlacionam com doença renal ou disfunção renal; e calcular um valor associado ao diagnóstico de uma doença renal ou uma disfunção renal em uma amostra de um indivíduo animal, compreendendo executar instruções legíveis em máquina para calcular o produto de um primeiro valor ponderado baseado na concentração de creatinina em uma amostra de sangue do indivíduo e um segundo valor ponderado baseado na concentração de SDMA livre em uma amostra de sangue do indivíduo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda comparar o valor calculado pelo método, como definido na reivindicação 6, com um valor padrão associado à doença ou disfunção renal.

8. Método para determinar a partir de uma amostra se um indivíduo tem uma doença renal, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) medir as concentrações de SDMA [SDMA] e de creatinina [CRE] em uma amostra de soro do indivíduo (b) calcular uma relação [SDMA] / SDMACUT (c) calcular uma relação [CRE] / CRECUT (d) calcular um valor combinado: C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT (e) determinar que o indivíduo tem uma doença renal se C for maior que CCUT, em que SDMACUT é o valor de corte para SDMA, CRECUT é o valor de corte para CRE e CCUT é o valor de corte para o valor combinado.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (a) medir as concentrações de SDMA [SDMA] e de creatinina [CRE] em uma amostra de soro do indivíduo, (b) calcular um valor combinado: C = [SDMA] / SDMACUT + [CRE] / CRECUT (c) determinar que o indivíduo tem uma doença renal se C for maior que CCUT, onde SDMACUT é o valor de corte para [SDMA], CRECUT é o valor de corte para [CRE], e CCUT é o valor de corte para o valor combinado, em que, opcionalmente, a SDMACUT varia entre cerca de 10 e cerca de 20 μg/dL; a SDMACUT é cerca de 14 μg/dL, a CRECUT varia entre cerca de 1,3 a cerca de 2,5 mg/dL, a CRECUT varia entre cerca de 1,7 e cerca de 2,8 mg/dL, a CRECUT é cerca de 1,7 mg/dL.

10. Método para predizer a morte prematura ou determinar a mortalidade associada a uma doença renal em um indivíduo animal a partir de uma amostra do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) medir a concentração de SDMA livre na amostra de soro do indivíduo; (b) medir a concentração de creatinina na amostra de soro do indivíduo; (c) calcular uma relação [SDMA]/[CRE], e (d) determinar que o indivíduo vai sofrer morte prematura ou o indivíduo tem uma probabilidade aumentada de morte associada à doença renal se a relação foi superior a um valor de corte, em que, opcionalmente, para prever a morte precoce o valor de corte é 10, o valor de corte é 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15, a concentração de SDMA livre é pelo menos 14 μg/dL, o indivíduo animal fora diagnosticado com CKD, ou o indivíduo animal é canino ou felino; e em que, opcionalmente, para determinar a mortalidade associada a uma doença renal o paciente tem uma probabilidade de morte aumentada associada a uma doença renal quando o paciente apresentar uma concentração de SDMA no sangue superior a um nível limítrofe e em que o nível limítrofe é 14 μg/dL, o paciente tem uma probabilidade de morte aumentada associada a uma doença renal quando a relação de corte excede 10, em que o indivíduo animal é canino ou felino, ou em que o indivíduo animal tenha sido diagnosticado com CKD.

11. Dispositivo para determinar a função renal em um indivíduo animal, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira fase sólida, tal como um poço de reação, vareta de medição, fita de teste, disco de escoamento ("flow-through pad"), papel, matriz de fibra ou outro material em fase sólida adequado, tendo ligado à mesma um análogo de SDMA, que pode ter, as seguintes estruturas: onde x e y são inteiros variando de 1 a 5, ou um anticorpo específico para SDMA que tem nenhuma ou substancialmente nenhuma reatividade cruzada com um ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em dimetilarginina assimétrica (ADMA), L- arginina, e N-metilarginina; e uma segunda fase sólida tendo ligada à mesma um reagente sensor de creatinina ou um anticorpo específico para creatinina.

12. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o reagente sensor de creatinina é ácido pícrico ou um sal do mesmo, ou um anticorpo específico para creatinina.

13. Kit para a determinação da função renal em um indivíduo animal, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo anti- SDMA conjugado a um marcador e um análogo de SDMA.

14. Kit, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um conjunto de um ou mais valores padrão associado(s) à função renal baseados no produto da concentração de creatinina e da concentração de SDMA em uma ou mais amostras de sangue dos animais.