WO2004106382A1 - 抗体およびその用途 - Google Patents

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WO2004106382A1
WO2004106382A1 PCT/JP2004/007667 JP2004007667W WO2004106382A1 WO 2004106382 A1 WO2004106382 A1 WO 2004106382A1 JP 2004007667 W JP2004007667 W JP 2004007667W WO 2004106382 A1 WO2004106382 A1 WO 2004106382A1
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seq
amino acid
antibody
acid sequence
antibody according
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Masaaki Mori
Yukio Shimomura
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones

Definitions

  • the present invention is represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11
  • the present invention relates to a novel antibody having binding specificity for a polypeptide containing an amino acid sequence or a salt thereof.
  • a method for quantifying the polypeptide or a salt thereof based on an antigen-antibody reaction a disease involving the polypeptide or a salt thereof utilizing neutralizing activity (eg, anorexia nervosa, obesity, renal edema, antidiuresis Diagnosis and prevention of hormone secretion inadequate syndrome, diabetes insipidus, upper gastrointestinal tract disease, hyperacidity, etc.)
  • neutralizing activity eg, anorexia nervosa, obesity, renal edema, antidiuresis Diagnosis and prevention of hormone secretion inadequate syndrome, diabetes insipidus, upper gastrointestinal tract disease, hyperacidity, etc.
  • GPR8 ligand in the present specification is used as an in vivo ligand for human GPR7 and human GPR8 (Genomics, Vol. 28, pp. 84-91, 1995, TO 95/12670) which are G protein-coupled receptors. Or may be described as neuropeptide W) (W01 / 98494, W02 / 44368, J. Biol. Chem., 277, 35826-35832, 2002). . NPW has also been shown to be a ligand for rat or mouse GPR7 (the same receptor as TGR26 described in WO 02/44368) (WO 02/44368, J. Biol.
  • amino acid represented by SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7
  • SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9
  • SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 1st to 3rd, 1st to 4th, 1st to 5th, 1st to 6th, 1st
  • AW23N2 G6D1 (FERM BP-8363), the antibody according to the above (7), which can be produced from a hybridoma cell, which is produced by AhW23N2 G6D1a,
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 which has a neutralizing activity against a peptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 16th to 23rd, 17th to 23rd, 18th to 2nd of amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 Specific to the C-terminal partial polypeptide of the amino acid sequence-containing polypeptide or its salt Antibodies that react with
  • a diagnostic agent comprising the antibody according to (1), (14) and / or (27) above,
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 9, wherein the antibody described in (1) above is used.
  • No .: 10 or SEQ ID NO: 11 A method for quantifying a polypeptide containing the amino acid sequence represented by 11, or a salt thereof,
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, characterized by using the antibody described in (14) above, or a polypeptide thereof.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, characterized by using the antibody described in (27) above, or A method for determining the salt,
  • polypeptide comprising the antibody of (27) above and a test and labeled amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 Or reacting with a salt thereof in a competitive manner, and measuring the ratio of the labeled polypeptide or a salt thereof bound to the antibody, wherein SEQ ID NO: 5, Quantitative method for polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or a salt thereof,
  • the activity of the labeling agent is measured, or 2) the antibody described in (14) insoluble on a carrier,
  • a method for diagnosing a disease involving a polypeptide or a salt thereof comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11,
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, characterized by using the antibody described in (14) above, or a polypeptide thereof. Diagnostic methods for diseases involving salt,
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, characterized by using the antibody described in (27) above, or a polypeptide thereof. Diagnostic methods for diseases involving salt,
  • FIG. 1 shows the inhibition of the binding between monoclonal antibody 2G6-D1 and biotin-labeled peptide-1 by peptide-1, human NPW23 or human NPW30.
  • one indicates the case where peptide-1 was added
  • the other indicates the case where human NPW23 was added
  • the one indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 2 shows the binding inhibition by peptide-1, human NPW23 or human NPW30 on the binding between the monoclonal antibody 3H3-E4 and the biotin-labeled peptide-1.
  • one indicates the case where peptide-1 was added, the other indicates the case where human NPW23 was added, and the one indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 3 shows the inhibition of binding between the monoclonal antibody 5E6-C3 and the peptide-1 labeled with biotin by peptide-1, human NPW23 or human NPW30.
  • One shows the case where peptide-1 was added, the other one shows the case where human NPW23 was added, and the one shows the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 4 shows the binding inhibition by peptide-1, human NPW23 or human NPW30 on the binding between the monoclonal antibody 7F9-E12 and piotin-labeled peptide-1.
  • one indicates the case where peptide-1 was added
  • one indicates the case where human NPW23 was added
  • one ⁇ indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 5 shows the binding inhibition by peptide-2, human NPW23 or human NPW30 to the binding between monoclonal antibody 2F1B2A and piotin-labeled peptide-2.
  • — ⁇ — indicates the case where peptide-2 was added
  • —mouth— indicates the case where human NPW23 was added
  • — ⁇ — indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 6 shows the binding inhibition by peptide-2, human NPW23 or human NPW30 to the binding between monoclonal antibody 5A2A and biotin-labeled peptide-2.
  • “1” indicates the case where peptide-2 was added
  • “1” indicates the case where human NPW23 was added
  • “ ⁇ 1” indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 7 shows the binding inhibition by peptide-2, human NPW23 or human NPW30 to the binding between monoclonal antibody 5D6-F10 and piotin-labeled peptide-2.
  • “-” indicates the case where peptide-2 was added
  • “-” indicates the case where human NPW23 was added
  • “-” indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 8 shows the binding inhibition by peptide-2, human NPW23 or human NPW30 to the binding between monoclonal antibody 5G2-F6 and piotin-labeled peptide-2.
  • one shows the case where peptide-2 was added, the other one shows the case where human NPW23 was added, and the one shows the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 9 shows the binding inhibition by peptide-2, human NPW23 or human NPW30 to the binding between the monoclonal antibody 6G1-H8 and the biotin-labeled peptide-2.
  • “-” indicates the case where peptide-2 was added
  • “-” indicates the case where human NPW23 was added
  • “-” indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 10 shows the binding inhibition by peptide-2, human NPW23 or human NPW30 to the binding between monoclonal antibody 7B4-D2 and piotin-labeled peptide-2.
  • one column indicates the case where peptide-2 was added, and one column indicates the case where human NPW23 was added.
  • ⁇ - indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 11 shows the binding inhibition by peptide-3, human NPW23 or human NPW30 to the binding between monoclonal antibody 2A1A and piotin-labeled peptide-3.
  • one indicates the case where peptide-3 was added one indicates the case where human NPW23 was added, and one indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 12 shows the binding inhibition by peptide-3, human NPW23 or human NPW30 on the binding between monoclonal antibody 3A1A and peptin-labeled peptide-3.
  • “1-1” indicates the case where peptide-3 was added
  • “ ⁇ ” indicates the case where human NPW23 was added
  • “1-1” indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 13 shows the binding inhibition by peptide_3, human NPW23 or human NPW30 on the binding between the monoclonal antibody 7F2-E8 and the biotin-labeled peptide-3.
  • one indicates the case where peptide-3 was added one indicates the case where human NPW23 was added, and one ⁇ - indicates the case where human NPW30 was added.
  • FIG. 14 shows the suppression of the cAMP synthesis inhibitory activity of human NPW23 by the NPW amino terminal recognition monoclonal antibody. The case where it is added to human GPR7 expressing cells is shown.
  • FIG. 15 shows suppression of the cAMP synthesis inhibitory activity of human NPW23 by an NPW amino terminal-recognizing monoclonal antibody. The case where it is added to human GPR8 expressing cells is shown.
  • FIG. 16 shows the suppression of the cAMP synthesis inhibitory activity of rat NPW23 by the NPW amino terminal recognition monoclonal antibody.
  • ' Figure 17 shows the inhibition of rat NPW23 and rat NPW30 cAMP synthesis inhibitory activity by monoclonal antibody 2G6-D1.
  • the mouth indicates the case where only rat NPW was added
  • the Xiang indicates the case where rat NPW and 2G6-D1 antibody were added.
  • FIG. 18 shows suppression of rat NPW23 cAMP synthesis inhibitory activity by a NPW23 lipoxyl end-recognizing monoclonal antibody.
  • FIG. 19 shows the inhibition of rat NPW30 cAMP synthesis inhibitory activity by NPW30 lipoxyl end-recognizing monoclonal antibody.
  • FIG. 20 shows the absorbance at 450 nm when various concentrations of human NPW23 and rat (mouse) NPW23 were added to the EIA system using the monoclonal antibody 2F1B2A.
  • ⁇ indicates the case where human NPW23 was added
  • —Mouth indicates the rat (mouse). The case where NPW23 was added is shown.
  • FIG. 21 shows the absorbance at 450 gall when various concentrations of human NPW23 and rat (mouse) NPW23 were added to the EIA system using the monoclonal antibody 5A2A.
  • — ⁇ indicates the case where human NPW23 was added
  • ⁇ indicates the case where rat (mouse) NPW23 was added.
  • FIG. 22 shows the absorbance at 450 nm when various concentrations of human NPW23 and rat (mouse) NPW23 were added to the EIA system using the monoclonal antibody 5D6-F10.
  • “1-1” indicates the case where human NPW23 was added
  • “-” indicates the case where rat (mouse) NPW23 was added.
  • FIG. 23 shows the absorbance at 450 nm when various concentrations of human NPW23 and rat (mouse) NPW23 were added to the EIA system using the monoclonal antibody 5G2-F6.
  • — ⁇ indicates the case where human NPW23 was added
  • —Low indicates the case where rat (mouse) NPW23 was added.
  • FIG. 24 shows the absorbance at 450 nm when various concentrations of human NPW23 and rat (mouse) NPW23 were added to the EIA system using the monoclonal antibody 6G1-H8.
  • one square indicates the case where human NPW23 was added, and one square indicates the case where rat (mouse) NPW23 was added.
  • FIG. 25 shows the absorbance at 450 nm when various concentrations of human NPW23 and rat (mouse) NPW23 were added to the EIA system using the monoclonal antibody 7B4-D2.
  • - ⁇ - indicates the case where human NPW23 was added
  • -Low indicates the case where rat (mouse) NPW23 was added.
  • FIG. 26 shows the absorbance at 450 nm when various concentrations of human NPW30, rat NPW30, mouse NPW30 and pig NPW30 were added to the EIA system using the monoclonal antibody 2A1A.
  • “-” indicates the case where human NPW30 was added
  • “-” indicates the case where rat NPW30 was added
  • “-” indicates the case where mouse NPW30 was added
  • “-” indicates the case where human NPW30 was added.
  • Each case is shown.
  • Figure 27 shows the absorbance in 450 dishes when various concentrations of human NPW30, rat NPW30, mouse NPW30 and bushu NPW30 were added to the EIA system using monoclonal antibody 3A1A.
  • one part shows the case where human NPW30 was added, and one part NPW30 was added, ⁇ indicates the case where mouse NPW30 was added, and ⁇ indicates the case where busi NPW30 was added.
  • Fig. 28 shows the absorbance at 450 nm when various concentrations of human NPW30, rat NPW30, mouse NPW30 and bushu NPW30 were added to the EIA system using the monoclonal antibody 7F2-E8.
  • one shows the case where human NPW30 was added the other one shows the case where rat NPW30 was added
  • the one shows the case where mouse NPW30 was added Each case is shown.
  • the protein has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (capilloxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide labeling.
  • the protein used in the present invention including the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, may have any one of a carboxyl group, a carboxylate, and an amide or ester at the C-terminal. .
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or Poly containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • peptides include: (1) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 (1) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11, an amino acid sequence in which a number (1-5) amino acids have been inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, or (3) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: such polypeptides the number (1
  • Polypeptide salts include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, Salts with organic acids) and bases (eg, alkali metals, etc.) are used, and particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, Salts with organic acids
  • bases eg, alkali metals, etc.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid.
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or Poly containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11
  • partial peptides on the N-terminal side of peptides or salts thereof include, for example,
  • the partial peptide on the C-terminal side of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 or a salt thereof is, for example, SEQ ID NO: No .: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10
  • the partial peptide on the C-terminal side of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof is, for example, SEQ ID NO: : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11
  • the antibody that specifically reacts with the N-terminal partial peptide of the peptide or its salt may be any antibody that specifically reacts with the N-terminal partial peptide of the polypeptide or its salt, for example.
  • a monoclonal antibody is used.
  • a peptide containing the amino acid sequence of 1 to 13 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, the amino acid sequence of 1 to 13 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 have, (preferably, monoclonal antibodies) antibodies you specifically reactive with a polypeptide having an amino acid sequence obtained by replacing the 14th amino acid sequence in parentheses Cys_NH 2 and the like are used.
  • amino acid represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 It does not recognize the partial peptide on the C-terminal side of the polypeptide containing the sequence or its salt.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 An antibody that neutralizes the activity of a polypeptide or a salt thereof containing
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 When added at a molar ratio of 1- to 1000-fold, preferably 1- to 100-fold, more preferably 1- to 10-fold the activity of the polypeptide or a salt thereof (e.g., Cell stimulating activity on cells expressing human GPR8, human GPR7, rat GPR7 or mouse GPR7 (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAM.P generation and suppression, intracellular cGMP generation , Inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c_fos, lowering of pH, G Activity, such as promoting TP rs binding activity, etc.)
  • the polypeptide or a salt thereof e.g., Cell
  • Antibodies that suppress 50% or more, more preferably 80% or more, and the like.
  • Preferred specific examples include a monoclonal antibody indicated by AhW23N2G6D1a, a monoclonal antibody indicated by AhW23N3H3E4a, and the like.
  • Antibodies that specifically react with the N-terminal partial peptide of the contained polypeptide or a salt thereof include (a) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, (I) the first to third amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11;
  • Antibodies that specifically react with are also included in the present invention. Among them, antibodies having a neutralizing activity against the above polypeptide (eg, monoclonal antibodies).
  • binding site is a site where the monoclonal antibody represented by AhW23N2G6D1a or the monoclonal antibody represented by AhW23N3H3E4a binds. It is sufficient if they are present, and preferably a specific binding site, an epitope.
  • An antibody which specifically reacts with the C-terminal partial peptide of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 or a salt thereof is For example, specific to the partial peptide at the C-terminal side of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof.
  • Any monoclonal antibody may be used as long as it reacts, preferably a monoclonal antibody.
  • An antibody preferably a monoclonal antibody that specifically reacts with a polypeptide having an amino acid sequence of up to the third position and an amino acid sequence in which Cys is added to the first position of the parentheses is used.
  • an antibody that neutralizes the activity of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 or a salt thereof.
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or a salt thereof 1 to 100 times, Preferably 1 to 100 times, more preferably 1 to 10 times mol
  • the activity of the polypeptide or a salt thereof e.g., cell stimulating activity on cells expressing human GPR8, human GPR7, rat GPR7 or mouse GPR7 (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, Intracellular Ca 2+ release, Intracellular cAMP production and suppression, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c-fos, Decrease in 'H, GTP T S binding activity, etc., such as promoting activity), etc.] 10% or more, such as preferably 50% or more, more preferably inhibits 80% antibody.
  • Preferred specific examples e.g.
  • an antibody that specifically reacts with a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 or a partial peptide on the C-terminal side of a salt thereof Is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, (i) the 16th to 23rd amino acid sequence, (ii) 17th to 23rd The amino acid sequence at the th position, (iii) the amino acid sequence at the 18th to 23rd position, (iv) the amino acid sequence at the 19th to 23rd position, (v) the amino acid sequence at the 20th to 23rd position, (vi) the 21st to 23rd position
  • An antibody that specifically reacts with the binding site for the contained polypeptide eg, (A nal antibody) are also included in the present invention.
  • antibodies having neutralizing activity against the above polypeptide eg, monoclonal antibodies).
  • the ⁇ binding site '' may be any site that binds a monoclonal antibody represented by AhW23N2 G6D1a or a monoclonal antibody represented by AhW23N3H3E4a, and preferably specifically binds. It is a part, an epitop.
  • An antibody that specifically reacts with a partial peptide on the C-terminal side of a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or a salt thereof Is, for example, specific to the partial peptide at the C-terminal side of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or a salt thereof.
  • Any monoclonal antibody may be used as long as it reacts, preferably a monoclonal antibody.
  • a peptide containing the 16th to 30th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, the 16th to 30th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 An antibody (preferably a monoclonal antibody) which has an amino acid sequence and specifically reacts with a polypeptide having an amino acid sequence obtained by adding Cys to the 16th amino acid sequence of parentheses is used.
  • an antibody that neutralizes the activity of the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, or a salt thereof.
  • the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof is 1 to 1000 times, preferably 1 to 1000 times.
  • the activity of the above-mentioned polypeptide or a salt thereof eg, cell stimulating activity on cells expressing human GPR8, human GPR7, rat GPR7 or mouse GPR7 (eg, , Arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ migration Promotes release, suppression of intracellular CAMP, generation of intracellular cGMP, production of inositol phosphate, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular protein, activation of c-fos, reduction of pH, GTPr S binding activity, etc. , Etc.), preferably at least 50%, more preferably at least 80%.
  • Preferred specific examples include a mono
  • the antibody specifically reacts with the partial peptide at the C-terminal side of the polypeptide or its salt containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11
  • the antibody include: (i) the 23rd to 30th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, @ 3, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11, (ii) 24th to 30th amino acid sequence, (iii) 25th to 30th amino acid sequence, (iv) 26th to 30th amino acid sequence, (v) 27th to 30th amino acid sequence, (vi) 28th amino acid sequence (Vii) amino acid sequence at positions 23-29, (viii) amino acid sequence at positions 24-29, (ix) amino acid sequence at positions 25-29, (X) amino acid sequence at positions 26- Amino acid sequence at position 29, (xi) amino acid sequence at positions 27-29, (xii) amino acid sequence at positions 23-28
  • the monoclonal antibody represented by ArW30C3A1Aa or the monoclonal antibody represented by ArW30C7F2E8 is represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11
  • An antibody eg, a monoclonal antibody that specifically reacts with a binding site for a polypeptide containing the amino acid sequence to be determined is also included in the present invention.
  • antibodies having neutralizing activity against the above polypeptide eg, monoclonal antibodies).
  • binding site the monochrome indicated by ArW30 C 3 Al Aa —A site to which a null antibody or a monoclonal antibody represented by ArW30C7F2E8 binds may be used, and a specific binding site, epitope is preferable.
  • amino acid represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 An antibody that specifically reacts with a partial peptide at the N-terminal side of a polypeptide containing an acid sequence or a salt thereof, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 An antibody that specifically reacts with the C-terminal partial peptide of the polypeptide containing the amino acid sequence or the salt thereof, and SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 11 An antibody that specifically reacts with a partial peptide at the C-terminal side of a polypeptide having the amino acid sequence represented or a salt thereof
  • antigen used for preparing the antibody of the present invention examples include: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 Has one or more antigenic determinants identical to the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or a salt thereof (hereinafter, also referred to as NPW). Any peptide such as a synthetic peptide can be used (hereinafter, these may be simply referred to as NPW antigen).
  • NPWs are prepared from (a) mammalian tissues or cells such as humans, monkeys, rats, mice, etc. using known methods or equivalent methods, and (b) known methods using peptide synthesizers and the like. And (c) culturing a transformant containing a DNA encoding NPW.
  • tissue or cells are homogenized, and then extracted with an acid or alcohol, and the extracted solution is subjected to salting out, dialysis, and gel. Filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography Purification and isolation can be performed by combining chromatography such as chromatography and affinity chromatography.
  • the synthetic peptide may be, for example, one having the same structure as the above-mentioned NPW antigen purified from nature, or three or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • a peptide containing one or more amino acids identical to the amino acid sequence at an arbitrary position consisting of eight or more amino acids is used.
  • the DNA can be prepared by a known cloning method [for example, Molecular Cloning (2nd ed .; J. Sambrook et al., Cold Springing). Harbor Lab. Press, 1989)].
  • the cloning method includes: (1) using a DNA probe or DNA primer designed based on the amino acid sequence of NPW, obtaining a transformant containing DNA encoding NPW from a cDNA library by a hybridization method. Or (2) a method using a DNA primer designed based on the amino acid sequence of NPW to obtain a transformant containing DNA encoding NPW by PCR.
  • the peptide as an NPW antigen can be obtained by (1) according to a known peptide synthesis method, or (2) SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, sequence
  • the polypeptide can be produced by cleaving a polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 with an appropriate peptidase.
  • the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the peptide with the remaining portion and, when the product has a protecting group, removing the protecting group.
  • Known methods for condensation and elimination of the protective group include, for example, the methods described in the following (i) to (ii).
  • the peptide can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method.
  • the peptide is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method.
  • a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4 -Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl FM ocaminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide according to various known condensation methods.
  • the peptide is cleaved from the resin and at the same time, various protecting groups are removed to obtain the desired peptide.
  • a partially protected peptide may be taken out using a chlorotrityl resin, an oxime resin, a 4-hydroxybenzoic acid-based resin, or the like, and the protecting group may be removed by a conventional means to obtain a desired peptide.
  • sulfoimides include DCC, N, N'-diisopropylcarboimide, and N-ethyl-'' (3-dimethylaminoprolyl) carbopimide.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, H ⁇ Bt, HO tBt, etc.), or the symmetric acid anhydride or HOB t ester or HO ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ It can be added to the resin after activating the amino acid protected in advance as a Bt ester.
  • a racemization inhibitor additive eg, H ⁇ Bt, HO tBt, etc.
  • HOB t ester e.g., symmetric acid anhydride or HOB t ester or HO ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ It can be added to the resin after activating the amino acid protected in advance as a Bt ester.
  • the solvent used for activation of the protected amino acid or condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the peptide condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide; tertiary amines such as pyridine; ethers such as dioxane and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; An appropriate mixture or the like is used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 to about 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in about 1.5 to about 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting amino acid include Z, B oc, aryl pentyl oxycarbonyl, isopolnyoxy carbonyl, 4-methoxybenzyloxy carbonyl, CI — Z, Br — Z, adamantyloxycarponyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinochioil, Fmoc and the like.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for the esterification include, for example, lower (C ⁇ ) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarponyl group.
  • groups suitable for etherification include, for example, benzene Examples include a jyl group, a tetrahydroviranyl group, and a short-butyl group.
  • Examples of the phenolic hydroxyl-protecting group of tyrosine include Bz1, C1-Bz1,2-nitrobenzyl, Br-Z, and t-butyl.
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, Bom, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like.
  • Activated carboxyl groups in the raw materials include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, and active esters [alcohols (for example, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 —Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, HOB t)].
  • the activated amino group of the raw material includes, for example, the corresponding phosphoramide.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon in a stream of hydrogen, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon in a stream of hydrogen, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of -20 to 40 ° C.
  • anisole, phenol, thioanisole, methacrylate, paracresol, dimethyl sulfide, 1, 4 It is effective to add a cation capture agent such as butanedithiol and 1,2-ethanedithiol.
  • a cation capture agent such as butanedithiol and 1,2-ethanedithiol.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane described above.
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide, dilute ammonia, etc. '
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • the peptide chain is extended to a desired chain length on the amino group side.
  • a peptide was prepared by removing only the protecting group of the amino-terminal amino group of the peptide chain and a peptide (or amino acid) by removing only the protecting group of the carboxyl group at the C-terminus. Condensate in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude peptide. The crude peptide is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired peptide.
  • the ⁇ -carboxyl group of the amino acid at the end of the amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then the ester of the desired peptide is prepared in the same manner as the amide of the peptide. Obtainable.
  • the NPW antigen can also be used to directly immunize the insolubilized one. Further, a complex in which the NPW antigen is bound or adsorbed to an appropriate carrier may be immunized.
  • the mixing ratio of the carrier (carrier) and the NPW antigen (hapten) is determined by the ratio of what kind and what ratio of the antibody to the NPW antigen bound or adsorbed to the carrier, if the antibody can be efficiently produced.
  • the hapten antigen may be adsorbed by binding or adsorbing a natural or synthetic polymer carrier commonly used in the production of antibodies against the hapten antigen in a weight ratio of 0.1 to 100 with respect to 1 hapten. Can be used.
  • Natural polymer carriers include, for example, serum albumin of mammals such as horses, egrets and humans, and thyroglobulin of mammals such as horses and egrets, and mammals such as horses, egrets, humans, and higgies. Animal hemoglobin and keyhole limpet hemocyanin are used.
  • synthetic polymer carrier for example, various latexes such as polymers or copolymers such as polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polyviers, and polypropylenes can be used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • diazonium compounds such as bisdiazobenzidine which crosslink tyrosine, histidine, and tributofan; dialdehyde compounds such as dalyl aldebito which crosslink amino groups; diisocyanate compounds such as toluene-1,2,4-diisocyanate; thiol.
  • dimaleimide compounds such as N, ⁇ '-o-phenylenedimaleimide, which bridge groups, maleimide active ester compounds, which bridge an amino group and a thiol group, carpoimide compounds, which crosslink an amino group with a lipoxyl group, etc. Is conveniently used.
  • a thiol group is introduced by reacting an active ester reagent having a dithiopyridyl group with one of the amino groups (for example, SPDP) and then reducing the same to introduce the thiol group. After the maleimide group is introduced into the group with a maleimide active ester reagent, both can be reacted.
  • the NPW antigen is administered to a warm-blooded animal alone or together with a carrier or diluent to a site where antibody production is possible, by an administration method such as intraperitoneal injection, intravenous injection, or subcutaneous injection.
  • Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, about 2 to 10 times in total.
  • Examples of the warm-blooded animal include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens. Mice are preferably used for preparing monoclonal antibodies.
  • a warm-blooded animal immunized with the NPW antigen for example, a mouse with an antibody titer was selected from the mouse, and the spleen or lymph node was collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an anti-NPW monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the anti-NPW antibody titer in the serum is performed, for example, by reacting the labeled NPW described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • a fusion promoter Render recall (PEG), Sendai virus and the like can be mentioned, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP 2/0, AP_1 and the like, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of bone marrow cells used is usually about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is about 10 to ⁇ 0%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, usually for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used to screen anti-NPW antibody-producing haploidomas. For example, add the hybridoma culture supernatant to a solid phase (eg, microplate) on which NPW or its partial peptide is adsorbed directly or together with a carrier. Then, add an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is a mouse) or protein A labeled with a radioactive substance or enzyme, and bind to the solid phase.
  • a solid phase eg, microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is a mouse
  • protein A labeled with a radioactive substance or enzyme bind to the solid phase.
  • a method for detecting anti-NPW monoclonal antibodies that have been isolated adding the hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immune globulin antibody or protein A has been adsorbed, adding NPW labeled with a radioactive substance, enzyme, etc., and binding to the solid phase And a method for detecting the NPW monoclonal antibody.
  • Screening and breeding of anti-NPW monoclonal antibodies are usually performed in animal cell culture medium (eg, RPMI 1640) containing 10-20% fetal bovine serum with the addition of HAT (hypoxanthine, aminobuterin, thymidine). .
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the anti-NPW antibody titer in the antiserum described above.
  • Separation and purification of anti-NPW monoclonal antibodies can be performed by the same method as that used for ordinary polyclonal antibody separation and purification (e.g., salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers). (E.g., DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific antibody obtained by collecting only the antibody with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody Purification method etc.].
  • DEAE adsorption / desorption method
  • ultracentrifugation method ultracentrifugation method
  • gel filtration method antigen-binding solid phase or specific antibody obtained by collecting only the antibody with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody Purification method etc.
  • the hybridoma cells are cultured in vivo or in vitro in a warm-blooded animal, and the antibody is collected from the body fluid or culture, whereby the antibody of the present invention is obtained.
  • Screening for hybridomas that produce anti-NPW antibodies that react with some regions of NPW and those that produce anti-NPW monoclonal antibodies that react with NPW but do not react with some regions For example, it can be carried out by measuring the binding between a peptide corresponding to a partial region thereof and an antibody produced by a hybridoma.
  • NPW can be measured or detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2, Fab' or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, the antigen, or the antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (for example, the amount of NPW) in the liquid to be measured can be measured chemically or Any measurement method may be used as long as it is detected by physical means and is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • a sandwich method, a competition method, an immunometric method, a nephelometry and the like are used. From the viewpoint of sensitivity and specificity, a sandwich method and a competition method described later are preferable, and a sandwich method is particularly preferable.
  • the activity of the labeling agent is measured to quantify NPW in the test wave.
  • the activity of the labeling agent is measured to quantify NPW in the test wave.
  • the antibody that specifically reacts with the partial peptide at the N-terminal side of NPW is a monoclonal antibody represented by AhW23N2G6Dla or a monoclonal antibody represented by AhW23N3H3E4a, which is specific to the partial peptide at the C-terminal side of NPW.
  • the antibody that reacts with (a) is (a) a monoclonal antibody represented by AhW23C6GlH8a or a monoclonal antibody represented by AhW23C5G2F6a, or (b) a monoclonal antibody represented by ArW30C3AlAa or a monoclonal antibody represented by ArW30C7F2E8a. is there.
  • These antibodies are, for example, horseradish peroxidase.
  • a test wave is reacted with an insolubilized antibody of the present invention (primary reaction), and then a labeled antibody of the present invention is reacted (secondary reaction).
  • primary reaction an insolubilized antibody of the present invention
  • secondary reaction a labeled antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed at the same time or at different times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be.
  • the antibody used in the primary reaction recognizes the partial peptide on the C-terminal side of NPW
  • the antibody used in the secondary reaction is the partial peptide on the C-terminal side.
  • the antibody used in the secondary reaction should be N-terminal.
  • An antibody that recognizes other than the above partial peptide (that is, the C-terminal side) is preferably used.
  • the antibody of the present invention, the test solution and the labeled NPW are allowed to react competitively, and the ratio of the labeled NPW bound to the antibody is measured to determine the NPW in the test solution. .
  • This reaction method is performed using, for example, a solid phase method.
  • an anti-mouse IgG antibody manufactured by ICN / CAPPEL
  • ICN / CAPPEL an anti-mouse IgG antibody
  • a solid phase and a liquid phase are separated after a competitive reaction of a protein in a test wave and a solid-phased antigen with a fixed amount of a labeled antibody of the present invention is performed. Reacts the antigen in the test wave with an excessive amount of the labeled antibody of the present invention, and then adds the solid-phased antigen to allow the unreacted labeled antibody of the present invention to bind to the solid phase. Separate the solid and liquid phases. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • Nephrometry measures the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in solution. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry using laser scattering is preferably used.
  • Examples of the labeling agent used in the assay method using labeling substances e.g., a radioactive isotope (e.g., [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4] , [ 14 C], [ 32 P], C 33 P), [], etc.), fluorescent substances [eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Biosciences) ), Etc.), fluorescamine, fluorescein isothiosinate, etc.), enzymes' (eg, 3-galactosidase,
  • the insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used.
  • a method using a chemical bond used for insolubilizing or immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, and synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass.
  • An NPW measurement system may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method.
  • you can refer to reviews, compendiums, etc. [For example, Hiroshi Irie, edited by “Radio Nonotsusei” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie Ed. “Continuing Radio Imnoatssey” (Kodansha, published in 1979), Eiji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay” (Medical Shoin, published in 1978), Eiji Ishikawa et al.
  • a disease involving NPW eg, Anorexia nervosa, obesity (e.g., malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity , Symptomatic obesity, pediatric obesity, upper body obesity, dietary obesity Dysfunction, hypogonadism, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.), pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormalities, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence
  • a disease involving NPW eg, Anorexia nervosa, obesity (e.g., malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinulinic obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity , Symptomatic obesity, pediatric obesity, upper body obesity, dietary obesity Dys
  • NPW in body fluids is quantified, and when the amount of NPW is higher than normal, for example, the blood concentration is about 10 fmol / ml or more, preferably about 15 fmol / ml or more. If so, diagnose as hyperacidity.
  • the antibody of the present invention has NPW activity (e.g., GPR7 binding activity, GPR8 binding activity, GPR7 cell stimulatory activity, GPR8 cell stimulating activity, feeding-suppressing action, prolactin-producing action, antidiuretic action, gastric acid secretion).
  • NPW activity e.g., GPR7 binding activity, GPR8 binding activity, GPR7 cell stimulatory activity, GPR8 cell stimulating activity, feeding-suppressing action, prolactin-producing action, antidiuretic action, gastric acid secretion.
  • NPW neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-derived neuropeptide-like neuropeptide, etc.
  • NSADH antidiuretic hormone secretion inadequate syndrome
  • hypertension upper gastrointestinal tract disease
  • digestion Ulcers eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer,
  • Dyspeps ia gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, gastric hyperacidity, ulcers, etc.
  • prophylactic / therapeutic agents for infertility, renal edema, peptic ulcer and hyperacidity are preferred.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for parenteral administration include, for example, injections, suppositories and the like.
  • Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Dosage forms.
  • Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, and the like, suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, It may be used in combination with propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated catalyst)], and the like.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the i- injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • a suppository for rectal administration is prepared by mixing the antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions, etc. I can do it.
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and tablets for tablets.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dose of the active ingredient.
  • the dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially 5 to 100 mg for each dosage unit.
  • other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the above antibody.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention has low toxicity, and is used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, porcupine, sheep, pig, Oral or parenteral administration to mice, cats, dogs, and monkeys.
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route and the like.For example, when used for the treatment of adult hyperacidity, the antibody of the present invention is usually administered in a single dose.
  • Th r Threonine
  • d-FB S dialyzed fetal serum TMB 3,3,5,5, -NMP N-methylpyrrolidone
  • Example 1 shows an amino acid sequence of an immunogen-producing peptide (may be referred to as peptide-1 in the present specification) used in Example 1 below.
  • Example 1 shows the amino acid sequence of a peptide for producing an immunogen (sometimes referred to as peptide-2 in the present specification) used in Example 1 below.
  • Example 1 shows the amino acid sequence of a peptide for producing an immunogen (sometimes referred to as peptide-3 in the present specification) used in Example 1 below.
  • Human neuropeptide W (1-23) (herein human NPW 23 (Which may be described).
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of human nucleus peptide W (1-30) (in this specification, sometimes referred to as human NPW30).
  • rat neuropeptide W (1-23) (herein, sometimes referred to as rat NPW23).
  • rat neuropeptide W (1-30) (may be referred to as rat NPW30 herein).
  • mouse neuropeptide W (1-23) (may be referred to as mouse NPW23 in this specification).
  • mouse neuropeptide W (1-30) (may be referred to as mouse NPW30 in this specification).
  • bushu neuropeptide W (1-23) (herein sometimes referred to as bushu NPW23).
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of bushing neuropeptide W (1-30) (sometimes referred to as porcine NPW30 in the present specification).
  • Xaa represents a Cys residue labeled with biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES).
  • Xaa is a Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES) Shows the Cys residue labeled with a photoin.
  • Xaa represents a Cys residue labeled with biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES).
  • SEQ ID NO: 19 The nucleotide sequence of DNA encoding the amino acid represented by SEQ ID NO: 17 is shown. [SEQ ID NO: 19]
  • rat GPR7 the same receptor protein as TGR26 described in known literature (WO02 / 44368).
  • the hybridoma cells AhW23N3H3E4 obtained in Example 1 described below have been used since April 23, 2003 at 1-1, Tsukuba East Higashi, Ibaraki Pref., 1st, Chuo No. 6 (Zip code 305-8566). Location Deposited at the Patent Organism Depositary under the accession number FERM BP-8364.
  • the hybridoma cells AhW23C6GlH8 obtained in Example 1 described below have been administered from April 23, 2003 at 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, under the independent administration of Chuo No. 6 (zip code 305-8566). Deposited with the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the deposit number FERM BP-8365.
  • the hybridoma cell AhW23C5G2F6 obtained in Example 1 described below has been used since April 23, 2003 at 1-1, Tsukuba East Higashi, Ibaraki Prefecture, 1st, Chuo No. 6 (Zip code 305-8566). Location Deposited at the Patent Organism Depositary under the accession number FERM BP-8366.
  • Example 1 From April 23, 2003, the hybridoma cell ArW30C3AlA obtained in Example 1 described below was used as an independent administrative law of Tsukuba-Higashi 1-chome 1 Chuo No. 6 (Zip code 305-8566) Research Institute Deposited with the Patent Organism Depositary under the deposit number FERM BP-8367.
  • the hybridoma cell ArW30C7F2E8 obtained in Example 1 described below was a 1-1-1, Higashi, Tsuguba City, Ibaraki Prefecture 1 'Chuo No. 6 (zip code 305-8566) Laboratory Deposited with the Patent Organism Depositary under the accession number FERM BP-8368.
  • Antibodies obtained from each hybridoma cell are indicated by adding "a" after the cell name.
  • 2G6-DK 3H3-E4, 5G2-F6, 6G1-H8, 3A1A and 7F2-E8 are AhW23N2G6Dla, AhW23N3H3a AhW23C5G2F6a,
  • AhW23C6GlH8a ArW30C3AlAa and ArW30C7F2E8a.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Reference Examples, but these do not limit the scope of the present invention.
  • NPW23 human NPW23, rat NPW23, mouse and bush NPW23 may be collectively referred to as NPW23.
  • human NPW30, rat NPW30, mouse NPW30 and pig NPW30 may be collectively described as NPW30.
  • NPW23 and NPW30 may be collectively described as NPW.
  • peptide-1 SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • Balb / c mice females, 6 to 8 were prepared by mixing the immunogen prepared according to the methods described in (2) and (3) and incomplete Freund's adjuvant, and priming a mixture corresponding to 0.05 mg of each peptide. (Week-old). After the second immunization, a mixture of the immunogen and incomplete Freund's adjuvant corresponding to 0.05 mg of each peptide was immunized at 2-week intervals until the antibody titer increased.
  • Peptide-1 and peptide-2 obtained by labeling the cysteine residues of Peptide-1 (SEQ ID NO: 1), peptide-2 (SEQ ID NO: 2) and peptide-3 (SEQ ID NO: 3) with biotin and labeling with biotin And peptide-3 were synthesized.
  • 50 nmol of each peptide and 500 nmol of Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES) were dissolved in 0.5 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), and this solution was kept at 37 ° C for 3 hours.
  • the antibody titer of the antibody that binds to the amino terminal region of NPW is measured using a biotin-labeled peptide-1
  • An anti-mouse IgG immobilized plate was prepared as follows. Goat anti-mouse IgG (Fc) (ICN Biomedicals) diluted to 10 ⁇ / 1111 in 50 mM carbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96 ⁇ Erymno plate with IOO I per 1 ⁇ and added at 4 ° C. For 3 days. The solution in the well was discarded, and Block Ace (Snow Brand Milk Products) was added at 3501 per well, and left at 4 ° C for 3 days. The solution in the well was discarded, and 350% PBS containing 3% sucrose and 1% bovine serum albumin (BSA) was added per well, and left at 4 ° C for 1 day. The solution in the well was discarded and dried in a desiccator overnight for 3 days. The plate was stored at 4 ° C until use.
  • Fc Goat anti-mouse IgG
  • 50 mM carbonate buffer pH 9.6
  • Block Ace Snow Brand Milk Products
  • Sera obtained from mice immunized with the complex of peptide-1 and thyroglobulin prepared by the method described in (1) above were diluted with PBS containing 0.1% BSA at various magnifications.
  • the solution 50 ⁇ diluted 1000 to 64000 times with 83 was added to the well of the anti-mouse IgG solid-phased plate prepared as described above, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2 to 3 hours. The solution in the well was discarded, and the well was washed four times with distilled water containing 0.9% sodium chloride and 0.05% Tween20.
  • the (HRP) complex solution (Calbiochem) was diluted 12,000-fold with PBS containing 0.1% BSA, and the diluted solution ⁇ was added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. The solution in the well was discarded, and the well was washed four times with distilled water containing 0.9% sodium chloride and 0.05% Tween20.
  • the HRP substrate was prepared by dissolving 10 mg of orthophenylenediamine tablets (SIGMA) in 11 ml of 66 mM disodium hydrogenphosphate dodecahydrate aqueous solution containing 33 mM citric acid and 0.015% hydrogen peroxide. 100 l of this substrate solution was added to each well and left at room temperature for 10 to 30 minutes.
  • the absorbance of the substrate solution at 492 nm was measured. If the absorbance of the gel is high, it means that there is an antibody in the serum that binds to the amino terminal region of the NPW. In addition, the decrease in absorbance to the level of pack ground due to the addition of an excessive amount of NPW means that the binding between this antibody and the amino terminal region of NPW is sequence-specific.
  • the antibody titer of the antibody that binds to the lipoxyl-terminal region of NPW23 was measured by an enzyme immunoassay using biotin-labeled peptide-2 (SEQ ID NO: 13).
  • the anti-mouse IgG immobilized plate was prepared by the method described in (6) above. Serum obtained from mice immunized with the complex of peptide-2 and porcine thyroglobulin prepared by the method described in (2) above was diluted with PBS containing 0.1% BSA at various magnifications.
  • the streptavidin-HRP complex solution was diluted 12,000-fold with PBS containing 0.1% BSA, and 100 1 of this diluted solution was added to each well, and left at room temperature for 1 hour. The solution in the well was discarded, and the well was washed four times with distilled water containing 0.9% sodium chloride and 0.05% Tween20.
  • a substrate for HRP was prepared in the same manner as in Example 8, and 100 1 of the substrate solution was added to each well, and left at room temperature for 10 to 30 minutes. After stopping the reaction by adding 100/1 2N sulfuric acid to each well, the absorbance of the substrate solution at 492 nm was measured.
  • the absorbance of the well is high, it means that there is an antibody in the serum that binds to the lipoxyl-terminal region of NPW23.
  • the decrease in the absorbance to about the level of a pack-a-land due to the addition of an excessive amount of NPW23 means that the binding between this antibody and the carboxyl terminal region of NPW23 is sequence-specific.
  • the antibody titer of the antibody that binds to the lipoxyl-terminal region of NPW30 was measured by an enzyme immunoassay using a biotin-labeled peptide-3 (SEQ ID NO: 14).
  • Anti mouse The IgG-immobilized plate was prepared by the method described in (6) above. Sera obtained from mice immunized with the complex of peptide_3 and KLH prepared by the method described in (3) above were diluted with PBS containing 0.1% BSA at various magnifications.
  • Diluted serum solution 501, PBS containing 0.1% BSA or NPW30 solution 501 and the biotin-labeled peptide_3 solution prepared by the method described in (5) above were diluted 1000 to 64000 times with PBS containing 0.1% BSA. 50/1 of the solution was added to a well of an anti-mouse IgG-immobilized plate and left at room temperature for 2 to 3 hours. The solution in the well was discarded, and the well was washed four times with distilled water containing 0.9% sodium chloride and 0.05% Tween20.
  • the streptavidin-HRP complex solution was diluted 12,000-fold with PBS containing 0.1% BSA, 100 n1 of the diluted solution was added to each well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. The solution in the well was discarded, and the well was washed four times with distilled water containing 0.9% sodium salt and 0.05% Tween20.
  • the HRP substrate was prepared in the same manner as in Example 8, and 100 1 of the substrate solution was added to each well, and left at room temperature for 10 to 30 minutes. After stopping the reaction by adding 100 ⁇ 1 2N sulfuric acid to each well, the absorbance of the substrate solution at 492 nm was measured.
  • the absorbance of the well is high, it means that there is an antibody in the serum that binds to the lipoxyl-terminal region of NPW30.
  • the decrease in P luminosity to the background level due to the addition of an excessive amount of NPW30 means that the binding of this antibody to the NPW30 lipoxyl terminal region is sequence-specific.
  • Antibody titers against the respective antigens in the sera of mice immunized by the method described in (4) above were measured by the method described in (6), (7) or (8) above, and showed relatively high antibody titers.
  • a final immunization was performed by intravenously administering a solution of 0.05 mg of the immunogen in 50 l of PBS to mice intravenously.
  • the spleen was removed from the mouse 3 to 4 days after the final immunization, pressed with a stainless mesh, filtered, and suspended in RPMI 1640 medium to obtain a spleen cell suspension.
  • Balb / c-derived myeloma cells P3X63Ag8.653 were used as cells for cell fusion.
  • spleen cells and P3X63Ag8.653 were each contained in serum-free RPMI 1640 three times. After washing, spleen cells and P3X63Ag8.653 cells were mixed at a ratio of 10: 1 to the number of cells and centrifuged at 800 rpm for 15 minutes to precipitate the cells. After thoroughly removing the supernatant, the precipitate was loosened gently, and 0.2 ml of polyethylene glycol (HYBRI-MAX, SIGMA) was added over 30 seconds. Then, 5 ml of RPMI 1640 was added over 2 minutes.
  • HYBRI-MAX polyethylene glycol
  • the culture solution turns yellow 9 to 14 days after the start of the culture, the supernatant is collected, and the antibody titer in the culture supernatant of the hybridoma with cell fusion is determined as described in (6), (7) or (8) above. Each was measured by the method described in.
  • hybridoma cells After confirming the presence of an antibody that specifically binds to the amino terminus of NPW, the lipoxyl terminus of NPW23, or the lipoxyl terminus of NPW30 in the hybridoma culture supernatant, these hybridoma cells are subjected to limiting dilution. Cloned by the method. A 96 l plate pre-inoculated with 5 x 10 5 Balb / c mouse breast J3 fountain cells per well is used for a 100 l culture containing an average of one hybridoma (HAT and 10% fetal serum serum). RPMI 1640).
  • the antibody titer in the culture supernatant of the well in which a hybridoma consisting of one colony grew was measured, and the antibody titer was determined for the amino terminus of NPW, the lipoxyl terminus of NPW23 or the lipoxyl terminus of NPW30, respectively.
  • Hybridoma cells producing specific antibodies were selected.
  • Goat anti-mouse IgG (Fc) (ICN Biomedicals) diluted to 10 g / ml with 50 mM carbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96 ⁇ Erymno plate at 150 1 / ⁇ l and 4 ° C. C was left for one day. The solution in the well was discarded, Block Ace was added at 200 1 per well, and the plate was stored at 4 ° C until use.
  • Hybridoma culture supernatants producing 2G6-DK 3H3-E4, 5E6-C3 or 7F9-E12 antibodies were added to EIA buffer (0.1% BSA, 0.4% sodium chloride, 2M EDTA, 0.05% CHAPS. (3-((3-cholamidopropyl) dimethyla monio) -l-propanesul fonate) Diluted with 20 mM phosphate buffer (PH 7.0) at a fixed magnification (50 to 1000 times).
  • the relative binding (%) in this reaction system is defined as the value obtained by adding the EIA buffer and the biotin-labeled peptide-1 solution based on the absorbance of the antibody solution, EIA buffer and the biotin-labeled peptide-1 solution.
  • Hybridoma cells producing 2G6-Dl (AhW23N2G6Dla) and 3H3-E4 (AhW23N3H3a), which are antibodies that specifically recognize the amino terminal region of NPW, were named AhW23N2G6Dl and AhW23N3H3E4, respectively.
  • the relative binding (%) Is 100% of the value obtained by subtracting the absorbance of the well containing the EIA buffer and the biotin-labeled peptide-2 solution from the absorbance of the well containing the antibody solution, EIA buffer, and the biotin-labeled peptide-2 solution. It is a relative value of the value obtained by subtracting the absorbance of the wells to which the EIA buffer and the biotin-labeled peptide-2 solution were added from the absorbance of each well when the above was used.
  • 5G2-F6 is an antibody that specifically recognizes the lipoxyl-terminal region of NPW23
  • hybridoma cells producing AhW23C5G2F6a
  • 6G-H8 AhW23C6GlH8a
  • AhW23C5G2F6 and AhW23C6GlH8a were named AhW23C5G2F6 and AhW23C6GlH8, respectively.
  • the mouse IgG-immobilized plate was prepared according to the above (10).
  • the hybridoma culture supernatant producing the 2A1A, 3A1A or 7F2-E8 antibody was diluted 100-fold with the EIA buffer described in (10) above.
  • the relative binding (%) in the system refers to the absorbance of the well containing the antibody solution, the EIA buffer and the biotin-labeled peptide_3 solution, and the absorbance of the well containing the EIA buffer and the biotin-labeled peptide-3 solution. This is the relative value of the value obtained by subtracting the absorbance of the wells to which the EIA buffer and the biotin-labeled peptide-3 solution were added from the absorbance of each well when the reduced value was defined as 100% binding.
  • 3A1A is an antibody that specifically recognizes the lipoxyl-terminal region of NPW30
  • Hybridoma cells producing (ArW30C3AlAa) and 7F2-E8 (ArW30C7F2E8a) were named ArW30C3AlA and ArW30C7F2E8, respectively.
  • Example 2 Hybridoma cells producing (ArW30C3AlAa) and 7F2-E8 (ArW30C7F2E8a) were named ArW30C3AlA and ArW30C7F2E8, respectively.
  • Example 11 The inhibitory effect of the monoclonal antibodies described in 11 (10), 1- (11) and 1_ (12) on the agonist activity of NPW was examined. After reacting NPW with an anti-NPW monoclonal antibody for 1 hour at room temperature, this reaction mixture was prepared by the method described in the publication of TO 02/93161, a CH0 cell line expressing human GPR7 (SEQ ID NO: 15), A CH0 cell line expressing human GPR8 (SEQ ID NO: 17) prepared by the method described in W0 01/98494 or rat GPR7 (described in W02 / 44368) prepared by the method described in W02 / 44368 (SEQ ID NO: 19) expressing the same receptor as TGR26 (SEQ ID NO: 19) was added to a CH0 cell line to measure the activity of inhibiting cAMP accumulation in these cells stimulated by bolskolin (FSK).
  • FSK bolskolin
  • Buffers for diluting each NPW and each anti-NPW monoclonal antibody used in this example were 20 mM HEPES, 0.05% BSA, 2 jM FSK, and 0.2 mM 3-
  • a pH 7.4 MEM medium containing isobutyl-l-methylxantine (IBMX) was used.
  • IBMX isobutyl-l-methylxantine
  • Human GPR7 expression CH0 For cell lines, human GPR8-expressing CH0 cell line or rat GPR7-expressing CH0 cell line, inoculate 4 x 5xl0 cells on a 24-well plate and culture for 2 days.Before adding the reaction solution of each NPW and each anti-NPW antibody, After washing each well three times with 0.5 ml of ⁇ ⁇ ⁇ medium containing 0.5 mM 20 mM HEPES, 0.05% BSA and 0.2 mM IBMX (hereinafter referred to as washing buffer), 0.5 ml per well was washed. Was added.
  • reaction mixture After reacting human NPW23 (SEQ ID NO: 4) with NPW amino-terminal recognition monoclonal antibodies 2G6-DK 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-E12, the reaction mixture is used as a human GPR7-expressing cell line or human GPR8-expressing cell The strain was administered.
  • rat NPW23 SEQ ID NO: 6
  • NPW amino-terminal-recognizing monoclonal antibodies 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-E12
  • the reaction mixture was treated with rat GPR7-expressing cells.
  • the strain was administered.
  • the administration of rat NPW23 alone reduced the amount of cAMP in rat GPR7-expressing cells to 9% compared to FSK stimulation alone, but a 30-fold molar excess of rat NPW23 in 3H3-E4, 5E6-C3 and 7F9-
  • cAMP levels in GPR7-expressing cells recovered to 53%, 17% and 32%, respectively, compared to the case of FSK stimulation alone.
  • Figure 16 shows the results.
  • rat NPW23 or rat NPW30 SEQ ID NO: 7
  • 2G6-D1 an NPW amino terminal-recognizing monoclonal antibody
  • the reaction solution was administered to a rat GPR7-expressing cell line.
  • the administration of rat NPW23 or rat NPW30 alone reduced the cAMP level in rat GPR7-expressing cells to 8% and 31%, respectively, compared to the case of FSK stimulation alone, but 30 times the molar ratio of rat NPW23 or rat NPW30
  • cAMP levels in GPR7-expressing cells were restored to 38% and 60%, respectively, compared to the case of FSK stimulation alone.
  • the results are shown in FIG.
  • Rat NPW23 was reacted with 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2-F6, 6G-H8 and 7B4-D2, monoclonal antibodies recognizing NPW23 lipoxyl end, and the reaction solution was administered to a rat GPR7-expressing cell line.
  • rat NPW23 alone reduced the amount of cAMP in rat GPR7-expressing cells to 7% compared to the case of only FSK stimulation, but a 30-fold molar excess of rat NPW23 in 2F1B2A, 5A2A, 5D6-F10, 5G2- When reacted with F6, 6G H8 and 7B4-D2, the amount of cAMP in GPR7 expressing cells when reacted with 5A2A, 5G2-F6 and 7B4-D2 was 16%, 71 % And 73%, respectively. The results are shown in FIG. '
  • Enzyme labeling of 2G6-D1 was performed as follows. A 4.4 mg 2G6-Dl IgG solution dissolved in 2 ml of PBS was dialyzed against 1 liter of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.7) at 4 ° C for 16 hours. To the dialyzed IgG solution was added 501 mM N- (4-maleimidobutyryloxy) -succinimide (GMBS, Dojin Kagaku) dissolved in 501 N, N-dimethylformamide (DMF), and the mixture was added. Was allowed to stand at room temperature for 40 minutes with stirring. This reaction solution was separated with Sephadex G-25.
  • GMBS N- (4-maleimidobutyryloxy) -succinimide
  • Example 1 1001 NPW solutions of various concentrations diluted with the EIA buffer described in (10) were added to each well, and the plate was allowed to stand at 4 ° C. for 16 hours. . After washing the plate three times with PBS, add 100 ⁇ 1 HRP-labeled 2G6-D1 diluted at a magnification (300 to 1000 times) fixed with EIA buffer to each well and add the plate to each well. The mixture was allowed to stand at ° C for 16 hours.
  • NPW23 SEQ ID NO: 10.
  • the antibody of the present invention has an extremely high ability to bind to NPW, can neutralize the intracellular cAMP production inhibitory activity of NPW, promotes feeding, suppresses prolactin production, diuresis, and secretes gastric acid. It also has an inhibitory effect.
  • the antibody of the present invention suppresses the action of NPW, for example, anorexia nervosa, pituitary gland tumor, mesencephalic tumor, menstrual dysfunction, autoimmune disease, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage , Acromegaly, Corpi flommell syndrome, Algon'd'Castle's mouth syndrome, Forbes' Albright syndrome, lymphoma, Sheehan's syndrome, spermatogenesis, renal edema, urinary excretion disorder (eg, bladder contraction) Disorders, urethral passage obstruction, dysuria, dysuria, urinary tract obstruction, etc., hyponatremia, antidiuretic hormone secretion syndrome (SIADH) ', hypertension, upper gastrointestinal tract diseases (eg, peptic ulcers (eg, , Gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-El li son syndrome, etc.
  • Assay using the antibody of the present invention preferably a immunization by a sandwich method using a monoclonal antibody specifically recognizing the C-terminus of NPW and a monoclonal antibody specifically recognizing the N-terminus of NPW NPW can be quantified with high sensitivity and specificity using biological measurement methods.
  • diseases involving NPW eg, anorexia nervosa, obesity (eg, malignant mastocytosis, exogenous obesity, hyperinsulin) Obesity, hyperplasmic obesity, pituitary obesity, hypoplasmic obesity, hypothyroid obesity, hypothalamic obesity, symptomatic obesity, childhood obesity, upper body obesity, dietary obesity, sexual function Depressed obesity, systemic mastocytosis, simple obesity, central obesity, etc.), pituitary gland tumor, diencephalon tumor, menstrual abnormalities, autoimmune diseases, prolactinoma, infertility, impotence, amenorrhea, milk leakage Disease , Acromegaly,

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Abstract

本発明のNPWのN端側またはC末端の部分ペプチドに特異的に反応する抗体は、NPWを感度よく特異的に定量することができ、さらには不妊症、腎性浮腫、消化性潰瘍、胃酸過多症などの予防・治療剤および診断薬等として有用である。

Description

明 細 抗体およびその用途 技術分野
本発明は、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配 列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表される アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に結合特異性を有する新規 な抗体に関する。 更に詳しくは、 抗原抗体反応に基づく該ポリペプチドまたは その塩の定量法、 中和活性を利用する該ポリペプチドまたはその塩が関与する 疾患 （例、 拒食症、 肥満症、 腎性浮腫、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群、 尿崩 症、 上部消化管疾患、 胃酸過多症など） の診断および予防 ·治療剤の開発に有 用な抗体などに関する。 背景技術
Gタンパク質共役型レセプ夕一であるヒト GPR7およびヒト GPR8 (Genomics, 28 巻、 84- 91頁、 1995年、 TO 95/12670号公報） の生体内リガンドとして GPR8リガ ンド （本明細書中、 NPWまたはニューロペプチド Wと記載することがある） が単 離同定された (W0 01/98494号公報、 W0 02/44368号公報、 J. Biol. Chem.、 277 巻、 35826- 35832頁、 2002年） 。 NPWは、 ラットまたはマウス GPR7 (W0 02/44368 号公報に記載の TGR26と同一のレセプ夕一） のリガンドであることも示された (W0 02/44368、 J. Biol. Chem,、 277巻、 35826- 35832頁、 20( ^年） 。 訓の生 理作用としては脳室内投与による摂食促進作用、 血中プロラクチン分泌促進作 用などが知られている (W0 01/98494、 J. Biol . Chem.、 277巻、 35826 - 35832頁、 2002年） 。
NPWの生理作用または疾患に対する関与についてのさらなる検討が必要とされ ており、 NPWを簡便かつ高感度に検出、 定量する測定系が切望されていた。 発明の開示 本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 NPWを認識 する複数のモノクローナル抗体を作製し、 該抗体が優れた NPWの中和活性を有す ることも見出し、 該抗体を用いる NPWの優れた測定法を開発した。 そして、 さら に研究を行った結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の N端側の部分べプチドに特異 的に反応する抗体、
( 2 ) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号：. 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列の第 1〜 1 3番目のアミノ酸配列を有するぺプチドに特異的に反応す る上記 （1 ) 記載の抗体、
( 2 a ) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列 番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるァ ミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記 （2 ) 記載の抗 体、
( 3 ) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列の第 1〜3番目、 第 1〜4番目、 第 1〜5番目、 第 1〜6番目、 第 1
7番目、 第 1 8番目、 第 1 ' 9番目、 第 2〜4番目、 第 2 5番目、 第 2 6番目、 第 2 7番目、 第 2 ' 8番目、 第 2〜9番目、 第 3 5番目、 第 3 6番目、 第 3 7番目、 第 3 ' 8番目、 第 3〜9番目、 第 4 6番目、 第 4 7番目、 第 4 8番目、 第 4 ' 9番目、 第 5〜7番目、 第 5 8番目、 第 5 〜99番番目目、、 第第 66〜88番番目目、、 第第 66〜9番目および第 7〜9番目のアミノ酸配列か ら選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に反応する上記 ( 1 ) 記載の抗体、
( 3 a ) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列 番号： 8 ¾ 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるァ ミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記 （3) 記載の抗 体、
(4) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の C端側の部分べプチドを認識 しない上記 (1) 記載の抗体、
(5) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 11で表されるアミ ノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記 （1) 記載の抗体、 (6) 標識化された上記 （1) 記載の抗体、
(7) モノクローナル抗体である上記 （1) 記載の抗体、
(8) A W23N2 G6D 1 (FERM B P— 8363 ) で標示される ハイプリドーマ細胞から産生され得る AhW23N2 G6D 1 aで標示される 上記 （7) 記載の抗体、
(9) 上記 （8) 記載の抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列 番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位 に特異的に反応する抗体、
(10) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列 番号： 8、 配列番号： 9、.配列番号： 10または配列番号： 1 1で表されるァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上記 （9) 記載 の抗体、
(11) AhW23N3H3E4 (FERM B P— 8364) で標示され るハイプリド一マ細胞から産生され得る AhW23N3H3 E4 aで標示され る上記 （7) 記載の抗体、
(12) 上記 （11) 記載の抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番 号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または 配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合 部位に特異的に反応する抗体、 (13) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列 番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 1 1で表されるァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上記 （12) 記 載の抗体、
(14) 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C端側の部分 ぺプチドに特異的に反応する抗体、
(15) 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列の第 11〜23番目のアミノ酸配列を有するペプチド に特異的に反応する上記 （14) 記載の抗体、
(15 a) 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記
(15) 記載の抗体、
(16) 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列の第 16〜23番目、 第 17〜23番目、 第 18〜2
3番目、 第 19〜23番目、 第 20〜23番目、 第 21〜23番目、 第 16〜 22番目、 第 17〜22番目、 第 18〜22番目、 第 19〜22番目、 第 20 〜22番目、 第 16〜21番目、 第 17〜21番目、 第 18〜 21番目、 第 1 9〜 21番目、 第 16〜20番目、 第 17〜20番目および第 18〜20番目 のアミノ酸配列から選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に 反応する上記 （14) 記載の抗体、
(16 a) 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記 (16) 記載の抗体、
(17) 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の N端側の部分 ペプチドを認識しない上記 （14) 記載の抗体、 .
(18) 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記 (14) 記載の抗体、
(19) 標識化された上記 （14) 記載の抗体、
(20) モノクローナル抗体である上記 （14) 記載の抗体、
(21) AhW23C6GlH8 (FERM B P— 8365 ) で標示され るハイプリドーマ細胞から産生され得る AhW23 C 6 G 1H8 aで標示され る上記 （20) 記載の抗体、
(22) 上記 （21) 記載の抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番 号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド に対する結合部位に特異的に反応する抗体、
(23) 配列番号： 4、'配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上 記 （22) 記載の抗体、
(24) AhW23C5G2F6 (FERM B P— 8366 ) で標示され るハイプリドーマ細胞から産生され得る AhW23 C 5 G2 F 6 aで標示され る上記 （20) 記載の抗体、
(25) 上記 （24·) 記載の抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番 号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド に対する結合部位に特異的に反応する抗体、
(26) 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドに対して中和活性を有する上 記 （25) 記載の抗体、
(27) 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1 で表されるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の C端側の部分 ぺプチドに特異的に反応する抗体、
(28) 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11 で表されるアミノ酸配列の第 16~30番目のアミノ酸配列を有するペプチド に特異的に反応する上記 （27) 記載の抗体、
(28 a) 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記 (28) 記載の抗体、
(29) 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11 で表されるアミノ酸配列の第 23〜30番目、 第 24〜30番目、 第 25〜3 0番目、 第 26〜30番目、 第 27〜30番目、 第 28〜30番目、 第 23〜 29番目、 第 24〜29番目、 第 25〜29番目、 第 26〜29番目、 第 27 〜29番目、 第 23〜28番目、 第 24〜28番目、 第 25〜28番目、 第 2 6〜28番目、 第 23〜27番目、 第 24〜 27番目および第 25〜 27番目 のアミノ酸配列から選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に 反応する上記 （27) 記載のお体、
(29 a) 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で表されるァミノ酸配列を含有するぺプチドに対して中和活性を有する上記
(29) 記載の抗体、
(30) 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の N端側の部分 ペプチドを認識しない上記 （27) 記載の抗体、
(31) 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11 で表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する上記
(27) 記載の抗体、
(32) 標識化された上記 （27) 記載の抗体、
(33) モノクローナル抗体である上記 （27) 記載の抗体、
(34) ArW30C3A1A (FERM B P _ 8367 ) で標示される ハイプリドーマ細胞から産生され得る A rW30 C 3A1 Aaで標示される上 記 （33) 記載の抗体、
(35) 上記 （34) 記載の抗体の、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番 号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド に対する結合部位に特異的に反応する抗体、
(36) 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11 で表されるァミノ酸配列を含有するポリべプチドに対して中和活性を有する上 記 （35) 記載の抗体、 (37) ArW30 C7F 2E8 (FERM B P— 8368 ) で標示され るハイプリド一マ細胞から産生され得る A rW30 C 7 F 2 E 8 aで標示され る上記 （33) 記載の抗体、
(38) 上記 （37) 記載の抗体の、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番 号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド に対する結合部位に特異的に反応する抗体、
(39) 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1 で表されるアミノ酸 K列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する上 記 （38) 記載の抗体、
(4 0) 上記 （1) 、 （14) または （27) 記載の抗体を含有してなる医
(41) 不妊症、 腎性浮腫、 消化性潰瘍または胃酸過多症の予防 ·治療剤で ある上記 （40) 記載の医薬、
(42) 上記 （1) 、 （14) および/または （27) 記載の抗体を含有し てなる診断薬、
(43) 上記 （1) 記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 4、 配 列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配 列番号： 10または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドまたはその塩の定量法、
(44) さらに上記 （14) または （27) 記載の抗体を用いることを特徴 とする上記 （43) 記載の定量法、
(45) 上記 （14) 記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を 含有するポリべプチドまたはその塩の定量法、
(46) 上記 （27) 記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を 含有するポリぺプチドまたはその塩の定量法、
(47) 上記 （1) 記載の抗体と、 被検液および標識化された配列番号： 4 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリ ぺプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、 上記抗体に結合した上記標識化 されたポリべプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、 被検液 中の配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 11で表されるアミノ酸 配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の定量法、
(48) 上記 （14) 記載の抗体と、 被検液および標識化された配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配 列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、 上記抗体に結 合した上記標識化されたポリぺプチドまたはその塩の割合を測定することを特 徴とする、 被検液中の配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列 番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定
(49) 上記 （27) 記載の抗体と、 被検波および標識化された配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配 列を含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、 上記抗体に結 合した上記標識化されたポリぺプチドまたはその塩の割合を測定することを特 徵とする、 被検液中の配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列 番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定 量法、 '
(50) 1) 担体上に不溶化した上記 （1) 記載の抗体、 標識化された上記
(14) 記載の抗体および被検波を反応させた後、 標識剤の活性を測定する、 または 2) 担体上に不溶化した上記 （14) 記載の抗体、 標識化された上記
(1) 記載の抗体および被検波を反応させた後、 標識剤の活性を測定すること を特徴とする被検液中の配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配 列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の
(51) 1) 担体上に不溶化した上記 （1) 記載の抗体、 標識化された上記 (27) 記載の抗体および被検波を反応させた後、 標識剤の活性を測定する、 または 2) 担体上に不溶化した上記 （27) 記載の坊体、 標識化された上記 (1) 記載の抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定すること を特徴とする被検液中の配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配 列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の 定量法、
(52) 上記 （1) 記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 4、 配 列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配 列番号： 10または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドまたはその塩が関与する疾患の診断法、
(53) さらに上記 （14) または （27) 記載の抗体を用いることを特徴 とする上記 （52) 記載の診断法、
(54) 上記 （14) 記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を 含有するポリぺプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法、
(55) 上記 （27) 記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を 含有するポリべプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法、
(56) 疾患が、 不妊症、 腎性浮腫、 消化性潰瘍または胃酸過多症である、 上記 （52) 〜 （55) 記載の診断法、
(57) 上記 （7) 記載の抗体を産生するハイプリドーマ細胞、
(58) AhW23N2G6D l (FERM B P— 8363 ) または A h W23N3H3 E4 (FERM BP— 8364) で標示される上記 （57) 記載のハイプリドーマ細胞、
(59) 上記 （58) 記載のハイプリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養 し、 その体液または培養物から上記 （7) 記載の抗体を採取することを特徴と する上記 （7) 記載の抗体の製造法、
(60) 上記 （20) 記載の抗体を産生する八イブリドーマ細胞、
(61) AhW23C6G1H8 (FERM B P— 8365 ) または A h W23C5G2F 6 (FERM BP— 8366) で標示される上記 （60) 記載のハイプリドーマ細胞、
(62) 上記 （61) 記載の八イブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養 し、 その体液または培養物から上記 （20) 記載の抗体を採取することを特徴 とする上記 （20) 記載の抗体の製造法、
(63) 上記 （33) 記載の抗体を産生するハイプリドーマ細胞、
(64) ArW30 C3A1A (FERM B P— 8367 ) または A r W 30C7F2E8 (FERM BP— 8368) で標示される上記 （63) 記 載のハイプリドーマ細胞、
(65) 上記 （64) 記載の八イブリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養 し、 その体液または培養物から上記 （33) 記載のモノクローナル抗体を採取 することを特徴とする上記 （33) 記載の抗体の製造法、
(66) 哺乳動物に対し、 上記 （1) 、 （14) または （27) 記載の抗体 の有効量を投与することを特徴とする不妊症、 腎性浮腫、 消化性潰瘍または胃 酸過多症の予防 ·治療法、
(67) 不妊症、 腎性浮腫、 消化性潰瘍または胃酸過多症の予防 ·治療剤を 製造するための上記 （1) 、 （14) または （27) 記載の抗体の使用などに 関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 モノクローナル抗体 2G6-D1とピオチン標識化 peptide- 1との結合に対 する peptide- 1、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一〇 一は peptide- 1を添加した場合を、 —口—はヒト NPW23を添加した場合を、 一△ 一はヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 2は、 モノク口一ナル抗体 3H3-E4とピオチン標識化 pep tide- 1との結合に対 する peptide- 1、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一〇 一は peptide- 1を添加した場合を、 一口一はヒト NPW23を添加した場合を、 —△ 一はヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 3は、 モノクローナル抗体 5E6-C3とピオチン標識化 peptide- 1との結合に対 する peptide- 1、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 —〇 一は pept i de-1を添加した場合を、 一口一はヒト NPW23を添加した場合を、 一△ 一はヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 4は、 モノクロ一ナル抗体 7F9-E12とピオチン標識化 pept i de-1との結合に 対する pept ide- 1、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一 〇一は pept ide- 1を添加した場合を、 一口—はヒト NPW23を添加した場合を、 一 △ーはヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 5は、 モノクローナル抗体 2F1B2Aとピオチン標識化 pept ide- 2との結合に対 する pept ide- 2、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 —〇 —は pept ide- 2を添加した場合を、 —口—はヒト NPW23を添加した場合を、 —△ 一はヒ卜 NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 6は、 モノクロ一ナル抗体 5 A2 Aとビォチン標識化 pep t i de- 2との結合に対す る pept i de- 2、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一〇一 は pept i de-2を添加した場合を、 一口一はヒト NPW23を添加した場合を、 —△一 はヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 7は、 モノクローナル抗体 5D6-F10とピオチン標識化 pept ide- 2との結合に 対する pept ide- 2、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一 〇—は pept ide-2を添加した場合を、 —ローはヒト NPW23を添加した場合を、 一 △ーはヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 8は、 モノクローナル抗体 5G2-F6とピオチン標識化 pept i de- 2との結合に対 する pept i de- 2、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一〇 一は pept ide- 2を添加した場合を、 一口—はヒト NPW23を添加した場合を、 一△ 一はヒ卜 NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 9は、 モノク口一ナル抗体 6G1- H8とピオチン標識化 pept ide- 2との結合に対 する pept ide- 2、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一〇 —は pept i de- 2を添加した場合を、 —ローはヒト NPW23を添加した場合を、 一△ 一はヒト NPW30を添加した塲合をそれぞれ示す。
図 1 0は、 モノクローナル抗体 7B4-D2とピオチン標識化 pep t i de- 2との結合に 対する pept i de- 2、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一 〇—は pept ide- 2を添加した場合を、 一口一はヒト NPW23を添加した場合を、 一 △ーはヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 1 1は、 モノクローナル抗体 2A1Aとピオチン標識化 pept ide- 3との結合に対 する pept ide- 3、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一〇 一は pept ide- 3を添加した場合を、 一口一はヒト NPW23を添加した場合を、 一△ —はヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 1 2は、 モノクローナル抗体 3A1Aとピオチン標識化 pept ide- 3との結合に対 する pept ide-3、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一〇 一は pept ide-3を添加した場合を、 —ローはヒト NPW23を添加した場合を、 一△ 一はヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 1 3は、 モノクロ一ナル抗体 7F2-E8とピオチン標識化 pept ide- 3との結合に 対する pept ide_3、 ヒト NPW23またはヒト NPW30による結合阻害を示す。 図中、 一 〇一は pept ide- 3を添加した場合を、 一口一はヒト NPW23を添加した場合を、 一 △—はヒト NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 1 4は、 NPWァミノ末端認識モノクローナル抗体によるヒト NPW23の cAMP合 成阻害活性の抑制を示す。 ヒト GPR7発現細胞に添加した場合を示す。
図 1 5は、 NPWァミノ末端認識モノク口一ナル抗体によるヒト NPW23の cAMP合 成阻害活性の抑制を示す。 ヒト GPR8発現細胞に添加した場合を示す。
図 1 6は、 NPWァミノ末端認識モノクローナル抗体によるラット NPW23の cAMP 合成阻害活性の抑制を示す。 ' 図 1 7は、 モノクローナル抗体 2G6-D1によるラット NPW23およびラット NPW30 の cAMP合成阻害活性の抑制を示す。 図中、 口はラット NPWのみを加えた場合を、 疆はラット NPWおよび 2G6- D1抗体を加えた場合を示す。
図 1 8は、 NPW23力ルポキシル末端認識モノクローナル抗体によるラット NPW23の cAMP合成阻害活性の抑制を示す。
図 1 9は、 NPW30力ルポキシル末端認識モノクローナル抗体によるラット NPW30の cAMP合成阻害活性の抑制を示す。
図 2 0は、 モノクロ一ナル抗体 2F1B2Aを用いた EIA系に、 種々の濃度のヒト NPW23およびラット （マウス） NPW23を添加した場合の 450 nmにおける吸光度を 示す。 図中、 —〇一はヒト NPW23を添加した場合を、 —口—はラット （マウス） NPW23を添加した場合をそれぞれ示す。
図 2 1は、 モノクローナル抗体 5A2Aを用いた EIA系に、 種々の濃度のヒト NPW23およびラット （マウス） NPW23を添加した場合の 450胆における吸光度を 示す。 図中、 —〇一はヒト NPW23を添加した場合を、 一口一はラッ卜 （マウス） NPW23を添加した場合をそれぞれ示す。
図 2 2は、 モノクローナル抗体 5D6- F10を用いた EIA系に、 種々の濃度のヒト NPW23およびラット （マウス） NPW23を添加した場合の 450 nmにおける吸光度を 示す。 図中、 一〇一はヒト NPW23を添加した場合を、 —ローはラット （マウス） NPW23を添加した場合をそれぞれ示す。
図 2 3は、 モノクローナル抗体 5G2- F6を用いた EIA系に、 種々の濃度のヒト NPW23およびラット （マウス） NPW23を添加した場合の 450 nmにおける吸光度を 示す。 図中、 —〇一はヒト NPW23を添加した場合を、 —ローはラット （マウス） NPW23を添加した場合をそれぞれ示す。
図 2 4は、 モノクローナル抗体 6G1- H8を用いた EIA系に、 種々の濃度のヒト NPW23およびラット （マウス） NPW23を添加した場合の 450 nmにおける吸光度を 示す。 図中、 一〇—はヒト NPW23を添加した場合を、 一口一はラット （マウス） NPW23を添加した場合をそれぞれ示す。
図 2 5は、 モノクローナル抗体 7B4- D2を用いた EIA系に、 種々の濃度のヒト NPW23およびラット （マウス） NPW23を添加した場合の 450 nmにおける吸光度を 示す。 図中、 —〇—はヒト NPW23を添加した場合を、 —ローはラット （マウス） NPW23を添加した場合をそれぞれ示す。
図 2 6は、 モノクローナル抗体 2A1Aを用いた EIA系に、 種々の濃度のヒト NPW30, ラット NPW30、 マウス NPW30およびブタ NPW30を添加した場合の 450 nmに おける吸光度を示す。 図中、 一〇—はヒト NPW30を添加した場合を、 —口—はラ ット NPW30を添加した場合を、 一△—はマウス NPW30を添加した場合を、 一◊一 はブ夕 NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 2 7は、 モノクローナル抗体 3A1Aを用いた EIA系に、 種々の濃度のヒト NPW30, ラット NPW30、 マウス NPW30およびブ夕 NPW30を添加した場合の 450 皿に おける吸光度を示す。 図中、 一〇一はヒト NPW30を添加した場合を、 一口一はラ ット NPW30を添加した場合を、 —△一はマウス NPW30を添加した場合を、 一◊— はブ夕 NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。
図 2 8は、 モノクロ'ーナル抗体 7F2- E8を用いた EIA系に、 種々の濃度のヒト NPW30, ラット NPW30、 マウス NPW30およびブ夕 NPW30を添加した場合の 450 nmに おける吸光度を示す。 図中、 一〇一はヒト NPW30を添加した場合を、 —口—はラ ット NPW30を添加した場合を、 —△一はマウス NPW30を添加した場合を、 —◊一 はブ夕 NPW30を添加した場合をそれぞれ示す。 発明を実施するための最良の形態
本明細書におけるタンパク質 （ポリペプチド） は、 ペプチド標記の慣例に従 つて左端が N末端 (ァミノ末端) 、 右端が C末端 (力ルポキシル末端) である。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、 本発明で用いられるタンパク質は、 C末端がカルボキシル基、 カルポキシレ一 ト、 アミド卖たはエステルの何れであってもよい。
配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1表されるアミノ酸配列を 含有するポリペプチドとしては、 例えば、 （1) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0 または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列に数 （1〜5) 個のアミノ酸が付 加したアミノ酸配列、 （2) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列 番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列に数 （1〜5) 個のアミノ酸が掙入されたアミノ酸配 列、 （3) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列中の数 （1〜5) 個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配 列を含有するポリぺプチドなどが用いられる。
配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列 を含有するポリペプチドの塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生 理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無 機酸 （例、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 または有機酸 （例、 酢 酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン 酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） と の塩などが用いられる。
配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列 を含有するポリぺプチドまたはその塩の N端側の部分べプチドとしては、 例え ば、
(a) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸 配列の
(i) 第 1〜3番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(i i) 第 1〜4番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(i i i) 第 1〜5番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(iv) 第 1〜6番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(V) 第 1〜7番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(vi) 第 1〜8番目のァミノ酸配列を有するポリペプチド、
(vi i) 第 1〜9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(vi i i) 第 2〜 4番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ix) 第 2〜 5番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(X) 第 2〜6番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xi) 第 2〜7番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xi i) 第 2〜8番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xi i i) 第 2〜 9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xiv) 第 3〜 5番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(XV) 第 3 ~ 6番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xv i) 第 3〜 7番目のァミノ酸配列を有するポリぺプチド、 (xvi i) 第 3〜 8番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xvi i i) 第 3〜 9番目のアミノ酸配列を有するポリぺプチド、
(xix) 第 4〜6番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(XX) 第 4〜 7番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xx i) 第 4〜8番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xxi i ) 第 4〜 9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xxi i i) 第 5〜 7番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xxiv) 第 5〜 8番目のアミノ酸配列を有するポリぺプチド、
(XXV) 第 5〜 9番目のアミノ酸配列を有するポリぺプチド、
(xxv 0 第 6〜 8番目のアミノ酸配列 有するポリペプチド、
(xxvi i) 第 6〜9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、 ならびに
(xxvi i i) 第 7〜9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、 および
(b) 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列の第 1〜5 番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。
配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 1 0で表され るァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C端側の部分べプチド としては、 例えば、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番 号： 1 0で表されるアミノ酸配列の、
(i) 第 1 6〜2 3番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(i i) 第 1 7〜2 3番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(i i i) 第 1 8〜2 3番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(iv) 第 1 9〜2 3番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(V) 第 2 0〜2 3番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(vi) 第 2 1 - 2 3番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(vi i) 第 1 6〜2 2番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(vi i i) 第 1 7〜2 2番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ix) 第 1 8〜2 2番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(X) 第 1 9〜2 2番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xi) 第 2 0〜2 2番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、 (xi i) 第 1 6〜2 1番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xi i i) 第 1 7〜2 1番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xiv) 第 1 8〜2 1番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(XV) 第 1 9〜2 1番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xv i) 第 1 6〜2 0番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xvi i) 第 1 7〜2 0番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、 および
(xvi i i) 第 1 8〜2 0番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げら れる。
配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で表され るァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C端側の部分べプチド としては、 例えば、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番 号： 1 1で表されるアミノ酸配列の、
(i) 第 2 3〜3 0番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(i i) 第 2 4〜3 0番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(i i i) 第 2 5〜3 0番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(iv) 第 2 6〜3 0番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(v) 第 2 7〜3 0番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(vi) 第 2 8〜3 0番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(vi i) 第 2 3〜2 9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(vi i i) 第 2 4〜2 9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(ix) 第 2 5〜2 9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(X) 第 2 6〜2 9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xi) 第 2 7〜2 9番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xi i) 第 2 3〜2 8番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xi i i) 第 2 4〜2 8番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xiv) 第 2 5〜2 8番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xv) 第 2 6〜2 8番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xv i) 第 2 3〜2 7番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、
(xvi i) 第 2 4〜2 7番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、 および (xviii) 第 25〜27番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げら れる。
配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列 を含有するポリぺプチドまたはその塩の N端側の部分べプチドに特異的に反応 する抗体としては、 例えば該ポリペプチドまたはその塩の N端側の部分べプチ ドに特異的に反応するものであればよく、 好ましくはモノクローナル抗体が挙 げられる。 具体的には、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列の第 1〜13番 目までのアミノ酸配列を含むペプチド、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列 の第 1〜13番目までのアミノ酸配列を有し、 かっこのアミノ酸配列の第 14 番目を Cys_NH2に置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に反応す る抗体 （好ましくは、 モノクローナル抗体） などが用いられる。
このうち好ましくは、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番 号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 11 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C端側の部分 ぺプチドを認識しないものである。
さらに好ましくは、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番 号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 11 で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の活性を中和す る抗体である。
具体的には、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 11で表され るアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に対して 1〜1000倍、 好ましくは 1〜100倍、 さらに好ましくは 1〜10倍のモル比で添加した際 に、 上記ポリペプチドまたはその塩の活性 〔例、 ヒト GPR8、 ヒト GPR7、 ラット GPR7またはマウス GPR7を発現する細胞に対する細胞刺激活性 (例、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 c AM.P生成および抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c_ f o sの活性化、 pHの低下、 G TP rs結合活性などを促進する活性など） など〕 を ιο%以上、 好ましくは
50%以上、 さらに好ましくは 80%以上抑制する抗体などである。
好ましい具体例としては、 AhW23N2 G6D 1 aで標示されるモノクロ —ナル抗体、 AhW23N3H3E4 aで標示されるモノクローナル抗体など が挙げられる。
さらに、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列 番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 11で表されるァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の N端側の部分べプチドに特 異的に反応する抗体としては、 （a) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列 番号： 1 1で表されるアミノ酸配列の （i) 第 1〜3番目のアミノ酸配列、
(ii) 第 1〜4番目のアミノ酸配列、 （iii) 第 1〜 5番目のアミノ酸配列、 (iv) 第 1〜6番目のアミノ酸配列、 （V) 第 1〜7番目のアミノ酸配列、 (vi) 第 1〜8番目のアミノ酸配列、 （vii) 第 1〜9番目のアミノ酸配列、 (viii) 第 2〜4番目のアミノ酸配列、 （ix) 第 2〜 5番目のアミノ酸配列、 (x) 第 2〜6番目のアミノ酸配列、 （xi) 第 2〜7番目のアミノ酸配列、 (xii) 第 2〜8番目のアミノ酸配列、 （xiii) 第 2〜 9番目のアミノ酸配列、 (xiv) 第 3〜5番目のアミノ酸配列、 （XV) 第 3〜6番目のアミノ酸配列、 (xv i) 第 3〜7番目のアミノ酸配列、 （xvii) 第 3〜 8番目のアミノ酸配列、 (xviii) 第 3〜9番目のアミノ酸配列、 （xix) 第 4〜 6番目のアミノ酸配列、 (XX) 第 4〜7番目のアミノ酸配列、 （xxi) 第 4〜8番目のアミノ酸配列、 (xxii) 第 4〜9番目のアミノ酸配列、 （xxiii) 第 5〜 7番目のアミノ酸配列、 ( xiv) 第 5〜8番目のアミノ酸配列、 （XXV) 第 5〜9番目のアミノ酸配列、 (xxv i) 第 6〜 8番目のアミノ酸配列、 （xxvii) 第 6〜 9番目のアミノ酸配列 もしくは （xxviii) 第 7〜 9番目のアミノ酸配列、 または （b) 配列番号： 10 または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列の第 1〜 5番目のアミノ酸配列 を特異的に認識する抗体などが用いられる。
また、 AhW23N2G6Dl aで標示されるモノクローナル抗体または A hW23 N3H3 E4 aで標示されるモノクローナル抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリ ペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体 （例、 モノクローナル抗 体） も、 本発明に含まれる。 中でも、 上記ポリペプチドに対して中和活性を有 する抗体 （例、 モノクローナル抗体） である。
上記 「結合部位」 としては、 A hW 2 3 N 2 G 6 D 1 aで標示されるモノク ローナル抗体または A hW 2 3 N 3 H 3 E 4 aで標示されるモノクローナル抗 体が結合する部位であればよく、 好ましくは、 特異的に結合する部位、 ェピト ープである。
配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 1 0で表され るアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C端側の部分べプチド に特異的に反応する抗体は、 例えば、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番 号： 8または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド またはその塩の C端側の部分べプチドに特異的に反応するものであればよく、 好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。
具体的には、 例えば、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列の第 1 1〜2 3 番目までのアミノ酸配列を含むペプチド、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配 列の第 1 1〜2 3番目までのアミノ酸配列を有し、 かっこのアミノ酸配列の第 1 1番目に Cysを付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に反応す る抗体 （好ましくは、 モノクローナル抗体） などが用いられる。
このうち好ましくは、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配 列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の N端側の部分ペプチドを認識しないものである。
さらに好ましくは、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列 番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活 性を中和する抗体である。
具体的には、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に対して 1 〜 1 0 0 0倍、 好ましくは 1〜 1 0 0倍、 さらに好ましくは 1〜 1 0倍のモル 比で添加した際に、 上記ポリペプチドまたはその塩の活性 〔例、 ヒト GPR8、 ヒト G P R 7、 ラット G P R 7またはマウス G P R 7を発現する細胞に対する 細胞刺激活性 （例、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊 離、 細胞内 c AMP生成および抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、' Hの低下、 GTPTS結合活性などを促進する活性など） など〕 を 10%以上、 好ましくは 50%以上、 さらに好ましくは 80%以上抑制する抗体などである。 好ましい具体例としては、 AhW23N2 G6D 1 aで標示されるモノクロ ーナル抗体、 AhW23N3H3E4 aで標示されるモノクロ ナル抗体など が挙げられる。
さらに、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10 で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C端側の部分 ペプチドに特異的に反応する抗体としては、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配 列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列の、 （i) 第 16〜2 3番目のアミノ酸配列、 （ii) 第 17〜23番目のアミノ酸配列、 （iii) 第 1 8〜23番目のアミノ酸配列、 （iv) 第 19〜23番目のアミノ酸配列、 （v) 第 20〜23番目のアミノ酸配列、 （vi) 第 21〜23番目のアミノ酸配列、
(vii) 第 16〜22番目のアミノ酸配列、 （viii) 第 17〜22番目のァミノ 酸配列、 （ix) 第 18〜22番目のアミノ酸配列、 （X) 第 19〜22番目のァ ミノ酸配列、 （xi) 第 20〜22番目のアミノ酸配列、 （xii) 第 16〜21番 目のアミノ酸配列、 （xiii) 第 17〜21番目のアミノ酸配列、 （xiv) 第 18 〜21番目のアミノ酸配列、 （XV) 第 19〜21番目のアミノ酸配列、 （xvi) 第 16〜20番目のアミノ酸配列、 （xvii) 第 17〜20番目のアミノ酸配列 または （xviii) 第 18〜20番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体など が用いられる。
また、 AhW23N2G6D 1 aで標示されるモノクローナル抗体または A hW23N3H3 E4 aで標示されるモノクローナル抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を 含有するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体 （例、 モノク ローナル抗体） も、 本発明に含まれる。 中でも、 上記ポリペプチドに対して中 和活性を有する抗体 （例、 モノクローナル抗体） である。
上記 「結合部位」 としては、 AhW23N2 G6D 1 aで標示されるモノク 口一ナル抗体または A hW23N3H3 E4 aで標示されるモノクローナル抗 体が結合する部位であればよく、 好ましくは、 特異的に結合する部位、 ェピト ープである。
配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で表され るァミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の C端側の部分べプチド に特異的に反応する抗体は、 例えば、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番 号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド またはその塩の C端側の部分べプチドに特異的に反応するものであればよく、 好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。
具体的には、 例えば、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列の第 16〜 30 番目までのアミノ酸配列を含むペプチド、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配 列の第 16〜30番目までのアミノ酸配列を有し、 かっこのアミノ酸配列の第 16番目に Cysを付加したアミノ酸配列を有するポリぺプチドに特異的に反応す る抗体 （好ましくは、 モノクローナル抗体） などが用いられる。
このうち好ましくは、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配 列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の N端側の部分ペプチドを認識しないものである。
さらに好ましくは、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列 番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の活 性を中和する抗体である。
具体的には、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩に対して 1 〜 1000倍、 好ましくは 1〜 100倍、 さらに好ましくは 1〜 10倍のモル 比で添加した際に、 上記ポリペプチドまたはその塩の活性 〔例、 ヒト GPR8 ヒト GPR7、 ラット GPR7またはマウス GPR7を発現する細胞に対する 細胞刺激活性 （例、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊 離、 細胞内 CAM P生成および抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下、 GTPr S結合活性などを促進する活性など） など〕 を 10%以上、 好ましくは 50%以上、 さらに好ましくは 80%以上抑制する抗体などである。 好ましい具体例としては、 ArW30 C 3 Al Aaで標示されるで標示され るモノクローナル抗体、 ArW30 C 7 F 2 E 8で標示されるモノクローナル 抗体などが挙げられる。
さらに、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1 で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の C端側の部分 ペプチドに特異的に反応する抗体としては、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 @3 列番号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列の、 （i) 第 23〜3 0番目のアミノ酸配列、 （ii) 第 24〜30番目のアミノ酸配列、 （iii) 第 2 5〜30番目のアミノ酸配列、 （iv) 第 26〜30番目のアミノ酸配列、 （v) 第 27〜30番目のアミノ酸配列、 （vi) 第 28〜30番目のアミノ酸配列、 (vii) 第 23〜29番目のアミノ酸配列、 （viii) 第 24〜29番目のァミノ 酸配列、 （ix) 第 25〜29番目のアミノ酸配列、 （X) 第 26〜29番目のァ ミノ酸配列、 （xi) 第 27〜29番目のアミノ酸配列、 （xii) 第 23〜28番 目のアミノ酸配列、 （xiii) 第 24〜28番目のアミノ酸配列、 （xiv) 第 25 〜28番目のアミノ酸配列、 （XV) 第 26〜 28番目のアミノ酸配列、 （xvi) 第 23〜27番目のアミノ酸配列、 （xvii) 第 24〜27番目のアミノ酸配列 または （xviii) 第 25〜27番目のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体など が用いられる。
また、 ArW30C 3A1 Aaで標示されるモノクローナル抗体または Ar W30 C 7 F 2 E 8で標示されるモノクローナル抗体の、 配列番号： 5、 配列 番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有 するポリペプチドに対する結合部位に特異的に反応する抗体 （例、 モノクロ一 ナル抗体） も、 本発明に含まれる。 中でも、 上記ポリペプチドに対して中和活 性を有する抗体 （例、 モノクローナル抗体） である。
上記 「結合部位」 としては、 ArW30 C 3 Al Aaで標示されるモノクロ —ナル抗体または A r W 3 0 C 7 F 2 E 8で標示されるモノク口一ナル抗体が 結合する部位であればよく、 好ましくは、 特異的に結合する部位、 ェピトープ である。 以下に、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列 番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるァ ミノ酸配列を含有するポリべプチドまたはその塩の N端側の部分べプチドに特 異的に反応する抗体、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列 番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C 端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、 および配列番号： 5、 配列番 号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有す るポリペプチドまたはその塩の C端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体
(以下、 これらを合わせて本発明の抗体と称することもある） の抗原の調製法、 および該抗体の製造法について説明する。
( 1 ) 抗原の調製
本発明の钪体を調製するために使用される抗原としては、 例えば、 配列番 号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番 号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有 するポリペプチドまたはその塩 （以下、 NPWと称することもある） と同一の抗原 決定基を 1種または 2種以上有する合成ペプチドなど何れのものも使用すること ができる （以下、 これらを単に NPW抗原と称することもある） 。
NPWは、 （a) 例えばヒト、 サル、 ラット、 マウスなどの哺乳動物の組織また は細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、 （b) ぺプチ ド ·シンセサイザ一等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、 (c) NPWをコードする DNAを含有する形質転換体を培養することによつても製造 される。
(a) 該哺乳動物の組織または細胞から NPW抗原を調製する場合、 その組織また は細胞をホモジナイズした後、 酸、 またはアルコールなどで抽出を行い、 該抽 出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマ 卜グラフィ一、 ァフィ二ティ一クロマ卜グラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
(b) 化学的に NPW抗原を調製する場合、 該合成ペプチドとしては、 例えば上述 した天然より精製した NPW抗原と同一の構造を有するもの、 配列番号： 4で表さ れるアミノ酸配列において 3個以上、 好ましくは 8個以上のアミノ酸からなる任 意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を 1種あるいは 2種以上含有する ぺプチドなどが用いられる。
(c) DNAを含有する形質転換体を用いて NPWを製造する場合、 該 DNAは、 公知の クローニング方法 〔例、 Mo lecul ar Cl oning (2nd ed. ； J. Sambrook et al .， Cold Spr ing Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など〕 に従って作成する ことができる。 該クローニング方法とは、 （1) NPWのアミノ酸配列に基づきデ ザインした DNAプローブまたは DNAプライマーを用い、 cDNAライブラリ一からハ イブリダィゼーション法により NPWをコードする DNAを含有する形質転換体を得 る方法、 または （2) NPWのアミノ酸配列に基づきデザインした DNAプライマ一を 用い、 PCR法により NPWをコードする DNAを含有する形質転換体を得る方法などが 挙げられる。
NPW抗原としてのペプチドは、 （1) 公知のペプチドの合成法に従って、 また は （2) 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによつ て製造することができる。
該ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによ つても良い。 すなわち、 該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはァミノ 酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離する ことにより目的のペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基 の脱離としてはたとえば、 以下の （i) 〜 （i i) に記載された方法等が挙げられ る。
(リ Pept ide Synthes i s, Intersc i ence Pub l i shers, New York (1966年) (i i) The Pept ide, Academi c Press, New York (1965年) また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグ ラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結晶などを組み合わせて該ペプチドを 精製単離することができる。 上記方法で得られるぺプチドが遊離体である場合 は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用 いることができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒド ロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一ベン ジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルアミン榭脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 （2 '， 4 ' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメ チル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2 '， 4 ' -ジメトキシフエ二ルー Fm o cァミノ ェチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチド の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後 に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 目的のペプチド を取得する。 あるいはクロロトリチル樹脂、 ォキシム樹脂、 4ーヒドロキシ安 息香酸系樹脂等を用い、 部分的に保護したペプチドを取り出し、 更に常套手段 で保護基を除去し目的のぺプチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 ペプチド合成に使用できる 各種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 力 ルポジイミド類としては D C C、 N, N'—ジイソプロピルカルポジイミド、 N ーェチルー Ν'— ( 3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが挙げら れる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t、 HO 〇B tなど） とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは HO〇B tエステルとしてあら かじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができ る。 保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる < たとえば N, N—ジメチルホルムアミド、 N, N—ジメチルァセトアミド、 N 一メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン、 クロ口ホルムなどのハ ロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチル スルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなどの三級アミン類、 ジォキサ ン、 テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリ ルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれ らの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度はべプチド結合形成反応に使用 され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0〜約 5 0 °C の範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常約 1 . 5〜約 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十 分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分 な縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないとき には、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセチ ル化して、 後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 B o c、 夕ーシ ャリーペンチルォキシカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4—メト キシベンジルォキシカルポニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカ ルポニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエ二 ルスルフエニル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが挙げられる。 力ルポキシル基の保護基としては、 たとえば アルキル基、 C3_8シクロアル キル基、 C7_14ァラルキル基、 2—ァダマンチル、 4—ニトロベンジル、 4ーメ トキシベンジル、 4一クロ口ベンジル、 フエナシルおよびべンジルォキシカル ボニルヒドラジド、 夕一シャリーブトキシカルポニルヒドラジド、 トリチルヒ ドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化 によって保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァ セチル基などの低級 （C ^) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導され る基などが挙げられる。 また、 .エーテル化に適する基としては、 たとえばベン ジル基、 テトラヒドロビラニル基、 夕一シャリーブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば Bz 1、 C 1— B z 1 , 2—二トロベンジル、 B r—Z、 夕ーシャリーブチルなどが挙げられ る。
ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 To s、 4—メトキシー 2， 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 Bom、 Bum, Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペン夕クロ口フエノー ル、 2, 4， 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァ ノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 H〇NB、 N—ヒドロキシスク シミド、 N—ヒドロキシフ夕ルイミド、 HOB t) とのエステル] などが挙げ られる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 たとえば対応するリン 酸アミドが挙げられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば Pd—黒あるいは Pd—炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリウムによる還元なども挙げられる。 上記酸処理による脱離反応は一 般に— 20〜40°Cの温度で行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエ ノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフ イド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールのようなカチォ ン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として 用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2—エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ る脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。 ' 原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその保 護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手 段から適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 力ルポキシル末端アミ ノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化した後、 アミノ基側にペプチド鎖を所望 の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端のひ—ァミノ基の保護基のみを 除いたぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたぺプチド （ま たはアミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮 合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた 保護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の 粗べプチドを得ることができる。 この粗べプチドは既知の各種精製手段を駆使 して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得る ことができる。
ぺプチドのエステル体を得るには力ルポキシ耒端アミノ酸の α—カルボキシ ル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ペプチドのァ ミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
NPW抗原は、 不溶化したものを直接免疫することもできる。 また、 NPW抗原を 適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。 該担体 （キヤリ ァ一） と NPW抗原 （ハプテン） との混合比は、 担体に結合または吸着させた NPW 抗原に対して抗体が効率よくできれば、 どのようなものをどのような比率で結 合あるいは吸着させてもよく、 通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり 常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン 1に対し 0 . 1〜1 0 0の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。 天 然の高分子担体としては、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒトなどの哺乳動物の血清ァ ルブミンや例えばゥシ、 ゥサギなどの哺乳動物のチログロブリン、 例えばゥシ、 ゥサギ、 ヒト、 ヒッジなどの哺乳動物のヘモグロビン、 キーホールリンペット へモシァニンなどが用いられる。 合成の高分子担体としては、 例えばポリアミ ノ酸類、 ポリスチレン類、 ポリアクリル類、 ポリビエル類、 ポリプロピレン類 などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができる。 例えば、 チロシン、 ヒスチジン、 トリブトファンを架橋するビスジ ァゾ化べンジジンなどのジァゾニゥム化合物、 アミノ基同志を架橋するダル夕 ルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、 トルエン一 2， 4—ジイソシァネー トなどのジイソシァネート化合物、 チオール基同志を架橋する N, Ν'— o—フ ェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、 ァミノ基とチオール基を架 橋するマレイミド活性エステル化合物、 ァミノ基と力ルポキシル基とを架橋す るカルポジイミド化合物などが好都合に用いられる。 また、 アミノ基同志を架 橋する際にも、 一方のァミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試薬 (例えば、 S P D Pなど） を反応させた後還元することによりチオール基を導 入し、 他方のァミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導 入後、 両者を反応させることもできる。
( 2 ) モノクローナル抗体の作製
NPW抗原は、 温血動物に対して、 例えば腹腔内注入、 静脈注入、 皮下注射など の投与方法によって、 抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、 希釈剤と共に投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイ ントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常 2〜6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10回程度行われる。 温血動物としては、 例えば サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリ などがあげられるが、 モノクロ一ナル抗体作製にはマウスが好ましく用いられ る。
モノクローナル抗体の作製に際しては、 NPW抗原を免疫された温血動物、 たと えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜5日後に脾臓ま たはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合さ せることにより、 抗 NPWモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製すること ができる。 血清中の抗 NPW抗体価の測定は、 例えば後記の標識化 NPWと抗血清と を反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされ る。 融合操作は既知の方法、 例えばケーラ一とミルスタインの方法 〔Nature、 256巻、 495頁 （1975年） 〕 に従い実施できる。 融合促進剤としては、 ポリェチ レンダリコール （PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P EGなどが用いられる。 骨髄腫細胞としてはたとえば NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP_ 1などがあげられるが、 P 3U 1などが好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄細胞数との好ましい比率は、 通 常 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG 6000) が 10~β 0 %程度の濃度で添加され、 通常 20〜 40 °C、 好まし くは 30〜37°Cで、 通常 1〜10分間インキュベートすることにより効率よ く細胞融合を実施できる。
抗 NPW抗体産生八ィプリドーマのスクリ一エングには種々の方法が使用できる が、 例えば NPWまたはその部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた 固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射 性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細 胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテ イン Aを加え、 固相に結合した抗 NPWモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免 疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養 上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識した NPWを加え、 固相に結合した NPWモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。 抗 NPWモノクローナ ル抗体のスクリーニング、 育種は通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノブテリ ン、 チミジン） を添加して、 10〜 20%牛胎児血清を含む動物細胞用培地 (例、 RPM I 1640) で行われる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗 NPW抗体価の測定と同様にして測定できる。
抗 NPWモノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精 製と同様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等 電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 DEAE) による吸脱着法、 超遠心 法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gな どの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的 精製法など〕 に従って行われる。
以上のようにして、 ハイプリドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培 養し、 その体液または培養物から抗体を採取することによって、 本発明の抗体 を製造することができる。
なお、 NPWの一部領域と反応する抗 NPW抗体を産生するハイプリドーマおよび、 NPWとは反応するがその一部領域とは反応しない抗 NPWモノク口一ナル抗体を産 生するハイプリドーマのスクリーニングは、 たとえばその一部領域に相当する ペプチドとハイプリドーマが産生する抗体との結合性を測定することにより行 うことができる。
C 1〕 本発明の抗体を用いる NPWの定量法および NPWの関与する疾患の診断法 NPWの定量法 （免疫測定法等） について、 以下に述べる。
本発明の抗体を用いることにより、 NPWの測定または組織染色などによる検出 を行なうことができる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また抗体分子の F (ab' ) 2、 Fab'または Fab画分などを用いてもよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定 液中の抗原量 （例えば、 NPW量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体—抗原複合 体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標 準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法 を用いてもよい。 例えば、 サンドイッチ法、 競合法、 ィムノメトリック法、 ネ フロメトリーなどが用いられるが、 感度、 特異性の点で後述するサンドイッチ 法、 競合法が、 特にサンドイッチ法が好ましい。
( 1 ) サンドイッチ法
担体上に不溶化した本発明の抗体、 標識化された本発明の抗体および被検液 を反応させた後、 標識剤の活性を測定することにより被検波中の NPWを定量する。 好ましくは、
( 0 担体上に不溶化した NPWの N端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体、 標識化された NPWの C端側の部分べプチドに特異的に反応する抗体および被検液 を反応させた後、 標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の NPWの定 量法、
(i i) 担体上に不溶化した NPWの C端側の部分べプチドに特異的に反応する抗体、 標識化された NPWの N端側の部分べプチドに特異的に反応する抗体および被検液 を反応させた後、 標識剤の活性を測定することを特徴とする被検波中の NPWの定 量法などが挙げられる。
さらに好ましくは、 NPWの N端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体が、 AhW23N2G6Dl aで標示されるモノクローナル抗体または AhW23N3H3E4aで標示され るモノクローナル抗体で、 NPWの C端側の部分ペプチドに特異的に反応する抗体 が、 （a) AhW23C6GlH8aで標示されるモノクローナル抗体もしくは AhW23C5G2F6a で標示されるモノクローナル抗体、 または （b) ArW30C3AlAaで標示されるモノ クローナル抗体もしくは ArW30C7F2E8aで標示されるモノクローナル抗体である 定量法である。 これらの抗体は、 例えば西洋ヮサビパーォキシダーゼ
(horseradi sh peroxi dase； HRP) で標識化されて用いられるのが好ましい。 サンドイッチ法においては、 不溶化した本発明の抗体に被検波を反応 （1次 反応） させ、 さらに標識化された本発明の抗体を反応 （2次反応） させた後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の NPW量を定量する ことができる。 1次反応と 2次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして 行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることが できる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体または 標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を 向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 サンドイツ チ法による NPWの測定法においては、 例えば、 1次反応で用いられる抗体が NPW の C端側の部分ペプチドを認識する場合は、 2次反応で用いられる抗体は C端 側の部分ペプチド以外 （即ち、 N端側） を認識する抗体が好ましく、 1次反応 で用いられる抗体が NPWの N端側の部分べプチドを認識する場合は、 2次反応で 用いられる抗体は、 N端側の部分ペプチド以外 （即ち、 C端側） を認識する抗 体が好ましく用いられる。
( 2 ) 競合法
本発明の抗体、 被検液および標識化された NPWとを競合的に反応させ、 該抗体 に結合した標識化された NPWの割合を測定することにより、 被検液中の NPWを定 量する。
本反応法は、 例えば、 固相化法を用いて行う。 具体例としては、 抗マウス IgG抗体 （ICN/CAPPEL社製） を固相化抗体として用 レ 、 この固相化抗体の存在するプレートに、 i)本発明の抗体 （例、
AhW23N2G6Dl a, AhW23N3H3E4a, AhW23C6GlH8a, AhW23C5G2F6a, ArW30C3AlAa, ArW30C7F2E8aなど） 、 i i ) horseradi sh peroxidase (HRP) で標識化された NPW、 および i i i) 被検液を添加し、 反応後、 固相に吸着した HRP活性を測定し、 NPWを 定量する。
( 3 ) ィムノメトリック法'
ィムノメトリック法では、 被検波中の钪原と固相化抗原とを一定量の標識化 された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 ある いは被検波中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、 次に 固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原 量を定量する。
( 4 ) ネフロメトリ一
ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不 溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降物 しか得られない場合にもレ一ザ一の散乱を利用するレーザーネフロメトリーな どが好適に用いられる。
上記 （1 ) 〜 （4 ) において、 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤 としては、 標識剤としては、 例えば、 放射性同位元素 （例、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔14C〕 、 〔32P〕 、 C33P) 、 〔 〕 など） 、 蛍光物質 〔例、 シァニン蛍 光色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイエンス社製） など） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネ一トなど〕 、 酵素 '(例、 3—ガラクトシダ一ゼ、 |8—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一 ゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素など） 、 発光物質 （例、 ルミノー ル、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなど） 、 ピオチン、 ラン夕 ニド元素などが用いられる。 さらに、 抗体と標識剤との結合にピオチン一アビ ジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 例えばァガロース、 デキストラン、 セル口 —スなどの不溶性多糖類、 例えばポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコ ンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、 特別の条 件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操 作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて NPWの測定系を構築すればよい。 これ らの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することがで きる [例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発 行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行） 、 石 川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編
「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 62年発行） 、 「Methods in
ENZYM0L0GY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) ) 、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B) ) 、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0) 、 同書 Vol. 84 (I廳删 chemical Techniques (Pari D: Selected Immunoassays) ) 、 同書 Vol . 92 (I匪漏 chemical
Techniques (Part E :Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay
Methods) ) 、 同書 Vol . 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and Monoc lonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発 行） など参照] 。 したがって、 本発明のサンドイッチ免疫測定法により NPWの測 定系を構築する場合、 その方法は後述する実施例に限定されない。
以上のように、 本発明の抗体は、 NPWを感度良く定量することができるので、 NPWのさらなる生理機能の解明および NPWの関与する疾患の診断に有用である。 例えば、 本発明の抗体を用いて、 体液中 （血液、 血漿、 血清、 尿、 卵胞液、 脊髄液、 精液など） に含まれる NPWの量を測定することにより、 NPWが関与する 疾患 〔例、 拒食症、 肥満症 （例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシユリ ン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下 肥満症、 視床下部性肥満、 症候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満 症、 性機能低下性肥満、 全身性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊 症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ ·フロンメル症 候群、 アルゴンッ 'デル'カスティ口症候群、 フォーべス 'アルブライト症候 群、 リンパ腫、 シ一ハン症候群、 精子形成異常、 腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリ ゥム血症、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群 （SIADH) 、 高血圧、 蓄尿障害 （例、 頻尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） など） 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカリローシス、 低カリウム血症、 Cushing症候群、 上部消化管疾患 (例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zol l inger - El l ison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspeps i a) 、 胃 癌、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 潰 瘍など） 、 消化不良症 （例、 下垂体性消化不良症、 腎性消化不良症など） 、 骨 代謝障害 （例、 骨粗しょう症、 骨軟化症など） 、 貧血症 （例、 鉄欠乏性貧血な ど） など〕 に罹患している、 または将来罹患する可能性が高いと診断すること ができる。
例えば、 胃酸過多症の診断においては、 体液中の NPWを定量し、 NPWの量が正 常時より多い場合、 例えば、 血中濃度として約 10 fmol/ml以上、 好ましくは約 15 fmol/ml以上の場合、 胃酸過多症と診断する。
〔2〕 本発明の抗体を含有してなる医薬
本発明の抗体は、 NPWの活性 （例、 GPR7結合活性、 GPR8結合活性、 GPR7細 J3包剌 激活性、 GPR8細胞刺激活性、 摂食行動抑制作用、 プロラクチン産生作用、 抗利 尿作用、 胃酸分泌促進作用など） を中和するため、 NPWが関与する疾患、 例えば 拒食症、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノ一 マ、 不妊症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ ·フ口 ンメル症候群、 アルゴンッ 'デル'カスティ口症候群、 フォーべス 'アルブラ イト症候群、 リンパ腫、 シ一ハン症候群、 精子形成異常、 腎性浮腫、 尿排出障 害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリウム血症、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群 （SIADH) 、 高血圧、 上部消 化管疾患 （例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、
Zol l inger- El l i son症候群など) 、 胃炎、 逆流性食道炎、 UD (Non Ulcer
Dyspeps ia) 、 胃癌、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 潰瘍など） などの予防 ·治療剤、 摂食 （食欲） 促進剤などの安全な 医薬として使用することができる。 中でも不妊症、 腎性浮腫、 消化性潰瘍、 胃 酸過多症などの予防 ·治療剤が好ましい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的 に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成 物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
例えば、 非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが 用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴 注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に 溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性 剤 〔例、 ポリソルべ一ト 80、 HCO-50 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどを併用してもよい。 i周製された注射液は、 通常、 適当なアン プルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通 常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的 には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコ一ティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあ げられる。 かかる組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通 常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠 剤用の担体、 陚形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシ ゥムなどが用いられる。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜 100mg、 その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好まし い。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤は低毒性であり、 そのまま 液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口 的または非経口的に投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の胃酸過多症の治療 のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 01〜20mg/kg 体重程度、 好ましくは 0. 1〜10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体 重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 非経口投与するのが好 都合である。 経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状 が特に重い場合には、 その症状に応じて増量してもよい。 本発明の明細書において、 アミノ酸等を略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commi s i on on Biochemi cal Nomenc l ature による略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 アミノ酸に関し光学異性 体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
G 1 y ：グリシン
A 1 a ：ァラニン Va 1 ：パリン
Le u ：ロイシン
I 1 e ：ィソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
Cy s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グルタミン酸
As p ：ァスパラギン酸
L y s • "ジン
A r g ：アルギニン
H i s . ヒスチジン
Ph e ：フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：ダル夕ミン
TFA ： トリフ レ才ロ酢酸
DMF ： N，N—ジメチルホルムアミド
S PDP ： 3 - (2-ピリジルジチォ）プロピオン酸 N-スクシンィミジル
GMBS ： N- (4-マレイミドプチリルォキシ）スクシンイミド
B S A ：ゥシ血清アルブミン
BTG ：ゥシチログロブリン
E T A • J"ンザ'ィムィムノア、ソセィ
HPLC ：逆相高速液体クロマトグラフィー
HRP ：西洋ヮサビパーォキシダ一ゼ
FB S ：ゥシ胎児血清
d-FB S ：透析済みゥシ胎児血清 TMB 3， 3，， 5， 5，- NMP N -メチルピロリドン
B o c ターシヤリブトキシカルポニル
Fmo c 9 -フルォレニルメトキシカルボニル
DCC
P b f -5-スルホニル t B u ターシヤリブチル
T r t 卜リチル
T o s パラトルエンスルホニル
D I EA N, Ν'-ジイソプロピルェチルァミン
HOB t 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HOA t 卜ヒドロキシ- 7-ァザべンゾトリアゾール
P y Ao p 7 -ァザべンゾトリァゾール- 1-ィルォキシトリスピロリジノホス ホニゥム へキサフルォロホスフェイト
C 1 t 2 -クロロトリチル
BHA 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
以下の実施例 1において使用した免疫原作製用のペプチド （本明細書におい て peptide-1と記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
以下の実施例 1において使用した免疫原作製用のペプチド （本明細書におい て peptide- 2と記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
以下の実施例 1において使用した免疫原作製用のペプチド （本明細書におい て peptide- 3と記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4〕
ヒトニユーロペプチド W (1-23) (本明細書においてヒト NPW 23と 記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：. 5〕
ヒトニュ一口ペプチド W (1— 30) (本明細書においてヒト NPW30と 記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
ラットニユーロペプチド W (1-23) (本明細書においてラット NPW2 3と記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7〕
ラットニユーロペプチド W (1-30) (本明細書においてラット NPW3 0と記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
マウスニューロペプチド W (1-23) (本明細書においてマウス NPW2 3と記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 9〕
マウスニューロペプチド W (1— 30) (本明細書においてマウス NPW3 0と記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 10〕
ブ夕ニューロペプチド W (1— 23) (本明細書においてブ夕 NPW23と 記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 11〕
ブ夕ニューロペプチド W (1-30) (本明細書においてブタ NPW30と 記載することがある） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 12〕
以下の実施例 1において作製したピオチン標識化 peptide- 1のアミノ酸配列を 示す。 Xaaは Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES)によってビ ォチン標識された Cys残基を示す。
〔配列番号： 13〕
, 以下の実施例 1において作製したピオチン標識化 peptide- 2のアミノ酸配列を 示す。 Xaaは Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES)によってビ ォチン標識された Cys残基を示す。
〔配列番号： 14〕
以下の実施例 1において作製したピオチン標識化 peptide- 3のアミノ酸配列を 示す。 Xaaは Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES)によってビ ォチン標識された Cys残基を示す。
〔配列番号： 1 5〕
ヒト GP R 7のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 16〕
配列番号： 15で表されるアミノ酸をコードする DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 17〕
ヒト G P R 8のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 18〕
配列番号： 17で表されるアミノ酸をコードする DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 19〕
ラット GPR7 (公知文献 （WO02/44368) に記載の TGR26と 同一のレセプタータンパク質） のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 20〕
配列番号： 19で表されるアミノ酸をコードする DNAの塩基配列を示す。 後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 AWV23N2G6D1は、 2003年 4月 23 日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 寄託番号 FERM BP- 8363と して寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 AhW23N3H3E4は、 2003年 4月 23 日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 寄託番号 FERM BP- 8364と して寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 AhW23C6GlH8は、 2003年 4月 23 日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 寄託番号 FERM BP-8365と して寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 AhW23C5G2F6は、 2003年 4月 23 日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) の独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、 寄託番号 FERM BP- 8366と して寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 ArW30C3AlAは、 2003年 4月 23日 から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政法 人産業技術総合研究所 特許生物寄託セン夕一に、 寄託番号 FERM BP- 8367とし て寄託されている。
後述の実施例 1で得られたハイプリドーマ細胞 ArW30C7F2E8は、 2003年 4月 23 日から茨城県つぐば市東 1丁目 1番地 1 '中央第 6 (郵便番号 305- 8566) の独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ一に、 寄託番号 FERM BP- 8368と して寄託されている。
各ハイプリドーマ細胞から得られる抗体については細胞名の後に 「a」 を付け た形で表す。
後述の実施例で得られた抗体、 2G6-DK 3H3-E4, 5G2- F6、 6G1-H8, 3A1Aおよ び 7F2- E8は、 それぞれ AhW23N2G6Dla、 AhW23N3H3a AhW23C5G2F6a,
AhW23C6GlH8a, ArW30C3AlAaおよび ArW30C7F2E8aと表されることもある。 以下に、 実施例および参考例を示し、 本発明をより詳細に説明するが、 これ らは本発明の範囲を限定するものではない。
本明細書においてヒト NPW23、 ラット NPW23、 マウス およびブ夕 NPW23を 総称して NPW23と記載することがある。 また、 ヒ卜 NPW30、 ラット NPW30、 マウス NPW30およびブタ NPW30を総称して NPW30と記載することがある。 さらに、 NPW23 および NPW30を総称して NPWと記載することがある。 実施例 1
抗 NPWモノクローナル抗体の作製 ( 1 ) NPWのァミノ末端領域と結合する抗体作製のための免疫原の調製
NPWのァミノ末端領域と結合する抗体を作製するために、 ヒト NPW23のァミノ 末端 13残基ペプチドのカルボキシル末端にシスティンを付加したペプチド
(peptide- 1、 配列番号： 1) をシスティン残基を介してブ夕チログロブリンと の複合体とし、 免疫原を作製した。
2.5 mlの phosphate- buffered saline (PBS, Nissui Pharma)に溶解した 35.0 mgのブタチログロブリン (SIGMA) に、 9.1 mgの Sulfosuccinimidyl 4-(N- maleiiidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate (Sulfo-SMCC, PIERCE)を添カロし、 室温で 1時間攪拌した。 Sulfo-SMCCと反応したブ夕チログ Πίプリンを PD-10 (Amersham Biosciences)を利用した分子ふるいクロマトグラフィーにより、 大 過剰にある未反応の Su 1 f o-SMCCから分離した。 Su 1 f o-SMCCと反応したブタチ口 グロブリンにあらかじめ 0.2 mlの 0.1%酢酸溶液に溶かした 4 mgの peptide- 1
(配列番号： 1) と 1.8 mlの PBSを添加して 4°Cで 16時間攪拌し、 peptide- 1とブ タチログロブリンの複合体を得た。 この pep t i de- 1とブ夕チログ口ブリンの複合 体を NPWのァミノ末端領域と結合する抗体作製のための免疫原とした。
(2) NPW23の力ルポキシル末端領域と結合する抗体作製のための免疫原の調製 NPW23の力ルポキシル末端領域と結合する抗体を作製するために、 ヒト NPW23 の力ルポキシル末端 13残基ペプチドのァミノ末端にシスティンを付加したぺプ チド （peptide- 2、 配列番号： 2) をシスティン残基を介してブタチログロブリ ンとの複合体とし、 免疫原を作製した。
2.5 mlの PBSに溶解した 35.2 mgのブタチログロブリンに、 9.1 mgの Sulfo- SMCCを添加し、 室温で 1時間攪拌した。 Sulfo-SMCCと反応したブ夕チログロブ リンを PD- 10を利用した分子ふるいクロマトグラフィーにより、 大過剰にある未 反応の Sulfo-SMCCから分離した。 Sulfo-SMCCと反応したブタチログロブリンに あらかじめ 0.2 mlの 0.1%酢酸溶液に溶かした 4 mgの pept ide- 2 (配列番号：
2) と 1.8 mlの PBSを添加して 4°Cで 16時間攪拌し、 peptide- 2とブ夕チログロブ リンの複合体を得た。 この peptide- 2とブ夕チログロブリンの複合体を NPW23の 力ルポキシル末端領域と結合する抗体作製のための免疫原とした。
(3) NPW30のカルボキシル末端領域と結合する抗体作製のための免疫原の調製 NPW30の力ルポキシル末端領域と結合する抗体を作製するために、 ラット NPW30のカルボキシル末端 15残基ペプチドのァミノ末端にシスティンを付加した ペプチド （peptide-3、 配列番号： 3) をシスティン残基を介してブタチログ口 ブリンとの複合体とし、 免疫原を作製した。
2.5 mlの PBSに溶解した 20.0 mgの keyhole limpet hemocyanin (KLH,
PIERCE)に、 5.0 mgの Sulfo-SMCCを添加し、 室温で 1時間攪拌した。 Sulfo-SMCC と反応した KLHを PD- 10を利用した分子ふるいクロマトグラフィーにより、 大過 剰にある未反応の Sulfo-SMCCから分離した。 Sulfo-SMCCと反応した KLmこあらか じめ 0.2 mlの 0.1 %酢酸溶液に溶かした 4 mgの peptide- 3 (配列番号： 3) と 1.8 mlの PBSを添加して 4°Cで 16時間攪拌し、 peptide- 3とブタチログロブリンの 複合体を得た。 この peptide_3とブタチログロブリンの複合体を NPW30の力ルポ キシル末端領域と結合する抗体作製のための免疫原とした。
(4) マウスの免疫
上記 （1) 、 （2) および （3) に記載の方法によって調製した各免疫原に フロイント完全アジュバントを混合し、 各ペプチド （peptide_l、 peptide- 2ま たは peptide- 3) 0.1 mgに相当する混合物を Balb/cマウス （雌、 6〜8週齢） の 腹腔内にそれぞれ投与した。 初回免疫からおよそ 4週間後、 上記 （1) 、
(2) および （3) に記載の方法によって調製した免疫原とフロイン卜の不完 全アジュバントを混合し、 各ペプチド 0.05 mgに相当する混合物を初回免疫した Balb/cマウス （雌、 6〜8週齢） の腹腔内にそれぞれ投与した。 2回目の免疫 以降、 抗体価が上昇するまで 2週間間隔で各ペプチド 0.05 mgに相当する免疫原 とフロイントの不完全アジュバントの混合物をそれぞれ免疫した。
(5) Peptide - 1、 peptide- 2および peptide-3のピオチン標識化
Peptide - 1 (配列番号： 1) 、 peptide - 2 (配列番号： 2) および peptide - 3 (配列番号： 3) のシスティン残基をピオチンにより標識してピオチン標識化 した peptide- 1、 peptide- 2および peptide- 3を合成した。 50 nmolの各ペプチド と 500 nmolの Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR LABORATORIES)を 0.5 mlの 0.1 Mリン酸緩衝液 （pH 7.0)に溶解し、 この溶液を 37°Cで 3時間保温した。
Peptide- 1、 peptide- 2および p印 tide- 3のシスティン残基のみがピオチンによつ て標識された生成物をそれぞれ HPLCによって分取し、 ビォチン標識化 pep tide-1 (配列番号： 12) 、 ピオチン標識化 peptide- 2 (配列番号： 1 3) およびピオ チン標識化 peptide- 3 (配列番号： 14) を得た。
(6) NPWのァミノ末端領域と結合する抗体の抗体価の測定
NPWのァミノ末端領域と結合する抗体の抗体価はピオチン標識化 peptide - 1
(配列番号： 12) を使用した酵素免疫法により測定した。 抗マウス IgG固相化 プレートを以下のように作製した。 50 mM炭酸緩衝液 （pH 9.6)で10^^/1111に希 釈したャギ抗マウス IgG (Fc) (ICN Biomedicals) を 96ゥエルィムノプレートに 1ゥエル当たり IOO I添加し、 4°Cで 3日間静置した。 ゥエル内の溶液を捨て、 ブ ロックエース （雪印乳業） を 1ゥエル当たり 350 1添加し、 4°Cで 3日間静置した。 ゥエル内の溶液を捨て、 3%ショ糖およびり.1%ゥシ血清アルブミン （BSA) を含 む PBSを 1ゥエル当たり 350 1添加し、 4°Cで 1日間静置した。 ゥエル内の溶液を 捨て、 デシケ一夕一内で 3日間乾燥させた後、 このプレートを使用するまで 4°C で保存した。
上記 （1) に記載の方法により調製した peptide-1とブ夕チログロブリンの複 合体を免疫したマウスから得た血清を 0.1 %BSAを含む PBSで種々の倍率で希釈し た。 希釈血清溶液 50 l、 0.1%BSAを含む PBSまたは NPW23溶液 50 および上記 (5) に記載の方法により作製したピオチン標識化 peptide- 1溶液を 0.1% BSA を含む？83で1000〜64000倍に希釈した溶液50 ^を上記のょぅにして作製した抗 マウス IgG固相化プレートのゥエルに添加して室温で 2〜3時間静置した。 ゥエル 内の溶液を捨て、 ゥエルを 0.9%塩化ナトリウムおよび 0.05% Tween20を含む蒸 留水で 4回洗浄した。 ストレブトァビジン一西洋ヮサビペルォキシダーゼ
(HRP) 複合体溶液 (Calbiochem) を 0.1% BSAを含む PBSで 12000倍に希釈し、 この希釈溶液 ΙΟθ ΐを各ゥエルに添加し、 室温で 1時間静置した。 ゥエル内の 溶液を捨て、 ゥエルを 0.9%塩化ナトリウムおよび 0.05% Tween20を含む蒸留水 で 4回洗浄した。 HRPの基質は、 10 mgのオルソフエ二レンジァミン錠剤 (SIGMA) を 33 mMクェン酸および 0.015%過酸化水素を含む 66 mMリン酸水素ニナトリウム 十二水和物水溶液 11 mlに溶解して調製した。 この基質溶液 100 lをそれぞれの ゥエルに添加して室温で 10〜30分間静置した。 100 1の 2 N硫酸をそれぞれのゥ エルに添加して反応を止めた後、 基質溶液の 492 nmにおける吸光度を測定した。 ゥヱルの吸光度が高い場合は血清中に NPWのァミノ末端領域と結合する抗体が存 在することを意味する。 また、 吸光度が過剰量の NPWの添加によりパックグラウ ンド程度に低下することはこの抗体と NPWのァミノ末端領域との結合が配列特異 的であることを意味する。
(7) NPW23の力ルポキシル末端領域と結合する抗体の抗体価の測定
NPW23の力ルポキシル末端領域と結合する抗体の抗体価はピオチン標識化 peptide- 2 (配列番号： 13) を使用した酵素免疫法により測定した。 抗マウス IgG固相化プレートは上記 （6) に記載の方法で作製した。 上記 （2) に記載の · 方法により調製した peptide- 2とブタチログロブリンの複合体を免疫したマウス から得た血清を 0.1 % B S Aを含む PBSで種々の倍率で希釈した。 希釈血清溶液 50 K 0.1% BSAを含む PBSまたは NPW23溶液 50 1および上記 （5) に記載の方 法 より作製したピオチン標識化 peptide- 2溶液を 0.1% BSAを含む: PBSで 1000〜 64000倍に希釈した溶液 50 zlを抗マウス IgG固相化プレートのゥエルに添加して 室温で 2〜3時間静置した。 ゥエル内の溶液を捨て、 ゥエルを 0.9%塩化ナトリウ ムおよび 0.05% Tween20を含む蒸留水で 4回洗浄した。 ストレプトアビジン一 HRP複合体溶液を 0.1% BSAを含む PBSで 12000倍に希釈し、 この希釈溶液 100 1 を各ゥエルに添加し、 室温で 1時間静置した。 ゥエル内の溶液を捨て、 ゥエルを 0.9%塩化ナトリウムおよび 0.05% Tween20を含む蒸留水で 4回洗浄した。 HRPの 基質は実施例 8と同様にして調製し、 基質溶液 100 1をそれぞれのゥエルに添 加して室温で 10〜30分間静置した。 100 / 1の 2 N硫酸をそれぞれのゥエルに添加 して反応を止めた後、 基質溶液の 492 nmにおける吸光度を測定した。 ゥエルの 吸光度が高い場合は血清中に NPW23の力ルポキシル末端領域と結合する抗体が存 在することを意味する。 また、 吸光度が過剰量の NPW23の添加によりパックダラ ゥンド程度に低下することはこの抗体と NPW23カルボキシル末端領域との結合が 配列特異的であることを意味する。
( 8 ) NPW30の力ルポキシル末端領域と結合する抗体の抗体価の測定
NPW30の力ルポキシル末端領域と結合する抗体の抗体価はピオチン標識ィ匕 peptide- 3 (配列番号： 14) を使用した酵素免疫法により測定した。 抗マウス IgG固相化プレートは、 上記 （6) に記載の方法で作製した。 上記 （3) に記載 の方法により調製した peptide_3と KLHの複合体を免疫したマウスから得た血清 を 0.1% BSAを含む PBSで種々の倍率で希釈した。 希釈血清溶液 50 1、 0.1% BSAを含む PBSまたは NPW30溶液 50 1および上記 （5) に記載の方法により作製 したピオチン標識化 peptide_3溶液を 0.1% BSAを含む PBSで 1000〜64000倍に希 釈した溶液 50 / 1を抗マウス IgG固相化プレー卜のゥエルに添加して室温で 2〜3 時間静置した。 ゥエル内の溶液を捨て、 ゥエルを 0.9%塩化ナトリウムおよび 0.05% Tween20を含む蒸留水で 4回洗浄した。 ストレプトアビジン一 HRP複合体 溶液を 0.1 %BSAを含む PBSで 12000倍に希釈し、 この希釈溶液 100 n 1を各ゥエル に添加し、 室温で 1時間静置した。 ゥエル内の溶液を捨て、 ゥエルを 0.9%塩ィ匕 ナトリウムおよび 0.05% Tween20を含む蒸留水で 4回洗浄した。 HRPの基質は実 施例 8と同様にして調製し、 基質溶液 100 1をそれぞれのゥエルに添加して室 温で 10〜30分間静置した。 100^1の 2 N硫酸をそれぞれのゥエルに添加して反応 を止めた後、 基質溶液の 492 nmにおける吸光度を測定した。 ゥエルの吸光度が 高い場合は血清中に NPW30の力ルポキシル末端領域と結合する抗体が存在するこ とを意味する。 また、 P 光度が過剰量の NPW30の添加によりバックグラウンド程 度に低下することはこの抗体と NPW30力ルポキシル末端領域との結合が配列特異 的であることを意味する。
(9) 細胞融合、 抗体産生ハイプリドーマのスクリーニング、 モノクローナル 抗体取得と腹水取得
上記 （4) に記載の方法によって免疫したマウスの血清の各抗原に対する抗 体価を上記 （6) 、 (7) または （8) に記載の方法によって測定し、 比較的 高い抗体価を示したマウスに対して 0.05 mgの免疫原を 50 lの PBSに溶解した溶 液を静脈内に投与することにより最終免疫を行なった。 最終免疫から 3〜4日後 のマウスから脾臓を摘出し、 ステンレスメッシュで圧迫した後、 ろ過し、 RPMI 1640培地 に浮遊させて脾臓細胞浮遊液を得た。 細胞融合に用いる細胞として Balb/c由来ミエローマ細胞 P3X63Ag8.653を用いた。 細胞融合は原報 （Kohler, G. & Milstein, 、 Nature, 256巻、 495頁、 1975年） に準じて行なった。 すなわ ち、 脾臓細胞および P3X63Ag8.653をそれぞれ血清を含有しない RPMI 1640で 3度 洗浄し、 脾臓細胞と P3X63Ag8. 653細胞の細胞数の比率を 10： 1になるよう混合し て 800回/分の回転数で 15分間遠心を行なって細胞を沈澱させた。 上清を充分に 除去した後、 沈殿を軽くほぐし、 0. 2 mlのポリエチレングリコール （HYBRI- MAX, SIGMA)を 30秒間かけて加え、 次に 5 mlの RPMI 1640を 2分間かけて加え、 最後に 5 mlの RPMI 1640を加えた。 この混合液を 37 で 3分間保温して細胞融合を進行さ せた。 融合後、 600回/分の遠心速度で 15分間遠心した。 この細胞沈殿物に HAT (ヒポキサンチン Ixl 0—4M、 アミノプテリン 4xl O—7M、 チミジン 1. 6x10— 3M) およ び 10%ゥシ胎児血清を含む RPMI 1640培地を加えて P3X63Ag8. 653の細胞数が 0. 2 ml 当り 2〜3xl05個になるように調製し、 96ゥエルプレートに 1ゥエルあたり 0. 2 mlを播種した。 培養開始後 9〜14日で培養液が黄変したとき上清を採取し、 細胞融合されたハイプリドーマの培養上清中の抗体価を上記 （6 ) 、 ( 7 ) ま たは （8 ) に記載の方法によってそれぞれ測定した。
ハイプリド一マ培養上清中に NPWのァミノ末端、 NPW23の力ルポキシル末端ま たは NPW30の力ルポキシル末端に対して特異的に結合する抗体の存在を確認した 後、 これらのハイプリドーマ細胞を限界希釈法によりクローニングした。 1ゥェ ル当たり 5xl05個の Balb/cマウス胸 J3泉細胞をあらかじめ播種した 96ゥエルプレ —トに平均 1個のハイプリドーマを含む 100 lの培養液 （HATおよび 10%ゥシ胎 児血清を含む RPMI 1640) をそれぞれ添加した。 10日間培養した後、 一つのコロ ニーからなるハイプリドーマが生育したゥエルの培養上清中の抗体価を測定し、 NPWのァミノ末端、 NPW23の力ルポキシル末端あるいは NPW30の力ルポキシル末端 に対してそれぞれ特異的な抗体を産生するハイプリドーマ細胞を選択した。
腹腔内に 0. 5 mlのプリスタンを投与したヌードマウス （Balb/c AnNCrj - nu/nu、 雌、 6〜8週齢） に、 1匹当たり lxlO6から 5xl 06個の上記のようにして選択した ハイプリドーマ細胞を腹腔内投与し、 6〜20日後に抗体含有腹水を採取した。 得 られた腹水よりモノクローナル抗体をプロテイン Aカラムにより精製した。 即 ち、 6〜20mlの腹水を等量の結合緩衝液 （3. 5M NaCK 0. 05 % NaN3を含む 1. 5M グリシン緩衝液 （PH9. 0) ) で希釈した後、 あらかじめ結合緩衝液で平衡化した プロテイン A—セルロース （生化学工業）'カラムに供し、 特異抗体を溶離緩衝 液 （0. 05 % NaN3を含む 0. 1Mク Xン酸緩衝液、 pH3. 0) で溶出した。 この抗体を 含む溶出液を中和した後、 Centriplus YM- 50 (Amicon)により濃縮した。 この抗 体濃縮液に PBSを加えて、 Centriplus YM- 50による濃縮を繰り返すことにより抗 体が溶けている緩衝液を PBSに置換した。
( 1 0 ) NPWのァミノ末端領域と結合するモノクローナル抗体
上記 （9 ) に記載の方法により取得した NPWのァミノ末端領域に特異的に結合 する抗体を産生するハイプリドーマ細胞から得られた 4種類のモノクローナル抗 体、 2G6- Dl、 3H3-E4, 5E6- C3および 7F9-E12について酵素免疫法によって pept ide- 1 (配列番号： 1 )、 ヒト NPW23 (配列番号： 4 ) およびヒト NPW30 (配 列番号： 5 ) を認識することを確認した。 マウス IgG固相化プレートを以下のよ うにして作製した。 50 mM炭酸緩衝液 （pH 9. 6)で 10 g/mlに希釈したャギ抗マ ウス IgG (Fc) (ICN Biomedicals) を 96ゥエルィムノプレートに 1ゥエル当たり 150 1添加し、 4°Cで 1日間静置した。 ゥエル内の溶液を捨て、 ブロックエース を 1ゥエル当たり 200 1添加し、 このプレ一トを使用するまで 4°Cで保存した。
2G6-DK 3H3-E4, 5E6-C3または 7F9-E12抗体を産生するハイブリドーマ培養上 清を EIA緩衝液 （0. 1 %BSA、 0. 4%塩化ナトリウム、 2 M EDTA、 0. 05% CHAPS . (3- ( (3-cholamidopropyl) dimethyla monio) -l-propanesul fonate) 20 mMUン 酸緩衝液 （PH 7. 0) ) によりそれぞれ固定した倍率 （50〜1000倍） で希釈した。 これらの抗体溶液 50 1、 種々の濃度に EIA緩衝液で希釈した pept ide-1 (配列番 号： 1 ) 、 ヒト NPW23 (配列番号： 4) またはヒト NPW30 (配列番号： 5 ) 溶液 50 1および EIA緩衝液で 75000倍希釈したピオチン標識化 pept ide- 1溶液 50 1を 上記のマウス IgG固相化プレートに添加した。 これらのプレートを 4°Cで 16時間 静置した後、 それぞれのゥエルを PBSで洗浄した。 各ゥエルに EIA緩衝液で 20000 倍に希釈したストレプトアビジン一 HRP溶液 150 1 を加えて室温で 2時間静置し た。 PBSで洗浄した後、 TMBマイクロウェルパーォキシダーゼ基質
( IRKEGAARD&PERRY LAB, INC) 150 1 を添加して室温で静置した。 反応を 1 M リン酸 75 を加えて停止した後、 450 nmにおける吸光度をプレートリーダー (BICHR0MATIC, 大日本製薬社製） で測定した。 この反応系で相対的結合 （％) とは、 抗体溶液、 EIA緩衝液およびピオチン標識化 pept ide- 1溶液を添加したゥ エルの吸光度から EIA緩衝液とピオチン標識化 pept ide- 1溶液を添加したゥエル の吸光度を減じた値を 100%結合としたときのそれぞれのゥエルにおける吸光度 から EIA緩衝液とピオチン標識化 pept i de-1溶液を添加したゥエルの吸光度を減. じた値の相対値である。
図 1、 図 2、 図 3および図 4に示すように、 2G6- Dl、 3H3_E4、 5E6- C3および 7F9- E12抗体とピオチン標識化 pepUde_lとの結合は濃度依存的に pept ide- 1、 ヒ ト NPW23およびヒト NPW30によって阻害された。
このことは、 2G6- Dl、 3H3-E4, 5E6- C3および 7F9- E12抗体は、 NPWのァミノ末 端領域を認識して NPWと結合することを意味する。
NPWのァミノ末端領域を特異的に認識する抗体である 2G6- Dl (AhW23N2G6Dl a) および 3H3- E4 (AhW23N3H3a) を産生するハイプリドーマ細胞を、 AhW23N2G6Dlお よび AhW23N3H3E4とそれぞれ命名した。
( 1 1 ) NPW23の力ルポキシル末端領域と結合するモノクローナル抗体
上記 （9 ) に記載の方法により取得した NPW23のカルボキシル末端領域に特異 的に結合する抗体を産生するハイプリドーマ細胞から得られた 6種類のモノク ローナル抗体、 2F1B2A, 5A2A、 5D6- F10、 5G2_F6、 6G1-H8および 7B4-D2について 酵素免疫法によって pept i de- 2 (配列番号： 2 )およびヒト NPW23 (配列番号： 4 ) を認識することを確認した。 マウス IgG固相化プレートは、 上記 （1 0 ) に 従って作製した。 2F廳、 5A2A、 5D6-F10、 5G2-F6, 6G1- H8または 7B4-D2抗体を 産生するハイプリドーマ培養上清を上記 （1 0 ) に記載の EIA緩衝液によりそれ ぞれ固定した倍率 （30〜1000倍） で希釈した。 これらの抗体溶液 50 1、 種々の 濃度に EIA緩衝液で希釈した pept ide- 2 (配列番号： 2 )、 ヒト NPW23 (配列番 号： 4 ) またはヒト NPW30 (配列番号： 5 ) 溶液 50 および EIA緩衝液でそれぞ れ固定した倍率 （75000〜225000倍） に希釈したピオチン標識化 pept ide- 2溶液 をマウス IgG固相化プレートに添加した。 これらのプレートを 4°Cで 16時間 静置した後、 それぞれのゥエルを PBSで洗浄した。 各ゥエルに EIA緩衝液で 20000 倍に希釈したストレプトアビジン—HRP溶液 150 1 を加えて室温で 2時間静置し た。 PBSで洗浄した後、 TMBマイクロウェルパ一ォキシダーゼ基質 150 1 を添加 して室温で静置した。 反応を 1 Mリン酸 75 を加えて停止した後、 450 nmにお ける吸光度をプレー卜リーダーで測定した。 この反応系で相対的結合 （％) と は、 抗体溶液、 EIA緩衝液およびピオチン標識化 peptide- 2溶液を添加したゥェ ルの吸光度から EIA緩衝液とピオチン標識化 peptide- 2溶液を添加したゥエルの 吸光度を減じた値を 100%結合としたときのそれぞれのゥエルにおける吸光度か ら EIA緩衝液とピオチン標識化 peptide- 2溶液を添加したゥエルの吸光度を減じ た値の相対値である。
図 5、 図 6、 図 7、 図 8、 図 9および図 1.0に示すように、 2F1B2A、 5A2A、 5D6-F10, 5G2-F6, 6G卜 H8および 7B4-D2抗体とピオチン標識化 peptide_2との結 合は peptide- 2およびヒト NPW23によって阻害された。
このことは、 2F1B2A、 5A2A、 5D6- F10、 5G2-F6, 6G卜 H8および 7B4-D2抗体は NPW23の力ルポキシル末端領域を認識して NPW23と結合することを意味する。
NPW23の力ルポキシル末端領域を特異的に認識する抗体である 5G2-F6
(AhW23C5G2F6a) および 6G卜 H8 (AhW23C6GlH8a) を産生するハイプリドーマ細 胞をそれぞれ AhW23C5G2F6および AhW23C6GlH8と命名した。
(12) NPW30のカルボキシル末端領域と結合するモノクローナル抗体
上記 （9) に記載の方法により取得した NPW30のカルボキシル末端領域に特異 的に結合する抗体を産生するハイプリドーマ細胞から得られた 3種類のモノク 口一ナル抗体、 2A1A、 3A1Aおよび 7F2-E8について酵素免疫法によって peptide - 3 (配列番号： 3) およびヒト NPW30 (配列番号： 5) を認識することを確認した。 マウス IgG固相化プレートは、 上記 （10) に従って作製した。 2A1A、 3A1Aまた は 7F2-E8抗体を産生するハイプリドーマ培養上清を上記 （10) に記載の EIA緩 衝液により 100倍希釈した。 これらの抗体溶液 50 1、 種々の濃度に EIA緩衝液で 希釈した peptide- 3 (配列番号： 3) 、 ヒト NPW23 (配列番号： 4) またはヒト NPW30 (配列番号： 5) 溶液 50 1および EIA緩衝液で 100000倍希釈したピオチン 標識化 peptide- 3溶液 50 ^1をマウス IgG固相化プレートに添加した。 これらのプ レートを 4°Cで 16時間静置した後、 それぞれのゥエルを PBSで洗浄した。 各ゥェ ルに EIA緩衝液で 20000倍に希釈したストレプトアビジン— HRP溶液 150 H を加 えて室温で 2時間静置した。 PBSで洗浄した後、 TMBマイクロウェルパーォキシ ダーゼ基質 150 1 を添加して室温で静置した。 反応を 1 Mリン酸 を加えて 停止した後、 450 nmにおける吸光度をプレートリーダ一で測定した。 この反応 系で相対的結合 (%) とは、 抗体溶液、 EIA緩衝液およびピオチン標識化 pept ide_3溶液を添加したゥエルの吸光度から EIA緩衝液とピオチン標識化 pept ide- 3溶液を添加したゥエルの吸光度を減じた値を 100%結合としたときの それぞれのゥエルにおける吸光度から E I A緩衝液とビォチン標識化 pep t i d e- 3溶 液を添加したゥエルの吸光度を減じた値の相対値である。
図 1 1、 図 1 2および図 1 3に示すように、 2A1A、 3A1Aおよび 7F2- E8抗体と ピオチン標識化 pept i de- 3との結合は pept ide- 3およぴヒト NPW30によって阻害さ れた。 このことは、 2A1A、 3A1Aおよび†F2- E8抗体は NPW30の力ルポキシル末端領 域を認識して NPW30と特合することを意味する。
NPW30の力ルポキシル末端領域を特異的に認識する抗体である 3A1A
(ArW30C3AlAa) および 7F2- E8 (ArW30C7F2E8a) を産生するハイブリドーマ細胞 をそれぞれ ArW30C3Al Aおよび ArW30C7F2E8と命名した。 実施例 2
抗 NPWモノク口一ナル抗体による NPWのァゴニスト活性の抑制
実施例 1一 （1 0 ) 、 1— ( 1 1 ) および 1 _ ( 1 2 ) に記載のモノクロ一 ナル抗体による NPWのァゴニスト活性に対する抑制作用を調べた。 NPWと抗 NPWモ ノクローナル抗体を室温で 1時間反応させた後、 この反応液を TO 02/93161号公 報記載の方法により作製したヒト GPR7 (配列番号： 1 5 ) を発現する CH0細胞株、 W0 01/98494号公報記載の方法により作製したヒト GPR8 (配列番号： 1 7 ) を発 現する CH0細胞株または W0 02/44368号公報記載の方法により作製したラット GPR7 (W0 02/44368に記載の TGR26と同一のレセプ夕一） （配列番号： 1 9 ) を 発現する CH0細胞株に添加してブォルスコリン （FSK) 刺激によるこれらの細胞 の cAMP蓄積を阻害する活性を測定した。
本実施例において用いた各 NPWと各抗 NPWモノクローナル抗体を希釈するバッ ファー （以下、 希釈バッファ一と称する） として 20 mM HEPES、 0. 05 % BSA、 2 j M FSKおよび 0. 2 mM 3-i sobutyl-l-methylxant ine (IBMX)を含む pH 7. 4の MEM ひ培地を用いた。 この希釈バッファーで調製した 2 nMの各 NPWと種々の濃度の各 抗 NPWモノク口一ナル抗体 IgG混合液を室温で 1時間保温した。 ヒト GPR7発現 CH0 細胞株、 ヒト GPR8発現 CH0細胞株またはラット GPR7発現 CH0細胞株は 5xl04個を 24 ゥエルプレートに播種して 2日間培養し、 各 NPWと各抗 NPW抗体の反応液を添加す る前に各ゥエルを 0. 5 mlの 20 mM HEPES、 0. 05% BSAおよび 0. 2 mM IBMXを含む ΜΕΜ α培地 （以下、 洗浄バッファーと称する） で 3回洗浄した後、 1ゥエル当たり 0. 5 mlの洗浄バッファ一を添加した。 30分間培養し、 さらに 0. 5 mlの洗浄バッ ファーで 3回洗浄した後、 1ゥエル当たり 0. 25 mlの洗浄バッファーと 0. 25 mlの NPWと抗 NPW抗体の反応液を添加した。 37°Cで 30分間保温した後、 各ゥエルに 0. 1 mlの 20%過塩素酸を添加することによって細胞内の cAMP合成反応を停止させ、 次に 24ゥエルプレートを氷上に 1時間置くことで cAMPを抽出した。 抽出液中の cAMP量は、 cAMP EIAシステム （Amersham Biosciences) で測定した。 cAMP蓄積 の相対値 （％) は、 測定試料添加の細胞内の cAMP量から FSK非添加の細胞内 cAMP 量を減じた値の FSK刺激のみの細胞内 cAMP量から FSK非添加の細胞内 cAMP量を減 じた値に対する相対比率である。
ヒト NPW23 (配列番号： 4 ) を NPWァミノ末端認識モノクローナル抗体である 2G6-DK 3H3- E4、 5E6- C3および 7F9- E12と反応させた後、 反応液をヒト GPR7発現 細胞株またはヒト GPR8発現細胞株に投与した。 ヒト NPW23のみの投与によりヒト GPR7発現細胞内の cAMP量は FSK刺激のみの場合に比べ 46%に減少したが、 ヒト NPW23をモル比で 30倍過剰量の 2G6- Dl、 3H3- E4、 5E6- C3および 7F9-E12と反応さ せることによりヒト GPR7発現細胞内の cAMP量は FSK刺激のみの場合に比べ 97%、 93%、 69%および 81 %までそれぞれ回復した。 結果を図 1 4に示す。
一方、 ヒト NPW23のみの投与によりヒト GPR8発現細胞内の cAMP量は FSK刺激の みの場合に比べ 31 %に減少したが、 ヒト NPW23をモル比で 30倍過剰量の 2G6- Dl.、 3H3-E4, 5E6-C3および 7F9- E12と反応させることによりヒト GPR8発現細胞内の cAMP量は FSK刺激のみの場合に比べ 100%、 100%、 87%および 90%までそれぞれ 回復した。 結果を図 1 5に示す。
これらの結果は、 2G6- Dl、 3H3-E4, 5E6- C3および 7F9- E12がヒト NPW23の cAMP 合成阻害活性を抑制することを意味する。
ラット NPW23 (配列番号： 6 ) を NPWァミノ末端認識モノクローナル抗体であ る 3H3- E4、 5E6- C3および 7F9- E12と反応させた後、 反応液をラット GPR7発現細胞 株に投与した。 ラット NPW23のみの投与によりラット GPR7発現細胞内の cAMP量は FSK刺激のみの場合に比べ 9%に減少したが、 ラット NPW23をモル比で 30倍過剰量 の 3H3- E4、 5E6-C3および 7F9- El 2と反応させることにより GPR7発現細胞内の cAMP 量は FSK刺激のみの場合に比べ 53%、 17%および 32 %までそれぞれ回復した。 結 果を図 1 6に示す。
これらの結果は、 3H3- E4、 5E6 - C3および 7F9- 812がラッ卜^¥23の0^0>合成阻 害活性を抑制することを意味する。
ラット NPW23またはラット NPW30 (配列番号： 7 ) を NPWァミノ末端認識モノク ローナル抗体である 2G6- D1と反応させた後、 反応液をラット GPR7発現細胞株に 投与した。 ラット NPW23あるいはラット NPW30のみの投与によりラット GPR7発現 細胞内の cAMP量は FSK剌激のみの場合に比べ 8%および 31 %にそれぞれ減少した が、 ラッ卜 NPW23あるいはラッ卜 NPW30をモル比で 30倍過剰量の 2G6- D1と反応さ せることにより GPR7発現細胞内の cAMP量は FSK刺激のみの場合に比べ 38%および 60%までそれぞれ回復した。 結果を図 1 7に示す。
これらの結果は、 2G6- D1がラット NPW23およびラット NPW30の cAMP合成阻害活 性を抑制することを意味する。
ラッ卜 NPW23を NPW23力ルポキシル末端認識モノクローナル抗体である 2F1B2A、 5A2A, 5D6-F10, 5G2-F6, 6G卜 H8および 7B4- D2と反応させた後、 反応液をラット GPR7発現細胞株に投与した。 ラット NPW23のみの投与によりラット GPR7発現細胞 内の cAMP量は FSK刺激のみの場合に比べ 7%に減少したが、 ラット NPW23をモル比 で 30倍過剰量の 2F1B2A、 5A2A、 5D6- F10、 5G2-F6, 6G卜 H8および 7B4- D2と反応さ せたところ、 5A2A、 5G2-F6および 7B4- D2と反応させたときに GPR7発現細胞内の cAMP量は FSK刺激のみの場合に比べ 16%、 71 %および 73%までそれぞれ回復した。 結果を図 1 8に示す。 '
これらの結果は、 5A2A、 5G2- F6および 7B4-D2がラット NPW23の cAMP合成阻害活 性を抑制することを意味する。
ラット NPW30を NPW30力ルポキシル末端認識モノク口一ナル抗体である 3A1 Aお よび 7F2- E8と反応させた後、 反応液をラット G P R 7発現細胞株に投与した。 ラット NPW30のみの投与によりラット GPR7発現細胞内の cAMP量は FSK刺激のみの 場合に比べ 50%に減少したが、 ラット NPW30をモル比で 150倍過剰量の 3A1Aおよ び 7F2-E8と反応させることにより GPR7発現細胞内の CAMP量は FSK刺激のみの場合 に比べ 75%および 72%までそれぞれ回復した。 結果を図 1 9に示す。
これらの結果は、 3A1Aおよび 7F2- E8がラット NPW30の cAMP合成阻害活性を抑制 することを意味する。 実施例 3
NPW23および NPW30を定量する 2抗体 EIA系の設定
( 1 ) NPWのァミノ末端を認識する抗体の酵素標識体の作製
NPWのァミノ末端を認識するモノクローナル抗体である 2G6- D1の酵素標識を以 下のようにして行った。 2 mlの PBSに溶解した 4.4 mgの 2G6- Dl IgG溶液 1リット ルの 0. 1 Mリン酸バッファー （pH 6. 7) に対して 4°Cで 16時間透析した。 透析し た IgG溶液に 50 1の N， N-ジメチルホルムアミド （DMF) ヒ溶解した 6. 4 mMの N- (4-maleimidobutyryloxy) -succinimide (GMBS, 同仁化学） を添加した後、 この' 混合液を攪拌しながら室温で 40分間静置した。 この反応液を Sephadex G-25
(Amersham Biosciences) カラムに添加し、 4°Cで分子ふるいクロマトグラフィ ― (バッファ一： 0. 1 Mリン酸バッファ一 （pH 6. 7) 、 流速： 0. 5 ml/min) を行 つて IgG画分を得た。 これと同時に 1. 1 mlの 0. 1 M塩化ナトリウムを含む 20 mMリ ン酸バッファー （PH 6. 8) に溶解した 7. 3 mgの HRP溶液に 60 lの DMFに溶解した 45. 5 mMの N- succ inimidyl 3- (2-pyr idyldi thio) propionate (SPDP、 和光純薬） を添加した後、 この混合液を攪拌しながら窒温で 40分間保温した。 この HRPと SPDPの反応液に 400 lの 100 mM酢酸バッファー （pH 4. 5) に溶解した 5. 48 mMの ジチオスレィトール （DTT、 和光純薬） を添加した後、 この混合液を攪拌しなが ら室温で 20分間静置した。 この反応液を Sephadex G - 25 カラムに添加し、 4°Cで 分子ふるいクロマトグラフィー （バッファ一： 0. 2 mM EDTAを含む 0. 1 Mリン酸 バッファー （PH 6. 0) 、 流速： 0. 5 ml/min) を行って HRP画分を得た。 この HRP 画分と先に示した IgG画分の混合液を Centr iplus YM-10 (MILLIPORE) で約 2 ml に濃縮した後、 この濃縮混合液を 4 で 16時間保温した。 この濃縮液を
Sephacryl S-300 (Amersham Biosciences) カラムに添加し、 4°Cで分子ふるい クロマトグラフィー （バッファー： 0. 1 Mリン酸バッファー （pH 6. 5) 、 流速： 1. 0 ml/min) を行なって HRPが結合した IgGを得た。 この HRPが結合した IgGを酵 素標識抗体 (以下、 HRP標識 2G6- D1と記載する） として二抗体 EIAに使用した。
( 2 ) NPW23を測定する二抗体 EIA系の設定
NPW23のカルボキシル末端領域と結合する 6種類のモノクローナル抗体、
2F1B2A、 5A2A、 5D6- F10、 5G2 - F6、 6G卜 H8または 7B4- D2を 50 mM炭酸緩衝液 (pH 9. 6) で 10 g/mlに調製し、 100 1の抗体溶液を 96ゥエルィムノプレート
(NUNC) の各ゥエルに添加し.た。 このプレートを 4 で 16時間静置した後、 ゥェ ル内の溶液を捨て、 ブロックエースを 1ゥエル当たり 200 添加してこのプレー トを使用するまで 4°Cで保存した。 実施例 1— ( 1 0 ) に記載の EIA緩衝液によ り希釈した 100 1の種々の濃度の NPW溶液をそれぞれのゥエルに添加した後、 こ のプレートを 4°Cで 16時間静置した。 プレートを PBSで 3回洗浄した後、 EIA緩衝 液により固定した倍率 （300〜1000倍） で希釈した 100 ^ 1の HRP標識 2G6- D1をそ れぞれのゥエルに添加してこのプレートを 4°Cで 16時間静置した。 プレートを PBSで 4回洗浄した後、 TMBマイクロウェルパ一ォキシダ一ゼ基質システム 100 /2 1 を加えて室温で反応させた。 反!^を 1 Mリン酸 50 ^ 1を加えて停止させた後、 450 nmにおける吸光度をプレートリーダ一で測定した。 それぞれの二抗体 EIA系にお いて添加したヒト NPW23 (配列番号： 4 ) 、 ラット NPW23 (配列番号： 6 )、およ びマウス NPW23 (配列番号： 8 (配列番号： 6と同一） ) の各ペプチド量に依存 して 450 nmにおける吸光度の増加を示した。 モノクローナル抗体、 2F1B2A、
5A2A、 5D6- F10、 5G2- F6、 6G1- H8および 7B4- D2を用いたときの結果を図 2 0、 図 2 1、 図 2 2、 図 2 3、 図 2 4および図 2 5にそれぞれ示す。
これらの二抗体 EIA系を用いて最小量 0. 3fmolの NPW23を検出することができた。 なお、 これらの二抗体法を用いてブ夕 NPW23 (配列番号： 1 0 ) を測定すること もできる。
( 3 ) NPW30を測定する二抗体 EIA系の設定
NPW30の力ルポキシル末端領域と結合する 3種類のモノクローナル抗体、 2A1A、 3A1Aまたは 7F2- E8を 50 mM炭酸緩衝液 （pH 9. 6) で 10 g/mlに調製し、 100 Uの 抗体溶液を 96ゥエルィムノプレート （NUNC) の各ゥエルに添加した。 このプレ ートを 4°Cで 16時間静置した後、 ゥエル内の溶液を捨て、 ブロックエースを 1ゥ エル当たり 200 1添加してこのプレートを使用するまで 4°Cで保存した。 実施例 1一 （1 0 ) に記載の EIA緩衝液により希釈した 100 1の種々の濃度の NPW溶液 をそれぞれのゥエルに添加した後、 このプレートを 4°Cで 16時間静置した。 プレ —トを PBSで 3回洗浄した後、 EIA緩衝液により固定した倍率 （300〜1000倍） で 希釈した 100 1の H R P標識 2G6- D1をそれぞれのゥエルに添加してこのプレー トを 4°Cで 16時間静置した。 プレートを PBSで 4回洗浄した後、 TMBマイクロゥェ ルパーォキシダ一ゼ基質システム 100 lを加えて室温で反応させた。 反応を 1 M リン酸 50 1を加えて停止させた後、 450 nmにおける吸光度をプレートリーダー で測定した。 それぞれの二抗体 EIA系において添加したヒト NPW30 (配列番号： 5 ) 、 ラット NPW30 (配列番号： 7 ) 、 マウス NPW30 (配列番号： 9 ) およびブ タ NPW30 (配列番号： 1 1 ) の各ペプチド量に依存して 450 nmにおける吸光度の 増加を示した。 モノクローナル抗体 2A1A、 3A1Aおよび 7F2- E8を用いたときの結 果を、 図 2 6、 図 2 7および図 2 8にそれぞれ示す。
これらの二抗体 EIA系を用いて最小量 1 fmolの NPW30を検出することができた。 産業上の利用可能性
本発明の抗体は、 極めて高い NPWへの結合能を有し、 NPWの細胞内 cAMP産生抑 制活性を中和することができ、 摂食促進作用、 プロラクチン産生抑制作用、 利 尿作用、 胃酸分泌抑制作用も有する。
従って、 本発明の抗体は、 NPWの作用を抑制することにより、 例えば拒食症、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊 症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ ·フロンメル症 候群、 アルゴンッ 'デル'カスティ口症候群、 フォーべス 'アルブライト症候 群、 リンパ腫、 シーハン症候群、 精子形成異常、 腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリ ゥム血症、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群 （SIADH) '、 高血圧、 上部消化管疾患 (例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zo l l inger- El l i son症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspeps i a) 、 胃 癌、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 潰 瘍など） などの予防 ·治療剤、 摂食 （食欲） 促進剤などの安全な医薬として使 用することができる。
本発明の抗体を用いる測定法、 好ましくは NPWの C端部を特異的に認識するモ ノクローナル抗体と NPWの N端部を特異的に認識するモノク口一ナル抗体とを用 いるサンドイッチ法による免疫学的測定法などにより、 NPWを感度よく特異的に 定量することができるため、 例えば、 NPWが関与する疾患 〔例、 拒食症、 肥満症 (例、 悪性肥満細胞症、 外因性肥満、 過インシュリン性肥満症、 過血漿性肥満、 下垂体性肥満、 減血漿性肥満症、 甲状腺機能低下肥満症、 視床下部性肥満、 症 候性肥満症、 小児肥満、 上半身肥満、 食事性肥満症、 性機能低下性肥満、 全身 性肥満細胞症、 単純性肥満、 中心性肥満など） 、 下垂体腺腫瘍、 間脳腫瘍、 月 ' 経異常、 自己免疫疾患、 プロラクチノーマ、 不妊症、 インポテンス、 無月経症、 乳汁漏症、 末端肥大症、 キアリ 'フロンメル症候群、 アルゴンッ 'デル'カス ティロ症候群、 フォーべス ·アルブライト症候群、 リンパ腫、 シ一ハン症候群、 精子形成異常、 腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排 尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリウム血症、 抗利尿ホルモン分泌不 適症候群 （SIADH) 、 高血圧、 蓄尿障害 （例、 頻尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） など） 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿 ' 崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカリローシス、 低力 リウム血症、 Cushing症候群、 上部消化管疾患 （例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zol l inger-El l i son症候群など） 、 胃炎、 逆流性食 道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspeps ia) 、 胃癌、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイド系 抗炎症剤に起因する潰瘍、 胃酸過多、 潰瘍など） 、 消化不良症 （例、 下垂体性 消化不良症、 腎性消化不良症など） 、 骨代謝障害 （例、 骨粗しょう症、 骨軟化 症など） 、 貧血症 （例、 鉄欠乏性貧血など） など〕 などの診断ができる。 また、 本発明の抗体は、 NPWの免疫組織染色にも使用可能である。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の N端側の部分べプチドに特異 的に反応する抗体。
2 . 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列の第 1〜 1 3番目のアミノ酸配列を有するぺプチドに特異的に反応す る請求項 1記載の抗体。 .
3 . 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列の第 1〜3番目、 第 1〜4番目、 第 1〜5番目、 第 1〜6番目、 第 1 〜7番目、 第 1〜8番目、 第 1〜9番目、 第 2〜4番目、 第 2〜5番目、 第 2 〜6番目、 第 2〜.7番目、 第 2〜8番目、 第 2〜9番目、 第 3〜5番目、 第 3 〜6番目、 第 3〜7番目、 第 3〜8番目、 第 3〜9番目、 第 4〜6番目、 第 4 〜7番目、 第 4〜8番目、 第 4〜9番目、 第 5〜7番目、 第 5〜8番目、 第 5 〜9番目、 第 6〜8番目、 第 6〜9番目および第 7〜9番目のアミノ酸配列か ら選ばれる少なくともひとつを含有するべプチドに特 的に反応する請求項 1 記載の抗体。
4. 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C端側の部分ペプチドを認識 しない請求項 1記載の抗体。
5 . 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミ ノ酸配列を含有するべプチドに対して中和活性を有する請求項 1記載の抗体。
6 . 標識化された請求項 1記載の抗体。
7 . モノクローナル抗体である請求項 1記載の抗体。
8. AhW23N2 G6D 1 (FERM B P— 8363 ) で標示されるハ イブリドーマ細胞から産生され得る AhW23N2 G6D 1 aで標示される請 求項 7記載の抗体。
9. 請求項 8記載の抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 5 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番 号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位に 特異的に反応する抗体。
10. 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 11で表されるアミ
10 ノ酸配列を含有するポリぺプチドに対して中和活性を有する請求項 9記載の抗 体。
11. A W23N3H3E4 (FERM B P— 8364) で標示される ハイプリドーマ細胞から産生され得る AhW23N 3H3 E4 aで標示される 請求項 7記載の抗体。
15 12. 請求項 1 1記載の抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： " 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列 番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対する結合部位 に特異的に反応する抗体。 '
13. 配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配冽番 20 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10または配列番号： 11で表されるアミ ノ酸配列を含有するポリぺプチドに対して中和活性を有する請求項 12記載の.
' 抗体
14. 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で 表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C端側の部分べ
25 プチドに特異的に反応する抗体。
15. 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で 表されるアミノ酸配列の第 11〜23番目のアミノ酸配列を有するペプチドに 特異的に反応する請求項 14記載の抗体。
16. 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で 表されるアミノ酸配列の第 16〜23番目、 第 17〜23番目、 第 18〜23 番目、 第 19〜23番目、 第 20〜23番目、 第 21〜23番目、 第 16〜2 2番目、 第 17〜22番目、 第 18〜22番目、 第 19〜22番目、 第 20〜 22番目、 第 16〜21番目、 第 17〜21番目、 第 18〜21番目、 第 19 〜21番目、 第 16〜 20番目、 第 17〜20番目および第 18〜20番目の ァミノ酸配列から選ばれる少なくともひとつを含有するぺプチドに特異的に反 応する請求項 14記載の抗体。
17. 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で 表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の N端側の部分べ プチドを認識しない請求項 14記載の抗体。
18. 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で 表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する請求項 1 4記載の抗体。 '
19. 標識化された請求項 14記載の抗体。
20. モノクローナル抗体である請求項 14記載の抗体。
21. AhW23C6GlH8 (FERM B P— 8365 ) で標示される ハイブリドーマ細胞から産生され得る Ah W23 C 6 G 1 H8 aで標示される 請求項 20記載の抗体。
22. 請求項 21記載の抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対 する結合部位に特異的に反応する抗体。
23. 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で 表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する請求 項 22記載の抗体。
24. A W23 C 5 G2 F 6 (FERM B P— 8366 ) で標示される 八イブリドーマ細胞から産生され得る A hW23 C 5 G2 F 6 aで標示される 請求項 20記載の抗体。
25. 請求項 24記載の抗体の、 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対 する結合部位に特異的に反応する抗体。
26. 配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で 表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する請求 項 25記載の抗体。
27. 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で 表されるァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の C端側の部分べ プチドに特異的に反応する抗体。
28. 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で 表されるアミノ酸配列の第 16〜30番目のアミノ酸配列を有するペプチドに 特異的に反応する請求項 27記載の抗体。
29. 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で 表されるアミノ酸配列の第 23〜30番目、 第 24〜30番目、 第 25〜30 番目、 第 26〜30番目、 第 27〜30番目、 第 28〜30番目、 第 23〜2
9番目、 第 24〜29番目、 第 25〜29番目、 第 26〜29番目、 第 27〜 29番目、 第 23〜28番目、 第 24〜28番目、 第 25〜28番目、 第 26 〜28番目、 第 23〜27番目、 第 24〜27番目および第 25〜27番目の アミノ酸配列から選ばれる少なくともひとつを含有するペプチドに特異的に反 応する請求項 27記載の抗体。 .
30. 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で 表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の N端側の部分べ プチドを認識しない請求項 27記載の抗体。 ，
31. 配列番号： 5、 配列番号： Ί、 配列番号： 9または配列番号： 11で 表されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して中和活性を有する請求項 2 7記載の抗体。
32. 標識化された請求項 27記載の抗体。
33. モノクローナル抗体である請求項 27記載の抗体。
34. ArW30 C 3A1 A (FERM B P— 8367 ) で標示されるハ イブリドーマ細胞から産生され得る A rW30C3AlAaで標示される請求 項 33記載の抗体。
35. 請求項 34記載の钪体の、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対 する結合部位に特異的に反応する抗体。
36. 配列番号： 5： 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で 表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する請求 項 35記載の抗体。 -
37. ArW30 C7F2E8 (FERM B P— 8368 ) で標示される ハイプリドーマ細胞から産生され得る A rW30 C 7 F 2 E 8 aで標示される 請求項 33記載の抗体。
38. 請求項 37記載の抗体の、 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対 する結合部位に特異的に反応する抗体。
39. 配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で 表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドに対して中和活性を有する請求 項 38記載の抗体。
40. 請求項 1、 請求項 14または請求項 27記載の抗体を含有してなる医 薬。
41. 不妊症、 腎性浮腫、 消化性潰瘍または胃酸過多症の予防 ·治療剤であ る請求項 40記載の医薬。
42. 請求項 1、 請求項 14および/または請求項 27記載の抗体を含有し てなる診断薬。
43. 請求項 1記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 4、 配列番 号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番 号： 10または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有するポリべプチ ドまたはその塩の定量法。
44. さらに請求項 14または請求項 27記載の抗体を用いることを特徴と する請求項 43記載の定量法。
45. 請求項 14記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 4、 配列 番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有 するポリぺプチドまたはその塩の定量法。
' 4 6 . 請求項 2 7記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 5、 配列 番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有 するポリぺプチドまたはその塩の定量法。
4 7 . 請求項 1記載の抗体と、 被検波および標識化された配列番号： 4、 配 列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、. 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配 列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリべ プチドまたはその塩とを競合的に反応させ、 上記抗体に結合した上記標識化さ れたポリペプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴とする、 被検液中 の配列番号： 4、 配列番号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8 配列番号： 9、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列 を含有するポリぺプチドまたはその塩の定量法。
4 8 . 請求項 1 4記載の抗体と、 被検液および標識化された配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を 含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、 上記抗体に結合し た上記標識化されたポリぺプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴と する、 被検波中の配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番 号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量 法。
4 9 . 請求項 2 7記載の抗体と、 被検液および標識化された配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を 含有するポリペプチドまたはその塩とを競合的に反応させ、 上記抗体に結合し た上記標識化されたポリぺプチドまたはその塩の割合を測定することを特徴と する、 被検液中の配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番 号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量 法。
5 0 . ( 1 ) 担体上に不溶化した請求項 1記載の抗体、 標識化された請求項 1 4記載の抗体および被検波を反応させた後、 標識剤の活性を測定する、 また は （2 ) 担体上に不溶化した請求項 1 4記載の抗体、 標識化された請求項 1記 載の抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定することを特徴と する被検液中の配列番号： 4、 配列番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチドまたはその塩の定量法。
51. (1) 担体上に不溶化した請求項 1記載の抗体、 標識化された請求項 27記載の抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定する、 また は （2) 担体上に不溶化した請求項 27記載の抗体、 標識化された請求項 1記 載の抗体および被検液を反応させた後、 標識剤の活性を測定することを特徴と する被検波中の配列番号： 5、 配列番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で表されるァミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩の定量法。
52. 請求項 1記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 4、 配列番 号： 5、 配列番号： 6、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番号： 9、 配列番 号： 10または配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を含有するポリぺプチ ドまたはその塩が関与する疾患の診断法。
53. さらに請求項 14または請求項 27記載の抗体を用いることを特徴と する請求項 52記載の診断法。
54. 請求項 14記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 4、 配列 番号： 6、 配列番号： 8または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有 するポリぺプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法。
55. 請求項 27記載の抗体を用いることを特徴とする配列番号： 5、 配列 番号： 7、 配列番号： 9または配列番号： 11で表されるアミノ酸配列を含有 するポリぺプチドまたはその塩が関与する疾患の診断法。
56. 疾患が、 不妊症、 腎性浮腫、 消化性潰瘍または胃酸過多症である、 請 求項 52〜 55記載の診断法。
57. 請求項 7記載の抗体を産生するハイプリドーマ細胞。.
58. AhW23N2 G6 D 1 (FERM B P— 8363 ) または A h W 23N3H3 E4 (FERM B P— 8364) で標示される請求項 57記載 のハイプリド一マ細胞。
59. 請求項 58記載のハイプリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、 その体液または培養物から請求項 7記載の抗体を採取することを特徴とする請 求項 7記載の抗体の製造法。
60. 請求項 20記載の抗体を産生するハイプリドーマ細胞。
61. AhW23C6GlH8 (FERM B P— 8365 ) または A hW 23 C 5G2 F6 (FERM B P— 8366 ) で標示される請求項 60記載 のハイブリドーマ細胞。
62. 請求項 61記載のハイプリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、 その体液または培養物から請求項 20記載の抗体を採取することを特徴とする 請求項 20記載の抗体の製造法。
63. 請求項 33記載の抗体を産生するハイプリドーマ細胞。
64. Ar.W3 O'C 3A1 A (FERM B P— 8367 ) または A r W 3 ' 0 C 7 F 2 E 8 (FERM B P— 8368 ) で標示される請求項 63記載の ハイブリド一マ細胞。
65. 請求項 64記載のハイプリドーマ細胞を生体内又は生体外で培養し、 その体液または培養物から請求項 33記載のモノクローナル抗体を採取するこ とを特徴とする請求項 33記載の抗体の製造法。
66. 哺乳動物に対し、 請求項 1、 請求項 14または請求項 27記載の抗体 の有効量を投与することを特徴とする不妊症、 腎性浮腫、 消化性潰瘍または胃 酸過多症の予防 ·治療法。
67. 不妊症、 腎性浮腫、 消化性潰瘍または胃酸過多症の予防 ·治療剤を製 造するための請求項 1、 請求項 14または請求項 27記載の抗体の使用。
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