CN102759631B

CN102759631B - 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒

Info

Publication number: CN102759631B
Application number: CN201210273085.1A
Authority: CN
Inventors: 何仕钊
Original assignee: NANJING NORMAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Nanjing Norman Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2012-08-02
Publication date: 2016-05-11
Anticipated expiration: 2032-08-02
Also published as: CN102759631A

Abstract

本发明涉及一种定量检测降钙素原PCT的胶乳增强免疫比浊试剂盒，该试剂盒包括R1试剂：包含保护剂、反应增强剂、防腐剂和缓冲液；R2试剂：包含保护剂、防腐剂、缓冲液和包被抗人PCT抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒；和校准品：包含保护剂、防腐剂、缓冲液及PCT重组蛋白；所述R2试剂中抗人PCT抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒之间通过链亲和素-生物素连接；所述R2试剂中胶乳颗粒粒径为40~500nm。所述试剂盒可在生化分析仪和散射比浊分析仪上用于定量检测人体血液中PCT含量。本发明提供一种方便快速、灵敏度高、特异性强、定量准确的PCT检测试剂盒，它仪器兼容性强，检测成本低，弥补了临床上对PCT比浊产品的需求。

Description

一种定量检测降钙素原PCT的胶乳增强免疫比浊试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种采用胶乳增强免疫比浊法定量检测人体血液中降钙素原PCT的试剂盒。

背景技术

降钙素原（procalcitonin，PCT）为降钙素CT的前体物质，由116个氨基酸组成，分子量13kD，由N末端-降钙素-C末端三部分组成，其结构稳定，不受体内激素水平的影响，在人体内的半衰期为25-30小时，具有良好稳定性。体内产生PCT的主要部位在肝脏，其他如外周血单核细胞、脾、肺或小肠的神经内分泌细胞也是产生PCT的重要场所。内毒素、细胞因子可刺激PCT的释放。

PCT作为一种临床标志物，具有独特的优势。PCT在健康人血液中含量极低（＜0.05ng/ml），0.5ng/ml被认为是全身性感染（脓毒症）诊断的分界值。PCT在脓毒症患者中浓度显著增高，可达1000ng/ml。PCT与炎症的严重程度成正比，在SIRS（系统炎症反应综合征）、脓毒症（败血症）、严重脓毒症（败血症）及脓毒症（败血症）休克病人中PCT浓度有明显差异。PCT可在感染2小时后检测到，在感染后12-24小时达到高峰，在炎症消失后恢复正常。PCT在体内、外稳定性好，不受慢性炎症或自身免疫疾病影响，不受临床用药影响（OKT3除外），对于系统性细菌感染和脓毒症等具有高度敏感性和特异性。

临床研究表明，PCT检测在不同医学领域对多种疾病的诊断和治疗有很高的价值，可应用于ICU、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科和治疗实验室等众多科室。与目前所应用的诊断指标相比，PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息，涉及下列多种疾病的诊断、治疗项目：对败血症、系统性严重细菌感染（腹膜炎或软组织感染等）做早期诊断；对败血症和SIRS作鉴别诊断、细菌感染和非细菌性炎症反应（自身免疫性疾病等）的鉴别诊断、细菌感染和病毒感染的鉴别诊断（脑脊膜炎等）、器官移植术后鉴别诊断（细菌感染、病毒感染、排斥反应、真菌感染等）、对不明原因发烧（UFO）诊断及对特殊感染高危患者（重症监护室、器官移植术后、免疫抑制期）监测、脓毒性休克和非脓毒性休克的鉴别诊断。PCT与其他细菌感染的传统诊断指标，如：白细胞计数、血沉、C反应蛋白、细菌培养等比较，可实现早期、快速、更高的灵敏度和特异性；作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标更有助于医生及时准确了解患者的疾病状况，跟进疾病的进程，准确预后以及对治疗方法进行指导，为制定合理的抗生素应用方案提供依据，减少患者不必要的医疗支出和防止抗生素的滥用。

目前，检测PCT的方法有很多，不仅可以定性，亦可以定量，常用的方法有：凝胶层析及高效液相色谱分析、酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）、放射免疫测定（Radioimmunoassay，RIA）、免疫发光法和胶体金层析法。其中，凝胶层析及高效液相色谱分析费时且不易自动化；ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，多用于定性检测；RIA法既能检测游离PCT，又能检测结合型PCT，也可检测降钙素基因相关前体（Pro-CGRP），此法可信敏感度为4pg/ml，能检测正常人血清PCT，较双抗夹心法敏感，RIA缺点是所需时间较长，检测结果不稳定，重复性比ELISA差，且存在放射性污染危险。金标方法虽稳定性较好，但灵敏度较低，一般只能定性，不能定量，特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用，尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。免疫发光法采用两个抗原特异性抗体分别结合在PCT的不同位点。一株抗体是光标记（示踪物），而另一株则结合于试管内壁的包被物上。在孵育过程中，抗体与标本中的降钙素原分子结合形成夹心复合物，而光标抗体则结合于试管表面的包被物。反应完成后，清洗，将过剩的示踪物弃去，应用适当的光度计和发光检测试剂测量光信号，计算结合到管壁包被物上的剩余示踪物的量。光信号强度与PCT浓度成正比。应用已知的抗原浓度建立标准曲线，通过它就可求得血清或血浆中未知的PCT浓度。该方法特异性强，敏感性高，但需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员，一般多在特定医疗机构使用。

免疫比浊法的基本原理是当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应且比例合适（一般规定抗体过量）时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂（聚乙二醇等）作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。胶乳颗粒增强免疫比浊法（particle-enhancedturbidimetricimmunoassay，PETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，在高分子胶乳微球的表面交联特异性抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能，反应液散光性能或透光性能（即吸光度）的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定，抗原抗体反应后可直接测定反应液的吸光度值，省去了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足以检测到健康人血液中许多标志蛋白的下限值，而且可用于自动化仪器检测。目前市售各种胶乳免疫比浊检测产品检测低限多限于0.1μg/ml，而这一检测低限对于降钙素原比浊产品应用于临床是远远不够的，降钙素原0.5ng/ml是全身性感染（脓毒症）诊断的分界值，下呼吸道细菌感染患者PCT浓度可能还低于这一临界值（≥0.25ng/ml且<0.5ng/ml），因此开发灵敏度更高、特异性更强、稳定性更好、抗干扰能力更强的PCT免疫比浊产品，仍是临床诊断产品研究领域亟需解决的重要问题。

在免疫检测技术中，采用改善的包被技术，提高检测试剂中载体上连接的与待检标本发生免疫反应的成份的浓度，是提高临床检测产品的灵敏度的重要途径。生物素-亲和素系统是一种在多种免疫检测技术中连接检测试剂中载体和检测抗体（或抗原）的包被系统。生物素分子有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；II环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物—活化生物素。生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。亲和素主要包括卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素及类亲和素等。后两种因其特异性亲和力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。亲和素（avidin，AV）和链亲和素（streptavidin，SA）是生物素的天然特异性结合物，二者均为大分子蛋白。亲和素亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pI为10~10.5，耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用。每个亲和素能结合4个分子的生物素，其亲和常数Ka高达10¹⁵mol/L。链亲和素与亲和素具有类似生物学特性，由Streptomycesavidin链霉菌在培养过程中分泌，分子量为65kD，每个SA分子也具有4个可与生物素分子结合的位点，其亲和常数Ka与AV相同，约为抗原抗体间Ka（10⁵～10¹¹mol/L）的1万倍以上。SA与AV的ka虽然相同，但在实际应用中其检测灵敏度明显优于AV。AV的高pI及高含糖结构导致在聚苯乙烯板和硝酸纤维素膜上或与组织细胞DNA结合时，易产生一定程度的非特异性结合，造成较高的显色背景，而SA较AV在应用中明显克服了这一缺点。生物素-亲和素（链亲和素）系统具有以下显著特点：高特异性、高灵敏度、简易、快速、安全、稳定和适用性。生物素亲和素的结合反应因亲和力而呈现高度专一性。生物素-亲和素系统（BAS）可通过4个结合位点多价桥联生物素化的大分子衍生物和标记物，极大提高检测方法的灵敏度。BAS可与多种标记系统如酶、荧光素、铁蛋白、凝集素、SPA、放射性核素等联合用于抗原、抗体、蛋白、激素、受体、核酸系统等多种生物学反应体系，也可作为亲合介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。因此，BAS有着极广的研究与应用价值。另外，生物素化的大分子蛋白、核酸、酶等物质不仅保持其活性不受影响，更因生物素化形成许多“触手”的多价制剂，使整个反应体系出现多级放大效应，因而赋予BAS极高的灵敏性。同时，BAS的高度特异性及灵敏性，使其在反应体系应用中用量极微，故成本低廉。生物素-亲和素（链亲和素）系统成为免疫学、分子生物学领域中广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术系统之一。在免疫诊断领域，生物素-亲和素（链亲和素）系统应用于ELISA、免疫组化及放射免疫、金标技术已开发出多种有助于灵敏度提高的检测产品。

发明内容

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种检测浓度范围达0.2-100ng/ml，且快速、准确、灵敏度高、特异性强，可在半自动、全自动生化分析仪及散射比浊分析仪上应用，适用于需要快速获取降钙素原PCT检测结果的常规和急诊用途的降钙素原（PCT）胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种定量检测降钙素原PCT的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包括降钙素原R1试剂、降钙素原R2试剂和降钙素原校准品；所述R1试剂包含保护剂A、反应增强剂、防腐剂和缓冲液A；所述R2试剂包含保护剂B、防腐剂、缓冲液B和包被抗人降钙素原抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，所述R2试剂中抗人降钙素原抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒之间通过链亲和素-生物素系统连接；所述R2试剂中胶乳颗粒的粒径为40~500nm；所述校准品包含保护剂C、防腐剂、缓冲液C及降钙素原重组蛋白。

所述R2试剂中的抗人降钙素原抗体选自多克隆抗体和单克隆抗体中的一种，优选多克隆抗体。所述降钙素原抗体可为鼠源、兔源或羊源抗体，优选羊源抗体。

所述R2试剂中的包被抗人降钙素原抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒是通过分别制备生物素化抗人降钙素原抗体、链亲和素包被的聚苯乙烯胶乳颗粒，并将所述生物素化抗人降钙素原抗体与所述链亲和素包被的聚苯乙烯胶乳颗粒混合孵育而制成，在所述生物素化抗人降钙素原抗体制备中，所述抗人降钙素原抗体与生物素的摩尔比为1：1~1：100，优选1：10。

所述R2试剂中的胶乳颗粒与抗人降钙素原抗体通过链亲和素-生物素系统连接。链亲和素-生物素系统可极大地提高检测方法的灵敏度，同时不增加非特异干扰。此外，链亲和素-生物素结合很稳定，不会因反应试剂的高度稀释而受影响，保证了检测结果的准确性。

所述聚苯乙烯胶乳颗粒可为羧基化或氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，优选羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒。羧基化胶乳颗粒经碳化二亚胺（EDAC）活化或氨基化胶乳颗粒经戊二醛活化后再进行链亲和素包被，胶乳颗粒的粒径范围为40-500nm。

上述技术方案中所述生物素一般选用已活化的产品，抗体的生物素标记反应温和，很少抑制抗体活性，标记抗体稳定，能被链亲和素结合，且背景水平很低，结合紧密迅速。生物素与抗体共价结合常见为生物素酰基化反应，将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳化二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS）。BNHS分子酯键中的-C=O基团可与抗体分子中赖氨酸的氨基形成肽键，从而使抗体标记上生物素。生物素的分子量较小，当与抗体或酶反应形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可能对生物素与链亲和素间的结合以及系统的应用效果造成干扰。此时可通过在生物素分子侧链上连接一定数量的基团，形成连接臂，增加生物素与被标记大分子间的距离（如长臂活化生物素），减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。

生物素标记抗体时，活化生物素与待标记抗体应有适当的比例，使每个抗体分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围。与生物素结合后，抗体的活性可能会降低，这种情况常发生在保持抗体活性所必需的游离氨基基团和生物素过多的结合，此时，生物素化会降低或破坏抗体的抗原结合能力。本发明在所述生物素化PCT抗体制备中，所述抗人降钙素原抗体与生物素的摩尔比优选1：10。

上述技术方案中所述R2试剂中的包被抗人降钙素原抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒质量体积比终浓度为0.04~0.16%，优选0.05~0.1%。

牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）和明胶，能够保护胶乳颗粒表面交联的抗体。所述保护剂A选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和明胶中的一种或多种，优选牛血清白蛋白，所述保护剂A的浓度为1~10mg/ml，优选2~5mg/ml；所述保护剂B选自牛血清白蛋白和卵清蛋白中的一种或两种，优选牛血清白蛋白，所述保护剂B的浓度为1~10mg/ml，优选4~8mg/ml；所述保护剂C为牛血清白蛋白，浓度为0.5~8mg/ml，优选1~5mg/ml。

所述降钙素原R1试剂中包括缓冲液A，其中所述缓冲液A选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，优选Tris-HCl缓冲液或硼酸盐缓冲液；所述缓冲液A的浓度为20~200mM，优选50~100mM，pH为6~10，优选8~8.5；所述降钙素原R2试剂中包括缓冲液B，其中所述缓冲液B选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，优选甘氨酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液B的浓度为20~200mM，优选50~100mM，pH为7~9，优选8~8.5。

上述技术方案中所述反应增强剂选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇20000中的一种或多种，优选聚乙二醇6000；所述反应增强剂的质量体积比为1~5%，优选5%。聚乙二醇PEG是非离子型水溶性聚合物，有很强的亲水性，可以破坏溶液中蛋白质周围的电子云和水化层，促进特异性的抗原和抗体分子靠近并结合形成大分子复合物。

所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种或多种，优选叠氮钠，所述防腐剂的质量体积比为0.03~0.2%，优选0.1%。

上述技术方案中所述R2试剂的制备方法包括以下步骤：

1）胶乳粒子的活化、洗涤

将商品化的聚苯乙烯胶乳溶液活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1%，所述洗涤缓冲液选自PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种；

2）链亲和素包被胶乳颗粒

①取1m1活化洗涤后的胶乳溶液，加入链亲和素，使链亲和素终浓度为0.1~1mg/ml；混匀后，置4~37℃摇床以220rpm转速包被4~18h；

②用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的链亲和素，重复3次；

③封闭：将洗涤后的包被链亲和素的胶乳颗粒溶于包含所述保护剂B的缓冲液B中，使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1~0.3%；

3）抗人降钙素原抗体的生物素化

生物素选用商品化的已活化产品，将所述生物素与所述抗人降钙素原抗体混合，室温下反应1-4h，离心，除去其中少量的沉淀物，将上清装入透析袋中，在0～4℃下置于PBS缓冲液中透析过夜；所述抗人降钙素原抗体与所述生物素的摩尔比为1：1~1：100，优选1：10；

4）生物素化降钙素原抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接

在步骤2）中所得的链亲和素包被的胶乳颗粒溶液中加入步骤3）中所得的生物素化抗人降钙素原抗体，混匀后置37℃摇床孵育0.5~2h，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人降钙素原抗体复合物；

5）清洗

将步骤4）中形成的胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人降钙素原抗体复合物溶液离心，弃上清，重复清洗3次；将末次沉淀溶于含所述保护剂B和防腐剂的缓冲液B中，使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.04~0.16%。

所述的降钙素原胶乳增强免疫比浊试剂盒可在半自动、全自动生化分析仪及散射比浊分析仪上用于定量检测人体血液中降钙素原的含量，其中所述血液包括全血、血清及血浆。当所述试剂盒在半自动、全自动生化分析仪上用于检测降钙素原含量时，建议采用血清或血浆样本进行检测；当所述试剂盒在散射比浊分析仪上用于检测降钙素原含量时，可采用全血、血清及血浆样本进行检测。

本发明与现有技术相比，具有如下特点：

1）本发明试剂盒在胶乳增强免疫比浊原理基础上进一步采用了链亲和素-生物素放大系统，大大提高了比浊试剂的检测灵敏度，本发明试剂盒的最低检测限可达0.2ng/ml，满足了临床应用的需求。

2）本发明试剂盒可在散射比浊分析仪上实现多样本类型灵活快速定量检测。市售降钙素原PCT检测多采用血清或血浆进行检测，不能满足临床快速检测需求，本发明试剂盒当在散射比浊分析仪上使用时可采用的样本类型包括全血、血清或血浆，可在临床多科室应用。市售PCT检测约需半小时左右的时间，而本发明试剂盒从样本采集到出具检测结果最快只需2-3分钟，为患者争取了更多的宝贵时间，可对患者病情进行动态检测。

3）本发明试剂盒与进口试剂盒对同一样本的PCT含量检测结果经统计分析，结果相关性好，无显著差异，检测结果准确可靠，在临床上可以替代进口产品使用，大幅降低检测成本。

附图说明

图1为本发明降钙素原试剂盒实施例的校准曲线；

图2为本发明降钙素原试剂盒实施例的线性范围相关性；

图3为本发明降钙素原试剂盒实施例与罗氏PCT试剂盒检测结果的相关性比较。

具体实施方式

本发明公开了一种定量检测降钙素原PCT含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或者适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

一、降钙素原测定试剂盒的制备

1、降钙素原R1试剂配制

三羟甲基氨基甲烷（Tris）浓度为0.2M，用盐酸调节pH为8.0。再加入BSA、PEG6000及叠氮钠，使终浓度为：BSA5mg/ml、PEG60005%（w/v）、叠氮钠0.1%（w/v）。

2、降钙素原R2试剂配制

1）胶乳粒子的活化、洗涤

取10.1%羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒溶液（BangsLaboratories,Inc.，粒径为200nm）100μl，向胶乳溶液中加入6mg/mlEDAC溶液1.68ml，置于37℃往复式摇床中反应0.5h。12000rpm离心30min，弃上清，加入50mMpH6.5MES缓冲液洗涤三次，将沉淀分散于50mMpH6.5MES缓冲液中，使胶乳颗粒浓度为1%（w/v）。

2）链亲和素包被胶乳颗粒

取1ml活化洗涤后的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液，加入2mg/ml链亲和素溶液500μl，混匀，置37℃往复式摇床以220rpm转速包被16h，以12500rpm离心20min，弃上清；将沉淀物溶于0.1MpH7.4PBS缓冲液，混匀，以12500rpm离心20min，弃上清，而后重复洗涤两次去除未与胶乳粒子结合的链亲和素；将链亲和素包被的胶乳颗粒沉淀物溶于含4mg/mlBSA的20mMpH8.0甘氨酸缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为0.3%（w/v）。

3）生物素化降钙素原抗体的制备

用0.1MpH9.5碳酸盐缓冲液将6mg/ml羊抗人PCT多克隆抗体（上海叶民生物技术有限公司）稀释成2mg/ml的抗体溶液，每毫升抗体溶液中加入二甲基甲酰胺溶解的BNHS（5mg/ml）10μl，混匀，于室温（22℃）反应1h，离心，除去其中少量的沉淀物，将上清装入透析袋中，在4℃环境中置于0.1MpH7.4PBS缓冲液透析24h。

4）生物素化降钙素原抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接

在1ml步骤2）制备的链亲和素包被胶乳颗粒溶液中加入400μl步骤3）制备的生物素化抗体溶液，混匀，置37℃摇床1h，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-PCT多克隆抗体连接复合物。12500rpm速度离心20min，弃上清，将沉淀物溶于0.1MpH7.4PBS缓冲液，混匀，12500rpm离心20min，弃上清，而后重复洗涤两次；将末次沉淀溶解于含4mg/mlBSA及0.1%叠氮钠的50mMpH8.0甘氨酸缓冲液中。

3、PCT校准品配制

将市售人降钙素原重组蛋白溶于类似人血清基质的溶液（NaCl0.8%，BSA0.2%，NaN₃0.4%，Tris-HClpH8.0）中，制成不同浓度的校准品。以进口的罗氏公司降钙素原校准品为原始标准，采用其降钙素原试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次，求出均值，得到降钙素原校准品的浓度：0.2，1，3，10，30，100ng/ml。

二、降钙素原试剂盒的检测方法

1、生化分析仪检测

以日立7020操作为例：测定波长为600nm，分别取不同浓度的校准品溶液（20μl），加入降钙素原R1试剂（240μl），混匀，37℃孵育5分钟后，加入降钙素原R2试剂（80μl），混匀，37℃孵育1分钟后，读取各管吸光度值A₁，反应4~5分钟后，读取各管吸光度值A₂，计算吸光度差值ΔA=A₂－A₁，每管重复测定3次，以各校准管3次测得的吸光度差值ΔA的平均值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制“浓度-吸光度差值”校准曲线（见图1）。

取待测血清或血浆样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中降钙素原PCT的含量。如果血清或血浆中降钙素原的浓度超出校准曲线范围，需对样本进行稀释后再检测以保证检测结果的准确性。

本试剂盒不仅适用于日立7020，还适用于其它品牌和型号的半自动、全自动生化分析仪，具体参数可根据仪器进行调整。

2、NORMAN系列散射比浊分析仪检测

将全血35μl（血清或血浆20μl）加入样品反应杯中，然后加入试剂R1240μl，混匀，等反应杯中的散射光强度稳定后，加入试剂R280μl，混匀，在1-2分钟之内，测定散射光强度的变化差值ΔA，将ΔA代入校准曲线，即可计算出待测样本中降钙素原的含量。

三、检测试剂盒的分析性能评估

1、线性范围

用接近线性范围上限的降钙素原高浓度样本（100.20ng/ml），用生理盐水将其按1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64稀释，共配制成6个稀释浓度（xi）的溶液，用所述生化分析仪检测方法测定各稀释样本浓度。每个浓度重复测定3次，分别求出测定结果的平均值（yi）。以稀释浓度（xi）为自变量，以测定结果平均值（yi）为因变量求出线性回归方程。按公式（1）计算线性回归的相关系数r，结果显示回归方程为y=1.0086x-0.1464，相关系数r=0.9998，表明本发明试剂盒在0.2ng/ml-100ng/ml线性范围内相关性较好（见图2）。

r = \frac{Σ [(x_{i} - \overset{&OverBar;}{x}) (y_{i} - \overset{&OverBar;}{y})]}{\sqrt{Σ {(x_{i} - \overset{&OverBar;}{x})}^{2} Σ {(y_{i} - \overset{&OverBar;}{y})}^{2}}} . . . . . . (1)

2、灵敏度（最低检测限）

以5%牛血清白蛋白溶液为空白样本，按所述生化分析仪检测方法重复测定20次，以空白均值加两倍标准差报告最低检测限，结果显示本发明试剂盒的最低检测限为0.2ng/ml。

3、重复性和准确度

用AUDIT公司标示值分别为0.67ng/ml和51.4ng/ml的降钙素原校准品作为样本，按所述生化分析仪检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差（S），以计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为2.86%和1.38%；以计算相对偏差进行准确度考察，其相对偏差分别为1.49%和0.79%。

表1降钙素原试剂盒的重复性和准确度考察

4、批间差

按本发明实施例所述方法制备三批试剂盒，用三批试剂盒对同一份血清样本进行重复测定，每个批号重复测定3次，分别计算每批3次测定的均值按公式（2）、（3）计算相对偏差（R），结果显示相对偏差R为2.68%。

\overset{&OverBar;}{x} = \frac{\overset{&OverBar;}{x_{1}} + \overset{&OverBar;}{x_{2}} + \overset{&OverBar;}{x_{3}}}{3} . . . . . . . . . . . . . . . (2)

R = \frac{{\overset{&OverBar;}{x}}_{\max} - {\overset{&OverBar;}{x}}_{\min}}{\overset{&OverBar;}{x}} \times 100 % . . . . . . (3)

式中：中的最大值；

中的最小值；

三批试剂检测均值。

表2降钙素原试剂盒的批间差考察

5、干扰实验

取浓度为0.67ng/ml的降钙素原校准品溶液，分别加入相同体积的各干扰物质溶液，使加入后的各干扰物质浓度分别为血红蛋白10g/L、胆红素684μmol/L、甘油三酯20g/L，用本发明试剂盒对每个制备样本重复测定3次，取平均值，与加入相同体积蒸馏水的样本比较，观察加入干扰物质与加入蒸馏水后PCT测定值的相对偏差。结果显示，加入以上浓度干扰物质测定值与加入同体积蒸馏水后测定值相对偏差不超过4%。当检测样本中存在一定浓度的干扰物质包括血红蛋白、胆红素和甘油三酯，对本发明试剂盒的测定结果影响很小。

6、稳定性

对本发明试剂盒进行开瓶稳定性和长期稳定性考察。

开瓶稳定性：将本发明试剂盒开瓶后置于2℃-8℃保存30天后，取出按所述生化分析仪检测方法测定AUDIT公司标示值分别为0.67ng/ml和51.4ng/ml的降钙素原校准品，各浓度重复测定3次，计算检测结果与标示值的相对偏差。结果显示，开瓶30天后本发明试剂盒检测值与标示值的相对偏差分别为1.99%和1.12%，开瓶稳定性较好。

长期稳定性：将本发明试剂盒置于2℃-8℃保存12个月后，取出按所述生化分析仪检测方法测定AUDIT公司标示值分别为0.24ng/ml和45.9ng/ml的降钙素原校准品，各浓度重复测定3次，计算检测结果与标示值的相对偏差。结果表明，本发明试剂盒检测值与标示值的相对偏差分别为2.78%和1.32%，试剂盒在2℃-8℃保存12个月是比较稳定的。

表3降钙素原试剂盒的开瓶及长期稳定性考察

四、本发明试剂盒与已上市产品的比较

南京军区总医院提供79例住院患者血清，其中男性45例，女性34例，平均年龄39岁。79例样本中有21例采自血培养等病原微生物检测阳性的患者，分离的病原微生物前3位分别为：大肠杆菌，肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌。用本发明降钙素原测定试剂盒和市售进口罗氏降钙素原电化学发光试剂盒分别对样本重复测定2次，分别计算平均值，对79例样本检测结果进行线性回归分析，计算两种试剂盒检测结果的相关系数。

结果显示，两种试剂盒检测结果的相关系数r=0.9986，线性回归方程为y=0.9475x+0.1073（见图3）。根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）文件要求（r>0.975），本发明降钙素原测定试剂盒和市售进口罗氏降钙素原电化学发光试剂盒具有很好的一致性。由此可见本发明降钙素原测定试剂盒在临床上可以代替进口试剂盒使用，降低检测成本，减轻患者的经济负担。

Claims

1.一种定量检测降钙素原的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包括降钙素原R1试剂、降钙素原R2试剂和降钙素原校准品；

所述R1试剂包含保护剂A、反应增强剂、防腐剂和缓冲液A；

所述R2试剂包含保护剂B、防腐剂、缓冲液B和包被抗人降钙素原抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，所述R2试剂中抗人降钙素原抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒之间通过链亲和素-生物素系统连接，所述R2试剂中胶乳颗粒的粒径为40～500nm，所述R2试剂中的包被抗人降钙素原抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒质量体积比终浓度为0.04～0.16％；

所述校准品包含保护剂C、防腐剂、缓冲液C及降钙素原重组蛋白，

其中，所述保护剂A选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和明胶中的一种或多种，并且所述保护剂A的浓度为1～10mg/ml；所述保护剂B选自牛血清白蛋白和卵清蛋白中的一种或两种，并且所述保护剂B的浓度为1～10mg/m；所述保护剂C为牛血清白蛋白，浓度为0.5～8mg/ml，

其中，所述缓冲液A选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，并且，所述缓冲液A的浓度为20～200mM，pH为6～10；所述缓冲液B选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，并且所述缓冲液B的浓度为20～200mM，pH为7～9，

其中，所述反应增强剂选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇20000中的一种或多种，并且所述反应增强剂的质量体积比为1～5％，

其中，所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞和Proclin300中的一种或多种，并且所述防腐剂的质量体积比为0.03～0.2％。

2.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中的抗人降钙素原抗体选自多克隆抗体和单克隆抗体中的一种。

3.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中的抗人降钙素原抗体为多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中的包被抗人降钙素原抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒是通过分别制备生物素化抗人降钙素原抗体、链亲和素包被的聚苯乙烯胶乳颗粒，并将所述生物素化抗人降钙素原抗体与所述链亲和素包被的聚苯乙烯胶乳颗粒混合孵育而制成，在所述生物素化抗人降钙素原抗体制备中，所述抗人降钙素原抗体与生物素的摩尔比为1：1～1：100。

5.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述抗人降钙素原抗体与生物素的摩尔比为1：10。

6.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中的包被抗人降钙素原抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒质量体积比终浓度为0.05～0.1％。

7.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述保护剂A为牛血清白蛋白并且所述保护剂A的浓度为2～5mg/ml；所述保护剂B为牛血清白蛋白并且所述保护剂B的浓度为4～8mg/ml；所述保护剂C的浓度为1～5mg/ml。

8.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述缓冲液A为Tris-HCl缓冲液或硼酸盐缓冲液，并且所述缓冲液A的浓度为50～100mM，pH为8～8.5；所述缓冲液B为甘氨酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，并且所述缓冲液B的浓度为50～100mM，pH为8～8.5。

9.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述反应增强剂为聚乙二醇6000，并且所述反应增强剂的质量体积比为5％。

10.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠，所述防腐剂的质量体积比为0.1％。

11.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述R2试剂的制备方法包括以下步骤：

1)胶乳粒子的活化、洗涤

将商品化的聚苯乙烯胶乳溶液活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次；

将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1％，所述洗涤缓冲液选自PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种；

2)链亲和素包被胶乳颗粒

①取1ml活化洗涤后的胶乳溶液，加入链亲和素，使链亲和素终浓度为0.1～1mg/ml；混匀后，置4～37℃摇床以220rpm转速包被4～18h；

②用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的链亲和素，重复3次；

③封闭：将洗涤后的包被链亲和素的胶乳颗粒溶于包含所述保护剂B的缓冲液B中，使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1～0.3％；

3)抗人降钙素原抗体的生物素化生物素选用商品化的已活化产品，将所述生物素与所述抗人降钙素原抗体混合，室温下反应1-4h，离心，除去其中少量的沉淀物，将上清装入透析袋中，在0～4℃下置于PBS缓冲液中透析过夜；所述抗人降钙素原抗体与所述生物素的摩尔比为1：1～1：100；

4)生物素化降钙素原抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接

在步骤2)中所得的链亲和素包被的胶乳颗粒溶液中加入步骤3)中所得的生物素化抗人降钙素原抗体，混匀后置37℃摇床孵育0.5～2h，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人降钙素原抗体复合物；

5)清洗

将步骤4)中形成的胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人降钙素原抗体复合物溶液离心，弃上清，重复清洗3次；将末次沉淀溶于含所述保护剂B和防腐剂的缓冲液B中，使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.04～0.16％。

12.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，在所述R2试剂的制备方法中，所述抗人降钙素原抗体与所述生物素的摩尔比为1：10。

13.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述试剂盒可在半自动、全自动生化分析仪及散射比浊分析仪上用于定量检测人体血液中降钙素原的含量。