WO2004037863A1 - 抗体およびその用途 - Google Patents

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disease
amino acid
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peptide
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PCT/JP2003/013528
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Yukio Shimomura
Nobuhiro Suzuki
Masaaki Mori
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • A61P9/12—Antihypertensives

Definitions

  • the present invention relates to an amino acid represented by the sequence number: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • the present invention relates to an antibody having binding specificity to a partial peptide on the C-terminal side of a polypeptide having an acid sequence or a derivative thereof. More specifically, the present invention relates to an antibody useful for the development of a method for quantifying the polypeptide or a derivative thereof based on an antigen-antibody reaction, and for the diagnosis and prevention / treatment of diseases involving the polypeptide or the derivative thereof.
  • Perotinsin II is a peptide originally found in the tail pituitary gland of fish, and is known to be involved in cardiovascular regulation, osmoregulation, and lipid metabolism in fish.
  • Perotinsin 11 shows a blood pressure lowering effect by intravenous administration to mammals such as rats, and a contractile or relaxing activity on vascular specimens, and the specific binding of labeled perotinsin 11 to membranes prepared from rat blood vessels. Therefore, it was anticipated that a homolog of perotinsin II would exist in mammals, function as an endogenous peptide, and that its specific receptor would exist in mammals (J. Exp. Zool ., Volume 275, pp. 226-238, 1996). And as expected, it was shown that the precursor gene for perotinsin II is present in fish, fish, and even in mice, rats, and hides (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15803-15808, 1998.
  • perotinsin II as a mature peptide processed from the precursor gene was purified and isolated from porcine spinal cord, and it was shown that perotinsin II actually exists as a peptide in mammals (Biochem. Biophys. Res. Commun., 265, 123-129, 1999, WO 00/32627).
  • human and rat GPR14 (SENR), an orphan receptor of unknown ligand (Genomics, Vol. 29, pp. 335-344, 1995, Bichem.
  • Biophys. Res. Commun., Vol. 209, pp. 752-759, 1995 is a functional receptor for ⁇ rotensin ⁇ .
  • Administering ⁇ rotensin II as a candidate ligand to animal cells expressing the GPR14 receptor protein (WO 01/04298, Nature, 401, 282-286, 1999, Biochem. Biophys. Res. Co bandad un., 266, 174-178, 1999, Nature Cell Biol., Vol. 1, pp. 383-385, 1999) or the purification of perotinsin II, which is a ligand active substance, from animal tissue extracts using the reactivity of receptor-expressing cells as an index (Biochem. Biophys. Res. Co. basket, 265, 123-129, 1999, WO 00/3262).
  • perotinsin II Prior to the discovery of homologous peptides and receptors in mammals, perotinsin II was found to have extremely potent vasoconstrictor activity using goby mouth tensin II and rat thoracic aorta. Am. J. Phys., 21, R361-R366, 1987, Eur. J. Pharmacol., 149, 6-66, 1988) has also been confirmed using A. niger Tensin II. (Nature, 401, 282-286, 1999). Furthermore, intravenous administration of perotinsin II to monkeys has been shown to reduce blood flow due to systemic vasoconstriction and to cause heart failure due to coronary vasoconstriction (Nature, 401, 282-286, 1999). Year) .
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, produced a plurality of monoclonal antibodies recognizing perotinsin II and developed an excellent method for measuring perotinsin II using the antibodies. did. As a result of further research, Ming has been completed.
  • An antibody that specifically reacts with the C-terminal partial peptide of the derivative SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, or a polypeptide thereof
  • the partial peptide at the C-terminal side is: (i) the 5th to 10th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (ii) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6th to 11th amino acid sequence of 6, (iii) SEQ ID NO: 8th to 13th amino acid sequence of 5, (iv) SEQ ID NO: 2nd to 7th of 7
  • the fanciform of (1) above which is a peptide having an amino acid sequence of the 8th to 13th amino acids of SEQ ID NO: 8;
  • AUI1 5-6-10 (FERM, BP-8221) AUII5-6-10a which can be produced from the hybridoma cells
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 6, characterized by using the antibody described in (1) above. 7 or a method for quantifying a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a derivative thereof,
  • FIG. 1 shows the results of examining the antibody titer of mice immunized with goby mouth tensin II using biotin-labeled gobypertensin II and HRP-labeled avidin.
  • the mouth is mouse No. 1
  • the country is mouse No. 2
  • the triangle is mouse No. 3
  • the hata is mouse No. 4
  • the triangle is mouse No. 5
  • the triangle is mouse No. 6.
  • ⁇ indicates mouse No. 7
  • ⁇ indicates mouse No. 8
  • X represents a non-immunized mouse.
  • FIG. 2 shows a typical example of screening for a hybridoma after cell fusion using a mouse immunized with goby mouth tensin 11.
  • b shows the absence of pig urotensin II-1
  • the drawing shows the addition of pig urotensin 11-1.
  • Fig. 3 shows AUII5-6-10a of human porcine tensin 11 (—low), porcine urotensin II-1 (_ ⁇ _), porcine tensin II (_ ⁇ _), rat porcine tensin II (— ⁇ -1)
  • the results obtained by examining the reactivity to octaprotensin II (-X-) and zeperotinsin II by a competition method using biotin-labeled vaserotensin 11 and HRP-labeled avidin-EIA are shown.
  • FIG. 4 shows human porcine tensin II (one bite), porcine urotensin II-1 (_-1), porcine porcine tensin II (1-1), and rat porcine tensin II (1-1) of AUII103-5-41a.
  • FIG. 3 shows the results obtained by examining the reactivity to goat mouth tensin II (-X-) by a competition method using biotin-labeled hazelopentensin II and miRP-labeled avidin-EIA.
  • Fig. 5 shows the AUII5-6-10a human porcine tensin II (one bite), porcine urotensin II-1 (1-1), porcine tensin II (- ⁇ -), rat porcine tensin II (_ ⁇ -1) 2 shows the results of the neutralizing action of goat tensin II (-X-) on the arachidonic acid metabolite release activity from rat GPR14 receptor-expressing CH0 cells.
  • FIG. 6 shows the inhibitory effect of intracerebroventricularly administered AUII5-6-10a on anxiety-like behavior.
  • a on the horizontal axis indicates the group administered with mouse IgG (unrestrained stress)
  • B indicates the group administered with mouse IgG (restrained stress load)
  • C indicates the group administered AUII5-6-10a (restraint stress load)
  • the axis represents the number of gazes.
  • the protein has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end, according to the convention of peptide labeling.
  • the protein used in the present invention including the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, may have any of a C-terminal hepoxyl group, carboxylate, amide, or ester.
  • Polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 And derivatives thereof may be hereinafter referred to as the peptide of the present invention.
  • polypeptides having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and derivatives thereof are also included in the peptides of the present invention.
  • the above derivative is represented by, for example, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 8.
  • Examples of derivatives of (i) are those in which one or more (eg, 1 to 5, preferably 1 or 2) amino acids in the above amino acid sequence are deleted, and (ii) Or two or more (eg, 1 to 5, preferably 1 or 2) amino acids added; (iii) one or more (eg, 1 to 5, preferably 1 or 2) (Iv) 1 or 2 or more (for example, 1 to 5, preferably 1 or 2) amino acids in the above amino acid sequence have been substituted with another amino acid Things.
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8.
  • the peptide on the C-terminal side of the peptide of the present invention includes: (i) a peptide having the 5th to 10th amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, (ii) a SEQ ID NO: 2 A peptide having the 6th to 11th amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, (iii) the 8th to 13th amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (Iv) a peptide having the 2nd to 7th amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, (V) a peptide having the 8th to 13th amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and (Vi) Examples include those in which some amino acid residues (eg, one) of these peptides are substituted with a substitutable group.
  • Examples of the partial peptide on the N-terminal side of the peptide of the present invention include (i) a peptide having the first to fifth amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, (ii) a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: : 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, 1st to 6th (Iii) a peptide having the first to eighth amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, (iv) a first to eighth amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 And (V) those in which some amino acid residues (eg, one) of these polypeptides are substituted with a substitutable group. '
  • the antibody that specifically reacts with the C-terminal partial peptide of the peptide of the present invention may be any antibody that specifically reacts with the C-terminal partial peptide of the peptide of the present invention.
  • a monoclonal antibody As an antibody that specifically reacts with the partial peptide on the C-terminal side of the peptide of the present invention, a monoclonal antibody is more preferable.
  • Preferred examples include the monoclonal antibody AU II 103-6-5, which can be produced from the hybridoma cells represented by AU II 5-6-10 (FERM BP-8221). -41 (FERM BP-8220), and a monoclonal antibody represented by AU I1103-5-41a, which can be produced from the hybridoma cell represented by FERM BP-8220.
  • an antibody that specifically reacts with the partial peptide at the C-terminal side of the peptide of the present invention can recognize the specific amino acid sequence at the C-terminal side of the peptide of the present invention, Can react with peptides.
  • an antibody that specifically reacts with the partial peptide at the N-terminal side of the peptide of the present invention Any peptide that specifically reacts with the partial peptide on the N-terminal side of the clear peptide may be used.
  • Such antibodies include (i) a peptide having the first to fifth amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, (ii) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or sequence A peptide having the first to sixth amino acid sequences of SEQ ID NO: 6; (iii) a peptide having the first to eighth amino acid sequences of SEQ ID NO: 5; (iv) the first peptide having SEQ ID NO: 8 Specifically reacts with a peptide having the amino acid sequence from the 8th to the 8th amino acid sequence, and (V) those in which some amino acid residues (eg, one) of these polypeptides have been substituted with a substitutable group.
  • Antibodies Antibodies.
  • an antibody that specifically reacts with the N-terminal partial peptide of the peptide of the present invention a monoclonal antibody is more preferable.
  • an antibody which specifically reacts with the partial peptide at the N-terminal side of the peptide of the present invention but does not react with the partial peptide at the C-terminal side is more preferable.
  • an antibody that specifically reacts with the partial peptide at the N-terminal side of the peptide of the present invention can recognize the specific amino acid sequence at the N-terminal side of the peptide of the present invention, Can react with peptides.
  • the method for preparing the antigen of the antibody of the present invention and the method for producing the antibody are described below.
  • any of the peptide of the present invention for example, any of the peptide of the present invention, a synthetic peptide having one or more of the same antigenic determinants as the peptide of the present invention can be used. (Hereinafter, these may be simply referred to as the antigen of the present invention). .
  • the peptide of the present invention can be obtained by a method known in the art from a tissue or cell such as a mammal (eg, human, mouse, rat, mouse, mouse, monkey, etc.), fish (eg, goby, etc.) or a method analogous thereto.
  • B chemically synthesized by a known peptide synthesis method using a peptide synthesizer, or (c) culturing a transformant containing DNA encoding the peptide of the present invention. It can be manufactured by (a) When the antigen of the present invention is prepared from tissues or cells of the mammal or fish, the tissues or cells are homogenized, and then extracted with an acid, alcohol, or the like. The antigen is purified and isolated by a combination of chromatography such as salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography to prepare the antigen of the present invention.
  • chromatography such as salting out, dialysis,
  • Synthetic peptides used for chemically synthesizing the antigen of the present invention include, for example, those having the same structure as the antigen of the present invention purified from nature, and amino acids such as peptides of the present invention. Examples include a peptide containing one or more amino acid sequences identical to the amino acid sequence at an arbitrary position consisting of two or more, preferably three or more amino acids in the sequence.
  • the DNA may be prepared by a known cloning method (for example, Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sarabrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). As the cloning method,
  • DNA encoding the peptide of the present invention from a cDNA library by a hybridization method using a DNA probe or a DNA primer designed based on the amino acid sequence of the peptide of the present invention.
  • the peptide as the antigen of the present invention may be prepared by (1) a known peptide synthesis method, or (2) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, It can be prepared by cleaving a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 with an appropriate peptidase.
  • any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the peptide is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is removed. Thus, the desired peptide can be produced.
  • condensation methods and elimination of protecting groups include the methods described in the following (i) or (ii).
  • the peptide can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method.
  • the peptide is obtained by a salt, it is converted to a free form by a known method. be able to.
  • the amide form of the peptide can be obtained using a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4 resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to the sequence of the target peptide according to various known condensation methods.
  • the peptide is cleaved from the resin and at the same time, various protecting groups are removed to obtain the desired peptide.
  • a partially protected peptide can be taken out using a resin such as a trityl resin, an oxime resin, or a 4-hydroxybenzoic acid-based resin, and the protecting group can be removed by a conventional method to obtain the desired peptide.
  • carbodiimides are preferably used.
  • carbodiimides include DC C, N, N'-diisopropyl Carpoimide, N-Nethyl-N '-(3.-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like.
  • the protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, H ⁇ Bt, HOOBt, etc.) or symmetrical acid anhydrides or HOBT esters Alternatively, it can be added to the resin after activating the amino acid protected in advance as an H ⁇ OB t ester.
  • a racemization inhibitor eg, H ⁇ Bt, HOOBt, etc.
  • symmetrical acid anhydrides or HOBT esters e.g., symmetrical acid anhydrides or HOBT esters
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for peptide condensation reactions.
  • Such a solvent examples include acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; Alcohols such as trifluoroethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, methyl acetate, and ethyl acetate And the like, or an appropriate mixture thereof, are used as a solvent for activating a protected amino acid or condensing with a resin.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform
  • Alcohols such as trifluor
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to about 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in about 1.5 to about 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting amino acid include Z, Boc, tertiary pentyloxycarponyl, isoporiloxylcarponyl, 4-methoxybenzyloxycarponyl, C11Z, Br-Z Adamantyloxycarponyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
  • the protecting group of the force Rupokishiru group include an alkyl group, C 3 _ 8 Kuroaru Kill group, C 7 - another 14 Ararukiru group, 2-Adamanchiru, 4 twelve Torobenjiru, 4-methoxybenzyl, 4-black port benzyl, Fuenashiru group and downy Njiruoki deer Lupo hydrazide, evening Sharibu Bok carboxymethyl Cal Poni hydrazide, tri Chill Hydrazide and the like.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower (Cw) alkanol groups such as an acetyl group, aroyl groups such as a benzoyl group, and groups derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a short-butyl group.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include Bz1, Cl_Bzl, 2-nitrobenzyl, Br—Z, tertiary butyl and the like. ,
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, Bom, Bum, Boc, Trt, and Fmoc.
  • Activated versions of the raw propyloxyl groups include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2, 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, ⁇ , ⁇ -hydroxysuccinimide, ⁇ -hydroxyfurimide, ester with HOB t)].
  • the activated amino group of the raw material includes, for example, the corresponding phosphoramide.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon in a stream of hydrogen, hydrogen fluoride anhydride, methyl sulfonic acid, and trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon in a stream of hydrogen, hydrogen fluoride anhydride, methyl sulfonic acid, and trifluoromethane.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally In the acid treatment, anisol, phenol, thioanisole, methacresol, paracresol, dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2 Addition of a cation scavenger such as monoethanedithiol is effective.
  • a cation scavenger such as monoethanedithiol
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-butanedithiol, etc.
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a peptide first, amidating the ⁇ -carboxyl group of the amino acid at the terminal end of lipoxyl, and then extending the peptide chain to the desired length on the amino group side, And a peptide (or amino acid) from which only the protecting group for the carboxyl group at the C-terminus is removed, and both peptides are prepared as described above.
  • a method of condensing in a mixed solvent may be mentioned. The details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude peptide can be obtained.
  • the crude peptide is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired peptide.
  • the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the terminal of the carboxy group is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the ester of the desired peptide is prepared in the same manner as the amide of the peptide. You can get the body.
  • the antigen of the present invention can also be used to directly immunize the insolubilized antigen. Further, a complex obtained by binding or adsorbing the antigen of the present invention to a suitable carrier may be immunized.
  • the mixing ratio between the carrier (carrier) and the antigen (hapten) of the present invention may be any ratio as long as the antibody can be efficiently produced with respect to the antigen of the present invention bonded or adsorbed to the carrier. May be bound or adsorbed in any ratio, and a polymer carrier commonly used for preparing antibodies to octene is usually used in a weight ratio of 0.1 to 1 hapten.
  • a polymer carrier examples include a natural polymer carrier and a synthetic polymer carrier.
  • Natural polymer carriers include, for example, serum albumin of mammals such as horses, egrets and humans; thyroglobulin of mammals such as horses and egrets; Hemoglobin, KHL hemosyanin and the like are used.
  • synthetic polymer carrier for example, polymers such as polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polyvinyls, and polypropylenes, or various latexes such as a copolymer can be used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • the condensing agent include diazonium compounds such as bisdiazobenzidine which crosslinks tyrosine, histidine, and tributofan; dialdehyde compounds such as glutaraldebit which crosslink amino groups; and toluene-2,4-diisopropylate.
  • diazonium compounds such as bisdiazobenzidine which crosslinks tyrosine, histidine, and tributofan
  • dialdehyde compounds such as glutaraldebit which crosslink amino groups
  • toluene-2,4-diisopropylate Diisocyanate compounds
  • dimaleimide compounds such as N, ⁇ '-0-phenylenedimaleimide which crosslink thiol groups
  • maleimide active ester compounds which crosslink amino groups and thiol groups
  • carpoimides which crosslink amino groups and carboxylic groups Compounds and the like
  • a thiol group is introduced by reacting an active ester reagent having a dithiopyridyl group with one of the amino groups (eg, SPDP), followed by reduction, to thereby introduce the thiol group.
  • an active ester reagent having a dithiopyridyl group with one of the amino groups (eg, SPDP), followed by reduction, to thereby introduce the thiol group.
  • the antigen of the present invention is administered to a warm-blooded animal alone or together with a carrier or diluent to a site where antibody production is possible, by an administration method such as intraperitoneal injection, intravenous injection, or subcutaneous injection. Is done. Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of warm-blooded animals include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, Goats, chickens and the like can be mentioned, but mouse is preferably used for preparing monoclonal antibodies.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen of the present invention for example, an individual having a bovine titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma of the peptide of the present invention can be prepared.
  • the antibody titer of the peptide of the present invention in the serum can be measured, for example, by reacting the below-described peptide of the present invention with an antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kellar and Milstein (Nature, 256, 495, 1975).
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, and the like, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of bone marrow cells used is usually about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG 1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, usually for 1 to 10 minutes.
  • hybridoma culture on a solid phase eg, a microplate
  • a solid phase eg, a microplate
  • a mouse immunoglobulin antibody is used.
  • a method for detecting the monoclonal antibody of the present invention bound to a solid phase by adding protein A, an anti-immunoglobulin antibody or protein
  • the hybridoma culture supernatant is added to the solid phase to which A has been adsorbed, the peptide of the present invention labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like is added, and the monoclonal antibody of the present invention bound to the solid phase is detected. How to put out is captured. Screening and breeding of the monoclonal antibody of the present invention is usually performed by adding HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the above-described antibody titer of the antibody of the present invention in the antiserum.
  • Separation and purification of the monoclonal antibody against the peptide of the present invention can be carried out by the same method as that used for the separation and purification of normal monoclonal antibodies (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation; Electrophoresis, adsorption / desorption using an ion exchanger (eg, DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-bound solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G. Specific purification method for obtaining an antibody by dissociation).
  • the antibody of the present invention can be produced by culturing the hybridoma cells in vivo or in vitro of a warm-blooded animal and collecting the antibody from the body fluid or culture.
  • the antibody of the present invention can quantify the peptide of the present invention with high sensitivity.
  • the use of the antibody of the present invention such as the method for quantifying the peptide of the present invention (immunoassay) and the medicament containing the vesicle of the present invention, will be described in detail.
  • the peptide of the present invention can be measured or detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2, Fal)' or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, the antigen, or the antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (for example, the amount of the peptide of the present invention) in the liquid to be measured is measured. Any measurement method may be used as long as it is detected by physical or physical means, and is prepared and calculated using a standard solution containing a known amount of the antigen.
  • a sandwich method for example, a sandwich method, a competition method, an immunometric method, a nephrometry method and the like are used, and a competition method described later is preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • a competition law for example, a sandwich method, a competition method, an immunometric method, a nephrometry method and the like are used, and a competition method described later is preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • the competition method involves competitively reacting the antibody of the present invention, a test solution, and a labeled peptide of the present invention, and measuring the ratio of the labeled peptide of the present invention bound to the antibody.
  • This is a quantitative method for quantifying the peptide of the present invention in a test solution.
  • the quantification of the peptide of the present invention in the test solution by the competition method is preferably performed, for example, by using a solid phase immobilization method.
  • an anti-mouse IgG antibody is used as the solid phase antibody.
  • an antibody of the present invention eg, a monoclonal antibody represented by AUII5-6-10a or AUII103_5-41a
  • a peptide of the present invention labeled with HRP e.g., HRP activity adsorbed on the solid phase is measured to quantify the peptide of the present invention.
  • the sandwich method comprises reacting an antibody of the present invention, a labeled antibody of the present invention, and a test solution which are insolubilized on a carrier, and then measuring the activity of the labeling agent to obtain the peptide of the present invention in the test solution.
  • a method for quantifying the peptide of the present invention in a test solution preferably, a monoclonal antibody represented by AUII5-6-10a or AUII103-5-41a
  • an antibody that reacts specifically with a partial peptide on the C-terminal side of the peptide of the present invention insolubilized on a carrier preferably labeled with AUII5-6-10a or AUII103-5-41a) A monoclonal antibody
  • a carrier preferably labeled with AUII5-6-10a or AUII103-5-41a
  • a monoclonal antibody after reacting an antibody specifically reacting with the partial peptide at the N. terminal side of the labeled peptide of the present invention and a test solution, and then measuring the activity of the labeling agent.
  • the body or the peptide of the present invention that specifically reacts with the C-terminal partial peptide of the insolubilized peptide of the present invention is used in the sandwich method.
  • the test solution is reacted with an antibody that specifically reacts with the partial peptide on the N-terminal side of the peptide (primary reaction), and is further specific to the partial peptide on the C-terminal side of the labeled peptide of the present invention.
  • Primary reaction an antibody that specifically reacts with the partial peptide on the N-terminal side of the peptide
  • secondary reaction Measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier after reacting (secondary reaction) with an antibody that reacts specifically or a body that specifically reacts with the N-terminal partial peptide of the peptide of the present invention.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be carried out at the same time or at different times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase carrier or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, and two or more types of antibodies are used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. Mixtures may be used.
  • the antibody used in the secondary reaction is An antibody that recognizes a peptide other than the C-terminal partial peptide (ie, the N-terminal side) is preferable.
  • the antibody used in the primary reaction recognizes the N-terminal partial peptide of the peptide of the present invention, 2
  • an antibody that recognizes a peptide other than the N-terminal partial peptide ie, the C-terminal is preferably used.
  • an antigen in a test solution and a solid-phased antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of the labeled antibody of the present invention, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Reacts the antigen in the test wave with an excessive amount of the labeled antibody of the present invention, then adds the solid-phased antigen and binds the unreacted labeled antibody of the present invention to the solid phase. Separate the solid and liquid phases. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • Nephrometry In nephrometry, the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance is not particularly limited, but a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or the like is used.
  • the radioisotope is not particularly limited, but for example, [ 125 1], [ 131 1], [3 ⁇ 4]., [ 1 C] and the like are preferable.
  • the enzyme is not particularly limited, but is preferably a stable enzyme having a large specific activity, for example, i3_galactosidase, / 3-darcosidase, alkaline phosphatase, passoxidase, or the like.
  • fluorescent substance examples include, but are not limited to, fluorescein and fluorescein isothiosinate). Examples thereof include, but are not limited to, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc. Further, for binding between the antibody and the labeling agent, a biotin-avidin compound may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellose, and synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass.
  • the antibody of the present invention can quantify the peptide of the present invention with high sensitivity, elucidate the physiological function of the peptide of the present invention, and prevent diseases and symptoms involving the peptide of the present invention. Useful for treatment and diagnosis.
  • the peptide of the present invention has effects such as a vascular smooth muscle contraction effect, a myocardial hypertrophy effect, and an anxiety-enhancing effect.
  • a disease involving the peptide of the present invention can be obtained.
  • central nervous system disorders eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, Pick's disease, Huntington's disease, senile dementia, cerebrovascular dementia, etc.
  • mental disorders eg, anxiety, depression, insomnia, schizophrenia, fear
  • Cardiovascular disease eg, hypertension, hypotension, etc.
  • heart disease eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, dilated congestive heart myopathy, hypertrophic cardiomyopathy, pulmonary hypertension, etc.
  • kidney disease eg, nephritis, renal failure, interventricular ⁇ kidney disease, etc.
  • urinary system disease eg, frequent urination, urinary incontinence, etc.
  • the antibody of the present invention can also be used for detecting the peptide of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the peptide of the present invention, detection of the peptide of the present invention in each fraction during purification, analysis of the behavior of the peptide of the present invention in test cells, etc. Can also be used.
  • the antibody of the present invention has a neutralizing effect of the peptide of the present invention, It has an inhibitory action such as a vascular smooth muscle contraction action, a myocardial hypertrophy action, and an anxiety-promoting action.
  • a disease involving the peptide of the present invention eg, a central nervous disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome) , Pick's disease, Huntington's disease, senile dementia, cerebrovascular dementia, etc.)
  • Mental illness eg, anxiety, depression, 'insomnia, schizophrenia, phobia etc.
  • cardiovascular disease eg, hypertension, Hypotension, etc.
  • heart disease eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, dilated depressive cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, pulmonary hypertension, etc.
  • kidney disease eg, nephritis, renal failure, interventricular kidney
  • urinary diseases eg, frequent urination,
  • the prophylactic / therapeutic agent containing the antibody of the present invention has low toxicity, and can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form in humans or mammals (eg, rat, egret, sheep, It can be administered parenterally or orally to pigs, mice, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the antibody of the present invention may be administered per se or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used. Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. May be included. Such injections can be prepared according to known methods. Examples of the method of preparing an injection include dissolving the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid commonly used for injections. It can be prepared by suspending or emulsifying.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing budose sugar and other adjuvants, and the like
  • suitable solubilizing agents for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol ( For example, propylene glycol, polyethylene glycol 1] col), nonionic surfactant (for example, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene thyne (50mo 1) adduc tof hydrogenated cast or oil))
  • Oily liquids include, for example, sesame oil, soybean oil, etc. However, benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • a suppository for rectal administration may be prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a usual suppository base.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, and capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain carriers, diluents or excipients usually used in the field of formulation.
  • carriers and excipients for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the above-mentioned parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a dosage unit form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the antibody content is usually about 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, especially about 5 to 100 mg for injection, and about 10 to 250 mg for other dosage forms. Is preferably contained.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the dosage of a prophylactic or therapeutic agent or a diagnostic agent (pharmaceutical) containing the antibody of the present invention varies depending on the administration target, target disease, symptoms, administration route, and the like.
  • the antibody of the present invention is usually used in a dose of about 0.1 to 2 Omg / kg body weight, preferably about 0.1 to 1 OmgZkg body weight, more preferably about 0.1 to 1 OmgZkg body weight. It is convenient to administer 0.1 to 5 mg Z kg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day.
  • an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • amino acids and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the relevant field.
  • amino acids may have optical isomers, the L-isomer shall be indicated unless otherwise specified.
  • a 1 a Alanine
  • Th r Threonine
  • G 1 n Glutamine
  • SEQ ID NOs used herein represent the amino acid sequences of the following peptides.
  • 1 shows the amino acid sequence of human porcine tensin II.
  • 1 shows the amino acid sequence of pig urotensin II.
  • hybridoma cells AUI I 103-5-41 obtained in Example 1 described below were obtained from October 22, 2002, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan 1 Central No. 6 (postal code) 305-8566) and deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the accession number FERM BP-8220.
  • the antibody obtained from each hybridoma cell is represented by adding “a” to the end of the cell name.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Reference Examples and Examples, but these examples do not limit the scope of the present invention.
  • Linear gradient elution was performed using 300 ml of 20% aqueous acetonitrile containing 0.1% TFA and 300 ml of 50% aqueous acetonitrile containing 0.1% TFA. The main fraction was collected and freeze-dried to obtain 7.9 mg of a white powder.
  • Human porcine tensin II (SEQ ID NO: 1), porcine urotensin II-1 (SEQ ID NO: 2), porcine urotensin II-2 (SEQ ID NO: 3), porcine urotensin II (SEQ ID NO: 4) and rat Mouth tensin II (SEQ ID NO: 5) and the structure at the C-terminal side (Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys) are compatible with goby, long-jawed mudsucker,
  • Pyotin was bound to goblet tensin II and used as a label for enzyme immunoassay (EIA). That is, 2 nmol of goby mouth tensin II was dissolved in 0.1 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), and 20 nmol of biotin N-hydroxysuccinimide ester was added thereto, followed by reaction at room temperature for 1 hour.
  • EIA enzyme immunoassay
  • the antibody titer in the mouse antiserum immunized with goat mouth tensin II was measured by the following method.
  • a 50 mM carbonate buffer (pH 9.6) 96 well microphone containing anti-mouse immunoglobulin antibody (IgG fraction, manufactured by Kappel) containing lO ⁇ g / ml was used. 100 1 was dispensed into the mouth plate and left at 4 ° C for 24 hours. The plate is then washed with phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4), and a 25% blockage is applied to block excess binding sites in the wells.
  • PBS phosphate buffered saline
  • mice with relatively high antibody titers 200-300 zg of immunogen dissolved in 0.25-0.3 ml of physiological saline is intravenously inoculated for final immunization. Done. Three to four days after the final immunization, the spleen is removed from the mouse, squeezed and filtered with a stainless mesh, and Eagle's 'Minimum' Essential Medium
  • MEM mouse-derived myeloma cells
  • P3U1 mouse-derived myeloma cells
  • the cell precipitate GIT medium (Wako Pure drug) containing 10% fetal bovine serum were suspended as (GIT-10% FCS) to P3U1 is 2XL 0 5 per lml, 24-well multi-dishes (Limburg port 1 ml each in 1 ml. After seeding, the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • HAT hypoxanthine 1 ⁇ 10- 4 ⁇ , aminopterin 4x10- 3 ⁇ 4, adding thymidine 1.
  • 6xl (T 3 M) I containing I to GIT- 10% FCS medium (HAT medium) one by one Ueru per lml HAT selective culture was started, and the HAT selective culture was continued by discarding 1 ml of the old solution and adding 1 ml of HAT medium 3 days, 6 and 9 days after the start of the culture. was observed 9 to 14 days after the cell fusion.
  • the culture broth turned yellow (about lxlO 6 cells / ml), the supernatant was collected and the antibody titer was measured according to the method described in the above (3).
  • FIG. 2 shows the results obtained using mouse No. 6 (see FIG. 1) as a typical example of screening of a hybridoma derived from a mouse immunized with goat mouth tensin 11.
  • the antibodies in the culture supernatants of No. 5 and No. 103 hybridomas were shown to specifically bind to perotinsin II, and a total of two types of hybridomas, No. 5 and No. 103, were selected. .
  • hybridomas were cloned by limiting dilution.
  • thymocytes of a BALB / C mouse were added as feeder cells at 5 ⁇ 10 5 cells / well.
  • two types of clones No. 5-6-10 and No. 103-5-41, were selected as hybridomas with high antibody production.
  • No. 5-6-10 and No. 103-5-41 will be named AUI 15-6-10 and AUI 1103-5-41, respectively.
  • mice were injected intraperitoneally with 0.5 ⁇ 1 of mineral oil (BALB / C), and 1-3 ⁇ 10 6 cells / animal were injected intraperitoneally, and antibody-containing ascites were collected 6-20 days later did.
  • mineral oil BALB / C
  • the eluate was dialyzed against PBS at 4 ° C for 2 days, sterilized and filtered through a filter (manufactured by Millipore), and stored at 4 ° C or -80 ° C.
  • the class subclass of the monoclonal antibody was determined by the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) method using a purified monoclonal antibody-bound solid phase. That is, a 0.1 M carbonate buffer, pH 9.6 solution ′ containing 2 g / ml of the antibody was dispensed in 100 1 portions into a 96-well microplate and left at 4 ° C. for 24 hours.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • the excess binding site of the gel is filled with a block ace, and then the isotat (Mouse-TyperTM Sub-Isotyping Kit, Bio-Rad)
  • the class and subclass of the immobilized antibody were examined by ELISA using The class of antibodies produced by the two hybridomas (Nos. 5-6-10 and 103-5-41) was IgGl.
  • Example 2
  • Monoclonal antibodies (AUII5-6-10a and AUI II 03-5) produced by two hybridomas, No.5-6-10 and No.103-5-41, respectively, prepared using goby mouth tensin 11 as an immunogen.
  • the reaction specificity of -41 a) was examined by the following method.
  • the microplate bound to the anti-mouse immunoglobulin antibody described in Example 1 (3) above was treated with Buffer C (0.02 M phosphate buffer containing 1% BSA, 0.4 M NaCK and 2 mM EDTA, PH 7.0). 486-fold diluted AUII5- 6-10 hybridoma culture supernatant or AUII103-5-41 hybridoma culture supernatant diluted 54-fold with buffer 1 C 33 U buffer 1 C 33 l of human, porcine-1, porcine, rat or goby mouth tensin II solution 33 ⁇ 1 and the biotin-labeled hazel perotinsin II (diluted 8333-fold in buffer C) described in Example 1 (2) above In addition, the reaction was carried out at 4 ° C for 16 hours.
  • AUII103-5-41a was Compared to tensin II, it showed higher reactivity to human and octapertensin II.
  • the measurement of arachidonic acid metabolite release activity was performed by seeding rat GPR14 receptor-expressing CH0 cells in a 24-well plate at a cell density of 0.5 10 5 eel ls / wel 1 and culturing for 24 hours. Ci / weIl was added. [3 ⁇ 4] Twenty-four hours after the addition of arachidonic acid, the cells are washed with MEM containing 0.1% BSA, and then mixed with the above-mentioned monoclonal antibodies at the above concentrations and human, porcine-1, porcine, rat, and goby mouth tensins. The sum solution was added at 500 1 / well.
  • AUII5-6-10a neutralizes the arachidonic acid metabolite-releasing activity of human, porcine-1, porcine, rat, and octalactin tensin II.
  • mice (9-10 weeks old, 36-38 g, male, Nippon Charles River) were lightly anesthetized with getylether, and mouse IgG (immunoglobulin G) (Sigma, 10 mg / ml PBS, 5 ⁇ 1) or AUII5-6-10a (10 mg / ml PBS, 5 ⁇ 1) was administered to the right ventricle.
  • a two-stage needle (Matsumoto Seisakusho) was used for intraventricular administration. Mice awakened 30 minutes later were placed in restraint cages (Natsume Seisakusho) and subjected to restraint stress for 1 hour. Control animals were allowed to move freely in the cage for 1 hour.
  • a spontaneous momentum measurement system (Muromachi Kikai) was used for the measurement.
  • a stand-up sensor (MRX-110TX-RX) was attached to the lower side of the cage, and a plate with holes (3.8 cm in diameter, 4 pieces) was hung from above the thigh above the sensor 5 thighs.
  • the measurement was performed using a device that was fixed down to the inside.
  • the number of gazes was expressed as the number of times the mouse placed on the board protruded the head from the hole by the gaze action and blocked the sensor installed.
  • the spontaneous activity was measured with a SUPERMEX sensor (PYS-001, passive infrared sensor) attached to the upper part. Spontaneous activity was expressed as the number of times the mouse crossed the sensor. The experiment was performed between 15:00 and 18:00.
  • mice No change was observed in the spontaneous behavior of the mice at this time [mouse IgG administration (unrestrained): 621.5 ⁇ 20. 4 times, mouse IgG administration (restraint stress load): 611.2 2 6 times, AUI I5-6-10a administration (restraint stress load): 649.7 Sat 20. 1 times).
  • intracerebroventricular administration of AUI 15-6-10a suppresses anxiety-like behavior indicated by a decrease in mouse gaze behavior induced by restraint stress without affecting spontaneous behavior. I understand. Industrial applicability
  • the antibodies of the present invention are useful for the development of therapeutic, prophylactic, and diagnostic agents for diseases and the like involving the peptide of the present invention.
  • the antibody of the present invention can be industrially produced.
  • a medicine (especially a diagnostic agent) containing the antibody of the present invention may be a disease associated with the peptide of the present invention [eg, a central nervous system disease (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, Pick's disease, Huntington's disease) , Senile dementia, cerebrovascular dementia, etc.), mental illness (eg, anxiety, depression, insomnia, schizophrenia, phobia etc.), cardiovascular disease (eg, hypertension, hypotension, etc.), heart disease (Eg, heart failure, arrhythmia, long QT syndrome, dilated depressive cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, pulmonary hypertension, etc.), kidney diseases (eg, nephritis, renal failure, interventricular renal disease, etc.), urinary diseases (eg, Eg, frequent urination, urinary incontinence, etc.).
  • a central nervous system disease eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, Pick's disease, Huntington's disease
  • Senile dementia cerebrovascular dementia, etc
  • the antibody of the present invention has a neutralizing effect of the peptide of the present invention, for example, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, Pick's disease, Huntington's disease, senile dementia, cerebrovascular dementia, etc.) ), Mental disorders (eg, anxiety, depression, insomnia, schizophrenia, phobia etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, hypotension, etc.), heart diseases (eg, heart failure, arrhythmia, QT) Prolonged syndrome, dilated congestive cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, pulmonary hypertension, etc., kidney disease (eg, nephritis, renal failure, interventricular renal disease, etc.), urinary system disease (eg, pollakiuria, urinary incontinence, etc.) ⁇ Prevention ⁇ Treatment It is for.
  • central nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, Pick's disease, Huntington's disease, senile dementia, cerebrovascular dementia, etc.
  • the quantification method of the present invention is applicable to diseases involving the peptide of the present invention [eg, central nervous system diseases (eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, Pick's disease, Huntington's disease, senile dementia, cerebrovascular dementia) ), Mental illness (eg, anxiety, depression, insomnia, schizophrenia, phobia, etc.), cardiovascular disease (eg, hypertension, hypotension, etc.), heart disease (eg, heart failure, arrhythmia, QT prolongation) Syndrome, dilated depressive cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, pulmonary hypertension, etc.), kidney disease (eg, nephritis, renal failure, interventricular renal disease, etc.), urinary system disease (eg, pollakiuria, urinary incontinence, etc.) Etc.] for diagnosis, prevention or treatment.
  • central nervous system diseases eg, Alzheimer's disease, Parkinson's syndrome, Pick's disease, Huntington's disease, senile dementia, cerebrovascular dementia
  • Mental illness
  • the amount of the peptide of the present invention derived from human, pig, mouse, rat, mouse or goby can be measured with high sensitivity. It is useful as a diagnostic, prophylactic or therapeutic agent, reagent, etc. for diseases involving peptides.

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Abstract

本発明は、配列番号：１～８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、該抗体を用いたウロテンシンＩＩの定量方法、および該抗体を含有してなる医薬（例、中枢神経疾患、精神疾患、循環器疾患、心疾患、腎臓疾患または泌尿器系疾患など）などに関する。

Description

明細 抗体およびその用途 技術分野
本発明は、 配列畚号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配 列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表きれるアミ ノ酸配列を有するポリぺプチド.またはその誘導体の C端側の部分べプチドに結 合特異性を有する抗体に関する。 更に詳しくは、 抗原抗体反応に基づく上記ポ リペプチドまたはその誘導体の定量法の開発、 上記ポリペプチドまたはその誘 導体が関与する疾患の診断および予防 ·治療剤の開発などに有用な抗体に関す る。 背景技術
ヒトなど哺乳動物においては、 心機能や血圧などの心循環器系の調節にアン ジォテンシン I I、 ブラディキニンおよびエンドセリンなどの種々の内在性生理 活性ペプチドが関与していることが知られている。 最近、 これらのペプチドに 加えて新たにゥロテンシン 11の心循環器系に対する関与が明らかとなり、 新規 の心循環器系作用ペプチドとして注目されている。 ゥロテンシン I Iは、 当初、 魚類の尾部下垂体から見出されたペプチドであり、 魚類においては心循環調節、 浸透圧調節あるいは脂質代謝などに関与することが知られていたが、 一方で、 魚類のゥロテンシン 11がラットなど哺乳動物に対して静脈内投与による血圧低 下作用あるいは血管標本に対する収縮あるいは弛緩活性を示すこと、 また、 標 識したゥロテンシン 11に対する特異的結合がラット血管より調製された膜画分 に確認されたことから、 哺乳動物においてもゥロテンシン I Iのホモログが存在 して内在性のぺプチドとして機能し、 さらにその特異的受容体が存在すること が予想されていた （J. Exp. Zool .、 275巻、 226-238頁、 1996年） 。 そして、 そ の予想どおり、 ゥロテンシン I Iの前駆体遺伝子が魚類以外に力エル、 さらには 哺乳動物であるマウス、 ラットおよびヒドにも存在することが示された （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95巻、 15803 - 15808頁、 1998.年、 FEBS Lett., 457巻、 28- 32頁、 1999年、 WO 01/04298号公報） 。 また、 前駆体遺伝子からプロセスさ れた成熟ペプチドとしてのゥロテンシン IIがブタ脊髄から精製 ·単離され、 哺 乳動物においても実際にゥロテンシン IIがペプチドとして存在することも示さ れた (Biochem. Biophys. Res. Commun.、 265卷、 123-129頁、 1999年、 W0 00/32627号公報） 。 さらに、 リガンド未知のォーファン受容体であるヒトおよ びラット GPR14 (SENR) (Genomics, 29卷、 335-344頁、 1995年、 Bichem.
Biophys. Res. Commun.、 209卷、 752- 759頁、 1995年） がゥロテンシン Πの機能 的な受容体であることが、 GPR14受容体蛋白質を発現させた動物細胞にリガンド 候補としてゥロテンシン IIを投与して反応性を見出したり （W0 01/04298号公報、 Nature, 401巻、 282- 286頁、 1999年、 Biochem. Biophys. Res. Co匪 un.、 266巻、 174- 178頁、 1999年、 ature Cell Biol., 1巻、 383- 385頁、 1999年） 、 あるい は、 受容体発現細胞の反応性を指標として動物組織抽出物からリガンド活性物 質であるゥロテンシン IIを精製すること （Biochem. Biophys. Res. Co籠 un.、 265巻、 123- 129頁、 1999年、 W0 00/3262号公報) によって明らかにされた。
ゥロテンシン IIが極めて強力な血管収縮活性を示すことは、 哺乳動物におけ . るホモログペプチドおよび受容体の発見に先んじて、 ハゼゥ口テンシン IIおよ びラット胸部大動脈を用いて見出されていた （Am. J. Phys.、 21巻、 R361-R366 頁、 1987年、 Eur. J. Pharmacol., 149巻、 6卜 66頁、 1988年） が、 ヒトウ口テ ンシン IIを用いても確認された （Nature、 401巻、 282- 286頁、 1999年） 。 さら に、 ゥロテンシン IIをサルに静脈投与すると全身性の血管収縮により血流量が 減少し、 また、 冠血管の収縮によって心不全に陥ることが示された （Nature、 401巻、 282- 286頁、 1999年） 。 これらのことからゥロテンシン IIが新たな心循 環器系関連ペプチドとして心疾患などの発症に関与している可能性が予想され た。 しかし、 その後、 単離ヒト血管を用いた検討によってゥロテンシン Πがヒ ト血管に対しては、 冠血管あるいは微小血管において必ずしも顕著な収縮作用 を示さず、 ヒト循環器系に対する作用はあまり大きなものではないことが示さ れた （Br. J. Pharmacol., 131巻、 44卜 446頁、 2000年、 Am. J. Physiol.
Heart Circ. Physiol.、 280巻、 H925- H928頁、 2001年、 Circulation, 103卷、 1378- 1381頁、 2001年） 。 ヒ卜にゥロテンシン I Iを投与した実験では、 前腕部の 血流が減少したという報告 (Br. J. Pharmaco l .、 135巻、 25- 27頁、 2002年） お よび血流 影響を与えなかったという報告 (Card i ovasc. Res.、 53巻、 341-347 頁、 2002年） の両者がある。 最近、 低酸素状態に置くことによって肺性高血圧 および右室肥大を呈したラットにおいてゥロテンシン 11およびその受容体の右 室での発現が亢進していること （Hear t Vesse l s, 16巻、 64-68頁、 2002年） お よびヒトにおいても鬱血性心不全患者の心筋でゥ口テンシン 11の発現が亢進し ていることが報告された （Lancet、 359巻、 1990-1997頁、 2002年） 。 さらに、 培養ラット心筋細胞においてゥロテンシン I Iが肥大作用を示す （FEBS Let t . , 508巻、 57- 60頁、 2001年）ことから、 ゥロテンシン I Iが心肥大の発症に関与し、 心不全の原因となっている可能性が示唆された。 なお、 心不全患者の血中ゥロ テンシン I I濃度が増加していることも報告されている （Lancet、 360巻、 545- 546頁、 2002年） 。 さらには、 腎不全患者などの血中あるいは尿中ゥロテンシン Π濃度が増加していることが報告され (Lancet, 358巻、 810-81 1頁、 2001年、 J. Hyper tent i on, 19巻、 2185-2190頁、 2001年) 、 腎機能に対するゥロテンシ ン I Iの関与が示唆された。 また、 GPR14が脳の中脳橋被蓋野のコリン作動性ニュ 一ロンと共存すること （Brain Res.、 923巻、 .120-127頁、 2001年） 、 そして、 ラットを用いた実験によりゥロテンシン I Iの脳室内投与によって行動量が増加 したり、 不安が亢進されることが報告 （Psychopharmacol ogy、 155巻、 426-433 頁、 2001年、 W0 02/14513号公報） されており、 何らかの中枢作用が存在するこ とも示唆された。
ゥロテンシン I Iの生理作用または疾患に対する関与についてのさらなる検討 が必要とされており、 ゥロテンシン I Iを簡便かつ高感度に検出 ·定量する測定 系が切望されていた。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 ゥロテン シン I Iを認識する複数のモノクロ一ナル抗体を作製し、 該抗体を用いるゥロテ ンシン I Iの優れた測定法を開発した。 そして、 さらに研究を行った結果、 本発 明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5、 配列番号： 6または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポ リペプチドまたはその誘導体の C端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、
(2) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまた はその誘導体の C端側の部分ペプチドに特異的に反応する上記 （1) 記載の抗 体、
(3) 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応 する上記 （1) 記載の抗体、
(4) C端側の部分ペプチドが、 （i) 配列番号： 1の第 5番目〜第 10番目の アミノ酸配列、. (ii) 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4もしくは配 列番号： 6の第 6番目〜第 11番目のアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 5の第 8番目〜第 13番目のアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 7の第 2番目〜第 7番 目のアミノ酸配列、 または （V) 配列番号： 8の第 8番目〜第 13番目のァミノ 酸配列を有するペプチドである上記 （1) 記載の枋体、
(5) モノクロ一ナル抗体である上記 （1) 記載の抗体、
(6) 標識化された上記 （1)'記載の抗体、 '
(7) 中和抗体である上記 （1) 記載の抗体、
(8) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番 号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポ リペプチドまたはその誘導体.の活性を中和する上記 （7) 記載の抗体、 .
(9) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 5または配列 番号： 6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の活 性を中和する上記 （7) 記載の抗体、
(10) AUI 1 5-6- 10 (FERM, BP— 8221) で標示されるハ イブリドーマ細胞から産生され得る AU I I 5-6- 10 aで標示される上記
(5) 記載の抗体、 (11) AU I I 103 - 5 -41 (FERM BP— 8220) で標示され るハイプリドーマ細胞から産生され得る AU I 1 103- 5-41 aで標示さ れる上記 （5) 記載の抗体、
(12) 上記 （5) 記載の抗体を産生するハイプリドーマ細胞、
(13) AU I I 103 -.5 -41 (FERM BP- 8220) で標示され る上記 （12) 記載のハイプリドーマ細胞、
(14) AU I 1 5-6- 10 (FERM BP— 8221) で標示され,る上 記 （12) 記載のハイプリド一マ細胞、 .
(15) 上記 （12) 記載のハイプリドーマ細胞を生体内または生体外で培養 し、 その体液または培養物から上記 （5) 記載の抗体を採取することを特徴と する上記 （5) 記載の抗体の製造法、 '
(16) 上記 （1) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(17) 中枢神経疾患、 精神疾患、 循環器疾患、 心疾患、 腎臓疾患または泌尿 器系疾患の予防 ·治療剤である上記 （16) 記載の医薬、
(17 a) 精神疾患、 の予防 ·治療剤である上記 （16) 記載の医薬、
(18) 上記 （1) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(19) 中枢神経疾患、 精神疾患、 循環器疾患、 心疾患、 腎臓疾患または泌尿 器系疾患の診断薬である上記 （18) 記載の診断薬、
(19 a) 精神疾患の診断薬である上記 （18) 記載の診断薬、
(20) 上記 （1) 記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 1、 配列 番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列 番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドま たはその誘導体の定量法、
(21) 上記 （1) 記載の抗体、 被検波および標識化された配列番号： 1、 配 列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配 列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド またはその誘導体とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された配列 番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列 番号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有する ポリぺプチドまたはその誘導体の割合を測定することを特徴とする、 被検液中 の配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5 - 配列番号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有 するポリぺプチドまたはその誘導体の定量法、 '
(22) 上記 （1) 記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 1、 配列 番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列 番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドま たはその誘導体が関与する疾患の診断法、
(23) 哺乳動物に対して、 上記 （1) 記載の抗体の有効量を投与することを 特徴とする中枢神経疾患、 精神疾患、 循環器疾患、 心疾患、 腎臓疾患または泌 尿器系疾患の予防 ·治療法、
(24) 中枢神経疾患、 精神疾患、 循環器疾患、 心疾患、 腎臓疾患または泌尿 器系疾患の予防 ·治療剤を製造するための上記 （1) 記載の抗体の使用などを 提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ハゼゥ口テンシン IIを免疫したマウスの抗体価をピオチン標識化ハ ゼゥロテンシン IIおよび HRP標識アビジンを用いて調べた結果を示す。 図中、 口 はマウス No.1を、 國はマウス No.2を、 〇はマウス No.3を、 秦はマウス No.4を、 △はマウス No.5を、 ▲はマウス No.6を、 ◊はマウス No.7を、 ♦はマウス No.8を,
Xは非免疫マウスを表す。
図 2は、 ハゼゥ口テンシン 11を免疫したマウスを用いた場合の細胞融合後の ハイプリドーマのスクリーニングの典型例を示す。 図中、 ロはブタウロテンシ ン II- 1非添加を、 画はブタウロテンシン 11-1添加を表す。
図 3は、 AUII5-6- 10aのヒトウ口テンシ 11 (—ロー） 、 ブタウロテンシン II - 1 (_〇_) 、 ゥシゥ口テンシン II (_△_) 、ラットウ口テンシン II (―◊ 一） および八ゼゥロテンシン II (- X-) に対する反応性をピオチン標識化ハ ゼゥロテンシン 11および HRP標識ァビジンを用いる競合法- E I Aで調べた結果を示 す。 図 4は、 AUII103-5- 41aのヒトウ口テンシン II (一口一） 、 ブタウロテンシン II- 1 (_〇一） 、 ゥシゥ口テンシン II (一△一） 、ラットウ口テンシン II (一◊ 一） およびハゼゥ口テンシン II (-X-) に対する反応性をピオチン標識化ハ ゼゥロテンシン IIおよ miRP標識ァビジンを用いる競合法- E I Aで調べた結果を示 す。
図 5は、 AUII5-6-10aのヒトウ口テンシン II (一口—） 、 ブタウロテンシン II - 1 (一〇一) 、 ゥシゥ口テンシン II (-Δ-) 、ラットウ口テンシン II (_◊ 一） およびハゼゥ口テンシン II (-X-) のラット GPR14レセプタ一発現 CH0細 胞からのァラキドン酸代謝物放出活性に対する中和作用の結果を示す。
図 6は、 脳室内投与した AUII5- 6- 10aの不安様行動に対する抑制作用を示す。 図中、 横軸の Aはマウス IgG投与 （無拘束） 群を、 Bはマウス IgG投与 （拘束スト レス負荷）'群を、 Cは AUII5-6-10a投与 （拘束ストレス負荷） 群を、 縦軸は視き 込み回数をそれぞれ表す。 発明を実施するための最良の形態
本明細書におけるタンパク質 （ポリペプチド） は、 ペプチド標記の慣例に従 つて、 左端が N末端 (ァミノ末端) 、 右端が C末端 (カルボキシル末端) であ る。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをはじめと する、 本発明で用いられるタンパク質は、 C末端が力ルポキシル基、 カルポキ シレート、 アミドまたはエステルの何れであってもよい。
配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有 するポリペプチドおよびその誘導体を、 以下、 本発明のペプチドと称すること もある。 さらに、 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド およびその誘導体も、 本発明のペプチドに含まれる。
上記誘導体としては、 例えば、 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3， 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるァミノ酸配列の一部のァミノ酸残基が、 置換可能な基によって置 換されたもの、 アミノ酸残基の一部が欠失したもの、 アミノ酸残基などが付 加 ·揷入されたものなどが挙げられる。
配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有 するポリペプチドの誘導体の例としては、 （i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜5個、 好ましくは 1または 2個） のアミノ酸が欠失した もの、 （i i) 上記アミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜5個、 好まし くは 1または 2個） のアミノ酸が付加したもの、 （i i i) 上記アミノ酸配列に 1 または 2個以上 （例えば 1〜5個、 好ましくは 1または 2個） のアミノ酸が揷 入されたもの、 または （iv) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜5個、 好ましくは 1または 2個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された ものが挙げられる。
さらに、 上記誘導体としては、 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、 その一部のァミノ 酸残基が置換可能な基 （例、 C y s、 水酸基など） によって置換されたもの、 その一部のアミノ酸残基が欠失し、 かつ一部のアミノ酸残基が置換可能な基
(例、 C y s、 水酸基など） によって置換されたものなども挙げられる。
本発明のペプチドの C端側の部分べ: °チドとしては、 例えば、 （i) 配列番 号： 1の第 5番目〜第 1 0番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （i i) 配列 番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 6の第 6番目〜第 1 1番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （i i i) 配列番号： 5の第 8番目〜第 1 3番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （iv) 配列番号： 7の第 2番目〜 第 7番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （V) 配列番号： 8の第 8番目〜第 1 3番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 および （vi) これらのペプチドの 一部のアミノ酸残基 （例、 1個） が置換可能な基によって置換されたものなど が挙げられる。
本発明のペプチドの N端側の部分ペプチドとしては、 例えば、 （i) 配列番 号： 1の第 1番目〜第 5番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （i i) 配列番 号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 6の第 1番目〜第 6番 目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （iii) 配列番号： 5の第 1番目〜第 8番 目のアミノ酸配列を有するペプチド、 （iv) 配列番号： 8の第 1番目〜第 8番 目のアミノ酸配列を有するペプチド、 および （V) これらのポリペプチドの一部 のアミノ酸残基 （例、 1個） が置換可能な基によって置換されたものなどが挙 げられる。 '
本発明の'ペプチドの C端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、 本発 明のぺプチドの C端側の部分べプチドに特異的に反応するものであればよく、
(i) 配列番号： 1の第 5番目〜第 10番目、 第 4番目〜第 11番目のアミノ酸 配列を有するペプチド、
(ii) 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4または配列番号： 6の第 6 番目〜第 11番目、 第 5番目〜第 12番目のアミノ酸配列を有するペプチド、
(iii) 配列番号： 5の第 8番目〜第 13番目、 第 7番目〜第 14番目のァミノ 酸配列を有するペプチド、 '
• (iv) 配列番号： 7の第 2番目〜第 7番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (V) 配列番号： 8の第 8番目〜第 13番目、 第 7番目〜第 14番目のアミノ酸 配列を有するペプチド、 および
(vi) これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基 （例、 1個） が置換可能な 基によって置換されたものなどに特異的に反応する抗体が挙げられる。
本発明のペプチドの C端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、 モノクローナル抗体がより好ましい。 好ましい例としては、 AU I I 5— 6— 10 (FERM BP— 8221) で標示されるハイブリド一マ細胞から産生 され得る AU I I 5 - 6 - 10 aで標示されるモノクローナル抗体、 AU I I 103-5-41 (FERM B P— 8220 ) で標示されるハイブリドーマ 細胞から産生され得る AU I 1 103-5-41 aで標示されるモノクローナ ル抗体などが挙げられる。
このように、 本発明のぺプチドの C端側の部分べプチドに特異的に反応する 抗体は、 本発明のペプチドの C端側の特定のアミノ酸配列を認識することによ り、 本発明のペプチドと反応することができる。
本発明のペプチドの N端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、 本発 明のペプチドの N端側の部分ペプチドに特異的に反応するものであればよい。 このような抗体としては、 （i) 配列番号： 1の第 1番目〜第 5番目のアミノ酸 配列を有するペプチド、 （i i) 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4ま たは配列番号： 6の第 1番目〜第 6番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (i i i) 配列番号： 5の第 1番目〜第 8番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 (iv) 配列番号： 8の第 1番目〜第 8番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 および （V) これらのポリペプチドの一部のアミノ酸残基 （例、 1個） が置換可 能な基によって置換されたものなどに特異的に反応する抗体が挙げられる。
本発明のペプチドの N端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体としては、 モノクローナル抗体がより好ましい。 このような抗体として.は、 さらに本発明 のべプチドの N端側の部分べプチドに特異的に反応するが、 C端側の部分ぺプ チドには反応しない抗体がより好ましい。
このように、 本発明のぺプチドの N端側の部分べプチドに特異的に反応する 抗体は、 上記本発明のぺプチドの N端側の特定のアミノ酸配列を認識すること により、 本発明のペプチドと反応することができる。 以下に、 本発明の抗体の抗原の調製法、 および該抗体の製造法について説明 する。
( 1 ) 抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、 例えば本発明のぺ プチド、 本発明のぺプチドと同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以上有する 合成ペプチドなど何れのものも使用することができる （以下、 これらを単に本 発明の抗原と称することもある） 。 .
本発明のペプチドは、 （a) 哺乳動物 （例、 ヒト、 ゥシ、 ラット、 マウス、 ブ 夕、 サルなど） 、 魚類 （例、 ハゼなど） などの組織または細胞から公知の方法 あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、 （b) ペプチド ·シンセサイザ一等を 使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、 または （c) 本発明のぺプチ ドをコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって製造する ことができる。 (a) 該哺乳動物ま.たは魚類の組織または細胞から本発明の抗原を調製する場合 は、 その組織または細胞をホモジナイズした後、 酸、 またはアルコールなどで 抽出を行い、.得られた抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフ ィ一、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィーな どのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離し、 本発明の抗原 を調製できる。
(b) 本発明の抗原を化学的に合成する場合に用いられる、 合成ペプチドとして は、 例えば天然より精製した本発明の抗原と同一の構造を有するものや、 本発 明のぺプチドなどのアミノ酸配列において 2個以上、 好ましくは 3個以上のァ ミノ酸からなる任意の箇所のァミノ酸配列と同一のァミノ酸配列を 1種あるい は 2種以上含有するべプチドなどが挙げられる。
(c) D NAを含有する形質転換体を用いて該本発明のペプチドを製造する場合、 該 D NAは、 公知のクローニング方法 （例えば、 Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sarabrook et al .， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の 方法など) に従って作成することができる。 該クローニング方法としては、
(1) 本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づきデザインした D NAプローブま たは D NAプライマーを用い、 c D NAライブラリーからハイブリダィゼーシ ョン法により該本発明のペプチドをコードする D N Aを含有する形質転換体を 得る方法、 または （2) 該本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づきデザインし た D N Aプライマ一を用い、 P C R法により該本発明のペプチドをコードする D N Aを含有する形質転換体を得る方法などが挙げられる。
本発明の抗原としてのペプチドは、 （1 ) 公知のペプチドの合成法に従って、 または （2 ) 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配 列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるァ,ミ ノ酸配列を有するペプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによって調製 することができる。
ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによつ ても良い。 すなわち、 該ペプチドを構成し得る部分ペプチド、 またはアミノ酸 と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離するこ とにより目的のペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の 脱離としてはたとえば、 以下の （i) または （ii) に記載された方法等が挙げら れる。
(1リ M. Bodanszky およひ M.A. Ondetti、 Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年）
(ii) Schroederおよび Luebke、 The Peptide, Academic Press, New York (1965年） .
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグ ラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて該ペプチドを 精製単離することができる。 上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合 は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合は、 公知の方法によつて遊離体に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用 いて得ることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂， ヒドロキシメチル樹 JJ旨、 ベンズヒドリルアミン榭脂、 アミノメチル樹脂、 4一 脂、 PAM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフヱニルァセトアミドメチル樹 脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— (2'， 4'—ジメトキシフエ二ル―ヒドロ キシメチル） フエノキシ樹脂、 4— (2', 4'ージメトキシフエ二ル— Fmo cアミノエチル） フエノキシ樹脂などが挙げられる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチド の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後 に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 目的のペプチド を取得する。 あるいはクロ口.トリチル樹脂、 ォキシム樹脂、 4ーヒドロキシ安 息香酸系樹脂等を用い、 部分的に保護したペプチドを取り出し、 更に常套手段 で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の！^合に関しては、 ペプチド合成に使用できる 各種活性化試薬を用いることができるが、 カルポジイミド類が好ましく用いら れる。 このようなカルポジイミド類としては DC C、 N, N'—ジイソプロピル カルポジイミド、 Nニェチルー N'— （3 .—ジメチルァミノプロリル） カルポジ イミドなどが挙げられる。 各種活性化試薬による活性化にはラセミ化抑制添加 剤 （例えば、 H〇B t、 HO O B tなど） とともに保護されたアミノ酸を直接 樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HO B tエステルあるいは H〇 O B tエステルとしてあちかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに 樹脂に添加することができる。 保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に 用いられる溶媒としては、 ぺプチド縮合反応に使用しうることが知られている 溶媒から適宜選択されうる。 そのような溶媒としては、 例えば N, N—ジメチ ルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルピロリドンなど の酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 ト リフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスル ホキシド類、 ピリジンなどの三級ァミン類、 ジォキサン、 テトラヒドロフラン などのエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢 酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが 保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒として用いられ る。 反応温度はべプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲 から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜約 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活 性化されたアミノ酸誘導体は通常約 1 . 5ないし約 4倍過剰で用いられる。 二 ンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離 を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる 反応を繰り返しても十分な縮合が得られな,いときには、 無水酢酸またはァセチ ルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチル化して、 後の反応に影響を 及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 ターシャ リ一ペンチルォキシカルポニル、 ィソポル二ルォキシカルポニル、 4—メトキ シベンジルォキシカルポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカル ポニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2 -二トロフエニル スルフエニル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが挙げられる。 力ルポキシル基の保護基としては、 たとえば アルキル基、 C3_8 クロアル キル基、 C7-14ァラルキル基の他、 2—ァダマンチル、 4一二トロベンジル、 4 ーメトキシベンジル、 4—クロ口ベンジル、 フエナシル基およびべンジルォキ シカルポニルヒドラジド、 夕ーシャリーブ卜キシカルポニルヒドラジド、 トリ チルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはェ一テル化 によって保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァ セチル基などの低級 （Cw) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導され る基などが挙げられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 たとえばベン ジル基、 テトラヒドロピラニル基、 夕一シャリーブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば Bz 1、 C l _ B z l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 ターシャリーブチルなどが挙げられ る。 、
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 To s、 4ーメトキシ— 2， 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 Bom、 Bum, Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが挙げられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル [アルコール (たとえば、 ペンタクロロフエノー ル、 2, 4, 5—トリクロロフエノ一ル、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァ ノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 Η〇ΝΒ、 Ν—ヒドロキシスク シミド、 Ν—ヒドロキシフ夕ルイミド、 HOB t) とのエステル] などが挙げ られる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 たとえば対応するリン 酸アミドが挙げられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば Pd—黒または Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メ 夕ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいは これらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチ ルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア 中ナトリウムによる還元なども挙げられる。 上記酸処理による脱離反応は一般 に一 2 0 °C〜4 0 の温度で行われるが、 酸処理においてはァニソ一ル、 フエ ノール、 チオアニソール、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフ イド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2一エタンジチオールのようなカチォ ン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として 用いられる 2， 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジチオール、 1， 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ る脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手 段から適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 力ルポキシル末端アミ ノ酸の α—カルボキシル基をアミド化し、 その後、 アミノ基側にペプチド鎖を 所望の鎖長まで延ばした後に、 該ペプチド鎖の Ν末端の α—ァミノ基の保護基 のみを除いたぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたぺプチ ド （またはアミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような混合溶媒 中で縮合させる方法が挙げられる。 縮合反応の詳細については上記と同様であ る。 縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての 保護基を除去し、 所望の粗ペプチドを得ることができる。 この粗ペプチドは既 知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のぺ プチドのアミド体を得ることができる。
ぺプチドのエステル体を得るにはカルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシ ル基を所望のアルコ一ル類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ぺプチドのァ ミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の抗原は、 不溶化したものを直接免疫することもできる。 また、 本発 明の抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。 該担 体 （キャリアー） と本発明の抗原 （ハプテン） との混合比は、 担体に結合ある いは吸着させた本発明の抗原に対して抗体が効率よくできれば、 どのようなも のをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、 通常八プテンに対する 抗体の作製にあたり常用されている高分子担体を重量比でハプテン 1に対し 0 .
1〜1 0 0の割合で使用することができる。 このような高分子担体としては、 天然の高分子担体や合成の高分子担体が挙げられる。 天然の高分子担体として は、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンゃ例えばゥシ、 ゥサギなどの哺乳動物のチログロブリン、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒト、 ヒッジ などの哺乳動物のヘモグロビン、 KH Lへモシァニンなどが用いられる。
合成の高分子担体としては、 例えばポリアミノ酸類、 ポリスチレン類、 ポリ アクリル類、 ポリビニル類、 ポリプロピレン類などの重合物または供重合物な どの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができる。 縮合剤としては、 例えば、 チロシン、 ヒスチジン、 トリブトファン を架橋するビスジァゾ化べンジジンなどのジァゾニゥム化合物、 アミノ基同士 を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、 トルエン— 2， 4— ジィソシァネ一トなどのジィソシァネート化合物、 チオール基同士を架橋する N, Ν' - 0 -フエ二レンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、 ァミノ基とチ オール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、 ァミノ基と力ルポキシル 基とを架橋するカルポジイミド化合物などが好都合に用いられる。 また、 アミ ノ基同士を架橋する際にも、 一方の Τミノ基にジチォピリジル基を有する活性 エステル試薬 （例えば、 S P D Pなど） を反応させた後還元することによりチ オール基を導入し、 他方のァミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレ イミド基を導入後、 両者を反応させることもできる。
( 2 ) モノクローナル抗体の作製
本発明の抗原は、 温血動物に対して、 例えば腹腔内注入、 静脈注入、 皮下注 射などの投与方法によつて、 抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは 担体、 希釈剤と共に投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 温血動物と しては、 例えばサル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリなどがあげられるが、 モノクローナル抗体作製にはマゥスが好 ましく用いられる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、 本発明の抗原を免疫された温血動物、 たとえばマウスから坊体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に 脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と 融合させることにより、 本発明のぺプチドのモノク口一ナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 血清中の本発明のペプチドの抗体価の測定は、 例えば後記の標識化した本発明のペプチドと抗血清とを反応させた後、 抗体に 結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。 融合操作は既知の方法、 例えばケ一ラ一とミルスタインの方法 （Nature, 256巻、 495頁、 1975年） に従 い実施できる。 融合促進剤としては、 ポリエチレングリコール （PEG) ゃセ ンダイウィルスなどが挙げられ、 好ましくは PEGなどが用いられる。 骨髄腫 細胞としてはたとえば NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP— 1などがあげ られ、 P 3U1などが好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細 胞） 数と骨髄細胞数との好ましい比率は、 通常 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の 濃度で添加され、 通常 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜 37 °Cで通常 1〜 10 分間ィンキュペートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
本発明の抗体産生八イブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用で きるが、 例えば本発明のペプチドまたはそれらの部分ペプチドを直接あるいは 担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養 上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体
(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 坊マウス免疫グロプリン抗体が 用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合した本発明のモノクロ一 ナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着さ せた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識し た本発明のぺプチドを加え、 固相に結合した本発明のモノク口一ナル抗体を検 出する方法などが拿げられる。 本発明のモノクローナル抗体のスクリーニング、 育種は、 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加し て、 1 0〜 2 0 %牛胎児血清を含む動物細胞用培地 （例、 R P M I 1 6 4 0 ) で行われる。 ハイブリド一マ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の本発明の 抗体の抗体価の測定と同様 して測定できる。
本発明のぺプチドに対するモノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリク 口一ナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法 （例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法； 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロティ ン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤により坊体のみを採取し、 結合を 解離させて抗体を得る特異的精製法など） に従って行われる。
以上のようにして、 ハイプリドーマ細胞を温血動物の生体内または生体外で 培養し、 その体液または培養物から抗体を採取することによって、 本発明の抗 体を製造することができる。 本発明の抗体は、 本発明のペプチドを感度良く定量することができる。 以下に、 本発明のペプチドの定量法 （免疫測定法） 、 本発明の坊体含有医薬 など、 本発明の抗体の用途について、 詳細に説明、する。
( 1 ) 本発明のペプチドの定量法
本発明の抗体を用いることにより、 本発明のペプチドの測定あるいは組織染 色などによる検出を行なうことができる。 これらの目的には、 抗体分子そのも のを用いてもよく、 また抗体分子の F (ab' ) 2、 Fal)'または Fab画分などを用いて もよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるものではなく、 被測定液中 の抗原量 (例えば、 本発明のペプチド量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体 一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗 原を含む標準液を用いて作製し算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用 いてもよい。
このような測定法としては、 例えば、 サンドイッチ法、 競合法、 ィムノメト リック法、 ネフロメ卜リ一などが用いられるが、 感度、 特異性の点で後述する 競合法が好ましい。 1) 競合法
競合法は、 本発明の抗体、 被検液および標識化された本発明のペプチドとを 競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のぺプチドの割合を 測定することにより、 被検液中の本発明のぺプチドを定量する定量法である。 競合法による被検液中の本発明のペプチドの定量は、 例えば、 固相化法を用 ' いて行うことが好ましい。
固相化法の具体例としては、 抗マウス I gG抗体を固相化抗体として用い、 . この固相化抗体の存在するプレートに、
(a) (i) 本発明の抗体 （例、 AUII5- 6- 10aまたは AUII103-5- 41aで標示される モノクローナル抗体など） 、 （ii) ピオチンで標識化された本発明のペプチド、 および （iii) 被検液を反応させ、 HRP (西洋ヮサビパ一ォキシダーゼ） で標 識化されたアビジンを加え、 反応後、 固相上の HRP活性を測定し、 本発明の ペプチドを定量する方法、 または '
(b) (i) 本発明の抗体 （例、 AUII5- 6- 10aまたは AUII103_5-41aで標示される モノクローナル抗体など） 、 （ii) HRPで標識化された本発明のペプチド、 および （iii) 被検波を添加し、 反応後、 固相に吸着した HRP活性を測定し、 本発明のペプチドを定量する方法などが挙げられる。
2) サンドイッチ法
サンドイッチ法は、 担体上に不溶化した本発明の抗体、 標識化された本発明 の抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定することにより被検 液中の本発明のペプチドを定量する定量法である。
サンドイッチ法として、 好ましくは、
(0 担体上に不 化した本発明のぺプチドの N端側の部分べプチドに特異的に 反応する抗体、 標識化された本発明のぺプチドの C端側の部分べプチドに特異 的に反応する抗体 （好ましくは、 AUII5- 6- 10aまたは AUII103-5- 41aで標示され るモノクロ一ナル抗体） および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定す ることを特徴とする被検液中の本発明のぺプチドの定量法、
(ii) 担体上に不溶化した本発明のペプチドの C端側の部分ペプチドに特異的： に反応する抗体 （好ましくは、 AUII5- 6-10aまたは AUII103- 5-41aで標示される モノクローナル抗体） 、 標識化された本発明のペプチドの N.端側の部分べプチ ドに特異的に反応する抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定 することを特徴とする被検波中の本発明のペプチドの定量法などが挙げられる < サンドィツチ法においては、 不溶化した本発明のぺプチドの C端側の部分べ プチドに特異的に反応する坊体または本発明のペプチドの N端側の部分べプチ ドに特異的に反応する抗体に被検液を反応 （1次反応） させ、 さらに標識化さ れた本発明のぺプチドの C端側の部分べプチドに特異的に反応する抗体または 本発明のぺプチドの N端側の部分べプチドに特異的に反応するお体を反応 （ 2 次反応） させた後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより、 被検 液中の本発明のペプチド量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は同 時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。'標識化剤および不溶化 の方法は、 前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による 免疫測定法において、 固相用坊体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ず しも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等の目的で 2種類以上の 抗体の混合物を用いてもよい。 サンドイッチ法による本発明のペプチドの測定 法においては、 例えば、 1次反応で用いられるお体が本発明のペプチドの C端 側の部分べプチドを認識する場合は、 2次反応で用いられる抗体は C端側の部 分ペプチド以外 （即ち、 N端側） を認識する抗体が好ましく、 1次反応で用い られる抗体が本発明のぺプチドの N端側の部分べプチドを認識する場合は、 2 次反応で用いられる抗体は、 N端側の部分ペプチド以外 （即ち、 C端側） を認 識する抗体が好ましく用いられる。
3 ) ィムノメトリック法
ィムノメ卜リック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 ある いは被検波中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、 次に 固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させた後、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原 量を定量する。
4 ) ネフロメトリ一 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不 溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降物 しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリ一な どが好適に用いられる。
上記 1 ) 〜4 ) の定量法において、 標識物質を用いる測定法に用いられる標 識剤としては、 特に限定されるものではないが、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光 物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 特に限定される ものではないが、 例えば [1251] 、 [1311] 、 [¾] .、 [1 C] などが好ましい。 上記酵素としては、 特に限定されるものではないが、 安定で比活性の大きなも のが好ましく、 例えば i3 _ガラクトシダ一ゼ、 /3—ダルコシダ一ゼ、 アルカリ フォスファタ一ゼ、 パ一ォキシダ一ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる ( 上記蛍光物質としては、 特に限定されるものではないが、 例えばフルォレス力 ミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが挙げられる。 上記発光物質と しては、 特に限定されるものではないが、 例えばルミノール、 ルミノール誘導 体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが挙げられる。 さらに、 抗体と標識剤との 結合には、 ピオチン一アビジン系の化合物を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通 常タンパグ質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を 用いる方法でもよい。 担体としては、 例えばァガ口一ス、 デキストラン、 セル 口一スなどの不溶性多糖類、 例えばポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリ コンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、 特別の条 件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操 作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のペプチドの測定系を構築す ればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参 照することができる （例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6.2年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYJ Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)) 、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)) 、 同書 Vol. 74
(Immunochemical Techniques (Part 0) 、 同書 Vol. 84 (Immunochemical 5 Techniques (Part D:Selected Immunoassays)) 、 同書 Vol. 92
(Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) 、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part ' I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミック プレス社発行） など参照） 。 以上のように、 本発明の抗体は、 本発明の プチ 0 ドを感度良く定量することができ、 本発明のペプチドの生理機能の解明および 本発明のぺプチドが関与する疾患 ·症状の予防 ·治療や診断に有用である。
本発明のペプチドは、 血管平滑筋収縮作用、 心筋肥大作用、 不安亢進作用な どの作用を有する。
本発明の抗体を用いて体液中 （血液、 血漿、 血清、 尿など） に含まれる本発 5 明のペプチドの量を測定することにより、 本発明のペプチドが関与する疾患
〔例、 中枢神経疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 ピック病、 ハンチントン病、 老人性痴呆、 脳血管性痴呆など） 、 精神疾患 （例、 不安、 鬱 病、 不眠症、 統合失調症、 恐怖症など） 、 循環器疾患 （例、 高血圧症、 低血圧 症など） 、 心疾患 （例、 心不全、 不整脈、 QT延長症候群、 拡張型うつ血性心 0 筋症、 肥大型心筋症、 肺高血圧など） 、 腎臓疾患 （例、 腎炎、 腎不全、 間室性 ' 腎疾患など） 、 泌尿器系疾患 （例、 頻尿、 尿失禁など） など〕 などを診断する ことができる。 また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する 本発明のペプチドを検出するためにも使用することができる。 また、 本発明の ペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本 5 発明のペプチドの検出、 被検細胞内における本発明のペプチドの挙動の分析な どのために使用することもできる。
(2) 本発明の抗体を含有してなる医薬
本発明の抗体は、 本発明のペプチドの中和作用を有し、 本発明のペプチドの 示す血管平滑筋収縮作用、 心筋肥大作用、 不安亢進作用などの作用を阻害する 作用を有することより、 例えば、 本発明のペプチドが関与する疾患 〔例、 中枢 神経疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 ピック病、 ハンチン トン病、 老人性痴呆、 脳血管性痴呆など） 、 精神疾患 （例、 不安、 鬱病、'不眠 症、 統合失調症、 恐怖症など） 、 循環器疾患 （例、 高血圧症、 低血圧症など） , 心疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 拡張型うつ血性心筋症、 肥大 型心筋症、 肺高血圧など） 、 腎臓疾患 （例、 腎炎、 腎不全、 間室性腎疾患な ど） 、 泌尿器系疾患 （例、 頻尿、 尿失禁など） など〕 などの予防 ·治療剤また は診断薬などの医薬として使用することができる。
本発明の抗体を含有してなる予防 ·治療剤は低毒性であり、 そのまま液剤と して、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラッ ト、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して非経口的 または経口的に投与することができる。
本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物と して投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明の抗体お よびその塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むも のであっても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する 剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤等が用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤等の 剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調製できる 注射剤の調製方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはその塩を通常注 射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液に溶解、 懸濁または乳化するこ ' とによって調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブド ゥ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレング 1〕コール） 、 非イオン界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0、 H C O— 5 0 (po lyoxye t hy 1 ene (50mo 1 ) adduc t o f hydrogenated cas t or o i l ) ) 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用 いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用し てもよい。 調製された注射液は、 適当なアンプルに充填されることが好ましい 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混 合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 (糖衣錠、 フィルムコ一ティング錠を含む) 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル 剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このような組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用い られる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦 形剤としては、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが 用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の 剤形としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤 が挙げられる。 抗体の含有量としては、 .投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 0 m g程度、 とりわけ注射剤では 5〜1 0 O m g程度、 その他の剤形では 1 0〜2 5 0 m g程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
本発明の抗体を含有する予防 ·治療剤または診断薬 （医薬） の投与量は、 投 与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルート等によっても異なるが、 例えば、 成人の 肥大型心筋症の治療のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0 . 0 1〜2 O m g/k g体重程度、 好ましくは 0 . 1〜1 O m gZ k g体 重程度、 さらに好ましくは 0 . l〜5 m g Z k g体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他 の非経口投与 （例、 皮下投与） および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与 することができる。 症状が特に重 場合には、 その症状に応じて増量してもよ い。 本発明の明細書において、 アミノ酸等を略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 アミノ酸に関し光学異性 体があり得る場合は、 特に明示しなければ L—体を示すものとする。
PAM フエ二ルァセタミドメチル
B o c t -ブチルォキシカルボニル
Fmo c 9 -フルォレニルメチルォキシカルポニル
C 1 -Z 2 -クロ口—ベンジルォキシカルポニル
Br— Z 2-ブロモーべンジルォキシカルポニル
B z 1
C 1 -B z 1 2-クロローべンジル
O c H e X
OB z 1 ベンジルエステル
T o s p -トルエンスルホニル
HONB N-ヒドロキシ -5-ノルポルネン -2, 3-ジカルボキシイミド
HOB t 1-ヒドロキシベンゾ卜リアゾール '
HOOB t 3 -ヒドロキシ -3， 4 -ジヒド口- 4-ォキソ- 1 , 2， 3_ベンゾトリアジン
Me B z 1 4 -メチルベンジル
Bom ベンジルォキシメチル ,
Bum t -ブトキシメチル
T r t トリチル
DNP ジニトロフエニル
TFA トリフルォロ酢酸 ,
DMF N，N-ジメチルフオルムアミド
DCM ジクロロメタン
DCC BHA
pMBHA
CHO G 1 y ：グリシン
A 1 a ：ァラニン
Va 1 ：バリン
L e u ：ロイシン
I 1 e ：イソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As ：ァスパラギン酸
Figure imgf000027_0001
A r g ：アルギニン
H i s ：ヒスチジン
P h e ：フエ二ルァラニン
T V r •午口シン
T r p ： 卜リブ卜ファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン 本明細書において用いられる配列番号は、 以下のぺプチドのァミノ酸配列を 表す。
〔配列番号： 1〕
ヒトウ口テンシン I Iのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ブタウロテンシン I I一 1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
ブタウロテンシン I I— 2のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 4〕
ゥシゥ口テンシン I Iのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5〕
ラットウ口テンシン I Iのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
ハゼゥ口テンシン I Iのアミノ酸配列を示す。 ！
〔配列番号： 7〕
以下に示す参考例 1で得られたヒトウ口テンシン I I関連べプチド （U R P ) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
マウスゥロテンシン I Iのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 9〕
配列番号： 1の第 5番目〜第 1 0番目のアミノ酸配列を示す。 （配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4もしくは配列番号： 6の第 6番目〜第 1 1番目の アミノ酸配列、 配列番号： 5の第 8番目〜第 1 3番目のアミノ酸配列、 配列番 号： 7の第 2番目〜第 7番目のアミノ酸配列、 または配列番号： 8の第 8番目 〜第 1 3番目のアミノ酸配列） 後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 AUI 15-6-10は、 平成 14
(2002) 年 10月 22日から、 日本国茨城県つくば市東 1T目 1番地 1 中央第 6 (郵便 番号 305-8566) 、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 受託番号 FERM BP- 8221として寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 AUI I 103- 5-41は、 平成 14 (2002) 年 10月 22日から、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便 番号 305-8566) 、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 受託番号 FERM BP- 8220として寄託されている。
なお、 各ハイプリドーマ細胞から得られる抗体については細胞名の後に 「a」 を付けた形で表す。 以下に、 参考例および実施例を示し、 本発明をより詳細に説明するが、 これ らは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例 1
ヒトウ口テンシン I I関連ペプチド （URP) (配列番号： 7) の製造 市販の Boc- Va卜 0C¾-PAM樹脂 （0.77匪 ole/g resin) 0,5 mmole 分をぺプチ ド合成機 ACT- 90 (Advanced Chemtech社) の反応槽に入れ、 Boc- strategy (匿- HOBt) ペプチド合成方法で Boc- Cys (MeBzl)、 Boc-Tyr (Br- Z)、 Boc-Lys (Cl-Z) , Boc-Trp(CHO), Boc- Phe、 Boc-Cys (MeBzl)、 Boc- Alaを順に導入して目的の保護 ペプチド樹脂を得た。 この樹脂 0.32 gを p_クレゾ一ル 2 ml、 1,4-ブタンジチォ ール 1.5 mlと共に無水弗化水素 20 ml中 0°C 60分撹袢した後、 弗化水素を減圧留 去し、 残留物にジェチルエーテルを加えて沈殿を濾過した。 この沈殿に 50% 酢酸水を加えて抽出し、 不溶部分を除き、 抽出液を十分に濃縮後 50%酢酸水 で充填したセフアデックス （登録商標） G-25カラム （2.0 X 80 cm) に付した。 同溶媒で展開して主要画分を集め、 凍結乾燥して粗 SHペプチド 118. mgを得た。 このうち 50 mgを 6 M尿素水溶液 100 mlに溶解し、 蒸留数 400 mlを加えて希釈の 後、 アンモニア水を用いて pH8に調整し、 緩やかに空気を吹込みながら攪拌した。 反応を HPLCで追跡し、 SH体ペプチドのピークがすべて SS体に変化したことを確 認した後、 酢酸を加えて溶液の pHを 3に調整した。 LiChroprep (登録商標） RP-18を充填した逆相クロマトカラム （2.6 X 60 cm) ίこ付し、 0.1% TF'A水 200ml、続いて 0.1% TF A含有 20%ァセとにトリル水 200 mlで洗浄した。 次に
0.1% TF A含有 20%ァセトニトリル水 300mlと 0.1% TF A含有 50%ァセトニトリル 水 300 mlを用いた線型勾配溶出を行ない、 主要画分を集めて凍結乾燥し、 白色 粉末 7.9 mgを得た。
ESI-MS： M+ 1017.1 (理論値 1017.2)
HPLC溶出時間： 9.9分
カラム条件
カラム： Wakosi卜 II 5C18HG 4.6 x 10 Omni
溶離液： A液： 0.1% TFA-水、 B液： 0,1% TFA含有ァセトニトリルを用い、 A/B: 80/20〜60/40へ直線型濃度勾配溶出（10分） 流速： 1.0ml/分 実施例 1
(1) 免疫原の作製および免疫
ヒトウ口テンシン II (配列番号： 1) 、 ブタウロテンシン Π- 1 (配列番号： 2) 、 ブタウロテンシン II- 2 (配列番号： 3) 、 ゥシゥ口テンシン II (配列番 号： 4) およびラットウ口テンシン II (配列番号： 5) と C末端側の構造 （Cys- Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys) がー致するノ、セ (goby, long- jawed mudsucker,
Gillichthys mirabilis) ゥロテンシン II (ぺニンスラ社よりの購入品、 配列番 号： 6) を抗原としてゥロテンシン IIの C末側を認識する抗体を作製した。
抗原作製のため、 lmgのハゼゥ口テンシン IIペプチドと 4mgのゥシチログロブ リン (BTG) を 30mgの ECDI (卜ェチル -3- (3-ジメチルァミノプロピル）カルポジ イミド、 同仁化学） により結合させた後、 生成したハゼゥ口テンシン II- BTG複 合体を含む反応液を 0.15M塩化ナトリゥム水溶液に対して透析した。 透析内液と フロイントの完全アジュバントを混ぜ、 これを抗原として 1頭当たりハゼゥ口'テ ンシン II 20 g相当を Balb/Cマウス （雌、 6〜8週齢） に初回免疫した。 初回免 疫からおよそ 4週間後、 複合体とフロイントの不完全アジュバントを混ぜ、 これ を抗原として 2回目の免疫をした。 坊体価が上昇するまで、 2週間おきにハゼゥ 口テンシン I I-BTG複合体とフロイントの不完全ァジュバント混合物を免疫した。 (2) ピオチン標識抗原の作製
ハゼゥ口テンシン IIにピオチンを結合させ、 酵素免疫測定法 （EIA) の標識体 とした。 すなわち、 ハゼゥ口テンシン II 2nmolを 0. lmlの 50mMリン酸緩衝液 (pH7.5) に溶解し、 ピオチン N-ヒドロキシスクシンイミドエステル 20nmolを 加えて室温で 1時間反応させた。 この反応により、 N末のァラニンの α -ァミノ基 においてピオチン化されたハゼゥ口テンシン 11または 9残基目のリジンの ε -ァ ミノ基においてピオチン化されたハゼゥ口テンシン IIおよびこれら両者におい てビォチン化されたハゼゥ口テンシン IIが生成するが、 HPLCによって分画し、 Ν 末のァラニン残基のみがピオチン化されたハゼゥ口テンシン II ([Ν-ビォチ二 ル- Ala1]ハゼゥ口テンシン II、 以下、 ピオチン標識化ハゼゥ口テンシン IIと記 載する） を得た。 N末のァラニン残基のみがピオチン化されたハゼゥ口テンシン I Iの構造は、 質量分析においてピオチン 1分子が結合して分子量が増加したごと、 およびエドマン法による N末端アミノ酸配列分析において、 N末のァラニン残基 のひ—アミノ基がピオチン化されたためにイソチォシアン酸フエニルとの反応 が進行せず、 ァラニン残基のフエ二ルチオヒダントイン誘導体が全く検出され なかったことによって確認された。
( 3 ) 抗体価の測定
ハゼゥ口テンシン I Iを免疫中のマウス抗血清中の抗体価を以下の方法により 測定した。 抗マウスィムノグロプリン抗体結合マイクロプレートを作製するた め、 まず抗マウスィムノグロブリン抗体 （IgG画分、 カッペル社製） を lO ^ g/ml 含む 50mM炭酸緩衝液 (pH9. 6) 96ウェルマイク口プレートに 100 1ずつ分注し， 4°Cで 24時間放置した。 次に、 プレートをリン酸緩衝生理食塩水 （PBS、 pH7. 4) で洗浄したのち、 ゥエルの余剰の結合部位をふさぐため 25 %ブロックェ一ス
(雪印乳業社製） を含む PBSを 200 1ずつ分注し、 4°Cで少なくとも 24時間処理 した。
上記、 抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ゥエルにバ ッファー C (1 % BSA、 0. 4M NaCK および 2mM EDTAを含む 0. 02Mリン酸緩衝液、 PH7. 0) で希釈したマウス抗ハゼゥロテンシン I I抗血清 100 1を加え、 4 で 16 時間反応させた。 次に、 該プレートを PBSで洗浄したのち、 上記 （2 ) で作製し たピオチン標識化ハゼゥ口テンシン I I (バッファー Cで 200倍希釈） 100 lを加 え、 室温で 6時間反応させた。 次に、 該プレートを PBSで洗浄したのち、 各ゥェ ルにバッファ一 Cで 10000倍に希釈した HRP (西洋ヮサビパーォキシダ一ゼ） 標識 アビジン溶液 100 lを加え、 室温で 2時間反応させた。 次に、 該プレートを PBS で洗浄したのち、 固相上の酵素活性を TMBマイクロウエルパーォキシダーゼ基質 システム （KIRKEGAARD & PERRY LAB， IN 、 フナコシ薬品） 100 z lを加え室温 で 10分間反応させることにより測定した。 反応を、 1M リン酸 100 1を加えて 停止させたのち、 450nmの吸収をプレ一トリーダー （BICHR0MATIC、 大日本製薬 社製） で測定した。
結果を 〔図 1〕 に示す。 免疫した 8匹のマウスのうち 5匹にハゼゥ口テンシン I Iの C末端部分に対する坊 体価の上昇が認められた。
( 4 ) モノクローナル抗ゥロテンシン I I抗体の作製
比較的高い抗体価を示したマウスに対して 200〜300 z gの免疫原を生理食塩水 0 . 2 5〜0 . 3 m 1に溶解させたものを静脈内に接種することにより最終免 疫を行なった。 最終免疫 3〜4日後のマウスから脾臓を摘 し、 ステンレスメッ シュで圧迫、 ろ過し、 イーグルズ'ミニマム 'エッセンシャルメディウム
(MEM) に浮遊させ、 脾臓細胞浮遊液を得た。 細胞融合に用いる細胞として、 BALB/Cマウス由来ミエローマ細胞 P3- X63. Ag8. Ul (P3U1) を用いた （カレント トピックス イン マイクロバイオロジー アンド ィムノロジ一、 81巻、 1頁、
1978年） 。 細胞融合は、 原報 （ネイチヤー、 256巻、 495頁、 1975年） に準じて 行なった。 すなわち、 脾臓細胞および P3U1を、 それぞれ血清を含有しない MEMで 3度洗浄し、 脾臓細胞と P3U1数の比率を 5： 1になるよう混合して、 800回転で 15 分間遠心を行なって細胞を沈澱させた。 上清を充分に除去した後、 沈殿を軽ぐ ほぐし、 45 %ポリエチレングリコール (PEG) 6000 (コッホライト社製） を
0. 3ml加え、 37°C温水槽中で 7分間静置して融合を行なった。 融合後細胞に毎分 2mlの割合で MEMを添加し、 合計 15mlの MEMを加えた後 600回転 15分間遠心して ± 清を除去した。 この細胞沈殿物を 10%牛胎児血清を含有する GITメディウム （和 光純薬） (GIT-10% FCS)に P3U1が lml当り 2xl 05個になるように浮遊させ、 24穴 マルチディッシュ （リンブ口社製） に 1ゥエル lmlずつ 120ゥエルに播種した。 播 種後、 細胞を 37°Cで 5 %炭酸ガスインキュベータ一中で培養した。 24時間後 HAT (ヒポキサンチン 1 χ10—4Μ、 アミノプテリン 4x10— ¾、 チミジン 1. 6xl (T3M) を含 んだ GIT- 10% FCS培地 （HAT培地） を 1ゥエル当り lmlずつ添加することにより、 HAT選択培養を開始した。 HAT選択培養は、 培養開始 3、 6、 9日後に旧液を lml捨 てたあと、 lmlの HAT培地を添加することにより継続した。 ハイプリドーマの増 殖は、 細胞融合後 9〜14日で認められ、 培養液が黄変したとき （約 lxlO6セル /ml) 、 上清を採取し、 上記 （3 ) に記載の方法に従って抗体価を測定した。 こ の時、 ハイプリドーマ培養上清中の抗体とピオチン標識化ハゼゥ口テンシン I I の結合の特異性を確認するために、 この結合が 1 Mのブタウロテンシン 11 - 1に より阻害されるか否かを調べた。
ハゼゥ口テンシン 11を免疫したマウス由来ハイブリドーマのスクリ一ニング の典型例として、 マウス No. 6 (図 1参照） を用いて得られた結果を 〔図 2〕 に 示す。
No. 5および No. 103ハイブリド一マ培養上清中の抗体は、 特異的にゥロテンシ ン I Iに結合することが示され、 No. 5および No. 103の計 2種類のハイプリド一マを 選択した。
次に、 これらのハイプリドーマを限界希釈法によるクロ一ニングに付した。 クロ一ニングに際しては、 フィーダ一細胞として BALB/Cマウスの胸腺細胞をゥ 'エル当り 5xl05個になるように加えた。 クローニングの結果、 No. 5- 6- 10および No. 103-5- 41の 2種類のクローンを抗体産生量の高いハイブリドーマとして選択 した。 No. 5- 6-10および No. 103- 5- 41をそれぞれ AUI 15- 6- 10および AUI 1103-5-41 と命名する。
クローニング後、 八イブリドーマをあらかじめミネラルオイル 0. 5ηι 1を腹腔内 投与されたマウス （BALB/C) に 1〜3χ106セル/匹を腹腔内投与したのち、 6〜20 日後に抗体含有腹水を採取した。
モノクローナル抗体は得られた腹水よりプロティン- Aカラムにより精製した 即ち、 腹水 6〜20mlを等量の結合緩衝液 （3. 5M NaCl、 0. 05%NaN3を含む 1. 5Mグ リシン、 pH9. 0) で希釈したのち、 あらかじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビ ナントプロテイン- A-ァガロース （Repl igen社製） カラムに供し、 特異抗体を溶 離緩衝液 （0. 05%NaN3を含む 0. 1Mクェン酸緩衝液、 pH3. 0) で溶出した。 溶出液 は PBSに対して 4°C、 2日間透析したのち、 のフィルタ一 （ミリポア社 製） により除菌濾過し 4°Cあるいは- 80°Cで保存した。 モノクローナル抗体のク ラス ·サブクラスの決定に際しては、 精製モノクローナル抗体結合固相を用い るェンザィム一リンクトイムノソ一ベントアツセィ （ELISA) 法を行なった。 す なわち、 抗体 2 g/mlを含む 0. 1M炭酸緩衝液、 pH9. 6溶液'を 96ウェルマイクロブ レートに 100 1ずつ分注し、 4°Cで 24時間放置した。 上記 （3 ) で述べた方法に 従って、 ゥエルの余剰の結合部位をブロックエースでふさいだのち、 アイソタ ト（Mouse- TyperTM Sub-Isotyping Ki t, バイオラッド社 製） を用いる ELISAによって固相化抗体のクラス、 サブクラスを調べた。 上記 2 種類のハイブリド一マ （No.5- 6- 10および No.103-5- 41) の産生する抗体のクラ ' スはともに IgGlであった。 実施例 2
競合法による酵素免疫測定法
ハゼゥ口テンシン 11を免疫原として作製した 2種類のハイブリド一マ No.5-6- 10および No.103- 5- 41のそれぞれ産生するモノクローナル抗体 （AUII5-6- 10aお よび AUI II 03-5-41 a) の反応特異性を以下の方法により調べた。
上記実施例 1 (3) 記載の抗マウスィムノグロブリン抗体結合マイクロプレ —トに、 バッファ一 C (1% BSA、 0.4M NaCK および 2mM EDTAを含む 0.02Mリン 酸緩衝液、 PH7.0) で 486倍希釈された AUII5- 6- 10ハイプリドーマ培養上清また はバッファ一 Cで 54倍希釈された AUII103- 5- 41ハイプリドーマ培養上清希釈液 33 U バッファ一 Cにより調製された各種濃度のヒト、 ブタ- 1、 ゥシ、 'ラットおよ びハゼゥ口テンシン II溶液 33^1、 および上記実施例 1 (2) 記載のピオチン標 識化ハゼゥロテンシン II (バッファー Cで 8333倍希釈） を 33 l加え、 4°Cで 16時 間反応させた。 反応後、 PBSで洗浄したのち、 各ゥエルにバッファ一 Cで 10000倍 に希釈した HRP標識アビジン溶液 を加え、 室温で 3時間反応させた。 反応 後、 PBSで洗浄したのち、 固相上の酵素活性を上記実施例 1 (3) 記載の方法に より測定した。
これらハイブリド一マ培養上清 （AUII5- 6- 10および AUI 1103-5-41) を用いた 競合法- EIAの結果を 〔図 3〕 および 〔図 4〕 に示す。
図 3に示すように、 AUII5- 6- 10aは、 ヒト、 ブター 1、 ゥシ、ラットおよびハ ゼゥロテンシン IIのいずれのペプチドに対しても同程度の反応性を有すること がわかった。 このことから、 AUII5-6-10aは、 これらのペプチドに共通な部分構 造である Cys- Phe- Τι·ρ- Lys-Tyr-Cys配列を認識すると考えられる。 AUII 5-6-10a のヒトウ口テンシン IIの結合阻害曲線から、 （B/B。） =0.5を与えるヒトウ口テ ンシン II濃度は、 1.2nMであった。
一方、 図 4に示すように、 AUII103- 5- 41aは、 ブ夕- 1、 ゥシおよびラットウ口 テンシン IIに比べて、 ヒトおよび八ゼゥロテンシン IIに対して高い反応性を示 した。 AUII103- 5- 41aのヒトウ口テンシン IIに対する反応性 （ (B/B。） =0.5を与 える抗原濃度： 0.68nM) は、 ブタウロテンシン Π-1に対する反応性 （'(Β/Β。) = 0.5を与える抗原濃度： 17.4ηΜ) の約 0.04倍であった。 このことから、 AUII103 - 5- 41aは、 ヒトおよびハゼゥ口テンシン IIに共通な部分構造である Asp- Cys- Phe- T卬- Lys-Tyr_Cys配列を認識することが考えられる。
これら 2種類のハイプリドーマ培養上清の （B/B。） =0.5を与えるヒトウ口テ ンシン IIの濃度は、 0.5〜2.0nMの範囲にあり、 これら 2種類のハイブ' jドーマ培 養上清を用いる競合法- EIAはともに高感度であり、 約 0.2nM [ (B/B0) =0.9] のヒトウ口テンシン IIが検出可能であった。 実施例 3
モノクローナル抗体 AUII5-6-10aによるヒト、 ブタ- 1、 ゥシ、 ラットおよびハ ゼゥロテンシン 11の生物活性の中和作用
AUII5-6-10aによるヒト、 ブ夕 -1、 ゥシ、 ラットおよびハゼゥ口テンシン IIに 対する中和活性を、 ラット GPR14レセプター発現 CH0細胞 （W0 00/32627に記載の ラッ卜 SENR発現 CH0細胞と同一の細胞） を用いたァラキドン酸代謝物放出活性測 定系により測定した。
AUI 15- 6- 10aを各種濃度 （1、 3、 10、 30、 100および 300nM) に希釈し、 ヒト、 ブタ— 1、 ゥシ、 ラッ卜および八ゼゥロテンシン II (各 ΙΟηΜ) と室温で 1時間 インキュベーション後、 残存活性を、 ラット GPR14レセプ夕一発現 CH0細胞を使 用して測定した。
ァラキドン酸代謝物放出活性の測定は、 ラット GPR14レセプ夕一発現 CH0細胞 を、 24 well plateに 0.5 105 eel ls/wel 1の細胞密度でまき、 24時間培養後、 [¾] ァラキドン酸を 0.5 Ci/weIlとなるように添加した。 [¾] ァラキドン 酸添加 24時間後、 細胞を、 0.1% BSAを含む MEMで洗浄後、 上述の各濃度のモノ クロ一ナル抗体とヒト、 ブタ— 1、 ゥシ、 ラットおよびハゼゥ口テンシン Ιί混 和溶液を 500 1/wellで添加した。 37°Cで 1時間インキュべ一ションした後に、 反応液 500^1中 をシンチレ一夕一 4mlに加え、 反応液中に遊離された [3H] ァラキドン酸代謝物の量をシンチレ一シヨン 'カウン夕一によりモニタ 一した。
結果を 〔図 5〕 に示す。 1 AUII5-6- 10aは、 ヒト、 ブ夕— 1、 ゥシ、 ラットおよびハゼゥ口テンシン IIの 活性を 3倍量または 10倍量 （モル比） で 100%.抑制した。
以上のことから、 AUII5- 6- 10aは、 ヒト、 ブタ- 1、 ゥシ、 ラットおよび八ゼゥ 口テンシン IIのァラキドン酸代謝物放出活性を中和することが明らかである。 実施例 4
ホールボード試験系における AUII5_6_10aの抗不安様作用
ICR (CD-I) マウス （9- 10週齢、 36- 38g、 雄性、 日本チヤ一ルス ·リバ一） を ジェチルェ一テルで軽く麻酔し、 マウス IgG (ィムノグロブリン G) (Sigma, 10mg/ml PBS, 5β1) または AUII5- 6- 10a (10mg/ml PBS, 5^1) を右側脳室に投 与した。 脳室内投与には二段針 （松本製作所） を使用した。 30分後に覚醒した マウスを拘束ケージ （夏目製作所） に入れ、 拘束ストレスを 1時間負荷した。 対 照動物は飼育ケージ内で 1時間自由に行動させた。 その後、 5分間の自発的行動 量と視き込み行動量を測定した。 測定には自発的運動量測定システム （室町機 械） を使用した。 マウスの視き込み行動は、 立ち上がりセンサー （MRX- 110TX - RX) をケージの下部側面に取り付け、 穴 （直径 3.8cm、 4個） をあけた板をセン サ一より 5腿上に上部から吊り下げるようにして内側に固定した装置を用いて測 定した。 視き込みの回数は、 板の上に置かれたマウスが視き込み行動によって 穴から頭部を突き出して設置されたセンサーを遮った回数で表した。 同時に、 上部に取り付けられた SUPERMEXセンサ一 （PYS- 001、 受動型赤外線センサー） で 自発的行動量を測定した。 自発的行動量はマウスがセンサーを横切った回数で 表した。 実験は 15時から 18時の間に行なった。
結果を以下に示す （図 6) 。
マウス IgG投与 （無拘束） ： 70.5±4.2回 （n=21)
マウス IgG投与 （拘束ストレス負荷） ： 51.1土 5.3回 （n=19) 、 p<0.01 AUII5-6-10a投与 (拘束ストレス負荷） ： 64·6±3· 6回 (η=21) 、 ρ<0.05 これより、 1時間の拘束ストレス負荷により、 マウスの覼き込み行動は有 ¾に 減少したことがわかり、 さらに、 AUI I5-6-10aの脳室内投与は拘束ストレスによ り減少した靦き込み行動を有意に回復させたことがわかる。
なお、 このときマウスの自発的行動量に変化は見られなかった 〔マウス IgG投 与 （無拘束） ： 621. 5 ±20. 4回、 マウス IgG投与 （拘束ストレス負荷） ： 611. 2士 29. 6回、 AUI I5- 6- 10a投与 (拘束ストレス負荷） ： 649. 7土 20. 1回〕 。
以上より、 AUI 15-6- 10aの脳室内投与は、 拘束ストレスによって惹起されたマ ウスの視き込み行動の減少によって示される不安様行動を自発的行動に影響を , 与えずに抑制することがわかる。 産業上の利用可能性
本発明の抗体は、 本発明のペプチドが関与する疾患等の治療剤、 予防剤、 診 断薬の開発に有用である。 本発明の抗体を含むハイプリドーマ細胞を用いるこ とにより、 本発明の抗体は工業的に生産することが可能である。 また、 本発明 の抗体を含有してなる医薬 （特に診断薬） は、 本発明のペプチドが関与する疾 患 〔例、 中枢神経疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 ピック 病、 ハンチン卜ン病、 老人性痴呆、 脳血管性痴呆など） 、 精神疾患 （例、 不安、 鬱病、 不眠症、 統合失調症、 恐怖症など） 、 循環器疾患 （例、 高血圧症、 低血 圧症など） 、 心疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 拡張型うつ血性 心筋症、 肥大型心筋症、 肺高血圧など） 、 腎臓疾患 （例、 腎炎、 腎不全、 間室 性腎疾患など） 、 泌尿器系疾患 （例、 頻尿、 尿失禁など） など〕 の診断等に有 用である。
本発明の抗体は、 本発明のペプチドの中和作用を有することより、 例えば中 枢神経疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 ピック病、 ハンチ • ントン病、 老人性痴呆、 脳血管性痴呆など） 、 精神疾患 （例、 不安、 鬱病、 不 眠症、 統合失調症、 恐怖症など） 、 循環器疾患 （例、 高血圧症、 低血圧症な ど） 、 心疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 拡張型うつ血性心筋症、 肥大型心筋症、 肺高血圧など） 、 腎臓疾患 （例、 腎炎、 腎不全、 間室性腎疾患 など） 、 泌尿器系疾患 （例、 頻尿、 尿失禁など） などの予防 ·治療剤として有 用である。
本発明の抗体を用いることにより、 本発明のペプチドの量を高い感度で測定 することができる。 このため、 本発明の定量法は、 本発明のペプチドが関与す る疾患 〔例、 中枢神経疾患 （例、 アルツハイマー病、 パーキンソン症候群、 ピ ック病、 ハンチントン病、 老人性痴呆、 脳血管性痴呆など） 、 精神疾患 （例、 不安、 鬱病、 不眠症、 統合失調症、 恐怖症など） 、 循環器疾患 （例、 高血圧症、 低血圧症など） 、 心疾患 （例、 心不全、 不整脈、 Q T延長症候群、 拡張型うつ 血性心筋症、 肥大型心筋症、 肺高血圧など） 、 腎臓疾患 （例、 腎炎、 腎不全、 間室性腎疾患など） 、 泌尿器系疾患 （例、 頻尿、 尿失禁など） など〕 の診断、 予防または治療に有用である。 本発明の抗体を用いることにより、 ヒト、 ブタ、 ゥシ、 ラット、 マウスまたはハゼ等由来の本発明のペプチドの量を高い感度で 測定することができるため、 本発明の抗体は、 本発明のペプチドが関与する疾 患の診断薬、 予防 ·治療剤、 試薬等として有用である。

Claims

請求 の 範 囲
1. 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5、 配列番号： 6または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポ リペプチドまたはその誘導体の C端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体。
2. 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番 号： 5または配列番号： 6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまた はその誘導体の C端側の部分べプチドに特異的に反応する請求項 1記載の抗体。
3. 配列番号： 9で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に反応 する請求項 1記載の抗体。 ，
4. C端側の部分ペプチドが、 （i) 配列番号： 1の第 5番目〜第 10番目の アミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4もしくは配 列番号： 6の第 6番目〜第 11番目のアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 5の第 8番目〜第 13番目のアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 7の第 2番目〜第 7番 目のアミノ酸配列、 または （V) 配列番号： 8の第 8番目〜第 13番目のァミノ 酸配列を有するペプチドである請求項 1記載の抗体。
5. モノクローナル抗体である請求項 1記載の抗体。
6. 標識化された請求項 1記載の抗体。
7. 中和抗体である請求項 1記載の抗体。
8. 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番 号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポ リぺプチドまたはその誘導体の活性を中和する請求項 7記載の抗体。
9. 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 4、 配列番号： 5または配列 番号： 6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその誘導体の活 '性を中和する請求項 7記載のお体。
10. AU I I 5 - 6 - 10 (FERM B P— 8221 ) で標示されるハ イブリドーマ細胞から産生され得る AU I I 5— 6— 10 aで標示される請求 項 5記載の抗体。 1
1 1. AU I I 103— 5— 41 (FERM B P— 8220 ) で標示され るハイプリドーマ細胞から産生され得る AU I I 103-5-41 aで標示さ れる請求項 5記載の抗体。
12. 請求項 5記載の抗体を産生するハイプリドーマ細胞。
13. AU I I 103-5-41 (FEKM B P— 8, 220 ) で標示され る請求項 12記載のハイプリド一マ細胞。
14. AU I I 5-6- 10 (FERM BP— 8221) で標示される請 求項 12記載のハイプリドーマ細胞。
15. 請求項 12記載のハイプリド一マ細胞を生体内または生 #外で培養し， その体液または培養物から請求項 5記載の抗体を採取することを特徴とする請 求項 5記載の抗体の製造法。
16. 請求項 1記載の抗体を含有してなる医薬。
17. 中枢神経疾患、 精神疾患、 循環器疾患、 心疾患、 腎臓疾患または泌尿 器系疾患の予防 ·治療剤である請求項 16記載の医薬。
18. 請求項 1記載の抗体を含有してなる診断薬。
19. 中枢神経疾患、 精神疾患、 循環器疾患、 心疾患、 腎臓 患または泌尿 器系疾患の診断薬である請求項 18記載の診断薬。
20. 請求項 1記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 1、 配列番 号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番 号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまた はその誘導体の定量法。
21. 請求項 1記載の抗体、 被検液および標識化された配列番号： 1、 配列 番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列 番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドま たはその誘導体とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された配列番 号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番 号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポ リペプチドまたはその誘導体の割合を測定することを特徴とする、 被検波中の 配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有 するポリぺプチドまたはその誘導体の定量法。
2 2 . 請求項 1記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 1、 配列番 号： 2、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番 号： 7または配列番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまた はその誘導体が関与する疾患の診断法。
2 3 . 哺乳動物に対して、 請求項 1記載の抗体の有効量を投与することを特 徵とする中枢神経疾患、 精神疾患、 循環器疾患、 心疾患、 腎臓疾患または泌尿 器系疾患の予防 ·治療法。
2 4. 中枢神経疾患、 精神疾患、 循環器疾患、 心疾患、 腎臓疾患または泌尿 器系疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1記載の抗体の使用。
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