CN106290822B - D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用，D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法优化化学交联方法，将聚苯乙烯微球的羧基在低pH条件下活化，与高pH条件溶解的抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，在低温下偶联12～24h，既保证了抗体的偶联效率，同时极大程度的降低了活化剂对抗体活性的破坏。采用本发明方法制备的免疫胶乳微球制成的胶乳增强免疫比浊法D‑二聚体测定试剂盒具有灵敏度高、定量准确、重复性好、性质稳定的特点，最低检测低限可达0.01mg/L，可应用于全自动生化分析仪或凝血分析仪，操作快速、简单，从检测至采集结果只需5～10分钟，具有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫诊断领域，具体地指一种D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用。
背景技术
D-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，是一个特异性的纤溶过程标记物。
血浆D二聚体测定是了解继发性纤维蛋白溶解功能的一个试验。现有技术采用的胶乳增强免疫比浊法检查原理为：抗D-D单克隆抗体包被于胶乳颗粒上，受体血浆中如果存在D-二聚体，将产生抗原-抗体反应，乳胶颗粒发生聚集现象。
1977年Sternberg创建了速率散射比浊法，是以测定的溶液对光的散射程度来判断样品中抗原的含量。一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物可导致光散射，散射强度与抗原抗体免疫复合物的含量成正比。但免疫比浊法由于检测灵敏度达不到临床的要求，于是出现了胶乳增强免疫比浊法。其基本原理是首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现胶乳凝集。单个胶乳颗粒的大小在入射光波长之内，光线可透过。当两个以上胶乳颗粒凝集可阻碍光线透过，使透射光减少，其减少程度与胶乳凝集的程度成正比，亦与抗原成反比。
现有技术中常采用聚苯乙烯微球偶联抗体，得到用于检测的胶乳试剂，但偶联效率普遍偏低，只有60～80％，且偶联时碳化二亚胺类活化剂对抗体活性破坏较大，导致产品成品率低。
发明内容
本发明的目的就是要克服现有D-二聚体免疫胶乳微球制备方法产品成品率低的缺陷，提供一种偶联效率高、偶联后抗体活性影响小的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及由采用该D-二聚体免疫胶乳微球的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒。
为实现上述目的，本发明所提供的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法，步骤如下：
1)准备粒径范围200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4～0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；
2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005～0.02mg/mL之间，得到FDP单抗溶液，储存于2～8℃备用；
5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后2～8℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球。
优选地，所述步骤3)中震荡活化条件为：4℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min。
优选地，所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时，4℃震荡16h，震荡速度为50r/min。
本发明还提供了一种胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，包括D-二聚体检测试剂R1和D-二聚体检测试剂R2；
所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.01～13％稳定剂1、10～200mM的缓冲液1、1～6％的促凝剂1、0.02～0.1％的防腐剂1；
所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为：0.01～23％稳定剂2、1～5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、10～200mM的缓冲液2、0.02～0.1％的防腐剂2、0.05～5％的赋形剂2；
所述D-二聚体检测试剂R2的制备方法为：
1)准备粒径范围200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4～0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；
2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液，
3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005～0.02mg/mL之间，得到FDP单抗溶液，储存于2～8℃备用；
5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后2～8℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球；
6)向D-二聚体免疫胶乳微球中加入含有稳定剂2和缓冲液2的封闭液，震荡得到胶乳溶液；
7)胶乳溶液离心，去上清液，以除去其中残留的活化剂，然后加入防腐剂2至贮存浓度，超声分散，即得。
优选地，所述稳定剂1选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述缓冲液1选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述促凝剂1选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖中的一种；
所述防腐剂1选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述稳定剂2选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述缓冲液2选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述防腐剂2选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种。
所述赋形剂2选自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种；
进一步优选地，所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、pH7.4的100～200mM Tris、0.02～2％的PEG、0.05％的NaN3；
所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、2～6％蔗糖、1～5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.05％的NaN3；
或所述D-二聚体检测试剂R1和所述D-二聚体检测试剂R2中0.05％的NaN3替换为0.1％的Proclin 300。
进一步地，上述试剂盒还包括D-二聚体校准品，其各组分及含量为：0.01～13％的校准品稳定剂、20mg/L的D-二聚体、10～200mM的校准品缓冲液、0.02～0.1％的校准品防腐剂、0.05～5％的校准品赋形剂。
优选地，所述校准品稳定剂选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述校准品缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述校准品防腐剂选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述校准品赋形剂选自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种。
进一步优选地，所述D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.05％的NaN3；
或所述D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.1％的Proclin 300。
优选地，上述试剂盒的技术方案中，所述步骤3)中震荡活化条件为：4℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min。
优选地，上述试剂盒的技术方案中，所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时，4℃震荡16h，震荡速度为50r/min。
优选地，上述试剂盒的技术方案中，所述步骤6)中震荡条件为：25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min。
本发明的有益效果：
(1)本发明方法制备的D-二聚体免疫胶乳微球时优化化学交联方法，将聚苯乙烯微球的羧基在低pH条件下活化，与高pH条件溶解的抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，在低温下偶联12～24h，既保证了抗体的偶联效率，同时极大程度的降低了活化剂对抗体活性的破坏。
(2)本发明D-二聚体免疫胶乳微球的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒具有灵敏度高、定量准确、重复性好、性质稳定的特点，最低检测低限可达0.01mg/L。
(3)本发明试剂盒具有较强的特异性。本实验中使用的是针对不同抗原表位的单克隆抗体，极大提高了反应时的特异性。
(4)可应用于全自动生化分析仪或凝血分析仪，操作快速、简单，从检测至采集结果只需5～10分钟，具有较好的临床应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1
本发明所提供的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法如下：
1、准备粒径240nm的聚苯乙烯微球，浓度为10％，取用2ml；聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.5％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液，溶液的体积是40mL；
2、以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加80μL，4℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4、将DD单克隆抗体(市售DD单克隆抗体DD2和DD41，两者的终浓度≤10mg/mL)在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.008mg/mL，得到FDP单抗溶液，溶液的体积是40mL，储存于4℃备用；
5、将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续5min，两者的混合液呈中性，之后4℃震荡16h，震荡速度为50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球1。
实施例2
本发明所提供的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法如下：
1、准备粒径200nm的聚苯乙烯微球，浓度为10％，取用2ml；聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液，溶液的体积是50mL；
2、以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加80μL，8℃震荡活化1h，震荡速度为30r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4、将DD单克隆抗体(市售DD单克隆抗体DD2和DD41，两者的总浓度≤10mg/mL)在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.02mg/mL，得到FDP单抗溶液，溶液的体积是40mL，储存于4℃备用；
5、将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4min，两者的混合液呈中性，之后8℃震荡12h，震荡速度为30r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球2。
实施例3
本发明所提供的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法如下：
1、准备粒径400nm的聚苯乙烯微球，浓度为10％，取用2ml；聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液，溶液的体积是40mL；
2、以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3、以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，共滴加84μL，2℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4、将DD单克隆抗体(市售DD单克隆抗体DD2和DD41，两者的总浓度≤10mg/mL)在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005mg/mL，得到FDP单抗溶液，溶液的体积是40mL，储存于4℃备用；
5、将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4min，两者的混合液呈中性，之后2℃震荡24h，震荡速度为50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球3。
实施例4
以实施例1制备的D-二聚体免疫胶乳微球1为原料，制备胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒。其各组分如下：
D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.8％BSA、0.5％NaCl、200mM Tris(pH＝7.4)、0.02％PEG6000、0.05％NaN3；
D-二聚体检测试剂R2中各组分的及含量为：0.4％BSA、6％蔗糖、1mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、25mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH＝7.4)、0.05％NaN3；
D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.8％BSA、0.5％NaCl、6％蔗糖、0.1％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、25mmol/L的甘氨酸缓冲液、0.05％NaN3。
其中，D-二聚体检测试剂R2的制备步骤如下：
1、向80mL的D-二聚体免疫胶乳微球1的溶液中加入40mL封闭液，25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min，得到胶乳溶液；封闭液组分为：3％w/v的BSA、100mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH＝8.5不含防腐剂)。
2、胶乳溶液以15000r/min离心15～25min，去掉上清液，然后加入含有NaN3成分的贮存液至贮存浓度，超声分散即得。
实施例5
以实施例1制备的D-二聚体免疫胶乳微球1为原料，制备胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒。其各组分如下：
D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.4％BSA、0.9％NaCl、100mM Tris(pH＝7.4)、2％PEG8000、0.1％Proclin 300；
D-二聚体检测试剂R2中各组分的及含量为：0.6％BSA、2％蔗糖、2mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、50mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH＝7.4)、0.1％Proclin 300；
D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4％BSA、0.9％NaCl、2％蔗糖、0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、50mmol/L的甘氨酸缓冲液、0.1％Proclin 300。
其中，D-二聚体检测试剂R2的制备步骤如下：
1、向80mL的D-二聚体免疫胶乳微球1的溶液中加入40mL 封闭液，25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min，得到胶乳溶液；封闭液组分为：3％w/v的BSA、100mmol/L的甘氨酸缓冲液(pH＝8.5不含防腐剂)。
2、胶乳溶液以15000r/min离心30～45min，去掉上清液，然后加入含有Proclin300成分的贮存液至贮存浓度，超声分散即得。
实施例6
以实施例1制备的D-二聚体免疫胶乳微球1为原料，制备胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒。其各组分如下：
D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：3％BSA、50mM乙二胺四乙酸二钠、0.9％的NaCl、1％的Tween-20、1％的丙三醇、10mM的磷酸盐缓冲液(PBS)、100mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(Hepes)、1％的PEG6000、0.02％的硫柳汞；
D-二聚体检测试剂R2中各组分的含量为：10％的丙三醇、0.05％葡萄糖、1mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、10mM的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液(Mopso)、0.04％的硫柳汞；
D-二聚体校准品中各组分的含量为：1％的Tween-20、10％的丙三醇、0.05％葡萄糖、20mg/L的D-二聚体、200mM的硼酸盐缓冲液(BBS)、0.04％的硫柳汞；
其中，D-二聚体检测试剂R2的制备步骤如下：
1、向80mL的D-二聚体免疫胶乳微球1的溶液中加入40mL封闭液，25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min，得到胶乳溶液；封闭液中含葡萄糖、丙三醇和3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液(Mopso)。
2、胶乳溶液以15000r/min离心30～45min，去掉上清液，然后加入含有硫柳汞成分的贮存液至贮存浓度1mg/mL，超声分散即得。
实施例7
以实施例1制备的D-二聚体免疫胶乳微球1为原料，制备胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒。其各组分如下：
D-二聚体检测试剂R1中各组分的含量为：5mM乙二胺四乙酸二钠、10％的丙三醇、50mmol/L的甘氨酸缓冲液、6％的硫酸葡聚糖、0.08％的NaN3；
D-二聚体检测试剂R2中各组分的含量为：0.9％的NaCl、3％BSA、50mM乙二胺四乙酸二钠、1％的Tween-20、10％的丙三醇、3％甘露醇、2％海藻糖、5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、110mM的Tris、0.05％的Proclin 300；
D-二聚体校准品中各组分的含量为：1％的NaCl、3％甘露醇、2％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、50mM的磷酸盐缓冲液(PBS)、0.02％的NaN3；
其中，D-二聚体检测试剂R2的制备步骤如下：
1、向100mL的D-二聚体免疫胶乳微球1的溶液中加入50mL封闭液，25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min，得到胶乳溶液；封闭液中含NaCl、BSA、乙二胺四乙酸二钠、Tween-20、丙三醇、甘露醇、海藻糖、及Tris。
2、胶乳溶液以15000r/min离心30～45min，去掉上清液，然后加入含有Proclin300成分的贮存液至贮存浓度5mg/mL，超声分散即得。
试验例
一、D-二聚体免疫胶乳微球偶联效率及活性检测
(1)准备4份50mg的CRP多克隆抗体及4份粒径120nm的聚苯乙烯胶乳颗粒，三份采用实施例1～3所提供的制备方法，制得D-二聚体免疫胶乳微球1～3；
(2)另一份采用现有D-二聚体免疫胶乳微球的制备方法，制得对照D-二聚体免疫胶乳微球；
对照D-二聚体免疫胶乳微球的制备方法步骤如下：
1)取1ml的表面带有羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒(颗粒直径240nm)用50mM的pH＝6.0的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至10ml，终浓度为1％w/v。
2)再加入0.5％w/v的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.5％w/v的硫代N羟基琥珀酰胺进行活化胶乳，37℃水浴1小时。
3)离心，去上清液(含残留活化交联剂)，用2-吗啉乙磺酸缓冲液清洗一遍，再加入50mg的DD单克隆抗体进行交联反应，37℃水浴4小时，即得。
(3)对D-二聚体免疫胶乳微球1～3和对照D-二聚体免疫胶乳微球分别离心分离，以收集上清中未偶联的抗体，然后再对上述微球分别加入封闭液，封闭胶乳表面残留活化位点。
针对上述免疫乳胶微球的检测试验如下：
1、通过在封闭前离心分离未偶联的抗体，采用BCA蛋白浓度测定法得到未偶联抗体的质量，即可求出偶联效率，得到实施例1～3的制备方法偶联效率分别为95、86、90％，而现有制备方法的偶联效率为75％。
2、通过酶联免疫吸附法检测上述已封闭的免疫胶乳微球的抗体效价，计算得出D-二聚体免疫胶乳微球1～3的活性分别为1:640、1:610、1:600，对照D-二聚体免疫胶乳微球的活性为1:40。
上述试验证明本发明方法既保证了抗体的偶联效率，同时极大程度的降低了活化剂对抗体活性的破坏。
二、试剂盒在生化分析仪上的应用
1、将实施例4中的D-二聚体校准品配置成5个浓度梯度和一个空白对照，采用透射比浊蛋白分析仪进行检测，检测步骤为：将15ul的各校准品分别加入到装有150ul的D-二聚体检测试剂R1试剂和搅拌子的比色杯中，将比色杯放入检测口，仪器自动检测到比色杯，再加入150ul D-二聚体检测试剂R2试剂加入到比色杯中，仪器自动搅拌混匀10s，测定吸光度OD1，反应1min后，测定吸光度OD2，仪器自动计算吸光度的差值：ΔOD＝OD2-OD1。每个浓度检测5次，测得的各浓度校准品的ΔOD的平均值作纵坐标，相应的浓度作横坐标，制作浓度-吸光度差值校准曲线，通过excel计算得到曲线方程为Y＝0.1646X-0.0034。
2、然后放入待测品1人的血浆，测定得到其吸光度差值ΔOD，然后根据上述浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到待测品1中D-二聚体的浓度。
3、同一份人血待测品1稀释10倍，然后采用实施例4的试剂盒进行检测，测定得到其吸光度差值，然后根据上述浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到人血待测品1稀释100倍后，其中D-二聚体的浓度。
重复上述人血待测品1检测5次，所得的结果见下表1
表1人血待测品中CRP浓度检测重复试验
测定的数值偏小，是会导致CV值偏大.
4、同一份人血待测品1再采用实施例5～7的试剂盒进行检测，测定得到其吸光度差值，然后根据各个试剂盒的浓度-吸光度差值校准曲线，计算得到待测品1中D-二聚体的浓度，重复5次取平均值，并计算Cv％，所得的结果见下表2。
表2不同试剂盒针对同一人血待测品检测试验
| 试剂盒实施例编号 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例7 |
| 人血待测品中DD浓度 | 0.78mg/L | 0.82mg/L | 0.93mg/L | 0.71mg/L |
| Cv％ | 4.33％ | 4.79％ | 4.52％ | 4.98％ |
上述试验表明，本发明的试剂盒最低检测低限可达0.01mg/L，灵敏度高、定量准确、重复性好、性质稳定。
Claims (8)
1.一种D-二聚体免疫胶乳微球制备方法，步骤如下：
1)准备粒径范围200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4～0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；
2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液；
3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005～0.02mg/mL之间，得到DD单克隆抗体溶液，储存于2～8℃备用；
5)将DD单克隆抗体溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后2～8℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球。
2.根据权利要求1所述的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法，其特征在于：所述步骤3)中震荡活化条件为：4℃震荡活化1h，震荡速度为50r/min。
3.根据权利要求1或2所述的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法，其特征在于：所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时，4℃震荡16h，震荡速度为50r/min。
4.一种胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：包括D-二聚体检测试剂R1和D-二聚体检测试剂R2；
所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.01～13％稳定剂1、10～200mM的缓冲液1、1～6％的促凝剂1、0.02～0.1％的防腐剂1；
所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为：0.01～23％稳定剂2、1～5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、10～200mM的缓冲液2、0.02～0.1％的防腐剂2、0.05～5％的赋形剂2；
其中，所述稳定剂1选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述缓冲液1选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述促凝剂1选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖中的一种；
所述防腐剂1选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述稳定剂2选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述缓冲液2选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述防腐剂2选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述赋形剂2选自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种；
所述D-二聚体检测试剂R2的制备方法为：
1)准备粒径范围200～400nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4～0.6％w/v，得到pH为5.5～6.5的微球溶液；
2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺，得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液，
3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按每10mg聚苯乙烯微球添加35～45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震荡活化1h，震荡速度为30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5～9.5条件下溶解，溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液，使抗体终浓度在0.005～0.02mg/mL之间，得到DD单克隆抗体溶液，储存于2～8℃备用；
5)将DD单克隆抗体溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗体与微球质量比为0.001～0.02:1，整个滴加过程持续4～7min，使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合，两者的混合液呈中性，之后2～8℃震荡12～24h，震荡速度为30～50r/min，即得D-二聚体免疫胶乳微球；
6)向D-二聚体免疫胶乳微球中加入含有稳定剂2和缓冲液2的封闭液，震荡得到胶乳溶液；
7)胶乳溶液离心，去上清液，以除去其中残留的活化剂，然后加入包含防腐剂2的贮存液至贮存浓度，超声分散，即得。
5.根据权利要求4所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：
所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、pH7.4的100～200mM Tris、0.02～2％的PEG、0.05％的NaN3；
所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、2～6％蔗糖、1～5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.05％的NaN3；
或所述D-二聚体检测试剂R1和所述D-二聚体检测试剂R2中0.05％的NaN3替换为0.1％的Proclin 300。
6.根据权利要求4或5任一项所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括D-二聚体校准品，其各组分及含量为：0.01～13％的校准品稳定剂、20mg/L的D-二聚体、10～200mM的校准品缓冲液、0.02～0.1％的校准品防腐剂、0.05～5％的校准品赋形剂；
其中，所述校准品稳定剂选自0.5～0.9％的氯化钠、0.1～3％的BSA、5～50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01～1％的Tween-20、1～10％的丙三醇中的一种或两种以上；
所述校准品缓冲液选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上；
所述校准品防腐剂选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种；
所述校准品赋形剂选自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种。
7.根据权利要求6所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：
所述D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.05％的NaN3；
或所述D-二聚体校准品中各组分及含量为：0.4～0.8％的BSA、0.5～0.9％的NaCl、2～6％蔗糖、0.1～0.5％海藻糖、20mg/L的D-二聚体、pH7.4的25～50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.1％的Proclin 300。
8.根据权利要求4所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒，其特征在于：所述步骤6)中震荡条件为：25℃震荡2h，然后转入4℃震荡24h，震荡速度为50r/min。
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| CN109187955A (zh) * | 2018-08-01 | 2019-01-11 | 深圳市锦瑞生物科技有限公司 | 一种用于检测d-二聚体的试剂盒及其检测方法 |
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| CN114137223A (zh) * | 2021-11-25 | 2022-03-04 | 安徽大千生物工程有限公司 | 一种快速测定igf-1的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒及其制备使用方法 |
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006064807A1 (ja) * | 2004-12-14 | 2006-06-22 | Arkray, Inc. | 検体前処理方法およびそれを用いた免疫測定方法 |
| WO2007074864A1 (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-05 | Advanced Life Science Institute, Inc. | アシンメトリックジメチルアルギニンを認識する抗体及びその製造方法並びに翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法 |
| EP2146207A1 (en) * | 2007-11-21 | 2010-01-20 | Arkray, Inc. | Measurement reagent, immune nephelometry using the same, and analyte analysis tool |
| CN101819202A (zh) * | 2010-05-06 | 2010-09-01 | 上海太阳生物技术有限公司 | D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法) |
| CN101968492A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-02-09 | 厦门大学附属中山医院 | 检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒及其制备方法 |
| CN102628868A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-08-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 |
| CN204228713U (zh) * | 2014-11-13 | 2015-03-25 | 江苏达骏生物科技有限公司 | 用于d-二聚体检测的检测卡 |
-
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006064807A1 (ja) * | 2004-12-14 | 2006-06-22 | Arkray, Inc. | 検体前処理方法およびそれを用いた免疫測定方法 |
| WO2007074864A1 (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-05 | Advanced Life Science Institute, Inc. | アシンメトリックジメチルアルギニンを認識する抗体及びその製造方法並びに翻訳後修飾アミノ酸含有タンパク質の検出方法 |
| EP2146207A1 (en) * | 2007-11-21 | 2010-01-20 | Arkray, Inc. | Measurement reagent, immune nephelometry using the same, and analyte analysis tool |
| CN101819202A (zh) * | 2010-05-06 | 2010-09-01 | 上海太阳生物技术有限公司 | D-二聚体(D-Dimer)测定试剂盒(胶乳免疫比浊法) |
| CN101968492A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-02-09 | 厦门大学附属中山医院 | 检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒及其制备方法 |
| CN102628868A (zh) * | 2011-12-30 | 2012-08-08 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 检测非对称二甲基精氨酸含量的胶乳增强免疫比浊法试剂盒 |
| CN204228713U (zh) * | 2014-11-13 | 2015-03-25 | 江苏达骏生物科技有限公司 | 用于d-二聚体检测的检测卡 |
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