JP2000037187A - 抗体およびその用途 - Google Patents
抗体およびその用途Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体に対するモ
ノクローナル抗体の提供。 【解決手段】本発明の１９Ｐ２リガンドに対するモノク
ローナル抗体(特に、Ｐ２Ｌ-１Ｃａ)は、極めて高い結
合能を有し、かつ１９Ｐ２リガンドのアラキドン酸代謝
物放出活性を中和することが出来る。従って、１９Ｐ２
リガンドが有すると考えられる下垂体機能調節作用（例
えば、プロラクチン分泌促進作用）、中枢神経調節作
用、膵臓機能調節作用などに、異常がある場合の各種疾
患の診断薬、予防薬、治療薬などに用いることができ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ
法（特に、該モノクロナール抗体と１９Ｐ２リガンドの
中間部を認識する抗体とを用いるサンドイッチ法）によ
る免疫学的測定法により、１９Ｐ２リガンドまたはその
誘導体を高感度かつ特異的に定量することができる。こ
の定量方法は１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の生理
機能の解明に用いることができる。
ノクローナル抗体の提供。 【解決手段】本発明の１９Ｐ２リガンドに対するモノク
ローナル抗体(特に、Ｐ２Ｌ-１Ｃａ)は、極めて高い結
合能を有し、かつ１９Ｐ２リガンドのアラキドン酸代謝
物放出活性を中和することが出来る。従って、１９Ｐ２
リガンドが有すると考えられる下垂体機能調節作用（例
えば、プロラクチン分泌促進作用）、中枢神経調節作
用、膵臓機能調節作用などに、異常がある場合の各種疾
患の診断薬、予防薬、治療薬などに用いることができ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ
法（特に、該モノクロナール抗体と１９Ｐ２リガンドの
中間部を認識する抗体とを用いるサンドイッチ法）によ
る免疫学的測定法により、１９Ｐ２リガンドまたはその
誘導体を高感度かつ特異的に定量することができる。こ
の定量方法は１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の生理
機能の解明に用いることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、１９Ｐ２リガンド
またはその誘導体に結合特異性を有する新規なモノクロ
ーナル抗体に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応に基
づく１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量法の開
発、および、中和活性を利用して１９Ｐ２リガンドまた
はその誘導体が関与する疾患の診断あるいは予防・治療
剤の開発に有用な抗体に関する。
またはその誘導体に結合特異性を有する新規なモノクロ
ーナル抗体に関する。更に詳しくは、抗原抗体反応に基
づく１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量法の開
発、および、中和活性を利用して１９Ｐ２リガンドまた
はその誘導体が関与する疾患の診断あるいは予防・治療
剤の開発に有用な抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】１９Ｐ２リガンドは、オーファンＧ蛋白
質共役型レセプター(１９Ｐ２)に対するリガンドとして
見出された新規ペプチドであり、脳（特に視床下部）に
最も多く存在し、またそのレセプターである１９Ｐ２が
下垂体に最も多く局在することから、新規の視床下部ホ
ルモン（向下垂体性ホルモン）の一つであると考えられ
ている。また、１９Ｐ２リガンドは、その配列から
（１）31残基よりなる１９Ｐ２-Ｌ３１（３１個のアミ
ノ酸からなるペプチド）と、（２）12番目のThrより始
まる１９Ｐ２-Ｌ２０（２０個のアミノ酸からなるペプ
チド）の存在が推測されている（ＷＯ９７／２４４３
６）。〔以下、３１個のアミノ酸からなる１９Ｐ２リガ
ンドを、１９Ｐ２リガンド（１−３１）、または、１９
Ｐ２−Ｌ３１と呼び、２０個のアミノ酸からなる１９Ｐ
２リガンドを、１９Ｐ２リガンド（１２−３１）、また
は、１９Ｐ２−Ｌ２０と呼ぶ場合もある。〕
質共役型レセプター(１９Ｐ２)に対するリガンドとして
見出された新規ペプチドであり、脳（特に視床下部）に
最も多く存在し、またそのレセプターである１９Ｐ２が
下垂体に最も多く局在することから、新規の視床下部ホ
ルモン（向下垂体性ホルモン）の一つであると考えられ
ている。また、１９Ｐ２リガンドは、その配列から
（１）31残基よりなる１９Ｐ２-Ｌ３１（３１個のアミ
ノ酸からなるペプチド）と、（２）12番目のThrより始
まる１９Ｐ２-Ｌ２０（２０個のアミノ酸からなるペプ
チド）の存在が推測されている（ＷＯ９７／２４４３
６）。〔以下、３１個のアミノ酸からなる１９Ｐ２リガ
ンドを、１９Ｐ２リガンド（１−３１）、または、１９
Ｐ２−Ｌ３１と呼び、２０個のアミノ酸からなる１９Ｐ
２リガンドを、１９Ｐ２リガンド（１２−３１）、また
は、１９Ｐ２−Ｌ２０と呼ぶ場合もある。〕
【０００３】ウシ、ヒトおよびラットの１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）のアミノ酸配列を以下に示す。 〔ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）〕（配列番号：１） H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile- Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 〔ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）〕（配列番号：２） H-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-Ile- Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 〔ラット１９Ｐ２リガンド（１−３１）〕（配列番号：３） H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Thr- Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Thr-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 ウシ、ヒトおよびラットの１９Ｐ２リガンド（１２−３
１）のアミノ酸配列を以下に示す。 〔ウシ１９Ｐ２リガンド（１２−３１）〕（配列番号：１２） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 〔ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１）〕（配列番号：５） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 〔ラット１９Ｐ２リガンド（１２−３１）〕（配列番号：１３） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Thr-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2
ド（１−３１）のアミノ酸配列を以下に示す。 〔ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）〕（配列番号：１） H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile- Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 〔ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）〕（配列番号：２） H-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-Ile- Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 〔ラット１９Ｐ２リガンド（１−３１）〕（配列番号：３） H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Thr- Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Thr-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 ウシ、ヒトおよびラットの１９Ｐ２リガンド（１２−３
１）のアミノ酸配列を以下に示す。 〔ウシ１９Ｐ２リガンド（１２−３１）〕（配列番号：１２） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Ala-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 〔ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１）〕（配列番号：５） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2 〔ラット１９Ｐ２リガンド（１２−３１）〕（配列番号：１３） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr- Thr-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg- Phe-NH2
【０００４】下垂体ホルモンの調節因子である視床下部
ホルモンの異常は様々な病態と関連している。視床下部
ホルモンの一つと考えられる１９Ｐ２リガンドは、下垂
体ホルモンが関与する何らかの作用を有すると考えられ
るが、その生理機能についてはまだ未解明な部分が多
い。従って、１９Ｐ２リガンドの生理作用を解明するた
めに、１９Ｐ２リガンドを簡便かつ高感度に検出・定量
する測定系が切望されていた。
ホルモンの異常は様々な病態と関連している。視床下部
ホルモンの一つと考えられる１９Ｐ２リガンドは、下垂
体ホルモンが関与する何らかの作用を有すると考えられ
るが、その生理機能についてはまだ未解明な部分が多
い。従って、１９Ｐ２リガンドの生理作用を解明するた
めに、１９Ｐ２リガンドを簡便かつ高感度に検出・定量
する測定系が切望されていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、１９Ｐ２リ
ガンドまたはその誘導体を感度よく特異的に定量するこ
とができるモノクローナル抗体、および該抗体を用いる
１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の検出・定量法を提
供することを目的とする。
ガンドまたはその誘導体を感度よく特異的に定量するこ
とができるモノクローナル抗体、および該抗体を用いる
１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の検出・定量法を提
供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、１９Ｐ２リガ
ンドまたはその誘導体の異なる部分を特異的に認識する
複数のモノクローナル抗体を作製し、これら抗体を用い
ることにより１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の高感
度の優れた検出・定量法を開発した。さらに研究を行っ
た結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプ
チドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクロー
ナル抗体）、１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の中心
部分の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましく
は、モノクローナル抗体）、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞、該抗体およびハイブリドー
マ細胞の製造法、該抗体を用いた競合法あるいはサンド
イッチ法による１９Ｐ２リガンドおよびその誘導体の免
疫測定法などに関する。さらに詳しくは、本発明者らは
〔Cys17〕１９Ｐ２リガンド（１７−３１）および〔Cys
25〕１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を免疫原として、
モノクローナル抗体を複数作製し、これらを組み合わせ
ることにより、１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体を高
感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発した。
即ち、ウシチログロブリン（BTG）と〔Cys17〕１９Ｐ２
リガンド（１７−３１）および〔Cys25〕１９Ｐ２リガ
ンド（１２−２５）との複合体を免疫原として１９Ｐ２
リガンド（１−３１）またはその誘導体のＣ端部および
中間部を認識するモノクローナル抗体、例えばＰ２Ｌ−
１ＣaおよびＰ２Ｌ−１Ｔaを確立した。これらの抗体
は、西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRP）標識化した〔C
ys17〕１９Ｐ２リガンド（１７−３１）および〔Cy
s25〕１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を用いる競合法
免疫測定法では、この2種類のモノクローナル抗体を組
み合わせることにより、１９Ｐ２-Ｌ３１および１９Ｐ
２-Ｌ２０に対して極めて高感度なサンドイッチ-免疫測
定法を与えることが明かとなった。本発明により、１９
Ｐ２リガンドを簡便にかつ高感度に測定することが可能
となり、生体成分中の１９Ｐ２リガンドの変動をモニタ
ーすることによりその生理機能の解明に大いに役立つも
のと思われる。
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、１９Ｐ２リガ
ンドまたはその誘導体の異なる部分を特異的に認識する
複数のモノクローナル抗体を作製し、これら抗体を用い
ることにより１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の高感
度の優れた検出・定量法を開発した。さらに研究を行っ
た結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプ
チドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクロー
ナル抗体）、１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の中心
部分の部分ペプチドに特異的に反応する抗体（好ましく
は、モノクローナル抗体）、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞、該抗体およびハイブリドー
マ細胞の製造法、該抗体を用いた競合法あるいはサンド
イッチ法による１９Ｐ２リガンドおよびその誘導体の免
疫測定法などに関する。さらに詳しくは、本発明者らは
〔Cys17〕１９Ｐ２リガンド（１７−３１）および〔Cys
25〕１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を免疫原として、
モノクローナル抗体を複数作製し、これらを組み合わせ
ることにより、１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体を高
感度にかつ特異的に検出し得る免疫測定法を開発した。
即ち、ウシチログロブリン（BTG）と〔Cys17〕１９Ｐ２
リガンド（１７−３１）および〔Cys25〕１９Ｐ２リガ
ンド（１２−２５）との複合体を免疫原として１９Ｐ２
リガンド（１−３１）またはその誘導体のＣ端部および
中間部を認識するモノクローナル抗体、例えばＰ２Ｌ−
１ＣaおよびＰ２Ｌ−１Ｔaを確立した。これらの抗体
は、西洋ワサビパーオキシダーゼ（HRP）標識化した〔C
ys17〕１９Ｐ２リガンド（１７−３１）および〔Cy
s25〕１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を用いる競合法
免疫測定法では、この2種類のモノクローナル抗体を組
み合わせることにより、１９Ｐ２-Ｌ３１および１９Ｐ
２-Ｌ２０に対して極めて高感度なサンドイッチ-免疫測
定法を与えることが明かとなった。本発明により、１９
Ｐ２リガンドを簡便にかつ高感度に測定することが可能
となり、生体成分中の１９Ｐ２リガンドの変動をモニタ
ーすることによりその生理機能の解明に大いに役立つも
のと思われる。
【０００７】即ち、本発明は、（１）１９Ｐ２リガンド
またはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反
応するモノクローナル抗体、（２）マウスＩｇＧである
上記（１）記載のモノクローナル抗体、（３）Ｐ２Ｌ−
１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで標示される上記（２）記
載のモノクローナル抗体、（４）１９Ｐ２リガンドまた
はその誘導体の中間部分ペプチドに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体、（５）マウスＩｇＧである上記
（４）記載のモノクローナル抗体、（６）Ｐ２Ｌ−１Ｔ
ａで標示される上記（５）記載のモノクローナル抗体、
（７）上記（１）または上記（４）記載のモノクローナ
ル抗体を用いることを特徴とする被検液中の１９Ｐ２リ
ガンドまたはその誘導体の定量法、（８）上記（１）記
載の抗体と上記（４）記載のモノクローナル抗体を用い
ることを特徴とする被検液中の１９Ｐ２リガンドまたは
その誘導体の定量法、および、（９）上記（１）または
上記（４）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞などに関する。
またはその誘導体のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反
応するモノクローナル抗体、（２）マウスＩｇＧである
上記（１）記載のモノクローナル抗体、（３）Ｐ２Ｌ−
１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで標示される上記（２）記
載のモノクローナル抗体、（４）１９Ｐ２リガンドまた
はその誘導体の中間部分ペプチドに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体、（５）マウスＩｇＧである上記
（４）記載のモノクローナル抗体、（６）Ｐ２Ｌ−１Ｔ
ａで標示される上記（５）記載のモノクローナル抗体、
（７）上記（１）または上記（４）記載のモノクローナ
ル抗体を用いることを特徴とする被検液中の１９Ｐ２リ
ガンドまたはその誘導体の定量法、（８）上記（１）記
載の抗体と上記（４）記載のモノクローナル抗体を用い
ることを特徴とする被検液中の１９Ｐ２リガンドまたは
その誘導体の定量法、および、（９）上記（１）または
上記（４）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞などに関する。
【０００８】さらに、本発明は、（１０）配列番号：７
で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識す
ることを特徴とする１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体
のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴
とするモノクローナル抗体、（１１）配列番号：１１で
表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識する
ことを特徴とする１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の
中間部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする
モノクローナル抗体、（１２）上記（１０）または上記
（１１）記載の抗体を用いることを特徴とする被検液中
の１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量法、（１
３）上記（１１）記載の抗体と、上記（１０）記載の抗
体を用いることを特徴とする被検液中の１９Ｐ２リガン
ドまたはその誘導体の定量法、（１４）高プロラクチン
血症の診断に用いられる上記（１２）または（１３）記
載の定量法などに関する。 上記（１）記載のモノクローナル抗体の好ましい態様と
しては、（i）１９Ｐ２リガンドが配列番号：１、配列
番号：２、配列番号：３、配列番号５または配列番号：
１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである上
記（１０）記載のモノクローナル抗体、（ii）１９Ｐ２
リガンドの誘導体が配列番号：７で表されるアミノ酸
配列を有するペプチド、配列番号：１、配列番号：２
または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１８番
目〜３１番目のアミノ酸配列を有するペプチドであって
Ｃ端がアミドであるペプチド、配列番号：５または配
列番号：１２で表されるアミノ酸配列の第８番目〜２０
番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番
号：１〜配列番号：７、配列番号：１０または１１で表
されるアミノ酸配列のＣ末端の９残基のアミノ酸配列を
有するペプチドである第（１０）記載のモノクローナル
抗体、（iii）１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ
端側の部分ペプチドが、１９Ｐ２リガンドのＮ端のアミ
ノ酸から数えて２０番目以降のアミノ酸配列を有する部
分ペプチドである上記（１０）記載のモノクローナル抗
体、（iv）抗体が配列番号：９で表されるＣ末端がカル
ボン酸となったアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認
識しないことを特徴とする上記（１０）記載のモノクロ
ーナル抗体、（v）抗体が配列番号：７で表されるアミ
ノ酸配列を有する部分ペプチドを認識するが、配列番
号：８で表されるアミノ酸配列を認識しないことを特徴
とする上記（１０）記載のモノクローナル抗体、（vi）
配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプ
チドを認識するが、配列番号：１０で表されるＣ末端の
Pheが欠けたアミノ酸配列を有するペプチドを認識しな
いことを特徴とする上記（１０）記載のモノクローナル
抗体、（vii）Ｐ２Ｌ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで
標示される上記（１０）記載のモノクローナル抗体、
（viii）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、
配列番号：５および配列番号：１２で表されるアミノ酸
配列を有するペプチドに対して中和活性を有する上記
（１０）記載のモノクローナル抗体などがあげられる。
上記（４）記載のモノクローナル抗体の好ましい態様と
しては、（i）１９Ｐ２リガンドが配列番号：１、配列
番号：２、配列番号：３、配列番号：５または配列番
号：１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであ
る上記（１１）記載のモノクローナル抗体、（ii）１９
Ｐ２リガンドの誘導体が配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列の第１２番目〜２４番目のアミノ酸配列を有す
るペプチド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の
第１２番目〜２４番目のアミノ酸配列を有するペプチド
または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１２
番目〜２４番目のアミノ酸配列を有するペプチドである
上記（１１）記載のモノクローナル抗体、（iii）配列
番号：４または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドを認識しない上記（１１）記載のモノク
ローナル抗体、（iv）Ｐ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２Ｌ−３
Ｔａで標示される上記（１１）記載のモノクローナル抗
体などがあげられる。 また、好ましいハイブリドーマ
細胞として、（i）上記（１０）または（１１）記載の
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞など
があげられる。 上記（１２）記載の定量法の好ましい
態様としては、（i）上記（１０）または上記（１１）
記載のモノクローナル抗体と、被検液および標識化１９
Ｐ２リガンドまたはその誘導体とを競合的に反応させ、
該抗体に結合した標識化１９Ｐ２リガンドまたはその誘
導体の割合を測定することを特徴とする被検液中の１９
Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量法などがあげられ
る。上記（１３）記載の定量法の好ましい態様として
は、（i）担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドまたは
その誘導体に対する抗体、標識化された１９Ｐ２リガン
ドまたはその誘導体に対する抗体および被検液を反応さ
せた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを
特徴とし、担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドまたは
その誘導体に対する抗体および標識化された１９Ｐ２リ
ガンドまたはその誘導体に対する抗体の一方が上記（１
０）記載のモノクローナル抗体であり、他方が上記（１
１）記載のモノクローナル抗体であることを特徴とする
被検液中の１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量
法、（ii）上記（１１）記載のモノクローナル抗体がＰ
２Ｌ−１ＴａまたはＰ２Ｌ−３Ｔａで標示されるモノク
ローナル抗体である上記（i）記載の定量法、（iii）担
体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドに対する抗体および
標識化された１９Ｐ２リガンドに対する抗体の一方がＰ
２Ｌ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで標示されるモノク
ローナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２
Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗体である上記
（i）記載の定量法、（iv）担体上に不溶化した１９Ｐ
２リガンドに対する抗体および標識化された１９Ｐ２リ
ガンドに対する抗体の一方がＰ２Ｌ−１Ｃａで標示され
るモノクローナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−２Ｃａ、
Ｐ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２Ｌ−３Ｔａで標示されるモノ
クローナル抗体であり、１９Ｐ２リガンドまたはその誘
導体が配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するペ
プチド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有する
ペプチド、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有す
るペプチド、および（または）配列番号：５で表される
アミノ酸配列を有するペプチドである上記（i）記載の
定量法、（v）担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドに
対する抗体および標識化された１９Ｐ２リガンドに対す
る抗体の一方がＰ２Ｌ−２Ｃａで標示されるモノクロー
ナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−１Ｃａ、Ｐ２Ｌ−１Ｔ
ａまたはＰ２Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗
体であり、１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体が配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列
番号：２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配
列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチ
ドおよび（または）配列番号：５で表されるアミノ酸配
列を有するペプチドである上記（i）記載の定量法、（v
i）担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドに対する抗体
および標識化された１９Ｐ２リガンドに対する抗体の一
方がＰ２Ｌ−１Ｔａで標示されるモノクローナル抗体で
あり、他方がＰ２Ｌ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで標
示されるモノクローナル抗体であり、１９Ｐ２リガンド
またはその誘導体が配列番号：１で表されるアミノ酸配
列を有するペプチド、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するペプチド、配列番号：３で表されるアミノ
酸配列を有するペプチド、配列番号：５で表されるアミ
ノ酸配列を有するペプチドおよび（または）配列番号：
１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである上
記（i）記載の定量法などがあげられる。
で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識す
ることを特徴とする１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体
のＣ端側の部分ペプチドに特異的に反応することを特徴
とするモノクローナル抗体、（１１）配列番号：１１で
表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識する
ことを特徴とする１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の
中間部分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする
モノクローナル抗体、（１２）上記（１０）または上記
（１１）記載の抗体を用いることを特徴とする被検液中
の１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量法、（１
３）上記（１１）記載の抗体と、上記（１０）記載の抗
体を用いることを特徴とする被検液中の１９Ｐ２リガン
ドまたはその誘導体の定量法、（１４）高プロラクチン
血症の診断に用いられる上記（１２）または（１３）記
載の定量法などに関する。 上記（１）記載のモノクローナル抗体の好ましい態様と
しては、（i）１９Ｐ２リガンドが配列番号：１、配列
番号：２、配列番号：３、配列番号５または配列番号：
１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである上
記（１０）記載のモノクローナル抗体、（ii）１９Ｐ２
リガンドの誘導体が配列番号：７で表されるアミノ酸
配列を有するペプチド、配列番号：１、配列番号：２
または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１８番
目〜３１番目のアミノ酸配列を有するペプチドであって
Ｃ端がアミドであるペプチド、配列番号：５または配
列番号：１２で表されるアミノ酸配列の第８番目〜２０
番目のアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番
号：１〜配列番号：７、配列番号：１０または１１で表
されるアミノ酸配列のＣ末端の９残基のアミノ酸配列を
有するペプチドである第（１０）記載のモノクローナル
抗体、（iii）１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ
端側の部分ペプチドが、１９Ｐ２リガンドのＮ端のアミ
ノ酸から数えて２０番目以降のアミノ酸配列を有する部
分ペプチドである上記（１０）記載のモノクローナル抗
体、（iv）抗体が配列番号：９で表されるＣ末端がカル
ボン酸となったアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認
識しないことを特徴とする上記（１０）記載のモノクロ
ーナル抗体、（v）抗体が配列番号：７で表されるアミ
ノ酸配列を有する部分ペプチドを認識するが、配列番
号：８で表されるアミノ酸配列を認識しないことを特徴
とする上記（１０）記載のモノクローナル抗体、（vi）
配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプ
チドを認識するが、配列番号：１０で表されるＣ末端の
Pheが欠けたアミノ酸配列を有するペプチドを認識しな
いことを特徴とする上記（１０）記載のモノクローナル
抗体、（vii）Ｐ２Ｌ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで
標示される上記（１０）記載のモノクローナル抗体、
（viii）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、
配列番号：５および配列番号：１２で表されるアミノ酸
配列を有するペプチドに対して中和活性を有する上記
（１０）記載のモノクローナル抗体などがあげられる。
上記（４）記載のモノクローナル抗体の好ましい態様と
しては、（i）１９Ｐ２リガンドが配列番号：１、配列
番号：２、配列番号：３、配列番号：５または配列番
号：１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであ
る上記（１１）記載のモノクローナル抗体、（ii）１９
Ｐ２リガンドの誘導体が配列番号：１で表されるアミ
ノ酸配列の第１２番目〜２４番目のアミノ酸配列を有す
るペプチド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の
第１２番目〜２４番目のアミノ酸配列を有するペプチド
または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の第１２
番目〜２４番目のアミノ酸配列を有するペプチドである
上記（１１）記載のモノクローナル抗体、（iii）配列
番号：４または配列番号：６で表されるアミノ酸配列を
有するペプチドを認識しない上記（１１）記載のモノク
ローナル抗体、（iv）Ｐ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２Ｌ−３
Ｔａで標示される上記（１１）記載のモノクローナル抗
体などがあげられる。 また、好ましいハイブリドーマ
細胞として、（i）上記（１０）または（１１）記載の
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞など
があげられる。 上記（１２）記載の定量法の好ましい
態様としては、（i）上記（１０）または上記（１１）
記載のモノクローナル抗体と、被検液および標識化１９
Ｐ２リガンドまたはその誘導体とを競合的に反応させ、
該抗体に結合した標識化１９Ｐ２リガンドまたはその誘
導体の割合を測定することを特徴とする被検液中の１９
Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量法などがあげられ
る。上記（１３）記載の定量法の好ましい態様として
は、（i）担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドまたは
その誘導体に対する抗体、標識化された１９Ｐ２リガン
ドまたはその誘導体に対する抗体および被検液を反応さ
せた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを
特徴とし、担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドまたは
その誘導体に対する抗体および標識化された１９Ｐ２リ
ガンドまたはその誘導体に対する抗体の一方が上記（１
０）記載のモノクローナル抗体であり、他方が上記（１
１）記載のモノクローナル抗体であることを特徴とする
被検液中の１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量
法、（ii）上記（１１）記載のモノクローナル抗体がＰ
２Ｌ−１ＴａまたはＰ２Ｌ−３Ｔａで標示されるモノク
ローナル抗体である上記（i）記載の定量法、（iii）担
体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドに対する抗体および
標識化された１９Ｐ２リガンドに対する抗体の一方がＰ
２Ｌ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで標示されるモノク
ローナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２
Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗体である上記
（i）記載の定量法、（iv）担体上に不溶化した１９Ｐ
２リガンドに対する抗体および標識化された１９Ｐ２リ
ガンドに対する抗体の一方がＰ２Ｌ−１Ｃａで標示され
るモノクローナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−２Ｃａ、
Ｐ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２Ｌ−３Ｔａで標示されるモノ
クローナル抗体であり、１９Ｐ２リガンドまたはその誘
導体が配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するペ
プチド、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有する
ペプチド、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有す
るペプチド、および（または）配列番号：５で表される
アミノ酸配列を有するペプチドである上記（i）記載の
定量法、（v）担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドに
対する抗体および標識化された１９Ｐ２リガンドに対す
る抗体の一方がＰ２Ｌ−２Ｃａで標示されるモノクロー
ナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−１Ｃａ、Ｐ２Ｌ−１Ｔ
ａまたはＰ２Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗
体であり、１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体が配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列
番号：２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配
列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、
配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチ
ドおよび（または）配列番号：５で表されるアミノ酸配
列を有するペプチドである上記（i）記載の定量法、（v
i）担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドに対する抗体
および標識化された１９Ｐ２リガンドに対する抗体の一
方がＰ２Ｌ−１Ｔａで標示されるモノクローナル抗体で
あり、他方がＰ２Ｌ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで標
示されるモノクローナル抗体であり、１９Ｐ２リガンド
またはその誘導体が配列番号：１で表されるアミノ酸配
列を有するペプチド、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するペプチド、配列番号：３で表されるアミノ
酸配列を有するペプチド、配列番号：５で表されるアミ
ノ酸配列を有するペプチドおよび（または）配列番号：
１２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである上
記（i）記載の定量法などがあげられる。
【０００９】本発明における１９Ｐ２リガンドとして
は、アミノ酸３１残基からなる１９Ｐ２リガンド（１−
３１）とアミノ酸２０残基からなる１９Ｐ２リガンド
（１２−３１）がある。例えば、配列番号：１で表され
るアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リガンド（１−３
１）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するヒ
ト１９Ｐ２リガンド（１−３１）、配列番号：３で表さ
れるアミノ酸配列を有するラット１９Ｐ２リガンド（１
−３１）、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有す
るラット１９Ｐ２リガンド（１２−３１）または配列番
号：１２で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２
リガンド（１２−３１）などが用いられる。本発明にお
ける１９Ｐ２リガンドの誘導体としては、例えば、上記
１９Ｐ２リガンドのＮ端部のアミノ酸がそれぞれ１６な
いし１７残基程度欠落したもの、Ｃ端部のアミノ酸が１
残基欠落したもの、Ｌ−グリシンをD−アラニンに置換
したもの、Ｃ末端アミドをカルボン酸に変換したもの、
Ｃ端側にＬ−グリシンとＬ−アルギニンを付加したも
の、Ｌ−システインを付加したもの、Ｎ端部にアセチル
基を有するものなどが用いられる。具体的には、１９
Ｐ２−Ｌ３１のアミノ酸配列から第１番目〜１６番目の
アミノ酸配列が欠如した配列番号：４で表されるペプチ
ド、配列番号：４で表されるペプチドのＮ末端にアセ
チル基が付加した配列番号：６で表されるペプチド、
１９Ｐ２−Ｌ３１のアミノ酸配列の第２９番目のグリシ
ンがＤ-アラニンに変換したH-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His
-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-T
rp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-D-Ala-Arg-P
he-NH2で表されるペプチド、１９Ｐ２−Ｌ３１のＣ端
側にＬ−グリシンとＬ−アルギニンを付加した配列番
号：８で表されるペプチド、１９Ｐ２−Ｌ３１のアミ
ノ酸配列のＣ末端アミドをカルボン酸に変換した配列番
号：９で表されるペプチド、１９Ｐ２−Ｌ３１のアミ
ノ酸配列の第３１番目のＰｈｅが欠如した配列番号：１
０で表されるペプチドなどが用いられる。これらの１９
Ｐ２リガンドまたはその誘導体は、（ａ）例えばヒト、
サル、ラット、マウスなどの哺乳動物から自体公知の方
法で調製することもできるし、（ｂ）ペプチド・シンセ
サイザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化
学的に合成することもできる。
は、アミノ酸３１残基からなる１９Ｐ２リガンド（１−
３１）とアミノ酸２０残基からなる１９Ｐ２リガンド
（１２−３１）がある。例えば、配列番号：１で表され
るアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リガンド（１−３
１）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するヒ
ト１９Ｐ２リガンド（１−３１）、配列番号：３で表さ
れるアミノ酸配列を有するラット１９Ｐ２リガンド（１
−３１）、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を有す
るラット１９Ｐ２リガンド（１２−３１）または配列番
号：１２で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２
リガンド（１２−３１）などが用いられる。本発明にお
ける１９Ｐ２リガンドの誘導体としては、例えば、上記
１９Ｐ２リガンドのＮ端部のアミノ酸がそれぞれ１６な
いし１７残基程度欠落したもの、Ｃ端部のアミノ酸が１
残基欠落したもの、Ｌ−グリシンをD−アラニンに置換
したもの、Ｃ末端アミドをカルボン酸に変換したもの、
Ｃ端側にＬ−グリシンとＬ−アルギニンを付加したも
の、Ｌ−システインを付加したもの、Ｎ端部にアセチル
基を有するものなどが用いられる。具体的には、１９
Ｐ２−Ｌ３１のアミノ酸配列から第１番目〜１６番目の
アミノ酸配列が欠如した配列番号：４で表されるペプチ
ド、配列番号：４で表されるペプチドのＮ末端にアセ
チル基が付加した配列番号：６で表されるペプチド、
１９Ｐ２−Ｌ３１のアミノ酸配列の第２９番目のグリシ
ンがＤ-アラニンに変換したH-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His
-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-T
rp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-D-Ala-Arg-P
he-NH2で表されるペプチド、１９Ｐ２−Ｌ３１のＣ端
側にＬ−グリシンとＬ−アルギニンを付加した配列番
号：８で表されるペプチド、１９Ｐ２−Ｌ３１のアミ
ノ酸配列のＣ末端アミドをカルボン酸に変換した配列番
号：９で表されるペプチド、１９Ｐ２−Ｌ３１のアミ
ノ酸配列の第３１番目のＰｈｅが欠如した配列番号：１
０で表されるペプチドなどが用いられる。これらの１９
Ｐ２リガンドまたはその誘導体は、（ａ）例えばヒト、
サル、ラット、マウスなどの哺乳動物から自体公知の方
法で調製することもできるし、（ｂ）ペプチド・シンセ
サイザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化
学的に合成することもできる。
【００１０】本発明における１９Ｐ２リガンドまたはそ
の誘導体のＣ端側の部分ペプチドとしては、配列番号：
７で表されるアミノ酸配列の第１８番目〜３１番目のア
ミノ酸配列を有するペプチドであって、そのＮ端にシス
テインが付加したペプチドが挙げられる。本発明におけ
る１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペ
プチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクロ
ーナル抗体）としては、例えば１９Ｐ２リガンドまたは
その誘導体を認識する抗体などが用いられる。より具体
的には、これらの抗体の中でも、（ｉ）配列番号：７で
表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（即ち、１
９Ｐ２リガンド（１8−３１））を認識するが、配列番
号：１１で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド
（即ち、１９Ｐ２リガンド（１２−２4））を認識しな
い抗体、（ii）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を
有する部分ペプチド（即ち、１９Ｐ２リガンド（１8−
３１））を認識し、配列番号：１１で表されるアミノ酸
配列を有する部分ペプチド（即ち、１９Ｐ２リガンド
（１２−２4））を認識する抗体が挙げられる。上記
（ｉ）、（ii）の抗体のなかでも、マウスＩｇＧである
もの、さらには抗体のサブクラスがκであるものが好ま
しく用いられる。上記（ｉ）の抗体の中でも、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）、配列
番号：３で表されるアミノ酸配列を有するラット１９Ｐ
２リガンド（１−３１）、配列番号：５で表されるアミ
ノ酸配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１）
および（または）配列番号：１２で表されるアミノ酸配
列を有するウシ１９Ｐ２リガンド（１２−３１）を特異
的に認識する抗体がより好ましく、さらにはH-Ser-Arg-
Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Il
e-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-
Val-D-Ala-Arg-Phe-NH2で表されるアミノ酸配列を有す
るヒト１９Ｐ２リガンド［Ｄ-Ａｌａ29］（１−３１）
を認識するが、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を
有するヒト１９Ｐ２リガンド（１−３０）、配列番号：
９で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）-OH、配列番号：８で表されるアミノ酸
配列を有するウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ-OHを認識しない抗体が好ましい。
の誘導体のＣ端側の部分ペプチドとしては、配列番号：
７で表されるアミノ酸配列の第１８番目〜３１番目のア
ミノ酸配列を有するペプチドであって、そのＮ端にシス
テインが付加したペプチドが挙げられる。本発明におけ
る１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペ
プチドに特異的に反応する抗体（好ましくは、モノクロ
ーナル抗体）としては、例えば１９Ｐ２リガンドまたは
その誘導体を認識する抗体などが用いられる。より具体
的には、これらの抗体の中でも、（ｉ）配列番号：７で
表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド（即ち、１
９Ｐ２リガンド（１8−３１））を認識するが、配列番
号：１１で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチド
（即ち、１９Ｐ２リガンド（１２−２4））を認識しな
い抗体、（ii）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を
有する部分ペプチド（即ち、１９Ｐ２リガンド（１8−
３１））を認識し、配列番号：１１で表されるアミノ酸
配列を有する部分ペプチド（即ち、１９Ｐ２リガンド
（１２−２4））を認識する抗体が挙げられる。上記
（ｉ）、（ii）の抗体のなかでも、マウスＩｇＧである
もの、さらには抗体のサブクラスがκであるものが好ま
しく用いられる。上記（ｉ）の抗体の中でも、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）、配列
番号：３で表されるアミノ酸配列を有するラット１９Ｐ
２リガンド（１−３１）、配列番号：５で表されるアミ
ノ酸配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１）
および（または）配列番号：１２で表されるアミノ酸配
列を有するウシ１９Ｐ２リガンド（１２−３１）を特異
的に認識する抗体がより好ましく、さらにはH-Ser-Arg-
Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Il
e-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-
Val-D-Ala-Arg-Phe-NH2で表されるアミノ酸配列を有す
るヒト１９Ｐ２リガンド［Ｄ-Ａｌａ29］（１−３１）
を認識するが、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を
有するヒト１９Ｐ２リガンド（１−３０）、配列番号：
９で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）-OH、配列番号：８で表されるアミノ酸
配列を有するウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ-OHを認識しない抗体が好ましい。
【００１１】また、上記（ii）の抗体の中でも、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）、配列
番号：３で表されるアミノ酸配列を有するラット１９Ｐ
２リガンド（１−３１）および（または）配列番号：５
で表されるアミノ酸配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド
（１２−３１）を特異的に認識する抗体が好ましく、さ
らには配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する
ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３０）および配列番号：８
で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リガンド
（１−３１）−Ｇｌｙ−Ａｌａ-OHを認識する抗体が好
ましい。上記（ｉ）の抗体の代表例としては、Ｐ２Ｌ−
１Ｃａで標示されるモノクローナル抗体があり、上記
（ii）の抗体の代表例としては、Ｐ２Ｌ−２Ｃａで標示
されるモノクローナル抗体が挙げられる。
号：１で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）、配列
番号：３で表されるアミノ酸配列を有するラット１９Ｐ
２リガンド（１−３１）および（または）配列番号：５
で表されるアミノ酸配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド
（１２−３１）を特異的に認識する抗体が好ましく、さ
らには配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有する
ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３０）および配列番号：８
で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リガンド
（１−３１）−Ｇｌｙ−Ａｌａ-OHを認識する抗体が好
ましい。上記（ｉ）の抗体の代表例としては、Ｐ２Ｌ−
１Ｃａで標示されるモノクローナル抗体があり、上記
（ii）の抗体の代表例としては、Ｐ２Ｌ−２Ｃａで標示
されるモノクローナル抗体が挙げられる。
【００１２】次に、本発明における１９Ｐ２リガンドま
たはその誘導体の中心部の部分ペプチドに特異的に反応
するモノクローナル抗体としては、例えば配列番号：７
で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識せ
ず、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有する部
分ペプチドを認識することを特徴とする１９Ｐ２リガン
ドまたはその誘導体に特異的に反応するモノクローナル
抗体などが用いられる。これら抗体のなかでも、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）、配列
番号：３で表されるアミノ酸配列を有するラット１９Ｐ
２リガンド（１−３１）、配列番号：５で表されるアミ
ノ酸配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３
１）、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有する
ウシ１９Ｐ２リガンド（１２−３１）、および（また
は）配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を有するラ
ット１９Ｐ２リガンド（１２−３１）を特に認識する抗
体が好ましく、配列番号：４または配列番号：６で表さ
れるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配
列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドを認識しな
い抗体が好ましい。なかでも、マウスＩｇＧであるも
の、さらには抗体のサブクラスがκであるものが好まし
く用いられる。具体的には、Ｐ２Ｌ−１Ｔａ、Ｐ２Ｌ−
２Ｔａ、Ｐ２Ｌ−３ＴａまたはＰ２Ｌ−４Ｔａで標示さ
れるモノクローナル抗体などが用いられる。これらモノ
クローナル抗体のなかでも、特にＰ２Ｌ−１Ｔａなどが
好適である。
たはその誘導体の中心部の部分ペプチドに特異的に反応
するモノクローナル抗体としては、例えば配列番号：７
で表されるアミノ酸配列を有する部分ペプチドを認識せ
ず、配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有する部
分ペプチドを認識することを特徴とする１９Ｐ２リガン
ドまたはその誘導体に特異的に反応するモノクローナル
抗体などが用いられる。これら抗体のなかでも、配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を有するウシ１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）、配列番号：２で表されるアミノ酸
配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）、配列
番号：３で表されるアミノ酸配列を有するラット１９Ｐ
２リガンド（１−３１）、配列番号：５で表されるアミ
ノ酸配列を有するヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３
１）、配列番号：１２で表されるアミノ酸配列を有する
ウシ１９Ｐ２リガンド（１２−３１）、および（また
は）配列番号：１３で表されるアミノ酸配列を有するラ
ット１９Ｐ２リガンド（１２−３１）を特に認識する抗
体が好ましく、配列番号：４または配列番号：６で表さ
れるアミノ酸配列から第１番目〜１６番目のアミノ酸配
列が欠如したアミノ酸配列を有するペプチドを認識しな
い抗体が好ましい。なかでも、マウスＩｇＧであるも
の、さらには抗体のサブクラスがκであるものが好まし
く用いられる。具体的には、Ｐ２Ｌ−１Ｔａ、Ｐ２Ｌ−
２Ｔａ、Ｐ２Ｌ−３ＴａまたはＰ２Ｌ−４Ｔａで標示さ
れるモノクローナル抗体などが用いられる。これらモノ
クローナル抗体のなかでも、特にＰ２Ｌ−１Ｔａなどが
好適である。
【００１３】以下に、本発明におけるモノクローナル抗
体の抗原の調製方法、および該モノクローナル抗体の製
造方法について詳細に説明する。 （１）抗原の調製 本発明の抗体を調製するために使用される抗原として
は、例えば１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体、１９Ｐ
２リガンドと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上
有する合成ペプチドなど何れのものも使用することがで
きる（以下、これらを単に１９Ｐ２リガンド抗原と称す
ることもある）。該１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体
としては、前述したものなどが用いられる。これら１９
Ｐ２リガンドまたはその誘導体は、（ａ）例えばヒト、
サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織または細胞
から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて
調製することもできるし、（ｂ）ペプチド・シンセサイ
ザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化学的
に合成することもできる。また、（ｃ）該１９Ｐ２リガ
ンドまたはその誘導体は、それをコードするＤＮＡを含
有する形質転換体を培養することによっても製造するこ
とができる。 （ａ）該哺乳動物の組織または細胞から調製する場合、
その組織または細胞をホモジナイズした後、酸、または
アルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透
析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精
製単離することができる。 （ｂ）化学的に合成する場合、該合成ペプチドとして
は、例えば上述した天然より精製した１９Ｐ２リガンド
抗原と同一の構造を有するものや、１９Ｐ２リガンド
（１−３１）などのアミノ酸配列において３個以上、好
ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミ
ノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上
含有するペプチド（以下１９Ｐ２リガンド関連合成ペプ
チドと略す）などが用いられる。 （ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて該１９Ｐ２
リガンドまたはその誘導体を製造する場合、そのリガン
ドまたはその誘導体をコードするＤＮＡは、公知のクロ
ーニング方法〔例えば、Molecular Cloning（２nd e
d.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Pr
ess, 1989）に記載の方法など〕に従って作成すること
ができる。該クローニング方法とは、（１）該ペプチド
のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブま
たはＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡライブラリーか
らハイブリダイゼーション法により該ペプチドをコード
するＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法、または
（２）該ペプチドのアミノ酸配列に基づきデザインした
ＤＮＡプライマーを用い、ＰＣＲ法により該ペプチドを
コードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法など
が挙げられる。
体の抗原の調製方法、および該モノクローナル抗体の製
造方法について詳細に説明する。 （１）抗原の調製 本発明の抗体を調製するために使用される抗原として
は、例えば１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体、１９Ｐ
２リガンドと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上
有する合成ペプチドなど何れのものも使用することがで
きる（以下、これらを単に１９Ｐ２リガンド抗原と称す
ることもある）。該１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体
としては、前述したものなどが用いられる。これら１９
Ｐ２リガンドまたはその誘導体は、（ａ）例えばヒト、
サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織または細胞
から自体公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて
調製することもできるし、（ｂ）ペプチド・シンセサイ
ザー等を使用する自体公知のペプチド合成方法で化学的
に合成することもできる。また、（ｃ）該１９Ｐ２リガ
ンドまたはその誘導体は、それをコードするＤＮＡを含
有する形質転換体を培養することによっても製造するこ
とができる。 （ａ）該哺乳動物の組織または細胞から調製する場合、
その組織または細胞をホモジナイズした後、酸、または
アルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透
析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
などのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精
製単離することができる。 （ｂ）化学的に合成する場合、該合成ペプチドとして
は、例えば上述した天然より精製した１９Ｐ２リガンド
抗原と同一の構造を有するものや、１９Ｐ２リガンド
（１−３１）などのアミノ酸配列において３個以上、好
ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミ
ノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上
含有するペプチド（以下１９Ｐ２リガンド関連合成ペプ
チドと略す）などが用いられる。 （ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて該１９Ｐ２
リガンドまたはその誘導体を製造する場合、そのリガン
ドまたはその誘導体をコードするＤＮＡは、公知のクロ
ーニング方法〔例えば、Molecular Cloning（２nd e
d.；J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Pr
ess, 1989）に記載の方法など〕に従って作成すること
ができる。該クローニング方法とは、（１）該ペプチド
のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブま
たはＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡライブラリーか
らハイブリダイゼーション法により該ペプチドをコード
するＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法、または
（２）該ペプチドのアミノ酸配列に基づきデザインした
ＤＮＡプライマーを用い、ＰＣＲ法により該ペプチドを
コードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法など
が挙げられる。
【００１４】上記したように該抗原としてのペプチド
は、（１）自体公知のペプチドの合成法に従って、また
は（２）本発明のペプチドを含有するペプチドを適当な
ペプチダーゼで切断することによって製造することがで
きる。該ペプチドの合成法としては、例えば固相合成
法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該
ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と
残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は
保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造する
ことができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては
たとえば、以下の〜に記載された方法等が挙げられ
る。 Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ および M.A. Ondetti、
ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscie
nce Publishers, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸
留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィ
ー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離す
ることができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体
である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換する
ことができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によ
って遊離体に変換することができる。
は、（１）自体公知のペプチドの合成法に従って、また
は（２）本発明のペプチドを含有するペプチドを適当な
ペプチダーゼで切断することによって製造することがで
きる。該ペプチドの合成法としては、例えば固相合成
法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該
ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と
残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は
保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造する
ことができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては
たとえば、以下の〜に記載された方法等が挙げられ
る。 Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ および M.A. Ondetti、
ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscie
nce Publishers, New York (1966年) SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),
Academic Press, New York (1965年) また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸
留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィ
ー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離す
ることができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体
である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換する
ことができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によ
って遊離体に変換することができる。
【００１５】ペプチドのアミド体は、アミド形成に適し
た市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そ
のような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒド
ロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノ
メチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹
脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、
４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチ
ル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメ
トキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、
４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチ
ル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このよ
うな樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保
護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、
自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。
反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種
保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいは
クロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安
息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取
り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチド
を得ることもできる。上記した保護されたアミノ酸の縮
合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試
薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類が
よい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロ
ピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノ
プロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらに
よる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt、HO
OBtなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加
するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるい
はHOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸
の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。
保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられ
る溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが
知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトア
ミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メ
チレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ト
リフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルス
ルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級
アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエー
テル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニト
リル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類ある
いはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度
はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られて
いる範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃
の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導
体は通常約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニン
ヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場
合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返す
ことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り
返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸ま
たはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をア
セチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにする
ことができる。
た市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そ
のような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒド
ロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノ
メチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹
脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、
４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチ
ル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２',４'-ジメ
トキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、
４−（２',４'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチ
ル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このよ
うな樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保
護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、
自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。
反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種
保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいは
クロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安
息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取
り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチド
を得ることもできる。上記した保護されたアミノ酸の縮
合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試
薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類が
よい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N'-ジイソプロ
ピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノ
プロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらに
よる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt、HO
OBtなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加
するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるい
はHOOBtエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸
の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。
保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられ
る溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが
知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトア
ミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メ
チレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、ト
リフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルス
ルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級
アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエー
テル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニト
リル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類ある
いはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度
はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られて
いる範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃
の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導
体は通常約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニン
ヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場
合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返す
ことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り
返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸ま
たはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をア
セチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにする
ことができる。
【００１６】原料アミノ酸のアミノ基の保護基として
は、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシ
カルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メト
キシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが挙げられる。
カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ1-6アル
キル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ7-14アラルキル基
の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メ
トキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基お
よびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリ
ーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジド
などが挙げられる。セリンおよびスレオニンの水酸基
は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護
することができる。このエステル化に適する基としては
例えばアセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル
基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカ
ルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導
される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する
基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニ
ル基、ターシャリーブチル基などである。チロシンのフ
ェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl2
−Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチ
ルなどが挙げられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護
基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベン
ゼンスルホニル、DNP、Bom、Bum、Boc、Trt、Fmocなど
が挙げられる。原料のカルボキシル基の活性化されたも
のとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性
エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノ
ール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェ
ノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル］などが挙げられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対
応するリン酸アミドが挙げられる。
は、たとえば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシ
カルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メト
キシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマン
チルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロ
イル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが挙げられる。
カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ1-6アル
キル基、Ｃ3-8シクロアルキル基、Ｃ7-14アラルキル基
の他、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メ
トキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル基お
よびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリ
ーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジド
などが挙げられる。セリンおよびスレオニンの水酸基
は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護
することができる。このエステル化に適する基としては
例えばアセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル
基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカ
ルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導
される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する
基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニ
ル基、ターシャリーブチル基などである。チロシンのフ
ェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl2
−Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチ
ルなどが挙げられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護
基としては、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベン
ゼンスルホニル、DNP、Bom、Bum、Boc、Trt、Fmocなど
が挙げられる。原料のカルボキシル基の活性化されたも
のとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性
エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノ
ール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェ
ノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノー
ル、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ
ルイミド、HOBt）とのエステル］などが挙げられる。原
料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対
応するリン酸アミドが挙げられる。
【００１７】保護基の除去（脱離）方法としては、たと
えばPd黒あるいはPd炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸
処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で
行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノー
ル、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾー
ル、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-
エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効
である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として
用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処
理により除去され、トリプトファンのインドール保護基
として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオ
ール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ
る脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアな
どによるアルカリ処理によっても除去される。原料の反
応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、なら
びにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化
などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しう
る。ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、ま
ず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基を
アミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長
まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基
の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル
基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）と
を製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中
で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様で
ある。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、
上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプ
チドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種
精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥するこ
とで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。ペ
プチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しア
ミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様に
して所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
えばPd黒あるいはPd炭素などの触媒の存在下での水素気
流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンス
ルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオ
ロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジ
イソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリ
ジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモ
ニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸
処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で
行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノー
ル、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾー
ル、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-
エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効
である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として
用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処
理により除去され、トリプトファンのインドール保護基
として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオ
ール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理によ
る脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアな
どによるアルカリ処理によっても除去される。原料の反
応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、なら
びにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化
などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しう
る。ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、ま
ず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基を
アミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長
まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基
の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル
基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）と
を製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中
で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様で
ある。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、
上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプ
チドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種
精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥するこ
とで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。ペ
プチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸
のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しア
ミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様に
して所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１８】１９Ｐ２リガンド抗原は、凝集しやすいた
め、不溶化したものを直接免疫することもできる。ま
た、該１９Ｐ２リガンド抗原を適当な担体に結合または
吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体および担体
（キャリアー）と１９Ｐ２リガンド抗原（ハプテン）と
の混合比は、担体に結合あるいは吸着させた１９Ｐ２リ
ガンド抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのよう
なものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよ
く、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用
されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハ
プテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸
着させたものを使用することができる。天然の高分子担
体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物
の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物
のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジ
などの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペット
ヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体とし
ては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリア
クリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合
物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いるこ
とができる。また、ハプテンとキャリアーのカプリング
には、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チ
ロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジ
アゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基
同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド
化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジ
イソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ,
Ｎ'-ｏ-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化
合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性
エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋す
るカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。ま
た、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基に
ジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、
ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオ
ール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エス
テル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させ
ることもできる。
め、不溶化したものを直接免疫することもできる。ま
た、該１９Ｐ２リガンド抗原を適当な担体に結合または
吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体および担体
（キャリアー）と１９Ｐ２リガンド抗原（ハプテン）と
の混合比は、担体に結合あるいは吸着させた１９Ｐ２リ
ガンド抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのよう
なものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよ
く、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用
されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハ
プテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸
着させたものを使用することができる。天然の高分子担
体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物
の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物
のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジ
などの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペット
ヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体とし
ては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリア
クリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合
物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いるこ
とができる。また、ハプテンとキャリアーのカプリング
には、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チ
ロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジ
アゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基
同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド
化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジ
イソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ,
Ｎ'-ｏ-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化
合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性
エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋す
るカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。ま
た、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基に
ジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、
ＳＰＤＰなど）を反応させた後還元することによりチオ
ール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エス
テル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させ
ることもできる。
【００１９】（２）モノクローナル抗体の作製 １９Ｐ２リガンド抗原は、温血動物に対して、例えば腹
腔内注入、静脈注入，皮下注射などの投与方法によっ
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担
体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能
を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フ
ロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温
血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあ
げられるが、モノクローナル抗体作製にはマウス、ラッ
トなどが好ましく用いられる。モノクローナル抗体の作
製に際しては、１９Ｐ２リガンド抗原を免疫された温血
動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選
択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取
し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合
させることにより、抗１９Ｐ２リガンドモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清
中の抗１９Ｐ２リガンド抗体価の測定は、例えば後記の
標識化１９Ｐ２リガンドと抗血清とを反応させたのち、
抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなさ
れる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６、４９５
（１９７５）〕に従い実施できる。融合促進剤として
は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィ
ルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用い
られる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ
１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ
１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞
（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常
１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥ
Ｇ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃
度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３
７℃で通常１〜１０分間インキュベートすることにより
効率よく細胞融合を実施できる。
腔内注入、静脈注入，皮下注射などの投与方法によっ
て、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担
体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能
を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フ
ロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常
２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温
血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモッ
ト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあ
げられるが、モノクローナル抗体作製にはマウス、ラッ
トなどが好ましく用いられる。モノクローナル抗体の作
製に際しては、１９Ｐ２リガンド抗原を免疫された温血
動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選
択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取
し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合
させることにより、抗１９Ｐ２リガンドモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清
中の抗１９Ｐ２リガンド抗体価の測定は、例えば後記の
標識化１９Ｐ２リガンドと抗血清とを反応させたのち、
抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなさ
れる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー（Nature）、２５６、４９５
（１９７５）〕に従い実施できる。融合促進剤として
は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィ
ルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用い
られる。骨髄腫細胞としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ
１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられるが、Ｐ３Ｕ
１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞
（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常
１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥ
Ｇ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃
度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３
７℃で通常１〜１０分間インキュベートすることにより
効率よく細胞融合を実施できる。
【００２０】抗１９Ｐ２リガンド抗体産生ハイブリドー
マのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例
えば１９Ｐ２リガンドあるいは１９Ｐ２リガンド関連合
成ペプタイドを直接あるいは担体とともに吸着させた固
相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清
を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫
グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの
場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）また
はプロテインＡを加え、固相に結合した抗１９Ｐ２リガ
ンドモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブ
リン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブ
リドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標
識した１９Ｐ２リガンドを加え、固相に結合した抗１９
Ｐ２リガンドモノクローナル抗体を検出する方法などが
あげられる。抗１９Ｐ２リガンドモノクローナル抗体の
スクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％
牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４
０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、
上記の抗血清中の抗１９Ｐ２リガンド抗体価の測定と同
様にして測定できる。抗１９Ｐ２リガンドモノクローナ
ル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離
精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析
法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イ
オン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心
法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあ
るいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを
採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法な
ど〕に従って行われる。
マのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例
えば１９Ｐ２リガンドあるいは１９Ｐ２リガンド関連合
成ペプタイドを直接あるいは担体とともに吸着させた固
相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清
を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫
グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの
場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）また
はプロテインＡを加え、固相に結合した抗１９Ｐ２リガ
ンドモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブ
リン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブ
リドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標
識した１９Ｐ２リガンドを加え、固相に結合した抗１９
Ｐ２リガンドモノクローナル抗体を検出する方法などが
あげられる。抗１９Ｐ２リガンドモノクローナル抗体の
スクリーニング、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）を添加して、１０〜２０％
牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ１６４
０）で行われる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、
上記の抗血清中の抗１９Ｐ２リガンド抗体価の測定と同
様にして測定できる。抗１９Ｐ２リガンドモノクローナ
ル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離
精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析
法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イ
オン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心
法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあ
るいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを
採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法な
ど〕に従って行われる。
【００２１】また、１９Ｐ２リガンドの一部領域と反応
する抗１９Ｐ２リガンド抗体を産生するハイブリドーマ
および、１９Ｐ２リガンドとは反応するがその一部領域
とは反応しない抗１９Ｐ２リガンドモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマのスクリーニングはたとえば
その一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産
生する抗体との結合性を測定することにより行うことが
できる。以上のようにして得られるＰ２Ｌ−１Ｃａで
標示されるモノクローナル抗体、Ｐ２Ｌ−３Ｃａで標
示されるモノクローナル抗体および１９Ｐ２リガンド
またはその誘導体の中心部分の部分ペプチドに特異的に
反応することを特徴とする抗体Ｐ２Ｌ−３Ｔａで標示さ
れるモノクローナル抗体は、それぞれ１９Ｐ２リガンド
のＣ端側および中心部分の部分ペプチドを特異的に認識
することができるので、被検液中の１９Ｐ２リガンドの
定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使
用することができる。
する抗１９Ｐ２リガンド抗体を産生するハイブリドーマ
および、１９Ｐ２リガンドとは反応するがその一部領域
とは反応しない抗１９Ｐ２リガンドモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマのスクリーニングはたとえば
その一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産
生する抗体との結合性を測定することにより行うことが
できる。以上のようにして得られるＰ２Ｌ−１Ｃａで
標示されるモノクローナル抗体、Ｐ２Ｌ−３Ｃａで標
示されるモノクローナル抗体および１９Ｐ２リガンド
またはその誘導体の中心部分の部分ペプチドに特異的に
反応することを特徴とする抗体Ｐ２Ｌ−３Ｔａで標示さ
れるモノクローナル抗体は、それぞれ１９Ｐ２リガンド
のＣ端側および中心部分の部分ペプチドを特異的に認識
することができるので、被検液中の１９Ｐ２リガンドの
定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使
用することができる。
【００２２】即ち、本発明は、（１）本発明の１９Ｐ２
リガンドまたはその誘導体に対する抗体と、被検液およ
び標識化１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体とを競合的
に反応させ、該抗体に結合した標識化１９Ｐ２リガンド
またはその誘導体の割合を測定することを特徴とする被
検液中の１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量法、
（２）担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドまたはその
誘導体に対する抗体、標識化された１９Ｐ２リガンドま
たはその誘導体に対する抗体および被検液を反応させた
のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特
徴とする被検液中の１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体
の定量法であって、担体上に不溶化した１９Ｐ２リガン
ドまたはその誘導体に対する抗体および標識化された１
９Ｐ２リガンドまたはその誘導体に対する抗体の一方が
１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプ
チドに特異的に反応することを特徴とする抗体であり、
他方が配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有する
部分ペプチド（即ち１９Ｐ２リガンド（１２−２４））
などの１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の中間部分を
認識する抗体である定量法などを提供する。より具体的
には、１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ端側の部
分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体が
Ｐ２Ｌ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで標示されるモノ
クローナル抗体であり、配列番号：１１で表されるアミ
ノ酸配列を有する部分ペプチド（即ち、１９Ｐ２リガン
ド（１２−２４））などの１９Ｐ２リガンドまたはその
誘導体の中間部分を認識する抗体がＰ２Ｌ−１Ｔａまた
はＰ２Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗体であ
る。
リガンドまたはその誘導体に対する抗体と、被検液およ
び標識化１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体とを競合的
に反応させ、該抗体に結合した標識化１９Ｐ２リガンド
またはその誘導体の割合を測定することを特徴とする被
検液中の１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量法、
（２）担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドまたはその
誘導体に対する抗体、標識化された１９Ｐ２リガンドま
たはその誘導体に対する抗体および被検液を反応させた
のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特
徴とする被検液中の１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体
の定量法であって、担体上に不溶化した１９Ｐ２リガン
ドまたはその誘導体に対する抗体および標識化された１
９Ｐ２リガンドまたはその誘導体に対する抗体の一方が
１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ端側の部分ペプ
チドに特異的に反応することを特徴とする抗体であり、
他方が配列番号：１１で表されるアミノ酸配列を有する
部分ペプチド（即ち１９Ｐ２リガンド（１２−２４））
などの１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の中間部分を
認識する抗体である定量法などを提供する。より具体的
には、１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ端側の部
分ペプチドに特異的に反応することを特徴とする抗体が
Ｐ２Ｌ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで標示されるモノ
クローナル抗体であり、配列番号：１１で表されるアミ
ノ酸配列を有する部分ペプチド（即ち、１９Ｐ２リガン
ド（１２−２４））などの１９Ｐ２リガンドまたはその
誘導体の中間部分を認識する抗体がＰ２Ｌ−１Ｔａまた
はＰ２Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗体であ
る。
【００２３】上記の定量法（２）の中でも、特に、 担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドに対する抗体お
よび標識化された１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体に
対する抗体の一方がＰ２Ｌ−１Ｃａで標示されるモノク
ローナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２
Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗体であり、１
９Ｐ２リガンドが配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３、配列番号：５または配列番号：１２で表される
アミノ酸配列を有するペプチドである定量法、 担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドに対する抗体お
よび標識化された１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体に
対する抗体の一方がＰ２Ｌ−２Ｃａで標示されるモノク
ローナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２
Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗体であり、１
９Ｐ２リガンドが配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３、配列番号：５または配列番号：１２で表される
アミノ酸配列を有するペプチドである定量法などが好適
である。
よび標識化された１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体に
対する抗体の一方がＰ２Ｌ−１Ｃａで標示されるモノク
ローナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２
Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗体であり、１
９Ｐ２リガンドが配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３、配列番号：５または配列番号：１２で表される
アミノ酸配列を有するペプチドである定量法、 担体上に不溶化した１９Ｐ２リガンドに対する抗体お
よび標識化された１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体に
対する抗体の一方がＰ２Ｌ−２Ｃａで標示されるモノク
ローナル抗体であり、他方がＰ２Ｌ−１ＴａまたはＰ２
Ｌ−３Ｔａで標示されるモノクローナル抗体であり、１
９Ｐ２リガンドが配列番号：１、配列番号：２、配列番
号：３、配列番号：５または配列番号：１２で表される
アミノ酸配列を有するペプチドである定量法などが好適
である。
【００２４】以下に本発明の１９Ｐ２リガンドまたはそ
の誘導体（以下、１９Ｐ２リガンドと略称する）の定量
法（免疫測定法）について、より詳細に説明する。本発
明の抗体は１９Ｐ２リガンドを認識することができるの
で、１９Ｐ２リガンドの測定あるいは組織染色などによ
る検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体
分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のＦ（ａ
ｂ'）2、Ｆａｂ'あるいはＦａｂ画分などを用いてもよ
い。本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるべ
きものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、１９Ｐ
２リガンド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗
原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、
これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準
曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用
いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノ
メトリック法、サンドイッチ法などが好適に用いられる
が、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法を用い
るのが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いら
れる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物
質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素として
は、例えば 125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃなどが、上記酵素
としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例え
ばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水
素酵素などが、蛍光物質としては、例えばフルオレスカ
ミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光
物質としては、例えばルミノール、ルミノール誘導体、
ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。
さらに、抗体あるいは１９Ｐ２リガンドと標識剤との結
合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。抗原
あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いても
よく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化
するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担
体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロ
ースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリア
クリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラス
などが挙げられる。
の誘導体（以下、１９Ｐ２リガンドと略称する）の定量
法（免疫測定法）について、より詳細に説明する。本発
明の抗体は１９Ｐ２リガンドを認識することができるの
で、１９Ｐ２リガンドの測定あるいは組織染色などによ
る検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体
分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のＦ（ａ
ｂ'）2、Ｆａｂ'あるいはＦａｂ画分などを用いてもよ
い。本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるべ
きものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、１９Ｐ
２リガンド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗
原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、
これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準
曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用
いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノ
メトリック法、サンドイッチ法などが好適に用いられる
が、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法を用い
るのが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いら
れる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物
質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素として
は、例えば 125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃなどが、上記酵素
としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例え
ばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水
素酵素などが、蛍光物質としては、例えばフルオレスカ
ミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光
物質としては、例えばルミノール、ルミノール誘導体、
ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。
さらに、抗体あるいは１９Ｐ２リガンドと標識剤との結
合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。抗原
あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いても
よく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化
するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担
体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロ
ースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリア
クリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラス
などが挙げられる。
【００２５】サンドイッチ法においては、不溶化した抗
１９Ｐ２リガンド抗体に被検液を反応（１次反応）さ
せ、さらに標識化抗１９Ｐ２リガンド抗体を反応（２次
反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定す
ることにより被検液中の１９Ｐ２リガンド量を定量する
ことができる。１次反応と２次反応は同時に行なっても
よいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および
不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。ま
た、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用
抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１
種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的
で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明の
サンドイッチ法による１９Ｐ２リガンドの測定法におい
ては、１次反応と２次反応に用いられる抗１９Ｐ２リガ
ンド抗体とは１９Ｐ２リガンドの該抗体と結合する部位
が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、例えば１
次反応で用いられる抗体が１９Ｐ２リガンドのＣ端側の
部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる
抗体は、好ましくはＣ端側の部分ペプチド以外（即ち、
Ｎ端側または中間部の部分ペプチド）を認識する抗体が
用いられる。具体的に、本発明のサンドイッチ免疫測定
法に用いられる１９Ｐ２リガンドのＣ端側の部分ペプチ
ドに特異的に反応するモノクローナル抗体としては、
［Cys17］ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）を免疫
原として作製したモノクローナル抗体が用いられる。本
発明者らは、このような抗体を産生するハイブリドーマ
を８種類確立した。中でもハイブリドーマＰ２Ｌ−１Ｃ
が産生する抗体は、後述するパーオキシダーゼ標識化１
９Ｐ２リガンド（１７−３１）を用いる競合法の酵素免
疫測定法において、ヒト、ウシおよびラット１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）と反応した（Ｂ／Ｂ０＝０．５を与
える抗原濃度：３ ｎＭ、１．１ｎｇ/well）。さらに、
後述する［Cys25］１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を
免疫原として作製した１９Ｐ２リガンドの中間部の部分
ペプチドを認識するモノクローナル抗体のうち、特にＰ
２Ｌ−１Ｔａと組み合わせたサンドイッチ法に用いた場
合、予想外にも１９Ｐ２リガンドをより高感度に測定で
きることが明らかとなった（検出感度、０．１ ｆｍｏ
ｌ/well）。即ち、本発明のサンドイッチ法酵素免疫測
定法に適した１９Ｐ２リガンドのＣ端側の部分ペプチド
に特異的に反応するモノクローナル抗体は、必ずしも１
９Ｐ２リガンド（１−３１）に対して高親和性である必
要はない。このような抗体として、例えば、Ｐ２Ｌ−１
Ｔａなどが好都合に用いられる。
１９Ｐ２リガンド抗体に被検液を反応（１次反応）さ
せ、さらに標識化抗１９Ｐ２リガンド抗体を反応（２次
反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定す
ることにより被検液中の１９Ｐ２リガンド量を定量する
ことができる。１次反応と２次反応は同時に行なっても
よいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および
不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。ま
た、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用
抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１
種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的
で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明の
サンドイッチ法による１９Ｐ２リガンドの測定法におい
ては、１次反応と２次反応に用いられる抗１９Ｐ２リガ
ンド抗体とは１９Ｐ２リガンドの該抗体と結合する部位
が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、例えば１
次反応で用いられる抗体が１９Ｐ２リガンドのＣ端側の
部分ペプチドを認識する場合は、２次反応で用いられる
抗体は、好ましくはＣ端側の部分ペプチド以外（即ち、
Ｎ端側または中間部の部分ペプチド）を認識する抗体が
用いられる。具体的に、本発明のサンドイッチ免疫測定
法に用いられる１９Ｐ２リガンドのＣ端側の部分ペプチ
ドに特異的に反応するモノクローナル抗体としては、
［Cys17］ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）を免疫
原として作製したモノクローナル抗体が用いられる。本
発明者らは、このような抗体を産生するハイブリドーマ
を８種類確立した。中でもハイブリドーマＰ２Ｌ−１Ｃ
が産生する抗体は、後述するパーオキシダーゼ標識化１
９Ｐ２リガンド（１７−３１）を用いる競合法の酵素免
疫測定法において、ヒト、ウシおよびラット１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）と反応した（Ｂ／Ｂ０＝０．５を与
える抗原濃度：３ ｎＭ、１．１ｎｇ/well）。さらに、
後述する［Cys25］１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を
免疫原として作製した１９Ｐ２リガンドの中間部の部分
ペプチドを認識するモノクローナル抗体のうち、特にＰ
２Ｌ−１Ｔａと組み合わせたサンドイッチ法に用いた場
合、予想外にも１９Ｐ２リガンドをより高感度に測定で
きることが明らかとなった（検出感度、０．１ ｆｍｏ
ｌ/well）。即ち、本発明のサンドイッチ法酵素免疫測
定法に適した１９Ｐ２リガンドのＣ端側の部分ペプチド
に特異的に反応するモノクローナル抗体は、必ずしも１
９Ｐ２リガンド（１−３１）に対して高親和性である必
要はない。このような抗体として、例えば、Ｐ２Ｌ−１
Ｔａなどが好都合に用いられる。
【００２６】一方、本発明のサンドイッチ免疫測定法に
用いられる１９Ｐ２リガンドの中間部の部分ペプチドを
認識するモノクローナル抗体としては、［Cys25］１９
Ｐ２リガンド（１２−２５）を免疫原として作製した抗
体が好適に用いられる。本発明者らは、これらの抗体を
産生するハイブリドーマを１２種類作製した（表２）。
これらの抗体の１９Ｐ２リガンド（１２−２５）に対す
る反応性を後述するパーオキシダーゼ標識化１９Ｐ２リ
ガンド（１２−２５）を用いる競合法により調べたとこ
ろ、４種類の抗体が１９Ｐ２リガンド（１２−２５）に
良好な反応性を有していた（Ｂ／Ｂ０＝０．５を与える
抗原濃度：１〜４ ｎＭ、０．９〜１．６ｎｇ/well）
が、Ｐ２Ｌ−１ＴａとＰ２Ｌ−３Ｔａが１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）に良好な反応性を有していた。そのなか
でも特にＰ２Ｌ−１Ｔａが極めて高感度のサンドイッチ
−測定法を与えることが明らかとなった。また、Ｐ２Ｌ
−１Ｔａは１９Ｐ２リガンド（１２−３１）とも同程度
の反応性を示した。即ち、本発明において、サンドイッ
チ法に適した１９Ｐ２リガンドの中間部の部分ペプチド
を認識する抗体として、１９Ｐ２リガンド（１２−２
４）に対する抗体を数種類提供するが、特にＰ２Ｌ−１
Ｔａが好適に用いられる。本発明のモノクローナル抗体
は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合
法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどにも用い
ることもができる。競合法では、被検液中の抗原と標識
抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応
の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを
分離し（Ｂ／Ｆ分離）、ＢおよびＦいずれかの標識量を
測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、
抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレ
ングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる
液相法や、第１抗体として固相化抗体を用いるかあるい
は第１抗体は可溶性のものを用い、第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法などが用いられる。イムノメト
リック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量
の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分
離するか、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
用いられる１９Ｐ２リガンドの中間部の部分ペプチドを
認識するモノクローナル抗体としては、［Cys25］１９
Ｐ２リガンド（１２−２５）を免疫原として作製した抗
体が好適に用いられる。本発明者らは、これらの抗体を
産生するハイブリドーマを１２種類作製した（表２）。
これらの抗体の１９Ｐ２リガンド（１２−２５）に対す
る反応性を後述するパーオキシダーゼ標識化１９Ｐ２リ
ガンド（１２−２５）を用いる競合法により調べたとこ
ろ、４種類の抗体が１９Ｐ２リガンド（１２−２５）に
良好な反応性を有していた（Ｂ／Ｂ０＝０．５を与える
抗原濃度：１〜４ ｎＭ、０．９〜１．６ｎｇ/well）
が、Ｐ２Ｌ−１ＴａとＰ２Ｌ−３Ｔａが１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）に良好な反応性を有していた。そのなか
でも特にＰ２Ｌ−１Ｔａが極めて高感度のサンドイッチ
−測定法を与えることが明らかとなった。また、Ｐ２Ｌ
−１Ｔａは１９Ｐ２リガンド（１２−３１）とも同程度
の反応性を示した。即ち、本発明において、サンドイッ
チ法に適した１９Ｐ２リガンドの中間部の部分ペプチド
を認識する抗体として、１９Ｐ２リガンド（１２−２
４）に対する抗体を数種類提供するが、特にＰ２Ｌ−１
Ｔａが好適に用いられる。本発明のモノクローナル抗体
は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合
法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどにも用い
ることもができる。競合法では、被検液中の抗原と標識
抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応
の標識抗原（Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを
分離し（Ｂ／Ｆ分離）、ＢおよびＦいずれかの標識量を
測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、
抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレ
ングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる
液相法や、第１抗体として固相化抗体を用いるかあるい
は第１抗体は可溶性のものを用い、第２抗体として固相
化抗体を用いる固相化法などが用いられる。イムノメト
リック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量
の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分
離するか、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化抗
体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化
抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。
次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量
を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい
は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の
量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の
沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用す
るレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００２７】これら個々の免疫学的測定法を本発明法に
適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必
要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操
作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて１９Ｐ２リガ
ンドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術
手段の詳細については、総説、成書などを参照すること
ができる［例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセ
イ］（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジ
オイムノアッセイ］（講談社、昭和５４年発行）、石川
栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Me
thods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunochemical Tech
niques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immunochemical Tec
hniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immunochemical Te
chniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immunochemical T
echniques(Part D:SelectedImmunoassays)）、同書 Vo
l. 92（Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal
Antibodies and General Immunoassay Methods)）、同
書 Vol. 121（Immunochemical Techniques(Part I:Hybr
idoma Technology and Monoclonal Antibodies)）（以
上、アカデミックプレス社発行）など参照］。したがっ
て、本発明のサンドイッチ免疫測定法により１９Ｐ２リ
ガンドの測定系を構築する場合、その方法は後述する実
施例に限定されない。以上のように、本発明の抗体は、
１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体を感度良く定量する
ことができるので、１９Ｐ２リガンドの生理機能の解明
および１９Ｐ２リガンドの関与する病態の診断等として
有用である。
適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必
要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操
作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて１９Ｐ２リガ
ンドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術
手段の詳細については、総説、成書などを参照すること
ができる［例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセ
イ］（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジ
オイムノアッセイ］（講談社、昭和５４年発行）、石川
栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発
行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医
学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測
定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Me
thods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70（Immunochemical Tech
niques(Part A)）、同書 Vol. 73（Immunochemical Tec
hniques(Part B)）、同書 Vol. 74（Immunochemical Te
chniques(Part C)）、同書 Vol. 84（Immunochemical T
echniques(Part D:SelectedImmunoassays)）、同書 Vo
l. 92（Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal
Antibodies and General Immunoassay Methods)）、同
書 Vol. 121（Immunochemical Techniques(Part I:Hybr
idoma Technology and Monoclonal Antibodies)）（以
上、アカデミックプレス社発行）など参照］。したがっ
て、本発明のサンドイッチ免疫測定法により１９Ｐ２リ
ガンドの測定系を構築する場合、その方法は後述する実
施例に限定されない。以上のように、本発明の抗体は、
１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体を感度良く定量する
ことができるので、１９Ｐ２リガンドの生理機能の解明
および１９Ｐ２リガンドの関与する病態の診断等として
有用である。
【００２８】本発明の明細書において、アミノ酸等を略
号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemic
al Nomenclature による略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミ
ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しな
ければＬ−体を示すものとする。 ＰＡＭ ：フェニルアセタミドメチル Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ2−Ｂｚｌ ：２,６−ジクロロベンジル ＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステル ＯＢｚｌ ：ベンジルエステル Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルホニル ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２、３
−ジカルボキシイミド ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＯＯＢｔ：３−ヒドロキシ−３、４−ジヒドロ−４−
オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｂｕｍ：ｔ−ブトキシメチル Ｔｒｔ：トリチル ＤＮＰ：ジニトロフェニル ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 ＤＭＦ：Ｎ、Ｎ−ジメチルフォルムアミド ＤＣＭ：ジクロロメタン ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド ＢＨＡ：ベンズヒドリルアミン ｐＭＢＨＡ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン ＣＨＯ：ホルミル ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン ２Ａｃ−ヒト１９Ｐ２リガンド：［ＡｃＰｒｏ１７，Ｔ
ｙｒ（Ａｃ）２０］ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３
１） Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン
号で表示する場合、IUPAC-IUB Commision on Biochemic
al Nomenclature による略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。アミ
ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しな
ければＬ−体を示すものとする。 ＰＡＭ ：フェニルアセタミドメチル Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル Ｃｌ2−Ｂｚｌ ：２,６−ジクロロベンジル ＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステル ＯＢｚｌ ：ベンジルエステル Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルホニル ＨＯＮＢ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２、３
−ジカルボキシイミド ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＯＯＢｔ：３−ヒドロキシ−３、４−ジヒドロ−４−
オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｂｕｍ：ｔ−ブトキシメチル Ｔｒｔ：トリチル ＤＮＰ：ジニトロフェニル ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸 ＤＭＦ：Ｎ、Ｎ−ジメチルフォルムアミド ＤＣＭ：ジクロロメタン ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド ＢＨＡ：ベンズヒドリルアミン ｐＭＢＨＡ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン ＣＨＯ：ホルミル ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン ２Ａｃ−ヒト１９Ｐ２リガンド：［ＡｃＰｒｏ１７，Ｔ
ｙｒ（Ａｃ）２０］ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３
１） Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン
【００２９】本明細書において用いられる配列番号は、
以下のペプチドのアミノ酸配列を表す。 〔配列番号：１〕ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１） H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：２〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１） H-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：３〕ラット１９Ｐ２リガンド（１−３１） H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Thr-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：４〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１） H-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-
Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：５〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-
Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：６〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）
のジアセチル体 Ac-Pro-Ala-Trp-Tyr(Ac)-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro
-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：７〕［Ｃｙｓ17］ヒト１９Ｐ２リガンド
（１7−３１） H-Cys -Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val
-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：８〕ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ-OH H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-Gly-Arg-OH 〔配列番号：９〕ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）-O
H H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-OH 〔配列番号：１０〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３０） H-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-NH2 〔配列番号：１１〕［Ｃｙｓ25］ヒト１９Ｐ２リガンド
（１２−２5） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-
Gly-Cys-NH2 〔配列番号：１２〕ウシ１９Ｐ２リガンド（１2−３
１） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-
Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：１３〕ラット１９Ｐ２リガンド（１２−３
１） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-Arg-
Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2
以下のペプチドのアミノ酸配列を表す。 〔配列番号：１〕ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１） H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：２〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１） H-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：３〕ラット１９Ｐ２リガンド（１−３１） H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Thr-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：４〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１） H-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-
Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：５〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-
Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：６〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）
のジアセチル体 Ac-Pro-Ala-Trp-Tyr(Ac)-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro
-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：７〕［Ｃｙｓ17］ヒト１９Ｐ２リガンド
（１7−３１） H-Cys -Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val
-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：８〕ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）Ｇ
ｌｙ−Ａｒｇ-OH H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-Gly-Arg-OH 〔配列番号：９〕ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）-O
H H-Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-OH 〔配列番号：１０〕ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３０） H-Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Met-Glu-Ile-Arg-Thr-
Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-Gly-Il
e-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-NH2 〔配列番号：１１〕［Ｃｙｓ25］ヒト１９Ｐ２リガンド
（１２−２5） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Ser-Arg-
Gly-Cys-NH2 〔配列番号：１２〕ウシ１９Ｐ２リガンド（１2−３
１） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-Gly-Arg-
Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2 〔配列番号：１３〕ラット１９Ｐ２リガンド（１２−３
１） H-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-Arg-
Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2
【００３０】後述の実施例で得られた抗１９Ｐ２リガン
ド抗体を産生するハイブリドーマ細胞のうち、Ｐ２Ｌ-
１ＣおよびＰ２Ｌ−１Ｔは平成１０年３月１８日から通
商産業省工業技術院生命工学技術研究所（ＮＩＢＨ）
に、それぞれ以下の受託番号で寄託されている。 ハイブリドーマ細胞 FERM-BP(NIBH) Ｐ２Ｌ−１Ｃ ６２９９ Ｐ２Ｌ−１Ｔ ６３００ なお、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体について
は細胞名の後にａを付けた形で表す。
ド抗体を産生するハイブリドーマ細胞のうち、Ｐ２Ｌ-
１ＣおよびＰ２Ｌ−１Ｔは平成１０年３月１８日から通
商産業省工業技術院生命工学技術研究所（ＮＩＢＨ）
に、それぞれ以下の受託番号で寄託されている。 ハイブリドーマ細胞 FERM-BP(NIBH) Ｐ２Ｌ−１Ｃ ６２９９ Ｐ２Ｌ−１Ｔ ６３００ なお、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体について
は細胞名の後にａを付けた形で表す。
【００３１】
【発明の実施の形態】以下に、実験例を含む実施例を示
し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の
範囲を限定するものではない。
し、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の
範囲を限定するものではない。
【００３２】
【実施例】〔実施例１〕抗原の作成 （１）１９Ｐ２リガンドの製造
【実験例１】ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）の製造 1）Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Ala-His(Bom)-Gln-His(Bom)-Ser
(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-Asp
(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly
-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Ph
e-pMBHA-resin の合成。 市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド バイオシテ
ムズ、現パ−キンエルマ−社製）0.71g(0.5 m mole)を
ペプチド合成機（アプライド バイオシテムズ社製４３
０Ａ）の反応器に入れ、ジクロロメタン(ＤＣＭ)で膨潤
させた後、最初のアミノ酸Boc-PheをHOBt/DCC法で活性
化しｐ−メチルＢＨＡ樹脂に導入した。樹脂を50%ＴＦ
Ａ／ＤＣＭで処理し、Boc基を除去してアミノ基を遊離
させ、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)で中和した。
このアミノ基に次のアミノ酸Boc-Arg(Tos)をHOBt/DCC
法で縮合した。 未反応アミノ基の有無をニンヒドリン
テストで調べ反応完了を確認後同様に、Boc-Gly、Boc-Va
l、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Gly、Boc-Arg(To
s)、Boc-Gly、Boc-Ala、Boc-Tyr(Br-Z)を順次縮合、ニンヒ
ドリンテストで縮合が不十分であると判明したBoc-Ala、
Boc-Tyr(Br-Z)は再縮合し反応を完了した。 樹脂を乾
燥して半量の樹脂を取り出した残りに、Boc-Trp(CHO)、B
oc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-
Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Glu(OcHe
x)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、Boc-His(Bom)、Boc-Gln、Boc-H
is(Bom)、Boc-Ala、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)を同様に
ニンヒドリンテストで十分な縮合が得られるまで再縮合
をくり返した。全配列アミノ酸が導入され樹脂を50%ト
リフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／ＤＣＭで処理し樹脂上のBoc
基を除去後、樹脂を乾燥し1.28gのペプチド樹脂を合成
した。
(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-Asp
(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly
-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Ph
e-pMBHA-resin の合成。 市販のｐ−メチルＢＨＡ樹脂（アプライド バイオシテ
ムズ、現パ−キンエルマ−社製）0.71g(0.5 m mole)を
ペプチド合成機（アプライド バイオシテムズ社製４３
０Ａ）の反応器に入れ、ジクロロメタン(ＤＣＭ)で膨潤
させた後、最初のアミノ酸Boc-PheをHOBt/DCC法で活性
化しｐ−メチルＢＨＡ樹脂に導入した。樹脂を50%ＴＦ
Ａ／ＤＣＭで処理し、Boc基を除去してアミノ基を遊離
させ、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)で中和した。
このアミノ基に次のアミノ酸Boc-Arg(Tos)をHOBt/DCC
法で縮合した。 未反応アミノ基の有無をニンヒドリン
テストで調べ反応完了を確認後同様に、Boc-Gly、Boc-Va
l、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Gly、Boc-Arg(To
s)、Boc-Gly、Boc-Ala、Boc-Tyr(Br-Z)を順次縮合、ニンヒ
ドリンテストで縮合が不十分であると判明したBoc-Ala、
Boc-Tyr(Br-Z)は再縮合し反応を完了した。 樹脂を乾
燥して半量の樹脂を取り出した残りに、Boc-Trp(CHO)、B
oc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-
Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、Boc-Glu(OcHe
x)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、Boc-His(Bom)、Boc-Gln、Boc-H
is(Bom)、Boc-Ala、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)を同様に
ニンヒドリンテストで十分な縮合が得られるまで再縮合
をくり返した。全配列アミノ酸が導入され樹脂を50%ト
リフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／ＤＣＭで処理し樹脂上のBoc
基を除去後、樹脂を乾燥し1.28gのペプチド樹脂を合成
した。
【００３３】2）Ser-Arg-Ala-His-Gln-His-Ser-Met-Glu
-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-G
ly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2の合成。 １）で得た樹脂をｐ−クレゾール3.8g、1、4-ブタンジチ
オ−ル１ml、弗化水素10mlと共にテフロン製弗化水素反
応装置中で０℃ ６０分間反応した。 弗化水素、1、4-
ブタンジチオ−ル１mlを減圧留去し、残留物にジエチル
エーテル100mlを加え撹袢後、グラスフィルター上に濾
取、乾燥した。 これを50%酢酸水溶液50ml中に懸濁、
撹袢し、ペプチドを抽出した後樹脂と分離し減圧下に約
５mlまでに濃縮した後、セファデックスG-25（２ｘ９０
ｃｍ）のカラムに付し50%酢酸水で展開し114 ml〜181 m
lの画分を集め凍結乾燥し、白色粉末290 ｍｇを得た。
これをLiChroprep(RP-18（ＭＥＲＣＫ社製）を充填した
逆相系カラムにつけ0.1%ＴＦＡ水と0.1% ＴＦＡ含有3
０％アセトニトリル水溶液を用いたグラジエント溶出で
の精製をくり返し、アセトニトリル濃度２５％前後に溶
出される部分を集め凍結乾燥し、白色粉末７１ｍｇを得
た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３５７４．６４５（計算値 ３５７４．８４７） ＨＰＬＣ溶出時間 １８．２分 カラム条件 カラム： Wakosil５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-Ala-G
ly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gly-Arg-Phe-NH2の合成。 １）で得た樹脂をｐ−クレゾール3.8g、1、4-ブタンジチ
オ−ル１ml、弗化水素10mlと共にテフロン製弗化水素反
応装置中で０℃ ６０分間反応した。 弗化水素、1、4-
ブタンジチオ−ル１mlを減圧留去し、残留物にジエチル
エーテル100mlを加え撹袢後、グラスフィルター上に濾
取、乾燥した。 これを50%酢酸水溶液50ml中に懸濁、
撹袢し、ペプチドを抽出した後樹脂と分離し減圧下に約
５mlまでに濃縮した後、セファデックスG-25（２ｘ９０
ｃｍ）のカラムに付し50%酢酸水で展開し114 ml〜181 m
lの画分を集め凍結乾燥し、白色粉末290 ｍｇを得た。
これをLiChroprep(RP-18（ＭＥＲＣＫ社製）を充填した
逆相系カラムにつけ0.1%ＴＦＡ水と0.1% ＴＦＡ含有3
０％アセトニトリル水溶液を用いたグラジエント溶出で
の精製をくり返し、アセトニトリル濃度２５％前後に溶
出される部分を集め凍結乾燥し、白色粉末７１ｍｇを得
た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３５７４．６４５（計算値 ３５７４．８４７） ＨＰＬＣ溶出時間 １８．２分 カラム条件 カラム： Wakosil５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００３４】
【実験例２】ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）の製造 実験例１と同様にｐ−メチルＢＨＡ樹脂にBoc-Phe、Boc
-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Val、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc
-Ile、Boc-Gly、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Ala、Boc
-Tyr(Br-Z)、Boc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Bo
c-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg
(Tos)、Boc-Ile、Boc-Glu(OcHex)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、
Boc-His(Bom)、Boc-Arg(Tos)、Boc-His(Bom)、Boc-Thr(Bz
l)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)をニンヒドリンテストで
十分な縮合が得られるまで再縮合をくり返した。全配列
アミノ酸が導入され樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し
樹脂上のBoc基を除去後、樹脂を乾燥し所望のペプチド
樹脂を合成した。 この樹脂を実験例１と同様の弗化水
素処理の後、やはり同様のクロマト精製で目的のペプチ
ドを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３６６２．８８４（計算値 ３６６２．９０５） ＨＰＬＣ溶出時間 １７．２分 カラム条件 カラム： Wakosil５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
-Arg(Tos)、Boc-Gly、Boc-Val、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc
-Ile、Boc-Gly、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Ala、Boc
-Tyr(Br-Z)、Boc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Bo
c-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg
(Tos)、Boc-Ile、Boc-Glu(OcHex)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、
Boc-His(Bom)、Boc-Arg(Tos)、Boc-His(Bom)、Boc-Thr(Bz
l)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)をニンヒドリンテストで
十分な縮合が得られるまで再縮合をくり返した。全配列
アミノ酸が導入され樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し
樹脂上のBoc基を除去後、樹脂を乾燥し所望のペプチド
樹脂を合成した。 この樹脂を実験例１と同様の弗化水
素処理の後、やはり同様のクロマト精製で目的のペプチ
ドを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３６６２．８８４（計算値 ３６６２．９０５） ＨＰＬＣ溶出時間 １７．２分 カラム条件 カラム： Wakosil５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００３５】
【実験例３】ラット１９Ｐ２リガンド（１−３１）の製
造 実験例１の１回目のBoc-Alaと２回目のBoc-IleをBoc-Th
r(Bzl)に変更して合成を進め、全配列アミノ酸が導入さ
れ樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し樹脂上のBoc基を除
去後、樹脂を乾燥し所望のペプチド樹脂を得た。 この
樹脂を実験例１と同様に処理、精製し、Ser-Arg-Ala-Hi
s-Gln-His-Ser-Met-Glu-Thr-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-
Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gl
y-Arg-Phe-NH2の、白色粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３６２２．５４７（３６２２．８２６） ＨＰＬＣ溶出時間 １７．４分 カラム条件 カラム： Wakosil( ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
造 実験例１の１回目のBoc-Alaと２回目のBoc-IleをBoc-Th
r(Bzl)に変更して合成を進め、全配列アミノ酸が導入さ
れ樹脂を50%ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し樹脂上のBoc基を除
去後、樹脂を乾燥し所望のペプチド樹脂を得た。 この
樹脂を実験例１と同様に処理、精製し、Ser-Arg-Ala-Hi
s-Gln-His-Ser-Met-Glu-Thr-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-
Pro-Ala-Trp-Tyr-Thr-Gly-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Gl
y-Arg-Phe-NH2の、白色粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３６２２．５４７（３６２２．８２６） ＨＰＬＣ溶出時間 １７．４分 カラム条件 カラム： Wakosil( ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００３６】
【実験例４】ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）の製
造 実験例２でBoc-Tyr(Br-Z)までを縮合した樹脂にさらにB
oc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、 を同様に縮合し、 Boc-
Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Il
e-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resinを
得た。 これを実験例１の２）と同様に弗化水素処理、
カラム精製し、白色粉末７０ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ １７３１．９（計算値 １７３２．０） ＨＰＬＣ溶出時間 １６．１分 カラム条件 カラム： Wakosil５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（１５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
造 実験例２でBoc-Tyr(Br-Z)までを縮合した樹脂にさらにB
oc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、 を同様に縮合し、 Boc-
Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Il
e-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resinを
得た。 これを実験例１の２）と同様に弗化水素処理、
カラム精製し、白色粉末７０ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ １７３１．９（計算値 １７３２．０） ＨＰＬＣ溶出時間 １６．１分 カラム条件 カラム： Wakosil５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（１５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００３７】
【実験例５】ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１）の製
造 実験例４でBoc-Proまでを縮合した樹脂にさらにBoc-As
n、Boc-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)を同
様に縮合し、 Boc-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-P
ro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile
-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resin を
得た。 これを実験例４と同様に弗化水素処理、カラム
精製し、白色粉末６０ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ２２７２．１２６０（計算値 ２２７２．２１０ ０） ＨＰＬＣ溶出時間 １６．８分 カラム条件 カラム： Wakosil５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
造 実験例４でBoc-Proまでを縮合した樹脂にさらにBoc-As
n、Boc-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)を同
様に縮合し、 Boc-Thr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-P
ro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile
-Arg(Tos)-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resin を
得た。 これを実験例４と同様に弗化水素処理、カラム
精製し、白色粉末６０ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ２２７２．１２６０（計算値 ２２７２．２１０ ０） ＨＰＬＣ溶出時間 １６．８分 カラム条件 カラム： Wakosil５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００３８】
【実験例６】ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）のジ
アセチル体の製造 実験例４の化合物１７．５ｍｇを１０％ピリジン水に溶
解し、無水酢酸２０μｌと約６０分反応後、実験例４と
同様に精製し、１０．７ｍｇの粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ １８１５．８６００（計算値 １８１５．９７４ ３） ＨＰＬＣ溶出時間 １９．７分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% 水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
アセチル体の製造 実験例４の化合物１７．５ｍｇを１０％ピリジン水に溶
解し、無水酢酸２０μｌと約６０分反応後、実験例４と
同様に精製し、１０．７ｍｇの粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ １８１５．８６００（計算値 １８１５．９７４ ３） ＨＰＬＣ溶出時間 １９．７分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% 水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００３９】
【実験例７】［Cys17］ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−
３１）の製造 実験例４の樹脂にさらにBoc-Cys(MeBzl)縮合し、これを
同様に弗化水素処理、カラム精製し、白色粉末５０ｍｇ
を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ １７３７．９（計算値 １７３７．６） ＨＰＬＣ溶出時間 １７．２分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
３１）の製造 実験例４の樹脂にさらにBoc-Cys(MeBzl)縮合し、これを
同様に弗化水素処理、カラム精製し、白色粉末５０ｍｇ
を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ １７３７．９（計算値 １７３７．６） ＨＰＬＣ溶出時間 １７．２分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００４０】
【実験例８】［D-Ala29］ヒト１９Ｐ２リガンド（１−
３１）の製造 実験例２と同様にｐ−メチルＢＨＡ樹脂にBoc-Phe、Boc
-Arg(Tos)を順に導入した後、Boc-GlyをBoc-D-Alaに代
えて導入した。以後実験例２と同様に反応し、Ser(Bzl)
-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-His(Bom)-Arg(Tos)-His(Bom)-Ser
(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-Asp
(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Ser
(Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-D-Ala-Arg
(Tos)-Phe-pMBHA-resinを得た。この樹脂を実験例２と
同様に処理、精製し、Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Me
t-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-
Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-D-Ala-Arg-Phe-NH2
の白色粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３６７８．６（計算値 ３６７９．２） ＨＰＬＣ溶出時間 １８．５分 カラム条件 カラム：ＹＭＣ−Ａ−３０１−３ ＯＤＳ（４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
３１）の製造 実験例２と同様にｐ−メチルＢＨＡ樹脂にBoc-Phe、Boc
-Arg(Tos)を順に導入した後、Boc-GlyをBoc-D-Alaに代
えて導入した。以後実験例２と同様に反応し、Ser(Bzl)
-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-His(Bom)-Arg(Tos)-His(Bom)-Ser
(Bzl)-Met-Glu(OcHex)-Ile-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Pro-Asp
(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Tyr(Br-Z)-Ala-Ser
(Bzl)-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-D-Ala-Arg
(Tos)-Phe-pMBHA-resinを得た。この樹脂を実験例２と
同様に処理、精製し、Ser-Arg-Thr-His-Arg-His-Ser-Me
t-Glu-Ile-Arg-Thr-Pro-Asp-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp-Tyr-
Ala-Ser-Arg-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-D-Ala-Arg-Phe-NH2
の白色粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３６７８．６（計算値 ３６７９．２） ＨＰＬＣ溶出時間 １８．５分 カラム条件 カラム：ＹＭＣ−Ａ−３０１−３ ＯＤＳ（４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００４１】
【実験例９】ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）Gly-Ar
g-OHの製造 市販Boc-Arg(Tos)-OCH2PAM樹脂（アプライド バイオシ
テムズ、現パ−キンエルマ−社製）0.83g(0.5 m mole)
をペプチド合成機（アプライド バイオシテムズ社製４
３０Ａ）の反応器に入れ、ＤＣＭで膨潤させた後、50%
ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し、Boc基を除去してアミノ基を
遊離させ、DIEAで中和した。 このアミノ基に次のアミ
ノ酸Boc-GlyをHOBt/DCC法で縮合した。以後実験例１と
同様のBocアミノ酸を順次縮合し、全アミノ酸配列を導
入した樹脂１．２１ｇを得た。この樹脂０．５９ｇを実
験例１と同様に処理、精製して白色粉末１６２ｍｇを得
た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３７８９．０１０５（計算値 ３７８８．９４７ ７） ＨＰＬＣ溶出時間 １６．４分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
g-OHの製造 市販Boc-Arg(Tos)-OCH2PAM樹脂（アプライド バイオシ
テムズ、現パ−キンエルマ−社製）0.83g(0.5 m mole)
をペプチド合成機（アプライド バイオシテムズ社製４
３０Ａ）の反応器に入れ、ＤＣＭで膨潤させた後、50%
ＴＦＡ／ＤＣＭで処理し、Boc基を除去してアミノ基を
遊離させ、DIEAで中和した。 このアミノ基に次のアミ
ノ酸Boc-GlyをHOBt/DCC法で縮合した。以後実験例１と
同様のBocアミノ酸を順次縮合し、全アミノ酸配列を導
入した樹脂１．２１ｇを得た。この樹脂０．５９ｇを実
験例１と同様に処理、精製して白色粉末１６２ｍｇを得
た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３７８９．０１０５（計算値 ３７８８．９４７ ７） ＨＰＬＣ溶出時間 １６．４分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００４２】
【実験例１０】ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）-OH
の製造 市販Boc-Phe-OCH2PAM樹脂（アプライド バイオシテム
ズ、現パ−キンエルマ−社製）0.６９g(0.5 m mole)を
用い実験例９と同様に所望するアミノ酸配列通りに順次
Bocアミノ酸を導入後、処理精製を行い、白色粉末を得
た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３５７５．７４５１（３５７５．８２５４） ＨＰＬＣ溶出時間 １６．６分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
の製造 市販Boc-Phe-OCH2PAM樹脂（アプライド バイオシテム
ズ、現パ−キンエルマ−社製）0.６９g(0.5 m mole)を
用い実験例９と同様に所望するアミノ酸配列通りに順次
Bocアミノ酸を導入後、処理精製を行い、白色粉末を得
た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３５７５．７４５１（３５７５．８２５４） ＨＰＬＣ溶出時間 １６．６分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００４３】
【実験例１１】ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３０）の製
造 実験例２と同様にｐ−メチルＢＨＡ樹脂に、Boc-Arg(To
s)、 Boc-Gly、Boc-Val、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、B
oc-Gly、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Ala、Boc-Tyr(B
r-Z)、Boc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、
Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg(Tos)、B
oc-Ile、Boc-Glu(OcHex)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、Boc-His
(Bom)、Boc-Arg(Tos)、Boc-His(Bom)、Boc-Thr(Bzl)、Boc-A
rg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)を順次縮合した後、同様に処理精
製し、白色粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３５１７．４（計算値 ３５１８．０） ＨＰＬＣ溶出時間 １７．５分 カラム条件 カラム： ＹＭＣ−Ａ−３０１−３ ＯＤＳ（４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
造 実験例２と同様にｐ−メチルＢＨＡ樹脂に、Boc-Arg(To
s)、 Boc-Gly、Boc-Val、Boc-Pro、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ile、B
oc-Gly、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Ala、Boc-Tyr(B
r-Z)、Boc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、
Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Arg(Tos)、B
oc-Ile、Boc-Glu(OcHex)、Boc-Met、Boc-Ser(Bzl)、Boc-His
(Bom)、Boc-Arg(Tos)、Boc-His(Bom)、Boc-Thr(Bzl)、Boc-A
rg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)を順次縮合した後、同様に処理精
製し、白色粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ３５１７．４（計算値 ３５１８．０） ＨＰＬＣ溶出時間 １７．５分 カラム条件 カラム： ＹＭＣ−Ａ−３０１−３ ＯＤＳ（４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００４４】
【実験例１２】［Cys25］ヒト１９Ｐ２リガンド（１２
−２５）の製造 実験例2と同様にｐ−メチルＢＨＡ樹脂に、Boc-Cys(MeB
zl)、Boc-Gly、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Ala、Boc-
Tyr(Br-Z)、Boc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc
-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)、を順次縮
合した後、同様に処理精製し、白色粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ １５４９．５（計算値 １５４９．７） ＨＰＬＣ溶出時間 １５．３分 カラム条件 カラム： Wakosil( ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
−２５）の製造 実験例2と同様にｐ−メチルＢＨＡ樹脂に、Boc-Cys(MeB
zl)、Boc-Gly、Boc-Arg(Tos)、Boc-Ser(Bzl)、Boc-Ala、Boc-
Tyr(Br-Z)、Boc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc
-Ile、Boc-Asp(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)、を順次縮
合した後、同様に処理精製し、白色粉末を得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ １５４９．５（計算値 １５４９．７） ＨＰＬＣ溶出時間 １５．３分 カラム条件 カラム： Wakosil( ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有５０％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（２５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００４５】
【実験例１３】ウシ１９Ｐ２リガンド（１２−３１）の
製造 実験例１でBoc-Tyr(Br-Z)までを縮合した樹脂にさらにB
oc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、Boc-As
p(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)を同様に縮合し、Boc-T
hr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Ty
r(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-
Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resin １．１４ｇを得た。
これを実験例１の２）と同様に弗化水素処理、カラム精
製し、白色粉末６０ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ２２４２．１４９（計算値 ２２４２．２００） ＨＰＬＣ溶出時間 １０．４分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有１５％アセトニトリル水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有４５％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（１５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
製造 実験例１でBoc-Tyr(Br-Z)までを縮合した樹脂にさらにB
oc-Trp(CHO)、Boc-Ala、Boc-Pro、Boc-Asn、Boc-Ile、Boc-As
p(OcHex)、Boc-Pro、Boc-Thr(Bzl)を同様に縮合し、Boc-T
hr(Bzl)-Pro-Asp(OcHex)-Ile-Asn-Pro-Ala-Trp(CHO)-Ty
r(Br-Z)-Ala-Gly-Arg(Tos)-Gly-Ile-Arg(Tos)-Pro-Val-
Gly-Arg(Tos)-Phe-pMBHA-resin １．１４ｇを得た。
これを実験例１の２）と同様に弗化水素処理、カラム精
製し、白色粉末６０ｍｇを得た。 質量分析による（Ｍ＋Ｈ）+ ２２４２．１４９（計算値 ２２４２．２００） ＨＰＬＣ溶出時間 １０．４分 カラム条件 カラム： Wakosil ５Ｃ１８ （４．６ｘ１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（0.1% ＴＦＡ含有１５％アセトニトリル水） Ｂ液（0.1% ＴＦＡ含有４５％アセトニトリル水）を用い Ａ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（１５分） 流速： 1.0 ｍｌ／分
【００４６】〔実施例２〕免疫原の作製 （１）１９Ｐ２リガンド(１８−３１)を含む免疫原の作
製 上記実施例１（実験例７）で得られた[Cys17] １９Ｐ２
リガンド(１７−３１)と牛チログロブリン（ＢＴＧ）と
の複合体を作製し、免疫原とした。即ち、ＢＴＧ２０ｍ
ｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．5）１．４ｍｌ
に溶解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サク
シニミド(ＧＭＢＳ)２．２ｍｇ（８μｍｏｌ）を含むＤ
ＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で４０分反応させ
た。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画した
のち、マレイミド基の導入されたＢＴＧ１５ｍｇと[Cys
17] １９Ｐ２リガンド(１７−３１)１．６ ｍｇとを混
合し、４℃で２日間反応させた。反応後、生理食塩水に
対し、４℃で２日間透析した。 （２）１９Ｐ２リガンド(１２−２５)を含む免疫原の作
製 上記実施例１（実験例１２）で得られた［Cys25］１９
Ｐ２リガンド(１２−２５)とＢＴＧとの複合体を作製
し、免疫原とした。即ち、ＢＴＧ２１ｍｇを０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．４ｍｌに溶解させ、ＧＭ
ＢＳ２．３５ｍｇ（８．４μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液
１００μｌと混合し、室温で４０分反応させた。反応
後、セファデックスＧ−２５カラムで分画したのち、マ
レイミド基の導入されたＢＴＧ１５ ｍｇと［Cys25］
１９Ｐ２リガンド(１２−２５) ３．８ｍｇとを混合
し、４℃で一晩反応させた。反応後、生理食塩水に対し
４℃で３日間透析した。
製 上記実施例１（実験例７）で得られた[Cys17] １９Ｐ２
リガンド(１７−３１)と牛チログロブリン（ＢＴＧ）と
の複合体を作製し、免疫原とした。即ち、ＢＴＧ２０ｍ
ｇを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．5）１．４ｍｌ
に溶解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サク
シニミド(ＧＭＢＳ)２．２ｍｇ（８μｍｏｌ）を含むＤ
ＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で４０分反応させ
た。反応後、セファデックスＧ−２５カラムで分画した
のち、マレイミド基の導入されたＢＴＧ１５ｍｇと[Cys
17] １９Ｐ２リガンド(１７−３１)１．６ ｍｇとを混
合し、４℃で２日間反応させた。反応後、生理食塩水に
対し、４℃で２日間透析した。 （２）１９Ｐ２リガンド(１２−２５)を含む免疫原の作
製 上記実施例１（実験例１２）で得られた［Cys25］１９
Ｐ２リガンド(１２−２５)とＢＴＧとの複合体を作製
し、免疫原とした。即ち、ＢＴＧ２１ｍｇを０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．４ｍｌに溶解させ、ＧＭ
ＢＳ２．３５ｍｇ（８．４μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液
１００μｌと混合し、室温で４０分反応させた。反応
後、セファデックスＧ−２５カラムで分画したのち、マ
レイミド基の導入されたＢＴＧ１５ ｍｇと［Cys25］
１９Ｐ２リガンド(１２−２５) ３．８ｍｇとを混合
し、４℃で一晩反応させた。反応後、生理食塩水に対し
４℃で３日間透析した。
【００４７】〔実施例３〕免疫 ６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに上記実施例２記載
の免疫原[Cys17] １９Ｐ２リガンド(１７−３１)−ＢＴ
Ｇ複合体および[Cys25] １９Ｐ２リガンド(１２−２５)
−ＢＴＧ複合体を、それぞれ約２０μｇ／匹を完全フロ
イントアジュバントとともに皮下免疫した。以後３週間
おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントと
ともに２〜３回追加免疫した。
の免疫原[Cys17] １９Ｐ２リガンド(１７−３１)−ＢＴ
Ｇ複合体および[Cys25] １９Ｐ２リガンド(１２−２５)
−ＢＴＧ複合体を、それぞれ約２０μｇ／匹を完全フロ
イントアジュバントとともに皮下免疫した。以後３週間
おきに同量の免疫原を不完全フロイントアジュバントと
ともに２〜３回追加免疫した。
【００４８】〔実施例４〕酵素標識化抗原の作製 （１）西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化１
９Ｐ２リガンド(１７−３１)の作製 上記実施例１（実験例７）で得られた[Cys17]１９Ｐ２
リガンド(１７−３１)とＨＲＰ（酵素免疫測定法用、ベ
ーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免疫測定
法（ＥＩＡ）の標識体とした。即ち、ＨＲＰ ６ｍｇ
（１５０ｎｍｏｌ）を０．９５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ６．５に溶解させ、ＧＭＢＳ０．４２ｍｇ
（１．５μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液５０μｌと混合
し、室温で３０分間反応させたのち、セファデックスＧ
−２５カラムで分画した。このようにして作製した、マ
レイミド基の導入されたＨＲＰ４．２ｍｇ（１０５ｎｍ
ｏｌ）と実施例１（実験例７）で作製された[Cys17]１
９Ｐ２リガンド(１７−３１)０．５５ｍｇ（３１５ｎｍ
ｏｌ）とを混合し、４℃で１日反応させた。反応後ウル
トロゲルＡｃＡ44（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラム
で分画し、ＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド(１７−３１)
を得た。 （２）ＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド（１２−２５）の
作製 上記実施例１（実験例１２）で得られた［Cys25］１９
Ｐ２リガンド(１２−２５)とＨＲＰとを架橋し、ＥＩＡ
の標識体とした。即ち、ＨＲＰ６ｍｇ（１５０ｎｍｏ
ｌ）を１．４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５
に溶解させ、ＧＭＢＳ０．４２ｍｇ（１．５μｍｏｌ）
を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で３０分間
反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画
した。このようにして作製した、マレイミド基の導入さ
れたＨＲＰ４．２ｍｇ（１０５ｎｍｏｌ）と実施例１
（１２）で作製された[Cys25]１９Ｐ２リガンド(１２−
２５)０．４８ｍｇ（３１５ｎｍｏｌ）とを混合し、４
℃で１日反応させた。反応後ウルトロゲルＡｃＡ４４カ
ラムで分画し、ＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド(１２−
２５)を得た。
９Ｐ２リガンド(１７−３１)の作製 上記実施例１（実験例７）で得られた[Cys17]１９Ｐ２
リガンド(１７−３１)とＨＲＰ（酵素免疫測定法用、ベ
ーリンガーマンハイム社製）とを架橋し、酵素免疫測定
法（ＥＩＡ）の標識体とした。即ち、ＨＲＰ ６ｍｇ
（１５０ｎｍｏｌ）を０．９５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ６．５に溶解させ、ＧＭＢＳ０．４２ｍｇ
（１．５μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液５０μｌと混合
し、室温で３０分間反応させたのち、セファデックスＧ
−２５カラムで分画した。このようにして作製した、マ
レイミド基の導入されたＨＲＰ４．２ｍｇ（１０５ｎｍ
ｏｌ）と実施例１（実験例７）で作製された[Cys17]１
９Ｐ２リガンド(１７−３１)０．５５ｍｇ（３１５ｎｍ
ｏｌ）とを混合し、４℃で１日反応させた。反応後ウル
トロゲルＡｃＡ44（ＬＫＢ−ファルマシア社製）カラム
で分画し、ＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド(１７−３１)
を得た。 （２）ＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド（１２−２５）の
作製 上記実施例１（実験例１２）で得られた［Cys25］１９
Ｐ２リガンド(１２−２５)とＨＲＰとを架橋し、ＥＩＡ
の標識体とした。即ち、ＨＲＰ６ｍｇ（１５０ｎｍｏ
ｌ）を１．４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５
に溶解させ、ＧＭＢＳ０．４２ｍｇ（１．５μｍｏｌ）
を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で３０分間
反応させたのち、セファデックスＧ−２５カラムで分画
した。このようにして作製した、マレイミド基の導入さ
れたＨＲＰ４．２ｍｇ（１０５ｎｍｏｌ）と実施例１
（１２）で作製された[Cys25]１９Ｐ２リガンド(１２−
２５)０．４８ｍｇ（３１５ｎｍｏｌ）とを混合し、４
℃で１日反応させた。反応後ウルトロゲルＡｃＡ４４カ
ラムで分画し、ＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド(１２−
２５)を得た。
【００４９】〔実施例５〕抗体価の測定 （１）[Cys17]１９Ｐ２リガンド(１７−３１)−ＢＴＧ
を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定 [Cys17]１９Ｐ２リガンド(１７−３１)−ＢＴＧを免疫
中のマウス抗血清中の抗体価を同様の方法により測定し
た。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレー
トを作製するため、まず抗マウスイムノグロブリン抗体
（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を１００μｇ／ｍｌ含む
０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイ
クロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間
放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結
合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社
製）を含むＰＢＳを３００μｌずつ分注し、４℃で少な
くとも２４時間処理した。上記、抗マウスイムノグロブ
リン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファー
Ｃ［１％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ
ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０］
５０μｌ、バッファーＣで希釈したマウス抗[Cys17]１
９Ｐ２リガンド(１７−３１)-BTG抗血清１００μｌを加
え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢ
Ｓで洗浄したのち、上記実施例４（１）で作製したＨＲ
Ｐ標識化１９Ｐ２リガンド(１７−３１)（バッファーＣ
で３００倍希釈）１００μｌを加え室温で１日反応させ
た。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上
の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基
質システム（KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC、 フナコシ薬
品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させ
ることにより測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを
加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリー
ダー（ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ、大日本製薬社製）で測
定した。結果を〔図１〕に示す。免疫した８匹のマウス
全てに１９Ｐ２リガンド(１７−３１)に対する抗体価の
上昇が認められた。 （２）[Cys25]１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−ＢＴＧ
を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定 [Cys25]１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−ＢＴＧを免疫
中のマウス抗血清中の抗体価を同様の方法により測定し
た。 バッファーＣで希釈したマウス抗[Cys25]１９Ｐ２
リガンド(１２−２５)−ＢＴＧ抗血清１００μｌを加え
４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳ
で洗浄したのち、上記実施例４（２）で作製したＨＲＰ
標識化１９Ｐ２リガンド(１２−２５)（バッファーＣで
５００倍希釈）１００μｌを加え室温で１日反応させ
た。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上
の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基
質システム（KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC、 フナコシ薬
品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させ
ることにより測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを
加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリー
ダー（ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ、大日本製薬社製）で測
定した。結果を〔図２〕に示す。免疫した８匹のマウス
全てに１９Ｐ２リガンド(１２−２５)に対する抗体価の
上昇が認められた。結果を〔図２〕に示す。免疫した８
匹のマウスのうち３匹に比較的高い抗体価が認められ
た。
を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定 [Cys17]１９Ｐ２リガンド(１７−３１)−ＢＴＧを免疫
中のマウス抗血清中の抗体価を同様の方法により測定し
た。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレー
トを作製するため、まず抗マウスイムノグロブリン抗体
（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を１００μｇ／ｍｌ含む
０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイ
クロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４時間
放置した。次に、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ウェルの余剰の結
合部位をふさぐため２５％ブロックエース（雪印乳業社
製）を含むＰＢＳを３００μｌずつ分注し、４℃で少な
くとも２４時間処理した。上記、抗マウスイムノグロブ
リン抗体結合マイクロプレートの各ウエルにバッファー
Ｃ［１％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、および２ｍＭ
ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０］
５０μｌ、バッファーＣで希釈したマウス抗[Cys17]１
９Ｐ２リガンド(１７−３１)-BTG抗血清１００μｌを加
え４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢ
Ｓで洗浄したのち、上記実施例４（１）で作製したＨＲ
Ｐ標識化１９Ｐ２リガンド(１７−３１)（バッファーＣ
で３００倍希釈）１００μｌを加え室温で１日反応させ
た。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上
の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基
質システム（KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC、 フナコシ薬
品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させ
ることにより測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを
加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリー
ダー（ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ、大日本製薬社製）で測
定した。結果を〔図１〕に示す。免疫した８匹のマウス
全てに１９Ｐ２リガンド(１７−３１)に対する抗体価の
上昇が認められた。 （２）[Cys25]１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−ＢＴＧ
を免疫したマウスの抗血清中の抗体価の測定 [Cys25]１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−ＢＴＧを免疫
中のマウス抗血清中の抗体価を同様の方法により測定し
た。 バッファーＣで希釈したマウス抗[Cys25]１９Ｐ２
リガンド(１２−２５)−ＢＴＧ抗血清１００μｌを加え
４℃で１６時間反応させた。次に、該プレートをＰＢＳ
で洗浄したのち、上記実施例４（２）で作製したＨＲＰ
標識化１９Ｐ２リガンド(１２−２５)（バッファーＣで
５００倍希釈）１００μｌを加え室温で１日反応させ
た。次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上
の酵素活性をＴＭＢマイクロウェルパーオキシダーゼ基
質システム（KIRKEGAARD&PERRY LAB, INC、 フナコシ薬
品取り扱い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させ
ることにより測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌを
加え停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリー
ダー（ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ、大日本製薬社製）で測
定した。結果を〔図２〕に示す。免疫した８匹のマウス
全てに１９Ｐ２リガンド(１２−２５)に対する抗体価の
上昇が認められた。結果を〔図２〕に示す。免疫した８
匹のマウスのうち３匹に比較的高い抗体価が認められ
た。
【００５０】〔実施例６〕モノクローナル抗１９Ｐ２リ
ガンド抗体の作製 比較的高い抗体価を示したマウスに対して２００〜３０
０μｇの免疫原を生理食塩水０．２５〜０．３ｍｌに溶
解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を
行なった。最終免疫３〜４日後のマウスから脾臓を摘出
し、ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・
ミニマム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊
させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞と
して、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ
63.Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント トピ
ックス イン マイクロバイオロジー アンド イムノロジ
ー、81、１（1978)〕。細胞融合は、原法〔ネイチャ
ー、256、495(1975)〕 に準じて行なった。即ち、脾臓
細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭ
で３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を１０：１
になるよう混合して、８００回転で１５分間遠心を行な
って細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿
を軽くほぐし、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）６０００（コッホライト社製）を０．３ｍｌ加え、
３７℃温水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合
後細胞に毎分２ｍｌの割合でＭＥＭを添加し、合計１５
ｍｌのＭＥＭを加えた後６００回転１５分間遠心して上
清を除去した。この細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含
有するＧＩＴメデイウム（和光純薬）(ＧＩＴ−１０％
ＦＣＳ）にＰ３Ｕ１が１ｍｌ当り２×１０5個になるよ
うに浮遊し、２４穴マルチディッシュ（リンブロ社製）
に１ウェル１ｍｌずつ１９２ウェルに播種した。播種
後、細胞を３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター中で
培養した。２４時間後ＨＡＴ（ヒポキサンチン１×１０
-4Ｍ、アミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１．６×
１０-3Ｍ）を含んだＧＩＴ−１０％ ＦＣＳ培地（ＨＡ
Ｔ培地）を１ウェル当り１ｍｌずつ添加することによ
り、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培
養開始３、６、９日後に旧液を１ｍｌ捨てたあと、１ｍ
ｌのＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブ
リドーマの増殖は、細胞融合後９〜１４日で認められ、
培養液が黄変したとき（約１×１０6セル／ｍｌ)、上清
を採取し、実施例５に記載の方法に従って抗体価を測定
した。[Cys17]１９Ｐ２リガンド（１７−３１）−ＢＴ
Ｇを免疫したマウス由来のハイブリドーマのスクリーニ
ングの典型例として、マウスＮｏ.６（図１参照）を用
いて得られた結果を〔図３〕に示した。これらも含め計
２種類のハイブリドーマを選択した〔表１〕。
ガンド抗体の作製 比較的高い抗体価を示したマウスに対して２００〜３０
０μｇの免疫原を生理食塩水０．２５〜０．３ｍｌに溶
解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を
行なった。最終免疫３〜４日後のマウスから脾臓を摘出
し、ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・
ミニマム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊
させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞と
して、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ
63.Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント トピ
ックス イン マイクロバイオロジー アンド イムノロジ
ー、81、１（1978)〕。細胞融合は、原法〔ネイチャ
ー、256、495(1975)〕 に準じて行なった。即ち、脾臓
細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭ
で３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を１０：１
になるよう混合して、８００回転で１５分間遠心を行な
って細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿
を軽くほぐし、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）６０００（コッホライト社製）を０．３ｍｌ加え、
３７℃温水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合
後細胞に毎分２ｍｌの割合でＭＥＭを添加し、合計１５
ｍｌのＭＥＭを加えた後６００回転１５分間遠心して上
清を除去した。この細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含
有するＧＩＴメデイウム（和光純薬）(ＧＩＴ−１０％
ＦＣＳ）にＰ３Ｕ１が１ｍｌ当り２×１０5個になるよ
うに浮遊し、２４穴マルチディッシュ（リンブロ社製）
に１ウェル１ｍｌずつ１９２ウェルに播種した。播種
後、細胞を３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター中で
培養した。２４時間後ＨＡＴ（ヒポキサンチン１×１０
-4Ｍ、アミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１．６×
１０-3Ｍ）を含んだＧＩＴ−１０％ ＦＣＳ培地（ＨＡ
Ｔ培地）を１ウェル当り１ｍｌずつ添加することによ
り、ＨＡＴ選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培
養開始３、６、９日後に旧液を１ｍｌ捨てたあと、１ｍ
ｌのＨＡＴ培地を添加することにより継続した。ハイブ
リドーマの増殖は、細胞融合後９〜１４日で認められ、
培養液が黄変したとき（約１×１０6セル／ｍｌ)、上清
を採取し、実施例５に記載の方法に従って抗体価を測定
した。[Cys17]１９Ｐ２リガンド（１７−３１）−ＢＴ
Ｇを免疫したマウス由来のハイブリドーマのスクリーニ
ングの典型例として、マウスＮｏ.６（図１参照）を用
いて得られた結果を〔図３〕に示した。これらも含め計
２種類のハイブリドーマを選択した〔表１〕。
【００５１】
【表１】
【００５２】[Cys25]１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−
ＢＴＧを免疫したマウス由来のハイブリドーマのスクリ
ーニングの典型例として、マウスＮｏ.１（図２参照）
を用いて得られた結果を〔図４〕に示した。これらも含
め計３種類のハイブリドーマを選択した〔表２〕。
ＢＴＧを免疫したマウス由来のハイブリドーマのスクリ
ーニングの典型例として、マウスＮｏ.１（図２参照）
を用いて得られた結果を〔図４〕に示した。これらも含
め計３種類のハイブリドーマを選択した〔表２〕。
【００５３】
【表２】
【００５４】次に、これらのハイブリドーマを限界希釈
法によるクローニングに付した。クローニングに際して
は、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細
胞をウェル当り５×１０5個になるように加えた。クロ
ーニング後、ハイブリドーマを、あらかじめミネラルオ
イル０．５ｍｌを腹腔内投与されたマウス（ＢＡＬＢ／
Ｃ）に１〜３×１０6セル／匹を腹腔内投与したのち、
６〜２０日後に抗体含有腹水を採取した。モノクローナ
ル抗体は得られた腹水よりプロテイン−Ａカラムにより
精製した。即ち、 腹水６〜２０ｍｌを等量の結合緩衝
液（３．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ3を含む
１．５Ｍグリシン、ｐＨ９．０）で希釈したのち、あら
かじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテイ
ン−Ａ−アガロース（Repligen社製）カラムに供し、特
異抗体を溶離緩衝液（０．０５％ＮａＮ3を含む０．１
Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０）で溶出した。溶出液は
ＰＢＳに対して４℃、２日間透析したのち、０．２２μ
mのフィルター(ミリポア社製)により除菌濾過し４℃あ
るいは−８０℃で保存した。モノクローナル抗体のクラ
ス・サブクラスの決定に際しては、精製モノクローナル
抗体結合固相を用いるエンザイム−リンクトイムノソー
ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を行った。即ち、抗体
２μg/mlを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を
９６ウェルマイクロプレートに１００μlずつ分注し、
４℃で２４時間放置した。上記実施例５で述べた方法に
従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエースでふ
さいだのち、アイソタイプタイピングキット(Mouse-Typ
erTM Sub-Isotyping Kit バイオラッド社製）を用いる
ＥＬＩＳＡによって固相化抗体のクラス、サブクラスを
調べた。
法によるクローニングに付した。クローニングに際して
は、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細
胞をウェル当り５×１０5個になるように加えた。クロ
ーニング後、ハイブリドーマを、あらかじめミネラルオ
イル０．５ｍｌを腹腔内投与されたマウス（ＢＡＬＢ／
Ｃ）に１〜３×１０6セル／匹を腹腔内投与したのち、
６〜２０日後に抗体含有腹水を採取した。モノクローナ
ル抗体は得られた腹水よりプロテイン−Ａカラムにより
精製した。即ち、 腹水６〜２０ｍｌを等量の結合緩衝
液（３．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ3を含む
１．５Ｍグリシン、ｐＨ９．０）で希釈したのち、あら
かじめ結合緩衝液で平衡化したリコンビナントプロテイ
ン−Ａ−アガロース（Repligen社製）カラムに供し、特
異抗体を溶離緩衝液（０．０５％ＮａＮ3を含む０．１
Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０）で溶出した。溶出液は
ＰＢＳに対して４℃、２日間透析したのち、０．２２μ
mのフィルター(ミリポア社製)により除菌濾過し４℃あ
るいは−８０℃で保存した。モノクローナル抗体のクラ
ス・サブクラスの決定に際しては、精製モノクローナル
抗体結合固相を用いるエンザイム−リンクトイムノソー
ベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を行った。即ち、抗体
２μg/mlを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を
９６ウェルマイクロプレートに１００μlずつ分注し、
４℃で２４時間放置した。上記実施例５で述べた方法に
従って、ウェルの余剰の結合部位をブロックエースでふ
さいだのち、アイソタイプタイピングキット(Mouse-Typ
erTM Sub-Isotyping Kit バイオラッド社製）を用いる
ＥＬＩＳＡによって固相化抗体のクラス、サブクラスを
調べた。
【００５５】〔実施例７〕競合法酵素免疫測定法 （１）競合法−ＥＩＡ（その１） [Cys17]１９Ｐ２リガンド（１７−３１）−ＢＴＧを免
疫原として作製したモノクローナル抗体の反応特異性を
以下の方法により調べた。まず、各モノクローナル抗体
溶液の抗体価を実施例５（１）記載の方法により調べ、
競合法−ＥＩＡに用いる抗体濃度として、標識体の結合
量が飽和結合量の約５０％となる抗体濃度（約３０〜５
０ｎｇ／ｍｌ)を決定した。次に、上記実施例５記載の
抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート
に、決定された濃度にバッファーＣで希釈された抗体溶
液５０μｌ、ヒト、ラットおよびウシ１９Ｐ２リガンド
（１−３１）あるいは１９Ｐ２リガンド部分ペプタイ
ド、即ちヒト１９Ｐ２リガンド（１−３０）、ヒト［D-
Ala29］−１９Ｐ２リガンド（１−３１）、ヒト１９Ｐ
２リガンド（２０−３１）、ウシ１９Ｐ２リガンド（１
−３１）-OH、ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）-Gly-
Arg-OHのバッファーＣ溶液５０μｌ、および上記実施例
４（１）記載ＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド（１７−３
１）（バッファーＣで４００倍希釈）を５０μｌ加え、
４℃で１６時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄した
のち固相上の酵素活性を上記実施例５（１）記載の方法
により測定した。結果を〔表１〕に示す。いずれの抗体
もＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド（１７−３１）と反応
し、またヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対しても
反応性を有していた〔表１〕。当初選択したモノクロー
ナル抗体４種類のうちのうち２種類がウシおよびラット
１９Ｐ２リガンド（１−３１）とも同程度に反応した。
典型例として、 これらの中でヒト、ラットおよびウシ
１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対して最も高い反応性
を示したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｃａ（ＩｇＧ
１，κ）の競合法-ＥＩＡの結果を〔図５（ａ）〕に示
す。これらの抗体がヒト、ラットおよびウシ１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）に対して同程度の反応性を有するこ
とが分かる。Ｐ２Ｌ−１Ｃのヒト１９Ｐ２リガンド（１
−３１）の標準曲線から、（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与え
る１９Ｐ２リガンド（１−３１）濃度は、３ｎＭ、１．
１ｎｇ／wellであることが分かった。また、この抗体は
Ｐ２Ｌ−１Ｃは、ヒト［D-Ala29］−１９Ｐ２リガンド
（１−３１）との反応性は弱いながらも示すものの、ヒ
ト１９Ｐ２リガンド（１−３０）、ウシ１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）-OHおよびウシ１９Ｐ２リガンド（１−
３１）Ｇｌｙ−Ａｒｇ-OHに対しては交差反応性を示さ
ないことから、 １９Ｐ２リガンド（１−３１）のＣ端
部分の部分構造を認識し、３１残基目のＰｈｅとＣ末端
のアミドを認識することが分かった〔図６（ａ）〕。一
方、Ｐ２Ｌ−２Ｃを用いた場合の競合法−ＥＩＡの結果
を〔図５（ｂ）〕に示した。Ｐ２Ｌ−２Ｃ（ＩｇＧ１，
κ）のヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対する反応
性（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与える抗原濃度：１．５ｎ
Ｍ、０．５ｎｇ／well）は、ウシ１９Ｐ２リガンド（１
−３１）に対する反応性（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与え
る抗原濃度：５０ｎＭ、１８ｎｇ／well）の３３倍、ラ
ット１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対する反応性
（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与える抗原濃度：２００ｎ
Ｍ、７３ｎｇ／well）の１３０倍であることが分かっ
た。これらの結果から、Ｐ２Ｌ−２Ｃは、ヒト、ウシ、
ラットで配列の異なる１９Ｐ２リガンド（１−３１）の
２１残基のＡｌａおよび２２残基のＳｅｒを強く認識し
ているものと考えられる。
疫原として作製したモノクローナル抗体の反応特異性を
以下の方法により調べた。まず、各モノクローナル抗体
溶液の抗体価を実施例５（１）記載の方法により調べ、
競合法−ＥＩＡに用いる抗体濃度として、標識体の結合
量が飽和結合量の約５０％となる抗体濃度（約３０〜５
０ｎｇ／ｍｌ)を決定した。次に、上記実施例５記載の
抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレート
に、決定された濃度にバッファーＣで希釈された抗体溶
液５０μｌ、ヒト、ラットおよびウシ１９Ｐ２リガンド
（１−３１）あるいは１９Ｐ２リガンド部分ペプタイ
ド、即ちヒト１９Ｐ２リガンド（１−３０）、ヒト［D-
Ala29］−１９Ｐ２リガンド（１−３１）、ヒト１９Ｐ
２リガンド（２０−３１）、ウシ１９Ｐ２リガンド（１
−３１）-OH、ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）-Gly-
Arg-OHのバッファーＣ溶液５０μｌ、および上記実施例
４（１）記載ＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド（１７−３
１）（バッファーＣで４００倍希釈）を５０μｌ加え、
４℃で１６時間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄した
のち固相上の酵素活性を上記実施例５（１）記載の方法
により測定した。結果を〔表１〕に示す。いずれの抗体
もＨＲＰ標識化１９Ｐ２リガンド（１７−３１）と反応
し、またヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対しても
反応性を有していた〔表１〕。当初選択したモノクロー
ナル抗体４種類のうちのうち２種類がウシおよびラット
１９Ｐ２リガンド（１−３１）とも同程度に反応した。
典型例として、 これらの中でヒト、ラットおよびウシ
１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対して最も高い反応性
を示したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｃａ（ＩｇＧ
１，κ）の競合法-ＥＩＡの結果を〔図５（ａ）〕に示
す。これらの抗体がヒト、ラットおよびウシ１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）に対して同程度の反応性を有するこ
とが分かる。Ｐ２Ｌ−１Ｃのヒト１９Ｐ２リガンド（１
−３１）の標準曲線から、（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与え
る１９Ｐ２リガンド（１−３１）濃度は、３ｎＭ、１．
１ｎｇ／wellであることが分かった。また、この抗体は
Ｐ２Ｌ−１Ｃは、ヒト［D-Ala29］−１９Ｐ２リガンド
（１−３１）との反応性は弱いながらも示すものの、ヒ
ト１９Ｐ２リガンド（１−３０）、ウシ１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）-OHおよびウシ１９Ｐ２リガンド（１−
３１）Ｇｌｙ−Ａｒｇ-OHに対しては交差反応性を示さ
ないことから、 １９Ｐ２リガンド（１−３１）のＣ端
部分の部分構造を認識し、３１残基目のＰｈｅとＣ末端
のアミドを認識することが分かった〔図６（ａ）〕。一
方、Ｐ２Ｌ−２Ｃを用いた場合の競合法−ＥＩＡの結果
を〔図５（ｂ）〕に示した。Ｐ２Ｌ−２Ｃ（ＩｇＧ１，
κ）のヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対する反応
性（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与える抗原濃度：１．５ｎ
Ｍ、０．５ｎｇ／well）は、ウシ１９Ｐ２リガンド（１
−３１）に対する反応性（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与え
る抗原濃度：５０ｎＭ、１８ｎｇ／well）の３３倍、ラ
ット１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対する反応性
（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与える抗原濃度：２００ｎ
Ｍ、７３ｎｇ／well）の１３０倍であることが分かっ
た。これらの結果から、Ｐ２Ｌ−２Ｃは、ヒト、ウシ、
ラットで配列の異なる１９Ｐ２リガンド（１−３１）の
２１残基のＡｌａおよび２２残基のＳｅｒを強く認識し
ているものと考えられる。
【００５６】（２）競合法−ＥＩＡ（その２） 抗 [Cys25]１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−ＢＴＧモノ
クローナル抗体の反応特異性を同様の方法により調べ
た。まず、各モノクローナル抗体溶液の抗体価を実施例
５（２）記載の方法により調べ、競合法−ＥＩＡに用い
る抗体濃度として、標識体の結合量が飽和結合量の約５
０％となる抗体濃度（約３０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を決定
した。次に、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイク
ロプレートに、決定された濃度にバッファーＣで希釈さ
れた抗体溶液５０μｌ、ヒトおよびラット１９Ｐ２リガ
ンド（１−３１）あるいは１９Ｐ２リガンド部分ペプタ
イド、即ちヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１）、ヒト
１９Ｐ２リガンド（１７−３１）およびヒト１９Ｐ２リ
ガンド（１７−３１）のジアセチル体のバッファーＣ溶
液５０μｌ、および上記実施例４（２）記載ＨＲＰ標識
化１９Ｐ２リガンド（１２−２５）（バッファーＣで５
００倍希釈）を５０μｌ加え、４℃で１６時間反応させ
た。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち固相上の酵素活性を
上記実施例５（１）記載の方法により測定した。結果を
〔表２〕に示す。いずれの抗体もＨＲＰ標識化１９Ｐ２
リガンド（１２−３１）と反応し、またヒト１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）およびラット１９Ｐ２リガンド（１
−３１）に対しても反応性を有していた。典型例とし
て、 これらの中でヒトあるいはラット１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）に対して最も高い反応性を示したモノク
ローナル抗体として、Ｐ２Ｌ−１Ｔａ（ＩｇＧ2b，κ）
あるいはＰ２Ｌ−３Ｔａ（ＩｇＧ1，κ）の競合法-ＥＩ
Ａの結果を〔図７〕に示す。Ｐ２Ｌ−１Ｔａのヒト１９
Ｐ２リガンド（１−３１）の標準曲線から、（Ｂ／Ｂ
０）＝０．５を与えるヒト１９Ｐ２リガンド（１−３
１）濃度は、４ ｎＭ、１．６ｎｇ／wellであることが
分かった。さらに、Ｐ２Ｌ−１Ｔａの１９Ｐ２リガンド
（１２−３１）に対する反応性（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５
を与える抗原濃度：４ ｎＭ、０．８８ｎｇ／well）は
ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）と同程度、ラット１
９Ｐ２リガンド（１−３１）に対する反応性（（Ｂ／Ｂ
０）＝０．５を与える抗原濃度：１ ｎＭ、０．４ｎｇ
／well）は、４倍であることが分かった〔図７
（ａ）〕。一方、Ｐ２Ｌ−３Ｔａの１９Ｐ２リガンドに
対する反応性は、（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与えるヒト１
９Ｐ２リガンド（１−３１）濃度は、４ ｎＭ、１．６
ｎｇ／wellであることが分かった。さらに、Ｐ２Ｌ−１
Ｔａの１９Ｐ２リガンド（１２−３１）に対する反応性
（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与える抗原濃度：７ ｎＭ、
１．５４ｎｇ／well）はヒト１９Ｐ２リガンド（１−３
１）の１／２、ラット１９Ｐ２リガンド（１−３１）に
対する反応性（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与える抗原濃
度：２５ ｎＭ、０．４ｎｇ／well）は、６倍であるこ
とが分かった〔図７（b）〕。また、いずれの抗体はと
もに、ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）および２Ａ
ｃ−ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）に対しては交
差反応性を示さないことから、 １９Ｐ２リガンド（１
２−１６）の部分構造を認識することが分かった〔図
８〕。また、〔図９〕に、これら2種類の抗体に加え、
当初選択したヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対し
て高い反応性を示したモノクローナル抗体2種類、Ｐ２
Ｌ−２ＴａおよびＰ２Ｌ−４Ｔａを用いた競合法−ＥＩ
Ａにおけるヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）の標準曲
線を示した。これら抗体の（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与え
るヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）の濃度は、３〜５
０ｎＭの範囲にあり、その中でＰ２Ｌ−１Ｔａを用いる
競合法−ＥＩＡが最も高感度であり、約０．１ｎＭ
［（Ｂ／Ｂ０）＝０．９］のヒト１９Ｐ２リガンド（１
−３１）が検出可能であった。
クローナル抗体の反応特異性を同様の方法により調べ
た。まず、各モノクローナル抗体溶液の抗体価を実施例
５（２）記載の方法により調べ、競合法−ＥＩＡに用い
る抗体濃度として、標識体の結合量が飽和結合量の約５
０％となる抗体濃度（約３０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を決定
した。次に、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイク
ロプレートに、決定された濃度にバッファーＣで希釈さ
れた抗体溶液５０μｌ、ヒトおよびラット１９Ｐ２リガ
ンド（１−３１）あるいは１９Ｐ２リガンド部分ペプタ
イド、即ちヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１）、ヒト
１９Ｐ２リガンド（１７−３１）およびヒト１９Ｐ２リ
ガンド（１７−３１）のジアセチル体のバッファーＣ溶
液５０μｌ、および上記実施例４（２）記載ＨＲＰ標識
化１９Ｐ２リガンド（１２−２５）（バッファーＣで５
００倍希釈）を５０μｌ加え、４℃で１６時間反応させ
た。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち固相上の酵素活性を
上記実施例５（１）記載の方法により測定した。結果を
〔表２〕に示す。いずれの抗体もＨＲＰ標識化１９Ｐ２
リガンド（１２−３１）と反応し、またヒト１９Ｐ２リ
ガンド（１−３１）およびラット１９Ｐ２リガンド（１
−３１）に対しても反応性を有していた。典型例とし
て、 これらの中でヒトあるいはラット１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）に対して最も高い反応性を示したモノク
ローナル抗体として、Ｐ２Ｌ−１Ｔａ（ＩｇＧ2b，κ）
あるいはＰ２Ｌ−３Ｔａ（ＩｇＧ1，κ）の競合法-ＥＩ
Ａの結果を〔図７〕に示す。Ｐ２Ｌ−１Ｔａのヒト１９
Ｐ２リガンド（１−３１）の標準曲線から、（Ｂ／Ｂ
０）＝０．５を与えるヒト１９Ｐ２リガンド（１−３
１）濃度は、４ ｎＭ、１．６ｎｇ／wellであることが
分かった。さらに、Ｐ２Ｌ−１Ｔａの１９Ｐ２リガンド
（１２−３１）に対する反応性（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５
を与える抗原濃度：４ ｎＭ、０．８８ｎｇ／well）は
ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）と同程度、ラット１
９Ｐ２リガンド（１−３１）に対する反応性（（Ｂ／Ｂ
０）＝０．５を与える抗原濃度：１ ｎＭ、０．４ｎｇ
／well）は、４倍であることが分かった〔図７
（ａ）〕。一方、Ｐ２Ｌ−３Ｔａの１９Ｐ２リガンドに
対する反応性は、（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与えるヒト１
９Ｐ２リガンド（１−３１）濃度は、４ ｎＭ、１．６
ｎｇ／wellであることが分かった。さらに、Ｐ２Ｌ−１
Ｔａの１９Ｐ２リガンド（１２−３１）に対する反応性
（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与える抗原濃度：７ ｎＭ、
１．５４ｎｇ／well）はヒト１９Ｐ２リガンド（１−３
１）の１／２、ラット１９Ｐ２リガンド（１−３１）に
対する反応性（（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与える抗原濃
度：２５ ｎＭ、０．４ｎｇ／well）は、６倍であるこ
とが分かった〔図７（b）〕。また、いずれの抗体はと
もに、ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）および２Ａ
ｃ−ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）に対しては交
差反応性を示さないことから、 １９Ｐ２リガンド（１
２−１６）の部分構造を認識することが分かった〔図
８〕。また、〔図９〕に、これら2種類の抗体に加え、
当初選択したヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対し
て高い反応性を示したモノクローナル抗体2種類、Ｐ２
Ｌ−２ＴａおよびＰ２Ｌ−４Ｔａを用いた競合法−ＥＩ
Ａにおけるヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）の標準曲
線を示した。これら抗体の（Ｂ／Ｂ０）＝０．５を与え
るヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）の濃度は、３〜５
０ｎＭの範囲にあり、その中でＰ２Ｌ−１Ｔａを用いる
競合法−ＥＩＡが最も高感度であり、約０．１ｎＭ
［（Ｂ／Ｂ０）＝０．９］のヒト１９Ｐ２リガンド（１
−３１）が検出可能であった。
【００５７】〔実施例８〕ＨＲＰ標識化抗１９Ｐ２リガ
ンドモノクローナル抗体の作製 （１）Ｐ２Ｌ−１Ｔａ−ＨＲＰ Ｐ２Ｌ−１Ｔａ精製画分１８ｍｇ（１２０ｎｍｏｌ）を
含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８溶液にＧＭＢＳ
１．４３μｍｏｌを含むＤＭＦ５０μｌを加え、室温で
４０分反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５カ
ラム（溶離液、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．７）で
分離し、マレイミド基の導入された抗体画分１３ｍｇを
得た。 次に、ＨＲＰ１５．５ｍｇ（３８７ｎｍｏｌ）
を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ
も含む）、ｐＨ６．８、１．４ｍｌにＮ−スクシニミジ
ル−３−（２−ピリミジルジチオ）プロピオネート(Ｓ
ＰＤＰ）５．８μｍｏｌを含むＤＭＦ６０μｌを加え、
室温で４０分反応させた。次に、６８μｍｏｌのジチオ
スレイトールを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
０．４ｍｌを加え、室温で２０分反応させた後セファデ
ックスＧ−２５カラム（溶離液、２ｍＭ ＥＤＴＡを含
む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）で分離し、ＳＨ
基の導入されたＨＲＰ１１ｍｇを得た。次に、ＳＨ基の
導入されたＨＲＰ８ｍｇとマレイミド基の導入された抗
体画分３ｍｇとを混合し、コロジオンバッグ（ザルトリ
ウス社製）で約０．５ｍｌにまで濃縮したのち、４℃で
１６時間放置した。反応液を溶離液に０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ６．５を用いるＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ-３０
０ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に供し、Ｐ２
Ｌ−１Ｔａ−ＨＲＰ複合体画分を精製した。 （２）Ｐ２Ｌ−３Ｔａ−ＨＲＰ 同様の方法により、Ｐ２Ｌ−３Ｔａ精製画分１５ｍｇと
ＨＲＰ１６ｍｇを用いてＰ２Ｌ−３Ｔ−ＨＲＰ複合体を
作製した。
ンドモノクローナル抗体の作製 （１）Ｐ２Ｌ−１Ｔａ−ＨＲＰ Ｐ２Ｌ−１Ｔａ精製画分１８ｍｇ（１２０ｎｍｏｌ）を
含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８溶液にＧＭＢＳ
１．４３μｍｏｌを含むＤＭＦ５０μｌを加え、室温で
４０分反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５カ
ラム（溶離液、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．７）で
分離し、マレイミド基の導入された抗体画分１３ｍｇを
得た。 次に、ＨＲＰ１５．５ｍｇ（３８７ｎｍｏｌ）
を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ
も含む）、ｐＨ６．８、１．４ｍｌにＮ−スクシニミジ
ル−３−（２−ピリミジルジチオ）プロピオネート(Ｓ
ＰＤＰ）５．８μｍｏｌを含むＤＭＦ６０μｌを加え、
室温で４０分反応させた。次に、６８μｍｏｌのジチオ
スレイトールを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
０．４ｍｌを加え、室温で２０分反応させた後セファデ
ックスＧ−２５カラム（溶離液、２ｍＭ ＥＤＴＡを含
む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０）で分離し、ＳＨ
基の導入されたＨＲＰ１１ｍｇを得た。次に、ＳＨ基の
導入されたＨＲＰ８ｍｇとマレイミド基の導入された抗
体画分３ｍｇとを混合し、コロジオンバッグ（ザルトリ
ウス社製）で約０．５ｍｌにまで濃縮したのち、４℃で
１６時間放置した。反応液を溶離液に０．１Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ６．５を用いるＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ-３０
０ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に供し、Ｐ２
Ｌ−１Ｔａ−ＨＲＰ複合体画分を精製した。 （２）Ｐ２Ｌ−３Ｔａ−ＨＲＰ 同様の方法により、Ｐ２Ｌ−３Ｔａ精製画分１５ｍｇと
ＨＲＰ１６ｍｇを用いてＰ２Ｌ−３Ｔ−ＨＲＰ複合体を
作製した。
【００５８】〔実施例９〕サンドイッチ法−ＥＩＡ （１）Ｐ２Ｌ−１Ｔａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ法
−ＥＩＡの特異性と感度 上記実施例６記載の精製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ
−１Ｃａを１０μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐ
Ｈ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μ
ｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。ウェルの余剰
の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエース４０
０μｌを加え不活化した。以上のように調製したプレー
トに、バッファーＥＣ〔１０％ブロックエース、０．２
％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ＣＨＡＰ
Ｓ〔３-[(コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロ
パンスルホン酸〕を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ
７〕で希釈した１９Ｐ２リガンド（１−３１）標準液１
００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで
洗浄したのち、上記実施例８で作製したＰ２Ｌ−１Ｔａ
−ＨＲＰ（バッファーＣで２０，０００倍希釈）１００
μｌを加え、４℃で２４時間反応させたが、標識体濃度
としては３０，０００倍希釈のものを用いた。ＰＢＳで
洗浄したのち、上記実施例５記載の方法によりＴＭＢを
用いて固相上の酵素活性を測定した（酵素反応２０
分）。結果を〔図１０〕に示すように、極めて高感度に
１９Ｐ２リガンド（１−３１）を検出することがわかっ
た。即ち、このサンドイッチ法−ＥＩＡは、ヒト１９Ｐ
２リガンド（１−３１）および１９Ｐ２リガンド（１２
−３１）を０.１ fmol／wellで、ウシ１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）および１９Ｐ２リガンド（１２−３１）
を０.１ fmol／wellで、ラット１９Ｐ２リガンド（１
−３１）を０.０３ fmol／wellで検出することが可能
であり、他の視床下部ペプチドＴＲＨ、ＬＨＲＨ、ＧＨ
ＲＨ、ＣＲＦ、ＳＳＴおよびＯｘｙｔｏｃｉｎは全く検
出しなかった〔図１１〕。したがって、固相抗体として
Ｐ２Ｌ−１Ｃを用い、標識体としてＰ２Ｌ−１Ｔａ−Ｈ
ＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡは、種にかかわら
ず１９Ｐ２リガンド（１−３１）および１９Ｐ２リガン
ド（１２−３１）を極めて高感度にかつ極めて選択的に
検出することが可能であるとわかった。
−ＥＩＡの特異性と感度 上記実施例６記載の精製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ
−１Ｃａを１０μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐ
Ｈ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに１００μ
ｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。ウェルの余剰
の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエース４０
０μｌを加え不活化した。以上のように調製したプレー
トに、バッファーＥＣ〔１０％ブロックエース、０．２
％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ＣＨＡＰ
Ｓ〔３-[(コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロ
パンスルホン酸〕を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ
７〕で希釈した１９Ｐ２リガンド（１−３１）標準液１
００μｌを加え、４℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで
洗浄したのち、上記実施例８で作製したＰ２Ｌ−１Ｔａ
−ＨＲＰ（バッファーＣで２０，０００倍希釈）１００
μｌを加え、４℃で２４時間反応させたが、標識体濃度
としては３０，０００倍希釈のものを用いた。ＰＢＳで
洗浄したのち、上記実施例５記載の方法によりＴＭＢを
用いて固相上の酵素活性を測定した（酵素反応２０
分）。結果を〔図１０〕に示すように、極めて高感度に
１９Ｐ２リガンド（１−３１）を検出することがわかっ
た。即ち、このサンドイッチ法−ＥＩＡは、ヒト１９Ｐ
２リガンド（１−３１）および１９Ｐ２リガンド（１２
−３１）を０.１ fmol／wellで、ウシ１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）および１９Ｐ２リガンド（１２−３１）
を０.１ fmol／wellで、ラット１９Ｐ２リガンド（１
−３１）を０.０３ fmol／wellで検出することが可能
であり、他の視床下部ペプチドＴＲＨ、ＬＨＲＨ、ＧＨ
ＲＨ、ＣＲＦ、ＳＳＴおよびＯｘｙｔｏｃｉｎは全く検
出しなかった〔図１１〕。したがって、固相抗体として
Ｐ２Ｌ−１Ｃを用い、標識体としてＰ２Ｌ−１Ｔａ−Ｈ
ＲＰを用いるサンドイッチ法−ＥＩＡは、種にかかわら
ず１９Ｐ２リガンド（１−３１）および１９Ｐ２リガン
ド（１２−３１）を極めて高感度にかつ極めて選択的に
検出することが可能であるとわかった。
【００５９】（２）Ｐ２Ｌ−３Ｔａ−ＨＲＰを用いるサ
ンドイッチ法−ＥＩＡの特異性と感度 固層抗体としてＰ２Ｌ−１Ｃａを用い、標識体として上
記実施例８（２）で作製したＰ２Ｌ−３Ｔａ−ＨＲＰを
用いるサンドイッチ法−ＥＩＡの特異性および感度を調
べた。上記実施例９（１）と同様にヒト１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）、１９Ｐ２リガンド（１２−３１）およ
びラット１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対する反応性
を調べたが、標識体濃度としては、１，０００倍希釈の
ものを用いた〔図１２〕。その結果、Ｐ２Ｌ−３Ｔａ−
ＨＲＰを用いたサンドイッチ法−ＥＩＡは、ヒト１９Ｐ
２リガンド（１−３１）を０.３ fmol／wellで、１９
Ｐ２リガンド（１２−３１）を１ fmol／wellで、ラッ
ト１９Ｐ２リガンド（１−３１）を３ fmol／wellで検
出可能であったが、Ｐ２Ｌ−１Ｔａ−ＨＲＰを用いるサ
ンドイッチ法−ＥＩＡと比較して、３−１０倍感度が低
いものであった。
ンドイッチ法−ＥＩＡの特異性と感度 固層抗体としてＰ２Ｌ−１Ｃａを用い、標識体として上
記実施例８（２）で作製したＰ２Ｌ−３Ｔａ−ＨＲＰを
用いるサンドイッチ法−ＥＩＡの特異性および感度を調
べた。上記実施例９（１）と同様にヒト１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）、１９Ｐ２リガンド（１２−３１）およ
びラット１９Ｐ２リガンド（１−３１）に対する反応性
を調べたが、標識体濃度としては、１，０００倍希釈の
ものを用いた〔図１２〕。その結果、Ｐ２Ｌ−３Ｔａ−
ＨＲＰを用いたサンドイッチ法−ＥＩＡは、ヒト１９Ｐ
２リガンド（１−３１）を０.３ fmol／wellで、１９
Ｐ２リガンド（１２−３１）を１ fmol／wellで、ラッ
ト１９Ｐ２リガンド（１−３１）を３ fmol／wellで検
出可能であったが、Ｐ２Ｌ−１Ｔａ−ＨＲＰを用いるサ
ンドイッチ法−ＥＩＡと比較して、３−１０倍感度が低
いものであった。
【００６０】〔実施例１０〕Ｐ２Ｌ−１Ｃａによる１９
Ｐ２リガンド（１−３１）の生物活性の中和作用 Ｐ２Ｌ−１Ｃａによる１９Ｐ２リガンド（１−３１）に
対する中和活性を１９Ｐ２レセプター発現ＣＨＯ細胞を
用いたアラキドン酸代謝物放出活性測定系により測定し
た。即ち、Ｐ２Ｌ−１Ｃａ、Ｐ２Ｌ−３Ｃａおよびコン
トロール抗体としてＰ２Ｌ−１Ｃaと同じＩｇＧサブク
ラス構造（ＩｇＧ1、κ）である抗エンドセリンモノク
ローナル抗体（ＡｗＥＴＮ４０）を各濃度に希釈し、ラ
ット１９Ｐ２リガンド（１−３１）（５ｘ１０-10Ｍ）
と室温で１時間インキュベーション後、残存活性を１９
Ｐ２レセプター発現ＣＨＯ細胞を使用して測定した。ア
ラキドン酸代謝物放出活性の測定は、１９Ｐ２レセプタ
ー発現ＣＨＯ細胞を、24 well plateに0.5 x 105 cells
/wellでまき、24時間培養後、［3Ｈ］アラキドン酸を0.
5μＣｉ/wellとなるように添加した。［3Ｈ］アラキド
ン酸添加２４時間後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＭＥ
Ｍで洗浄後、上述の各モノクローナル抗体とラット１９
Ｐ２リガンド（１−３１）混和溶液を５００μｌ/ｗｅ
ｌｌで添加した。３７℃で１時間インキュベーションし
た後に、反応液５００μｌ中４００μｌをシンチレータ
ー４ｍｌに加え、反応液中に遊離された［3Ｈ］アラキ
ドン酸代謝物の量をシンチレーション・カウンターによ
りモニターした（図 １３）。その結果、Ｐ２Ｌ−１Ｃ
ａは、１９Ｐ２リガンド（１−３１）の活性を５ｘ１０
-10Ｍで７５％、５ｘ１０-9Ｍで１００％抑制した（図
１３ａ）。一方、Ｐ２Ｌ−２Ｃａは、１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）の活性を５ｘ１０-8Ｍで４０％程度の抑
制がみられたのみであった（図 １３ｂ）。以上のこと
から、Ｐ２Ｌ−１Ｃaは、１９Ｐ２リガンド（１−３
１）のアラキドン酸代謝物放出活性を中和することが明
らかとなった。
Ｐ２リガンド（１−３１）の生物活性の中和作用 Ｐ２Ｌ−１Ｃａによる１９Ｐ２リガンド（１−３１）に
対する中和活性を１９Ｐ２レセプター発現ＣＨＯ細胞を
用いたアラキドン酸代謝物放出活性測定系により測定し
た。即ち、Ｐ２Ｌ−１Ｃａ、Ｐ２Ｌ−３Ｃａおよびコン
トロール抗体としてＰ２Ｌ−１Ｃaと同じＩｇＧサブク
ラス構造（ＩｇＧ1、κ）である抗エンドセリンモノク
ローナル抗体（ＡｗＥＴＮ４０）を各濃度に希釈し、ラ
ット１９Ｐ２リガンド（１−３１）（５ｘ１０-10Ｍ）
と室温で１時間インキュベーション後、残存活性を１９
Ｐ２レセプター発現ＣＨＯ細胞を使用して測定した。ア
ラキドン酸代謝物放出活性の測定は、１９Ｐ２レセプタ
ー発現ＣＨＯ細胞を、24 well plateに0.5 x 105 cells
/wellでまき、24時間培養後、［3Ｈ］アラキドン酸を0.
5μＣｉ/wellとなるように添加した。［3Ｈ］アラキド
ン酸添加２４時間後、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＭＥ
Ｍで洗浄後、上述の各モノクローナル抗体とラット１９
Ｐ２リガンド（１−３１）混和溶液を５００μｌ/ｗｅ
ｌｌで添加した。３７℃で１時間インキュベーションし
た後に、反応液５００μｌ中４００μｌをシンチレータ
ー４ｍｌに加え、反応液中に遊離された［3Ｈ］アラキ
ドン酸代謝物の量をシンチレーション・カウンターによ
りモニターした（図 １３）。その結果、Ｐ２Ｌ−１Ｃ
ａは、１９Ｐ２リガンド（１−３１）の活性を５ｘ１０
-10Ｍで７５％、５ｘ１０-9Ｍで１００％抑制した（図
１３ａ）。一方、Ｐ２Ｌ−２Ｃａは、１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）の活性を５ｘ１０-8Ｍで４０％程度の抑
制がみられたのみであった（図 １３ｂ）。以上のこと
から、Ｐ２Ｌ−１Ｃaは、１９Ｐ２リガンド（１−３
１）のアラキドン酸代謝物放出活性を中和することが明
らかとなった。
【００６１】〔実施例１1〕血漿中の１９Ｐ２リガンド
（１−３１）の定量 ラット血漿（１ｍｌ）をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ Ｃ
１８カートリッジ２６５ｍｇ（Ｗａｔｅｒｓ社製）で濃
縮・前処理した後、１９Ｐ２リガンド（１−３１）を上
記実施例９記載サンドイッチ−ＥＩＡにより定量した。
血漿の前処理方法は、まず４％酢酸含有８６%エタノー
ル４ｍｌ、メタノール４ｍｌ、蒸留水４ｍｌ、４％酢酸
４ｍｌを順次ながして活性化したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌ
ｕｓ Ｃ１８カートリッジに３ｍｌの４％酢酸を添加し
酸性化させた血漿１ｍｌを負荷した。添加後、１０ｍｌ
の蒸留水で洗浄後、４％酢酸含有８６%エタノール４ｍ
ｌ、メタノール４ｍｌで溶出し、３７℃の窒素ガス気流
下で濃縮した。濃縮画分を０．２５ｍｌのバファーＣ中
で再構成しサンドイッチ−ＥＩＡにより定量した。結果
を［表３］に示した。ラット血漿中には０．２±０．０
３fmol/ml(mean ±SEM, n=8)の１９Ｐ２リガンド（１−
３１）が存在することが分かった。
（１−３１）の定量 ラット血漿（１ｍｌ）をＳｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ Ｃ
１８カートリッジ２６５ｍｇ（Ｗａｔｅｒｓ社製）で濃
縮・前処理した後、１９Ｐ２リガンド（１−３１）を上
記実施例９記載サンドイッチ−ＥＩＡにより定量した。
血漿の前処理方法は、まず４％酢酸含有８６%エタノー
ル４ｍｌ、メタノール４ｍｌ、蒸留水４ｍｌ、４％酢酸
４ｍｌを順次ながして活性化したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌ
ｕｓ Ｃ１８カートリッジに３ｍｌの４％酢酸を添加し
酸性化させた血漿１ｍｌを負荷した。添加後、１０ｍｌ
の蒸留水で洗浄後、４％酢酸含有８６%エタノール４ｍ
ｌ、メタノール４ｍｌで溶出し、３７℃の窒素ガス気流
下で濃縮した。濃縮画分を０．２５ｍｌのバファーＣ中
で再構成しサンドイッチ−ＥＩＡにより定量した。結果
を［表３］に示した。ラット血漿中には０．２±０．０
３fmol/ml(mean ±SEM, n=8)の１９Ｐ２リガンド（１−
３１）が存在することが分かった。
【表３】
【００６２】〔実施例１２〕ラット血漿中の１９Ｐ２リ
ガンドの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰ
ＬＣ）による検出 上記実施例１１記載ラット血漿中に含まれる１９Ｐ２リ
ガンド分子種を同定するため、ラット血漿５０ｍｌを上
記実施例１１記載の方法で部分精製し、この溶出画分を
濃縮後ＯＤＳ−８０ＴＭを用いる逆相ＨＰＬＣによって
分画した。 カラム条件 カラム：ＯＤＳ−８０ＴＭ (4.6 x 250 mm) 溶離液：Ａ液（０．０５％トリフルオロ酢酸含有 ５％アセトニトリル） Ｂ液（０．０５％トリフルオロ酢酸含有 ６０％アセトニトリル ） 溶出方法：溶離液Ｂの濃度を最初の５分間に０％から３５％まで上昇させ、 次に３０分間かけて３５−４８％に直線的に上昇させた。 流速：１．０ ｍｌ／分 分画：０．５ｍｌ／ｔｕｂｅ 溶出画分を減圧下、遠心濃縮乾固したのち、２５０ｍｌ
のバッファーＣに溶解させ、上記実施例１０記載のサン
ドイッチＥＩＡに供した。結果を図１４に示す。血漿中
の１９Ｐ２リガンドの免疫活性はほとんど合成１９Ｐ２
リガンド（１−３１）の溶出位置に検出されたことか
ら、該サンドイッチ法−ＥＩＡが１９Ｐ２リガンド（１
−３１）を検出していることが確認された。従って、本
測定系は血漿中の１９Ｐ２リガンドの変動を研究する際
の重要な手段を提供すると考えられる。
ガンドの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰ
ＬＣ）による検出 上記実施例１１記載ラット血漿中に含まれる１９Ｐ２リ
ガンド分子種を同定するため、ラット血漿５０ｍｌを上
記実施例１１記載の方法で部分精製し、この溶出画分を
濃縮後ＯＤＳ−８０ＴＭを用いる逆相ＨＰＬＣによって
分画した。 カラム条件 カラム：ＯＤＳ−８０ＴＭ (4.6 x 250 mm) 溶離液：Ａ液（０．０５％トリフルオロ酢酸含有 ５％アセトニトリル） Ｂ液（０．０５％トリフルオロ酢酸含有 ６０％アセトニトリル ） 溶出方法：溶離液Ｂの濃度を最初の５分間に０％から３５％まで上昇させ、 次に３０分間かけて３５−４８％に直線的に上昇させた。 流速：１．０ ｍｌ／分 分画：０．５ｍｌ／ｔｕｂｅ 溶出画分を減圧下、遠心濃縮乾固したのち、２５０ｍｌ
のバッファーＣに溶解させ、上記実施例１０記載のサン
ドイッチＥＩＡに供した。結果を図１４に示す。血漿中
の１９Ｐ２リガンドの免疫活性はほとんど合成１９Ｐ２
リガンド（１−３１）の溶出位置に検出されたことか
ら、該サンドイッチ法−ＥＩＡが１９Ｐ２リガンド（１
−３１）を検出していることが確認された。従って、本
測定系は血漿中の１９Ｐ２リガンドの変動を研究する際
の重要な手段を提供すると考えられる。
【００６３】
【発明の効果】本発明の１９Ｐ２リガンドに対するモノ
クローナル抗体(特に、Ｐ２Ｌ-１Ｃa)は、極めて高い結
合能を有し、かつ１９Ｐ２リガンドのアラキドン酸代謝
物放出活性を中和することが出来る。従って、１９Ｐ２
リガンドが有すると考えられる下垂体機能調節作用（例
えば、プロラクチン分泌促進作用）、中枢神経調節作
用、膵臓機能調節作用などに、異常がある場合の各種疾
患の診断薬、予防薬、治療薬などに用いることができ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ
法（特に、該モノクロナール抗体と１９Ｐ２リガンドの
中間部を認識する抗体とを用いるサンドイッチ法）によ
る免疫学的測定法により、１９Ｐ２リガンドまたはその
誘導体を高感度かつ特異的に定量することができる。こ
の定量方法は１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の生理
機能の解明に用いることができる。
クローナル抗体(特に、Ｐ２Ｌ-１Ｃa)は、極めて高い結
合能を有し、かつ１９Ｐ２リガンドのアラキドン酸代謝
物放出活性を中和することが出来る。従って、１９Ｐ２
リガンドが有すると考えられる下垂体機能調節作用（例
えば、プロラクチン分泌促進作用）、中枢神経調節作
用、膵臓機能調節作用などに、異常がある場合の各種疾
患の診断薬、予防薬、治療薬などに用いることができ
る。本発明のモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ
法（特に、該モノクロナール抗体と１９Ｐ２リガンドの
中間部を認識する抗体とを用いるサンドイッチ法）によ
る免疫学的測定法により、１９Ｐ２リガンドまたはその
誘導体を高感度かつ特異的に定量することができる。こ
の定量方法は１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の生理
機能の解明に用いることができる。
【００６４】
【配列表】 [Sequence Listing] <110> Takeda Chemical Industries, Ltd. <120> Antibody and its use <130> A98081 <150> JP 10-140293 <151> 1998-5-21 <160> 14 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> Bovine <223> Xaa means Phe-NH2 <400> 1 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Xaa 20 25 30 <210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Human <223> Xaa means Phe-NH2 <400> 2 Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Xaa 20 25 30 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Rat <223> Xaa means Phe-NH2 <400> 3 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Thr Arg Thr Pro Asp Ile Asn 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Xaa 20 25 30 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Human <223> Xaa means Phe-NH2 <400> 4 Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Xaa 5 10 15 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Human <223> Xaa means Phe-NH2 <400> 5 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro 5 10 15 Val Gly Arg Xaa 20 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Human <223> Xaa on the 1st position means Ac-Pro, Xaa on the 4th position mean s Tyr(Ac), and Xaa on the 15th position means Phe-NH2 <400> 6 Xaa Ala Trp Xaa Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Xaa 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Human <223> Xaa means Phe-NH2 <400> 7 Cys Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Xaa 5 10 15 <210> 8 <211> 33 <212> PRT <213> Bovine <400> 8 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe Gly 20 25 30 Arg <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Human <223> Xaa means Phe-NH2 <400> 9 Ser Arg Ala His Gln His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Arg Phe 20 25 30 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Human <223> Xaa means Arg-NH2 <400> 10 Ser Arg Thr His Arg His Ser Met Glu Ile Arg Thr Pro Asp Ile Asn 5 10 15 Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Ile Arg Pro Val Gly Xaa 20 25 30 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Human <223> Xaa means Cys-NH2 <400> 11 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Ser Arg Gly Xaa 5 10 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Bovine <223> Xaa means Phe-NH2 <400> 12 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Ala Gly Arg Gly Ile Arg Pro 5 10 15 Val Gly Arg Xaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Rat <223> Xaa means Phe-NH2 <400> 13 Thr Pro Asp Ile Asn Pro Ala Trp Tyr Thr Gly Arg Gly Ile Arg Pro 5 10 15 Val Gly Arg Xaa 20
【図１】図１は、[Cys17]ヒト１９Ｐ２リガンド（１７
−３１）−ＢＴＧを免疫したマウスの抗体価をＨＲＰ標
識化ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）を用いて調べ
た結果を示す。
−３１）−ＢＴＧを免疫したマウスの抗体価をＨＲＰ標
識化ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）を用いて調べ
た結果を示す。
【図２】図２は、[Cys25]ヒト１９Ｐ２リガンド(１２−
２５)−ＢＴＧを免疫したマウスの抗体価をＨＲＰ標識
化ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を用いて調べた
結果を示す。
２５)−ＢＴＧを免疫したマウスの抗体価をＨＲＰ標識
化ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を用いて調べた
結果を示す。
【図３】図３は、[Cys17]ヒト１９Ｐ２リガンド（１７
−３１）−ＢＴＧを免疫したマウスを用いた場合の細胞
融合後のハイブリドーマのスクリーニングの典型例を示
す。
−３１）−ＢＴＧを免疫したマウスを用いた場合の細胞
融合後のハイブリドーマのスクリーニングの典型例を示
す。
【図４】図４は、[Cys25]ヒト１９Ｐ２リガンド(１２−
２５)−ＢＴＧを免疫したマウスを用いた場合の細胞融
合後のハイブリドーマのスクリーニングの典型例を示
す。
２５)−ＢＴＧを免疫したマウスを用いた場合の細胞融
合後のハイブリドーマのスクリーニングの典型例を示
す。
【図５】図５（ａ）および（ｂ）は、それぞれ[Cys17]
ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）−ＢＴＧを免疫原
として作製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｃａおよ
びＰ２Ｌ−２Ｃａの１９Ｐ２リガンド（１−３１）（ヒ
ト）（−○−）、（ラット）（−△−）および（ウシ）
（−□−）に対する反応性をＨＲＰ標識化ヒト１９Ｐ２
リガンド（１７−３１）を用いる競合法−ＥＩＡで調べ
た結果を示す。
ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）−ＢＴＧを免疫原
として作製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｃａおよ
びＰ２Ｌ−２Ｃａの１９Ｐ２リガンド（１−３１）（ヒ
ト）（−○−）、（ラット）（−△−）および（ウシ）
（−□−）に対する反応性をＨＲＰ標識化ヒト１９Ｐ２
リガンド（１７−３１）を用いる競合法−ＥＩＡで調べ
た結果を示す。
【図６】図６（ａ）は、[Cys17]ヒト１９Ｐ２リガンド
（１７−３１）−ＢＴＧを免疫原として作製したモノク
ローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｃａのヒト１９Ｐ２リガンド
（１−３１）（−●−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（２０
−３１）（−■−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３
０）（−▲−）、および［Ｄ−Ａｌａ29］ヒト１９Ｐ２
リガンド（１−３１）（−◆−）に対する反応性を、図
６（ｂ）は、Ｐ２Ｌ−１Ｃａのウシ１９Ｐ２リガンド
（１−３１）（−○−）、ウシ１９Ｐ２リガンド（１−
３１）-OH（−□−）、およびウシ１９Ｐ２リガンド
（１−３１）Gly-Arg-OH（−△−）に対する反応性をＨ
ＲＰ標識化ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）を用い
る競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
（１７−３１）−ＢＴＧを免疫原として作製したモノク
ローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｃａのヒト１９Ｐ２リガンド
（１−３１）（−●−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（２０
−３１）（−■−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１−３
０）（−▲−）、および［Ｄ−Ａｌａ29］ヒト１９Ｐ２
リガンド（１−３１）（−◆−）に対する反応性を、図
６（ｂ）は、Ｐ２Ｌ−１Ｃａのウシ１９Ｐ２リガンド
（１−３１）（−○−）、ウシ１９Ｐ２リガンド（１−
３１）-OH（−□−）、およびウシ１９Ｐ２リガンド
（１−３１）Gly-Arg-OH（−△−）に対する反応性をＨ
ＲＰ標識化ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）を用い
る競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図７】図７（ａ）および（ｂ）は、それぞれ[Cys25]
ヒト１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−ＢＴＧを免疫原と
して作製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｔａおよび
Ｐ２Ｌ−３Ｔａの１９Ｐ２リガンド（１−３１）（ラッ
ト）（−●−）、（ヒト）（−■−）、およびヒト１９
Ｐ２リガンド（１２−３１）（−□−）に対する反応性
をＨＲＰ標識化ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を
用いる競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
ヒト１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−ＢＴＧを免疫原と
して作製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｔａおよび
Ｐ２Ｌ−３Ｔａの１９Ｐ２リガンド（１−３１）（ラッ
ト）（−●−）、（ヒト）（−■−）、およびヒト１９
Ｐ２リガンド（１２−３１）（−□−）に対する反応性
をＨＲＰ標識化ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を
用いる競合法−ＥＩＡで調べた結果を示す。
【図８】図８（ａ）および（ｂ）は、それぞれ[Cys25]
ヒト１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−ＢＴＧを免疫原と
して作製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｔａおよび
Ｐ２Ｌ−３Ｔａのヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）
（−■−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１）（−
□−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）（−△
−）およびヒト１９P２リガンド（１７−３１）（−○
−）のジアセチル体に対する反応性をＨＲＰ標識化ヒト
１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を用いる競合法−ＥＩ
Ａで調べた結果を示す。
ヒト１９Ｐ２リガンド(１２−２５)−ＢＴＧを免疫原と
して作製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｔａおよび
Ｐ２Ｌ−３Ｔａのヒト１９Ｐ２リガンド（１−３１）
（−■−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−３１）（−
□−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）（−△
−）およびヒト１９P２リガンド（１７−３１）（−○
−）のジアセチル体に対する反応性をＨＲＰ標識化ヒト
１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を用いる競合法−ＥＩ
Ａで調べた結果を示す。
【図９】図９はＰ２Ｌ−１Ｔａ（−●−）、Ｐ２Ｌ−２
Ｔａ（−○−）、Ｐ２Ｌ−３Ｔａ（−△−）およびＰ２
Ｌ−４Ｔａ（−□−）に対する反応性をＨＲＰ標識化ヒ
ト１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を用いる競合法−Ｅ
ＩＡで調べた結果を示す。
Ｔａ（−○−）、Ｐ２Ｌ−３Ｔａ（−△−）およびＰ２
Ｌ−４Ｔａ（−□−）に対する反応性をＨＲＰ標識化ヒ
ト１９Ｐ２リガンド（１２−２５）を用いる競合法−Ｅ
ＩＡで調べた結果を示す。
【図１０】図１０は、酵素標識抗体としてＰ２Ｌ−１Ｔ
a−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＰ２Ｌ−１Cａを用
いたサンドイッチ法−ＥＩＡの、ラット１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）（−■−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１
−３１）（−●−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−２
５）（−○−）、ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）
（−▲−）あるいはウシ１９Ｐ２リガンド（１２−３
１）（−△−）の標準曲線を示す。
a−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＰ２Ｌ−１Cａを用
いたサンドイッチ法−ＥＩＡの、ラット１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）（−■−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１
−３１）（−●−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１２−２
５）（−○−）、ウシ１９Ｐ２リガンド（１−３１）
（−▲−）あるいはウシ１９Ｐ２リガンド（１２−３
１）（−△−）の標準曲線を示す。
【図１１】図１１は、酵素標識抗体としてＰ２Ｌ−１Ｔ
a−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＰ２Ｌ−１Cａを用
いたサンドイッチ法−ＥＩＡの、ラット１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）（−●−）あるいは他のペプチドＦＭＲ
Ｆ−Ａｍｉｄｅ（−■−）、ＣＧＲＰ（−▲−）、ＴＲ
Ｈ（−◆−）、ＬＨＲＨ（−○−）、ＧＨＲＨ（−□
−）、ＣＲＦ（−△−）、ＳＳＴ（−◇−）、Ｏｘｙｔ
ｏｓｉｎ（−-●−-）、ＶＩＰ（−-■−-）およびＰＡ
ＣＡＰ（−-▲−-）との反応性を示す。
a−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＰ２Ｌ−１Cａを用
いたサンドイッチ法−ＥＩＡの、ラット１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）（−●−）あるいは他のペプチドＦＭＲ
Ｆ−Ａｍｉｄｅ（−■−）、ＣＧＲＰ（−▲−）、ＴＲ
Ｈ（−◆−）、ＬＨＲＨ（−○−）、ＧＨＲＨ（−□
−）、ＣＲＦ（−△−）、ＳＳＴ（−◇−）、Ｏｘｙｔ
ｏｓｉｎ（−-●−-）、ＶＩＰ（−-■−-）およびＰＡ
ＣＡＰ（−-▲−-）との反応性を示す。
【図１２】図１２は、酵素標識抗体としてＰ２Ｌ−３Ｔ
a−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＰ２Ｌ−１Cａを用
いたサンドイッチ法−ＥＩＡの、ラット１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）（−■−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１
２−３１）（−○−）およびヒト１９Ｐ２リガンド（１
−３１）（−●−）の標準曲線を示す。
a−ＨＲＰを用い、固相用抗体としてＰ２Ｌ−１Cａを用
いたサンドイッチ法−ＥＩＡの、ラット１９Ｐ２リガン
ド（１−３１）（−■−）、ヒト１９Ｐ２リガンド（１
２−３１）（−○−）およびヒト１９Ｐ２リガンド（１
−３１）（−●−）の標準曲線を示す。
【図１３】図１３（ａ）および（ｂ）は、それぞれ[Cys
17]ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）−ＢＴＧを免
疫原として作製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｃａ
およびＰ２Ｌ−２Ｃａのラット１９Ｐ２リガンド（１−
３１）の１９Ｐ２発現ＣＨＯ細胞からのアラキドン酸代
謝物放出活性に対する中和作用を示す。
17]ヒト１９Ｐ２リガンド（１７−３１）−ＢＴＧを免
疫原として作製したモノクローナル抗体Ｐ２Ｌ−１Ｃａ
およびＰ２Ｌ−２Ｃａのラット１９Ｐ２リガンド（１−
３１）の１９Ｐ２発現ＣＨＯ細胞からのアラキドン酸代
謝物放出活性に対する中和作用を示す。
【図１４】図１６は、ラット血漿中の１９Ｐ２リガンド
の逆相−ＨＰＬＣによる溶出画分の免疫活性を、酵素標
識抗体としてＰ２Ｌ−１Ｔａ−ＨＲＰを用い、固相用抗
体としてＰ２Ｌ−１Ｃａを用いるサンドイッチ-ＥＩＡ
によって定量した結果を示す。
の逆相−ＨＰＬＣによる溶出画分の免疫活性を、酵素標
識抗体としてＰ２Ｌ−１Ｔａ−ＨＲＰを用い、固相用抗
体としてＰ２Ｌ−１Ｃａを用いるサンドイッチ-ＥＩＡ
によって定量した結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 Ａ６１Ｋ 31/00 ６０１Ｎ // Ａ６１Ｋ 31/00 ６０１ ６２５ ６２５ ６４３Ｄ ６４３ 39/395 Ｎ 39/395 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Claims (9)
- 【請求項１】１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体のＣ端
側の部分ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】マウスＩｇＧである請求項１記載のモノク
ローナル抗体。 - 【請求項３】Ｐ２Ｌ−１ＣａまたはＰ２Ｌ−２Ｃａで標
示される請求項２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】１９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の中間
部分ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体。 - 【請求項５】マウスＩｇＧである請求項４記載のモノク
ローナル抗体。 - 【請求項６】Ｐ２Ｌ−１Ｔａで標示される請求項５記載
のモノクローナル抗体。 - 【請求項７】請求項１または請求項４記載のモノクロー
ナル抗体を用いることを特徴とする被検液中の１９Ｐ２
リガンドまたはその誘導体の定量法。 - 【請求項８】請求項１記載の抗体と請求項４記載のモノ
クローナル抗体を用いることを特徴とする被検液中の１
９Ｐ２リガンドまたはその誘導体の定量法。 - 【請求項９】請求項１または請求項４記載のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11140305A JP2000037187A (ja) | 1998-05-21 | 1999-05-20 | 抗体およびその用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10-140293 | 1998-05-21 | ||
| JP14029398 | 1998-05-21 | ||
| JP11140305A JP2000037187A (ja) | 1998-05-21 | 1999-05-20 | 抗体およびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000037187A true JP2000037187A (ja) | 2000-02-08 |
| JP2000037187A5 JP2000037187A5 (ja) | 2007-04-12 |
Family
ID=26472859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11140305A Pending JP2000037187A (ja) | 1998-05-21 | 1999-05-20 | 抗体およびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000037187A (ja) |
-
1999
- 1999-05-20 JP JP11140305A patent/JP2000037187A/ja active Pending
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|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20091102 |
|
| A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20091211 |