WO2005037870A1

WO2005037870A1 - 抗体およびその用途

Info

Publication number: WO2005037870A1
Application number: PCT/JP2004/015961
Authority: WO
Inventors: Hirokazu Matsumoto; Jiro Noguchi; Yasushi Masuda
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2003-10-22
Filing date: 2004-10-21
Publication date: 2005-04-28
Also published as: CA2543447A1; US20070014799A1; EP1688434A1

Abstract

本発明は、ヒトZAQL-2が関与する疾患等の治療剤、予防剤、診断薬の開発に有用な新規抗体および該抗体を用いたZAQL-2の定量法などの提供を目的とする。具体的には、ヒトZAQL-2またはその誘導体に特異的に反応する抗体、該抗体を用いたZAQL-2の定量方法、および該抗体を含有してなる医薬等を提供する。

Description

抗体およびその用途技術分野

本発明は、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩に結合特異性を有する新規な抗体に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応に基づく該ポリぺプチドまたはその塩の定量法、中和活性を利用する該ポリぺプチドまたはその塩が関与する疾患の診断および予防 ·治療剤の開発に有用な抗体などに関する。背景技術

ヒト型 Bv8ぺプチド成熟体 (以下、ヒト ZAQL- 2と略記することもある）は、ォーファン受容体である ZAQおよび I5Eを活性化するヒト ZAQリガンド- 1 (ヒト ZAQL- 1) ( W0 01/16309号公報、 02/64835号公報、 W0 02/62996号公報など）に類似の構造を有し、ヒト ZAQリガンド- 1と同様に回腸収縮活性を示し、 ZAQおよび I5Eに結合してこれら受容体を活性化する（W0 02/62944号公報など）。また、ヒト ZAQL - 2は M APキナーゼと PI - 3キナーゼを活性化し神経保護作用を有することが報告されている（Eur. Neuroscience 13卷， 1694頁， 2001年）。その後、これらのペプチドは、 DNA databaseより見出された新規ぺプチド prokineticin - 1 (PK - 1)および prok ineticin_l (PK - 2)としても報告された（Mol. Pharamacol. 59卷， 692頁， 2001年）。また、ラット脳内の Bv8ペプチド（ZAQL-2)は、ラット視交叉上核に局在し、その発現は明期に増大する日内変動し、脳室内投与した ZAQL- 2はラットの行動量を減少させることが報告された（Nature. 417卷， 405頁， 2002年）。発明の開示

ヒト ZAQL - 2の生理機能をさらに明らかにするために、ヒト ZAQL - 2を簡便かつ高感度に検出 ·定量する測定系が切望されていた。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト ZAQL - 2 を免疫原として、モノクローナル抗体を複数作製し、これらを組み合わせることにより、ヒト ZAQL- 2を高感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発した。これより、血液、脳脊髄液、尿などの生体成分中のヒト ZAQL- 2の変動を簡便にかつ高感度に測定することが可能となる。

すなわち、本発明は、

〔1〕配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に特異的に反応するモノクローナル抗体、

〔2〕配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の、第 8〜9、 1 1、 15、 1 7、 21、 23、 25〜28、 30、 34、 36〜37、 39〜40、 44〜46、 48、 52〜53、 55、 64、 66、 68、 70〜73、 75〜 76および 7 8〜81番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に反応する上記〔1〕記載のモノクローナル抗体、

〔 3〕配列番号： 2または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列を含有するポリペプチドを認識しない上記〔1〕記載のモノクローナル抗体、

〔4〕標識化された上記〔1〕記載のモノクローナル抗体、

〔5〕 ZAL2— 103 (FERM B P _ 8431 ) で標示されるハイブリド一マ細胞から産生され得る ZAL2_103 aで標示される上記〔 1〕記載のモノクローナル抗体、

〔6〕 Z AL 2-106 (FERM B P— 8432 ) で標示されるハイプリド一マ細胞から産生され得る ZAL 2— 106 aで標示される上記〔1〕記載のモノクローナル抗体、

〔7〕配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対して中和活性を有する上記〔1〕記載のモノクローナル抗体、

[7 a] 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその塩 1モルに対し、抗体濃度が約 1〜 10モルで、該ポリぺプチドの活性を約 40 〜 100 %抑制する上記〔 7〕記載のモノクローナル抗体、

〔8〕上記〔1〕記載のモノクローナル抗体を含有してなる医薬、

〔9〕上記〔1〕記載のモノクローナル抗体を含有してなる診断薬、

〔10〕上記〔1〕記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法、

〔1 1〕上記〔1〕記載のモノグローナル抗体を用いることを特徴とする配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法、

〔12〕上記〔1〕記載のモノクローナル抗体と、被検液および標識化された配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の定量法、

〔13〕担体上に不溶化した上記〔5〕記載のモノクローナル抗体、標識化された上記〔6〕記載のモノクローナル抗体およぴ被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の定量法、

〔14〕担体上に不溶化した上記〔6〕記載のモノクローナル抗体、標識化された上記〔5〕記載のモノクローナル抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の定量法、

〔14 a〕担体上に不溶化した上記〔1〕記載のモノクローナル抗体、標識化された上記〔1〕記載のモノクローナル抗体（ただし、前記担体上に不溶化したモノクローナル抗体とは異なる抗体）および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の定量法、

〔1 5〕上記〔1〕記載のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞、

〔16〕 ZAL2— 103 (FERM BP— 8431) または ZAL2— 10 6 (FERM BP— 8432) で標示される上記〔15〕記載のハイプリドーマ細胞、

〔1 7〕上記〔15〕記載のハイプリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から上記〔1〕記載のモノクローナル抗体を採取することを特徴とする上記〔1〕記載のモノクローナル抗体の製造法、

〔18〕中枢神経疾患、運動機能障害または内分泌疾患の予防 ·治療剤である上記〔8〕記載の医薬、

〔19〕中枢神経疾患、運動機能障害または内分泌疾患の診断薬である上記〔9 〕記載の診断薬、

〔20〕上記〔1〕記載の抗体の、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体、

〔21〕上記〔5〕記載の抗体の、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体、〔2 2〕上記〔6〕記載の抗体の、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体、

〔2 3〕哺乳動物に対し、上記〔1〕記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする中枢神経疾患、運動機能障害または内分泌疾患の予防 ·治療法、

〔2 4〕中枢神経疾患、運動機能障害または内分泌疾患の予防 ·治療剤を製造するための上記〔1〕記載の抗体の使用などを提供する。図面の簡単な説明

図 1は、ヒト ZAQL- 2を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定結果を表す。図中、一◊一はマウス No. 1、一口一はマウス No. 2、一△一はマウス No. 3、ー〇一はマウス No. 4、 _♦一はマウス No. 5、一固一はマウス No. 6、一▲—はマウス No. 7 、一·_はマウス No. 8を表す。

図 2は、ヒト ZAQL- 2を免疫したマウス由来のハイプリドーマが、抗体を産生している状態（吸光分析の結果）を表す。

図 3は、ヒト ZAQL- 2を免疫したマウス由来のハイブリドーマが、抗体を産生している状態（吸光分析の結果）を表す。

図 4は、ヒト ZAQL- 2を免疫したマウス由来のハイプリドーマが、抗体を産生している状態（吸光分析の結果）を表す。

図 5は、ヒト ZAQL- 2を免疫したマウス由来のハイプリドーマが産生した抗体のヒト ZAQL - 2とヒト ZAQL- 1との反応性を（吸光分析の結果）を表す。図中、 _♦_ は ZAL2-85aとヒト ZAQL- 2との反応性を、一◊—は ZAL2 - 85aとヒト ZAQL-1との反応性を、一画一は ZAL2- 103aとヒト ZAQL-2との反応性を、一ローは ZAL2- 103aとヒト ZAQL - 1との反応性を、一▲—は ZAL2-106aとヒト ZAQL- 2との反応性を、一△—は Z AL2 - 106aとヒト ZAQL-1との反応性を、一秦一は ZAL2 - 58aとヒト ZAQL - 2との反応性を、一〇一は ZAL2 - 58aとヒト ZAQL- 1との反応性を表す。

図 6は、 ZAL2- 103aおよび ZAL2-106aのヒト ZAQL- 2に対する競合法- EIAの結果を表す。図中、一▲—は ZAL2- 103a、一■一は ZAL2- 106aの反応性を表す。

図 7は、 ZAL2- 106aおよび ZAL2- 103a- HRPを用いたサンドィツチ方 EIAの結果を表す。図中、一 ·ーはヒト ZAQL- 2の反応性を、一〇一はヒト ZAQL - 1の反応性を表す。本測定系の非特異的な吸光度（0. 1〉）を blankとして図中に口として示す。図 8は、 ZAL2- 85a、 ZAL2_103aまたは ZAL2- 106aの各共存時における I5E発現 CHO 細胞を用いた細胞内 Ca²⁺イオン濃度上昇活性に対する中和作用を表す。ヒト ZAQ L- 2および各抗体を、室温で 1時間反応させた後の細胞内 Ca²⁺イオン濃度上昇活性を示す。図中、白棒は ZAL2-85aを、黒棒は ZAL2- 103aを、斜線棒は ZAL2- 106aをヒト ZAQL - 2と共存させた時の I5E発現 CH0細胞における細胞内 Ca²⁺ィオン濃度上昇活性のコントロール（抗体非添加時）に対する割合を示す。

図 9は、逆相 HPLCを用いて分画したヒト血漿中のヒト ZAQL- 2免疫活性の溶出位置を表す。矢印は、標準品ヒト ZAQL- 2の溶出位置を示す。発明を実施するための最良の形態】

本明細書におけるタンパク質（ポリペプチド）は、ペプチド標記の慣例に従つて左端が N末端（ァミノ末端）、右端が C末端（カルボキシル末端）である。配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、 C末端がカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステルの何れであってもよい。

配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列に数（1〜5 ) 個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列に数 ( 1〜5 ) 個のアミノ酸が揷入されたァミノ酸配列、配列番号： 1または配列番号： 2で表されるアミノ酸配列中の数（1〜5 ) 個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァミノ酸配列を有するポリペプチドなどが用いられる。

配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸 ) との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。

配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に特異的に反応するモノクローナル抗体（以下、本発明の抗体と称することもある ) としては、例えば、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドまたはその塩に特異的に反応するモノクローナル抗体などが挙げられ、好ましくは配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドまたはその塩に特異的に反応するモノクローナル抗体などが挙げられる。

本発明の抗体は、好ましくは、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の、第 8 〜9、 1 1、 15、 1 7、 21、 23、 25〜28、 30、 34、 36〜37、 39〜40、 44〜46、 48、 52〜53、 55、 64、 66、 68、 70〜 73、 75〜76および 78〜81番目のアミノ酸から選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に反応し、配列番号： 2または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプチドを認識しない。

さらに好ましくは、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチドまたはその塩の活性を中和する抗体である。具体例としては、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するポリぺプチドまたはその塩 1モルに対し、抗体濃度が約 1〜 10モル、好ましくは約 1モルで、該ポリぺプチドまたはその塩の活性（例、 ZAQ結合活性、 ZAQ活性化作用、 I5E結合活性、 I5E活性化作用、回腸収縮活性、 MAPキナーゼ活性化作用、 PI- 3キナーゼ活性化作用など）を約 40〜10 0 %、好ましくは約 60から 100 %、さらに好ましくは約 80から 100 %抑制する抗体などが挙げられる。

具体例としては、 ZAL2— 103 aまたは ZAL 2— 106 aで標示されるモノクローナル抗体などが挙げられる。

以下に、本発明の抗体の抗原の調製法、およぴ該抗体の製造法について説明する。

(1) 抗原の調製

本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えば、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩と同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する（合成）ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単にヒト ZAQL - 2抗原と称することもある）。

配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩は、公知の方法、例えば W002/62944号公報に記載の方法に準じて製造でき、さらに、（a) 例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織または細胞力ら公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b) ペプチド ·シンセサイザ一等を使用する公知のぺプチド合成方法で化学的に合成、（ c ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードする DNAを含有する形質転換体を培養することによつても製造される。

( a ) 該哺乳動物の組織または細胞からヒト ZAQL - 2抗原を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、酸、またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマ 1、グラフィ一などのク口マトグラフィ一を組み合わせることにより精製単離することができる。

( b ) 化学的にヒト ZAQL - 2抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述した天然より精製したヒト ZAQL- 2抗原と同一の構造を有するもの、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列において 3個以上、好ましくは 6個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を 1種あるいは 2 種以上含有するぺプチドなどが用いられる。

( c ) DNAを含有する形質転換体を用いて配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を製造する場合、該 DNAは、公知のクロ一二ング方法〔例えば、 Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sambrook et al, , Co Id Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（1 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩のァミノ酸配列に基づきデザインした DNAプローブを用い、 cDNAライブラリーからハイブリダィゼーション法により配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードする DNAを含有する形質転換体を得る方法、または（2 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩のァミノ酸配列に基づきデザインした DNAプライマーを用い、 PCR法により配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩をコードする DNAを増幅し、適当なベクターに増幅断片を挿入し、宿主をこのベクターで形質転換することにより、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコ一ドする DNAを含有する形質転換体を得る方法などが挙げられる。

ヒト ZAQL- 2抗原としてのぺプチドは、（ 1 ) 公知のぺプチドの合成法に従って、または（2 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによつて製造することもできる。

該ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによつても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下に記載された方法等が挙げられる。

(1リ M. Bodanszky および M. A. 0ndetti、 Peptide Synthesis, Interscience P ublishers, New York (1966年)

(ii) Schroederおよび Luebke、 The Peptide, Academic Press, New York (1965 年）

また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトダラフィ一、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ぺプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるぺプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によつて遊離体に変換することができる。

ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用榭脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルァミン樹脂、アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチ /レフェニルァセトアミドメチノレ樹脂、ポリアタリルアミド樹脂、 4 - ( 2， , 4，ージメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル）フエノキシ樹脂、 4一（2，， 4 ' ージメトキシフエニル一 F m o cアミノエチル ) フエノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、 α—アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするぺプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からぺプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、ォキシム樹脂、 4—ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のぺプチドを得ることもできる。

上記した保護されたァミノ酸の縮合に関しては、ぺプチド合成に使用できる各種活性ィ匕試薬を用いることができるが、特に、カルポジイミド類がよい。カルボジイミド類としては D C C、 N, N ' —ジイソプロピルカルボジイミド、 N—ェチル一 N， - ( 3—ジメチルァミノプロリル）カルポジイミドなどが挙げられる。これらによる活性ィ匕にはラセミ化抑制添加剤 (例えば、 H O B t、 H O O B t など）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物または H O B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあら力じめ保護されたアミノ酸の活性ィヒを行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性ィヒゃ樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ぺプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえば N, N ージメチルホルムアミド、 N， N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルォロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジォキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、ァセトニトリル、プロピオ二トリルなどの二トリル類、酢酸メチル、酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はぺプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約一 2 0 °C〜約 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約 1 . 5ないし約 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチルイ匕して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。

原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、たとえば、 Z、 B o c、ターシャリーペンチルォキシカルボ二ノレ、イソボルニルォキシカルボニル、 4—メトキシベンジルォキシカルボ-ル、 C 1一 Zく B r— Z、ァダマンチルォキシカノレボニノレ、トリフルォロアセチル、フタロイル、ホノレミノレ、 2—ニトロフエニルスルフェニル、ジフエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばアルキル基、 C₃_₈シクロアルキル基、 C ₇_₁₄ァラルキル基、 2—ァダマンチル、 4 _ニトロベンジル、 4ーメトキシベンジル、 4一クロ口ベンジル、フヱナシルぉよびべンジルォキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。

セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばァセチル基などの低級（Ci— ₆) アルカノィル基、ベンゾィル基などのァロイル基、ベンジルォキシカルボ-ル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラエル基、 t—ブチル基などである。

チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、たとえば B z 1、 C 1一 B z 1 , 2—-トロベンジル、 B r _Z、 t _ブチルなどが挙げられる。

ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 To s、 4—メトキシ一 2, 3 ， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 B om、 Bum, B o c、 T r t、 Fmo cなどが挙げられる。

原料のカルボキシル基の活性ィヒされたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル [アルコール（たとえば、ペンタクロロフエノーノレ、 2, 4， 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジ-トロフエノール、シァノメチノレアノレコーノレ、ノヽ。ラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル] などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸ァミドが挙げられる。

保護基の除去（脱離）方法としては、たとえば P d_黒あるいは P d—炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルェチルァミン、トリェチルアミン、ピぺリジン、ピぺラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリゥムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に一 20°C 〜40°Cの温度で行われるが、酸処理においてはァ-ソール、フエノール、チォァニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフイド、 1, 4一ブタンジチオール、 1 , 2—エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2， 4一ジニトロフエニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジチォーノレ、 1, 4—プタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリゥム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性ィヒなどは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。 '

ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸の α—カルボキシル基をァミド化した後、ァミノ基側にぺプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ぺプチド鎖の Ν末端のひ一アミノ基の保護基のみを除いたぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたぺプチド（またはァミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護べプチドを精製した後、上記方法によりすベての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のぺプチドのァミド体を得ることができる。ぺプチドのエステ^^体を得るにはカルボキシ末端ァミノ酸の a—力ルポキシル基を所望のアルコーノレ類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のぺプチドのエステル体を得ることができる。

ヒト ZAQL- 2抗原は、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、ヒト ZAQL - 2抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）とヒト ZAQL-2抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させたヒト ZAQL - 2抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン 1に対レ0 . 1〜 1 0 0の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばゥシ、ゥサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンゃ例えばゥシ、ゥサギなどの哺乳動物のチログロプリン、例えばゥシ、ゥサギ、ヒト、ヒッジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットへモシァニンなどが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。

また、ハプテンとキャリアーの力プリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジァゾ化べンジジンなどのジァゾニゥム化合物、アミノ基同志を架橋するダルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン一 2， 4ージイソシァネートなどのジイソシァネート化合物、チオール基同志を架橋する N, N，一0—フエ-レンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、ァミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、ァミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジィミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のァミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、 3— ( 2—ピリジルジチォ）プロピオン酸 N—スクシンィミジル（SPDP) など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のァミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる

( 2 ) モノクローナル抗体の作製

ヒト ZAQL- 2抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常 2〜6週毎に 1回ずつ、計 2〜1 0回程度行われる。温血動物としては、例えばサル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒッジ、ャギ、エワトリなどがあげられるが、モノクローナル抗体作製にはマウスが好ましく用いられる。

モノクローナル抗体の作製に際しては、ヒト ZAQL - 2抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、本発明の抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。血清中の抗ヒト ZAQL - 2抗体価の測定は、例えば後記の標識化ヒト ZAQL- 2と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法〔Nature、 256巻、 495頁（1975年）〕に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくは PEGなどが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえば NS- 1、 P3U1、 SP2/0、 AP-1などがあげられ、 P3U1などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞 ) 数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常 1： 1〜20： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜80%程度の濃度で添加され、通常 20〜40°C、好ましくは 30〜37°C、通常 1〜： 10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。

本発明の抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩あるいはそれらの部分べプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテイン A を力 Πえ、固相に結合した本発明の抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドを加え、固相に結合した本発明の抗体を検出する方法などがあげられる。本発明の抗体のスクリーニング、育種は通常 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、 10〜20%牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、 RPMI1640) で行われる。ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の本発明の抗体の抗体価の測定と同様にして測定できる。

本発明の抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、 DEAE) による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロティン Aまたはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など〕に従って行われる。

以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造することができる。

なお、（a ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドの

—部領域と反応する本発明の抗体を産生するハイプリドーマ、および（b ) 上記ポリペプチドとは反応するが、その一部領域とは反応しない本発明の抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングは、例えば、その一部領域に相当するぺプチドとハイプリドーマが産生する抗体との結合性を測定することにより行うことができる。

以下に、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法（免疫測定法）について、より詳細に説明する。

本発明の抗体を用いることにより、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドの測定または組織染色などによる検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子の F (ab' ) 2、 Fab'または Fab画分などを用いてもよい。

本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ヒト ZAQL-2量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、サンドィツチ法、競合法、ィムノメトリック法、ネフロメトリーなどが用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法、競合法が、特にサンドイッチ法が好ましい。

( 1 ) サンドイッチ法

担体上に不溶化した本発明の抗体、標識化された本発明の抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することにより被検液中の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩を定量する。好ましくは、担体上に不溶化した本発明の抗体、標識化された本発明の抗体（ただし、前記担体上に不溶化した抗体とは異なる抗体）および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の定量法が挙げられる。

さらに好ましくは、

( i ) 担体上に不溶化した ZAL2_103aで標示されるモノクローナル抗体、標識化された ZAL2-106aで標示されるモノクローナル抗体およぴ被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の定量法、

( i i ) 担体上に不溶化した ZAL2 - 106aで標示されるモノクローナル抗体、標識化された ZAL2- 103aで標示されるモノクローナル抗体およぴ被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の定量法などが挙げられるサンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検液を反応（1次反応）させ、さらに標識化された本発明の抗体を反応（2次反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩（好ましくはヒト ZAQL - 2) の量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤おょぴ不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。サンドイッチ法による測定法においては、例えば、 1次反応で用いられる抗体が ZAL 2- 103aで標示されるモノクローナル抗体である場合は、 2次反応で用いられる抗体は ZAL2 - 106aで標示されるモノクローナル抗体が好ましく、 1次反応で用いられる抗体が ZAL2-106aで標示されるモノクローナル抗体である場合は、 2次反応で用いられる抗体は、 ZAL2 - 103aで標示されるモノクローナル抗体が用いられる。これらの抗体は、例えば西洋ヮサビパーォキシダーゼ（horseradish peroxida se； HRP) で標識化されて用いられるのが好ましい。

( 2 ) 競合法

本発明の抗体、被検液および標識化された配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の割合を測定することにより、被検液中の配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩を定量する。

本反応法は、例えば、固相化法を用いて行う。

具体例としては、抗マウス IgG抗体（ICN/CAPPEL社製）を固相化抗体として用レ、、この固相化抗体の存在するプレートに、（i)本発明の抗体（例、 ZAL2-103aまたは ZAL2 - 106a) 、（ii) HRPで標識化された配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩、および (iii)被検液を添カ卩し、反応後、固相に吸着した HRP活性を測定し、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を定量する。 ( 3 ) ィムノメトリック法

ィムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する力、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。

( 4 ) ネフロメトリー

ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

上記（1 ) 〜（4 ) において、標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵1〕、〔¹³¹1〕、〔¾〕、〔¹⁴C 〕などが、酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば _ガラクトシダ一ゼ、 β—グノレコシダーゼ、アル力リフォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例えばシァニン蛍光色素（例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイエンス社製）など ) 、フルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネートなどが、発光物質としては、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いることもできる。 . 抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えばァガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。

これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる

[例えば、入江寛編「ラジオィムノアツセィ」（講談社、昭和 4 9年発行）、入江寛編「続ラジオィムノアツセィ」（講談社、昭和 5 4年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和 5 3年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 2版）（医学書院、昭和 5 7年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 3版）（医学書院、昭和 6 2年発行）、「Methods in ENZYM0L0GY J Vol. (Immunochemical iechniques (Part A) ) 、 |P]書 Vol. 73 (Immunoche mical Techniques (Part B) ) 、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C) ) 、 |ロコ書 ol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D : Selected Immunoass ays) ) 、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Ant i bo dies and General Immunoassay Methods) ) 、同書 Vol. 121 (Immunochemical T echniques (Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、アカデミックプレス社発行）など参照] 。したがって、本発明のサンドイッチ免疫測定法などよる測定系を構築する場合、その方法は後述する実施例に限定されない。

以上のように、本発明の抗体は、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩を感度良く定量することができるので、上記ポリぺプチドの生理機能のさらなる解明および上記ポリべプチドの関与する疾患の診断に有用である。具体的には、本発明の抗体を用いて、体液中（血液、血漿、血清、尿など）に含まれる配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の量を測定することにより、例えば、消化器疾患（例、腸炎、下痢、便秘、吸収不良性症候群など）、睡眠障害（例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）、ナルコレプシ一など）、季節鬱病、生殖機能障害（例、子宮内膜症など ) 、内分泌疾患、中枢神経疾患（例、老人性痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン症候群など）、脳循環障害（例、脳卒中など）、老化に伴う各種傷害、精神疾患（例、不安、鬱病、不眠症、統合失調症、恐怖症など）、記憶障害、運動機能障害（例、パーキンソン症候群など）、てんかん、アルコール依存症、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内障、癌（例、乳癌など）、エイズ、糖尿病、 '摂食障害（例、拒食症、過食症など）、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満症、過ィンシュリン性肥満症、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、骨粗鬆症など、好ましくは睡眠障害、生殖機能障害、内分泌疾患、中枢神経疾患、精神疾患、運動機能障害、摂食障害などを診断することができる。例えば、睡眠障害の診断においては、体液中のヒト ZAQL- 2を定量し、ヒト ZAQL-2 の量が健常人より多い場合、例えば、血中濃度として約 15 fmol/ml以上、好ましくは約 20 fmol/ml以上の場合、睡眠障害と診断する。

また、本発明の抗体は、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩が関与する疾患、例えば、消化器疾患（例、腸炎、下痢、便秘、吸収不良性症候群など）、睡眠障害（例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）、ナルコレプシ一など）、季節鬱病、生殖機能障害（例、子宮内膜症など）、内分泌疾患、中枢神経疾患（例、老人性痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン症候群など）、脳循環障害（例、脳卒中など）、老化に伴う各種傷害、精神疾患（例、不安、-鬱病、不眠症、統合失調症、恐怖症など）、記憶障害、運動機能障害（例、パーキンソン症候群など）、てんかん、アルコール依存症、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内障、癌（例、乳癌など）、エイズ、糖尿病、摂食障害（例、拒食症、過食症など）、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満症、過ィンシュリン性肥満症、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、骨粗鬆症などの予防 ·治療剤、好ましくは睡眠障害、生殖機能障害、内分泌疾患、中枢神経疾患、精神疾患、運動機能障害、摂食障害などの予防 ·治療剤、さらに好ましくは内分泌疾患、中枢神経疾患、運動機能障害などの予防 ·治療剤として使用することができる。 - 本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ル^"トなどによっても異なるが、例えば、成人の摂食障害の治療のために使用する場合には、本発明の抗体を 1回量として、通常 0. 01〜20mg/kg体重程度、好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1 日 1〜5回程度、好ましくは 1日 1〜3回程度、非経口投与するのが好都合である。経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。

本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。

すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。力かる組成物はき体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシゥム等が用いられる。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含する。力かる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート 80、 HC0-50 、polyoxyethylene (,50mol) adduct of hydrogenated castor oil) 〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。

上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。力かる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）坐剤等が例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常約 5 500mg、とりわけ注射剤では約 5 100mg、その他の剤形では約 10 250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。

なお前記した各糸且成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。本発明の明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Coram ission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における' |貧用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければ L一体を示すものとする。

JT - . k Γ 1ソ] --7

ノノ /レオ n i-¹ Bt Fffix

Π L Μ丄 F . ， Tvr 一、、ノ、千ノノ /レフノ十 /1ノ ' 1 ^、ァノ、 K 1

〗 V •• グノ 1ノ1シン

• ァラニソ

V a 1 • ノ ¹ J ン

Γ u , ロイシン

I 1 e ：ィソロイシン

S e r ：セリン

T h r ：スレオニン

C y s

M e t ：メチォニン

G 1 u ：グノレタミン酸

A s p ：ァスパラギン酸

L y s ：リジン

A r g ：ァノレギニン

H i s ：ヒスチジン

P h e ：フエ二ルァラニン

T y r ：チロシン

T r p ：トリブトファン

P r o ：プロリン

A s n ：ァスパラギン G 1 n グノレタミン

S PDP 3— （2—ピリジルジチォ）プロピオン酸 N—スクシンィミジル GMB S N- (4—マレイミドブチリルォキシ）スクシンイミド

B S A ゥシ血清アルブミン

BTG ゥシチログロブリン

E I A ェンザィムィムノアッセィ

HP LC 逆相高速液体ク口マトグラフィー

HRP 西洋ヮサビパーォキシダーゼ

FB S ゥシ胎児血清

d— FB S 透析済みゥシ胎児血清

TMB (3， 3 ' , 5， 5 ' ―テトラメチルベンチジン）

H/HB S S へぺスバッファードハンクスパランス溶液

EDTA · N a ：エチレンジァミン一 N， N， N ' , Ν '—四酢酸ニナトリウム塩二水和物本明細書において用いられる配列番号は、以下のぺプチドのアミノ酸配列を表す。

〔配列番号： 1〕

ヒト ZAQL-2のァミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 2〕

ヒト ZAQL-1のァミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 3〕

ヒト ZAQL - 1のァミノ酸配列を示す。配列番号： 2で表されるァミノ酸配列の 48 番目の Valが lieに置換されている。後述の実施例 1で得られたハイブリドーマ細胞 ZAL2 - 103は、 2003年 7月 18日力ら茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号 FE匪 BP- 8431として寄託されている。

後述の実施例 1で得られたハイブリドーマ細胞 ZAL2 - 106は、 2003年 7月 18日力、ら茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号 FERM BP- 8432として寄託されている。

なお、各ハイプリドーマ細胞から得られる抗体については細胞名の後に「a」を付けた形で表す。以下に、実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例で用いたヒト ZAQL- 2 (配列番号： 1 ) は、 W0 02/62944号公報の参考例 1に記載の方法に従って得た。

実施例で用いたヒト ZAQL-1 (配列番号： 2 ) は、 W0 02/06483号公報の参考例 1に記載の方法に従って得た。実施例 1

抗ヒト ZAQL - 2モノクローナル抗体の取得

( 1 ) 免疫

8週令の BALB/C雌マウスにヒト ZAQL-2を、それぞれ約 80 g Z匹となるよう、完全フロイントアジュパントとともに皮下免疫した。以後 3週間おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントとともに 2〜3回追加免疫した。

( 2 ) 西洋ヮサビパーォキシダーゼ（H R P ) 標識化ヒト ZAQL- 2の作製ヒト ZAQL- 2と HRP (酵素免疫測定法用、ベーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免疫測定法（EIA) の標識体とした。

HRP 8. 5mg (213nmol) を 0. 95mlの 0. 1M塩化ナトリゥムを含む 0· 02Mリン酸緩衝液（pH6. 8) に溶解させ、 SPDP 1. 99mgを含む DMF溶液 50 1と混合し、室温で 60分間反応させた。さらに、 9. 25mgのジチオスレィトールを含む 0. 1M酢酸緩衝液（pH 4. 5) 0. 5mlを加え、室温で 30分反応させた後、セフアデックス G- 25カラム（溶離液、 2mM EDTAを含む 0. 1Mリン酸緩衝液、 pH6. 0) で分離し、 SH基の導入された HRP を得た。ヒト ZAQL - 2 2mgを 0. 1Mリン酸緩衝液（pH6. 7) に溶解させ、 GMBS 0. 76mg

(2. 7 μ πιο1) を含む MF溶液 50 μ 1と混合し、室温で 60分間反応させたのち、セフアデックス G- 25カラム（溶離液、 0. 1Mリン酸緩衝液、 ρΗ6· 8) で分離し、マレイミド基の導入されたヒト ZAQL- 2を得た。このようにして作製された、 SH基の導入された HRP 1. 67mg (41. 4nmol) とマレイミド基の導入されたヒト ZAQL - 1 1. 2mg ( 136nmol) とを混合し、 4°Cで 1日反応させた。反応後ウルトロゲル AcA44 (LKB -フアルマシア社製）カラムで分画し、 HRP標識化ヒト ZAQL- 2を得た。

( 3 ) ヒト ZAQL- 2を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定

ヒト ZAQL- 2を 3週間間隔で 3回免疫を行い、その 1週間後に眼底採血を行い血液を採取した。さらに血液を、 4°Cで 12，000rpmで 15分遠心した後、上清を回収し抗血清を得た。抗血清中の抗体価を下記の方法により測定した。抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロプレートを作製するため、まず、抗マウスィムノグロブリン抗体（IgG画分、カッペル社製）を 100 /i g/ml含む 0. 1M炭酸緩衝液 (pH9. 6 ) 溶液を 96ウェルマイク口プレートに ΙΟΟ μ Ιずつ分注し、 4°Cで 24時間放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（PBS、 pH7. 4) で洗浄したのち、ゥェルの余剰の結合部位をふさぐため 25%ブロックエース（雪印乳業社製）を含む PB Sを 300 IX 1ずつ分注し、 4°Cで少なくとも 24時間処理した。

得られた抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ゥエルにバッファー C 〔1% BSA、 0. 4M NaCl、 0. 05% 2mM EDTA - Na (D0JIND0社）を含む 0. 02Mリン酸緩衝液、 pH7. 0〕 50 1、およびバッファー Cで希釈した複合体に対する抗血清 100 // 1を加え、 4°Cで 16時間反応させた。次に、該プレートを PBSで洗浄したのち、上記（2) で作製した HRP標識化ヒト ZAQL- 2 (バッファー Cで 300倍希釈） 100 lを加え、室温で 1日反応させた。次に、該プレートを PBSで洗浄したのち、固相上の酵素活性を TMB (3, 3' , 5， 5' -テトラメチルベンチジン）マイクロゥェルパーォキシダーゼ基質システム（KIRKEGAARMPERRY LAB， INC, フナコシ薬品取り扱い） 100 1を加え室温で 10分間反応させることにより測定した。反応を 1M リン酸 ΙΟΟ μ Ιを加え停止させたのち、 450nraの吸収をプレートリーダー（BICHR0M ATIC、大日本製薬社製）で測定した。

結果を図 1に示す。

免疫した 8匹のマウス全ての、ヒト ZAQL-2に対する抗血清中に、ヒト ZAQL - 2に対する抗体価の上昇が認められた。

( 4 ) モノクローナル抗ヒト ZAQL -²抗体の作製

比較的高い抗体価を示したマウス（No. 2と No. 4) に対して 50〜100 μ _§の免疫原を生理食塩水 0. 2mlに溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を行なった。最終免疫 4日後のマウスから脾臓を摘出し、ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ' ミニマム 'エッセンシャルメディウム（MEM) \ させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用レヽる細胞として、 BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞 P3- X63. Ag8. Ul (P3U1) を用いた（Current Topics in Microbiol ogy and Imnology, 81卷、 1頁、 1978年）。

細胞融合は、原法 (Natureヽ 256卷、 495頁、 1975年) に準じて行なった。

脾臓細胞および P3U1をそれぞれ、血清を含有しない MEMで 3度洗浄し、脾臓細胞と P3U1数の比率を 5 : 1になるよう混合して、 800回転で 15分間遠心を行い、細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を軽くほぐし、 45%ポリエチレングリコール（PEG) 6000 (コッホライト社製）を 0. 3ml加え、 37。C温水槽中で 7分間静置して融合を行なった。融合後、細胞に毎分 2mlの割合で MEMを添加し、合計 15 mlの MEMを加えた後 600回転 15分間遠心して上清を除去した。この細胞沈殿物を 10 %牛胎児血清を含有する GITメディウム（和光純薬）（GIT- 10% FCS)に、 P3U1が 1 ml当り 2X 10⁵個になるように浮遊し、 24穴マルチディッシュ（リンブロネ土製）に 1 ゥエル lmlずつ 192ゥエルに播種した。播種後、細胞を 37°Cで 5%炭酸ガスインキュベータ一中で培養した。 24時間後、 HAT (ヒポキサンチン lxl(T⁴M、アミノプテリン 4x10— ¾、チミジン 1. 6x10— ¾) を含んだ GIT- 10% FCS培地（HAT培地）を 1ゥエル当り 1mlずつ添加することにより、 HAT選択培養を開始した。 HAT選択培養は、培養開始 3、 6および 9日後に旧液を lml捨てた後、 1mlの HAT培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの増殖は、細胞融合後 9〜14日で認められ、培養液が黄変したとき（約 1X 10⁶セル/ ml) 、上清を採取し、上記（3 ) に記載の方法に従って抗体価を測定した。

ヒト ZAQL- 2を免疫したマウス由来のハイプリドーマの抗体産生細胞株を選択した例として、マウス No. 2と Νο· 4 (図 1参照）を用いて細胞融合を行い、得られたハイブリドーマの抗体産生状態を、図 2〜図 4に示す。得られた抗体産生ハイプリドーマの中から下記の計 4種類のハイプリドーマを選択した〔表 1〕。

表 1

反応 '生¹)

ハイプリドーマ株 No. ヒ卜 ZAQL - 2 クラスサブクラス抗体名称 1 + IgGl, κ ZAL2- 103a

2 + IgGl, κ ZAL2- 106a

3 土 IgG2b, ZAL2-85a

4 士 IgGl, κ ZAL2 - 58a

1) InMの抗原ヒト ZAQL-2が存在した時

+ (B/B₀) < 0. 50

0. 50≤(Β/Β₀) < 0. 70

0. 70≤(Β/Β₀)

Β：抗原存在時の抗体に結合した HRP標識ヒト ZAQL-2量

B。：抗原非存在時の抗体に結合した HRP標識ヒト ZAQL- 2量次に、上記で得られたハイプリドーマを限界希釈法によるクローニングに付した。クローニングに際しては、フィーダ一細胞として BALB/Cマウスの胸腺細胞を 5xl0⁵個/ゥエルになるように加えた。クローニング後、ハイブリドーマを、あらかじめミネラルオイル 0. 5mlを腹腔内投与されたマウス（BALB/C) に l〜3xl0⁶セル /匹を腹腔内投与したのち、 6〜20日後に抗体含有腹水を採取した。

モノクローナル抗体は、得られた腹水よりプロティン- A力ラムにより精製した。腹水 6〜20mlを等量の結合緩衝液 [3. 5M NaCl, 0. 05% NaN₃を含む 1. 5Mグリシン（pH9. 0) 〕で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンピナントプロテイン- A-ァガロース（Repligen社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液〔（0. 05%NaN₃を含む 0· 1Mクェン酸緩衝液 (pH3. 0) 〕で溶出した。溶出液を PBSに対して 4°C、 2日間透析したのち、 0· 22 μ ιηのフィルター（ミリポア社製 ) により除菌濾過し、 4°Cあるいは- 80°Cで保存した。

モノクローナル抗体のクラス ·サブクラスの決定に際しては、精製モノクロ一ナル抗体結合固相を用いるェンザィムーリンクトイムノソ一ベントアツセィ（EL ISA) 法を行った。すなわち、抗体を含む 0· 1M炭酸緩衝液 (pH9. 6) 溶液を 96ウェルマイク口プレートに ΙΟΟ μ Ιずつ分注し、 4°Cで 24時間放置した。上記 ( 1 ) に記載の方法に従って、ゥエルの余剰の結合部位をブロックエースでふさいだのち、アイソタイプタイピングキット（Mouse- Typer™ Sub - Isotvping Kit バイオラッドネ土製）を用いる ELISAによって固相化抗体のクラス、サブクラスを調ベた。取得した抗体 4種はいずれも H鎖が IgGl、 L鎖が /cであった。実施例 2

競合法酵素免疫測定法

ヒト ZAQL - 2 - BTGを免疫原として作製したモノクローナル抗体の反応特異性を以下の方法により調べた。

まず、得られた 4種類のモノクローナル抗体溶液の抗体価を上記実施例 1一（ 3 ) 記載の方法により調べ、競合法- EIAに用いる抗体濃度として、標識体の結合量が飽和結合量の約 50%となる抗体濃度を決定した（約 30〜50ng/ml) 。次に、上記実施例 1一（3 ) 記載の抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、（i)各モノクローナル抗体を 50ng/mlとなるようバッファー Cで希釈された抗ヒト ZAQL-2抗体溶液 50 /z l、（ii)バッファー Cで希釈されたヒト ZAQL-1溶液 50 μ 1またはヒト ZAQL-²溶液 δθ 1、（i i i)および上記実施例 1— ( 3 ) で得られた H RP標識化ヒト ZAQL- 2 (バッファー Cで 400倍希釈） 50 1を抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロプレートに加え、 4°Cで 16時間反応させた。反応後、 PBSで洗浄したのち抗マウスィムノグロプリン抗体結合マイクロプレート上の酵素活性を、上記実施例 1一（3) 記載の方法により測定した。

結果を図 5に示す。

いずれの抗体も、ヒト ZAQL-2との反応性を有するが、ヒト ZAQL - 1に対しては反応性を有していないことがわかる。

例として、これらの中でヒト ZAQL - 2に対して最も高い反応性を示したモノクローナル抗体 ZAL2- 103aおよび ZAL2_106aの競合法- EIAの結果を、図 6に示す。

ZAL2- 103aおよび ZAL2- 106aのヒト ZAQL- 1の標準曲線から、最大反応に対する割合（B/B。) =0. 5を与えるヒト ZAQL - 2濃度は、それぞれ 0. 8 および 3 nMであることが分かった。これらの結果力ら、 ZAL2 - 103aおよび ZAL2-106aは、ヒト ZAQL- 2に対して高い反応性を示しているものと考えられる。 '' 実施例 3

HRP標識化抗ヒト ZAQL - 2モノクローナル抗体（ZAL2 - 103a- HRP) の作製

ZAL2 - 103a精製画分 9. 98mg (66. 5 nmol) を含む 0. 1Mリン酸緩衝液（pH6. 8) に、 GMBS 0. SO molを含む DMF 50 μ 1を加え、室温で 40分反応させた。反応液をセフアデックス G- ²⁵カラム（溶離液、 0. 1Mリン酸緩衝液、 ρΗ6. 7) で分離し、マレイミド基の導入された抗体画分 6. 99 mgを得た。次に、 HRP 17. 1 mg (428 nmol ) を含む 0· 02Mリン酸緩衝液 (0. 15M NaClも含む) (pH6. 8) 1· 14mlに、 SPDP 6. 4 を含む DMF 60 1を加え、室温で 40分反応させた。次に、 64. 2 ^α πιο1のジチオスレィトールを含む 0. 1M酢酸緩衝液 (_ΡΗ4. 5) 0. 4mlを加え、室温で 20分反応させた後、セフアデックス G - 25力ラム（溶離液、 2mM EDTAを含む 0. 1Mリン酸緩衝液、 pH6. 0) で分離し、 SH基の導入された HRP 9. 8mgを得た。次に、 SH基の導入された HRP 8mgとマレイミド基の導入された抗体画分 3mgとを混合し、コロジオンバッグ（ザルトリウス社製）で約 0. 5mlにまで濃縮したのち、 4°Cで 16時間放置した。反応液を 0. 1Mリン酸緩衝液 (pH6. 5) で平衡化した SephacrylS- 300HRカラム（Pha rmacia社製）に供し、 ZAL2_103a- HRP複合体画分を精製した。実施例 4

サンドイッチ法- EIA

実施例 1で得られた精製したモノクローナル抗体 ZAL2 - 106aを 15 // _g/ml含む 0. 1 M炭酸緩衝液 (pH9. 6溶液）を、 96ウェルマィクロプレートに 100 μ 1ずつ分注し、 4°Cで 24時間放置した。ゥヱルの余剰の結合部位を PBSで 4倍希釈したブロックェース 400 μ 1を加え不活化した。

上記調製済みプレートに、バッファー Cを含む 0. 02Μリン酸緩衝液 (ρΗ7) で希釈したヒト ZAQL-2またはヒト ZAQL- 票準液を ΙΟΟ μ Ιを加え、 4。Cで 24時間反応させた。 PBSで洗浄したのち、上記実施例 3で作製した ZAL2-103a- HRP (バッファー Cで 10, 000倍希釈） 100 lを加え、 4°Cで 24時間反応させた。 PBSで洗浄したのち、実施例 1 _ ( 3 ) 記載の方法により TMB (3， 3', 5， 5'-テトラメチルベンチジン）マイクロウェルパーォキシダーゼ基質システム（フナコシ）を用いて固相上の酵素活性を測定した（酵素反応 20分）。

結果を図 7に示す。

このサンドィツチ法 - EIAは、ヒト ZAQL-2を 0. 3 fmol/raLで検出することが可能であり、ヒト ZAQL - 1とは 10000fmol/mLまで反応しなかった。したがって、固相抗体として ZAL2-106aを用い、標識体として ZAL2 - 103a-HRPを用いるサンドィツチ法 - EIAは、ヒト ZAQL-2を極めて高感度にかつ極めて選択的に検出することが可能であるとわかった。実施例 5

抗 ZAL2 -モノクローナル抗体によるヒト ZAQL- 2の生物活性の中和作用

ZAL2_85a、 ZAL2-103aおよび ZAL2- 106aによるヒト ZAQL- 2対する中和活性を、 W0 02/06483号公報公報の実施例 3— 5記載の I5E発現 CH0細胞を用いた細胞内 Ca²⁺ イオン濃度上昇活性を指標に、 FLIPR (Molecular Devices社）を用いて測定を行つた。

I5E発現 CH0細胞を、 1. 2xl0⁵cells/mlとなるように透析処理済ゥシ胎児血清（以後 dFBS) (JRH BIOSCIENCES社）を含む Dulbecco' s modified Eagle medium (DM EM) 培地（日水製薬株式会社）（10% dFBS-DMEM) に懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート（Black plate clear bottom. Coster社）に分注器を用いて各ゥエルに 200 1ずつ播種し（4χ10⁴。θ1ΐ5/200 μ 1/ゥエル）、 5% C0₂インキュベータ一中にて 37°Cでー晚培養した後用いた（以後、細胞プレートとする）。 FLIPRアツセィバッファー〔二ッスィハンクス 2 (日水製薬株式会社） 9. 8g、炭酸水素ナトリウム 0. 35g、 HEPES 4. 77g、 6M水酸化ナトリウム溶液で pH7. 4に合わせた後、 1Lにフィルアップし、フィルター滅菌処理したもの〕 20ml、 250mM Probenecid (プロべセシド、シグマ社）、 200 μ 1、ゥシ胎児血清（FBS) 210 μ ΐを混合した。また、 Flu 0 3- AM (同人化学研究所） 2バイアル（50 /x g) を、ジメチルスルフォキサイド 4 0 l、 20% Pluronic acid (Molecular Probes社） 40 1に溶解し、これを H/HBS S (へぺスバッファードハンクスバランス溶夜（ッスィハジタス 2 (日水製薬株式会社） 9. 8g、炭酸水素ナトリウム 0· 35g、 HEPES 4. 77 g 、水酸化ナトリウム溶液で pH7. 4に合わせた後、フィルター滅菌処理）） 20 ml、 250 raM Probenec id 200 μ 1、ゥシ胎児血清（FBS) 200 /i 1よりなる H/HBSS— Probenecid_FBS溶液に加え、混和後、 8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに、各ゥェル 100 μ 1ずつ分注し、 5% C0₂ィンキュベータ一中で 37。C1時間ィンキュベートした（色素ローデイング）。 ZAL2- 85a、 ZAL2- 1033または2八し2-1063を、 2. 5mM Prob enecidと 0, 2% BSAを含む Hanks' /HBSS 120 μ 1にて希釈し、ヒト ZAQL - 2 (3. 3 X 1 0一¹¹ M) と 37°Cで 1時間インキュベーション後、各フラクション 5 /i lを、 FLIPR用 96 穴プレート（V- Bottomプレート、 Coster社）へ移した（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローデイング終了後、 Hanks' /HBSSに 2. 5mM Prob enecidを力！]えた洗净ノッファーで、プレートウォッシャー (Molecular Devices 社）を用いて細胞プレートを 4回洗浄し、洗浄後 ΙΟΟ μ Ιの洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレートを FLIPRにセットし、測定を行つた（F LIPRにより、サンプルプレートから 50 μ 1のサンプルが細胞プレートへと移される）。

結果を図 8に示す。

これより、 ZAL2- 103aは、ヒト ZAQL - 2 (3. 3xlO^{_1 1}M) の活性を、等モル濃度の 3 . 3 χ10-"Μで約 97%抑制した toことがわかる。また、ヒト ZAQL- 2の活性に対し、 ZAL 2 - 106aは 10倍濃度 (3. 3x10 -¹⁰ M to) で、 ZAL2- 85aは 100倍濃度 (3. 3xlO"⁹ ) で、 95 %以上の中和活性をそれぞれ示した。

以上のことから、特に ZAL2-103aは、ヒト ZAQL - 2と等モル濃度でヒト ZAQL- 2の細胞内 Ca²⁺上昇活性を中和することが明らかとなり、中和抗体として使用可能である。

DO C L O C

寸 c

実施例 6 0 0寸

血漿中の！？ト ZAQL-2の定量

ヒト血漿を、同量のバッファー Cで 2倍希釈し、上記実施例 4記載のサンドィ. ツチ法- EIAにより、ヒト ZAQL- 2を定量した。

結果を表 2に示す。

表 2

ヒト血漿中 ZAQL - 2免疫活性

No. 男性（fmol/ml) 女性 (fmol/ml)

1

2

3 4. 56 0. 38

4 1. 69 0. 35

5 0. 94 6. 84

6 1. 23

7 1. 46

8 1. 45 1. 54

ヒト血漿（1ml)中のヒト ZAQL - 2量：

男性； 1. 95 ±0. 38 fmol/ml (mean土 SEM， n= 10)

女性； 9. 90 ±6.30 fmol/ml(mean士 SEM， n=8) これより、この測定系は、血漿中のヒト Z A Q L— 2の変動を正確に定量する二とができることがわかった。実施例 7

ヒト血漿中のヒト ZAQL- 2の逆相高速液体クロマトグラフィ一による検出

実施例 6に記載の、ヒト血漿中に含まれるヒト ZAQL-2免疫活性を同定するため

、ヒト血漿 2. 5mlにァセ'トニトリルを 5ηιΓ添加して混和後、遠心分離（15, OOOrpm

, 5分）を行い、タンパク質の除去を行った。上清を凍結乾燥後、この画分を濃縮後 0DS- 80™を用レヽる逆相 HPLCによつて分画した。

カラム条件：

カラム： 0DS-80™ (4. 6 250 mm)

溶離液： A液 (0. 05%トリフルォロ酢酸含有 5%ァセトニトリノレ）

B液（0. 05%トリフルォロ酢酸含有 60%ァセトニトリル）

溶出方法：ァセトニトリル濃度を最初の 5分間に 5%から 30%まで上昇させ、次に 30

分間かけて 30-40%に直線的に上昇させた。

流速： 1. 0 ml/分

分画： 0. 5ml/tube

溶出画分を凍結乾燥したのち、 250 μ 1のバッファー Cに溶解させ、実施例 4記載のサンドィツチ法 -ΕΙΑに供した。

結果を図 9に示す。血漿中のヒト ZAQL- 2の免疫活性はほとんど標準品ヒト ZAQ L - 2の溶出位置に検出された（回収率 66%) こと力ゝら、該サンドイッチ法 - EIAが、ヒト ZAQL - 2を検出していることが確認された。これより、この測定系は、血漿中のヒト ZAQL-2の変動を研究する際の重要な手段となりうることがわかる。産業法の利用可能性

本発明の抗体は、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩への極めて高い結合能を有し、さらには配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の細胞内 [Ca²⁺] 上昇活性を中和することもでき、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の作用を抑制（あるいは促進）することにより、例えば、消化器疾患（例、腸炎、下痢、便秘、吸収不良性症候群など）、睡眠障害（例、原発性不眠、概日リズム障害（例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群（時差ボケ）など）、ナルコレプシ一など）、季節鬱病、生殖機能障害（例

、子宮内 S莫症など）、内分泌疾患、中枢神経疾患（例、老人性痴呆、ァルツハイマー病、パーキンソン症候群など）、脳循環障害（例、脳卒中など）、老化に伴う各種傷害、精神疾患（例、不安、鬱病、不眠症、統合失調症、恐怖症など）、記憶障害、運動機能障害（例、パーキンソン症候群など）、てんかん、アルコール依存症、高血圧症、動脈硬化、不整脈、月経前緊張症候群、緑内障、癌（例、乳癌など）、エイズ、糖尿病、摂食障害（例、拒食症、過食症など）、肥満症（例、悪性肥満細胞症、外因性肥満症、過ィンシュリン性肥満症、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など）、骨粗鬆症などの予防 ·治療剤、好ましくは睡眠障害、生殖機能障害、内分泌疾患、中枢神経疾患、精神疾患、運動機能障害、摂食障害などの予防 ·治療剤、さらに好ましくは内分泌疾患、中枢神経疾患、運動機能障害などの予防 ·治療剤として有用である。また、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩を発現している癌を見出し、本発明の抗体を用いたミサイル療法による抗癌治療も可能である。本発明の抗体 2種を用いるサンドイッチ法による免疫学的測定法により、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩を感度よく特異的に定量することができるため、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の生理機能および病態との解明に有用である。さらに、血液中の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の濃度を測定することにより、例えば、上記疾患などの診断も可能である。また、本発明の抗体は、上記ポリべプチドの免疫組織染色にも使用可能である。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩に特異的に反応するモノクローナル抗体。

2. 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の、第 8〜9、 1 1、 1 5、 1 7、 2

1、 23、 25〜28、 30、 34、 36〜37、 39〜40、 44〜46、 4

8、 52〜53、 55、 64、 66、 68、 70〜73、 75〜76および 78 〜81番目のアミノ酸配列から選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に反応する請求項 1記載のモノクローナル抗体。

3. 配列番号： 2または配列番号： 3で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドを認識しない請求項 1記載のモノク口ーナル抗体。

4. 標識化された請求項 1記載のモノクローナル抗体。

5. ZAL 2- 103 (FERM B P _ 8431 ) で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る ZAL 2— 103 aで標示される請求項 1記載のモノクローナル抗体。

6. Z AL 2- 106 (FERM B P— 8432) で標示されるハイブリドーマ細胞から産生され得る ZAL 2— 106 aで標示される請求項 1記載のモノクローナノレ抗体。

7. 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するぺプチドに対して中和活性を有する請求項 1記載のモノクローナル抗体。

8. 請求項 1記載のモノクローナル抗体を含有してなる医薬。

9. 請求項 1記載のモノクローナル抗体を含有してなる診断薬。

10. 請求項 1記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする配列番号：

1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の定量法。

1 1. 請求項 1記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法。

12. 請求項 1記载のモノクローナル抗体と、被検液およぴ標識化された配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、上記抗体に結合した上記標識化されたポリぺプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、被検液中の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の定量法。

13. 担体上に不溶化した請求項 5記載のモノク口ーナル抗体、標識化された請求項 6記載のモノク口ーナル抗体およぴ被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法。

14. 担体上に不溶化した請求項 6記載のモノクローナル抗体、標識化された請求項 5記載のモノク口ーナル抗体および被検液を反応させた後、標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の定量法。

15. 請求項 1記載のモノクローナル抗体'を産生するハイプリドーマ細胞。

16. ZAL2— 103 (FERM BP— 8431) または ZAL 2— 106 (FERM BP— 8432) で標示される請求項 15記載のハイブリドーマ細胞。

1 7. 請求項 15記載のハイプリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から請求項 1記載のモノク口ーナル抗体を採取することを特徴とする請求項 1記载のモノクローナル抗体の製造法。

18. 中枢神経疾患、運動機能障害または内分泌疾患の予防 ·治療剤である請求項 8記載の医薬。

19. 中枢神経疾患、運動機能障害または内分泌疾患の診断薬である請求項 9記載の診断薬。

20. 請求項 1記載の抗体の、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリべプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体。

21. 請求項 5記載の抗体の、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体。

22. 請求項 6記載の抗体の、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体。

23. 哺乳動物に対し、請求項 1記載の抗体の有効量を投与することを特徴とする中枢神経疾患、運動機能障害または内分泌疾患の予防 ·治療法。

24. 中枢神経疾患、運動機能障害または内分泌疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1記載の抗体の使用。