JP7282132B2 - 腎疾患の検出方法 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１５年４月３０日に出願した米国仮特許出願第６２／１５５，１５８号
の利益を主張するものであり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

本開示は、一般に、腎機能の決定に関する。より詳細には、本開示は、腎疾患の進行を
診断、予測および決定するための方法に関する。

腎機能を迅速かつ正確に測定できることは重要である。例えば、薬の投薬は、腎不全患
者に適したものでなければならない。したがって、腎機能を正確に評価することは、臨床
医学において必要なことである。しかし、腎不全の診断は、確実なマーカー、および／ま
たは利用可能な診断試験の不足によって妨げられる。臨床診療においては、腎機能を評価
するために、通常、血清クレアチニンが使用される。しかし、血清クレアチニンの使用は
、データが比較的大きく変動しうるので、不正確さを欠点として持つ。加えて、クレアチ
ニンが増加するまでに、最大で腎機能の７５％が失われうることは公知である。

したがって、本発明者らは、当分野における、正確さが増した腎機能評価方法の必要性
を認識している。

一態様において、本開示は、動物が、腎疾患に罹患しているかどうかを決定する方法で
あって、動物からの尿サンプルまたは血液サンプル中のβ－アミノイソ酪酸（ＢＡＩＢ）
を測定すること、および、サンプル中のＢＡＩＢの濃度に基づいて腎疾患を決定すること
を含む方法に関する。該方法は、サンプル中のＢＡＩＢの濃度を、健康な動物からのサン
プル中のＢＡＩＢの濃度に関する参照濃度と比較することをさらに含みうる。

別の態様において、本開示は、動物対象における腎疾患を診断する方法であって、対象
から尿または血液サンプルを得ること、サンプル中のＢＡＩＢの濃度を測定すること、Ｂ
ＡＩＢのレベルを、健康な対象におけるＢＡＩＢの参照濃度と比較すること、ならびに、
サンプル中のＢＡＩＢの値が参照濃度を超える腎障害を診断することを含む方法に関する
。

本開示の種々の態様において、参照濃度は、健康な動物におけるＢＡＩＢの濃度の９５
パーセンタイル値を反映することができる。また、腎疾患は、器質的損傷（ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒａｌ ｄａｍａｇｅ）の結果でありうる。例えば、器質的損傷は、炎症、線維症、傷
害、腎結石（例えば、シュウ酸塩石）またはがんによる浸潤の結果でありうる。腎疾患は
、糸球体腎炎である。

さらなる態様において、本開示は、動物対象が、腎疾患に罹患しているかどうかを決定
するための方法に関する。該方法は、対象から血液または尿サンプルを得ること、サンプ
ル中のＢＡＩＢの濃度および対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）を測定すること、な
らびに、ＳＤＭＡの濃度［ＳＤＭＡ］に対するＢＡＩＢの濃度［ＢＡＩＢ］の比が０．１
５より高い場合、または［ＢＡＩＢ］に対する［ＳＤＭＡ］の比が７未満である場合、腎
疾患を決定することを含む。

さらに、本開示は、動物対象における腎障害を診断する方法に関する。該方法は、対象
から血液または尿サンプルを得ること、サンプル中のＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの１つまた
は複数の濃度を測定すること、ならびに、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡのレベルを、健康な対
象におけるＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの参照濃度と比較することを含む。サンプル中のＳＤ
ＭＡの濃度がＳＤＭＡ参照濃度を超える場合、腎疾患が診断される。また、サンプル中の
ＢＡＩＢの濃度がＢＡＩＢ参照濃度を超える場合、腎機能の喪失は、器質的損傷の結果で
あると診断される。

さらに、本開示は、腎疾患に関連する死亡率を決定するための方法に関する。該方法は
、患者からの血液サンプル中のＢＡＩＢを測定すること、および、患者が閾値よりも高い
血中ＢＡＩＢ濃度を有する場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有すると決定
することを含む。該方法はまた、ＳＤＭＡを測定すること、および、患者が閾値よりも高
い血中ＳＤＭＡ濃度を有する場合、患者が腎疾患に関連する死の高い可能性を有すると決
定することも含む。

さらにまた、本開示は、ＢＡＩＢおよび検出可能な標識を含むＳＤＭＡコンジュゲート
、ＢＡＩＢと、グルタルアルデヒドおよびポリリジンの１つとを含むコンジュゲート、な
らびに、ＢＡＩＢおよびキャリアタンパク質を含むコンジュゲートに関する。

別の態様において、本開示は、ＢＡＩＢに特異的な抗ＢＡＩＢ抗体に関する。該抗体は
、サンプル中のＢＡＩＢの存在または量を決定する方法に関する本開示の様々な態様にお
いて、使用されうる。例えば、該方法は、抗ＢＡＩＢ抗体をサンプルと接触させること、
および、サンプル中の抗体とＢＡＩＢとの結合または結合の量を決定することを含む。該
方法はまた、サンプルおよび抗体を、ＢＡＩＢおよび検出可能な標識を含むコンジュゲー
トと接触させることも含みうる。いくつかの実施形態において、抗体は、標識を含む。

別の態様において、本開示は、抗ＢＡＩＢ抗体を含むキットに関する。該キットは、抗
ＳＤＭＡ抗体をさらに含みうる。

その種々の態様において、本開示は、腎疾患および腎疾患に関連する死亡率の決定、診
断、進行、および予後に関する。本開示は、動物において、腎機能、および腎障害の存在
、可能性または進行を決定するための方法を含む。

種々の態様において、本開示は、腎疾患の存在、可能性または進行、および、腎疾患に
関連する死亡率を決定する、β－アミノイソブチレートとしても知られるβ－アミノイソ
酪酸（ＢＡＩＢ）の使用に関する。ＢＡＩＢは、ネフロンの減少をもたらす腎臓の器質的
損傷のマーカーであり、したがって、腎がん(kidney cancer)、腎癌(renal carcinoma)、
転移性腎癌、腎臓の新生物浸潤、腎臓の炎症、低形質細胞性間質性腎炎(interstitial hy
poplasmocytic nephritis)、糸球体炎症および腎線維症のマーカーである。

加えて、動物、特に、ネコおよびイヌからの血液サンプル中の対称性ジメチルアルギニ
ン（ＳＤＭＡ）およびクレアチニンは、予後の精度を改善するために、ＢＡＩＢと併せて
使用される。したがって、本開示は、動物対象からの血液サンプル中のＢＡＩＢの濃度を
測定するための；動物対象からの血液サンプル中のＳＤＭＡおよび／またはクレアチニン
の濃度を測定するための；ならびに、ＢＡＩＢの濃度のみに基づいて、またはＳＤＭＡお
よび／もしくはクレアチニンと組み合わせて、腎疾患の存在、可能性または進行を決定す
るための、方法を含む。

ＳＤＭＡは、内因性一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）阻害物質である非対称性ジメチルア
ルギニン（ＡＤＭＡ）の構造異性体である。ＡＤＭＡもＳＤＭＡも、Ｌ－アルギニン残基
の核内メチル化から生じ、タンパク質分解後、細胞質中に放出される。ＳＤＭＡは、タン
パク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ５（ＰＲＭＴ５）およびＰＲＭＴ７によって
産生される。メチルアルギニン、例えば、ＳＤＭＡ、ＡＤＭＡ、およびモノメチルアルギ
ニンを有するタンパク質は、ＲＮＡプロセッシング、タンパク質シャトリング、およびシ
グナル伝達に関与する（ＢｅｄｆｏｒｄおよびＲｉｃｈａｒｄ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２０
０５年、１８（３）：２６３～７２）。そのようなメチル化タンパク質の分解から生じた
遊離型ＳＤＭＡは、主に、腎排泄によって排出されるのに対して、ＡＤＭＡは、大部分は
代謝される。ＡＤＭＡは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）のリスク因子、例えば、高血圧、高コレ
ステロール血症、高ホモシステイン血症、インスリン抵抗性、年齢、および平均動脈圧と
強く相関する。ＳＤＭＡは、腎機能のパラメーター、例えば、糸球体濾過量（ＧＦＲ）、
イヌリンクリアランス、およびクレアチニンクリアランスと相関する。

ＢＡＩＢは、（例えば、ＳＤＭＡによって示されるような）腎機能が、正常な参照範囲
内である場合でも、腎臓の損傷または病変のマーカーでありうる。

本開示のさらなる態様を記載する前に、多くの用語を以下に定義する。

ＢＡＩＢは、β－アミノイソ酪酸（β－アミノイソブチレート）である。ＢＡＩＢの構
造は、

である。

ＢＳＡは、ウシ血清アルブミンである。

腎疾患は、器質的損傷を伴ってまたは伴わずに、ネフロン機能（濾過効率）の喪失を含
む。器質的損傷は、病変、炎症、線維症、傷害、浸潤および他の原因によって起こりうる
。がんは器質的損傷の原因でありうるが、がん自身は、一般に、腎疾患として識別されな
い。したがって、いくつかの実施形態において、腎疾患に、腎がんは含まれない。

腎結石は、腎臓または泌尿器の解剖学的構造の任意の部分における石を指し、腎石（ne
phrolith）、尿細管または尿管内の腎石、および膀胱の石を含む。腎結石は、しばしば器
質的損傷および腎疾患につながる。

ＣＭＩＡは、化学発光磁気免疫アッセイである。

ＤＩＰＥＡは、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンである。

ＤＭＦは、ジメチルホルムアミドである。

ＥＩＡは、酵素免疫アッセイである。

ＥＬＩＳＡは、酵素結合免疫吸着アッセイである。

ＥＳＩ－ＭＳは、エレクトロスプレーイオン化質量分析である。

ＦＰＩＡは、蛍光偏光免疫アッセイである。

ＧＦＲは、糸球体濾過量である。

ＨＡＴＵは、（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テ
トラメチルウランヘキサフルオロホスフェートメタナミニウム(methanamininium)である
。

ＫＬＨは、キーホールリンペットヘモシアニンである。

ＭＥＩＡは、微粒子酵素免疫アッセイである。

ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水である。

ＲＩＡは、放射免疫アッセイである。

ＳＤＭＡは、対称性ジメチルアルギニンである。ＳＤＭＡの構造は、

である。

遊離型ＳＤＭＡは、ポリペプチド鎖の一部ではないＳＤＭＡを指す。ＳＤＭＡの１つま
たは複数のアミノ酸残基が、ポリペプチドに存在しうる。

ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸である。

用語「類似体」は、本明細書で使用する場合、概して、１つまたは複数の個々の原子が
異なる原子（複数可）または異なる官能基（複数可）で置きかえられた化合物を指す。例
えば、類似体は、受容体に対する分析物と競合できる、分析物の改変形態であってもよく
、改変は、分析物が別の部分、例えば、標識または固体担体に結合する手段を与える。分
析物類似体は、分析物と同じように抗体に結合することができる。

用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、概して、抗原への曝露に反応して、Ｂリン
パ球細胞により産生される糖タンパク質を指し、その抗原に特異的に結合する。用語「抗
体」を、最も広い意味で使用し、詳細には、それは、所望の生物学的活性を示す限り、モ
ノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、複数特異
性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを包含する。

本明細書で使用する場合、「抗ＢＡＩＢ」、「抗ＢＡＩＢ抗体部分」、もしくは「抗Ｂ
ＡＩＢ抗体フラグメント」および／または「抗ＢＡＩＢ抗体変異体」などは、ＢＡＩＢと
特異的に結合する、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分、例えば、限定されないが、
重鎖もしくは軽鎖定常領域の１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、フレームワーク領域、ま
たはその任意の一部分を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。

本明細書で使用する場合、「抗ＳＤＭＡ」、「抗ＳＤＭＡ抗体部分」、もしくは「抗Ｓ
ＤＭＡ抗体フラグメント」および／または「抗ＳＤＭＡ抗体変異体」などは、ＳＤＭＡと
特異的に結合する、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分、例えば、限定されないが、
重鎖もしくは軽鎖定常領域の１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、フレームワーク領域、ま
たはその任意の一部分を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子を含む。

用語「抗体フラグメント」は、本明細書で使用する場合、完全長の抗体の一部分、概し
て、その抗原結合または可変領域を指す。詳細には、例えば、抗体フラグメントとしては
、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ（ｄｉａ
ｂｏｄｉｅｓ）；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントからの複数特異
性抗体を挙げることができる。

用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、概して、抗原に特異的な抗体と適切な条件
下で反応することができる物質を指す。

用語「分析物」は、本明細書で使用する場合、概して、検出および／または測定される
サンプル中の物質または物質のセットを指す。

用語「動物」は、本明細書で使用する場合、概して、任意の動物、例えば、ヒト、また
はヒト以外の動物、例えば、ネコ、イヌ、またはウマを指す。

用語「サンプル」は、本明細書で使用する場合、一般に、尿、または、それらに限定さ
れないが、全血、血漿、および血清を含む任意の血液由来の流体サンプルを指す。本開示
の方法で使用する血清を用意するために、１つまたは複数の血清サンプルは、動物対象か
ら得られる。血清サンプルを、例えば、血液サンプルとして動物対象から得ることができ
、次いで、分離して血清を用意することができる。ある種の実施形態において、血清は、
血液から分離することなく測定することができる。当業者が理解する通り、単一で得られ
たサンプルを、多数の濃度を測定するために分ける、または使用することができる。ある
いは、複数のサンプルを動物対象から得ることができ、（少なくとも）１つのサンプルは
、目的の各分析物または多数の分析物について、連続的に、並行に、または同時に測定す
る。ある種のそのような場合において、サンプルは、ほぼ同時（例えば、互いに６０分以
内、３０分以内、または１０分以内）に動物から得られる。

用語「交差反応性」は、本明細書で使用する場合、概して、抗体の個々の抗原結合部位
の、２つ以上の抗原決定基と反応する能力、または抗体分子の集団の、２つ以上の抗原と
反応する能力を指す。一般に、交差反応は、（ｉ）交差反応性抗原が、免疫抗原と共通の
エピトープを有すること、または（ｉｉ）交差反応性抗原が、免疫抗原上のエピトープと
構造的に類似するエピトープを有することを理由にして起こる（複数特異性）。

用語「免疫アッセイ」は、本明細書で使用する場合、概して、測定可能な反応を生じさ
せる抗体抗原複合体を用いる検定を指す。「抗体抗原複合体」を、用語「免疫複合体」と
互換的に使用することができる。一般に、免疫アッセイとしては、非競合型免疫アッセイ
、競合型免疫アッセイ、均一系免疫アッセイ、および不均一系免疫アッセイが挙げられる
。「競合型免疫アッセイ」において、試験サンプル中の標識されていない分析物（または
抗原）は、免疫アッセイにおいて、標識されている抗原と競合する能力によって測定され
る。標識されていない抗原は、標識されている抗原の結合能力を妨げる。なぜなら、抗体
の結合部位がすでにふさがれているからである。「競合型免疫アッセイ」において、試験
サンプルに存在する抗原の量は、標識から生じるシグナルの量と逆の関係にある。結合し
た抗体抗原複合体の分離を必要とする免疫アッセイは、一般に、「不均一系免疫アッセイ
」と呼ばれ、抗体抗原複合体の分離を必要としない免疫アッセイは、一般に、「均一系免
疫アッセイ」と呼ばれる。当業者は、様々な免疫アッセイの形態を容易に理解するであろ
う。

「接触」は、本明細書で使用する場合、最も広い態様において、本明細書で別段の定め
がない限り、任意の順で試薬を組み合わせることを指すために使用される。

用語「免疫複合体」は、本明細書で使用する場合、概して、補体結合を伴ってまたは伴
わずに抗原と抗体分子との結合により形成される複合体を指す。抗体または抗原のどちら
か一方が標識された場合、抗原と抗体との結合の結果として、標識は、免疫複合体と関連
する。したがって、抗体が標識された場合、結合の結果として、標識は、抗原と関連する
ようになる。同様に、抗原が標識された場合（例えば、標識を有する分析物類似体）、抗
原と抗体との結合の結果として、標識は、抗体と関連するようになる。

用語「標識」は、本明細書で使用する場合、（例えば、共有結合もしくは非共有結合で
、単独で、または被包化されて）本開示の抗体、ＢＡＩＢ類似体、ＳＤＭＡ類似体または
抗原と直接または間接的にコンジュゲートさせることができる、検出可能な化合物、組成
物、または固体担体を指す。標識は、それ自体で検出可能（例えば、ラジオアイソトープ
標識、化学発光色素、電気化学的標識、金属キレート、ラテックス粒子、または蛍光標識
）であってもよいし、酵素標識の場合において、検出可能である基質化合物または組成物
の化学的変化を触媒してもよい（例えば、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼなど）。本開示で用いる標識は、それらに限定されないが、アル
カリホスファターゼ；グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ（「Ｇ６ＰＤＨ」
）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓ
ｃｅｒ）、例えば、イソルミノール、蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）例えば、フルオ
ロセインおよびローダミン化合物；リボザイム；ならびに色素でありうる。標識はまた、
それ自体が検出可能であってもよい特異的結合分子（例えば、ビオチン、アビジン、スト
レプトアビジン、ジゴキシゲニン(digioxigenin)、マルトース、オリゴヒスチジン、２，
４－ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｅｎａｔｅ）、ｓｓＤＮＡ、
ｄｓＤＮＡなど）であってもよい。標識は、別の分子または固体担体に結合してもよく、
標識された分子の検出を可能にする特性で選択される。標識の利用は、電磁放射または直
接可視化の検出などの手段によって検出することができ、場合により、測定することがで
きるシグナルをもたらす。

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用する場合、概して、実質的に均一な抗
体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体が同一である）から得られる抗体を指す
。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に対するものである。異なるエ
ピトープに対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物に対して、各モ
ノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープに対するものである。修飾語「モノクロ
ーナル」は、抗体の特徴を指すだけであり、任意の特定の方法による抗体の生成を必要と
すると解釈されるべきではない。詳細には、例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリド
ーマ法によって作製されてもよいし、組換えＤＮＡ法によって作製されてもよいし、公知
の技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。

用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、概して、ペプチド結合でつながっ
たアミノ酸配列を有する分子を指す。この用語は、タンパク質、融合タンパク質、オリゴ
ペプチド、環状ペプチド、およびポリペプチド誘導体を含む。抗体および抗体の誘導体を
、別の段落ですでに述べたが、抗体および抗体の誘導体を、本開示の目的のために、ポリ
ペプチドおよびポリペプチド誘導体のサブクラスとして取り扱う。

用語「固体担体」は、本明細書で使用する場合、本開示の抗体またはＳＤＭＡ類似体が
付着できる非水性マトリクスを指す。固体担体の例としては、ガラス（例えば、多孔質ガ
ラス）、合成および天然ポリマー、多糖類（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド
、ポリスチレン、ポリビニルアルコールおよびシリコーン、磁気粒子、ラテックス粒子、
クロマトストリップ、マイクロタイターポリスチレンプレート、または結合されていない
材料から洗浄もしくは分離される抗原および／または抗体と結合することができる任意の
他の物質で部分的または全体的に形成される担体が挙げられる。ある種の実施形態におい
て、適用に応じて、固体担体は、アッセイプレートのウェルである場合もあるし、精製カ
ラム（例えば、親和クロマトグラフィーカラム）である場合もある。

「受容体」は、分子の特定の空間的および極性組織、例えば、エピトープまたは決定部
位を認識できる任意の化合物または組成物を指す。受容体の例としては、抗体、Ｆａｂフ
ラグメントなどが挙げられる。

「結合特異性」または「特異的結合」は、例えば、ポリペプチドと、ポリペプチドに特
異的なポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、または抗体フラグメント（例えば、
Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント）などの第１の分子の
第２の分子への実質的な認識を指す。例えば、「特異性」は、本明細書で使用する場合、
概して、個々の抗体結合部位の、たった１つの抗原決定基と反応する能力、または抗体分
子の集団の、たった１つの抗原と反応する能力を指す。一般に、抗原－抗体反応において
は、高度な特異性が存在する。抗体は、（ｉ）抗原の一次構造、（ｉｉ）抗原の異性形態
、ならびに（ｉｉｉ）抗原の二次および三次構造における違いを区別することができる。
高い特異性を示す抗体－抗原反応は、低い交差反応性を示す。

「実質的な結合」または「実質的に結合する」は、特定のアッセイ条件下でのアッセイ
混合物における分子間の特異的結合または認識の程度を指す。最も広い態様において、実
質的な結合は、第１の分子が第２の分子を結合するまたは第２の分子を認識する能力の欠
如と、第１の分子が第３の分子と結合するまたは第３の分子を認識する能力との差に関連
し、当該差は、分子の相対濃度、ならびにインキュベーションの時間および温度を含む特
定のセットのアッセイ条件下で、特異的な結合を区別する意味あるアッセイの実施を可能
にするのに十分である。別の態様においては、交差反応という意味において、１つの分子
は、別の分子と結合するまたは別の分子を認識する能力が実質的に欠如し、ここでは、特
定のセットのアッセイ条件下で、第１の分子が第２の分子について、第３の分子に対して
示す反応性の２５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満の反応性を示す。特異
的な結合は、広く知られている多くの方法、例えば、免疫組織化学アッセイ、酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、またはウェスタン・ブロ
ットアッセイを使用して試験することができる。

用語「塩」は、本明細書で使用する場合、酸と化合物の塩基性官能基との間に形成され
る塩を意味する。塩の例としては、それらに限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸
塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸
塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸
塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレ
イン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカル酸塩、サッカラート、
ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベン
ゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’－
メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））が挙げられる。用語「塩」は
また、酸性官能基、例えば、カルボン酸官能基を有する化合物と、無機または有機塩基と
の間に形成される塩も指す。適切な塩基としては、それらに限定されないが、アルカリ金
属、例えば、ナトリウム、カリウムおよびリチウムの水酸化物；アルカリ土類金属、例え
ば、カルシウムおよびマグネシウムの水酸化物；他の金属、例えば、アルミニウムおよび
亜鉛の水酸化物；アンモニア、および有機アミン、例えば、非置換またはヒドロキシ置換
モノ－、ジ－、またはトリアルキルアミン；ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン
；ピリジン；Ｎ－メチル、Ｎ－エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン、モノ
－、ビス－、またはトリス－（２－ヒドロキシ－低級アルキルアミン）、例えば、モノ－
、ビス－、またはトリス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、２－ヒドロキシ－ｔｅｒｔ
－ブチルアミン、またはトリス－（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジ－低級
アルキル－Ｎ－（ヒドロキシ低級アルキル）－アミン、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－
（２－ヒドロキシエチル）アミン、またはトリ－（２－ヒドロキシエチル）アミン；Ｎ－
メチル－Ｄ－グルカミン；ならびにアミノ酸、例えば、アルギニン、リシンなどが挙げら
れる。

本開示を続ける場合、一態様において、本開示は、動物が、腎障害、例えば、腎疾患に
罹患しているかどうかを決定するための方法に関する。該方法は、動物からの尿または血
液サンプル中のＢＡＩＢを測定すること、および、サンプル中のＢＡＩＢの濃度に基づい
て、器質的損傷の結果である腎疾患を決定することを含む。例えば、該方法は、サンプル
中のＢＡＩＢの濃度を、健康な動物の集団からのサンプル中のＢＡＩＢにおける濃度に関
係する参照濃度と比較することを含む。動物の血液サンプル中のＢＡＩＢ濃度の参照範囲
または正常な範囲は、明白に健康な（非疾患の）対象からのサンプルを使用して設定する
ことができる。一態様において、参照上限は、健康なネコ対象の集団の９５パーセンタイ
ル値を表す。参照限界を超える血液または尿のＢＡＩＢ濃度［ＢＡＩＤ］を有する対象は
、腎障害、例えば、腎臓の器質的損傷に罹患しているとしてみなされうる。加えて、こう
した患者はまた、腎疾患に関連する早期死亡の高い可能性を有することも特徴とする。ネ
コ対象の場合、９５パーセンタイル値の参照限界は、ネコの集団に対して約２．０μｇ／
ｄＬのＢＡＩＢであってもよい。９５パーセンタイル値の範囲は、例えば、約１．５～２
．５μｇ／ｄＬを含み、特に、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２
．１、２．２、２．３、２．４および２．５μｇ／ｄＬを含むことができる。イヌの場合
、９５パーセンタイル値は、約１．０～２．０であり、特に、約１．０、１．１、１．２
、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９および２．０μｇ／ｄＬで
ある。

本開示の別の態様は、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの組合せを使用して、腎障害を決定する
ことを含む。この態様において、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの両参照範囲は、公知であり、
または健康な対象の集団から得ることができる。参照値より高いＢＡＩＢ濃度およびＳＤ
ＭＡ濃度の値は、腎障害を示しうる。ＳＤＭＡに対する健康な対象の９５パーセンタイル
値を表す適切な参照上限は、例えば、１４μｇ／ｄＬであってもよい。ＷＯ２０１５／０
３５１１５を参照されたい。腎障害の予後はまた、対象からの血液サンプル中のＢＡＩＢ
の濃度とＳＤＭＡの濃度との比を計算することでも達成されうる。［ＢＡＩＢ］／［ＳＤ
ＭＡ］比が０．１５超である、または［ＳＭＤＡＳＤＭＡ］／［ＢＡＩＢ］比が７未満で
あることは、腎障害を示し、死亡の兆候となる。正常なＳＤＭＡ濃度の存在下でのＢＡＩ
Ｂ濃度の上昇は、正常な腎機能であっても器質的損傷を示す可能性がある。上昇したＳＤ
ＭＡ濃度の存在下でのＢＡＩＢ濃度の減少は、器質的損傷の不在下でのネフロン機能の喪
失を示す可能性がある。

他の態様において、本開示は、腎結石を診断する方法に関する。該方法は、対象からの
サンプル中のＢＡＩＢの濃度を測定すること、および、対象が、参照限界より高いＢＡＩ
Ｂ濃度を有するかを決定することを含む。参照限界より高いＢＡＩＢレベルの上昇は、器
質的損傷を示すが、これは腎結石によって起こりうる。超音波、ＣＴスキャンまたはＸ線
による腎臓のさらなる分析は、腎結石の他の症状がなくても確証的でありうる。

別の態様において、本開示は、腎疾患を決定する方法に関し、ここで、該方法は、対象
からの２つ以上のサンプルにおけるＢＡＩＢの濃度を決定することを含み、ここで、該サ
ンプルは、数分、数時間、数日、週、数か月または数年にわたり、対象から得られる。腎
疾患の診断または進行は、サンプル中のＢＡＩＢの濃度に基づいて決定することができる
。サンプル中のＢＡＩＢの濃度が一連のサンプルにわたって上昇している場合、腎疾患、
例えば、腎臓の器質的損傷が悪化していることを決定することができる。死亡率または早
期死亡はまた、一連のサンプル中のＢＡＩＢの濃度の上昇に基づいて、予測されうる。

本開示はまた、本明細書に記載された計算もしくは比の決定を行う、または、腎疾患も
しくは腎機能障害を診断するためのコンピューティング装置にも関する。該コンピューテ
ィング装置は、疾患の状態を決定するために使用することができる方程式から値を実行時
に算出するソフトウェア命令のための記憶装置を含む。

ある種の実施形態において、遊離型ＳＤＭＡの濃度は、参照によりそれら全体がそれぞ
れ本明細書に組み込まれる、米国特許第８，４８１，６９０号、ＷＯ２０１５／０３５１
５５、２０１５年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１１８，８３２号に記
載されている、免疫学的な方法、装置およびキットを使用して決定される。該方法は、１
種または複数のＳＤＭＡ類似体を含む対照、校正物質、または標準物質を含むことができ
る。特に、該方法は、それに限定されないが、マイクロプレートおよびラテラルフロー装
置を使用することを含めて、当業者に周知の免疫アッセイ技術を使用することで達成する
ことができる。ＳＤＭＡを検出するためにサンプルが得られる動物対象としては、ヒトお
よびヒト以外の動物（例えば、ペット、家畜など）対象が挙げられる。

サンプルは、ＥＭＩＴ（登録商標）（酵素増幅免疫アッセイ技術）均一免疫アッセイシ
ステムに基づいて、改変されたアッセイを使用して分析されうる。従来のＥＭＩＴ（登録
商標）アッセイにおいて、分析物を含有するサンプルは、抗分析物抗体、分析物と酵素と
のコンジュゲート、および、酵素と接触した場合にシグナルを発生する基質と接触する。
抗体とコンジュゲートの結合は、酵素活性を阻害し、または減少させる。分析物がサンプ
ル中に存在する場合、サンプルの分析物は、抗体と結合するために、コンジュゲートさせ
た分析物と競合し、その結果、酵素／基質からのシグナルはより多く発生する。分析物が
存在しない場合、抗体とコンジュゲートとの間でさらに結合が起こり、シグナル発生を制
限または妨げる可能性がある。したがって、分析物がより多く存在する場合、シグナルは
より多く発生する。動力学アッセイは、サンプル中の分析物の存在または量を指標として
、シグナル発生速度を使用することができる。

一態様において、シグナルは、当業者には周知のように、酵素／基質システムに特異的
な波長での吸光度として測定される。例えば、Ｇ６ＰＤＨ／ＮＡＤの酵素／基質システム
について３４０ｎｍで吸光度を測定することで、Ｇ６ＰＤＨの存在下での、ＮＡＤからＮ
ＡＤＨへの変換の相対量の値が得られ、これを使用して酵素による基質の変換を反映した
反応速度を得ることができる。

反応速度は、酵素媒介反応の間に、複数の時点でシグナル（例えば、吸光度）を測定す
ることによって決定することができる。シグナル測定の時間および間隔の決定は、試薬の
濃度およびアッセイの温度を考慮する当該技術の範囲内である。例えば、速度は、サンプ
ル（または校正物質）と全試薬とを室温で組み合わせた後、最初の約２～１０分間で吸光
度を測定することによって決定され、さらに１～１５分間に、５～６０秒ごとに測定する
ことができる。反応速度は、吸光度の経時的変化として表されることができる。例えば、
吸光度は、サンプル（または校正物質）と全試薬とを組み合わせた後、約１、２、３、４
、５、６、７、８、９または１０分から開始して測定することができる。吸光度は、通常
、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５分間に
、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０秒の間
隔で測定する。これらの時間はそれぞれ、反応条件、分析物および試薬に応じて、延長ま
たは短縮することができる。

本開示の一実施形態によれば、分析物は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡであり、酵素コンジ
ュゲートシステムは、Ｇ６ＰＤＨ／ＮＡＤである。参照によりそれら全体がそれぞれ本明
細書に組み込まれる、２０１５年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１１８
，８３２号および２０１６年２月１９日に出願された米国特許出願第１５／０４８，２０
９号を参照されたい。本実施形態において、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡの類似体は、動物、
例えば、ヒト、ネコおよびイヌからの血清または血漿サンプル中のＢＡＩＢまたはＳＤＭ
Ａの存在または量を決定するために、Ｇ６ＰＤＨにコンジュゲートされ、アッセイにおい
てコンジュゲートとして使用される。本実施形態の一態様において、校正物質は、公知の
量のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡと校正物質マトリクス（例えば、処理血清）とを組み合わせ
ることによって調製される。

また、固相アッセイ形式は、よく使用される結合アッセイ技術である。分析物の存在（
例えば、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ）が、コンジュゲートおよび／または固定化された相補
性結合メンバーへの分析物の結合によって示される、いくつものアッセイ装置および手順
が存在する。１つの特定の態様において、固定化された結合メンバー（例えば、抗ＢＡＩ
Ｂまたは抗ＳＤＭＡ抗体）は、アッセイの間に、固相、例えば反応ウェル、ディップステ
ィック、試験紙、フロースルーパッド、紙、ファイバーマトリクス、または他の適切な固
相材料に結合する、または結合するようになる。サンプル中のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡと
固定化抗体との結合反応は、標識にコンジュゲートしたＢＡＩＢまたはＳＤＭＡを含むあ
る量のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体をサンプルに添加することによって決定される。サ
ンプルとＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体との混合物を固相に接触させた後、混合物および
固相をインキュベートして、固定化抗体とＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ、およびＢＡＩＢまた
はＳＤＭＡ類似体の間で結合させる。インキュベーション後、結合していない反応物は、
固相から除去される。類似体への抗体の結合によって抗体と結び付いた標識の量が測定さ
れる。抗体に結び付いた標識の量は、サンプル中のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡの量に反比例
する。ある種の実施形態において、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡは、上記の本開示によれば、
別々に標識され、同時に測定される。他の実施形態において、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡは
、単独で、連続的に、または、並行に測定される。

ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに対する１つまたは複数の抗体の、装置または固体担体への固
定化は、抗体が、サンプル、希釈および／または洗浄手順によって流されないように行わ
れる。１つまたは複数の抗体は、物理的吸着によって（すなわち、化学リンカーの使用な
しで）、または化学的結合によって（すなわち、化学リンカーを使用して）、表面に付着
させることができる。化学的結合は、表面での抗体のより強い付着をもたらすことができ
、表面結合分子の所定の配向および形態を与えることができる。

別の実施形態において、特定種において生じたＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ抗体は、固体担
体に結合する抗種抗体との相互作用によって、固体担体に結合する。１つの特定の態様に
おいて、抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体は、ウサギにおいて生じさせ、担体は、ウサギ
において生じた抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体を認識する、抗ウサギ抗体に結合してい
る。この態様において、抗体は、その種から得られた抗血清の形態であってもよい。抗Ｂ
ＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体は、サンプルを固相に添加する前に、抗種抗体を有する固相
に付すこともできるし、抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体は、サンプルを固相に添加する
前に、サンプルと混合させることもできる。どちらの場合でも、抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤ
ＭＡ抗体は、固相上の抗種抗体への結合によって、固相に結合するようになる。

別の実施形態において、１つまたは複数の標識された抗体は、混合物を固体担体に付す
前に、試験サンプルと混合させることができる。この場合において、ＢＡＩＢまたはＳＤ
ＭＡ類似体は、サンプル、希釈および／または洗浄手順によって流されないように固体担
体に付着させることができる。サンプル中の標識された抗体は、サンプル中のＢＡＩＢま
たはＳＤＭＡに結合し、したがって、固体担体でのＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体と結合
させるために利用することができない。混合物を固体担体に付し、適切にインキュベート
した後、混合物は、固体担体から洗浄される。サンプルのＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに結合
していなかった抗体は、固体担体上のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体に結合することにな
る。サンプル中のＢＡＩＢまたはＳＤＭＡの存在または量は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類
似体に結合した抗体の量に反比例する。抗体上の標識に関連するシグナルは、適切な方法
によって測定することができる。

抗体抗原複合体の検出は、当業者に周知の様々な手法、例えば、比濁法、酵素標識化、
放射性標識、発光、または蛍光によって実現することができる。免疫アッセイ法は、当業
者に公知であり、それらに限定されないが、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッ
セイ（ＥＩＡ）、蛍光偏光免疫アッセイ（ＦＰＩＡ）、微粒子酵素免疫アッセイ（ＭＥＩ
Ａ）、酵素増幅免疫アッセイ技術（ＥＭＩＴ）アッセイ、免疫濁度または凝集アッセイ、
ラテラルフロー装置を含むコロイド金ベースの免疫アッセイ、および化学発光磁気免疫ア
ッセイ（ＣＭＩＡ）を含むと理解されている。ＲＩＡにおいて、抗体または抗原は、放射
能で標識され、競合または非競合形式で使用される。ＥＩＡにおいて、抗体または抗原は
、基質を、測定されるシグナル、例えば、色の変化、を生じる産物に変える酵素で標識さ
れる。ＦＰＩＡにおいて、抗原は、蛍光標識で標識され、試料からの標識されていない抗
原と競合する。測定される分析物の量は、測定されるシグナルの量に反比例する。ＭＥＩ
Ａにおいて、固相の微粒子は、目的の抗原に対する抗体で被覆され、分析物を捕捉するた
めに使用される。検出のための抗体は、ＥＩＡ法のように、酵素で標識される。測定され
る分析物の濃度は、測定されるシグナルの量に比例する。ＣＭＩＡにおいて、化学発光標
識が、抗体または抗原へコンジュゲートされ、その基質と合わさった時に光を発生する。
ＣＭＩＡは、競合または非競合形式に設定することができ、それぞれ、存在する分析物の
量に反比例または正比例する結果をもたらす。

特異的結合アッセイにおける、試薬に浸漬した試験紙の使用も周知である。そのような
手法において、試験サンプルは、試験紙の一部分に付され、試験紙材料を移動、または運
ばれる（wick）。したがって、検出または測定される分析物は、試験サンプル自体であり
うるまたは別個に添加される溶出液を利用して、材料中をまたは材料に沿って通過する。
分析物は、分析物の相補性結合メンバーが固定化されている、試験紙上の捕捉部分または
検出部分へと移動する。分析物が検出部分で結合する程度は、試験紙に組み込むこともで
きるまたは別個に付すことができるコンジュゲートを利用して決定することができる。一
実施形態において、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに特異的な抗体は、離れた所で固体担体に固
定化される。サンプルの添加後、固体担体でのＢＡＩＢ－またはＳＤＭＡ－抗体複合体の
検出は、当分野で公知の任意の手段によるものでありうる。例えば、参照によりその全体
が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７２６，０１０号は、ラテラルフロー装置の一
例、ＳＮＡＰ（登録商標）免疫アッセイ装置（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
を記載している。

他の検出技術は、磁気粒子またはマイクロビーズ、例えば、超常磁性酸化鉄に浸漬した
ポリマービーズを用いる。これらのビーズは、例えば、分析物の特異的な結合相手に結び
付く。ビーズは、試験されるサンプル中の標的の分析物と結合し、次いで、通常、磁気に
よって溶液から単離または分離される。一度単離が行われたら、直接的に、光学的に、ま
たはカメラによって、特定の画像かまたは標識を観察することを含む、他の試験を行うこ
とができる。

さらなる実施形態において、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体、特に、チオール含有、ヒ
ドロキシル含有、アミノ含有、およびカルボキシレート含有ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似
体は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡを他の分子（コンジュゲートする標的）、例えば、活性タ
ンパク質と連結させることができ、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡコンジュゲートを形成する。
本明細書に記述するＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ類似体は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡを、コン
ジュゲートする標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、検出可能な標識、固体担体な
どに連結させることができ、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡコンジュゲートをもたらす。本明細
書に記述するＢＡＩＢまたはＳＤＭＡコンジュゲートを使用して、ＢＡＩＢまたはＳＤＭ
Ａに特異的な免疫アッセイで使用する抗体を作ることができる。ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡ
類似体は、ＢＡＩＢまたはＳＤＭＡに特異的な免疫アッセイで使用する標識とコンジュゲ
ートさせることもできる。

一実施形態において、ＢＡＩＢは、キャリアタンパク質とコンジュゲートされ、「ハプ
テン－キャリア」免疫原を形成し、それを、ＢＡＩＢを含むエピトープへの免疫反応を刺
激するために使用することができる。免疫原タンパク質の例としては、それらに限定され
ないが、ＢＳＡ、ＫＬＨ、およびオボアルブミンが挙げられる。ハプテンを免疫原タンパ
ク質とコンジュゲートするためのプロトコルは、当分野で公知である（例えば、Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．
Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８）７８～８７頁を参照されたい）。

適切なＳＤＭＡ類似体は、例えば、参照によりそれら全体が組み込まれる米国特許第８
，４８１，６９０号およびＷＯ２０１５／０３５１５５に記載される。

ＢＡＩＢ類似体は、例えば、ＢＡＩＢ－チオール（アミノ末端およびカルボキシ末端）
ならびにＢＡＩＢ－ＦＭＯＣ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）を含み、ここに示
す：

これらの類似体を使用して、例えば、以下：グルタルアルデヒド－ＢＡＩＢコンジュゲ
ート、ポリリジン－ＢＡＩＢコンジュゲート、ＢＡＩＢ（アミン末端）－ＢＳＡコンジュ
ゲート、ＢＡＩＢ（カルボキシ末端）－ＢＳＡコンジュゲート、ＢＡＩＢ（アミン末端）
－ＫＬＨコンジュゲート、ＢＡＩＢ（カルボキシ末端）－ＫＬＨコンジュゲート、ＢＡＩ
Ｂ－Ｇ６ＰＤＨコンジュゲートおよび粒子にコンジュゲートさせたＢＡＩＢを含む、ＢＡ
ＩＢのコンジュゲートを調製することができる。これらのコンジュゲートのいくつかの構
造を、ここに示す。

代替的実施形態において、ＢＡＩＢおよび／またはＳＤＭＡ類似体は、検出可能な標識
に連結される。標識は、それ自体で検出可能（例えば、ラジオアイソトープ標識、化学発
光色素、電気化学的標識、金属キレート、ラテックス粒子、または蛍光標識）であっても
よいし、酵素標識の場合において、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化
を触媒してもよい（例えば、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼなど）。標識は、それ自体が検出可能であってもよい特異的結合分子（例えば
、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒス
チジン、２，４－ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸（phenylarsenate）、ｓｓＤＮＡ、ｄ
ｓＤＮＡなど）であってもよい。ＳＤＭＡおよび／またはＢＡＩＢは、当業者に周知の方
法を使用して、検出可能な標識に連結させることができる。

ＳＤＭＡおよびＢＡＩＢならびにＫＬＨまたはＢＳＡの類似体のコンジュゲートは、Ｂ
ＡＩＢおよびＳＤＭＡと実質的に結合する抗体（すなわち、抗ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡ抗
体）を生じる免疫原として使用されうる。本開示の方法、装置、およびキットに有用な抗
ＳＤＭＡ抗体および抗ＢＡＩＢ抗体は、ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡに高い親和性で結合する
ことを特徴とする。したがって、本明細書に記述するのは、単離された、遺伝子組換えの
、合成の、および／またはインビボで生成された抗ＢＡＩＢ抗体および抗ＳＤＭＡ抗体、
ならびに、そのような抗体を作製および使用する方法であり、診断用および治療用の組成
物、方法および装置を含む。本明細書に記述する抗体は、例えば、患者のサンプル中のＳ
ＤＭＡおよびＢＡＩＢを決定するためのアッセイの試薬として有用である。一実施形態に
おいて、もたらされた抗体は、ＢＡＩＢおよび遊離型ＳＤＭＡ（すなわち、ポリペプチド
鎖の一部ではないＳＤＭＡ）を検出することができる。

抗体を作製するための方法は、１つまたは複数のＢＡＩＢおよびＳＤＭＡコンジュゲー
トを免疫原として使用して、免疫反応を刺激することを含むことができる。該方法は、適
切な免疫化プロトコルを使用して、１つまたは複数のＢＡＩＢおよびＳＤＭＡコンジュゲ
ートを動物に投与すること、および、動物の体液（複数可）から適切な抗体を分離するこ
とを含む。あるいは、コンジュゲートをファージディスプレイ法で使用して、それらの表
面に適切な抗体を示すファージを選択することができ、その後、少なくとも適切な抗体の
様々なドメイン領域をコードする核酸配列の分離が続く。ファージディスプレイ法は、当
業者に周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ；Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ，１７８、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ
、Ｐｈｉｌｉｐｐａ Ｍ．；Ａｉｔｋｅｎ，Ｒｏｂｅｒｔ（Ｅｄｓ．）２００２を参照さ
れたい）。モノクローナル抗体は、当分野で一般に知られた方法によって、調製すること
ができる。

本明細書に記述するＢＡＩＢおよびＳＤＭＡ類似体は、受容体結合アッセイ、例えば、
ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの免疫アッセイで使用する検出可能なコンジュゲートを与えるた
めに、標識に連結させることができる。同様に、抗ＢＡＩＢおよび抗ＳＤＭＡ抗体も、受
容体結合アッセイ、例えば、免疫アッセイで使用する検出可能な抗ＳＤＭＡ抗体および抗
ＢＡＩＢ抗体を与えるために、標識に連結させることができる。類似体および抗体は、当
業者に周知の方法を使用して、標識に連結させることができる。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２９５、Ｒ．Ｂｕｒｎｓ編（２００５））。検出可能なコンジュ
ゲートまたは検出可能な抗ＳＤＭＡ抗体は、試験サンプル中のＢＡＩＢおよび／またはＳ
ＤＭＡの存在または量に関係するシグナルを出すために、様々な均一系および／または競
合型アッセイ形式で使用することができる。

特定の実施形態において、免疫アッセイ法は、抗ＢＡＩＢおよび抗ＳＤＭＡ抗体の検出
のための競合型免疫アッセイである。競合型免疫アッセイは、以下の例示的な方法で行う
ことができる。動物の体液からの、サンプルは、固体担体とコンジュゲートしたＢＡＩＢ
類似体またはＳＤＭＡ類似体、および検出可能な標識とコンジュゲートした抗ＢＡＩＢお
よび抗ＳＤＭＡ抗体と接触させる。サンプルに存在する、目的の抗体は、固体担体とコン
ジュゲートした類似体との結合のために、検出可能な標識とコンジュゲートした抗ＢＡＩ
Ｂおよび抗ＳＤＭＡ抗体と競合する。固体担体と結び付いた標識の量は、結合していない
抗体および固体担体を分離した後に決定することができる。代替的実施形態において、競
合型免疫アッセイは、以下の例示的な方法で行われる。動物の体液からの、ＢＡＩＢおよ
びＳＤＭＡを含有するサンプルは、検出可能な標識に連結したＢＡＩＢ類似体またはＳＤ
ＭＡ類似体、次いで、固体担体とコンジュゲートした抗ＢＡＩＢまたは抗ＳＤＭＡ抗体と
接触させる。サンプル中のＳＤＭＡまたはＢＡＩＢは、標識された抗体に連結したＢＡＩ
ＢまたはＳＤＭＡコンジュゲートと結合するために、固体担体上のＳＤＭＡまたはＢＡＩ
Ｂと競合する。どちらの場合でも、得られたシグナルは、サンプルに存在するＢＡＩＢま
たはＳＤＭＡの量と逆関係である。

血清中のクレアチニンの濃度は、当業者によって知られているように、様々な方法で測
定することができる。例えば、Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｄｘ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ
ｎａｌｙｚｅｒまたはＶｅｔＴｅｓｔ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅ
ｒは、クレアチニンの試験に適合したドライスライド、例えば、ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓから市販されているものと共に使用することができる。他の分析装置およ
びスライド、例えば、Ｏｒｔｈｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手
可能なＶＩＴＲＯＳ（登録商標）９５０分析装置およびＶＩＴＲＯＳ（登録商標）ＣＲＥ
Ａスライド、ならびにＲｏｃｈｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＣＯＢＡＳ（登録商標
）分析装置および関連したキットも使用することができる。酵素湿式アッセイ（Ｅｎｚｙ
ｍａｔｉｃ ｗｅｔ ａｓｓａｙ）も使用することができる。例えば、当業者は、Ｉｎｔ
ｅｇｒａ ８００分析装置で酵素湿式化学法を使用することができる。１つの特定のアッ
セイは、５５２ｎｍでの検出、および６５９ｎｍでの吸光度ブランキングを伴う、クレア
チニナーゼ／クレアチナーゼ／サルコシンオキシダーゼ系に基づく。当業者は、比色法、
例えば、ピクリン酸に基づくもの、例えば、Ｊａｆｆｅアッセイも使用することができる
。当業者に公知の他の方法、例えば、参照によりそれぞれが本明細書に組み込まれる米国
特許公開第２００５／０２６６５７４号および米国特許第４，８１８、７０３号に記載さ
れているものも、クレアチニン濃度を測定するために使用することができる。ある種の実
施形態において、クレアチニン濃度の測定は、アイソトープ希釈質量分析を使用して行わ
れる。

以下のものは、例示の目的で示すにすぎず、上記の広義の用語で説明している本発明の
範囲を限定することを意図するものではない。本開示で引用したすべての参考文献は、参
照により本明細書に組み込まれる。

実施例１：ＢＡＩＢ血清レベルの液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）アッセ
イ
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）アッセイは、ＢＡＩＢ血清レベルを測
定するために最適化された。

イヌの処理血清は、以下の通り調製した：未処置の市販のイヌの血清（５００ｍＬ）は
、２フィートのＳＮＡＫＥＳＫＩＮ（商標）透析チューブ（３．５Ｋ ＭＷＣＯ、３５ｍ
ｍ Ｄｒｙ Ｉ．Ｄ．）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に充填し、４℃で少な
くとも６時間、２０ｇの炭素粉末を有するＰＢＳ緩衝液（２０Ｌ）に対して透析した。プ
ロセスは、緩衝液と炭素を交換しながら、３回繰り返した。血清中のＢＡＩＢ濃度は、透
析前後に、ＬＣ－ＭＳによって測定された。透析前の血清において、ＢＡＩＢ濃度は、２
～３μｇ／ｄＬであった。透析後、ＢＡＩＢ濃度は、検出限界を下回った。イヌのチャコ
ール処理血清を、使用するために－８０℃で保管した。

ＬＣ－ＭＳ標準曲線を、以下の手順に従って作成した。

水中に５０μｇ／ｄＬのＤ３－ＢＡＩＢ（３つの重水素原子で標識されたＢＡＩＢ）（
ＣＤＮ ＩＳＯＴＯＰＥＳ型番Ｄ－７２２９）を溶解することによって内部標準を調製し
た。

アッセイ標準を、水中の１ｍｇ／ｍＬのＢＡＩＢの溶液を最初に調製することによって
調製した。８μＬのこの溶液を、７９９２μＬのイヌの処理血清に移し、逐次的に処理血
清（上記で調製）に希釈して表１の希釈系列を生成した。

サンプルを、以下に従ってＬＣ－ＭＳについて調製した：
１．５０μＬの試験サンプルまたは参照標準を、バイアルに移した。
２．５０μＬの内部標準溶液を、バイアルに添加し、溶液を、完全に混合した。
３．３００μＬの純粋なアセトニトリルを、バイアルに添加し、溶液を、完全に混合した
。
４．バイアルを、２０分間、３０００ｘｇで遠心分離し、上澄みを、デカント、濾過し（
０．２μｍ）、下記の条件下でＬＣ－ＭＳにかけた。

ＬＣ－ＭＳを、以下の条件下で行った：
移動相Ａ：水、０．１％ギ酸、０．５ｍＭペルフルオロヘプタン酸（Ｓｉｇｍａ ３４２
０４１－５Ｇ）
移動相Ｂ：アセトニトリル、０．１％ギ酸
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＣＳＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１×３０ｍｍ（Ｗａｔｅｒ
ｓ １８６００５２９５）
スキャンタイプ：ＭＲＭ
スキャンモード：正極性
イオン源：ターボスプレー

時間０分で、０％Ｂで開始する。１分で５％Ｂになる勾配に強める。１．２分間で１０
０％Ｂになる勾配に強める（２．２０分マーク）。０．３分間、１００％Ｂを保ち（２．
５分マーク）、その後、初期状態に戻す（０％Ｂ）。

実施例２：健康なおよび疾患を有するネコにおけるＢＡＩＢの測定
正常なネコ対象におけるＢＡＩＢ参照レベルを、両方の性で様々な種の５８匹のネコに
おいて決定した。血清サンプルを集め、上記の通りＬＣ－ＭＳにかけ、個別の試験サンプ
ルを標準（上記で測定）と比較してＢＡＩＢレベルを決定した。この集団における９５パ
ーセンタイル値に基づく参照上限は、２．０μｇ／ｄＬであった。

腎疾患に罹患しているネコの血清中ＢＡＩＢ濃度［ＢＡＩＢ］をまた、ＬＣ－ＭＳによ
って１０匹のネコにおいても測定した。加えて、ＳＤＭＡ濃度［ＳＤＭＡ］を、ＬＣ－Ｍ
Ｓによって測定した。

ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡのレベルを、表２に示す。

ネコのＳＤＭＡの濃度［ＳＤＭＡ］の参照上限は、１４μｇ／ｄＬで、これは健康な対
象におけるＳＤＭＡの濃度の９５パーセンタイル値を表す。ＷＯ２０１５／０３５１１５
を参照されたい。

上昇したＢＡＩＢレベルは、腎臓の器質的損傷の重症度のマーカーであり、死亡の兆候
である。約７未満の［ＳＤＭＡ］／［ＢＡＩＢ］比は、腎疾患における機能的損傷ならび
に器質的損傷を示す。約０．１５より高い［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比はまた、腎疾患
における器質的損傷による機能喪失も示す。高い［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比は、早期
死亡の高い可能性を反映し、低い［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比は、早期死亡の低い可能
性を反映する。ネコの［ＳＤＭＡ］／［ＢＡＩＢ］比の参照限界は、７である。ネコの［
ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比の参照限界は、０．１５である。

実施例３：腎結石を有するネコのＢＡＩＢ
ＢＡＩＢの血清レベルは、腎結石に罹患しているネコ対象において、様々な時間で決定
される。上昇した血清中ＢＡＩＢ濃度は、表３に示される通り、腎結石を示した。

実施例４：糸球体腎炎に罹患しているネコ対象のＢＡＩＢレベル
４匹のネコ患者および１匹のイヌ患者は、腎疾患の結果として死亡した。患者の死後、
剖検により、糸球体腎炎の診断となった。ＳＤＭＡ、ＢＡＩＢおよびＣＲＥは、患者の死
亡の前に集めた貯蔵したサンプルにおいて、遡及的に（上記した通り）測定された。ＢＡ
ＩＢは、表４で示される通り、これらの患者で上昇した。

実施例５：腎障害を有するイヌにおけるＢＡＩＢレベル
正常なイヌ対象におけるＢＡＩＢ参照レベルは、両方の性で様々な種の１３６匹のイヌ
において決定した。血清サンプルを集め、上記の通りＬＣ－ＭＳで分析した。この集団に
おける９５パーセンタイル値に基づく参照上限は、１．２４μｇ／ｄＬであった。

血清中ＳＤＭＡ濃度と血清中ＣＲＥ濃度との間の不調和（すなわち、［ＳＤＭＡ］／［
ＣＲＥ］の高い比および正常値より高い血清ＳＤＭＡ）の存在は、時期尚早の死亡のリス
クを示すことは公知である。ＷＯ２０１５／０３５１５５を参照されたい。したがって、
血清ＢＡＩＢ、ＣＲＥおよびＳＤＭＡを、ＳＤＭＡおよびＣＲＥの様々レベルで、１３匹
のイヌにおいて測定した。比［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］を計算した。これらのデータを
、表５に表す。

それに続いて、イヌのコホートをモニタリングした。［ＳＤＭＡ］：［ＣＲＥ］不調和
を示すイヌにおいて、ＢＡＩＢは、正常なカットオフ値より高く上昇した。［ＳＤＭＡ］
：［ＣＲＥ］不調和を示すイヌにおいて、［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］比は、不調和を示
さないイヌに対して上昇した。追跡すると、［ＳＤＭＡ］：［ＣＲＥ］不調和を示すイヌ
は、死亡と報告された。１．５より高い［ＢＡＩＢ］／［ＳＤＭＡ］の比を、腎機能障害
および時期尚早の死亡のリスクを示すとして決定した。上昇した血清中ＢＡＩＢ濃度は、
腎機能障害および時期尚早の死亡のリスクを示す。

実施例６：がん患者におけるＢＡＩＢおよびＳＤＭＡの測定
ＢＡＩＢおよびＳＤＭＡを、診療所にいる、様々ながんを有する７匹のイヌおよび６匹
のネコの患者の血清で測定した。

７匹のイヌのがん患者のうち、１匹のみ（Ｃ６）が、正常な参照範囲の上限（３．６ｐ
ｇ／ｍＬ）より高いＢＡＩＢレベルを有した。イヌのがん患者Ｃ６は、転移性腎癌を有す
ると見出された、すなわち、Ｃ６は、がんが腎臓に広がっていた群の中で、唯一のイヌだ
った。

６匹のネコのがん患者のうち、腎臓の病理組織学的な陽性所見（転移性腎癌、リンパ形
質細胞性間質性腎炎、炎症、線維症）を有する３匹の患者は、参照範囲（２．０μｇ／ｄ
ｌ）より高いＢＡＩＢの上昇したレベルを有していた（Ｆ３、Ｆ４およびＦ５）。正常な
腎臓の病理組織像を有する３匹の患者は、正常な参照内のＢＡＩＢレベルを有していた。

実施例７：ＢＡＩＢ－Ｇ６ＰＨＤコンジュゲートの調製
ＢＡＩＢとＧ６ＰＤＨとのコンジュゲートを、ＮＡＤおよびＧ６Ｐの存在下で、ＢＡＩ
Ｂ類似体ＳＤＭＡ－ＳＨをＳＩＡ活性化Ｇ６ＰＤＨとコンジュゲートすることで調製した
。

ＳＩＡによる酵素予備活性化：１つのバイアルのグルコース－６－ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）（１２ｍｇ）を、３ｍＬのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．
０）に溶解し、１時間回転して、酵素を完全に溶解したことを確実にした。酵素溶液を、
必要とされるまで氷上で保持した。追加の４．５ｍＬのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８
．０）を、酵素溶液に添加し、ボルテックスでよく混合し（５秒間）、１０分間氷上で溶
液を保持した。１００ｍｇのＧ６Ｐを、１ｍＬの脱イオン水に溶解し、１０分間氷上に置
いた。２００ｍｇのＮＡＤＨを、１ｍＬの脱イオン水に溶解し、１０分間氷上で保持した
。０．６８ｍＬのＧ６Ｐ溶液および０．３４ｍＬのＮＡＤＨ溶液を、酵素溶液に添加し、
ボルテックスでよく混合し（５秒間）、１０分間氷上で溶液を保持した。１つのバイアル
のＳＩＡ（５０ｍｇ）を、０．５ｍＬのＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。０．
１４ｍＬのＳＩＡ溶液を、酵素溶液に添加し、ボルテックスでよく混合し（５秒間）、ア
ルミホイルで覆い、室温で２時間回転した。溶液を、Ｇ２ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ
透析カセットに移し、４℃の暗室で５時間、ＰＢＳ緩衝液（４Ｌ）に対して透析した。緩
衝液を、新しいＰＢＳ（４Ｌ）に交換し、溶液を４℃の暗室で一晩かけて透析した。透析
緩衝液を、ＭＥＳ（４Ｌ、２５ｍＭ、ｐＨ８．０）に交換し、溶液を４℃で３時間透析し
た。１２．５ｍＬの酵素溶液を、透析カセットから除去し、０．３２ｍＬのＭＥＳ緩衝液
（１Ｍ、ｐＨ８．０）および０．３２ｍＬのＥＤＴＡ（０．２Ｍ、ｐＨ８．０）を添加し
て、溶液の最終濃度を５０ｍＭのＭＥＳおよび５ｍＭのＥＤＴＡとした。必要ならば、酵
素溶液が１２．５ｍＬ未満である場合、ＭＥＳおよびＥＤＴＡの体積を、適宜に調整して
もよい。溶液を、５分間アルゴンで脱気した。

ＢＡＩＢ－ＳＨ類似体（カルボキシ末端）を、実施例１２に記載の通り調製し、以下の
通り活性化した酵素にカップリングした：ＢＡＩＢ－ＳＨ（４００ｅｑ、０．０９６ｍｍ
ｏｌ、１５．６ｍｇ）を、水（０．１５６ｍｌ）に溶解し、ＳＩＡ活性Ｇ６ＰＤＨ酵素溶
液に添加した。反応物を４℃で３６時間攪拌した。ＢＡＩＢ－Ｇ６ＰＤＨコンジュゲート
を、４℃で６時間、緩衝液を３回交換しながら、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して透析することに
よって形成し、精製した。

実施例８：グルタルアルデヒド－ＢＡＩＢコンジュゲートの調製
グルタルアルデヒド－ＢＡＩＢコンジュゲートを、２０ｍＭのＰＢＳおよび０．１５Ｍ
のＮａＣｌ（５ｍＬ、総計１０ｍｇ）中の２ｍｇ／ｍＬのＢＡＩＢと、２５μＬ（６．２
５ｍｇ）の追加のグルタルアルデヒド（水中で２５％）とで調製した。室温で１時間反応
後、ＮａＢＨ４（４ｅｑのＢＡＩＢ、０．７７６ｍｍｏｌ、４８ｍｇ）を添加し、反応混
合物を４℃で１８時間攪拌した。

実施例９：ポリリジン－ＢＡＩＢコンジュゲートの調製
ポリリジン－ＢＡＩＢコンジュゲートを、以下の反応スキームに従って、水中の０．１
ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。

Ｆｍｏｃ－ＢＡＩＢ（５ｍｇ）を、水（５ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ（２ｍｇ）およびス
ルホ－ＮＨＳ（３ｍｇ）を添加した。溶液を、室温で１５分間攪拌し、次いで、ポリリジ
ン溶液（２０ｍｌ、０．１％）を添加し、次いで、混合物を室温で３時間攪拌した。溶液
を、ピペリジンに添加して最終濃度を２０％とし、室温で少なくとも１時間インキュベー
トした。反応溶液を、次いで、４℃で、１０Ｋ ＭＷＣＯ透析カセット（３０ｍｌ）でＰ
ＢＳ（４Ｌ）に対して透析し、緩衝液を２回交換した。

実施例１０：粒子－ＢＡＩＢコンジュゲートの調製
５％固体における０．４ｍＬの粒子を、２．８ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液中の、５ｍ
ｇ／ｍＬ濃度の０．８ｍＬのＢＡＩＢと混合し、４℃で２日間回転させて混合した。

実施例１１：ＢＡＩＢ－チオール（アミン末端）およびＢＳＡでコンジュゲートさせたＢ
ＡＩＢの合成
例示的な免疫原であるＢＡＩＢ（アミン末端）－ＢＳＡコンジュゲートを、下記の手順
に従って調製した。

まず、ＢＡＩＢ－ＳＨ類似体（アミノ末端）を、下記の反応スキームおよび下記の方法
により調製した。

１．２２ｍｇ（０．２１６ｍｍｏｌ）のＢＡＩＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ
番号２１７７９４）を、ＰＢＳ（４ｍＬ）に溶解した。
２．５０ｍｇ（０．２１６ｍｍｏｌ）のＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチルチ
オ酢酸 － Ｔｈｅｒｍｏカタログ番号ＰＤ１９９３７７）を、ＤＭＳＯ（０．４ｍＬ）
に溶解し、ＢＡＩＢ溶液に添加した。
３．反応は、２０℃で３０分間、反転させた。
４．反応を、次いで、脱アセチル化溶液（ＰＢＳ中の０．９ｍＬ、０．５Ｍのヒドロキシ
ルアミン、２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）で処理した。
５．反応は、４℃で４時間、反転させ、ＢＡＩＢ－ＳＨ（アミノ末端）を得た。

ＢＡＩＢ－ＳＨを、以下の通りＢＳＡにカップリングした：
１．１ｍＬの反応溶液を、１つのバイアルのマレイミド活性化ＢＳＡ（５ｍｇ）（Ｓｉｇ
ｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号０５４Ｍ４８０１Ｖ）に添加し、反応は、２℃で１８
時間、反転させた。
３．コンジュゲートを１０ＭＷカットオフ、３ｍＬ透析カセット内に設置し、４℃で４８
時間、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して透析した。
４．カップリング効率を、当業者には公知の方法に従って、上記ステップ６から過剰なチ
オール溶液を使用して、エルマン試験によって決定した：１０μＬのサンプル＋２０μＬ
のエルマン試薬＋７０μＬのＤＴＮＢ緩衝液を、次いで、４１２ｎｍで読み取った。

実施例１２：ＢＡＩＢ－チオール（カルボキシ末端）とＢＳＡコンジュゲートされたＢＡ
ＩＢとの合成
例示的な免疫原であるＢＡＩＢ（カルボキシ末端）－ＢＳＡコンジュゲートを、以下の
手順に従って調製した。

ＢＡＩＢ樹脂の調製：
ＢＡＩＢ－ＳＨ樹脂を、以下の一般的な反応スキームに従って、および下記のように調
製した。

１．１５０ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）のＢＡＩＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ
番号２１７７９４）、４００ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ－Ｃｌ（Ｆｌｕｋａ
ＢＣＢＨ６１５３Ｖ）、０．４１ｍＬ（０．４７ｍｍｏｌ）のＤＩＰＥＡ（Ｓｉｇｍａ－
Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号７７９９６ＪＪ）、および１８ｍＬのＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ－
Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２３１８５）を含む混合物を、２０℃で３時間、反転させた
。
２．以下を、上記の混合物に添加した：１．２ｇ（０．０９３ｍｍｏｌ）の４－メトキシ
－トリチル樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｓ６０１３８８７ ３４８）および５３０ｍ
ｇ（０．２８ｍｍｏｌ）のＨＡＴＵ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｓ８４４６５１３ ３０
９）。得られた溶液を、２０℃でさらに１８時間、反転させた。
３．ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを、次いで、添加し、１５分間反転させた（３×１８ｍ
Ｌ）。
３．インキュベーション後、樹脂を、ＤＭＦ（４×１８ｍＬ）、次いで、ＭｅＯＨ（４×
１８ｍＬ）で洗浄し、乾燥して０．９５ｇのＢＡＩＢ－ＳＨ樹脂を得た。

ＢＡＩＢ（カルボキシ末端）－ＢＳＡコンジュゲートの合成
１．２００ｍｇのＢＡＩＢ－ＳＨ樹脂を、４ｍＬのＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
カタログ番号９１７０７）に添加した。
２．ＢＡＩＢ－ＴＦＡ混合物を、２０℃で１時間、反転させた。
３．反応物を、乾燥して、２０ｍｇのＢＡＩＢ－チオール類似体を得た。
４．ステップ３からのチオールを、ＰＢＳ（４ｍＬ）に溶解した。
６．チオール溶液を、４つのバイアルのマレイミド活性化ＢＳＡ（２０ｍｇ）（Ｓｉｇｍ
ａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号０５４Ｍ４８０１Ｖ）に添加し、反応は、４℃で１８時
間、反転させた。過剰な溶液を、エルマン試験のために保存した：１０μＬのサンプル＋
２０μＬのエルマン試薬＋７０μＬのＤＴＮＢ緩衝液を、次いで、４１２ｎｍで読み取っ
た。
７．コンジュゲートを１０ＭＷカットオフ、３ｍＬ透析カセット内に設置し、４℃で４８
時間、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して透析した。
８．カップリング効率を、当業者には公知の方法に従って、上記ステップ５から過剰なチ
オール溶液を使用して、エルマン試験によって決定した：１０μＬのサンプル＋２０μＬ
のエルマン試薬＋７０μＬのＤＴＮＢ緩衝液を、次いで、４１２ｎｍで読み取った。

実施例１３：ＫＬＨコンジュゲートされたＢＡＩＢの合成
例示的な免疫原であるＢＡＩＢ（カルボキシ末端）－ＫＬＨコンジュゲートを、以下の
手順に従って調製した：
１．１００ｍｇのＢＡＩＢ－ＳＨ樹脂（上記、実施例１１を参照されたい）を、２ｍＬの
ＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＳＨＢＤ１５３７Ｖ）に添加した。
２．ＢＡＩＢ－ＴＦＡ混合物を、２０℃で１時間、反転させ、樹脂を、濾別し、０．５ｍ
Ｌのアセトニトリルで洗浄した。
３．反応を、乾燥して、１５ｍｇのＢＡＩＢ－ＳＨを、澄んだ油として得た。
４．ステップ３からの油を、ＰＢＳ（３ｍＬ）に溶解して、ＢＡＩＢチオール溶液を形成
した。
５．２ｍＬのチオール溶液を、１０ｍｇのマレイミド活性化ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄ
ｒｉｃｈカタログ番号０７２Ｍ４７９６）に添加し、反応は、４℃で１８時間、反転させ
た。
６．コンジュゲートを１０ＭＷカットオフ、３ｍＬ透析カセット内に設置し、４℃で４８
時間、ＰＢＳ（４Ｌ）に対して透析した。
７．カップリング効率を、当業者には公知の方法に従って、上記ステップ５から過剰なチ
オール溶液を使用して、エルマン試験によって決定した：１０μＬのサンプル＋２０μＬ
のエルマン試薬＋７０μＬのＤＴＮＢ緩衝液を、次いで、４１２ｎｍで読み取った。

実施例１４：抗ＢＡＩＢポリクローナル抗体を作製する方法
抗ＢＡＩＢポリクローナル抗体を作製する免疫プロトコルを、当業者には周知の、以下
のプロトコルに従って実施してもよい。ウサギを、例えば、上記の実施例８～１２からの
免疫原の１つ、または別のＢＡＩＢ特異的抗原で免疫する。それぞれの場合、例示的な免
疫を、１ｍＬの完全フロイントアジュバントと混合された、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）中の０．５ｍｇの免疫原を注射することによって実施する。各動物の剃毛さ
れた背部に、２０～３０回の皮内注射を行ってもよい。各動物の後ろ足に、等量の不完全
フロイントアジュバントと混合された１ｍＬのＰＢＳ中の０．２５ｍｇの免疫原で追加免
疫してもよい。追加免疫注射を、最初の注射後に各月に与えてもよい。各追加免疫の７～
１０日後に、各ウサギから試験採血の血液５ｍＬを採取することができる。採血産物４０
ｍＬを、３回目の追加免疫注射後、抗血清力価が約１：２０００より大きかった時、各ウ
サギから採取することができる。抗血清力価は、アッセイについての校正曲線の傾きが最
も大きい、抗血清の希釈度である。

実施例１５：抗ＢＡＩＢモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体を生成する方法は、当該分野の技術内である。実施形態において、
抗体は、グルタルアルデヒド－ＢＡＩＢコンジュゲート、ポリリジン－ＢＡＩＢコンジュ
ゲート、ＢＡＩＢ（アミン末端）－ＢＳＡコンジュゲート、ＢＡＩＢ（カルボキシ末端）
－ＢＳＡコンジュゲート、ＢＡＩＢ（アミン末端）－ＫＬＨコンジュゲート、または、Ｂ
ＡＩＢ（カルボキシ末端）－ＫＬＨコンジュゲートに対して生じたモノクローナル抗体で
ある。抗体は、当業者に周知の方法を使用することによって、精製し、特徴付けられうる
。

実施例１６：抗ウサギＢＡＩＢ抗血清の調製
抗ＢＡＩＢ抗体特異性を、ＢＡＩＢ（アミン末端）－ＫＬＨコンジュゲートとＢＡＩＢ
（カルボキシ末端）－ＫＬＨコンジュゲートとの混合物に対して生じたウサギ抗ＢＡＩＢ
血清を使用する結合アッセイにより示した。ＢＡＩＢを量り、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で溶解
して１．０ｍｇ／ｍｌとし、さらに希釈して５０μｇ／ｍｌとした。タンパク質Ａ（ｒＰ
Ａ）スラリーを、ウサギ抗ＢＡＩＢ抗血清によってインキュベートして、ＩｇＧを捕捉し
た。陰性対照において、タンパク質Ａ（ｒＰＡ）スラリーを、ＰＢＳによってインキュベ
ートした。インキュベーション後、６００μＬのｒＰＡスラリーを、マイクロスピンカラ
ムに添加し、回転して液体を除去した。３００μＬの５０μｇ／ｍＬのＢＡＩＢを、カラ
ムに添加し、２５℃で１００分間インキュベートした。カラムを、次いで、回転し、フロ
ースルーを集めた。フロースルーを、次いで、以下の通り、ＬＣ－ＭＳによる分析で調製
した。５０μＬのフロースルーの各サンプルを、９６ウェルのプレートにおいて、５０μ
ＬのＢＡＩＢ内部標準と混合し、次いで、２０分間、３，０００ｘｇで遠心分離した。３
００μＬのアセトニトリルを、次いで、プレート内の各サンプルに添加し、プレートを、
次いで、２０分間超音波処理した。プレートを、次いで、２０分間、３，０００ｘｇで遠
心分離した。３００μＬの上澄みを、次いで、９６ウェルのプレートフィルター（０．４
５ｕｍ）に充填することによって濾過し、２０分間、３，０００ｘｇで遠心分離した。濾
過後、プレートを、次いで、４時間、ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥した。乾燥後、５０μＬの
２０％アセトニトリル溶液を、各サンプルに添加した。サンプルを、次いで、ＬＣ－ＭＳ
にかけた。下記の表７に示す通り、抗ＢＡＩＢ：ｒＰｒｏｔＡカラムは、対照のｒＰｒｏ
ｔＡカラムより６．６％多くＢＡＩＢと結合した。

先に示した実施例は、例示的なものにすぎず、本発明のすべての可能な実施形態、応用
、または変更形態の網羅的な列挙であることを意味するものではない。したがって、本発
明の範囲および趣旨を逸脱することなく、上記の本発明の方法および系の種々の変更形態
または変形物が、当業者に明らかである。本発明を、特定の実施形態と絡めて説明してき
たが、特許請求している本発明を、そのような特定の実施形態に過度に限定すべきではな
いと理解すべきである。実際、本発明を実施するための上記の形態の種々の変更形態が、
当業者に明らかである。

本発明を、本明細書に記述した特定の方法、プロトコル、および試薬などに限定しない
と理解されたい。なぜなら、それらは、当業者が認識するように変わりうるからである。
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を記述するために使用するものにすぎず、本
発明の範囲を限定していることを意図するものではないとも理解されたい。また、本明細
書で使用する場合、および添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ、ａｎ）
」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の言及を含む
ことにも留意されたい。したがって、例えば、「１つのリンカー（ａ ｌｉｎｋｅｒ）」
への言及は、１つまたは複数のリンカー、および当業者に公知の等価物への言及である。

別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明
が関係する技術分野の当業者に共通に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の
実施形態および種々の特徴、ならびにそれらの有利な詳細を、非限定的な実施形態の参照
によってより十分に説明され、および／または添付図面で図示し、その後の説明で詳述す
る。図面に示した特徴は、必ずしも正寸ではなく、本明細書で明記されていなくても、当
業者が認識するように、一実施形態の特徴を他の実施形態によって用いることができるこ
とに留意すべきである。

本明細書に記述する任意の数値は、その低い値と高い値とが少なくとも２単位離れてい
れば、その低い値からその高い値まで１単位ずつ増えるすべての値を含む。一例として、
ある成分の濃度、またはプロセスの変数の値、例えば、大きさ、角度、圧力、時間などが
、例えば、１～９０、詳細には２０～８０、より詳細には３０～７０と記載されていれば
、１５～８５、２２～６８、４３～５１、３０～３２などの値を本明細書に明白に列挙し
ていることを意図するものである。１未満の値の場合、１単位は、適宜０．０００１、０
．００１、０．０１または０．１であると考える。これらは、特に意図しているものの単
なる一例にすぎず、列挙している最小の値から最高の値までの間の数値のすべての可能な
組合せを、同じように本出願に明記しているものと考えるべきである。

特定の方法、装置、材料を記述するが、本明細書に記述するものと類似または同等の任
意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができる。先に引
用したすべての参考文献および刊行物の開示は、あたかも、それらそれぞれが、参照によ
って個々に組み込まれるように、参照によってそれら全体が本明細書に明らかに組み込ま
れる。

Claims (7)

1. 構造式：
   

   

   ［式中、Ｒ _８ は－（Ｃ_１－アルキル）－Ｄである
   ［式中、Ｄは、標識またはタンパク質である］］
   を有する化合物またはその塩、ならびに／あるいはその溶媒和物または水和物。
2. Ｄが、ラジオアイソトープ標識、化学発光色素、電気化学的標識、金属キレート、ラテックス粒子、蛍光標識、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４－ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびグルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼからなる群から選択される標識である、請求項１に記載の化合物。
3. Ｄが、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アビジン、ストレプトアビジンおよびオリゴヒスチジンからなる群から選択されるタンパク質である、請求項１に記載の化合物。
4. Ｄが、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンから選択されるタンパク質である、請求項１に記載の化合物。
5. 式：
   

   

   を有する、請求項１に記載の化合物。
6. 式：
   

   

   を有する、請求項１に記載の化合物。
7. 式：
   

   

   を有する、請求項１に記載の化合物。