CN109187997A - 一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法。本发明采用的技术方案是:一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，R1试剂包括缓冲液、促进剂、防腐剂，R2试剂包括缓冲液、稳定剂、偶联有RLP‑C单克隆抗体‑生物素‑链霉亲和素的胶乳微球、防腐剂。本发明的优点是:本发明的测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒,采用胶乳微球连接链霉亲和素1:1，RLP‑C单克隆抗体连接生物素1:2，二者再以1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到0.1‑8mg/L。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法。
背景技术
脂蛋白残粒(remnant lipoprotein，RLP)又称富含甘油三酯 (triglyceride，TG)，脂蛋白残粒(TRL)是乳糜微粒(chylomicron，CM)和极低密度脂蛋白(verylowdensitylipoprotein，VLDL)经脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase，LPL)水解逐渐失去甘油三酯、磷脂、脂蛋白A，apoA)和apoC后，转变成的富含胆固醇、胆固醇脂和apoE的较小颗粒。
近年来，随着对脂蛋白残粒的深入了解，RLP测定的临床意义日趋受重视。大量研究表明，浓度在动脉粥样硬化性疾病及动脉粥样相关的疾病(如Ⅱ型糖尿病、Ⅲ型高脂血症和慢性肾功能衰竭及肥胖患者)中显著增加。另外，从人动脉粥样斑块中分离的脂蛋白在结构上与富含TG脂蛋白残粒相似。因此，血清或血浆脂蛋白残粒胆固醇 (RLP-C)水平升高是动脉粥样硬化性疾病和冠心病(coronary heart、 disease，CHD)以及与动脉粥样硬化性有关的代谢性疾病的重要危险因素。所以，准确、快速测定RLP非常重要。常规方法中采用胶乳微球直接偶联RLP-C抗体，我公司采用该方法发现灵敏度和线性范围均较差。因此，应该提供一种新的技术方案解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是：提供一种灵敏度高，重复性好的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，包括试剂R1 和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2包括第二缓冲液、保存液、偶联有RLP-C单克隆抗体- 生物素-链霉亲和素的胶乳微球，所述第二缓冲液的浓度为 8.05-27.30g/L，所述保存液的各组分及浓度包括：
N,N-二羟乙基甘氨酸 1.26-9.83g/L
稳定剂 0.5-2.0g/L
第二防腐剂 0.8-2.0ml/L
胶乳微球偶联物的各组份及浓度包括：
胶乳微球0.01-3.0％
生物素 5-20 g/L
链霉亲和素 5-20 g/L
脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体 0.05-3.0g/L
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 0.005-0.3g/L。
进一步的技术方案：
所述试剂R1中的第一缓冲液A、第一缓冲液B以及试剂 R2中的第二缓冲液均为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris 缓冲液、甘氨酸缓液中的一种或几种的组合。
优选的，所述第一缓冲液A为二水合磷酸二氢钠、第一缓冲液B为十二水合磷酸氢二钠，第二缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物。
所述试剂R1和R2中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、 Proclin-300、硫柳汞中的一种或几种的组合。
所述试剂R2中稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、甘露醇中的一种或几种的组合。
优选的，所述试剂R2中稳定剂为牛血清白蛋白。
胶乳微球所选粒径为90-280nm，其表面修饰基团为羧基或氨基中的一种。
所述试剂R1pH在6.80-8.00之间，试剂R2pH在6.30-8.50 之间。
生物素结合RLP-C单克隆抗体比例为1:1-3:1之间，链霉亲和素结合生物素-RLP-C单克隆抗体比例为0.5:1-4:1之间。
测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，以0.8-3.2g/L标准，边搅拌边投入第一缓冲液A，以8.75-24.31g/L的标准投入第一缓冲液B，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.80-8.00之间，之后以5.8-20.0g/L标准，投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以 40-120g/L、0.8％-2.0％的标准，依次投入PEG 6000、第一防腐剂, 投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
b1、缓冲液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以8.05-27.30g/L的标准，边搅拌边投入第二缓冲液，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.30-8.50之间，继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
b2、保存液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以 1.26-9.83g/L的标准边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌 5-30分钟至物料完全溶解，调节pH值到6.30-8.50之间，之后以0.5-2.0g/L标准，投入稳定剂，待物料完全溶解后，再以 0.8-2.0ml/L标准，投入第二防腐剂，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
b3、胶乳微球抗体偶联物的制备，胶乳微球所选粒径为 90-280nm，其表面修饰基团为羧基或氨基中的一种将胶乳微球以缓冲液稀释到0.01-3.0％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，将脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以反应液稀释到0.05-3.0g/L的浓度,与生物素按3:1-1:1的比例结合后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，链霉亲和素结合生物素-RLP-C单克隆抗体比例为0.5:1-4:1 之间，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.005-0.3g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应100-140分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应80-100 分钟，将混合液以14000rpm的转速离心15-45分钟，吸去上清液，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，进行标识。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒,采用胶乳微球连接链霉亲和素1:1，RLP-C单克隆抗体连接生物素1:2，二者再以1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到 0.1-8mg/L。
附图说明
图1是本发明实施例4中R2试剂未采用级联放大偶联的定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度，Y轴表示吸光度。
图2是本发明实施例4中R2试剂采用级联放大偶联的定标曲线图。其中X轴表示标准品浓度，Y轴表示吸光度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：
实施例1:
一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，包括试剂R1 和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液A 的二水合磷酸二氢钠，其浓度为0.8g/L，作为第一缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为24.31g/L，作为第一电解质的氯化钠，其浓度为5.8g/L,作为第一高分子促进剂的PEG 6000，其浓度为 40g/L，以及作为第一防腐剂的Proclin-950，其浓度为2.0％。
所述试剂R2包括第二缓冲液、保存液、偶联有RLP-C单克隆抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球，所述第二缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，其浓度为8.05g/L；所述保存液包括：浓度为 9.83g/L的N,N-二羟乙基甘氨酸、作为稳定剂的牛血清白蛋白，其浓度为0.5g/L的，作为第二防腐剂的Proclin-950，其浓度为0.8 ml/L；胶乳微球偶联物的各组份及浓度包括：浓度为3.0％的胶乳微球，浓度为5g/L的生物素，浓度为5g/L的链霉亲和素，浓度为 0.05g/L的脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以及浓度为0.005g/L的 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
以上测定测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为0.8 g/L二水合磷酸二氢钠和浓度为24.31g/L的十二水合磷酸氢二钠，搅拌30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为6.8，之后投入浓度为5.8g/L的氯化钠，待物料完全溶解后，再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和Proclin-950，以上两者的浓度分别为40g/L和2.0％，投料完成后，继续搅拌5分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
b1、缓冲液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以8.05g/L的标准，边搅拌边投入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌5分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为6.30，继续搅拌5分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
b2、保存液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以9.83 g/L的标准边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌5分钟至物料完全溶解，调节pH值为6.30，之后以0.5g/L标准，投入牛血清白蛋白，待物料完全溶解后，再以0.8ml/L标准，投入Proclin-950，继续搅拌30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
b3、胶乳微球抗体偶联物的制备，胶乳微球所选粒径为90nm，其表面修饰基团为羧基，将胶乳微球以缓冲液稀释到3.0％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，将脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以反应液稀释到0.05g/L的浓度,与生物素按2:1的比例结合后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，链霉亲和素结合生物素-RLP-C 单克隆抗体比例为1:1，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.005g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应100分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应80分钟，将混合液以14000rpm的转速离心15分钟，吸去上清液，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，进行标识。
实施例2
一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，包括试剂R1 和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括作为第一缓冲液A 的二水合磷酸二氢钠，其浓度为3.2g/L，作为第一缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为8.75g/L，作为第一电解质的氯化钠，其浓度为20.0g/L,作为第一高分子促进剂的PEG 6000，其浓度为80g/L，作为第一防腐剂的Proclin-300，其浓度为0.8％，所述试剂R2包括第二缓冲液、保存液、偶联有RLP-C单克隆抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球，所述第二缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，其浓度为27.30g/L；所述保存液包括：浓度为5.0g/L的N,N-二羟乙基甘氨酸、作为稳定剂的酪蛋白，其浓度为2.0g/L的，作为第二防腐剂的Proclin-300，其浓度为2.0ml/L；胶乳微球偶联物的各组份及浓度包括：浓度为0.01％的胶乳微球，浓度为20g/L的生物素，浓度为20g/L的链霉亲和素，浓度为3.0g/L的脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以及浓度为0.3g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
以上测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为3.2 g/L二水合磷酸二氢钠和浓度为8.75g/L的十二水合磷酸氢二钠，搅拌5分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为7.3，之后投入浓度为20g/L的氯化钠，待物料完全溶解后，再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和Proclin-300，以上两者的浓度分别为80g/L和0.8％，投料完成后，继续搅拌30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
b1、缓冲液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以27.3g/L的标准，边搅拌边投入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到7，继续搅拌18分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
b2、保存液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以5.0g/L 的标准边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌18分钟至物料完全溶解，调节pH值为7，之后以2.0g/L标准，投入酪蛋白，待物料完全溶解后，再以2.0ml/L标准，投入Proclin-300，继续搅拌18分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
b3、胶乳微球抗体偶联物的制备，胶乳微球所选粒径为190nm，其表面修饰基团为氨基，将胶乳微球以缓冲液稀释到0.01％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，将脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以反应液稀释到3.0g/L的浓度,与生物素按3:1的比例结合后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，链霉亲和素结合生物素-RLP-C单克隆抗体比例为4:1，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.3g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应120分钟，加入酪蛋白封闭，振荡混匀，室温反应60分钟，将混合液以14000rpm的转速离心30分钟，吸去上清液，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，进行标识。
实施例3
一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，包括试剂R1 和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括作为第一缓冲液A 的二水合磷酸二氢钠，其浓度为2g/L，作为第一缓冲液B的十二水合磷酸氢二钠，其浓度为16g/L，作为第一电解质的氯化钠，其浓度为12g/L,作为第一高分子促进剂的PEG 6000，其浓度为120g/L，作为第一防腐剂的硫柳汞，其浓度为1.0％，所述试剂R2包括第二缓冲液、保存液、偶联有RLP-C单克隆抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球，所述第二缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，其浓度为 16.80g/L；所述保存液包括：浓度为1.26g/L的N,N-二羟乙基甘氨酸、作为稳定剂的甘露醇，其浓度为1.2g/L的，作为第二防腐剂的叠氮钠，其浓度为1.5ml/L；胶乳微球偶联物的各组份及浓度包括：浓度为1.5％的胶乳微球，浓度为13g/L的生物素，浓度为13g/L的链霉亲和素，浓度为1.5g/L的脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以及浓度为0.15g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
以上测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边投入浓度为2g/L 二水合磷酸二氢钠和浓度为16g/L的十二水合磷酸氢二钠，搅拌18 分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为8.0，之后投入浓度为12g/L的氯化钠，待物料完全溶解后，再按照上述投料方式依次投入PEG 6000和硫柳汞，以上两者的浓度分别为120g/L和1.0％，投料完成后，继续搅拌18分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
b1、缓冲液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以16.8g/L的标准，边搅拌边投入2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物，搅拌18分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到7，继续搅拌30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
b2、保存液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以1.26 g/L的标准边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌30分钟至物料完全溶解，调节pH值为8.5，之后以1.2g/L标准，投入甘露醇，待物料完全溶解后，再以1.5ml/L标准，投入叠氮钠，继续搅拌5分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
b3、胶乳微球抗体偶联物的制备，胶乳微球所选粒径为280nm，其表面修饰基团为羧基将胶乳微球以缓冲液稀释到1.5％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，将脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以反应液稀释到3g/L的浓度,与生物素按1:1的比例结合后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，链霉亲和素结合生物素-RLP-C单克隆抗体比例为0.5:1，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.15g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应140分钟，加入甘露醇封闭，振荡混匀，室温反应100分钟，将混合液以14000rpm的转速离心40分钟，吸去上清液，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，进行标识。
实施例4
本发明一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的应用，其工作原理是:一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈，形成级联放大反应。检测样本中脂蛋白残粒胆固醇(RLP-C)与其相应的链霉亲和素-生物素-RLP-C抗体在溶液中相遇，采用级联放大反应，形成抗原-抗体复合物，使乳胶颗粒发生凝集，产生浊度变化。该浊度变化的高低在足量抗体存在时与样本中RLP-C的含量成正比，在340nm波长下，通过与已知浓度的校准品比较，可定量检测出样品中RLP-C的含量。
具体测定结果比较如下：
R2试剂采用胶乳微球直接偶联RLP-C单克隆抗体试剂盒，使用标准品进行定标，结果如表1所示，定标曲线如图1所示。
表1、R2试剂未采用级联放大偶联，胶乳微球直接偶联RLP-C 单克隆抗体定标结果：
结果解析：如图1和表1所示，线性范围可做到0.1-8mg/L，浓度大于4mg/L时出现hook效应。
R2试剂采用胶乳微球间接偶联RLP-C单克隆抗体试剂盒，使用标准品进行定标，结果如表2所示，定标曲线如图2所示。
表2、R2试剂采用级联放大偶联，胶乳微球间接偶联RLP-C单克隆抗体定标结果：
结果解析：如图2和表2所示，线性范围可做到0.1-8mg/L。
实施例5
精密度CV检测:
R2试剂采用胶乳微球直接偶联RLP-C单克隆抗体试剂盒，随机取3份份临床血清样本，使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次，检测结果如表3所示。
表3：检测样本的脂蛋白残粒胆固醇含量(10次)及变异系数
结果解析：精密度CV较大，基本＞5％。
R2试剂采用胶乳微球间接偶联RLP-C单克隆抗体的试剂盒，随机取3份临床血清样本，使用全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次，检测结果如表4所示。
表4：检测样本的脂蛋白残粒胆固醇含量(10次)及变异系数
结果解析：精密度CV明显改善，4％以内。
结论:采用胶乳微球间接偶联RLP-C单克隆抗体的试剂盒，即胶乳微球连接链霉亲和素1:1，RLP-C单克隆抗体连接生物素1:2，二者再以1:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到 0.1-8mg/L。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进或替换，这些改进或替换也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2包括第二缓冲液、保存液、偶联有RLP-C单克隆抗体-生物素-链霉亲和素的胶乳微球，所述第二缓冲液的浓度为8.05-27.30g/L，所述保存液的各组分及浓度包括：
N,N-二羟乙基甘氨酸 1.26-9.83g/L
稳定剂 0.5-2.0g/L
第二防腐剂 0.8-2.0ml/L
胶乳微球偶联物的各组份及浓度包括：
2.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的第一缓冲液A、第一缓冲液B以及试剂R2中的第二缓冲液均为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓液中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R1和R2中的防腐剂为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中稳定剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、甘露醇中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，其特征在于：胶乳微球所选粒径为90-280nm，其表面修饰基团为羧基或氨基中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R1pH在6.80-8.00之间，试剂R2pH在6.30-8.50之间。
7.根据权利要求1所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，其特征在于：生物素结合RLP-C单克隆抗体比例为1:1-3:1之间，链霉亲和素结合生物素-RLP-C单克隆抗体比例为0.5:1-4:1之间。
8.根据权利要求2所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，其特征在于：所述第一缓冲液A为二水合磷酸二氢钠、第一缓冲液B为十二水合磷酸氢二钠，第二缓冲液为2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物。
9.根据权利要求2所述的一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中稳定剂为牛血清白蛋白。
10.如权利要求1-9任一测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器转速至200-300rpm，使搅拌保持匀速状态，以0.8-3.2g/L标准，边搅拌边投入第一缓冲液A，以8.75-24.31g/L的标准投入第一缓冲液B，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.80-8.00之间，之后以5.8-20.0g/L标准，投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式分别以40-120g/L、0.8％-2.0％的标准，依次投入PEG 6000、第一防腐剂,投料完成后，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
b1、缓冲液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以8.05-27.30g/L的标准，边搅拌边投入第二缓冲液，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.30-8.50之间，继续搅拌5-30分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放在成品罐中，进行标识；
b2、保存液配制，在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，以1.26-9.83g/L的标准边搅拌边投入N,N-二羟乙基甘氨酸，搅拌5-30分钟至物料完全溶解，调节pH值到6.30-8.50之间，之后以0.5-2.0g/L标准，投入稳定剂，待物料完全溶解后，再以0.8-2.0ml/L标准，投入第二防腐剂，继续搅拌5-30分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀,定容至最终体积；
溶解完的配液按照微孔过滤器操作规程，通过微孔滤膜过滤，过滤后的溶液存放备用，进行标识；
b3、胶乳微球抗体偶联物的制备，胶乳微球所选粒径为90-280nm，其表面修饰基团为羧基或氨基中的一种，将胶乳微球以缓冲液稀释到0.01-3.0％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，将脂蛋白残粒胆固醇单克隆抗体以反应液稀释到0.05-3.0g/L的浓度,与生物素按3:1-1:1的比例结合后，加入到含有链霉亲和素的微球中，混匀，链霉亲和素结合生物素-RLP-C单克隆抗体比例为0.5:1-4:1之间，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.005-0.3g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应100—140分钟，加入牛血清白蛋白封闭，振荡混匀，室温反应80-100分钟，将混合液以14000rpm的转速离心15-45分钟，吸去上清液，加入保存液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入保存液，超声重悬，将制备好的R2装入成品罐中，进行标识。
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