CN107589266A

CN107589266A - 一种血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN107589266A
Application number: CN201710674796.2A
Authority: CN
Inventors: 王连升
Original assignee: Shanghai Original Industrial Development Co Ltd
Current assignee: Shanghai Original Industrial Development Co Ltd
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2018-01-16

Abstract

本发明公开了一种血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用，包括试剂R1，试剂R2和血管内皮生长因子校准品，所述试剂R1包括3‑(N‑吗啉基)丙磺酸缓冲液、聚乙二醇对异辛基苯基醚、BSA、甘氨酸、表面活性剂、防腐剂，所述试剂R2包括磷酸盐缓冲液、血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球、BSA、表面活性剂、海藻糖、甘露醇、蔗糖、PEG6000、防腐剂；本发明试剂盒采用定向偶联法将VEGF抗体的Fc段与聚苯乙烯胶乳颗粒偶联，包被效果好，抗体不易与胶乳颗粒脱离，大大提高了抗体的利用率和检测灵敏度。

Description

一种血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及胶乳增强免疫比浊试剂盒技术领域，尤其涉及一种血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用。

背景技术

血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF) 是最有效的促血管生长因子，也是迄今所发现最强大的血管通透因子，因此又称血管通透因子(vascular permeability factor ,VPF)。

VEGF 是一种主要作用于血管内皮细胞的有丝分裂原，是由两条相同多肽链通过二硫键构成的同源二聚体糖蛋白，分子量为36～46kDa。人VEGF 基因位于6 号染色体短臂1区2带(6p12.3)，该基因由8 个外显子和7个内含子组成，经过转录水平的剪切可产生5 种不同的转录子，分别产生VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206 等至少5 种蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165 是分泌型可溶性蛋白，VEGF 是一种典型的外分泌蛋白，其作用为促进内皮细胞增殖和迁徙，增加血管通透性，改变细胞外基质，血管生成和维持作用。

血管内皮生长因子是近些年研究较为广泛的一种全新广谱肿瘤标记物，被认为是最有意义的血液肿瘤筛查的标记物。VEGF 血液学检测可作为(1) 肿瘤的筛查、(2) 肿瘤的辅助诊断(3) 肿瘤治疗疗效的评估和监测、(4) 肿瘤预后及复发监测。

VEGF 在正常人肾脏中主要分布于肾小球足细胞和肾小管上皮细胞, 可通过旁分泌作用穿透肾小球基底膜作用于内皮细胞, 调节肾小球滤过膜的通透性。研究表明，VEGF水平的变化不仅能反映肾小球硬化，同时还能反映糖尿病肾小管-间质病变，可作为糖尿病肾病的早期敏感指标，并可预示糖尿病肾病的进展。对糖尿病肾病的早期诊断和肾功能损害程度的判断有较高的临床诊断价值。

目前，VEGF的检测主要有酶联免疫分析法（ELISA）、免疫放射法（IRMA）、化学发光法等。酶联免疫法主要缺点是灵敏度不高，测定过程中需要洗涤、分离等步骤，耗时长，自动化程度不高，重复性相对较差。免疫放射法受同位素半衰期影响，有效期较短，只能手工操作，易产生人为误差，此外还有一定的放射性污染。化学发光法虽然灵敏度和线性都较高，但试剂成本相对较高且配套的大型仪器比较昂贵。因此，需要研发一种灵敏度高、特异性强，方便快捷，成本较低，可在自动生化分析仪上使用的血液、尿液VEGF 检测试剂盒。

胶乳增强免疫比浊法是在免疫比浊法基础上发展的一种测定人体液特种标志蛋白含量的检测方法。其基本原理是：将待测物质相对应的具有高特异性、高亲和力抗体包被至纳米胶乳微球上，当此微球与含有待测样本混合时，在合适的反应条件下，抗体与样本中抗原特异结合，形成抗原- 抗体- 胶乳微粒复合物，在短时间内迅速聚集在一起，改变反应液的散光或透光性能，并且在一定范围内，反应液吸光度值变化与待测样本中的抗原含量成正比关系，利用标准品绘制标准曲线，便可根据样本吸光度值变化测定待测物含量。由于抗体特异性识别抗原，所以该方法具有很好的特异性；纳米胶乳微球的引入使反应液浊度变化更为显著，从而提高试验的灵敏度，能测定体液中微量蛋白含量；同时胶乳增强免疫比浊法能利用普通生化分析仪进行检测，操作简单，容易实现自动化，不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性好，可快速、准确获得检测结果，对疾病早期诊断和治疗具有重要临床意义。

申请公布号CN105181694A公开了一种癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括癌胚抗原，R1试剂，R2试剂和校准品，R1试剂包括以下各成分：MOPS缓冲液，BSA，表面活性剂，防腐剂；R2试剂包括以下各成分：PBS缓冲液，CEA抗体包被的胶乳微球，BSA，表面活性剂，海藻糖和防腐剂。上述试剂盒应用于癌胚抗原检测准确性可靠，相关性及精密度良好，但是上述试剂盒检测的人血清癌胚抗原含量的单位为ug/mL，而对于人血清或尿中pg/mL的VRGF无法获得准确检测。

目前，胶乳增强免疫比浊分析技术用于检测人血液、尿液中VEGF的方法和商品化试剂盒尚未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中胶乳增强免疫比浊分析技术无法准确检测VEGF含量的问题，本发明的目的是提供一种血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂R1，试剂R2和血管内皮生长因子校准品，所述试剂R1包括3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、聚乙二醇对异辛基苯基醚、BSA、甘氨酸、表面活性剂、防腐剂，所述试剂R2包括磷酸盐缓冲液、血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球、BSA、表面活性剂、海藻糖、甘露醇、蔗糖、PEG6000、防腐剂。

试剂R1、试剂R2及标准品中缓冲液的选择需要从增加蛋白质稳定性、水溶性，保持缓冲液稳定的离子强度和pH值，防止微生物污染，保持胶乳微球均一、稳定等方面进行综合考虑。

上述的胶乳微球为聚苯乙烯微球。

聚乙二醇对异辛基苯基醚用于保持试剂盒中蛋白的稳定。

甘氨酸是一种两性物质，有一定的缓冲能力，利于保持缓冲液的pH值稳定。

甘露醇、蔗糖为是蛋白质的非特异性稳定剂，可以阻止蛋白质二级结构的改变、防止蛋白质多肽链的聚集，使蛋白质稳定并保持生物活性。

PEG6000可与蛋白质的疏水链作用，增加蛋白溶液稳定性。

优选的是，所述试剂R1中各组分的用量分别为：3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液0.01mol/L-0.1mol/L，聚乙二醇对异辛基苯基醚 10-50 mmol/L，BSA 0.1％-5％ (w/v)，表面活性剂 0.1％-3％(w/v)，甘氨酸0.12％-0.45％(w/v)，防腐剂 0.05％-1％(w/v)；所述试剂R2中各组分的用量分别为：磷酸盐缓冲液0.01 mol/L -0.15 mol/L，血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球1％(w/v)，BSA 0.1％-3％ (w/v)，表面活性剂 0.2％-5％(w/v)，海藻糖1％-5％(w/v)，蔗糖1％-5％(w/v)，PEG6000 0.1％-1％(w/v)，甘露醇0.02％-0.2％(w/v)，防腐剂 0.05％-1％(w/v)。

文中w/v是质量/体积单位，指单位体积的溶剂中所溶解的溶质质量数，如：BSA0.1％-3％ (w/v)指0.1-0.3g BSA溶于100mL水中。

其中，所述表面活性剂选自Tween-20、TritonX-100、NP-40中的一种或多种的组合。

其中，所述防腐剂选自叠氮钠、Prolin300、硫柳汞中的一种或多种的组合。

其中，所述血管内皮生长因子抗体选自鼠源、兔源或羊源抗体。

其中，所述血管内皮生长因子抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

优选的是，所述胶乳微球的粒径为40-500nm，其表面修饰基团为-COOH、-NH₂、-SH、-OH、- CHO 中的一种。

对胶乳微粒进行修饰，可以使其携带如-OH、-NH₂、-COOH等不同的基团，这些基团可与抗体多肽链氨基酸上各种基团共价结合，形成抗体-胶乳微球交联物。

优选的是，所述血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球通过下述方法制备得到：

S1，采用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液冲洗胶乳微球；

S2，采用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液重悬胶乳微球；

S3，采用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液配制2-4.5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺溶液和2.5-5mg/mL的碳化二亚胺溶液；

S4，将N-羟基琥珀酰亚胺溶液和碳化二亚胺溶液分别加入重悬后的胶乳微球中，于18-25℃下反应15-30分钟；

S5，采用3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液冲洗反应产物，并将冲洗后的反应产物重悬在2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中得到微球悬液；

S6，将血管内皮生长因子抗体溶解于3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液中，并加入微球悬液，于18-25℃下反应2-6小时；

S7，冲洗反应产物，重悬于磷酸盐缓冲液中，得到血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球。

其中，所述血管内皮生长因子校准品包括血管内皮生长因子蛋白、磷酸盐缓冲液、BSA和防腐剂。

其中，S4中N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺的添加比例为1:4。

本发明的第二方面，提供上述血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒在检测血管内皮生长因子方面的应用。

患者体内的类风湿因子可与免疫分析系统中的捕获抗体或标记抗体的Fc段直接偶合，导致检测结果呈现假阳性；同样地，嗜异性抗体可与动物源性的捕获抗体或标记抗体的Fc直接结合，导致检测结果假阳性。本发明的试剂盒采用定向偶联法将VEGF抗体的Fc段与聚苯乙烯胶乳颗粒偶联，使得VEGF抗体的Fc段与胶乳颗粒结合后其抗原决定簇结构发生改变，患者血清中的类风湿因子和嗜异性抗体无法识别并与之结合，减少了检测干扰，提高了检测灵敏度。

与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明试剂盒采用胶乳增强免疫比浊法的原理检测人血液或尿液中的VEGF含量，可以适用于半自动、全自动生化分析仪及散射比浊分析仪，操作简单、快速、精确度高、自动化程度高，适用于各级医院包括中小型及基层医院临床广泛使用；本发明试剂盒采用定向偶联法将VEGF抗体的Fc段与聚苯乙烯胶乳颗粒偶联，包被效果好，抗体不易与胶乳颗粒脱离，大大提高了抗体的利用率和检测灵敏度；采用定向偶联，使得VEGF的Fc片段发生了结构改变，减少了类风湿因子RF和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：

图1是本发明试剂盒的标准曲线。

具体实施方式

一种血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂R1，试剂R2和血管内皮生长因子校准品，试剂R1包括3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、聚乙二醇对异辛基苯基醚、BSA、甘氨酸、表面活性剂、防腐剂，试剂R2包括磷酸盐缓冲液、血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球、BSA、表面活性剂、海藻糖、甘露醇、蔗糖、PEG6000、防腐剂,校准品包括血管内皮生长因子蛋白、磷酸盐缓冲液、BSA和防腐剂。

其中，表面活性剂选自Tween-20、TritonX-100、NP-40中的一种或多种的组合。

其中，防腐剂选自叠氮钠、Prolin300、硫柳汞中的一种或多种的组合。

其中，血管内皮生长因子抗体选自鼠源、兔源或羊源抗体。

其中，血管内皮生长因子抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

其中，胶乳微球的粒径为40-500nm，其表面修饰基团为-COOH、-NH₂、-SH、-OH、-CHO 中的一种。

对胶乳微粒进行修饰，可以使其携带如-OH、-NH2、-COOH、-OTS等不同的基团，这些基团可与抗体多肽链氨基酸上各种基团共价结合，形成抗体-胶乳微球交联物。

试剂R1中各组分的用量分别为：

3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液 0.01mol/L-0.1mol/L

聚乙二醇对异辛基苯基醚 10-50 mmol/L

BSA 0.1％-5％ (w/v)

表面活性剂 0.1％-3％(w/v)

甘氨酸 0.12％-0.45％(w/v)

防腐剂 0.05％-1％(w/v)。

试剂R2中各组分的用量分别为：

磷酸盐缓冲液 0.01 mol/L -0.15 mol/L

血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球 1％(w/v)

BSA 0.1％-3％ (w/v)

表面活性剂 0.2％-5％(w/v)

海藻糖 1％-5％(w/v)

蔗糖 1％-5％(w/v)

PEG6000 0.1％-1％(w/v)

甘露醇 0.02％-0.2％(w/v)

防腐剂 0.05％-1％(w/v)。

校准品的制备过程：将VEGF蛋白溶于稀释液中，制成0、10、100、200、400、800 pg/ml六个浓度的校准品，其中稀释液中磷酸盐（PBS）缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4，BSA的质量浓度为0.5%，防腐剂的质量浓度为0.1%。

实施例1 人VEGF抗体的制备

将人VEGF抗原免疫日本大耳白兔获得抗体。具体方法是：兔子背部皮下多点免疫，首次免疫量为200μg/只，每月免疫一次，免疫量为100μg/只，共4次，最后加强免疫量为200μg/只，7天后收集免疫血清，用protein G 纯化抗血清，最终保存在pH 7.4 的磷酸盐缓冲液中，抗体效价通过酶联免疫吸附试验进行鉴定。

实施例2 人VEGF抗体与胶乳微球的偶联

用10ml MES缓冲液冲洗100mg/ml 胶乳微球(粒径为100nm) (购于Millipore，型号为Fluorescent Microspheres - F-XC 030)2次；第二次冲洗后，在10ml MES缓冲液中重悬微球，调整微球浓度为1％，超声或搅拌使微球重悬均匀；分别加入350μL NHS(2-4.5mg/ml)和EDC(2.5-5mg/ml)混合均匀,在室温(18-25℃ ) 反应15-30分钟；取50mM MOPS 缓冲液(pH7.0) 冲洗两次并将微球重悬在5ml 15mM MES缓冲液中；溶解人VEGF抗体于5ml MOPS缓冲液中，将微球悬液和抗体溶液混合，室温反应2-6小时；冲洗，重悬于10ml 磷酸盐缓冲液中，缓慢混合30 分钟，超声使微球分散，4℃储存。

实施例3 血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒的组成

试剂R1的组成：

3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液 0.06 mol/L，pH 7-8.5

聚乙二醇对异辛基苯基醚 45 mmol/L

BSA 1％ (w/v)

表面活性剂 0.1％(w/v)

甘氨酸 0.15％(w/v)

防腐剂 0.1％(w/v)。

试剂R2的组成：

磷酸盐缓冲液 0.15mol/L，pH 7.2-7.4

血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球 1％(w/v)

BSA 1％ (w/v)

表面活性剂 0.2％(w/v)

海藻糖 1％(w/v)

蔗糖 2.5％(w/v)

PEG6000 0.18％(w/v)

甘露醇 0.03％(w/v)

防腐剂 0.1％(w/v)

校准品的制备：

将人VEGF蛋白溶解于稀释液中，稀释液由0.1 mol/L，pH 7.2-7.4的PBS缓冲液，质量浓度为0.5%的BSA，质量浓度为0.1%的防腐剂组成，制成0、10、100、200、400、800 pg/ml六个浓度的校准品。

实施例4 血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒的组成

试剂R1的组成：

3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液 0.01 mol/L，pH 7-8.5

聚乙二醇对异辛基苯基醚 10 mmol/L

BSA 5％ (w/v)

表面活性剂 2％(w/v)

甘氨酸 0.45％(w/v)

防腐剂 1％(w/v)。

试剂R2的组成：

磷酸盐缓冲液 0.01 mol/L，pH 7.2-7.4

血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球 1％(w/v)

BSA 3％ (w/v)

表面活性剂 5％(w/v)

海藻糖 2％(w/v)

蔗糖 1％(w/v)

PEG6000 0.1％(w/v)

甘露醇 0.02％(w/v)

防腐剂 0.05％(w/v)

校准品的制备：

实施例5 血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒的组成

试剂R1的组成：

3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液 0.1 mol/L，pH 7-8.5

聚乙二醇对异辛基苯基醚 50 mmol/L

BSA 0.1％ (w/v)

表面活性剂 3％(w/v)

甘氨酸 0.12％(w/v)

防腐剂 0.05％(w/v)。

试剂R2的组成：

磷酸盐缓冲液 0.1mol/L，pH 7.2-7.4

血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球 1％(w/v)

BSA 0.1％ (w/v)

表面活性剂 3％(w/v)

海藻糖 5％(w/v)

蔗糖 5％(w/v)

PEG6000 1％(w/v)

甘露醇 0.2％(w/v)

防腐剂 1％(w/v)

校准品的制备：

实施例6 血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒的使用方法

检测仪器：全自动/半自动生化分析仪

分析方法：采用两点终点法；具体参数为：测定波长630nm，VEGF校准品25μl，R1试剂240μl，R2 试剂80μl；校准方式：多点校准。

将VEGF校准品与R1 试剂混合均匀，37℃孵育5min 后，读取吸光度值A1，加入R2试剂80μl，反应4min 后读取吸光度值A2，计算吸光度变化值△A= A2-A1 ；然后以△A 值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制校准曲线，校准曲线如图1 所示。

取待测血清或尿液样本25μL，按相同的方法测定其△A，代入校准曲线，即可计算出待测样本中VEGF的含量。如果血清或尿液样本中VEGF的浓度超出校准曲线范围，需对样本进行稀释后再检测以保证检测结果的准确性。

实施例7 血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒的性能评价

1、检测灵敏度

以生理盐水为空白，稀释人尿液样本，配制浓度分别为0、5、10、50、100pg/mL 的样本，按上述的方法测定10 次，计算吸光度均值和标准差(SD)，以样本吸光度-2SD 大于空白吸光度+2SD的样本浓度作为该试剂盒的灵敏度。结果见表1 。从表1中可以看出，只有当浓度为10pg/mL及以上浓度时，样本的吸光度-2SD 大于空白吸光度+2SD（0.02），故本发明试剂盒的灵敏度为10pg/mL。

表1

	0pg/mL	5pg/mL	10pg/mL	50pg/mL	100pg/mL
						1	0.011	0.012	0.035	0.087	1.663
2	0.008	0.017	0.041	0.092	1.580
						3	0.014	0.015	0.032	0.081	1.712
4	0.011	0.019	0.027	0.085	1.645
						5	0.016	0.021	0.029	0.079	1.568
6	0.012	0.010	0.036	0.083	1.681
						7	0.007	0.011	0.042	0.089	1.599
8	0.009	0.009	0.033	0.078	1.633
						9	0.016	0.014	0.026	0.086	1.691
10	0.018	0.012	0.044	0.083	1.720
						均值	0.012	0.014	0.035	0.084	1.649
SD	0.004	0.004	0.006	0.004	0.054
						均值+2SD	0.020	0.022	0.047	0.093	1.757
均值-2SD	0.005	0.006	0.022	0.076	1.542

2、线性范围

VEGF浓度为1000pg/mL 的样本，用生理盐水做10 个不同比例的稀释后检测各浓度，每个浓度的样本重复测定3 次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行回收率分析，结果如表2，从表2中可知浓度在0-800pg/mL之间回收率偏差均小于10％，线性范围为0-800pg/mL。

表2

稀释比例	理论浓度（pg/mL）	检测浓度（pg/mL）	回收率（%）
				0/10	0.0	0.0
1/10	100.0	97.7	97.7%
				2/10	200.0	210.4	105.2%
3/10	300.0	308.7	102.9%
				4/10	400.0	412.4	103.1%
5/10	500.0	521.1	104.2%
				6/10	600.0	629.9	105.0%
7/10	700.0	736.4	105.2%
				8/10	800.0	867.1	108.4%
9/10	900.0	994.7	110.5%
				10/10	1000.0	1231.6	123.2%

3、精密度

分别对低浓度样本（浓度为53.2pg/mL）和高浓度样本（浓度为418.7pg/mL），连续测定10 次，分别计算变异系数均小于5%，精密度良好，见表3。

表3

4、准确度

对靶值为53.2pg/ml(50.64-59.76pg/ml)和418.7pg/ml(399.6-455.8pg/ml)的样品分别连续检测3 次，将检测结果均值与靶值范围进行测定偏差计算。结果如表4，从表4中可知本发明试剂盒测低值样本偏差小于10％，测高值样本偏差小于5％，准确度良好。

表4

上述的具体实施方式只是示例性的，是为了更好地使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。

Claims

1.一种血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂R1，试剂R2和血管内皮生长因子校准品，其特征在于，所述试剂R1包括3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液、聚乙二醇对异辛基苯基醚、BSA、甘氨酸、表面活性剂、防腐剂，所述试剂R2包括磷酸盐缓冲液、血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球、BSA、表面活性剂、海藻糖、甘露醇、蔗糖、PEG6000、防腐剂。

2. 如权利要求1所述的血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中各组分的用量分别为：3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液 0.01mol/L-0.1mol/L，聚乙二醇对异辛基苯基醚 10-50 mmol/L，BSA 0.1％-5％ (w/v)，表面活性剂 0.1％-3％(w/v)，甘氨酸0.12％-0.45％(w/v)，防腐剂 0.05％-1％(w/v)；所述试剂R2中各组分的用量分别为：磷酸盐缓冲液0.01 mol/L -0.15 mol/L，血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球1％(w/v)，BSA 0.1％-3％ (w/v)，表面活性剂 0.2％-5％(w/v)，海藻糖1％-5％(w/v)，蔗糖1％-5％(w/v)，PEG6000 0.1％-1％(w/v)，甘露醇0.02％-0.2％(w/v)，防腐剂 0.05％-1％(w/v)。

3.如权利要求1或2所述的血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂选自Tween-20、TritonX-100、NP-40中的一种或多种的组合。

4.如权利要求1或2所述的血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述防腐剂选自叠氮钠、Prolin300、硫柳汞中的一种或多种的组合。

5.如权利要求1所述的血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述血管内皮生长因子抗体选自鼠源、兔源或羊源抗体。

6.如权利要求5所述的血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述血管内皮生长因子抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

7. 如权利要求1所述的血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述胶乳微球的粒径为40-500nm，其表面修饰基团为-COOH、-NH₂、-SH、-OH、- CHO 中的一种。

8.如权利要求1所述的血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述血管内皮生长因子抗体包被的胶乳微球通过下述方法制备得到：

S1，采用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液冲洗胶乳微球；

S2，采用2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液重悬胶乳微球；

9.如权利要求1所述的血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述血管内皮生长因子校准品包括血管内皮生长因子蛋白、磷酸盐缓冲液、BSA和防腐剂。

10.如权利要求1所述的血管内皮生长因子胶乳增强免疫比浊试剂盒在检测血管内皮生长因子中的应用。