CN112485444A - 基于乳胶增强免疫比浊法测定d-二聚体的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于胶乳增强免疫比浊法测定D‑二聚体的试剂盒，包括反应缓冲液和胶乳试剂；所述反应缓冲液包括缓冲液，无机盐，增浊剂，防腐剂，稳定剂；所述胶乳试剂包括至少两种通过单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂。还公开了该试剂盒的制备方法：首先筛选出至少两株特异性、活性较强的DD单抗，将单抗各自与胶乳微球偶联制取胶乳试剂，然后按照一定的比例混合混匀即得到DD胶乳试剂，在保持灵敏度情况下特异性也较强；再配制反应缓冲液；最后将胶乳试剂和反应缓冲液组成试剂盒，用于检测DD的含量；通过该制备方法制备出的试剂盒，可以同时提高检测的灵敏度和特异性，使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测实际制备领域，特别是涉及一种基于乳胶增强免疫比浊法测定D- 二聚体的试剂盒及其制备方法。
背景技术
二聚体(D-dimer，DD)是交联纤维蛋白特异的降解产物，它的生成或增高反映了凝血 或纤溶系统的激活，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一，广泛应用于血栓性 疾病有关的临床诊断中。血浆D二聚体测定是了解继发性纤维蛋白溶解功能的一个试验。 检查原理：抗D-D单克隆抗体包被于胶乳颗粒上，受体血浆中如果存在D-二聚体，将产生 抗原-抗体反应，乳胶颗粒发生聚集现象。但是，凡有血块形成的出血，本试验均可呈阳性， 故其特异性低，敏感度高。
测定纤溶系统主要因子，对于诊断与治疗纤溶系统疾病(如DIC，各种血栓)及与纤溶 系统有关疾病(如肿瘤，妊娠综合症)，以及溶栓治疗监测，有着重要的意义。纤维蛋白降解产物D的水平升高，表明体内存在着频繁的纤维蛋白降解过程。因此，纤维D-二聚体是 深静脉血栓(DVT)、肺栓塞(PE)、弥漫性血管内凝血(DIC)的关键指标。
近年来，随着方法学的不断进步，DD检测的方法也越来越多，但利用的核心原理均是 免疫检测，应用较多的DD检测方法主要有：酶联免疫吸附试验(ELISA)、乳胶颗粒凝集试验(LATEX)、免疫过滤胶体金染色法、双抗体RBC凝集法和放免法。临床最常用是：ELISA、LATEX和免疫过滤胶体金染色法，其中LATEX法测定速度快，但敏感度不如ELISA法； ELISA法敏感度高，但检测时耗时较长。由于不同的检测方法其灵敏度不同，其正常参考值 随检测方法的不同而不同，且随年龄的增长而有所增高。
其中胶乳免疫比浊法是近年逐渐在全自动血凝仪上开始使用的方法，因其使用方便、操 作简单、定量准确、检测快速等优点逐渐在各大中型医院中推广使用。
在胶乳增强免疫比浊法应用中，采用多抗进行标记可以有效提高试剂灵敏度，但会造成 特异性不强，使检测结果准确度下降；而采用一株单抗对胶乳进行标记可以使特异性提高， 但灵敏度又会受到影响。
因此亟需提供一种新型的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的方法来解决上述问 题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂 盒及其制备方法，能够解决现有市场上流通的检测D-二聚体的灵敏度低和线性范围小的缺 点，可以使用全自动生化分析仪检测D-二聚体，操作简便、检测速度快、精密度高、重复 性好。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于胶乳增强免疫比浊 法测定D-二聚体的试剂盒，包括反应缓冲液和胶乳试剂；其中，所述反应缓冲液包括缓冲 液，无机盐，增浊剂，防腐剂，稳定剂；所述胶乳试剂包括至少两种通过单抗与胶乳微球偶 联而成的胶乳试剂。
在本发明一个较佳实施例中，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液中的任一 种。
在本发明一个较佳实施例中，所述无机盐包括氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化 钙中的一种或几种。
在本发明一个较佳实施例中，所述增浊剂包括聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二 醇6000、聚乙二醇8000中的一种或几种。
在本发明一个较佳实施例中，所述防腐剂包括Proclin300或硫柳汞中的任一种。
在本发明一个较佳实施例中，所述稳定剂包括BSA或蔗糖中的任一种。
在本发明一个较佳实施例中，所述胶乳微球的粒径范围为100—300nm。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种基于乳胶增强免疫比 浊法测定D-二聚体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)清洗：量取固含为10％的胶乳微粒，加至2.5ml—5ml清洗缓冲液中，20000转/分钟离心30min，去上清，用活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声；
(2)活化：量取活化剂加入到上述清洗好的胶乳微粒中，胶乳微粒与活化剂的重量比 例为：1：10—1：20，混匀，对胶乳微粒进行活化0.5h；
(3)偶联：取至少两珠经筛选好的特异性强的单抗各自与活化好的胶乳微粒进行偶联， 时间为2小时，胶乳微粒与抗体的质量比例为10:1—10:5；
(4)封闭：偶联时间结束后开始20000转/分钟离心30min，去上清，取2.5ml—5ml封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭1h；
(5)定溶：封闭结束后开始20000转/分钟离心30min，去上清，加入10ml—20ml胶乳保存液对胶乳微粒进行重悬超声，然后定溶；
(6)混合：将两珠定溶好的标记有单抗的胶乳微粒按照体积比2:1—4:1的比例混合混 匀，得到DD胶乳试剂，置于2—8℃保存；
(7)称取缓冲液、无机盐、增浊剂，防腐剂、稳定剂，制得反应缓冲液，并将反应缓冲液和DD胶乳试剂组成用于测定D-二聚体含量的试剂盒。
在本发明一个较佳实施例中，在步骤(1)中，所用清洗缓冲液为磷酸盐缓冲液；所用 活化缓冲液为磷酸盐缓冲液。
在本发明一个较佳实施例中，在步骤(2)中，所述活化剂为EDAC/NHS。
在本发明一个较佳实施例中，在步骤(4)中，所述封闭缓冲液包括BSA、甘氨酸中的一种或几种。
在本发明一个较佳实施例中，在步骤(5)中，所述胶乳保存液包括缓冲液，稳定剂，防腐剂和表面活性剂；其中，所述稳定剂包括BSA，蔗糖，甘露醇中一种或几种；所述防腐 剂包括Proclin300或硫柳汞中一种或几种；所述表面活性剂包括吐温-20，吐温-80，曲拉通X-100中的一种或几种。
本发明的有益效果是：
(1)本发明首先筛选出至少两株特异性、活性较强的DD单抗，将单抗各自与胶乳微球偶联制取胶乳试剂，然后按照一定的比例混合混匀即得到DD胶乳试剂，在保持灵敏度情况下特异性也较强；再配制反应缓冲液；最后将胶乳试剂和反应缓冲液组成试剂盒，用于检测DD的含量；
(2)通过本发明所述制备方法制备出的试剂盒，可以同时提高检测的灵敏度和特异性， 使得试剂盒的线性范围更宽，准确度更高，更好满足临床的需求；
(3)本发明旨在解决现有市场上流通的检测D-二聚体的灵敏度低和线性范围小的缺点， 可以使用全自动生化分析仪检测D-二聚体，操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好， 并有效提高试剂的灵敏度与特异性，具有极高的应用价值与广阔的市场前景。
附图说明
图1是本发明基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒的拟合曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域 技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：
一种基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，包括反应缓冲液和胶乳试剂； 其中，所述反应缓冲液包括缓冲液，无机盐，增浊剂，防腐剂，稳定剂；所述胶乳试剂包括 至少两种通过单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂，即所述胶乳试剂是采用至少两珠特异性 较强的单抗与胶乳微粒偶联后混合在一起而得到。所述胶乳微球的粒径范围为100— 300nm，优选为200nm。
另外，本发明还提供一种基于胶乳增强免疫比浊法测定DD的试剂盒的制备方法，其包 括以下步骤：
一、DD试剂R1即反应缓冲液的制备：
按照下表中的配比准确称取化学物质，置于装有0.7L纯化水的烧杯中，依次称取溶 解，搅拌均匀，然后将pH调节到7.0±0.05，最后将溶液转移到容量瓶中定溶至1L，用0.22um滤膜过滤，贴上标签，置于2-8度保存。
二、DD试剂R2即胶乳试剂的制备：
1.清洗：量取(JSR 200nm)固含为10％的胶乳微粒0.5ml加至3.0ml的清洗缓冲液中， 离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，用3.0ml活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声。 本步骤所述清洗缓冲液为磷酸盐缓冲液，所述活化缓冲液为磷酸盐缓冲液。
2.活化：量取2％的EDAC 0.1ml/4％NHS 0.2ml的活化剂加入到上述清洗好的胶乳微粒 中，混匀，对胶乳微粒进行活化。活化时间为0.5小时。
3.偶联：取两珠经筛选好的特异性强的单抗各自与活化好的胶乳微粒进行偶联，时间为2小时。胶乳微粒与抗体的质量比例为10:1—10:5。
4.封闭：偶联时间结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，取5.0ml的封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭，时间为1小时。本步所述封闭缓冲液为1％BSA。
5.定溶：封闭结束后开始离心，20000转/分钟，30分钟，去上清，加入15ml的胶乳保存液对胶乳微粒进行重悬超声，然后定溶。将两珠定溶好的标记有单抗的胶乳微粒按照3：1比例混合混匀就得到DD胶乳试剂，置于2—8℃保存。将至少两珠单抗标记好的胶乳混合在一起有利于提高试剂的灵敏度与特异性。本步所述胶乳保存液的配方如下：
6.混合：将反应缓冲液与胶乳试剂组成用于测定DD含量的试剂盒。
本发明采用上述制备方法索制备出的试剂盒用于检测人血清中DD的含量，其反应原理 如下：
样本中的D二聚体与抗人DD单克隆抗体胶乳颗粒发生抗原抗体反应，在特定波长下检 测其吸光度，其变化程度与样本中的DD含量成正比。
三、测试方法：
检测仪器：日立7180
温度：37℃；比色杯：1cm
分析方法：两点终点法；测光点：19-34；主副波长：570/0
样本量/R1/R2:6ul/150ul/50ul
反应方向：(+)
本发明所述试剂盒的使用步骤请参见下表：
校准方式为样条函数Spline。采用多点校准模式，用纯化水为零点，建立工作曲线。
计算方法：以校准品浓度对相应△A拟合校准曲线，样本浓度值通过校准曲线得出。
实施例2：
试剂盒性能评价：
1.线性
线性相关系数：在[0.5mg/L—24mg/L]范围内用接近线性区间下限的低值标本稀释接近线 性区间上限的高值标本，混合成至少5个不同浓度(Xi)的标本，每个标本重复测定3次， 分别计算测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(Xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变 量求出线性回归方程。按公式(1)计算线性回归的相关系数r，所得结果应符合r＞0.99要 求。
线性评价结果如下：
如图1所示，本试剂盒的直线拟合曲线为：y＝1.0408x-0.2779，R2＝0.9994，R2>0.99，满 足临床要求。
2.精密度
重复性：在重复条件下，取(2.0±0.2)mg/L和(8.0±0.4)mg/L浓度的样本(质控品、 校准品或其他定值样本)，用同一批号试剂重复测定10次，分别计算测定值的平均值和标准 差，按(2)式计算批内变异系数(CV)，所得结果应CV应≤8.0％。
式中：SD为标准差，计算公式为
dn为同水平各次所 测值的偏差，计算公式为
xn为同水平各次所测值；
为平均值，计算公式为
结果如下：
由检测结果可以看出，低值样本的CV为2.40％，高值样本的CV为1.62％，均小于8％， 满足临床要求。
3.准确度
取高、低两个水平的质控品，按照说明书操作步骤进行测定，用同一批号试剂重复测定 3次，测试结果记为(xi)，按(3)式求出相对偏差(Bi)，3次结果均应符合测定值与质控品 靶值相对偏差应≤15.0％；如果3次结果中有2次符合要求，1次不符合要求，应重新连续测 试20次，并分别按照(3)式计算相对偏差(Bi)，当大于等于19次结果符合要求，准确度被验证即符合测定值与质控品靶值相对偏差应≤15.0％的要求。
式中：xi为测定结果；T为靶值。
结果如下：
从检测结果可以看出，低值质控的相对偏差为3.29％，高值质控的相对偏差为3.19％， 均小于15％，故满足临床要求。
综上所述，本发明提供一种基于胶乳增强免疫比浊法测定DD的试剂盒及其制备方法， 能有效地提升DD检测试剂的灵敏度与特异性。本发明采用了创新的用至少两珠特异性强的 单抗通过标记胶乳微粒偶联然后混合在一起的技术来制备检测DD的试剂盒，实现了上全自 动生化仪，自动检测，并有效提高试剂的灵敏度与特异性，具有极高的应用价值与广阔的市 场前景。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合 该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例 中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描 述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结 合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述 所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作 很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理 和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要 求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (10)
1.一种基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，包括反应缓冲液和胶乳试剂；其中，所述反应缓冲液包括缓冲液，无机盐，增浊剂，防腐剂，稳定剂；所述胶乳试剂包括至少两种通过单抗与胶乳微球偶联而成的胶乳试剂。
2.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液中的任一种。
3.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述无机盐包括氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化锌、氯化钙中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述增浊剂包括聚乙二醇1000、聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂包括Proclin300或硫柳汞中的任一种。
6.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括BSA或蔗糖中的任一种。
7.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒，其特征在于，所述胶乳微球的粒径范围为100—300nm。
8.一种如权利要求1至7任一项所述的基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)清洗：量取固含为10％的胶乳微粒，加至2.5ml—5ml清洗缓冲液中，20000转/分钟离心30min，去上清，用活化缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声；
(2)活化：量取活化剂加入到上述清洗好的胶乳微粒中，胶乳微粒与活化剂的重量比例为：1：10—1：20，混匀，对胶乳微粒进行活化0.5h；
(3)偶联：取至少两珠经筛选好的特异性强的单抗各自与活化好的胶乳微粒进行偶联，时间为2小时，胶乳微粒与抗体的质量比例为10:1—10:5；
(4)封闭：偶联时间结束后开始20000转/分钟离心30min，去上清，取2.5ml—5ml封闭缓冲液对胶乳微粒沉淀物重悬超声，然后进行封闭1h；
(5)定溶：封闭结束后开始20000转/分钟离心30min，去上清，加入10ml—20ml胶乳保存液对胶乳微粒进行重悬超声，然后定溶；
(6)混合：将两珠定溶好的标记有单抗的胶乳微粒按照体积比2:1—4:1的比例混合混匀，得到DD胶乳试剂，置于2—8℃保存；
(7)称取缓冲液、无机盐、增浊剂，防腐剂、稳定剂，制得反应缓冲液，并将反应缓冲液和DD胶乳试剂组成用于测定D-二聚体含量的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述封闭缓冲液包括BSA、甘氨酸中的一种或几种。
10.根据权利要求8所述的基于乳胶增强免疫比浊法测定D-二聚体的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述胶乳保存液包括缓冲液，稳定剂，防腐剂和表面活性剂；其中，所述稳定剂包括BSA，蔗糖，甘露醇中一种或几种；所述防腐剂包括Proclin300或硫柳汞中一种或几种；所述表面活性剂包括吐温-20，吐温-80，曲拉通X-100中的一种或几种。
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