JP2007176872A - アシンメトリックジメチルアルギニンを認識する抗体及びその製造方法並びに翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明はアシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）と特異的に反応する新規抗体又はその抗体フラグメント、前記抗体を産生するハイブリドーマ、及び前記抗体の製造方法並びに前記抗体を用いたＡＤＭＡを含む塩基性タンパク質の解析方法を提供する。
【解決手段】本発明の抗体はＡＤＭＡに特異的に反応し、タンパク質をアシル化することにより、タンパク質への反応がより強くなることを特徴とする抗体又は抗体フラグメントである。本発明の抗体及びタンパク質のアセチル化を組み合わせることによって、従来同定されていなかった、ＡＤＭＡを含むタンパク質を検出することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、アシンメトリックジメチルアルギニンと特異的に反応する新規抗体又はその抗体フラグメント、前記抗体を産生するハイブリドーマ、及び前記抗体の製造方法並びに前記抗体を用いたアシンメトリックジメチルアルギニン含有タンパク質の検出方法に関する。

生体内のタンパク質は、ｍＲＮＡから翻訳された後、そのままの形で機能を発揮することはなく、様々な翻訳後修飾を受けることが知られている。例えば、タンパク質のリン酸化は細胞外シグナルを核まで伝達する際のシグナルカスケードとして、又は正常な細胞周期が進行するための制御因子として重要な役割を果たしている。核のクロマチン構造の形成に関与しているヒストンのアセチル化は、転写を効率的に進行させるために重要である。また、タンパク質がユビキチン化されるとプロテアソームに運ばれて分解して活性を失うことが知られている。一方、多くのタンパク質は、小胞体膜に存在するシグナルペプチダーゼによってシグナルペプチドが切り取られることにより活性型になる。この様に、タンパク質はｍＲＮＡから翻訳された後に、様々な修飾を受けることにより適切な時期に適切な場所で、それぞれの機能を発揮することになる。一方で、この翻訳後修飾の異常は、様々な疾患の原因となることが考えられる。

このようなタンパク質の翻訳後修飾の中で、タンパク質中のアルギニン残基のメチル化が、最近注目されるようになって来た。メチル化アルギニンには、シンメトリックジメチルアルギニン（以下、ＳＤＭＡと称することがある）、アシンメトリックジメチルアルギニン（以下、ＡＤＭＡと称することがある）、及びアルギニンからＳＤＭＡ又はＡＤＭＡへの中間体であるモノメチルアルギニン（以下、ＭＭＡと称することがある）が存在する。このうち、血中のＡＤＭＡは血管組織のＮＯ代謝や血管内皮機能に影響を与えるとされており、動脈硬化の病変との関連が考えられている。

ＡＤＭＡを含め、タンパク質の翻訳後修飾及びタンパク質の機能発現、又は疾患との関連を調べるために、まずどのようなタンパク質が翻訳後修飾を受けているのかを調べることが重要である。翻訳後修飾を受けたタンパク質を検出する手段としては、それぞれの翻訳後修飾に特異的なプローブ分子を用いる方法が考えられる。例えば、リン酸化チロシンを認識するプローブとしては、リン酸化チロシンに特異的に反応する抗体が多数市販されており、広く活用されている。しかしながら、ＡＤＭＡを効率よく検出できる有用な抗体は一般に利用可能な状態ではなく、ＡＤＭＡを含む蛋白は、２０種類程度が同定されているのみであった。

このような状況下で、Ｂｏｉｓｖｅｒｔらは、ＡＤＭＡ及びグリシンがクラスターを形成している配列番号１で表されるペプチド（Ｋ−Ｇ−ＡＤＭＡ−Ｇ−ＡＤＭＡ−Ｇ−ＡＤＭＡ−Ｇ−ＡＤＭＡ−Ｇ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−Ｐ−ＡＤＭＡ−Ｇ−ＡＤＭＡ−Ｇ−ＡＤＭＡ−Ｇ−ＡＤＭＡ−Ｇ：以下、ＡＤＭＡ−Ｇリッチペプチドと称す）を免疫源として用いることにより、ＡＤＭＡに対する抗体（ＡＳＹＭ２４）を取得した。彼らが、このペプチドを用いた理由は、アルギニンをメチル化する主要な酵素である、ＰＲＭＴ１（ｔｙｐｅＩ）及びＰＲＭＴ５（ｔｙｐｅＩＩ）が、アルギニン及びグリシンがクラスターを形成している領域（以下、ＲＧ−リッチクラスターと称す）のアルギニンを選択的にメチル化することが知られていたからである。彼らは、この抗体を用いた免疫沈降により、ＡＤＭＡを含むタンパク質を分離し、そのアミノ酸配列を決定したが、ほとんどのタンパク質が、ＲＧ−リッチクラスターを有していることがわかった。そのため、ＡＤＭＡに対する抗体であるＡＳＹＭ２４抗体は、ＲＧ−リッチクラスターに存在するＡＤＭＡを認識していると推定される。（非特許文献１）。

「モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」、（米国）、２００３年、第２巻、第１２号、ｐ．１３１９−１３３０

しかしながら、本発明者らは、タンパク質のＲＧ−リッチクラスターの領域以外にも、アシンメトリックジメチルアルギニンが存在すると考えた。従来の抗体は、ＲＧ−リッチクラスターに存在するＡＤＭＡを有するタンパク質を検出すると考えられたため、それ以外の領域に存在するＡＤＭＡを有するタンパク質の解析は困難であった。本発明者らは、ＡＤＭＡを有する新規なタンパク質を検出できる抗体について、鋭意研究した結果、従来の免疫源と異なる構造のペプチドを担体タンパク質に結合させた複合体で、動物を免疫することにより、公知の抗ＡＤＭＡ抗体と異なる反応性を示す抗体を調製できることを見出した。更に、本発明の抗体は、正荷電の少ないタンパク質に存在するＡＤＭＡを検出することが可能であり、本発明の抗体及びタンパク質の化学修飾、特には、アセチル化を組み合わせることによって、従来同定されていなかった、ＡＤＭＡを含む塩基性タンパク質を検出する方法を見出した。本発明はこうした知見に基づくものである。

前記の課題は、アシンメトリックジメチルアルギニンに特異的に反応し、アシンメトリックジメチルアルギニンを含有するタンパク質に対してタンパク質側鎖の化学修飾化処理を行うことによって得られる化学修飾化アシンメトリックジメチルアルギニン含有タンパク質に特異的に反応する抗体によって解決することができる。本発明の抗体の好ましい態様においては、アシンメトリックジメチルアルギニンに特異的に結合し、式（４）：
Ｇｌｙ−ＡＤＭＡ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （４）
［ＡＤＭＡはアシンメトリックジメチルアルギニンであり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンである］で表されるペプチドに対する結合力より、式（８）：
Ｇｌｙ−ＡＤＭＡ−ＡｃＬｙｓ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （８）
［ＡＤＭＡはアシンメトリックジメチルアルギニンであり、ＡｃＬｙｓはアセチル化リジンであり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンである］で表されるペプチドに対する結合力が、上昇することを特徴とする抗体である。本発明の抗体の別の好ましい態様においては、マウスモノクローナル抗体であり、特には、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４５８であるハイブリドーマによって分泌される抗体である。また、本発明は、前記抗体のフラグメントであって、アシンメトリックジメチルアルギニンに特異的に反応する抗原結合部位を含むことを特徴とする、抗体フラグメントに関する。また、本発明は、前記抗体を産生するハイブリドーマであり、特には、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４５８であるハイブリドーマに関する

また、本発明は、一般式（９）：
Ｘ−ＡＤＭＡ−Ｚ−Ｃｙｓ （９）
［式中、ＸはＣｙｓ以外の同一又は異なるアミノ酸残基１〜５からなるペプチドフラグメントであり、ＡＤＭＡはアシンメトリックジメチルアルギニンであり、ＺはＣｙｓ以外の同一又は異なるアミノ酸残基１〜５からなるペプチドフラグメントである］の配列で表されるペプチドを担体タンパク質に結合し、動物を免疫することを特徴とする、抗アシンメトリックジメチルアルギニン抗体の製造方法にも関する。本発明の抗体の製造方法の好ましい態様においては、ＸがＧｌｙであり、Ｚがε−アミノカプロン酸である一般式（９）で表されるペプチドである。本発明の抗体の製造方法の別の好ましい態様においては、動物が、自己免疫疾患マウスであり、特にはＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスである。

更に、本発明は、（１）翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を含む可能性のある被検試料に対して、タンパク質側鎖の化学修飾化を実施する工程、（２）タンパク質側鎖の化学修飾化によって得られる翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質に特異的に反応するプローブと、前記化学修飾化処理被検試料とを接触させる工程、及び（３）前記接触工程によって形成される、化学修飾化された翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質と前記プローブとの結合を検出する工程を含むことを特徴とする、前記翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法にも関する。本発明の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法の好ましい態様においては、翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質が、アシンメトリックジメチルアルギニンを含有するタンパク質である。本発明の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法の別の好ましい態様においては、タンパク質側鎖の化学修飾化が、アシル化又はアルキル化である。本発明の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法の別の好ましい態様においては、修飾アミノ酸に対するプローブが、ＡＤＭＡに特異的に反応する抗体又は抗体フラグメントである。本発明の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法の別の好ましい態様においては、タンパク質を等電点、分子量、又は等電点及び分子量の組み合わせ、により分別する工程を更に含む。

更に、本発明は、（１）翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を含む可能性のある被検試料に対して、タンパク質の電荷を変化させる処理を実施する工程、（２）電荷変化処理した被検試料に対して、タンパク質の等電点による分別を実施する工程、（３）分別後の被検試料と、翻訳後修飾アミノ酸に特異的に反応するプローブとを接触させる工程、及び（４）前記接触工程によって形成される、分別されたタンパク質と前記プローブとの結合を検出する工程を含むことを特徴とする、前記翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法にも関する。本発明の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法の好ましい態様においては、分別工程の前又は後に、タンパク質の分子量による分別を実施する。本発明の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法の別の好ましい態様においては、プローブが、メチルリジンに対する抗体である。

本発明の抗体は、アシンメトリックジメチルアルギニンを含むタンパク質の探索、同定に有用である。また、本発明の抗体及びタンパク質の化学修飾化を組み合わせた、翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法は、従来同定できなかったＡＤＭＡを含むタンパク質を同定することを可能にした。本発明の抗体、及び検出方法を用いて、疾病に関連する標的分子としての、ＡＤＭＡ含有タンパク質を同定することが可能となる。更には、本発明の抗体は同定した疾患に関連する標的分子の機能制御による治療及び標的分子を検出することによる診断に使用することが可能である。

本発明の抗体は、アシンメトリックジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）と特異的に反応し、シンメトリックジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）とは反応しない。本発明の抗体が認識するＡＤＭＡとは、一般式（１）

で表される、アルギニンの側鎖のアミノ基の水素原子２つが、メチル基で置換されたアルギニンである。本発明の抗体が反応しない、ＳＤＭＡとは、一般式（２）

で表されるアルギニンの側鎖のアミノ基の水素原子及びイミノ基の水素原子がメチル基に置換されたアルギニンである。本発明の抗体は、モノメチルアルギニン及びアルギニンにも反応しない、ＡＤＭＡに特異的に反応する抗体である。つまり、ＡＤＭＡに特異的に反応するとは、ＡＤＭＡに反応し、ＳＤＭＡ、モノメチルアルギニン、及びアルギニンに反応しないことを意味する。

本発明の抗体は、ＡＤＭＡを含む下記の３種類のペプチドとＢＳＡの複合体に特異的に反応する。
一般式（３）：
Ｌｅｕ−ＡＤＭＡ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （３）
（ＢＳＡはウシ血清アルブミンである：以下、ＲＭＥ−ＬａＲＣ−ＢＳＡと称することがある）
一般式（４）：
Ｇｌｙ−ＡＤＭＡ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （４）
（以下、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡと称することがある）
一般式（５）：
Ｇｌｙ−ＡＤＭＡ−Ａｃｐ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （５）
（Ａｃｐはε−アミノカプロン酸である：以下、ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＢＳＡと称することがある）

一方、本発明の抗体は、ＳＤＭＡ及びメチル化されていないアルギニンを含む下記のペプチドとＢＳＡの複合体には、反応しない。
一般式（６）：
Ｌｅｕ−ＳＤＭＡ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （６）
（以下、ＲＭＥ−ＬｓＲＣ−ＢＳＡと称することがある）
一般式（７）：
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （７）（以下、ＬＲＧＲＧＲＫＣ−ＢＳＡと称することがある）

本発明の抗体の、ＡＤＭＡを含む複合体であるＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＢＳＡに対する反応は、遊離のＡＤＭＡを反応系に添加することによって、用量依存的に阻害されるが、モノメチルアルギニン及びアルギニンを添加することによっては、阻害されなかった。これらの反応性は、本発明の抗体が、１つのアシンメトリックジメチルアルギニンを特異的に認識する抗体であり、ＡＤＭＡ及びその周辺のアミノ酸を認識する抗体でないことを示している。

更に、本発明の抗体は、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡのリジンをアセチル化したペプチドとＢＳＡの複合体である、
一般式（８）
Ｇｌｙ−ＡＤＭＡ−ＡｃＬｙｓ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （８）
（以下、ＲＭＥ−ＧａＲａｃＫＣ−ＢＳＡと称することがある）、
に対して、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対する反応より強い反応を示す。本発明の抗体は、ＬＲＧＲＧＲＫＣ−ＢＳＡのリジンがアセチル化された複合体に対しては反応しないため、ペプチドやＢＳＡ中のアセチル化リジンに反応しているのではなく、ＡＤＭＡに反応している。更に、本発明の抗体は、細胞中のタンパク質に含まれるリジンをアセチル化することによって、タンパク質への反応性が強くなる。このため、タンパク質をアセチル化することよって、従来は検出できなかった、ＡＤＭＡを含むタンパク質を検出することが可能になる。

一方、後述の実施例６で示すように、市販されている、ＡＤＭＡに対するモノクローナル抗体であるｃｌｏｎｅ ７Ｅ６は、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡにも、ＲＭＥ−ＧａＲａｃＫＣ−ＢＳＡにも反応しない。また、ＡＤＭＡ−Ｇリッチペプチドを免疫源として得られた、ポリクローナル抗体であるＡＳＹＭ２４抗体は、本願発明の抗体と対照的に、ＲＭＥ−ＧａＲａｃＫＣ−ＢＳＡに対するより、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対して強く反応する。更に、ＡＳＹＭ２４抗体は、細胞中のタンパク質に含まれるリジンをアセチル化することによって、タンパク質への反応性が弱くなる。

本発明の抗体は、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対する結合力より、ＲＭＥ−ＧａＲａｃＫＣ−ＢＳＡに対する抗体の結合力の方が強いという特徴を有する。本明細書で結合力が強いとは、親和定数が高いこと、解離定数が低いこと、又は抗体の結合量が上昇することなどを含む意味である。ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡ又はＲＭＥ−ＧａＲａｃＫＣ−ＢＳＡに対する、本発明の抗体の結合力は、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ法などによって測定することが可能である。例えば、ＥＬＩＳＡ法で結合力を調べる場合は、（ａ）ＥＬＩＳＡ用プレートに、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）を固相化する。（ｂ）ＰＢＳにスルフォＮＨＳアセテ−トを０ｍＭ（未処理）、１ｍＭ又は１０ｍＭで溶解し、２５℃で１時間処理（５０μＬ）する。（ｃ）プレートの各ウェルを１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１時間ブロッキングする。（ｄ）測定する抗体をＰＢＳＴで１０００ｎｇ／ｍＬ、３３３ｎｇ／ｍＬ、１１１ｎｇ／ｍＬ、３７ｎｇ／ｍＬ、１２．３ｎｇ／ｍＬ、４．１ｎｇ／ｍＬ、又は１．４ｎｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ添加し、室温で３０分反応させる。（ｅ）ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体５０μＬ（１μｇ／ｍＬ）を加え、室温で３０分反応させる。（ｆ）ＯＰＤ基質溶液［２０ｍＭ−ｏ−フェニレンジアミン、０．０５％過酸化水素水を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）］１００μＬを加え、２５℃で１０分間反応させる。（ｇ）４９２ｎｍにおける吸光度を測定する。本発明の抗体においてＲＭＥ−ＧａＲａｃＫＣ−ＢＳＡに対する抗体の結合力の方が強いことは、前記のいずれかの抗体濃度で、スルフォＮＨＳアセテ−トの０ｍＭ処理（未処理）より１ｍＭ処理又は１０ｍＭ処理で、４９２ｎｍにおける吸光度が、上昇することで確認できる。具体的に、抗体の結合力が強いとは、スルフォＮＨＳアセテ−トの１ｍＭ処理又は１０ｍＭ処理における吸光度（Ａ）を、スルフォＮＨＳアセテ−トの０ｍＭ処理における吸光度（Ｂ）で割ったときの値（Ｘ）が、１より大きいことを意味し、好ましくは１．０１以上、より好ましくは１．１以上、更に好ましくは、１．５以上である。

また、結合力の上昇は、結合定数（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋａ）の上昇や、解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｋｄ）の低下によっても表現できる。抗原と抗体が結合して抗原−抗体結合物の形成される反応は、可逆反応であるが、反応が平衡に達したときの非結合抗原、非結合抗体、抗原−抗体結合物の濃度をそれぞれ［Ａｇ］、［Ａｂ］、［Ａｇ・Ａｂ］とすると、
Ｋａ＝［Ａｇ・Ａｂ］／［Ａｇ］［Ａｂ］
Ｋｄ＝［Ａｇ］［Ａｂ］／［Ａｇ・Ａｂ］となり、放射性標識した抗原を用いて、スキャッチャ−ドプロットなどの解析により求めることができる。また、ＥＬＩＳＡ法によっても、近似値を求めることができる。例えば、
［Ａｇ］＋［Ａｂ］←→［Ａｇ・Ａｂ］で平衡状態にあるとすると、
Ｋｄ＝［Ａｇ］［Ａｂ］／［Ａｇ・Ａｂ］
となる。結合抗体の総量（濃度）をＡｂ_ｔｏｔとすると、
［Ａｇ・Ａｂ］＝Ａｂ_ｔｏｔ・［Ａｇ］／（Ｋｄ＋［Ａｇ］）
となる。Ａｂの５０％がＡｇに結合した時の［Ａｇ］をＡｇ_１／２とすると、
［Ａｇ・Ａｂ］＝１／２・Ａｂｔｏｔ
なので、これらを代入すると、
Ｋｄ＝Ａｇ_１／２
となる。従って、液相中のＡｇの結合により［Ａｇ］がほとんど影響されず、かつＥＬＩＳＡ法での洗浄後のシグナルが［Ａｇ・Ａｄ］に比例すると仮定することによって、Ｋｄを見積もることが可能であり、Ｋｄの値の低下が結合力の上昇を表す。尚、この見積り方法は、吸着抗体の濃度がＫｄの値に較べて十分小さい時に、特に有効である。具体的に、抗体の結合力が強いとは、スルフォＮＨＳアセテ−トの１ｍＭ処理又は１０ｍＭ処理におけるＫａを、スルフォＮＨＳアセテ−トの０ｍＭ処理におけるＫａで割ったときの値が、１より大きいことを意味し、好ましくは１．０１以上、より好ましくは１．１以上、更に好ましくは、１．５以上である。あるいは、抗体の結合力が強いとは、スルフォＮＨＳアセテ−トの０ｍＭ処理におけるＫｄを、スルフォＮＨＳアセテ−トの１ｍＭ処理又は１０ｍＭ処理におけるＫｄで割ったときの値が、１より大きいことを意味し、好ましくは１．０１以上、より好ましくは１．１以上、更に好ましくは、１．５以上である。

本発明の抗体には、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が含まれるが、より好ましくは、モノクローナル抗体である。本発明の抗体フラグメントは、本発明の抗体のフラグメントであって、しかも、もとの抗体と同じ反応特異性を有する抗体フラグメントである。すなわち、本発明の抗体フラグメントは、ＡＤＭＡと特異的に反応し、ＳＤＭＡ、モノメチルアルギニン、メチル化されていないアルギニンには反応しない。更に、ＡＤＭＡに連続するリジンがアセチル化されたペプチドであるＲＭＥ−ＧａＲａｃＫＣ−ＢＳＡに対して、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対する反応より強い反応を示し、細胞中のタンパク質に含まれるリジンをアセチル化することによって、タンパク質への反応性が強くなる。本発明の抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、本発明のモノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。

本発明の抗体は、一般式（９）：
Ｘ−ＡＤＭＡ−Ｚ−Ｃｙｓ （９）
［式中、ＸはＣｙｓ以外の同一又は異なるアミノ酸残基１〜５からなるペプチドフラグメントであり、ＡＤＭＡはアシンメトリックジメチルアルギニンであり、ＺはＣｙｓ以外の同一又は異なるアミノ酸残基１〜５からなるペプチドフラグメントである］
の配列で表されるペプチドを担体タンパク質に結合し、動物を免疫することによって調製することができる。

前記一般式（９）において、Ｘはシステイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸である。ＸはＣｙｓ以外のアミノ酸であれば、特に限定されないが、Ｃ末側のＡＤＭＡに影響を与えないアミノ酸が好ましく、例えば、側鎖が非極性側鎖及び非荷電極性側鎖を有するアミノ酸が好ましい。具体的なアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、セリンなどが挙げられ、特に好ましくはグリシンである。またＸのアミノ酸の連続する長さも、特に限定されないが、好ましくは１〜５の整数であり、より好ましくは、１である。
Ｚもシステイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸である。ＺはＣｙｓ以外のアミノ酸であれば、特に限定されないが、好ましくは、Ｎ末側のＡＤＭＡに影響を与えないアミノ酸、例えば、側鎖が非極性側鎖及び非荷電極性側鎖を有するアミノ酸が好ましい。具体的なアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、セリン、ε−アミノカプロン酸（６−アミノカプロン酸）などが挙げられ、特にはε−アミノカプロン酸（６−アミノカプロン酸）が好ましい。またＺの連続する長さも、特に限定されないが、好ましくは１〜５の整数であり、より好ましくは、１である。前記一般式（９）で表されるペプチドは、Ｃ末側のＣｙｓのチオール基（ＳＨ基）を利用して、担体タンパク質と結合させる。そのため、Ｘ又はＺにＣｙｓが含まれる場合は、Ｃ末側以外のＣｙｓが担体タンパク質と結合してしまい、ＡＤＭＡが隠されてしまうことがあるため、免疫源の構造上好ましくない。

前記一般式の（９）のペプチドは、化学合成によって調製することができ、例えば、Ｆｍｏｃ固相合成法、Ｂｏｃ固相合成法によって合成できる。合成したペプチドは、ＨＰＬＣ等の公知の方法で精製することができる。前記一般式の（９）のペプチドのＣｙｓのＳＨ基を利用して、ペプチドを担体タンパク質に結合させる。

本明細書で、「担体タンパク質」とは、前記ペプチドと結合して複合体を形成し、免疫原性を発揮できるタンパク質であれば、特に限定されないが、例えば、分子量が約１万以上、好ましくは、４万〜１００万のタンパク質が好ましい。具体的には、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、オボアルブミン、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）等を挙げることができる。前記ペプチドと担体の結合は、システインのＳＨ基と担体タンパク質の官能基を利用して結合させることができる。担体タンパク質の官能基としては、ＳＨ基と結合する官能基であれば限定されず、チオール基又はアミノ基が、挙げられる。結合方法は、従来公知の方法に従って、実施することができるが、例えば、マレイミド、カルボジミド、グルタールアルデヒド、スルフォＧＭＢＳ、又はＧＭＢＳなどをペプチドと担体タンパク質との架橋剤として使用することができる。

本発明の抗体には、動物のポリクローナル抗体及びヒトやマウスのモノクローナル抗体を含むが、抗体を得るために動物を免疫する方法、及びモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るための方法は、免疫源として一般式（９）のペプチドと担体タンパク質の複合体を免疫源として用いることを除いて、公知の方法によって実施することができる。例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）、又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って、行うことができる。

前記一般式（９）のペプチドと担体タンパク質の複合体を免疫源として用いて、動物を免疫することによって、本発明の抗体を取得することができる。免疫に用いる動物は、特に限定されないが、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、トリ、ウシ、ウマなどを用いることができる。しかしながら、アシンメトリックジメチルアルギニンは、本来、正常な動物の生体内に存在するアミノ酸であるため、免疫機能が正常な動物では、ＡＤＭＡに対する抗体が産生されにくいことがある。そのため、免疫に用いる動物は、自己抗体を産生しやすい、自己免疫疾患の動物が好ましい。特に、マウスで本発明の抗体を取得する場合は、自己免疫疾患マウスである、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスを用いることが好ましい。

免疫の方法は、公知の方法を用いればよく、特に限定されないが、例えば、前記複合体を等量のフロイントの完全アジュバント又はＴｉｔｅｒ−Ｍａｘ ｇｏｌｄ（Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ社）と乳化混合し、ウサギの皮下や、マウスの腹腔内に投与する。以後、１〜２週間間隔で、同様の操作を行い、数回免疫する。このようにして免疫した動物の血液を採血し、血清又は血漿とすることにより、本発明の抗体を調製することができる。

本発明のモノクローナル抗体を産生する本発明のハイブリドーマは、前記の免疫操作を行った動物から取得することができる。例えば、マウスに前記の免疫を行った２週後に、尾静脈からリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等に溶解した前記ペプチドを接種する。その２〜３日後に、マウスから抗体を産生するリンパ球を含む脾臓を無菌的に摘出する。このリンパ球を、例えば、ポリエチレングリコールの存在下で、ミエローマ細胞と細胞融合させる方法により、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして樹立可能である。

細胞融合を行う場合は、例えば、ポリエチレングリコールの存在下で、リンパ球及びミエローマ細胞を融合させる。ミエローマ細胞は、各種の公知の細胞を用いることができるが、例えば、ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１又はＳＰ２／０−Ａｇ１４などの細胞が挙げられる。融合した細胞は、選択培地、例えばＨＡＴ培地を用いて、融合しなかった細胞を死滅させることによって選択する。次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中の抗体産生の有無をスクリーニングする。スクリーニングは、アシンメトリックジメチルアルギニンに対する特異抗体の産生を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によって測定することによって実施することができる。このようにして、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを選択することができ、本発明の代表的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＡＤＭＡ２−２Ｈ５〔受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４５８〕は、平成１７年１１月３０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託された。

本発明のハイブリドーマは、公知の任意の培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０で継代培養することができる。本発明のモノクローナル抗体は、このハイブリドーマを培養することによって、調製することができるが、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ウシ胎児血清を加え、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で培養することによって、培養上清中に抗体が産生される。また、マウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、腹水を回収することによって、腹水中に抗体を産生させることが可能である。本発明の抗体は、公知の方法により精製することができるが、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＧを用いた精製法、ＡＤＭＡを結合させたアフィニティーカラムを用いる方法、又はイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる方法などで精製することができる。

本発明の抗体は、前記のように、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対する反応よりも、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡのリジンがアセチル化したＲＭＥ−ＧａＲａｃＫＣ−ＢＳＡに対して強く反応する。更に、細胞のタンパク質のリジンをアセチル化することによって、多くのタンパク質への反応性が強くなる。この本発明の抗体の性質を利用することによって、今まで検出することのできなかった、ＡＤＭＡを含むタンパク質を検出することが可能になる。つまり、タンパク質をアセチル化することにより、本発明の抗体とタンパク質中のＡＤＭＡとの結合が強くなるために、従来同定できなかったＡＤＭＡを有するタンパク質と結合することができる。従来公知の抗体であるｃｌｏｎｅ ７Ｅ６は、アセチル化したタンパク質に結合することができない。またＡＳＹＭ２４抗体は、ＲＧリッチクラスターのＡＤＭＡを認識し、アセチル化したタンパク質への反応性が悪くなることから、本発明の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法に効果的に使用できない。

《作用》
本発明の抗体が、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対するより、ＲＭＥ−ＧａＲａｃＫＣ−ＢＳＡに対して強く反応する理由、及びタンパク質のリジンをアセチル化することにより、タンパク質への反応性が強くなる理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。まず、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡのリジンは塩基性アミノ酸だが、アセチル化によりリジンの側鎖のアミノ基の水素原子が、アセチル基に置換される。そのため、リジンの正電荷が消失するものと考えられる。本発明の抗体は、ＡＤＭＡを認識しているが、ＡＤＭＡの周辺に塩基性アミノ酸が存在していると、正電荷の影響でＡＤＭＡへの結合が阻害されると考えられる。ところが、リジンがアセチル化されることにより、ＡＤＭＡの周辺の正電荷が弱まり、本発明の抗体のＡＤＭＡへの結合が強まると考えられる。細胞内のタンパク質の場合も、前記ペプチドと同様に、本発明の抗体が認識するＡＤＭＡの周辺に存在する、リジンのアミノ基がアセチル化されることによって、ＡＤＭＡの周辺の正電荷が中和され、本発明の抗体が結合できるようになるのではないかと考えられる。

一方、ＡＤＭＡ−Ｇリッチペプチドを免疫源として得られた、公知の抗体であるＡＳＹＭ２４は、本発明の抗体と対照的に、細胞のタンパク質のリジンをアセチル化することにより、タンパク質への反応性が弱くなるが、ＡＤＭＡ−Ｇリッチペプチドは、正電荷が強く、抗体ＡＳＹＭ２４は、ＡＤＭＡ周辺の正電荷が強いペプチド及びタンパク質と結合するものと考えられる。

次に、本発明による２つの翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法ついて、説明する。本発明の第１の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法は、（１）翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を含む可能性のある被検試料に対して、タンパク質側鎖の化学修飾化を実施する工程、（２）タンパク質側鎖の化学修飾化によって得られる翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質に特異的に反応するプローブと、前記化学修飾化処理被検試料とを接触させる工程、及び（３）前記接触工程によって形成される、化学修飾化された翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質と前記プローブとの結合を検出する工程、を含むことを特徴としている［以下、化学修飾化検出方法と称す］。本発明の第２の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法は、（１）翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を含む可能性のある被検試料に対して、タンパク質の電荷を変化させる処理を実施する工程、（２）電荷変化処理した被検試料に対して、タンパク質の等電点による分別を実施する工程、（３）分別後の被検試料と、翻訳後修飾アミノ酸に特異的に反応するプローブとを接触させる工程、及び（４）前記接触工程によって形成される、分別されたタンパク質と前記プローブとの結合を検出する工程、を含むことを特徴としている。［以下、電荷変化検出方法と称す］本発明の化学修飾検出方法及び電荷変化検出方法では、通常前記の工程をこの順序で行う。

本発明の化学修飾化検出方法及び電荷変化検出方法に用いられる被検試料は、翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を含む可能性のある試料であれば特に限定されるものではないが、例えば、培養細胞、培養細胞の培養上清、植物の組織、動物の生体試料、特には組織、血液、血漿、血清、尿などが挙げられる。

本発明の化学修飾化検出方法及び電荷変化検出方法で検出される翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質は、翻訳後修飾アミノ酸を含むタンパク質であれば限定されない。本発明の化学修飾化検出方法及び電荷変化検出方法でプローブの認識する翻訳後修飾アミノ酸は、生体内で翻訳後に修飾されたアミノ酸であれば、限定されないが、例えば、リン酸化、ユビキチン化、アセチル化、メチル化、ファルネシル化、硫酸化、カルボキシル化、糖鎖修飾，又は脂質修飾されたアミノ酸が挙げられ、具体的には、アシンメトリックジメチルアルギニン、メチルリジン、リン酸化チロシン、リン酸化セリン、又はリン酸化スレオニンが挙げられる。特に、化学修飾検出方法では、好ましくはアシンメトリックジメチルアルギンであり、電荷変化検出方法では、メチルリジンである。

本発明の化学修飾化検出方法で実施する化学修飾は、特に限定されないが、アルキル化、アシル化、アセチル化、アミド化、グリコシル化、スクシニル化、リン酸化、硫酸化、リポイル化、カルバミル化、又はメチル化などが挙げられるが、タンパク質の等電点による分別の操作と組み合わせて行う場合は、タンパク質の等電点を変化させるような化学修飾が好ましく、酸性タンパク質の場合は、負電荷を中和させるような化学修飾が、塩基性タンパク質の場合は、正電化を中和するような化学修飾が好ましい。特に塩基性タンパク質の場合は、好ましくはアシル化であり、アミン基又は水酸基をアシル基で置換するものであれば、限定されないが、例えば、アセチル化、ベンゾイル化、が挙げられ、より好ましくはアセチル化である。アセチル化は、タンパク質中のアミノ酸がアセチル化されるものであれば限定されない。アセチル化されるアミノ酸としては、リジンが挙げられるが、アセチル化されることにより、正電荷が消失する。また、アセチル化する試薬も、特に限定されないが、無水酢酸、Ｎ−アセチルスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアセテート（ＮＨＳ−アセテート）、Ｎ−アセチルイミダゾール、又はスルフォＮＨＳアセテ−ト（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ ａｃｅｔａｔｅ）が挙げられる。また、化学修飾化は、翻訳後修飾アミノ酸と結合するプローブとの関係では、化学修飾によりプローブとの結合を阻害する化学修飾は好ましくなく、化学修飾により、プローブの結合が強くなるような化学修飾が好ましい。例えば、酸性蛋白と結合しにくいプローブの場合は、負の電荷を中和させるような化学修飾が好ましい。また、塩基性タンパク質と結合しにくいプローブの場合は、正電化を中和させる化学修飾が好ましく、例えば、リジンのアセチル化が好ましい。

本発明の化学修飾化検出方法で用いるプローブは、タンパク質側鎖の化学修飾化を実施されたタンパク質に存在する翻訳後修飾アミノ酸を認識できるプローブであれば特に限定されないが、例えば、修飾アミノ酸に結合する抗体であるリン酸化、ユビキチン化、アセチル化、メチル化、ファルネシル化、硫酸化、カルボキシル化、糖鎖修飾、又は脂質修飾されたアミノ酸に対する抗体が挙げられ、より好ましくは、ＡＤＭＡに対する抗体である。本発明の化学修飾化検出方法においては、翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を化学修飾化するため、翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を化学修飾化することによって、前記タンパク質と反応しなくなる抗体は使用することができない。そのため、本発明の検出方法に使用する抗体は、化学修飾化されたタンパク質と結合することができ、好ましくは、タンパク質が化学修飾化することにより、翻訳後修飾アミノ酸に対する反応性が低下せず、より好ましくは、反応性が高くなる抗体である。

また、本発明の化学修飾化検出方法では、翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を分別する工程を更に実施することができる。分別する方法は、タンパク質が分別される方法であれば特に限定されず、公知の方法を用いることができるが、例えば、アクリルアミドゲル又はキャピラリーを用いた電気泳動などを用いることができる。また分別する工程は、検出方法のどの工程の前後に行ってもよいが、好ましくは、翻訳後修飾アミノ酸を認識するプローブと接触させる工程（２）の前である。プローブとタンパク質が結合することにより、分子量や等電点が変化することがあり、分析が困難になる場合があるからである。タンパク質を分離する方法には、分子量を利用する方法、等電点を利用する方法、また他の原理を利用した方法がある。これらの方法は、単独で行っても、組み合わせて実施することも可能であるが、多くのタンパク質を分別するためには、複数の分離原理を組み合わせて分別する方法が好ましく、例えば、等電点及び分子量による分別を組み合わせた２次元電気泳動が挙げられる。

タンパク質はアミノ基およびカルボキシル基などを有する両性電解質のため、アミノ酸の種類や構成によって、電荷が異なる。そのため、ｐＨ勾配中で電気泳動を行うと、等電点の違いにより、分別することができる。本明細書で「塩基性タンパク質」とは等電点が塩基性側のタンパク質のことを意味し、例えば７．０以上、好ましくは８．０以上、より好ましくは９．０以上のタンパク質である。本発明の化学修飾化検出方法及び電荷変化検出方法の検出方法において、検体中のすべてのタンパク質を検出方法にそのまま用いることも可能であるが、好ましくは、酸性タンパク質又は塩基性タンパク質のみを分離して、検出方法に用いる。酸性タンパク質又は塩基性タンパク質の分離方法は、公知のタンパク質の分離方法を使用することができるが、例えば、イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用することができる。

本発明の電荷変化検出方法で実施する電荷変化処理は、タンパク質の電荷を変化させる処理であれば特に限定されないが、共有結合又は非共有結合を利用して、電荷を変化させるものを結合させることができる。非共有結合の場合は、イオン結合や疎水結合が利用できる。共有結合を利用する場合は、例えば、タンパク質のアミノ酸側鎖を化学修飾することにより、タンパク質の電荷を変化させることができる。化学修飾は特に限定されないが、アルキル化、アシル化、アセチル化、アミド化、グリコシル化、スクシニル化、リン酸化、硫酸化及びリポイル化、カルバミル化、メチル化、リン酸化、又は硫酸化などが挙げられるが、酸性タンパク質の場合は、負電荷を中和させるような化学修飾が、塩基性タンパク質の場合は、正電荷を中和するような化学修飾が好ましい。特に塩基性タンパク質の場合は、好ましくはアシル化であり、アミン基又は水酸基をアシル基で置換するものであれば、限定されないが、例えば、アセチル化、ベンゾイル化、が挙げられ、より好ましくはアセチル化である。アセチル化は、タンパク質中のアミノ酸がアセチル化されるものであれば限定されない。アセチル化されるアミノ酸としては、リジンが挙げられるが、アセチル化されることにより、正電荷が消失する。また、アセチル化する試薬も、特に限定されないが、無水酢酸、Ｎ−アセチルスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアセテート（ＮＨＳ−アセテート）、Ｎ−アセチルイミダゾール、又はスルフォＮＨＳアセテ−ト（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ ａｃｅｔａｔｅ）が挙げられる。また、電荷変異処理は、翻訳後修飾アミノ酸と結合するプローブとの関係では、電荷変異処理によりプローブとの結合を阻害する電荷変異処理は好ましくなく、電荷変異処理により、プローブの結合が強くなるような電荷変異処理が好ましい。例えば、酸性蛋白と結合しにくいプローブの場合は、負の電荷を中和させるような電荷変異処理が好ましい。また、塩基性タンパク質と結合しにくいプローブの場合は、正電荷を中和させる電荷変異処理が好ましく、例えば、化学修飾によるリジンのアセチル化が好ましい。

本発明の電荷変化検出方法で用いるプローブは、タンパク質側鎖の電荷変化処理を実施されたタンパク質に存在する翻訳後修飾アミノ酸を認識できるプローブであれば特に限定されないが、例えば、修飾アミノ酸に結合する抗体であるリン酸化、ユビキチン化、アセチル化、メチル化、ファルネシル化、硫酸化、カルボキシル化、糖鎖修飾，脂質修飾されたアミノ酸が挙げられ、好ましくは、メチルリジンに対する抗体である。本発明の電荷変化検出方法においては、翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を電荷変化処理するため、翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の電荷変化処理によって、タンパク質と反応しなくなる抗体は使用することができない。そのため、本発明の検出方法に使用する抗体は、電荷変化処理されたタンパク質と結合することができ、好ましくは、タンパク質が電荷変化処理することにより、翻訳後修飾アミノ酸に対する反応性が低下せず、より好ましくは、反応性が高くなる抗体である。

本発明の電荷変化検出方法の工程（２）で実施する「等電点による分別」は、タンパク質を等電点により分別する方法であれば特に限定されないが、例えば、等電点電気泳動が挙げられる。更に、多くのタンパク質を分別するためには、等電点による分別に、他の分離原理を組み合わせて分別する方法が好ましく、例えば、等電点及び分子量による分別を組み合わせた２次元電気泳動が挙げられる。

翻訳後修飾アミノ酸に結合したプローブは、公知の方法によって検出することが可能であり、例えば、そのプローブを標識物質によって標識しておくことによって検出可能であり、標識物質としては、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼ）、蛍光色素［例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）］、発光物質、又は放射性物質を用いることができる。例えば、これらの標識物質を公知の発色法、発光法、蛍光法などによって検出することができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１》抗原の調製
（Ａ）ペプチドの合成
以下の配列のペプチドをＦｍｏｃ固相法により合成した。
Ｇｌｙ−ＡＤＭＡ−Ａｃｐ−Ｃｙｓ（配列番号２で示す：以下、ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣと称する）
Ｌｅｕ−ＡＤＭＡ−Ｃｙｓ（以下、ＲＭＥ−ＬａＲＣと称する）
Ｇｌｙ−ＡＤＭＡ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号３で示す：以下、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣと称する）
Ｌｅｕ−ＳＤＭＡ−Ｃｙｓ（以下、ＲＭＥ−ＬｓＲＣと称する）
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号４で示す：以下、ＬＲＧＲＧＲＫＣと称する）
前記の配列のペプチドにおいて、Ｇｌｙはグリシンを、ＡＤＭＡはアシンメトリックジメチルアルギニンを、Ａｃｐはイプシロンアミノカプロン酸を、Ｃｙｓはシステインを、Ｌｅｕはロイシンを、ＳＤＭＡはシンメトリックジメチルアルギニンを、Ａｒｇはアルギニンを、意味する。

（Ｂ）ペプチドとスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）又はＢＳＡとの結合
前記ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣペプチドを、Ｃ末端のＣｙｓを介して、担体タンパク質であるＫＬＨに結合させた。すなわち、ＫＬＨ（ナカライテスク社）又はＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）１０ｍｇを５ｍＭＥＤＴＡ入りＰＢＳ １ｍＬに溶解し、次いで、ＤＭＳＯに溶解した架橋剤ＧＭＢＳ（Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスルフォスクシンイミドエステル（Ｎ−（γ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ：濃度２０ｍｇ／ｍＬ、同仁化学）３３．５μＬを添加した。撹拌しながら、３０℃で３０分間反応させた後に、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア・バイオテク）を用いて、ゲル濾過法にて未反応のＧＭＢＳを除去した。続いて、ＧＭＢＳを付加したＫＬＨ１０ｍｇ又はＢＳＡ１０ｍｇに対して、ペプチド１ｍｇ［１００μＬ、ＰＢＳに１０ｍｇ／ｍＬで溶解］を添加した。撹拌しながら、３０℃で３時間反応させた後に、２μＬの２−メルカプトエタノールを添加し、更に３０分室温で反応させた後、未反応のペプチドをＰＤ−１０カラムによるゲル濾過で除去した。得られたＲＭＥ−ＧａＲεＡＣペプチドとＫＬＨの複合体を、ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＫＬＨと、ＢＳＡとの複合体をＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＢＳＡと称する。

ペプチドとして、ＲＭＥ−ＬａＲＣ、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ、ＲＭＥ−ＬｓＲＣ、及びＬＲＧＲＧＲＫＣを用いる以外は、前記ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ及びＢＳＡの結合と同じ手順で各ペプチドとＢＳＡの複合体を調製した。得られたＲＭＥ−ＬａＲＣ、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ、ＲＭＥ−ＬｓＲＣ、及びＬＲＧＲＧＲＫＣのペプチドとＢＳＡの複合体を、それぞれＲＭＥ−ＬａＲＣ−ＢＳＡ、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡ、ＲＭＥ−ＬｓＲＣ−ＢＳＡ、及びＬＲＧＲＧＲＫＣ−ＢＳＡと称する。

《実施例２》モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの樹立
（Ａ）免疫
実施例１で得られたＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＫＬＨ複合体抗原溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を等量のＴｉｔｅｒ−Ｍａｘ Ｇｏｌｄ（Ｔｉｔｅｒ Ｍａｘ ＵＳＡ社）と乳化するまで混和し、その混合液０．１ｍＬを３匹の６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス、又は３匹の６週齢のメスのＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（ＭＲＬ／ＭｐＪＵｍｍＣｒｊ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス）の腹腔内に投与することにより、免疫を行った。（第１回免疫）。２週おきに２回、前期と同様の方法で調整した混合液０．１ｍＬを腹腔内に投与した（第２及び３回免疫）。第２及び第３回免疫を行って２週後にマウスから採血し、以下（Ｂ）の抗体価の測定に使用した。抗体価の上昇したマウスに対し、ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＫＬＨ複合体抗原溶液を（２ｍｇ／ｍＬ）を等量のＰＢＳで希釈し、その希釈液０．１ｍＬをマウスの腹腔に投与した。投与した次の日に、ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＫＬＨ複合体抗原溶液を（２ｍｇ／ｍＬ）を等量のＰＢＳで希釈し、その希釈液０．０１ｍＬをマウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過した後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、以下の（Ｃ）の細胞融合の工程に使用した。

（Ｂ）ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定
９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｎｕｎｃ社）に、実施例１で調製したＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡ複合体（１０μｇ／ｍＬ）を各々５０μＬずつ分注し、４℃で一夜放置した。次に、このプレートの各ウェルを１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴと称す）で３０分ブロッキングした。この上清を除去した後、前記工程（Ａ）で得られた血清をＰＢＳＴで３０倍から、７２９０倍まで希釈し、５０μｌを加えた。室温で３０分放置した後、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと称する）で３回洗浄した。続いて、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ）５０μｌ（１μｇ／ｍＬ）を加え、室温で２時間放置した後、再び、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＯＰＤ基質溶液［２０ｍＭ−ｏ−フェニレンジアミン、０．０５％過酸化水素水を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）］１００μｌを各ウェルに加え、２５℃で１０分間反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１に示す。

Ｂａｌｂ／ｃマウス及びＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスのいずれのマウスでも、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対して、抗体価が上昇していた。しかし、Ｂａｌｂ／ｃマウスと比較して、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの抗体価が高く、特に１匹のマウス（ＭＲＬ−１）は非常に高い抗体価を示した。

（Ｃ）細胞融合
無菌的に摘出した前記ＭＲＬ−１マウスの脾臓を滅菌したＰＢＳ ８ｍＬを入れたシャーレーに入れた。脾臓細胞を流出させた後、この脾臓細胞懸濁液をナイロンメッシュに通し、１５ｍＬ遠心チューブに集めて３８０×ｇで３分間遠心した。この操作を２回行った後、ＲＰＭＩ培地８ｍＬに懸濁し、３８０×ｇで３分間遠心した。この操作を２回行った。このようにして得られた細胞ペレットをＲＰＭＩ１６４０培地８ｍＬで再懸濁し、脾細胞数を測定した。

一方、５０ｍＬチューブに予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４［理化学研究所ジーンバンク］（約１×１０^７個）に前記脾臓細胞（５×１０^７個）を加え、ＲＰＭＩ１６４０培地中でよく混合し、遠心分離を行った（３８０×ｇ、５分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３７℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００溶液１ｍＬを滴下し、遠心チューブを手で、１分間穏やかに回転することによってＰＥＧ溶液と細胞ペレットとを混合させた。次に、３７℃に保温しておいたＲＰＭＩ１６４０培地１０ｍＬを加え、チューブを穏やかに回転させた。その後、遠心分離（１７０×ｇ、５分）を行い、上清を除去した後、細胞ペレットを１０％ウシ胎児血清と、５％ブライクローン（ヒトＩＬ−６、大日本製薬）を含むＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地にアミノプテリン４×１０^−７Ｍ、チミジン１．６×１０^−５Ｍ、及びヒポキサンチン１×１０^−４Ｍになるように添加したもの）５０ｍＬに懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬずつ分注し、５％炭酸ガスを含む３７℃の炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地約１００μＬを除き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μＬを加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。約１０日目に、以下のハイブリドーマのスクリーニングを行った。

（Ｄ）ハイブリドーマのスクリーニング
血清からの試料の代わりに、ハイブリドーマの培養上清５０μＬを用いること以外は、前記工程（Ｂ）のＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定と同様の方法で、ハイブリドーマのスクリーニングを行った。抗体産生が認められたウェル中の各ハイブリドーマを、限界希釈法によりクローニングした。１０日後に、同様のＥＬＩＳＡ法によって、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、ＡＤＭＡ２−２Ｇ１１、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５、ＡＤＭＡ２−２Ｈ７、ＡＤＭＡ２−４Ｅ６、ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０、ＡＤＭＡ２−３Ｃ１０の６クローンのハイブリドーマ株を樹立した。ハイブリドーマ細胞株ＡＤＭＡ２−２Ｈ５〔受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４５８〕については、平成１７年１１月３０日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に国際寄託された。

《実施例４》樹立したモノクローナル抗体の調製
（Ａ）培養上清からのモノクローナル抗体の調製
樹立したマウスハイブリドーマを、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ）で、３７℃にて５％二酸化炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養液を、プロテインＧカラム（アマシャムバイオサイエンス社）にアプライした。カラムから抗体をｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製された本発明のモノクローナル抗体を得た。培養液５００ｍＬから約２０ｍｇの抗体がとれた。なお、本明細書においては、各ハイブリドーマの名称を、そのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の名称としても使用する。
（Ｂ）腹水からのモノクローナル抗体の調製
６週齢のＢａｌｂ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスの腹腔内に増殖させたハイブリドーマＡＤＭＡ２−２Ｈ５をマウス一匹あたり５×１０^６細胞となるように接種した。５匹のマウスから約１５ｍＬの腹水が得られ、２ｍＬの腹水から約１０ｍｇの抗体が得られた。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記の培養上清中からの精製と同様の方法で行った。

（Ｃ）抗体のＨＲＰ標識
抗体のＨＲＰ標識は、Ｐｉｅｒｃｅ社のＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いて行った。この方法は、抗体分子中のアミノ基にアルデヒド基を導入されたＨＲＰを結合させる方法である。標識はメーカーの提供するプロトコールに従って実施した。ＡＤＭＡ２−２Ｈ５から得られたＨＲＰ標識抗体をＨＲＰ−ＡＤＭＡ２−２Ｈ５と称する。

《実施例５》樹立したモノクローナル抗体の反応性の検討
（Ａ）樹立したモノクローナル抗体のＡＤＭＡ含有ペプチドに対する反応性
９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに、実施例１で調製したＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＢＳＡ、ＲＭＥ−ＬａＲＣ−ＢＳＡ、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡ、及びコントロールペプチド（１０μｇ／ｍＬ）を各々５０μＬずつ分注し、４℃で一夜放置した。次に、このプレートの各ウェルを１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで３０分ブロッキングした。この上清を除去した後、前記実施例５の工程（Ｂ）で得られた各抗体及びコントロールとしてＡＤＭＡに対するポリクローナル抗体であるＡＳＹＭ２４（ｕｐｓｔａｔｅ社）を、ＰＢＳＴで希釈し、５０μＬずつ添加した。室温で３０分放置した後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。続いて、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体５０μＬ（１μｇ／ｍＬ）又は、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体５０μＬ（１μｇ／ｍＬ）を加え、室温で１時間放置した後、再び、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＯＰＤ基質溶液１００μＬを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図２に示す。各モノクローナル抗体は、ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＢＳＡ、ＲＭＥ−ＬａＲＣ−ＢＳＡ、及びＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡには反応したが、コントロールペプチドには反応しなかった。

（Ｂ）樹立したモノクローナル抗体のＡＤＭＡ抗原に対する特異性
プレートに固相化する抗原として、更にＡＤＭＡを含まないペプチドである、ＲＭＥ−ＬｓＲＣ−ＢＳＡ、ＬＲＧＲＧＲＫＣ−ＢＳＡ、ＡｃＫ−ＢＳＡ（アセチル化リジンとＢＳＡの複合体）及びＭｅＫ−ＢＳＡ（メチルリジンとＢＳＡの複合体）を加えたこと、及び対照の抗体として、Ｃｌｏｎｅ ７Ｅ６（Ａｂｃａｍ社）及びＳＹＭ１１（ｕｐｓｔａｔｅ社）を測定した以外は、前記（Ａ）と同じ操作を行った。Ｃｌｏｎｅ７Ｅ６は市販されているＡＤＭＡに対するモノクローナル抗体であり、ＳＹＭ１１はシンメトリックジメチルアルギンニンに対するポリクローナル抗体である。結果を図３に示す。

ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０、ＡＤＭＡ２−３Ｃ１０、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５、及びＡＳＹＭ２４は、ＡＤＭＡを含むペプチドに対して反応したが、ＳＤＭＡを含むペプチドであるＲＭＥ−ＬｓＲＣ−ＢＳＡには反応せず、ＬＲＧＲＧＲＫＣ−ＢＳＡ、ＡｃＫ−ＢＳＡ及びＭｅＫ−ＢＳＡにも反応しなかった。Ｃｌｏｎｅ７Ｅ６はＡＤＭＡを含むペプチドであるＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＢＳＡ、ＲＭＥ−ＬａＲＣ−ＢＳＡには反応したが、ＡＤＭＡを含まないペプチドに対しても、若干、非特異的な反応を示した。またＳＹＭ１１はＳＤＭＡを含むペプチドである、ＲＭＥ−ＬｓＲＣ−ＢＳＡに反応したが、ＡＤＭＡを含むペプチドである、ＲＭＥ−ＬｓＲＣ−ＢＳＡにより強い非特異的な反応を示した。

（Ｃ）樹立したモノクローナル抗体の反応のアミノ酸による競合
ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０、ＡＤＭＡ２−３Ｃ１０、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５について、ＡＤＭＡによる阻害試験を行い、特異性を確認した。９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに、実施例１で調製したＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）を５０μＬずつ分注し、４℃で一夜放置した。次に、このプレートの各ウェルを１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで３０分ブロッキングした。モノクローナル抗体及びＡＤＭＡ、モノメチルアルギニン（ＭＭＡ）、又はアルギニン（Ａｒｇ）を混合し、２５℃で３０分インキュベートした。インキュベート時の最終濃度は、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５は１０ｎｇ／ｍＬ、ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０は３７ｎｇ／ｍＬ、ＡＤＭＡ２−３Ｃ１０は２．３４ｎｇ／ｍＬであり、各アミノ酸は、終濃度が２^０〜２^５ｍＭの範囲内で、ＰＢＳＴで希釈した。プレートから１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴを除去した後、前記抗体とアミノ酸の混合液を５０μＬずつ添加した。室温で３０分放置した後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。続いて、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体５０μＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）を加え、室温で３０分放置した後、再び、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＯＰＤ基質溶液１００μＬを各ウェルに加え、２５℃で１０分間反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図４に示す。いずれの抗体も、ＡＤＭＡによっては競合されるが、ＭＭＡ、Ａｒｇでは競合されなかった。

《実施例６》モノクローナル抗体の反応性のスルフォＮＨＳアセテ−ト（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ ａｃｅｔａｔｅ）処理による増強（ＥＬＩＳＡ）
９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに、実施例２で調製したＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）及びＬＲＧＲＧＲＫＣ−ＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）を各々５０μＬずつ分注し、４℃で一夜放置した。次に、ＰＢＳ、又はＰＢＳにスルフォＮＨＳアセテ−トを、１ｍＭ又は１０ｍＭ溶解したものを５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間処理した。次に、プレートの各ウェルを１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１時間ブロッキングした。この上清を除去した後、ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０、ＡＤＭＡ２−３Ｃ１０、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５、ＡＳＹＭ２４及びＣｌｏｎｅ ７Ｅ６を、ＰＢＳＴで希釈し、５０μＬずつ添加した。室温で３０分放置した後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。続いて、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ）５０μＬ（１μｇ／ｍＬ）を加え、室温で３０分放置した後、再び、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＯＰＤ基質溶液１００μＬを各ウェルに加え、２５℃で１０分間反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図５に示す。ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０、ＡＤＭＡ２−３Ｃ１０、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５の各抗体は、スルフォＮＨＳアセテ−トでの処理の濃度が高くなるに従って、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対する反応性が高くなった。また、実施例２の工程（２）で得られた、ＭＲＬ−１マウスの血清も各モノクローナル抗体と同様にスルフォＮＨＳアセテ−トでの処理の濃度が高くなるに従って、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対する反応性が高くなった（図には示していない）。対照的に、ＡＳＹＭ２４はスルフォＮＨＳアセテ−トでの処理の濃度が高くなるに従って、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対する反応性が低くなった。また、ｃｌｏｎｅ ７Ｅ６は、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡに対して反応していなかったが、スルフォＮＨＳアセテ−ト処理で、反応性が強くなることはなかった。

《実施例７》モノクローナル抗体の反応性のスルフォＮＨＳアセテ−ト（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ ａｃｅｔａｔｅ）処理による増強（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）
ＭＯＬＴ−４Ｆ細胞（約５×１０^６個）を、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ：Ｒｏｃｈｅ社）に懸濁し、溶解させた。そして、その細胞溶解液を超音波で破砕した。破砕した細胞溶解液を遠心分離（１０，０００×ｇ，１５分間）し、上清を回収した。各上清１０μＬ（１０μｇタンパク量）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した後、ゲル中のタンパク質をポリビリニデンジフルオライド（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ、Ｂｉｏ−ｒａｄ社：以下、ＰＶＤＦと称す）メンブレンに電気的に転写した。このメンブレンを、１０ｍＭスルフォＮＨＳアセテ−トで１時間処理することによって、タンパク質をアセチル化した。対照のメンブレンは、１０ｍＭスルフォＮＨＳアセテ−ト処理を行わなかった。３％ＢＳＡ、３％ポリビニルピロリドンＫ３０（ＰＶＰ、Ｗａｋｏ）及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に２５℃で１時間浸し、ブロッキングした。一次抗体として、前記実施例２で取得した、ＡＤＭＡに対するモノクローナル抗体ＡＤＭＡ２−２Ｈ５抗体（１μｇ／ｍＬ）を、２５℃で１時間反応させた。対照として、前記ＡＤＭＡに対するウサギポリクローナル抗体である、ＡＳＹＭ２４（０．１１μｇ／ｍＬ）及びアセチルリジンに対するモノクローナル抗体であるＡＣＫ２Ｆ１２（１μｇ／ｍＬ）を２５℃で３０分反応させた。

０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でメンブレンを３回洗浄した後、二次抗体としてＨＲＰ標識マウス抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ社）又はＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ（ＫＰＬ社）を、０．５％スキムミルク及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で２００００倍希釈し２５℃で３０分反応させた。前記と同様の方法でメンブレンを洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロティング検出キット（アマシャム株式会社）を用いて、ペルオキシダーゼと過酸化水素とによって触媒されるルミノールの発光反応を行わせた。この発光をＬＡＳ−１０００（富士フイルム社）で検出した。結果を図６に示す。

ＡＤＭＡに対するモノクローナル抗体である、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５抗体は、スルフォＮＨＳアセテ−ト処理によって、いくつかのタンパク質への反応が増強し、反応が弱くなるタンパク質はほとんどなかった。対照的に、ＡＳＹＭ２４抗体はＭＯＬＴ−４Ｆのほとんどのタンパク質への反応性が、減弱した（図６）。またアセチルリジンに対するモノクローナル抗体である、ＡＣＫ２Ｆ１２の反応性は、スルフォＮＨＳアセテ−ト処理によって非常に強くなっており、細胞中のタンパク質のリジンがアセチル化されたことを示している。

《実施例８》ＡＤＭＡ２−２Ｈ５モノクローナル抗体によるマウス臓器ｌｙｓａｔｅの解析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）
ＭＯＬＴ−４Ｆから抽出したタンパク質の代わりにマウスの組織から抽出したタンパク質を使用すること、及びタンパク質を転写したメンブレンをスルフォＮＨＳアセテ−トでの処理を行わないことを除いては、実施例７の方法と同様の方法でマウス臓器のタンパク質をＡＤＭＡ２−２Ｈ５モノクローナル抗体で解析した。組織のタンパク質は、前記Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを加え、ホモジェナイズし、用いた。結果を図７に示す。ほとんどの組織で、ＡＤＭＡを有するタンパク質を検出できたが、心臓及び骨格筋では、ＡＤＭＡを有するタンパク質は少なかった。

《実施例９》ＡＤＭＡ２−２Ｈ５モノクローナル抗体によるＨｅｐＧ２細胞ｌｙｓａｔｅの解析（２次元電気泳動）
ＨｅｐＧ２細胞を２Ｄ用Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（９．８Ｍｕｒｅａ、０．５％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ））に懸濁し、超音波で破砕した。破砕した細胞溶解液を遠心分離（１０，０００×ｇ、５分間）し、上清を回収した。

２０μｇのタンパク質を９．８Ｍ尿素、０．５％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭＤＴＴ、０．２％Ｂｉｏｌｙｔｅｓ、０．００１％ブロムフェノールブルー１２５μＬに溶解し、このタンパク質溶液にてｐＨレンジ３−１０のＩＰＧストリップ（ｓｔｒｉｐ）（７ｃｍ）を膨潤させた。膨潤後のｓｔｒｉｐを等電点電気泳動装置（ＢｉｏＲａｄ）にセットし、Ｓｔｅｐ１：２５０Ｖで１時間、Ｓｔｅｐ２：２５０〜４０００Ｖで２時間（直線勾配で増加）、Ｓｔｅｐ３：４０００Ｖで１０時間の設定で、等電点電気泳動を行った。泳動終了後のｓｔｒｉｐを０．３７５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、及び１３０ｍＭＤＴＴ中で還元し（１５分）、更に０．３７５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、及び１３５ｍＭヨードアセトアミド中でアルキル化した（１５分）。還元アルキル化処理の終了したｓｔｒｉｐをＳＤＳポリアクリルアミドゲルに乗せ、二次元目の展開を行った。

２次元電気泳動したゲル中のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに電気的に転写した。このメンブレンを、３％ＢＳＡ、３％ＰＶＰ及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に２５℃で１時間浸し、ブロッキングした。実施例４の工程（Ｃ）で調製した、ＨＲＰ−ＡＤＭＡ２−２Ｈ５抗体（０．２μｇ／ｍＬ）を、２５℃で３０分反応させた。０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でメンブレンを３回洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロティング検出キット（アマシャム株式会社）を用いて、発光反応を行った。この発光をＬＡＳ−１０００（富士フイルム社）で検出した。結果を図７に示す。

《実施例１０》抗ＡＤＭＡ抗体による塩基性タンパク質の検出
（Ａ）塩基性タンパク質のアセチル化
ＨｅｐＧ２細胞を前記Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、超音波で破砕した。破砕した細胞溶解液を遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間）し、上清を回収した。回収した培養上清を平衡化ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５％ ＮＰ−４０、１ｍＭＣａＣｌ２）で１０倍希釈した。平衡化ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに希釈した培養上清をアプライし、通過画分を回収した。通過画分をアセトン沈殿し、遠心エバポレーターによって乾燥させた。ペレットを２Ｄ用Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（９．８Ｍｕｒｅａ、０．５％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ））に溶解し、可溶化した。５０μｇのタンパク質に対して、ＤＭＳＯに溶かしたスルフォＮＨＳアセテ−トを最終濃度１０ｍＭとなるように添加した。２５℃で一時間反応した後、１／１０量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して反応を停止させた。対照の試料は、スルフォＮＨＳアセテ−ト処理を行わなかった。反応液中のタンパク質をアセトン沈殿し、再度２Ｄ用ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒに可溶化して、２次元電気泳動の試料とした。

（Ｂ）二次元電気泳動による細胞内ＡＤＭＡ含有タンパク質の分析
２０μｇのタンパク質を９．８Ｍ尿素、０．５％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭＤＴＴ、０．２％Ｂｉｏｌｙｔｅｓ、０．００１％ブロムフェノールブルー１２５μＬに溶解し、このタンパク質溶液にてｐＨレンジ３−１０のＩＰＧストリップ（ｓｔｒｉｐ）（７ｃｍ）を膨潤させた。膨潤後のｓｔｒｉｐを等電点電気泳動装置（ＢｉｏＲａｄ）にセットし、Ｓｔｅｐ１：２５０Ｖで１時間、Ｓｔｅｐ２：２５０〜４０００Ｖで２時間（直線勾配で増加）、Ｓｔｅｐ３：４０００Ｖで１０時間の設定で、等電点電気泳動を行った。泳動終了後のｓｔｒｉｐを０．３７５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、及び１３０ｍＭＤＴＴ中で還元し（１５分）、更に０．３７５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、及び１３５ｍＭヨードアセトアミド中でアルキル化した（１５分）。還元アルキル化処理の終了したｓｔｒｉｐをＳＤＳポリアクリルアミドゲルに乗せ、二次元目の展開を行った。

（Ｃ）モノクローナル抗体ＡＤＭＡ２−２Ｈ５による検出
２次元電気泳動したゲル中のタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに電気的に転写した。このメンブレンを、３％ＢＳＡ、３％ＰＶＰ及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に２５℃で１時間浸し、ブロッキングした。実施例４の工程（Ｃ）で調製した、ＨＲＰ−ＡＤＭＡ２−２Ｈ５抗体（０．２μｇ／ｍＬ）を、２５℃で３０分反応させた。０５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．１５Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でメンブレンを３回洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロティング検出キット（アマシャム株式会社）を用いて、発光反応を行った。この発光をＬＡＳ−１０００（富士フイルム社）で検出した。結果を図９に示す。スルフォＮＨＳアセテ−ト処理を行わない場合は、塩基性タンパク質がｐＨ１０付近に集中しているために、塩基性タンパク質のスポットの分別が困難である。しかし、スルフォＮＨＳアセテ−ト処理を行った場合は、タンパク質のスポットが分離しており、解析が可能である。ＡＳＹＭ２４及びｃｌｏｎｅ ７Ｅ６を用いた場合は、アセチル化されたタンパク質への反応が弱く、ほとんどのスポットが検出できなかった。

《実施例１１》抗メチルリジン抗体による塩基性タンパク質の検出
ＨＲＰ−ＡＤＭＡ２−２Ｈ５抗体の代わりに、メチルリジンに対する抗体であるＭＥＫ３Ｄ７（特願平２００３−４０３３１３）を使用すること以外は、実施例１０と同じ方法で、塩基性タンパク質の検出を行った。結果を図１０に示す。スルフォＮＨＳアセテ−ト処理を行わない場合は、塩基性タンパク質がｐＨ１０付近に集中しているために、塩基性タンパク質のスポットの分別が困難である。しかし、スルフォＮＨＳアセテ−ト処理を行った場合は、タンパク質のスポットが分離しており、解析が可能である。

本発明の抗体は、アセチル化したタンパク質に対して、反応性が強まるため、従来検出できなかった、アシンメトリックジメチルアルギニンを含むタンパク質の探索、同定に用いることができる。また、本発明の抗体及びタンパク質のアセチル化を組み合わせた翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法は、従来同定できなかったＡＤＭＡを含む塩基性タンパク質の探索、同定に用いることができる。本発明の抗体、及び検出方法を用い、疾患との相関を調べることにより、疾病に関連する標的分子であるＡＤＭＡ含有タンパク質を同定することが可能となる。更に、本発明の抗体は、同定された疾患に関連する標的分子を検出する診断、又はその標的分子を機能制御することによる治療に使用することが可能である。

免疫マウスの抗体価 ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＫＬＨ複合体の最終免疫から３日後の、Ｂａｌｂ／ｃ及びＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスのＥＬＩＳＡ法による血中抗体価を示す。 モノクローナル抗体の反応性（ＥＬＩＳＡ：抗原別） 樹立したマウスモノクローナル抗体ＤＭＡ２−２Ｇ１１、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５、ＡＤＭＡ２−２Ｈ７、ＡＤＭＡ２−４Ｅ６、ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０、又はＡＤＭＡ２−３Ｃ１０（サブクローンＡＤＭＡ２−３Ｃ１０Ａ及びＡＤＭＡ２−３Ｃ１０Ｂ）のＡＤＭＡを含むペプチドＲＭＥ−ＬａＲＣ−ＢＳＡ（Ａ）、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡ（Ｂ）、ＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＢＳＡ（Ｃ）、及びＡＤＭＡを含まないコントロールペプチドに対する反応性を示す。抗体のコントロールとして、モノクローナル抗体ｃｌｏｎｅ ７Ｅ６及びポリクローナル抗体ＡＳＹＭ２４の反応性を示す。 モノクローナル抗体の反応性（ＥＬＩＳＡ：抗体別） 樹立したマウスモノクローナル抗体ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０、ＡＤＭＡ２−３Ｃ１０、及びＡＤＭＡ２−２Ｈ５のＡＤＭＡを含むペプチドであるＲＭＥ−ＧａＲεＡＣ−ＢＳＡ、ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡ、ＲＭＥ−ＬａＲＣ−ＢＳＡ、ＳＤＭＡを含むペプチドであるＲＭＥ−ＬｓＲＣ−ＢＳＡ、アセチル化していないアルギニンを含むペプチドであるＬＲＧＲＧＲＫＣ−ＢＳＡ、ＡｃＫ−ＢＳＡ（アセチル化リジンとＢＳＡの複合体）及びＭｅＫ−ＢＳＡ（メチルリジンとＢＳＡの複合体）との反応を示す。抗体のコントロールとして、ポリクローナル抗体ＡＳＹＭ２４、モノクローナル抗体ｃｌｏｎｅ ７Ｅ６及びＳＤＭＡに対するポリクローナル抗体ＳＹＭ１１の反応性を示す。 モノクローナル抗体の反応のアミノ酸による阻害（ＥＬＩＳＡ） マウスモノクローナル抗体ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０、ＡＤＭＡ２−３Ｃ１０、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５のＡＤＭＡに対する反応性のＡＤＭＡ、ＭＭＡ、又はアルギンニン（Ａｒｇ）による阻害反応を示す。 スルフォＮＨＳアセテ−トの効果（ＥＬＩＳＡ） ＲＭＥ−ＧａＲＫＣ−ＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）及びＬＲＧＲＧＲＫＣ−ＢＳＡを、スルフォＮＨＳアセテ−ト処理することにより、マウスモノクローナル抗体ＡＤＭＡ２−５Ｅ１０、ＡＤＭＡ２−３Ｃ１０、ＡＤＭＡ２−２Ｈ５、ポリクローナル抗体ＡＳＹＭ２４、及びモノクローナル抗体ｃｌｏｎｅ ７Ｅ６の反応性の変化を示す。 スルフォＮＨＳアセテ−トの効果（Ｗｅｓｔｅｒｎ） スルフォＮＨＳアセテ−ト処理、又は未処理のＭＯＬＴ−４Ｆ細胞のタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体ＡＤＭＡ２−２Ｈ５、及びポリクローナル抗体ＡＳＹＭ２４の反応性を示す。ＡＣＫ２Ｆ１２はアセチルリジンに対するモノクローナル抗体であり、タンパク質のリジンがアセチル化されていることを示す。 マウス臓器のウエスタンブロッティング マウスの各臓器の組織から抽出したタンパク質の、マウスモノクローナル抗体ＡＤＭＡ２−２Ｈ５を用いた、ウエスタンブロッティングを示す。 ＨｅｐＧ２ ｌｙｓａｔｅの２Ｄ−Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨｅｐＧ２細胞のタンパク質の２次元電気泳動後の、マウスモノクローナル抗体ＡＤＭＡ２−２Ｈ５を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。 スルフォＮＨＳアセテ−ト処理によるＡＤＭＡ含有タンパク質の検出 ＨｅｐＧ２細胞のタンパク質をスルフォＮＨＳアセテ−ト処理、又は未処理の２次元電気泳動後の、マウスモノクローナル抗体ＡＤＭＡ２−２Ｈ５を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。 スルフォＮＨＳアセテート処理によるメチルリジン含有タンパク質の検出 ＨｅｐＧ２細胞のタンパク質をスルフォＮＨＳアセテ−ト処理、又は未処理の２次元電気泳動後の、マウスモノクローナル抗体ＭＥＫ３Ｄ７を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。

Claims (19)

1. アシンメトリックジメチルアルギニンに特異的に反応し、アシンメトリックジメチルアルギニンを含有するタンパク質に対してタンパク質側鎖の化学修飾化処理を行うことによって得られる化学修飾化アシンメトリックジメチルアルギニン含有タンパク質に特異的に反応する抗体。
2. アシンメトリックジメチルアルギニンに特異的に結合し、式（４）：
   Ｇｌｙ−ＡＤＭＡ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （４）
   ［ＡＤＭＡはアシンメトリックジメチルアルギニンであり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンである］で表されるペプチドに対する結合力より、式（８）：
   Ｇｌｙ−ＡＤＭＡ−ＡｃＬｙｓ−Ｃｙｓ−ＢＳＡ （８）
   ［ＡＤＭＡはアシンメトリックジメチルアルギニンであり、ＡｃＬｙｓはアセチル化リジンであり、ＢＳＡはウシ血清アルブミンである］で表されるペプチドに対する結合力が、上昇することを特徴とする抗体。
3. マウスモノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
4. 前記マウスモノクローナル抗体が、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４５８であるハイブリドーマによって分泌される抗体である、請求項３に記載のマウスモノクローナル抗体。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体のフラグメントであって、アシンメトリックジメチルアルギニンに特異的に反応する抗原結合部位を含むことを特徴とする、抗体フラグメント。
6. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
7. 前記ハイブリドーマが、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４５８である請求項６に記載のハイブリドーマ。
8. 一般式（９）：
   Ｘ−ＡＤＭＡ−Ｚ−Ｃｙｓ （９）
   ［式中、ＸはＣｙｓ以外の同一又は異なるアミノ酸残基１〜５からなるペプチドフラグメントであり、ＡＤＭＡはアシンメトリックジメチルアルギニンであり、ＺはＣｙｓ以外の同一又は異なるアミノ酸残基１〜５からなるペプチドフラグメントである］の配列で表されるペプチドを担体タンパク質に結合し、動物を免疫することを特徴とする、抗アシンメトリックジメチルアルギニン抗体の製造方法。
9. 前記一般式（１）の、ＸがＧｌｙであり、Ｚがε−アミノカプロン酸である一般式（９）で表されるペプチドを用いる、請求項８に記載の抗アシンメトリックジメチルアルギニン抗体の製造方法。
10. 前記動物が、自己免疫疾患マウスである請求項８又は９に記載の抗アシンメトリックジメチルアルギニン抗体の製造方法。
11. 前記自己免疫疾患マウスがＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスである請求項１０に記載の抗アシンメトリックジメチルアルギニン抗体の製造方法。
12. （１）翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を含む可能性のある被検試料に対して、タンパク質側鎖の化学修飾化を実施する工程、
    （２）タンパク質側鎖の化学修飾化によって得られる翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質に特異的に反応するプローブと、前記化学修飾化処理被検試料とを接触させる工程、及び
    （３）前記接触工程によって形成される、化学修飾化された翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質と前記プローブとの結合を検出する工程
    を含むことを特徴とする、前記翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法。
13. 前記翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質が、アシンメトリックジメチルアルギニンを含有するタンパク質である、請求項１２に記載の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法。
14. 前記タンパク質側鎖の化学修飾化が、アシル化である請求項１２又は１３に記載の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法。
15. 前記修飾アミノ酸に対するプローブが、請求項１〜５いずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントである、請求項１２〜１４いずれか一項に記載の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法。
16. 前記タンパク質を等電点、分子量、又は等電点及び分子量の組み合わせ、により分別する工程を更に含む、請求項１２〜１５いずれか一項に記載の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法。
17. （１）翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質を含む可能性のある被検試料に対して、タンパク質の電荷を変化させる処理を実施する工程、
    （２）電荷変化処理した被検試料に対して、タンパク質の等電点による分別を実施する工程、
    （３）分別後の被検試料と、翻訳後修飾アミノ酸に特異的に反応するプローブとを接触させる工程、及び
    （４）前記接触工程によって形成される、分別されたタンパク質と前記プローブとの結合を検出する工程
    を含むことを特徴とする、前記翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法。
18. 前記分別工程の前又は後に、タンパク質の分子量による分別を実施する請求項１７に記載の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法。
19. 前記プローブが、メチルリジンに対する抗体である請求項１７又は１８に記載の翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法。

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