WO2008096905A1 - 抗ｂｒａｋ（ｃｘｃｌ１４）ヒトモノクローナル抗体及びその用途 - Google Patents

抗ｂｒａｋ（ｃｘｃｌ１４）ヒトモノクローナル抗体及びその用途 Download PDF

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WO2008096905A1
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cxcl14
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obesity
diabetes
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PCT/JP2008/052603
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Takahiko Hara
Yuki Terasawa
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Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody recognizing BRAK (Breast and Kidney expressed chemokine) and use thereof.
  • BRAK Breast and Kidney expressed chemokine
  • metabolic syndrome In recent years, the number of patients with diabetes that develops closely related to obesity (especially “type 2 diabetes, which exhibits insulin resistance”) has been increasing worldwide. Along with this, hypertension and arteriosclerosis are also increasing. These onset mechanisms are presumed to be due to the comprehensive breakdown of fat metabolism and hormone regulation, and are now collectively referred to as metabolic syndrome.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Recently, gene expression analysis using white adipose tissue of obese mice and patients revealed that macrophages in white adipose tissue play an important role in the induction of obesity and the accompanying insulin resistance.
  • TNF was first produced from these mouth-mouth phages, and glucose absorption by insulin was suppressed.
  • secretion of inflammatory cytokines such as IL-1 and IL-6 increased, leading to a chronic inflammatory state (see Non-Patent Documents 3 and 4).
  • insulin resistance due to obesity was improved in mice that disrupted TNF o; or its receptor (see Non-Patent Document 5).
  • the hybridoma cell described in (2) above is cultured in vivo or in vitro, and the antibody described in (1) above is collected from the body fluid or culture, Production method of listed antibody.
  • a diagnostic agent comprising the antibody according to (1) above.
  • the diagnostic agent of the present invention can be used, for example, for the diagnosis of type 2 diabetes and / or obesity.
  • a medicament comprising the antibody according to (1) above.
  • a method for preventing / treating type 2 diabetes and Z or obesity which comprises administering an effective amount of the antibody according to (1) above to a mammal.
  • a method for promoting the reduction of the number of macrophages in white adipose tissue which comprises administering an effective amount of the antibody according to (1) above to a mammal.
  • a method for improving insulin resistance comprising administering an effective amount of the antibody according to (1) above to a mammal.
  • Figure 1 shows the data on the chemotaxis of C2C12 cells or Forskolin-stimulated C2C12 cells to CXCL14. After 6 hours of cultivation, the number of cells that migrated from the inside of the Chemotaxicell microchamber to the backside was measured and tested for statistical significance. The graph shows the average soil standard error for each group.
  • Fig. 2 shows data obtained by examining whether the chemotaxis of Forskolin-stimulated C2C12 cells to CXCL14 is neutralized by the addition of an anti-mouse CXCL14-specific antibody. After 6 hours of incubation, the number of cells that migrated from the inside of the microchamber to the backside was measured and tested for statistical significance. The graph shows the average soil standard error of each group.
  • FIG. 3 shows data examining whether the chemotaxis of Forskolin-stimulated THP-1 cells to CXCL14 is neutralized by the addition of an anti-mouse CXCL14-specific antibody. After 2 hours of incubation, the number of cells that migrated from the inside of the Chemotaxicell microchamber to the backside was measured and tested for statistical significance. The graph shows the average soil standard error of each group.
  • Fig. 4 shows data examining whether the chemotaxis of Forskolin-stimulated THP-1 cells to CXCL14 varies with the addition of anti-mouse CXCL14 monoclonal antibody. A representative stained photograph of cells that migrated from the inside of the Chemotaxicell microchamber to the back after 2 hours of culture is shown.
  • FIG. 5 shows that the anti-mouse CXCL14-specific antibody neutralizes the inhibitory activity of the insulin signal by CXCL14.
  • Differentiation-induced C2C12-derived myocytes were stimulated with insulin in the presence of the indicated substance, and phosphorylation of Akt Ser 473 was measured by Western plotting.
  • BRAK and CXCL14 are synonymous, and any notation is used to mean the same thing.
  • the present inventors focused on the physiological function of BRAK (CXCL14), focusing on the fact that mRNA expression was increased in skeletal muscle cells of muscular dystrophy model mouse mdx.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 6 Is part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and the numerical range in parentheses () is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the position is indicated by the number of amino acid residues from the N-terminal).
  • Derivatives of the polypeptide that can be recognized by the antibody of the present invention include, for example, a partial amino acid residue of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Examples include those in which a group is substituted with a substitutable group, those in which a part of an amino acid residue is deleted, and those in which an amino acid residue is added or inserted. Examples of the derivative of the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 include one or more of the above amino acid sequences (preferably about 1 to 10).
  • the above-mentioned derivatives of human or mouse CXCL14 include, for example, salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts) (preferably physiological). May be used as an acid addition salt), and as such a salt, for example, a salt with an inorganic acid (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or an organic acid (for example, a salt with acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • an acid addition salt for example, a salt with an inorganic acid (for example, hydrochloric
  • partial peptide that can be recognized by the antibody of the present invention that is, a partial peptide of human or mouse CXCL14 or a derivative thereof, for example, in a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2
  • Some amino acid residues are deleted, Some amino acid residues are replaced by substitutable groups (eg Cys, Hydroxyl groups, etc.)
  • substitutable groups eg Cys, Hydroxyl groups, etc.
  • Some amino acid residues In which a part of amino acid residues is substituted with a group that can be substituted (eg, Cys, hydroxyl group, etc.).
  • the partial peptide examples include those in which about 22 residues (signal peptide portion) on the N-terminal side of human or mouse CXCL14 or a derivative thereof are deleted. More specifically, the partial peptide is a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (i) the second 3rd to 99th amino acid sequence (SEQ ID NO: 3), ( ii) a polypeptide having the second 4th to 35th amino acid sequence (SEQ ID NO: 4), and (iii) a part of the amino acid residues of the polypeptides (i) to (ii) (eg, 1) substituted by a substitutable group, and SEQ ID NO: : (Iv) a polypeptide having the amino acid sequence represented by 2 (2) 3rd to 9th amino acid sequence (SEQ ID NO: 5), (v) 2nd 4th to 3rd 5th amino acid A polypeptide having a sequence (SEQ ID NO: 6), and (vi) a part of the amino acid residues (
  • a method for preparing an antibody antigen and a method for producing an antibody a method known per se, for example, the method described in W0 94/17197 or a method equivalent thereto can be used. Examples thereof are shown below. .
  • the synthetic peptide can be produced by a known conventional method, and can be produced by either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid that can constitute the peptide and the remaining part, and removing the protecting group when the product has a protecting group.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, B. Merrifield (J. Am. Chera. Soc., 85, 2149 1963), M. Bodanszky and MA Ondetti.
  • Peptide amides can be obtained using commercially available resins for peptide synthesis suitable for amide formation.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzoxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4- Hydroxymethylmethyl phenylacetamide methyl resin, Poly attalinoleamide resin, 4-one (2, 4, 4-dimethoxyphenyl monohydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2, 4'-dimethyoxyphenyl luo F moc aminoethyl) and phenoxy resin.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target peptide.
  • the peptide is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed to obtain the desired peptide.
  • a partially protected peptide can be taken out using a trioctyl resin, an oxime resin, a 4-hydroxybenzoic acid resin, etc., and then the protective group can be removed by conventional means to obtain the desired peptide.
  • carposimides are preferably used.
  • carbodiimides include DCC, N, N'-diisopropyl / recarbodiimide, N-ethyl-N,-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide, and the like.
  • a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization-suppressed addition U (eg, H Bt, HO Bt, etc.), or a symmetric acid anhydride or HOB t ester or HO ⁇ B t ester Then, after preactivation of the protected amino acid, it can be added to the resin.
  • a racemization-suppressed addition U eg, H Bt, HO Bt, etc.
  • ⁇ can be appropriately selected from solvents known to be usable in the peptide condensation reaction.
  • solvents examples include acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, Alcohols such as trifnoreo ethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, tertiary amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitol, methyl acetate, ethyl acetate Esters such as these, or appropriate mixtures thereof can be used as solvents used for the activation of protected amino acids and condensation with resins.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform
  • Alcohols such as trifnor
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be used for peptide bond formation reaction, and is usually selected appropriately from a range of about 120 ° C. to about 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in an excess of about 1.5 to about 4 times.
  • protecting groups for amino acid amino groups include Z, Boc, tertiary monopentinoreoxycarboninole, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1-Z , Br-Z, adamantino oxycanolebonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-titanium phenylenosphenol, diphenylphosphinothioyl, and F moc.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine are, for example, esterified or etherified. Can be protected.
  • groups suitable for esterification include lower (C 6 ) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl groups, and ethoxycarbonyl groups.
  • groups suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyraninole group, and a tertiary butinole group.
  • Examples of the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine include B z 1, C 1 -B z 1, 2-nitrobenzyl, B r—Z, and tertiary butyl.
  • Examples of protecting groups for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-1,2,6-trimethi / decizenesunorehonore, DNP, Bom, Bum, Boc, Trt, Fmoc, etc. .
  • the activated carboxyl group of the raw material includes, for example, the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2, 4, 5-trichloro-mouth phenol, 2, 4-dinitro And phenol, cyanome norenoreconole, paranitone phenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HBt).
  • active ester alcohol (eg, pentachlorophenol, 2, 4, 5-trichloro-mouth phenol, 2, 4-dinitro And phenol, cyanome norenoreconole, paranitone phenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HBt).
  • active ester alcohol (eg, pentachlorophenol, 2, 4, 5-trichloro-mouth phenol, 2, 4-dinitro And phenol, cyanome norenoreconole, paranitone phenol, HONB
  • Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as P d-black or P d-carbon, anhydrous hydrogen fluoride, methane sulphonic acid, Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with disopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. Can be mentioned.
  • the elimination reaction by the acid treatment is generally carried out at a temperature of 120 ° C.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,
  • it can also be removed by alkaline treatment with dilute sodium hydroxide or dilute ammonia.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw material and the protection group, the removal of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, etc. can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a peptide first, a monocarboxyl group of a carboxyl-terminal amino acid is amidated, and then the peptide chain is extended to the desired chain length on the amino group side.
  • a peptide in which only the N-terminal ⁇ -amino group protecting group is removed and a peptide (or amino acid) in which only the C-terminal carboxyl group protecting group is removed are prepared.
  • a method of condensation is used. The details of the condensation reaction are the same as described above.
  • all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain the desired crude peptide.
  • This crude peptide can be purified using various known purification means, and the desired peptide amide can be obtained by lyophilizing the main fraction.
  • CXCL14 antigen can be directly immunized with insolubilized one.
  • a complex in which CXCL14 antigen is bound or adsorbed to an appropriate carrier may be immunized.
  • the mixing ratio between the carrier (carrier) and the CXCL14 antigen (hapten) is such that the antibody can be efficiently bound to or adsorbed to the CXCL14 antigen bound or adsorbed to the carrier.
  • the polymer carrier usually used for the production of an antibody against a hapten can be used at a weight ratio of 0.1 to 100 with respect to the hapten 1. Examples of such polymer carriers include natural polymer carriers and synthetic polymer carriers.
  • condensing agents can be used for force pulling of the hapten and the carrier.
  • condensing agents include diazonium compounds such as bis-diazobenzidine that bridges tyrosine, histidine, and triftophan, and crosslinks of amino groups.
  • diazonium compounds such as bis-diazobenzidine that bridges tyrosine, histidine, and triftophan
  • crosslinks of amino groups include diazonium compounds such as bis-diazobenzidine that bridges tyrosine, histidine, and triftophan
  • Compounds, diisocyanate compounds such as toluene-1,4-diisocyanate, dimaleimide compounds such as N, N, -di-maleimide that crosslink thiol groups, maleimide active ester compounds that crosslink amino groups and thiol groups, and amino groups
  • a carpositimide compound that crosslinks with a carboxyl group is advantageously used.
  • a thiol group is introduced by reducing an active ester reagent having a dithiopyridyl group (for example, SPDP) after reacting with one of the amino groups, and the other amino group. It is also possible to react both after introducing a maleimide group with a maleimide active ester reagent.
  • SPDP dithiopyridyl group
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and is not particularly limited, but is preferably a monoclonal antibody.
  • a method for producing the antibody of the present invention a case of a monoclonal antibody will be described as an example.
  • the CXCL14 antigen is administered to a warm-blooded animal by itself, for example, by intraperitoneal injection, intravenous injection, or subcutaneous injection, at a site where antibody production is possible, alone or with a carrier or diluent.
  • complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered.
  • Administration is usually once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals include Sanore, Usagi, Inu, Monoremot, Mouse, Rat, Hedge, Goat, and Chicken, but mice are preferred for the production of antibodies, particularly monoclonal antibodies. Used frequently.
  • CXCL14 antigen For the production of monoclonal antibodies, warm-blooded animals immunized with CXCL14 antigen, eg For example, by selecting individuals with antibody titers from mice, collecting spleen or lymph nodes 2-5 days after the final immunization, and fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells, anti-CXCL14 Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared.
  • the anti-CXCL14 antibody titer in serum is measured, for example, by reacting labeled CXCL14 described below with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and preferably PEG is used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1, etc., and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody producing cells (spleen cells) and the number of bone marrow cells is usually about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by incubating at a concentration of from 20 to 40 ° C, preferably from 30 to 37 ° C, and usually from 1 to 10 minutes.
  • the hybridoma can be applied to a solid phase (eg, a microplate) on which CXCL14 or a derivative thereof or a partial peptide thereof is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, a microplate
  • Anti-CXCL14 monoclonal antibody is usually performed in animal cell culture medium (eg RPMI1640) containing 10-20% fetal bovine serum with addition of HA T (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) .
  • animal cell culture medium eg RPMI1640
  • HA T hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the above-described measurement of the anti-CXCL14 antibody titer in the antiserum.
  • Separation and purification of anti-CXCL14 monoclonal antibody is the same as that for separation and purification of normal polyclonal antibody, such as separation and purification of immunoglobulin (eg, salting out method, alcohol precipitation method, etc.
  • a specific purification method for obtaining an antibody by dissociating the binding and obtaining the antibody.
  • the antibody of the present invention thus obtained comprises a diagnostic agent for type 2 diabetes and obesity, a preventive / therapeutic agent for type 2 diabetes and obesity, an agent for promoting reduction in the number of macrophages in white adipose tissue, and an improvement in insulin resistance. It can be used as an agent.
  • the antibody of the present invention may be the antibody molecule itself, or a single-chain antibody of the above-mentioned antibody fragment or V region may be used.
  • An antibody fragment means a partial region of an antibody, and specifically includes Fab, Fab Fab Fv (variable fragment of antibody), sFv dsFv (disulphide stabilized Fv), or dAb (single domain antibody).
  • a single chain antibody of the V region has a structure in which V L (L chain variable region) and V H (H chain variable region) are connected by a linker.
  • humanized antibodies When producing humanized antibodies, antibodies from mammals such as mice (non-human animals) From the variable region, the complementarity determining region (CDR) is transplanted into the human variable region.
  • the framework region (FR) is derived from human and the CDR is derived from non-human animal.
  • a variable region reconstructed by use is produced.
  • a humanized antibody can be prepared by linking this reconstructed variable region to a human constant region.
  • a humanized antibody can also be prepared as a chimeric antibody comprising a non-human antibody-derived variable region and a human antibody-derived constant region. Methods for producing humanized antibodies are well known in the art.
  • Human antibodies generally have a problem with the specificity and binding affinity of the antigen binding site in the V region, that is, the hypervariable region, but any animal can be used structurally. . On the other hand, it is desirable that the rest of the V region and the structure of the constant region have the same structure as the human antibody.
  • a gene sequence common to humans has been established by genetic engineering techniques.
  • the antibody of the present invention can be used as a diagnostic agent for diseases involving CXCL14 (BRAK), that is, type 2 diabetes and Z or obesity.
  • BRAK CXCL14
  • the sandwich method comprises an antibody of the present invention (solid phase antibody) insolubilized on a carrier, a labeled antibody of the present invention (an antibody having a different epitope from the solid phase antibody: a labeling antibody), and a test solution.
  • This is a method for quantifying CXCL14 or a derivative thereof in a test solution by measuring the activity of the labeling agent after the reaction.
  • the test solution is reacted with the antibody of the present invention insolubilized on a carrier (primary reaction), and the labeled antibody of the present invention is reacted (secondary reaction), and then the insolubilized carrier is reacted.
  • the amount of CXCL14 in the test solution can be quantified.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed simultaneously or at different times.
  • the labeling agent and the insolubilizing method can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity. It may be used.
  • the antibody used in the primary reaction recognizes a partial peptide on the C-terminal side of CXCL14 or its derivative
  • the antibody used in the secondary reaction is on the C-terminal side.
  • An antibody that recognizes other than a partial peptide ie, N-terminal side
  • the antibody used in the primary reaction recognizes a partial peptide on the N-terminal side of CXCL14 or its derivative
  • it is used in the secondary reaction.
  • an antibody that recognizes other than the partial peptide on the N-terminal side that is, the C-terminal side
  • the labeling antibody is preferably used after being labeled with horseradish peroxidase (HRP).
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are competitively reacted with a certain amount of the labeled antibody of the present invention, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen in the test solution is reacted with an excessive amount of the labeled antibody of the present invention, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody of the present invention to the solid phase. After that, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured.
  • laser nephrometry using laser scattering is preferably used.
  • the labeling agent used in the measurement method using a labeling substance is not particularly limited, but radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, etc. are used. It is done.
  • the radioisotope is not particularly limited, but for example, [ 125 1], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are preferable.
  • the above-mentioned enzymes are not particularly limited, but those that are stable and have high specific activity are preferred. For example, ⁇ -galactosidase, / 3-darcosidase, alfa phosphatase, peroxidase, malic acid dehydration Elementary enzymes and the like.
  • a measurement system for CXCL14 or a derivative thereof may be constructed by adding the usual technical considerations of those skilled in the art to the usual conditions and operation methods in each method.
  • you can refer to reviews, textbooks, etc. for example, Hiroshi Irie “Radio Im No Atssey” (Kodansha, published in 1964), Hiroshi Irie “ “Continuing Radio Imno Atssey” (Kodansha, published in 1954), edited by Eiji Ishikawa et al.
  • the antibody of the present invention purifies CXCL14 or its derivatives. It can also be used for preparation of an antibody column used for detection, detection of CXCL14 or a derivative thereof in each fraction during purification, analysis of the behavior of CXCL14 or a derivative thereof in a test cell, and the like.
  • the antibody of the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical agent such as a prophylactic / therapeutic agent for diseases involving CXCL14 (BRAK), ie, type 2 diabetes and / or obesity.
  • a pharmaceutical agent such as a prophylactic / therapeutic agent for diseases involving CXCL14 (BRAK), ie, type 2 diabetes and / or obesity.
  • Preferred examples of the medicament also include a Macphage phage reduction promoter in white adipose tissue and an insulin resistance improving agent.
  • Such an injection can be prepared according to a known method, for example, by dissolving the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid usually used for injection
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing pudou sugar and other adjuvants, and suitable solubilizers such as, for example, Alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysonolate 80, HC0-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)), etc.
  • Alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactant eg, polysonolate 80, HC0-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil
  • the prepared injection solution is preferably filled in an appropriate ampoule, and the suppository used for rectal administration is prepared by mixing the above-mentioned antibody or a salt thereof with an ordinary suppository base. You may be prepared according to.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (softcapsenoles) ), Syrups, emulsions, suspensions, etc.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • carriers and excipients for tablets For example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient.
  • dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the content of the antibody is preferably about 5 to 50 Omg per dosage unit dosage form, especially about 5 to 100 mg for injections, and about 10 to 250 mg for other dosage forms.
  • Each of the above-described compositions may contain other active ingredients as long as they do not cause an unfavorable interaction by blending with the antibody.
  • the dose of the pharmaceutical agent containing the antibody of the present invention as a prophylactic / therapeutic agent varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route, etc., but is used for the treatment of type 2 diabetes in adults, for example.
  • the antibody of the present invention can be used as a single dose, usually about 0.01 to 2 Omg / kg body weight, preferably about 0.0! It is convenient to administer about ⁇ lOmgZkg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day.
  • the antibody of the present invention is usually administered at a dose of about 0.1 to 2 Omg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg. It is convenient to administer about 0.1 kg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg Zkg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. In the case of prevention of type 2 diabetes and obesity, or in the case of other parenteral administration (eg, subcutaneous administration) and oral administration, doses equivalent to these can be administered. If symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
  • amino acids and the like are represented by abbreviations based on abbreviations by IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, examples of which are described below.
  • optical isomers for amino acids L-form and L-form are shown unless otherwise specified.
  • Gly Glycine Ala: Alanine
  • H0NB N-Hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboxyimide
  • Trt Trityl
  • Mouse skeletal muscle-derived myoblast cell line C2C12 obtained from American Type Culture Collection (ATCC) obtained from public cell banks, and human monocytic leukemia cell line THP-1 (Human Science Foundation Research Resources) (Obtained from Bank HSRRB) in Dulbecco's modifies Eagle's medium (DMEM) medium containing 10% urchin fetal serum or RPMI-1640 medium containing 10% urchin fetal serum. Cells in the growth phase were used for the experiment. Inoculate 2 x 10 5 C2C12 cells on 100 plates, incubate at 37 ° C, add Forskolin (Sigma) to a final concentration of 20 ⁇ , and continue at 37 ° C for another 2 days. Cultured.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • THP-1 Human Science Foundation Research Resources
  • For THP-1 cells 10 6 cells were inoculated on a 100 ⁇ plate, and at the same time, Forskolin was added to a final concentration of 20 zM and cultured at 37 ° C for 2 days.
  • Forskolin is a reagent that activates A kinase and its downstream transcription factors by increasing intracellular cAMP concentration.
  • the Forskolin-stimulated THP-1 cell line is widely used in immunological research as a cell line with properties similar to activated macrophages.
  • Forskolin-stimulated C2C12 cells or Forskolin-stimulated THP-1 cells were washed once with chemotaxis buffer to remove fetal bovine serum, and then 2 x 10 5 cells / 200 ⁇ l each in a Chemotaxicell microchamber. Layered on top.
  • the 24-wall plate set as described above was cultured at 37 ° C for 6 hours (C2C12 cells) or 2 hours (THP-1 cells). Immediately after the reaction was completed, the culture solution at the top of the microchamber was removed, and the cells attached to the bottom of the microchamber were fixed and stained using Diff-Quik (International Reagents). Cells remaining in the upper part of the microchamber were removed using a cotton swab.
  • C2C12 myoblast cell line was cultured in DMEM medium containing 5% horse serum for 4 days to induce myogenic differentiation. After culturing in DMEM medium without serum for 16 hours at 37 ° C, myocytes were treated with 100 nM mouse CXCL14 (R & D Systems) for 1 hour, and 10 nM insulin (Sigma) was added. Stimulated for 10 minutes at 37 ° C. For neutralization experiments with antibodies, hedge anti-mouse CXCL14 polyclonal antibody (AF730, R & D Systems) was added to a pretreatment medium containing CXCL14 to a final concentration of 10 ⁇ g / ml.
  • hedge anti-mouse CXCL14 polyclonal antibody AF730, R & D Systems
  • Akt is a serine Z threonine kinase, also called protein kinase B (PKB), which is activated by the PI3 kinase pathway and is involved in various phenomena such as insulin metabolism.
  • PLB protein kinase B
  • Chemotaxis a typical biological activity of CXCL14, was analyzed by in vitro assay using a Chemotaxicell microchamber. As previously reported (Nara N et al., J. Biol. Chem., Vol. 282, p. 30794-30803, 2007), myogenic C2C12 cells respond to CXCL14. Thus, when C2C12 cells were stimulated with Forskolin, a general differentiation-inducing reagent, and then subjected to chemotaxis studies, cell attraction by mouse CXCL14 was detected (Fig. 1). Similar activity was detected in human CXCL14 ( Figure 1).
  • Mouse CXCL14 and human CXCL14 differ in only 2 of the 77 amino acid residues that make up the polypeptide (see SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2), so that the receptor expressed in C2C12 cells is human. It is expected to have cross-reacted with CXCL14.
  • SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 the receptor expressed in C2C12 cells is human. It is expected to have cross-reacted with CXCL14.
  • a specific antibody against mouse CXCL14 was added to the chemotaxis test solution, attraction of C2C12 cells by mouse CXCL14 was inhibited by 61% by polyclonal antibody AF730 and 54% by monoclonal antibody MAB730, respectively ( Figure 2 ) .
  • CXCL14 receptor is thought to be a trimeric G protein-binding 7-transmembrane protein. It has not been.
  • Anti-CXCL14-specific antibodies are not only useful as a tool to relieve prediabetic conditions caused by CXCL14 overproduced by obesity, but also remain unexplained physiological functions and receptors of CXCL14. It was thought to be useful in elucidating the body structure.

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Abstract

　BRAK（CXCL14）を認識する抗体及びその用途を提供する。　本発明の抗体は、配列番号：１若しくは配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド又はその誘導体、あるいはそれらの部分ペプチドを認識する抗体である。

Description

明 細書 抗 BRAK (CXCL14)ヒ トモノクローナル抗体及ぴその用途 技術分野
本発明は、 BRAK (Breast and Ki dney expressed chemokine)を認識する抗体及 びその用途に関する。 背景技術
近年、 肥満に密接に関連して発症する糖尿病 （特に、 インスリン抵抗性を示す 「2型糖尿病」 ） の患者数は世界的に増加している。 これに伴い、 高血圧症や動 脈硬化症等も増加傾向にある。 これらの発症機構は、 脂肪代謝やホルモン調節の 総合的な破綻によると推察されており、 メタボリックシンドロームと総称される ようになった。
最近、 肥満マウスや肥満患者の白色脂肪組織を用いた遺伝子発現解析により、 肥満及びこれに伴うインスリン抵抗性の惹起には、 白色脂肪組織中のマクロファ ージが重要な働きをしていることが報告された （非特許文献 1、 2参照） 。 肥満 マウスを用いた実験では、 まずこれらのマク口ファージから TNFひが産生され、 インスリンによるブドウ糖吸収作用が抑制された。 そして、 これと同時に、 IL - 1 及び IL- 6などの炎症性サイ トカインの分泌が高まって慢性の炎症状態が導かれた (非特許文献 3、 4参照） 。 事実、 TNF o;又はその受容体を破壊したマウスでは、 肥満によるインスリン抵抗性が改善された （非特許文献 5参照） 。
最近の研究により、 JNKキナーゼ、 及び小胞体ス トレスシグナル伝達経路の活 性化が肥満によるィンスリン抵抗性に必須であることが示唆された （非特許文献 6、 7参照） 。 また、 肝臓の IKK - |3 /NF- fc B経路をブロックすると、 肥満による インスリン抵抗性が改善されることも報告された （非特許文献 8、 9参照） 。 従 つて、 マクロファージの浸潤によって引き起こされる肥満脂肪組織からの炎症性 サイ トカインの分泌亢進や脂肪酸の負荷により、 上記小胞体ストレス · JNK経路、 又は IKK - β /NF- κ Β経路が活性化されること力 S、 肥満に伴うインスリン抵抗性の 惹起の主要原因であると考えられている。
さらに、 肥満マウスの脂肪組織では、 脂質や糖質のエネルギー代謝を制御する 重要な分泌性ホルモンであるアディポネクチンの産生が抑制されることも報告さ れている （非特許文献 10参照） 。
ところで、 「BRAK」 （Breast and Kidney expressed cheraokine) は、 腫瘍細胞 株で発現消失する新しいヒ トケモカイン遺伝子として、 1999年に Hromasらによつ てクローニングされたものである （非特許文献 11参照） 。 その後、 複数のグルー プによって同一のケモカイン分子に関する解析結果が報告されている （非特許文 献 12〜14参照） 。
現在までに、 50種類を越えるケモカインの遺伝子が哺乳類動物の染色体にコー ドされていることが分かっている。 これらケモカインは、 92〜99個のアミノ酸か ら構成されており （分子量は約8， 000〜10， 000) 、 それぞれが、 ジスルフィ ド結
Figure imgf000003_0001
している。 このシスティン残基及びその周辺の アミノ酸配列は、 ケモカインの N末端側における特徴的なものであり、 ケモカイ ンはこの特徴に基づいて 「CC」 、 「CXC」 、 「CX3C」 及び 「C」 という 4つのグル ープに分類されている （非特許文献 15参照） 。 なかでも、 CXCケモカインは、 こ れまでに 16種類が同定されており、 N末端側にある Glu- Leu- Arg配列（ELR配列）の 有無によって、 ELR+ CXCケモカインと ELR— CXCケモカインとに分類されている。 BRAKは、 ELR配列を持たない ELR— CXCケモカインに属するものであり、 名称統一 のため 「CXCL14」 と命名されている。
最近の研究によって、 BRAKは、 プロスタグランジン E2によって活性化させたヒ ト末梢血単球由来マクロファージを特異的に遊走させる活性を有することが明ら かとなつた （非特許文献 16参照） 。 また RAKは、 ヒト単球及ぴ造血前駆細胞より 分化誘導した樹状前駆細胞 （非特許文献 17、 18参照） 、 並びにヒト乳癌由来上皮 細胞株 （非特許文献 19参照） に対しても、 特異的な遊走活性を有することが報告 された。 このように、 BRAKは、 T細胞及び B細胞等に対してではなく、 組織マクロ ファージ及ぴ榭状前駆細胞等に対して遊走活性を有するユニークなケモカインで あり （非特許文献 16参照） 、 同一の作用スペク トラムを持つ CXCケモカインは他 には知られていない。 BRAKの発現は、 ヒ トにおいては小腸、 腎臓、 肝臓、 子宮及び乳腺等で確認され ており （非特許文献 14参照） 、 子宮癌及び乳癌の患者検体又は癌細胞株では BRAK の発現が消失しているという興味深い知見が得られている （非特許文献 11、 12参 照） 。 この知見により、 BRAK応答性細胞は、 癌組織へは遊走され難くなると推察 されている （非特許文献 20参照） 。 一方、 成獣マウスにおいて、 BRAKの発現は、 脳、 肺、 骨格筋、 脂肪及び卵巣で主に確認されている （非特許文献 14参照） 。 し かし、 マウス個体内における BRAK応答性細胞、 特に白色脂肪組織中の単球及びマ クロファージについての挙動実体や機能などに関する知見は得られていなかった。 そこで、 本発明者は、 白色脂肪組織への単球及びマクロファージの走化性と BARKとの関連性を明らかにし、 肥満とインスリン応答に関する種々のパラメータ 一の動態を解析するために、 BMK遺伝子が破壊されたノックアウト非ヒ ト動物、 具体的には BRAKノックアウトマウス （BRAKホモ欠損マウス（-/-) ) を作出した。 そして、 この BRAKノックアウトマウスと、 同腹の対照マウス （野生型マウス (+/+)、 BRAKヘテロ欠損マウス -)） とを用いて、 インスリン抵抗性及ぴ白色脂 肪組織中のマク口ファージ数等について解析及び比較評価した （国際出願番号： PCT/JP2006/324622) 。
その結果、 BRAKノックアウトマウスは、 普通食を与えて飼育した場合、 対照マ ウスと比べて体重及び白色脂肪量が顕著に少なく、 また高脂肪食を与えて飼育し た場合では、 対照マウスと同程度の白色脂肪量となるものの肥満マゥスに特有の 肝肥大及び脂肪肝が軽減されていた。 そして、 BRAKノックアウトマウスは、 白色 脂肪組織内部のマクロファージ数が対照マウスに比べて顕著に少なく、 さらに、 肥満に伴うインスリン抵抗性が観られなかった。 以上の結果から、 本発明者は、 BRAK (CXCL14) 摂食量調節による肥満化のプロセス、 白色脂肪組織中へのマ クロファージの遊走活性、 及び 2型糖尿病の代表的症状である肥満性ィンスリン 抵抗性の獲得に関与するという知見を得た。 非特許文献：
1 . Weisberg SP et al. , J. Clin. Invest. , 112 : 1796-1808 (2003)
2 . Xu H et al. , J. Clin. Invest. , 112 : 1821—1830 (2003) 3. Wellen KE et al. , J. Clin. Invest. , 112:1785—1788 (2003)
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20. Shurin GV et al. , J. Immunol. , 174: 5490 - 5498 (2005) 発明の開示
そこで、 本発明は、 BRAK (CXCL14) の機能 （例えば BRAKの産生もしくは作用） を抑制又は阻害する化合物及びその用途を提供すること、 特に、 BRAKを認識する 抗体及びその用途を提供することを目的とする。 具体的には、 BRAKの機能を抑制 又は阻害する化合物 （特に BRAKを特異的に認識する抗体） を用いて、 2型糖尿病 及び肥満のリスク診断や、 2型糖尿病及び肥満の予防 ·治療 （軽減） に有効利用 できる用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 上記課題を 解決し得る化合物 （特に抗体） 、 及びその用途 （2型糖尿病や肥満の診断、 予防 及び治療等） 等を開発して、 本発明を完成した すなわち、 本発明は以下の通りである。
(1) 配列番号： 1若しくは配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有するポ リペプチド又はその誘導体、 あるいはそれらの部分ペプチドを認識する抗体。 本発明の抗体としては、 例えば、 モノクローナル抗体、 ヒ ト型化抗体又はヒト 抗体、 及び標識化された抗体、 ならびにこれらを組み合わせた抗体が挙げられる。 また本発明の抗体としては、 例えば、 白色脂肪組織中のマクロファージ数の低 減促進活性、 及ぴ Z又はィンスリン抵抗性の改善活性を有する抗体が挙げられる。
(2) 上記（1)記載の抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞。
(3) 上記（2)記載のハイプリ ドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、 その体 液又は培養物から上記（ 1 )記載の抗体を採取することを特徴とする、 上記（ 1 )記 載の抗体の製造法。
(4) 上記（1)記載の抗体を含有してなる診断薬。
本発明の診断薬は、 例えば 2型糖尿病及び/又は肥満の診断に用いることがで さる。
(5) 上記（1)記載の抗体を含有してなる医薬。
本発明の医薬は、 例えば 2型糖尿病及び Z又は肥満の予防 ·治療剤、 白色脂肪 組織中のマクロファージ数の低減促進剤、 ィンス,リン抵抗性の改善剤として用い ることができる。
(6) 哺乳動物に対して、 上記（1)記載の抗体の有効量を投与することを特徴と する 2型糖尿病及び Z又は肥満の予防 ·治療方法。
(7) 哺乳動物に対して、 上記（1)記載の抗体の有効量を投与することを特徴と する白色脂肪組織中のマクロファージ数の低減促進方法。
(8) 哺乳動物に対して、 上記（1)記載の抗体の有効量を投与することを特徴と するインスリン抵抗性の改善方法。
(9) 2型糖尿病及び/又は肥満の診断薬を製造するための上記（ 1 )記載の抗体 の使用。 また、 2型糖尿病及び Z又は肥満の診断用の上記（1)記載の抗体。
(10) 2型糖尿病及び/又は肥満の予防 ·治療剤を製造するための上記（1)記載 の抗体の使用。 また、 2型糖尿病及び/又は肥満の予防 ·治療用の上記（1 )記載 の抗体。
(11) 白色脂肪組織中のマク口ファージ数の低減促進剤を製造するための上記 ( 1 )記載の抗体の使用。 また、 白色脂肪組織中のマク口ファージ数の低減促進用 の上記（1 )記載の抗体。
(12) インスリン抵抗性の改善剤を製造するための上記（ 1 )記載の抗体の使用。 また、 インスリン抵抗性の改善用の上記（ 1 )記載の抗体。 図面の簡単な説明
図 1は、 C2C12細胞、 あるいは Forskolin刺激した C2C12細胞の CXCL14に対する 走化性を調べたデータである。 6時間の培養後に Chemotaxicellミクロチヤンバ 一の中から裏面へと移動した細胞数を測定し、 統計的有意差を検定した。 グラフ は各群の平均値土標準誤差を示す。
図 2は、 Forskolin刺激した C2C12細胞の CXCL14に対する走化性が、 抗マウス CXCL14特異抗体の添加によって中和されるかどうかを調べたデータである。 6時 間の培養後にミクロチャンバ一の中から裏面へと移動した細胞数を測定し、 統計 的有意差を検定した。 グラフは各群の平均値土標準誤差を示す。
図 3は、 Forskolin刺激した THP-1細胞の CXCL14に対する走化性が、 抗マウス CXCL14特異抗体の添加によって中和されるかどうかを調べたデータである。 2時 間の培養後に Chemotaxicellミクロチャンバ一の中から裏面へと移動した細胞数 を測定し、 統計的有意差を検定した。 グラフは各群の平均値土標準誤差を示す。 図 4は、 Forskolin刺激した THP-1細胞の CXCL14に対する走化性が、 抗マウス CXCL14モノクローナル抗体の添加によって変動するかどうかを調べたデータであ る。 2時間の培養後に Chemotaxicellミクロチャンバ一の中から裏面へと移動し た細胞の代表的な染色写真を示す。
図 5は、 抗マウス CXCL14特異抗体が、 CXCL14によるィンスリンシグナルの阻害 活性を中和することを示した図である。 分化誘導した C2C12由来筋細胞を標記の 物質存在下でィンスリンにて刺激し、 Akt Ser473のリン酸化をウェスタンプロッ ティングによって測定した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 本発明の範囲はこれらの説明に拘束されるこ とはなく、 以下の例示以外についても、 本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変 更し実施し得る。
なお、 本明細書は、 本願優先権主張の基礎となる特願 2007- 030027号明細書の 全体を包含する。 また、 本明細書において引用された全ての刊行物、 例えば先行 技術文献、 及び公開公報、 特許公報その他の特許文献は、 参照として本明細書に 組み込まれる。
なお、 本明細書においては、 BRAKと CXCL14とは同義であり、 いずれの表記を用 いた場合も同じものを意味する。
1 . 本発明の概要
く本発明をするに至った経緯 >
本発明者は、 筋ジストロフィーモデルマウス mdx の骨格筋細胞において mRNA 発現が上昇していたことに着目し、 BRAK (CXCL14) の生理機能に注目した。
近年になって、 マクロファージが骨格筋や肝臓などの損傷修復に重要な働きを していることが次々と発表された。 そこで、 本発明者は、 CXCL14遺伝子欠損マ ウス [CXCL14 ( -/-)マウス]を mdx マウスと交配し、 CXCL14 (- / -） mdx マウス及び CXCL14 (+/- ) mdx マウスを産出した。 これらのマウスについて、 血中クレアチン キナーゼ（CK)活性を定期的に測定したところ、 個体間でばらつきはあるが CXCL14 (-/-) mdxマウス群の方が CXCL14 (+/- ) mdxマウス群より CK値が有意に低 下していた。 しかし、 老齢 CXCL14 ( -/-) mdx マウスの骨格筋や横隔膜を組織化学 的に解析したところ、 mdx マウス特有の筋変性症状は、 老齢 CXCL14 (+/ -) mdx マ ウスとほぼ同様に生じていた。 CXCL14 (- /）マウスでは、 ハブ毒注射による骨格 筋の損傷実験においても正常マウスと同程度のキネティタスで筋組織の再生が観 られた。 以上の事実から、 CXCL14 ( -/-) mdxマウスで観られた血中 CK値の減少は、 筋膜の変性緩和によるものではなく、 CXCL14 の筋肉に対する別の生理機能を反 映しているものと考えられた。 そこで、 CXCL14 ( -/-)マウスの基本的性質を慎重に比べてみたところ、 普通食 を与えて飼育した 6ヶ月齢 CXCL14 -/-)雌マゥスの平均体重は、 CXCL14 (+/- )雌マ ウスと比べて 25%少なく、 子宮周囲の白色脂肪量は 4分の 1に減少している結果 が得られた。 この体重差は CXCL14 - / -）マウスの摂食量が少ないことによるもの であった。 次に、 これらのマウスに高脂肪食を与えて飼育したところ、 CXCLM (- /-）マウスは、 CXCL14 (+/- )マウスより体重は軽いものの次第に肥満になり、 内臓 白色脂肪量についてはほぼ同程度となった。 しかし、 この CXCL14 ( -/-)マウスは、 肥満マウス特有の肝肥大と脂肪肝が軽減されていた。 さらに、 高脂肪食飼育した CXCL14 (-/-)マウスの血糖値は、 高脂肪食飼育 CXCL14 (+/-)マウスよりも有意に低 かった。 そこで、 インスリン投与後の血糖値変化を測定したところ、 高脂肪食飼 育した CXCL14 ( -/-)マウスは、 肥満個体でおこるィンスリン抵抗性が改善されて いた。 このような結果から、 本発明者は、 2型糖尿病及び肥満における CXCL14の 生理的役割を詳しく解析するに至った。 また、 CXCL14 (- /- )マウスにおけるイン スリン抵抗性の改善が、 特に骨格筋にて顕著であったことから、 CXCL14 ( -/-) mdx マウスで観察された CK値の低下は、 糖代謝と密接に関係しているものと考えられ た。
<本発明及び BRAKの作用メカニズム >
本発明者は、 BRAK (CXCL14) 遺伝子を欠損するマウス系統 [CXCL14 (-/- )マウ ス]を用いた解析結果から、 CXCL14 が 2型糖尿病の代表的症状である肥満性イン スリン抵抗性の獲得、 及び摂食量調節による肥満化のプロセスに関与することを 明らかにした （これについては下記（1 )，（2 )に詳述） 。 これらの知見から、 本 発明者は、 CXCL14の機能 （例えば CXCL14の産生もしくは作用） を抑制又は阻害 する化合物、 特に CXCL14 を特異的に認識する抗体が、 2型糖尿病に対する新し い治療薬として有効であり、 またポテンシャルとして肥満軽減薬としても有効で あることを見出した。 さらに、 上記化合物 （特に抗 BRAK抗体） は 2型糖尿病及 び肥満リスクの診断薬としても有用であることを見出した。
( 1 ) 肥満性ィンスリン抵抗性獲得における CXCL14の役割
CXCL14は、 組織マクロファージを誘引するケモカインとして cDNAクローニン グされた 77アミノ酸 （シグナルペプチドを含む場合は 99アミノ酸） から成るタ ンパク質である （Hromas, R. et al. , BBRC, 255 : 703 - 706， 1999； Frederick, M. J. et al. , Am. J. Pathol. , 156 : 1937—1950， 2000； Sleeman, M. A. et al. , Int. Immunol. , 12： 677-689, 2000) 。 本発明者は、 CXCL14 (-/- )マウスが、 高 脂肪食飼育による肥満性ィンスリン抵抗性になりにくいことを見出した。 この事 実に基づき、 本発明者は、 上記遺伝子改変マウス （CXCL14 (- /- )マウス） が 2型 糖尿病治療薬の研究開発に有用である と考えた （国際出願番号 ： PCT/JP2006/324622) 。
そこで、 対照マウスとしての CXCL14 (+/- )マウスを、 高脂肪食で 12週間飼育 したところ、 一般的な過食肥満マウスと同様に、 1) 内臓白色脂肪へのマクロフ ァージ浸潤、 2) 血中アディポネクチン濃度の低下、 3) インスリン抵抗性惹起因 子のひとつである retinol binding protein 4 (RBP4)の血中濃度上昇、 脂月方 肝、 及ぴ 5) インスリン腹腔投与による血糖値低下の鈍化が観察された。 これに 対して、 高脂肪食飼育した CXCL14 (- /- )マウスでは、 上記 1) 〜5) の項目のすべ てについて、 有意に改善することが認められた。 この違いは、 特に雌マウスにお いて顕著であった。 さらに、 CXCL14 を骨格筋特異的に強制発現させたトランス ジエニックマウスを CXCL14 ( -/-)マウスと交配して二重遺伝子改変マウスを作出 したところ、 この二重遺伝子改変マウスは高脂肪食飼育によるインスリン抵抗个生 が復帰した。 一方、 C2C12筋芽細胞株を分化誘導させて調製した筋管をインスリ ン刺激した in vitro実験系において、 CXCL14はィンスリン刺激による Aktキナ ーゼのリン酸ィ匕と 2- deoxy- glucose (グルコースのアナログ）の取り込みを部分 阻害した。 この実験結果は、 CXCL14 がマクロファージ走化性因子としてだけで なく、 糖代謝を直接制御することを示す初めての結果であった。 高脂肪食飼育し た CXCL14 (- /- )マウスでは、 骨格筋でのインスリン応答性が特に改善されていた こと力 ら、 CXCL14 は肥満個体において、 内臓脂肪へのマクロファージ浸潤によ る慢性の炎症反応を誘導するだけでなく、 骨格筋での糖吸収を直接阻害すること により、 肥満性のインスリン抵抗性発症に寄与しているものと考えられた。
( 2 ) CXCL14と肥満との関係
CXCL14 (- /- )雌マウスは、 普通食飼育条件下及び高脂肪食飼育条件下の両方に おいて、 CXCL14 (+/- )雌マウスと比べて平均体重が 20〜25%軽かった。 同様のこ とは、 レプチン欠損による遺伝性肥満マゥス ob/obと CXCL14 (-/-)マウスとの二重 変異マウスにおいても観察された。 8〜10週齢のじ乂(^14(-/-) 013ん13雌マウスは明 らかな肥満を呈するが、 CXCL14 -/-） ob/ob雌マウスと比べて体重が 15〜20°/o低下 しており、 このとき摂食量も約 20%低下していた。 従って、 CXCL14はレプチン系 とは独立のメカニズムにより食欲を上昇させる又は食欲低下を抑制する顕著な効 果を有するものであると考えられた。
2 . CXCL14の機能を抑制又は阻害する化合物
CXCL14の機能を抑制又は阻害する化合物としては、 例えば CXCL14の産生又は作 用を抑制又は阻害する化合物が挙げられる。 このような化合物としては、 例えば、 (i) CXCL14遺伝子の機能を抑制又は阻害する化合物、 （ii) CXCL14分子に直接相 互作用 （例えば、 結合もしくは会合） して CXCL14の機能を抑制又は阻害する化合 物、 （iii) CXCL14が作用する対象となる物質 （CXCL14の基質） や細胞等に対して 相互作用 （例えば、 結合もしくは会合） して CXCL14の機能を抑制又は阻害する化 合物などが挙げられる。 また、 これら化合物は、 当該技術分野において通常認識 される、 いわゆる低分子化合物であってもよいし、 高分子化合物であってもよい し、 これらの中間的な分子量を有する化合物であってもよく、 特に限定はされな レ、。
具体的に、 上記（i)の化合物としては、 例えば、 CXCL14遺伝子の機能を抑制又 は阻害する核酸、 及び他の各種有機化合物等が挙げられる。 当該核酸としては、 ポリヌクレオチド及びォリゴヌクレオチド (DNA, RNA)、 ならびにぺプチド核酸 (PNA)等のいずれであってもよく、 具体的な種類としては、 例えばアンチセンス DNA、 siRNA、 shRNA及びマイクロ RNA等が挙げられる。
上記（i i)の化合物としては、 例えば、 CXCL14を特異的認識する抗体又は酵素、 当該抗体及び酵素には含まれない天然又は合成ポリぺプチド及びオリゴぺプチド、 ならびに他の各種有機化合物等が挙げられる。
上記（ii i)の化合物は、 CXCL14及ぴその遺伝子に直接的に作用するものではな い点で、 CXCL14に対する間接的な抑制又は阻害化合物であると言える。 当該化合 物としては、 例えば、 CXCL14の作用対象となる物質を認識する抗体又は酵素、 当 該抗体及び酵素には含まれない天然又は合成ポリべプチド及びオリゴぺプチド、 ならびに他の各種有機化合物等が挙げられる。
上述した CXCL14の機能を抑制又は阻害する化合物は、 例えば、 2型糖尿病及び 肥満の診断薬、 2型糖尿病及び肥満の予防 ·治療剤又は予防 ·治療方法、 白色脂 肪組織中のマク口ファージ数の低減促進剤又は低減促進方法、 ならびにィンスリ ン抵抗性の改善剤又は改善方法などの用途に好適に用いることができる。
以下においては、 上述した CXCL14の機能を抑制又は阻害する各種化合物のうち、 特に好ましい態様の一つである 「CXCL14を認識する抗体」 について、 各種用途へ の使用態様も含めて詳細に説明するが、 該抗体以外の上記化合物についても各種 用途への使用態様については該抗体の説明と同様の説明が適用され得る。
3 . 本発明の抗体
本明細書において用いられる配列番号のうち、 配列番号： 1〜配列番号： 6は、 以下のペプチドのアミノ酸配列を表す。 なお、 配列番号： 1及び配列番号： 2で 表されるアミノ酸配列 （99アミノ酸） は、 いずれも、 N末端の 22アミノ酸はシグ ナル配列である。 また、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列は、 NCBI ( GenBank ) のウェブ、サ 卜 ( http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/ ) に 「Accession number: AAD03839J として表されており、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列 は、 同ウェブサイトに 「Accession number : AAD34157J として表されている。 ま た、 配列番号： 3〜配列番号： 6で表されるァミノ酸配列は、 いずれも、 配列番 号： 1又は配列番号： 2で表されるァミノ酸配列の一部であり、 括弧 （ ） 内の 数値範囲は、 配列番号： 1又は配列番号： 2で表されるァミノ酸配列中の存在位 置 （N末端からのアミノ酸残基数で表示） を示す。
〔配列番号： 1〕 ヒト型 CXCL14
〔配列番号： 2 ] マウス型 CXCL14
〔配列番号： 3〕 ヒト型 CXCL14 (23- 99)
〔配列番号： 4 ] ヒト型 CXCL14 (24- 35)
〔配列番号： 5 ) マウス型 CXCL14 (23 ；-99) 〔配列番号： 6〕 マウス型 CXCL14 (24- 35) ここで、 配列番号： 1で表されるヒ ト型 CXCL14のァミノ酸配列と、 配列番号： 2で表されるマウス型 CXCL14アミノ酸配列とを以下に示す （いずれも各アミノ酸 は 1文字表記） 。 当該アミノ酸配列において、 下線を付したアミノ酸残基 （計 2 残基） は、 シグナル配列以外の部分において、 ヒ ト型 CXCL14とマウス型 CXCL14と の間で相違が認められるァミノ酸残基である。 くヒ卜型 GXGL14 (配列番号：1 ) >
RLLAAALLLLLLALYTARVDGSKCKCSRK6PK I RYSDVKKLEMKPKYPHCEEKM I 1TTKSVSR YRGQEHCLHPKLQSTKPF I KWYNAWNEKRRVYEE
<マウス型 GXCL14 (配列番号： 2) >
MRLLAAALLLLLLALCASRVDGSKCKCSRKGP I RYSDVKKLEMKPKYPHCEEKMV I VTTKSMS YRGQEHCLHPKLQSTKRF I KWYNAWNEKRRVYEE 本明細書におけるタンパク質 （ポリペプチド又は部分ペプチド） は、 ペプチド 標記の慣例に従って、 左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシ ル末端） である。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド をはじめとする、 本発明で用いられるタンパク質は、 C末端がカルボキシル基、 カルボキシレート、 アミ ド又はエステルの何れであってもよい。
本発明の抗体が認識しうるポリペプチドの誘導体、 すなわちヒ ト又はマウス型 CXCL14の誘導体としては、 例えば、 配列番号： 1又は配列番号： 2で表されるァ ミノ酸配列の一部のアミノ酸残基が、 置換可能な基によって置換されたもの、 ァ ミノ酸残基の一部が欠失したもの、 アミノ酸残基などが付加 ·揷入されたものな どが挙げられる。 配列番号： 1又は配列番号： 2で表されるァミノ酸配列を有す るポリペプチドの誘導体の例としては、 上記アミノ酸配列中の 1又は 2個以上 （ 好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） 、 より好まし くは、 1、 2又は 3個） のアミノ酸が欠失したもの、 上記アミノ酸配列に 1又は 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さら に好ましくは数個 （1〜5個） 、 さらに好ましくは、 1、 2又は 3個） のァミノ 酸が付加したもの、 上記アミノ酸配列に 1又は 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0 個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） 、 さらに好ましくは、 1、 2又は 3個） のアミノ酸が挿入されたもの、 又は上記ァ ミノ酸配列中の 1又は 2個以上 （好ましくは、 1〜 1 0個程度、 より好ましくは 数個 （1〜5個） 、 さらに好ましくは、 1、 2又は 3個） のアミノ酸が他のアミ ノ酸で置換されたものが挙げられる。
なお、 上述したヒト又はマウス型 CXCL14の誘導体は、 例えば、 生理学的に許容 される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩 （好 ましくは生理学的に許容される酸付加塩） などとして用いてもよく、 このような 塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との 塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン 酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン 酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明の抗体が認識しうる部分べプチド、 すなわちヒ トもしくはマウス型 CXCL14又はその誘導体の部分ペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1又は配列 番号： 2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、 その一部のァ ミノ酸残基が欠失したもの、 一部のアミノ酸残基が置換可能な基 （例、 Cys、 水 酸基など） によって置換されたもの、 その一部のアミノ酸残基が欠失し、 かつ一 部のアミノ酸残基が置換可能な基 （例、 Cys、 水酸基など） によって置換された ものなども挙げられる。
当該部分べプチドの例としては、 ヒ トもしくはマウス型 CXCL14又はその誘導体 の N末端側の約 2 2残基 （シグナルペプチド部分） が欠失したものが挙げられる。 より具体的には、 当該部分べプチドは、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の (i) 第 2 3番目〜第 9 9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド （配列番号 ： 3 ) 、 (ii) 第 2 4番目〜第 3 5番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド （ 配列番号： 4 ) 、 及び （iii) これら（i)〜（i i)のポリペプチドの一部のアミノ酸 残基 （例、 1個） が置換可能な基によって置換されたもの、 ならびに、 配列番号 ： 2で表されるアミノ酸配列の （iv) 第 2 3番目〜第 9 9番目のアミノ酸配列を 有するポリペプチド （配列番号： 5 ) 、 (v) 第 2 4番目〜第 3 5番目のァミノ 酸配列を有するポリペプチド （配列番号： 6 ) 、 及び （vi) これら（iv)〜（v)の ポリペプチドの一部のアミノ酸残基 （例、 1個） が置換可能な基によって置換さ れたものなどが好ましく挙げられる。
抗体の抗原の調製法、 及び抗体の製造法については、 自体公知の方法、 例えば、 W0 94/17197号公報に記載の方法やそれに準ずる方法を用いることができるが、 以下に、 その例を示す。
( 1 ) 抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、 例えば CXCL14 (B A ) もしくはその誘導体又はその部分ペプチドや、 CXCL14と同一の抗原決定基を 1 種あるいは 2種以上有する合成ぺプチドなどの何れのものも使用することができ る （以下、 これらを単に CXCL14抗原と称することもある） 。 CXCL14もしくはその 誘導体又はその部分ペプチドとしては、 前述したものが用いられる。 CXCL14抗原 は、 例えば、 ヒト及びマウス、 あるいは場合によりサル、 ラット及びブタなどの 哺乳動物から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製することも できるし、 また市販の天然精製標品であってもよいし、 合成ペプチドを用いても よい。
CXCL14抗原は、 公知の方法、 例えば W0 02/06483号公報に記載の方法に準じて 調製でき、 さらに、 （a) ヒト及びマウス、 あるいは場合によりサル、 ラット及び ブタなどの哺乳動物の組織又は細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を 用いて調製すること、 （b) ペプチド .シンセサイザ一等を使用する公知のぺプチ ド合成方法で化学的に合成すること、 あるいは （c) CXCL14又はその誘導体をコ 一ドする環 Aを含有する形質転換体を培養すること、 によっても調製される。
(a) 該哺乳動物の組織又は細胞から CXCL14抗原を調製する場合は、 その組織又 は細胞をホモジナイズした後、 酸又はアルコールなどで抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィ 一、 ァフイエティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ一を組み合わせ ることにより精製単離し、 CXCL14抗原を調製できる。 (b) CXCL14抗原を化学的に合成する場合に用いられる、 合成ペプチドとしては、 例えば天然より精製した CXCL14抗原と同一の構造を有するものや、 CXCL14などの アミノ酸配列において 3個以上、 好ましくは 6個以上のアミノ酸からなる任意の 箇所のァミノ酸配列と同一のァミノ酸配列を 1種あるいは 2種以上含有するぺプ チドなどが挙げられる。
(c) DNAを含有する形質転換体を用いて CXCL14抗原を製造する場合、 該 DNAは、 公知のクローユング方法 （例えば、 Molecular Cloning (2nd ed. ； J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など） に従って 作製することができる。 該クローニング方法とは、 （1) CXCLM抗原のアミノ酸配 列に基づきデザィンした DNAプ口一ブ又は DNAプライマーを用レ、、 cDNAライブラリ 一からハイプリダイゼーション法により CXCL14抗原をコードする DNAを含有する 形質転換体を得る方法、 又は（2) CXCL14抗原のアミノ酸配列に基づきデザインし た DNAプライマーを用い、 PCR法により該 CXCL14抗原をコードする DNAを含有する 形質転換体を得る方法などが挙げられる。
CXCL14を加水分解して得られる部分ペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1 又は配列番号： 2で表されるァミノ酸配列を有するポリペプチドをアミノぺプチ ダーゼやカルボキシぺプチダーゼなどのェキソプロテアーゼにより N末端及び// 又は C末端から順次加水分解して得られる部分べプチド又はそれらの混合物、 あ るレヽは配列番号： 1又は配列番号： 2で表されるァミノ酸配列を有するポリぺプ チドを種々のェンドぺプチダーゼにより加水分解して得られる部分べプチド又は それらの混合物などが用いられる。
前記合成ペプチドは、 公知の常套手段で製造することができ、 固相合成法、 液 相合成法のいずれによっても製造することができる。 すなわち、 該ペプチドを構 成し得る部分べプチド又はアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を 有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができ る。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 B. Merrifield 〔ジャー ナル ォブ アメリカン ケミカル ソサイエティ（J. Am. Chera. Soc. ) , 85, 2149 1963年〕 、 M. Bodanszky及び M. A. Ondetti 〔ペプチド シンセーシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York, 196o年」 、 Schroeder及び Luebke 〔ザペプチド (The Peptide)， Academic Press, New York, 1965年〕 、 泉 屋信夫他 〔ペプチド合成の基礎と実験、 丸善、 1985年〕 、 矢島治明及び榊原俊平
〔生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 1977年〕 などが用いられる。 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラフ ィー、 液体ク口マトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて該ぺプチドを精製単 離することができる。 上記方法で得られるぺプチドが遊離体である場合は、 公知 の方法によって適当な塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合は、 公知 の方法によつて遊離体に変換することができる。
ペプチドのアミ ド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用い て得ることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒ ドロキシメチル樹脂、 ベンズヒ ドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベン ジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒ ドロキシメチルメチルフエニルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリ アタリノレアミ ド樹脂、 4一 ( 2，， 4，ージメ トキシフエ二ル一ヒドロキシメチル ) フエノキシ樹脂、 4 - ( 2，， 4 'ージメ トキシフエ二ルー F m o cアミノエチ ル） フエノキシ樹脂などが挙げられる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と 側鎖官能基を適当に保護したァミノ酸を、 目的とするぺプチドの配列通りに、 公 知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からペプチド を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 目的のペプチドを取得する。 あるいは クロ口トリチル樹脂、 ォキシム樹脂、 4ーヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、 部分的に保護したべプチドを取り出し、 更に常套手段で保護基を除去し目的のぺ プチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 ぺプチド合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができるが、 カルポジイミド類が好ましく用いられる。 このようなカルボジィミ ド類としては D C C、 N， N' —ジイソプロピ /レカルボ ジイミ ド、 N—ェチル— N， - ( 3—ジメチルァミノプロリル） カルボジイミ ド などが挙げられる。 各種活性化試薬による活性化にはラセミ化抑制添加斉 U (例え ば、 H〇 B t、 H O〇 B tなど） とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添カロ するか又は、 対称酸無水物又は H O B tエステルあるいは H O〇B tエステルと してあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加すること ができる。 保護されたァミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒として ^ は、 ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されう る。 そのような溶媒としては、 例えば N, N—ジメチルホルムアミ ド、 N， N— ジメチルァセトアミ ド、 N—メチルピロリ ドンなどの酸アミ ド類、 塩化メチレン、 クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフノレオ口エタノールなどのアル コール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなどの三級ァ ミン類、 ジォキサン、 テトラヒ ドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類 あるいはこれらの適宜の混合物などが保護されたァミノ酸の活性化や樹脂との縮 合に用いられる溶媒として用いられる。 反応温度はペプチド結合形成反応に使用 され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜約 5 0 °C の範囲から適宜選択される。 活性化されたァミノ酸誘導体は通常約 1 . 5〜約 4 倍過剰で用いられる。 ニンヒ ドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な 場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合 を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無 水酢酸又はァセチノレイミダゾールを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化して、 後 の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 ターシャリ 一ペンチノレォキシカルボ二ノレ、 ィソボルニルォキシカルボニル、 4ーメ トキシべ ンジルォキシカルボニル、 C 1— Z、 B r— Z、 ァダマンチノレオキシカノレボニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二ト口フエニノレスノレフエ二 ル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが挙げられる。 カルボキシル 基の保護基としては、 たとえば アルキル基、 C3— 8シクロアルキル基、 C7— 14ァ ラルキル基の他、 2—ァダマンチノレ、 4 —二トロべンジノレ、 4—メ トキシベンジ ル、 4—クロ ロべンジノレ、 フエナシル基及びべンジルォキシカルボニルヒ ドラジ ド、 ターシャリーブトキシカルボニルヒ ドラジド、 トリチルヒ ドラジドなどが挙 げられる。
セリン及びスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化又はエーテル化によつ て保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァセチル基 などの低級 (Cト 6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジル ォキシカルボ-ル基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが 挙げられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 たとえばベンジル基、 テト ラヒドロピラニノレ基、 ターシャリーブチノレ基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば B z 1、 C 1 -B z 1、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 ターシャリ一ブチルなどが挙げられる。 ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 To s、 4ーメ トキシ一 2， 3， 6—トリメチ /レベンゼンスノレホニノレ、 DNP、 B om、 Bum, B o c、 T r t、 Fmo cなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル [アルコール (たとえば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2， 4， 5—トリクロ口フエノーノレ、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメチ ノレアノレコーノレ、 パラニト口フエノール、 HONB、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N—ヒ ドロキシフタルイミ ド、 H〇B t) とのエステル] などが挙げられる。 原 料のアミノ基の活性ィヒされたものとしては、 たとえば対応するリン酸アミ ドが挙 げ'られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば P d—黒又は P d—炭素などの 触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンス ノレホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの 混合液などによる酸処理や、 ジィソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウム による還元なども挙げられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に一 20°C〜4 0°Cの温度で行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエノール、 チオア二 ソーノレ、 メタクレゾ一ノレ、 ノ ラクレゾ一ノレ、 ジメチノレスノレフイ ド、 1， 4ーブタ ンジチオール、 1， 2一エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効 である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2， 4ージニ トロフヱニル基はチオフェノール処理により除去され、 トリプトファンのィンド —ル保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジチオール、 1, 4ーブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナト リゥム、 希アンモニアなどによるアル力リ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護及び保護基、 ならびにその保護基 の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から 適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 カルボキシル末端アミノ 酸の 一カルボキシル基をアミ ド化し、 その後、 アミノ基側にペプチド鎖を所望 の鎖長まで延ばした後に、 該ぺプチド鎖の N末端の α—ァミノ基の保護基のみを 除いたぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたぺプチド （又は アミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させ る方法が挙げられる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗べプチドを得ることができる。 この粗ぺプチドは既知の各種精製手段を 駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のぺプチドのァミ ド体を得 ることができる。
ぺプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端ァミノ酸の α—カルボキシル 基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ペプチドのアミ ド 体と同様にして所望のぺプチドのエステル体を得ることができる。
CXCL14抗原は、 不溶化したものを直接免疫することもできる。 また、 CXCL14抗 原を適当な担体に結合又は吸着させた複合体を免疫してもよい。 該担体 （キヤリ ァー） と CXCL14抗原 （ハプテン） との混合比は、 担体に結合あるいは吸着させた CXCL14抗原に対して抗体が効率よくできれば、 どのようなものをどのような比率 で結合あるいは吸着させてもよく、 通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常 用されている高分子担体を重量比でハプテン 1に対し 0 . 1〜 1 0 0の割合で使 用することができる。 このような高分子担体としては、 天然の高分子担体や合成 の高分子担体が挙げられる。 天然の高分子担体としては、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒ トなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばゥシ、 ゥサギなどの哺乳動物のチ ログロブリン、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒ ト、 ヒッジなどの哺乳動物のへモグロビ ン、 KHL (キーホールリンペット） へモシァニンなどが用いられる。 合成の高分 子担体としては、 例えばポリアミノ酸類、 ポリスチレン類、 ポリアクリル類、 ポ リビュル類、 ポリプロピレン類などの重合物又は供重合物などの各種ラテックス などを用いることができる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できる。 縮合剤としては、 例えば、 チロシン、 ヒスチジン、 トリブトファンを架 橋するビスジァゾ化べンジジンなどのジァゾニゥム化合物、 ァミノ基同士を架橋
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ド化合物、 トルエン一 2， 4—ジイソ シァネートなどのジイソシァネート化合物、 チオール基同士を架橋する N， N，- レンジマレイミ ドなどのジマレイミド化合物、 ァミノ基とチオール基 を架橋するマレイミド活性エステル化合物、 ァミノ基とカルボキシル基とを架橋 するカルポジイミ ド化合物などが好都合に用いられる。 また、 アミノ基同士を架 橋する際にも、 一方のァミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試薬 （ 例えば、 S P D Pなど） を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、 他方のァミノ基にマレイミ ド活性エステル試薬によりマレイミ ド基を導入後、 両 者を反応させることもできる。
( 2 ) モノクローナル抗体の作製
本発明の抗体は、 ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であって もよく、 特に限定されるものではないが、 モノクローナル抗体であることが好ま しい。 以下、 本発明の抗体の作製方法として、 モノクローナル抗体の場合を例に 挙げて説明する。
CXCL14抗原は、 温血動物に対して、 例えば腹腔内注入、 静脈注入、 皮下注射な どの投与方法によって、 抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、 希釈剤と共に投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイン トアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通 常 2〜6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 温血動物としては、 例え ばサノレ、 ゥサギ、 ィヌ、 モノレモッ ト、 マウス、 ラッ ト、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮ トリ などが挙げられるが、 抗体、 特にモノクローナル抗体の作製にはマウスが好まし く用いられる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、 CXCL14抗原を免疫された温血動物、 例 えばマウスから、 抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 又はリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させ ることにより、 抗 CXCL14モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製すること ができる。 血清中の抗 CXCL14抗体価の測定は、 例えば後記の標識化 CXCL14と抗血 清とを反応させた後、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされ る。 融合操作は既知の方法、 例えばケーラーとミルスタインの方法 〔ネイチヤー (Nature) , 256, 495 (1975)〕 に従い実施できる。 融合促進剤としては、 ポリエ チレングリコール (PEG) ゃセンダイゥィルスなどが挙げられ、 好ましくは PEGな どが用いられる。 骨髄腫細胞としてはたとえば N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 / 0 , A P—1などがあげられ、 P 3 U 1などが好ましく用いられる。 用いられる抗体 産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄細胞数との好ましい比率は、 通常 1 ： 1〜2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 1 0〜8 0 %程度の 濃度で添加され、 通常 2 0〜 4 0 °C、 好ましくは 3 0〜 3 7 °Cで通常 1〜 1 0分 間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
抗 CXCL14抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき るが、 例えば CXCL14又はその誘導体又はそれらの部分べプチドを直接あるいは担 体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリ ドーマ培養上清 を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 （細胞融 合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる ) 又はプロテイン Aを加え、 固相に結合した抗 CXCL14モノクローナル抗体を検出 する方法、 抗免疫グロプリン抗体又はプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添カ卩し、 放射性物質や酵素などで標識した CXCL14を加え、 固相 に結合した CXCL14モノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。 抗 CXCL14モノクローナル抗体のスクリーニング、 育種は、 通常 HA T (ヒポキサン チン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加して、 1 0〜 2 0 %牛胎児血清を含む 動物細胞用培地 （例、 RPMI1640) で行われる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価 は、 上記の抗血清中の抗 CXCL14抗体価の測定と同様にして測定できる。
抗 CXCL14モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離 精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法 （例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等 電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活 性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法な ど） に従って行われる。
また、 CXCL14の一部領域と反応する抗 CXCL14抗体を産生するハイプリ ド 及ぴ、 CXCL14とは反応するがその一部領域とは反応しない抗 CXCL14モノクローナ ル抗体を産生するハイブリ ドーマの選別は、 たとえばその一部領域に相当するぺ プチドとハイプリ ドーマが生産する抗体との結合性を測定することにより行うこ とができる。
以上のようにして、 ハイプリ ドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培養 し、 その体液又は培養物から抗体を採取することによって、 本発明の抗体を製造 することができる。
このようにして得られる本発明の抗体は、 2型糖尿病及び肥満の診断薬、 2型 糖尿病及ぴ肥満の予防 ·治療剤、 白色脂肪組織中のマクロファージ数の低減促進 剤、 インスリン抵抗性の改善剤として使用することができる。
これらの目的には、 本発明の抗体は、 抗体分子そのものを用いてもよいし、 又 は上記の抗体の断片及ぴ V領域の一本鎖抗体を用いてもよく、 これらはいずれも 本発明の抗体の範囲内のものである。 抗体の断片は、 抗体の一部分の領域を意味 し、 具体的には F ab 、 Fab Fab Fv (variable fragment of antibody) sFv dsFv (disulphide stabil ized Fv)又は dAb (single domain antibody) など が挙げられる。 V領域の一本鎖抗体は、 VL (L鎖可変領域） と VH (H鎖可変領域） とをリンカーでつないだ構造を持つものである。
また、 本発明の抗体としては、 ヒ ト型化抗体 （ヒト化抗体） 及びヒト抗体が好 ましい態様として挙げられる。 これらヒト型化抗体及ぴヒ ト抗体は、 本明細書に おいては総称して 「ヒ ト抗体」 、 又はモノクローナル抗体の場合は 「ヒトモノク ローナル抗体」 と言うことがある。 これらの抗体は、 免疫系をヒトのものと入れ 換えた哺乳動物を用い、 該哺乳動物を免疫して、 通常のモノクローナル抗体の作 製と同様に直接作製することができる。
ヒ ト型化抗体を作製する場合は、 マウス等の哺乳動物 （非ヒ ト動物） の抗体の 可変領域から相ネ甫个生決定領域（complementarity determining region ; CDR)をヒ ト可変領域に移植して、 フレームワーク領域 (FR)はヒト由来のものを、 CDR は非 ヒ ト動物由来のものを使用して再構成した可変領域を作製する。 次いで、 この再 構成した可変領域をヒト定常領域に連結することでヒト型化抗体を作製すること ができる。 また、 ヒト型化抗体は、 非ヒト抗体由来可変領域及びヒト抗体由来定 常領域とからなるキメラ抗体として作製することもできる。 ヒ ト型化抗体の作製 法は、 当分野において周知である。
ヒ ト抗体は、 一般に、 V領域の抗原結合部位、 すなわち超過変領域 (Hyper Variable region)についてはその特異性と結合親和性が問題となるが、 構造的に どの動物で作製してもかまわない。 一方、 V領域のその他の部分や定常領域の構 造は、 ヒ トの抗体と同じ構造をしていることが望ましい。 ヒトに共通の遺伝子配 列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。
4 . 本発明の抗体の用途
以下に、 本発明の抗体の用途について、 詳細に説明する。
( 1 ) 本発明の抗体を含有してなる診断薬
本発明の抗体 （特に、 ヒトモノクローナル抗体） は、 CXCL14 (BRAK) が関与す る疾患、 すなわち 2型糖尿病及び Z又は肥満の診断薬として使用することができ る。
具体的には、 本発明の抗体は、 2型糖尿病及び Z又は肥満のリスク診断を目的 として使用される。 前述した通り、 CXCL14ホモ欠損マウスを用いた解析結果から、 CXCL14が 2型糖尿病の代表的症状である肥満性ィンスリン抵抗性の獲得、 及び摂 食量調節による肥満化のプロセスに関与することを明らかにした。 従って、 被験 者から採取した体液や組織などの生体サンプル （被測定液、 被検液） 中の抗原量 (CXCL14量） を測定することにより、 被験者の 2型糖尿病及び肥満リスクを評価 することができる。
本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるものではなく、 被測定液中の 抗原量 （CXCL14量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学 的又は物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製 し算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 このような測定法 としては、 例えば、 サンドィツチ法、 競合法、 ィムノメ トリック法、 ネフロメト リーなどが用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法、 競合 法がより好ましく、 特にサンドィツチ法が好ましい。
(A) サンドィツチ法
サンドイッチ法は、 担体上に不溶化した本発明の抗体 （固相用抗体） 、 標識ィ匕 された本発明の抗体 （固相用抗体とはェピトープが異なる抗体：標識用抗体） 及 び被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定することにより被検液中の CXCL14 又はその誘導体を定量する方法である。
サンドイッチ法においては、 担体上に不溶化した本発明の抗体に被検液を反応 ( 1次反応） させ、 さらに標識化された本発明の抗体を反応 （2次反応） させた 後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより、 被検液中の CXCL14量を 定量することができる。 1次反応と 2次反応は同時に行ってもよいし時間をずら して行ってもよい。 標識化剤及び不溶化の方法は、 前記のそれらに準じることが できる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは 標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向 上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 サンドィツチ法 による CXCL14の測定法においては、 例えば、 1次反応で用いられる抗体が CXCL14 またその誘導体の C端側の部分ペプチドを認識する場合は、 2次反応で用いられ る抗体は C端側の部分ペプチド以外 （即ち、 N端側） を認識する抗体が好ましく、 1次反応で用いられる抗体が CXCL14又はその誘導体の N端側の部分ぺプチドを認 識する場合は、 2次反応で用いられる抗体は、 N端側の部分ペプチド以外 （即ち、 C端側） を認識する抗体が好ましく用いられる。 また、 標識用抗体は、 西洋ヮサ ビパーォキシダーゼ （HRP) で標識化されて用いられることが好ましい。
(B) 競合法競合法
競合法競合法は、 本発明の抗体、 被検液及び標識化された CXCL14又はその誘導 体を競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された CXCL14又はその誘導体の 割合を測定することにより、 被検液中の CXCL14又はその誘導体を定量する定量法 である。 競合法による被検液中の CXCL14又はその誘導体を定量は、 例えば、 固相 化法を用いて行うことが好ましい。 固相化法の具体例としては、 抗マウス IgG抗 体 （ICN/CAPPEL社製） を固相化抗体として用い、 この固相化抗体の存在するプレ ートに、 （i) 本発明の抗体、 （ii) HRPで標識化された配列番号： 1又は配列番 号： 2で表されるペプチド、 及び （iii) 被検液を添加し、 反応後、 固相に吸着 した HRP活性を測定し、 CXCL14又はその誘導体を定量する方法が挙げられる。
(C) ィムノメ トリック法
ィムノメ トリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化さ れた本発明の抗体に対して競合反応させた後、 固相と液相を分離する力、 あるい は被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、 次に固相 化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させた後、 固相と 液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量 する。
(D) ネフロメ トリー
ネフロメ トリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶 性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降物しか 得られない場合には、 レーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが 好適に用いられる。
上記 (A)〜(D)の測定法において、 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤 としては、 特に限定されるものではないが、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 特に限定されるものでは ないが、 例えば [125 1 ] 、 [131 I ] 、 [3H] 、 [14C ] などが好ましい。 上記酵 素としては、 特に限定されるものではないが、 安定で比活性の大きなものが好ま しく、 例えば β —ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコシダ一ゼ、 アル力リフォスファ ターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。 上記蛍光物 質としては、 特に限定されるものではないが、 例えばフルォレスカミン、 フルォ レツセンィソチオシァネートなどが挙げられる。 上記発光物質としては、 特に限 定されるものではないが、 例えばルミノール、 ルミノール誘導体、 ノレシフェリン、 ルシゲニンなどが挙げられる。 さらに、 抗体と標識剤との結合には、 ピオチン一 ァビジン系の化合物を用いることもできる。 抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用い る方法でもよレ、。 担体としては、 例えばァガロース、 デキス トラン、 セルロース などの不溶性多糖類、 例えばポリスチレン、 ポリアクリルアミ ド、 シリコンなど の合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に 当業者の通常の技術的配慮を加えて CXCL14又はその誘導体の測定系を構築すれば よい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照する ことができる （例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 (講談社、 昭和 5 4年発行 ) 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら 編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「MethodS in ENZYM0LOGYJ Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) ) 、 同書 Vol. 73 ( Immunochemical Techniques (Part B) ) 、 同書 Vol. 74 ( Immunochemical Techniques (Part C) ) 、 同書 Vol. 84 ( Immunochemical Techniques (Part D : Selected Immunoassays) ) 、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods) ) 、 同書 Vol. 121 ( Immunochemi cal Techniques (Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行） など参照） 。 また、 本発明の抗体は、 CXCL14又はその誘導体を精製するために使用する抗体 カラムの作製、 精製時の各分画中の CXCL14又はその誘導体の検出、 被検細胞内に おける CXCL14又はその誘導体の挙動の分析などのために使用することもできる。
( 2 ) 本発明の抗体を含有してなる医薬
本発明の抗体 （特に、 ヒトモノクローナル抗体） は、 CXCL14 (BRAK) が関与す る疾患、 すなわち 2型糖尿病及び/又は肥満の予防 ·治療剤等の医薬の有効成分 として使用することができる。 当該医薬としては、 さらに、 白色脂肪組織中のマ ク口ファージの低減促進剤、 及びィンスリン抵抗性の改善剤も好ましく挙げられ る。
以下、 上記予防 ·治療剤としての医薬の使用について説明するが、 同様の説明 が上記低減促進剤及び改善剤の使用についても適用することができる。
本発明の抗体を含有してなる予防 ·治療剤は低毒"生であり、 そのまま液剤とし て、 又は適当な剤型の医薬組成物として、 ヒ ト又は哺乳動物 （例えば、 マウス） に対して非経口的又は経口的に投与することができる。 本発明の抗体は、 それ自 体を投与しても良いし、 又は適当な医薬組成物として投与しても良い。 投与に用 いられる医薬組成物としては、 本発明の抗体及びその塩と薬理学的に許容され得 る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。 このような医薬組 成物は、 経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。 非経口投与のため の組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤等が用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調製できる。 注射剤の調製方法として は、 例えば、 上記本発明の抗体又はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性 液、 又は油性液に溶解、 懸濁又は乳化することによって調製できる。 注射用の水 性液としては、 例えば、 生理食塩水、 プドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等 が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリ アルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール) 、 非イオン 界面活性剤 （例、 ポリソノレべー ト 80、 HC0-50 ( polyoxyethylene ( 50 mol ) adduct of hydrogenated castor oil) ) 等と併用してもよレ、。 油†生液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベ ンジルアルコール等を併用してもよい。 調製された注射液は、 適当なアンプルに 充填されることが好ましい。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体又はその塩 を通常の坐薬用基剤に混合することによつて調製されてもよレ、。
経口投与のための組成物としては、 固体又は液体の剤形、 具体的には錠剤 （糖 衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソ フ トカプセノレ剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このよう な組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用又は経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するような 投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形と しては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤が挙げら れる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜50 Omg程度、 と りわけ注射剤では 5〜 100 m g程度、 その他の剤形では 10〜250mg程度 の含有量が好ましい。 なお、 前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ま しくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよレ、。
本発明の抗体を含有する予防 ·治療剤としての医薬の投与量は、 投与対象、 対 象疾患、 症状、 投与ルート等によっても異なるが、 例えば、 成人の 2型糖尿病の 治療のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 0 1〜 2 Omg/k g体重程度、 好ましくは 0. ：！〜 l OmgZk g体重程度、 さらに 好ましくは 0. l〜5mg/k g体重程度を、 1日 1〜 5回程度、 好ましくは 1 日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 また、 成人の肥満 症の治療のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 0 1 ~2 Omg/k g体重程度、 .好ましくは 0. 1〜： 1 0mg/k g体重程度、 さ らに好ましくは 0. l〜5mgZk g体重程度を、 1日 1〜 5回程度、 好ましく は 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 2型糖尿病及 び肥満症の予防の場合、 あるいは、 他の非経口投与 （例、 皮下投与） 及ぴ経口投 与の場合も、 これらに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合に は、 その症状に応じて増量してもよい。
なお、 本発明の明細書において、 アミノ酸等を略号で表示する場合、 IUPAC - IUB Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野にお ける慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 アミノ酸に関し光学異性 体があり得る場合は、 特に明示しなければ L-体及び R-体のうち L-体を示すも のとする。
Gly ： グリシン Ala ：ァラニン
Val ：ノ リン Leu ： ロイシン lie ：イソロイシン Ser ：セリン
o b
Thr ： スレオニン し ys ： システィン
Met ： メチォニン Glu ： グノレタミン酸
Asp ： ァスノヽ°ラギン酸 Lys ： リジン
Arg ： アルギニン His ： ヒスチジン
Phe ： フエニノレアラニン Tyr ：チロシン
Trp ： トリプトファン Pro ： プロリン
Asn ： ァスノヽ°ラギン Gin ： グノレタミ ン
PAM ： フ土ニ ァセタミ ドメチル
Boc ： t-プチ/レオキシカルボニル
Fmoc ： 9 -フルォレニルメチノレオキシカルボ二ノレ
CI - Z ： 2 -ク口口一ベンジノレ;? 5"キシカノレボニニノレ
： 2 -ブロモーベンジノレォキシカルボ二ノレ
Bzl ：ベンジノレ
一 Bzl： 2—クロローべンジル
OcHex ： シクロへキシノレエステノレ
OBzl ：ベンジノレエステノレ
Tos ： p—トノレエンスノレホニノレ
H0NB ： N -ヒ ドロキシ- 5-ノルボルネン- 2, 3-ジカルボキシィミ ド
HOBt ： 1-ヒ ドロキシベンゾトリァゾール
HOOBt ： 3 -ヒ ドロキシ- 3， 4—ジヒ ドロ- 4 -ォキソ -1， 2， 3 -べンゾトリァジン
MeBzl : 4-メチルベンジル
Bom ：ベンジルォキシメチノレ
Bum ： t-ブトキシメチル
Trt ： トリチル
DNP ： ジニト口フエ二ノレ
TFA ： トリフルォロ酢酸
DMF ： N, N〜ジメチノレホルムアミ ド
DCM ： ジクロロメタン DCC ： N, N' -ジシクロへキシルカルボジィミ ド
BHA ：ベンズヒ ドリルァミン
pMBHA ： p -メチルベンズヒ ドリルァミン
CH0 ： ホルミル 以下に、 実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらに 限定されるものではない。
〔実施例 1〕
《材料と方法》
1 . 走化性試験
公的な細胞バンクよりそれぞれ入手したマウス骨格筋由来筋芽細胞株 C2C12 [American Type Culture Collection (ATCC)より入手〕 、 及びヒト単球系白血 病細胞株 THP - 1 (財団法人ヒューマンサイエンス財団研究資源バンク HSRRBより入 手） を、 10%ゥシ胎仔血清入りの Dulbecco' s modifies Eagle ' s medium (DMEM) 培地、 あるいは 10%ゥシ胎仔血清入りの RPMI- 1640培地にてそれぞれ培養し、 対 数増殖期にある細胞を実験に用いた。 C2C12細胞は 2 X 105個を 100 プレートに 接種し、 37°Cでー晚培養後、 最終濃度 20 μ Μになるように Forskolin (Sigma社） を添加して、 37°Cでさらに 2日間培養した。 THP - 1細胞については、 106個を 100 讓プレートに接種すると同時に Forskolinを最終濃度 20 z Mになるように添加して、 37°Cで 2日間培養した。 なお、 Forskolinは細胞内の cAMP濃度を高めて Aキナーゼ とその下流転写因子群を活性化する試薬である。 Forskolin刺激した THP - 1細胞株 は、 活性化マクロファージと類似した性質を有する細胞株として免疫学研究に広 く用いられている。
C2C12細胞に対してはマウス CXCL14 (R&D Systems社） を、 THP- 1細胞に対して はヒト CXCL14 (Peprotec社） をそれぞれ最終濃度 100 nMになるようにケモタクシ スバッファー 〔0. 1 % Fatty acid-free BSA (Sigma社） -20 mM HEPES pH 8. 0
(Invitrogen社） - DMEM〕 にて希釈し、 550 μ 1ずつ 24ゥェルプレートに入れた。 抗体による中和実験には、 ヒッジ抗マウス CXCL14ポリクローナル抗体 （AF730、 R&D Systems社） 、 又はラット抗マウス CXCL14モノクローナル抗体 （MAB730、 R&D Systems社） を、 それぞれ最終濃度 10 g/mlとなるように CXCL14を含むケモタク— シスバッファーに添加した。 次に、 C2C12細胞に対してはポアサイズ 8 μ πιの、 ΤΗΡ- 1細胞に対してはポアサイズ 5 mの Chemotaxicellミクロチャンパ一 （Kurabo 社） を反応液上部に静置した。 Forskolin刺激した C2C12細胞、 又は Forskolin刺 激した THP - 1細胞を、 ケモタクシスバッファ一にて一度洗浄してゥシ胎仔血清を 除去した後、 2 X 105個/ 200 μ ίずつ Chemotaxicellミクロチャンバ一に上層した。 上記のようにセットした 24ゥヱルプレートを、 37°Cで、 6時間 （C2C12細胞） 又は 2時間 （THP- 1細胞） 培養した。 反応終了後、 ただちにミクロチャンバ一上部の培 養液を除去し、 Diff- Quik (国際試薬社） を用いてミクロチャンバ一下部に付着 した細胞を固定 ·染色した。 ミクロチャンバ一上部に残存した細胞は綿棒を用い て除去した。 ミクロチャンバ一の膜を取り外しスライドガラスにマウントした後、 光学顕微鏡 （100倍） 下でポア周囲に移動した細胞の数をカウントした。 測定は 各サンプルにっき n = 4以上の検体を用い、 StatView- J5. 0 (SAS Institute社） を 用いて統計処理を行った。
2 . ウェスタンブロット角翠析
C2C12筋芽細胞株を、 5%ゥマ血清入りの DMEM培地にて 4日間培養し、 筋分化を 誘導した。 血清を除いた DMEM培地にて、 37°Cで 16時間培養した後、 筋細胞を 100 nMのマウス CXCL14 (R&D Systems社） にて 1時間処理し、 さらに 10 nMインスリン (Sigma社） を添加して 37°Cで 10分間刺激した。 抗体による中和実験には、 ヒッ ジ抗マウス CXCL14ポリクローナル抗体 （AF730、 R&D Systems社） を最終濃度 10 μ g/ mlとなるように CXCL14を含む前処理用の培地に添加した。 ネガティブコント ロールとして、 免疫していないヒッジの精製 IgGを添加した培地を用いた。 これ らの細胞を溶解し、 のタンパク質混合物を SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電 気泳動にかけ、 その後、 抗 Akt- PSer473抗体、 及び抗 Akt抗体 （Cell signaling 社） を用いてウェスタンブロット解析を行った。 なお、 Aktは、 プロテインキナ ーゼ B (PKB) とも呼ばれるセリン Zスレオニンキナーゼであり、 PI3キナーゼ経 路で活性化され、 インスリン代謝などの様々な現象に関与するものである。 《結果と考察》
CXCL14の代表的な生物活性である走化性について、 Chemotaxicellミクロチヤ ンバーを用いた in vitroアツセィにて解析した。 以前報告した通り （Nara N et al. , J. Biol. Chem. , vol. 282, p. 30794 - 30803， 2007) 、 筋分化させた C2C12 細胞は CXCL14に反応する。 そこで、 一般的な分化誘導試薬である Forskolinにて C2C12細胞を刺激した後に走化性試験にかけてみたところ、 マウス CXCL14による 細胞誘引が検出された （図 1) 。 同様の活性は、 ヒト CXCL14にも検出された （図 1) 。 マウス CXCL14とヒト CXCL14とはポリぺプチチドを構成する77アミノ酸残基 のうち 2残基しか異なっていないため （配列番号： 1及び配列番号： 2参照） 、 C2C12細胞に発現する受容体がヒ ト CXCL14と交叉反応したものと予想される。 次 に、 マウス CXCL14に対する特異的抗体を走化性試験液に添カ卩したところ、 マウス CXCL14による C2C12細胞の誘引がポリクローナル抗体 AF730によって 61%、 モノク ローナル抗体 MAB730によって 54 %、 それぞれ阻害された （図 2 ) 。 次に、 Forskolin刺激した THP-1細胞を用いて、 同様の走化性試験を行ったところ、 ヒト CXCL14による細胞誘引が抗マウス CXCL14ポリクローナル抗体 AF730の添加によつ て 79%阻害された （図 3) 。 以上の結果は、 CXCL14の標的細胞として肥満性イン スリン抵抗性の惹起に関与する 2種類の細胞 （骨格筋細胞と活性化マクロファー ジ） に対して、 抗 CXCL14特異的抗体の添加が CXCL14の生物活性を中和できること を示すものであった。 特に、 内蔵脂肪に蓄積した活性化マクロファージは、 肥満 性糖尿病の主要な悪化原因として知られているため、 その走化性を抑えることが できる抗 CXCL14抗体は、 抗糖尿病薬として利用できることが分かった。 なお、 抗 マウス CXCL14モノクローナル抗体 MAB730を THP - 1細胞のアツセィ系に添加した場 合には、 THP-1細胞のヒト CXCL14に対する走化性が逆に増強された （図 4) 。 この 現象のメカニズムはまだ不明だが、 CXCL14に対する特異的モノクローナル抗体は、 CXCL14の生物活性をネガティブにもポジティブにも制御できる可能性を示すもの であった。
分化した C2C12筋細胞では、 ィンスリン刺激による Aktキナーゼの第 473番目の セリン残基のリン酸化 （活性化状態） が CXCL14の前処理によつて部分阻害される ことが知られている （Nara N et al.， J. Biol. Chem. , vol. 282, p. 30794 - 30803, 2007) 。 そこで、 抗 CXCL14抗体が、 CXCL14によるインスリンシグナル阻 害活性を中和できるかどうかを検討した。 コントロール抗体存在下では、 マウス CXCL14の前処理によってリン酸化 Aktのパンドは薄くなつたが、 抗マウス CXCL14 ポリクローナル抗体 AF730の存在下では、 リン酸化 Aktのパンドは濃いままであつ た （図 5 ) 。 この結果は、 骨格筋細胞において、 抗 CXCL14特異的抗体の添加は CXCL14によるインスリンシグナルの阻害活性を中和できることを示すものであつ た。 骨格筋は、 インスリンによる血糖値調節を行う主要な組織である。 肥満によ つて骨格筋の CXCL14発現量も増加するため、 CXCL14によるィンスリンシグナルの 部分阻害も肥満による全身性のィンスリン抵抗性に寄与しているものと考えられ た。 抗 CXCL14抗体は、 糖尿病発症に関連する CXCL14の第二の活性に対しても、 有 効性を持つものと推測された。
Forskolin刺激した C2C12細胞を用いた検討では、 マウス CXCL14による細胞誘引 は別種のケモカイン CXCL12に対する応答と同様に、 百日咳毒素感受性であった。 従って、 CXCL14受容体は 3量体 Gタンパク質結合性の 7回膜貫通型タンパク質であ ると考えられるが、 現時点まで、 CXCL14受容体遺伝子はヒト及びマウスを含めて どの種においてもまだ単離同定されていない。 抗 CXCL14特異的抗体は、 肥満によ つて過剰産生された CXCL14によって惹起される前糖尿病状態を緩和するッールと して有用であるのみならず、 未解明のままである CXCL14の生理的機能や受容体構 造を解明していく上でも役立つものと考えられた。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 BRAK (CXCL14) の機能を抑制又は阻害する化合物、 特に BRAK を特異的に認識する抗体 （好ましくはヒトモノクローナル抗体） を提供すること ができる。 また本発明は、 該抗体を産生するハイブリ ドーマ細胞、 及び該抗体の 製造法を提供することができる。 さらに本発明は、 上記化合物 （特に抗 BRAK抗体 ) の用途として、 2型糖尿病及び肥満の診断薬、 2型糖尿病及び肥満の予防 '治 療剤、 白色脂肪糸且織中のマクロファージ数の低減促進剤、 インスリン抵抗性の改 善剤、 2型糖尿病及び肥満の予防 ·治療方法、 白色脂肪組織中のマクロファージ 数の低減促進方法、 ィンスリン抵抗性の改善方法などを提供することができる。 上記化合物 （特に抗 BRAK抗体） は、 2型糖尿病や肥満のリスクの診断薬として 利用できるとともに、 2型糖尿病に対する新しい治療薬となり、 またポテンシャ ルとして肥満軽減薬にもなる点で、 極めて有用なものである。

Claims

請求 の 範 囲
I . 配列番号： 1若しくは配列番号： 2で表されるァミノ酸配列を含有するポリ ぺプチド又はその誘導体、 あるいはそれらの部分べプチドを認識する抗体。
2. モノクローナル抗体である請求項 1記載の抗体。
3. ヒト型化抗体又はヒト抗体である請求項 1記載の抗体。
4. 標識化された請求項 1記載の抗体。
5. 白色脂肪組織中のマクロファージ数の低減促進活性を有する請求項 1記載の 抗体。
6. インスリン抵抗性の改善活性を有する請求項 1記載の抗体。
7. 請求項 1記載の抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞。
8. 請求項 7記載のハイブリ ドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、 その体液 又は培養物から請求項 1記載の抗体を採取することを特徴とする、 請求項 1 記載の抗体の製造法。
9. 請求項 1記載の抗体を含有してなる診断薬。
10. 2型糖尿病及び/又は肥満の診断に用いる請求項 9記載の診断薬。
I I . 請求項 1記載の抗体を含有してなる医薬。
1 2. 2型糖尿病及び/又は肥満の予防 ·治療剤である請求項 1 1記載の医薬。
1 3. 白色脂肪組織中のマク口ファージ数の低減促進剤である請求項 1 1記載の 医薬。
14. インスリン抵抗性の改善剤である請求項 1 1記載の医薬。
1 5. 哺乳動物に対して、 請求項 1記載の抗体の有効量を投与することを特徴と する 2型糖尿病及び Z又は肥満の予防 ·治療方法。
16. 哺乳動物に対して、 請求項 1記載の抗体の有効量を投与することを特徴と する白色脂肪組織中のマク口ファージ数の低減促進方法。
1 7. 哺乳動物に対して、 請求項 1記載の抗体の有効量を投与することを特徴と するインスリン抵抗性の改善方法。
1 8. 2型糖尿病及び/又は肥満の診断薬を製造するための請求項 1記載の抗体 の使用。
1 9 . 2型糖尿病及び/又は肥満の予防 ·治療剤を製造するための請求項 1記載 の抗体の使用。
2 0 . 白色脂肪組織中のマクロファージ数の低減促進剤を製造するための請求項 1記載の抗体の使用。
2 1 . インスリン抵抗性の改善剤を製造するための請求項 1記載の抗体の使用。
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