CN110372783A - 一种脂联素抗原、抗体及其胶乳试剂的制备方法以及脂联素检测试剂盒 - Google Patents

一种脂联素抗原、抗体及其胶乳试剂的制备方法以及脂联素检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种脂联素抗原的制备方法，其通过表达阳性肿瘤细胞或者化学合成方法制备得到脂联素DNA序列，再通过原核表达、真核细胞表达得到脂联素抗原。将其作为免疫原通过动物免疫，制备得到脂联素单克隆抗体，其可用于制备脂联素检测胶乳试剂，制备得到的脂联素检测胶乳试剂能够应用于脂联素检测试剂盒。本发明克服了现有技术中的有关于脂联素抗原以及脂联素抗体的制备方法不明确，同时在脂联素检测试剂盒中的脂联素多抗会与Ⅷ型胶原、补体C1q和Ⅷ因子有交叉反应，导致最终测试结果的准确性较差的缺陷，本发明将脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体引入到脂联素检测试剂盒中能够有效提升试剂盒的测试精确度。

Description

一种脂联素抗原、抗体及其胶乳试剂的制备方法以及脂联素 检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种脂联素抗原、脂联素抗体及其脂联素检测胶乳试剂的制备方法，同时还涉及一种脂联素检测试剂盒。
背景技术
糖尿病已成为全球威胁人类健康的三大慢性非传染性疾病之一。虽然占总发病率95％以上的II型糖尿病在世界范围内广泛分布，但其患病率在不同国家、地区和种族中也存在区别。目前中国糖尿病患者总数高居世界第一的事实已经不容争辩，并且世界卫生组织预测至2025年全球糖尿病患者更是将突破3亿大军，这将为整个社会带来非常沉重的负担。
糖尿病还是很多疾病的元凶。随着糖尿病的发展，患者往往会出现一系列并发症，包括心血管疾病、神经病变、视网膜病变及肾病，严重时可出现心肌梗塞、中风、足坏疽及肾衰竭。糖尿病一经确诊则无法逆转，目前还没有治愈糖尿病及其并发症的药物，现有药物只能控制血糖、延缓并发症的发生及减轻症状，患者需终生服药。而处在糖尿病前期的患者，大约有30％在十年左右会进展成为糖尿病(Ferrannini E.et al.Lancet DiabetesEndocrinol 2:667-675(2014))。糖尿病防治的关键在于早期发现及预测糖尿病及糖尿病前期人群。
脂联素(Adiponectin/ADPN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，糖尿病人的血液中脂联素含量往往会有所升高。
然而，脂联素检测的临床推广还面临一系列困难或障碍。首先其临床推广受限于目前脂联素的检测方法。脂联素的检测方法主要包括：酶联免疫分析法、放射免疫分析法、化学发光法等，酶联免疫分析法灵敏度高，但操作繁琐，难于实现全自动化检测；放射免疫分析法会对对操作人员产生危害，对环境造成污染，而化学发光法也存在操作繁琐成本高、仪器普及率低等缺点。这些缺点限制了现有脂联素检测方法的推广及应用，使其难于广泛的应用于科研及临床。胶乳免疫增强比浊法是近年来出现的一种较为快速、准确、稳定的液相免疫比浊检测方法。其基本原理是利用抗原抗体特异性结合，产生免疫沉淀反应引起液相浊度变化，来检测抗原的浓度。在一定范围内，抗原的浓度越高，免疫沉淀反应就越快，液相吸光度变化也越大。该技术通过采用纳米乳胶微球偶联特异性抗体，使抗原抗体形成的免疫沉淀物体积增大，从而放大检测信号，显著提高了检测的灵敏度。
常规的胶乳免疫比浊法(例如授权公告号为CN 103777023B的纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒、授权公告号为CN 104237522B的脂联素含量检测试剂盒及其制备方法)的R1是透明澄清的缓冲液，R2是交联着抗体的胶乳颗粒，此方法的R2中交联的抗体一般是多抗，然而血液中Ⅷ型胶原、补体C1q和Ⅷ因子有交叉反应，最终导致测试结果准确性较差。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的有关于脂联素抗原以及脂联素抗体的制备方法资料较少，同时在脂联素检测试剂盒中的脂联素多抗会与Ⅷ型胶原、补体C1q和Ⅷ因子有交叉反应，导致最终测试结果的准确性较差的缺陷，提供了一种有效制备脂联素抗原以及脂联素抗体的制备方法，同时通过该脂联素抗原以及脂联素抗体能够用于制备脂联素检测胶乳试剂以及用于脂联素检测试剂盒。
为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种脂联素抗原的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1.1)脂联素DNA序列获得：通过脂联素表达阳性肿瘤细胞或者化学合成方法制备得到脂联素DNA序列；
(1.2)脂联素重组蛋白的制备：将步骤(1)中得到的脂联素DNA序列作为模板克隆到原核细胞或者真核细胞表达载体中，得到脂联素重组蛋白即脂联素抗原。
作为优选，所述的步骤(1)中的通过脂联素表达阳性肿瘤细胞制备得到脂联素DNA序列的具体步骤如下：
通过免疫印渍方法从肿瘤细胞中筛选脂联素阳性细胞株(1×106表达脂联素的肿瘤细胞)，然后用RNAeasy试剂盒(购自德国Qiagen公司)分离纯化总RNA，经Oligo dT15引物将总RNA逆转录为cDNA，通过聚合酶链式反应方法从中扩增获得脂联素DNA序列。
其核苷酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.1：
5’-atgctgttgc tgggagctgt tctactgcta ttagctctgc ccgggcatga ccaggaaacc 60acgactcaag ggcccggagt cctgcttccc ctgcccaagg gggcctgcac aggttggatg 120gcgggcatcc cagggcatcc gggccataat ggggccccag gccgtgatgg cagagatggc 180acccctggtg agaagggtga gaaaggagat ccaggtctta ttggtcctaa gggagacatc 240ggtgaaaccg gagtacccgg ggctgaaggt ccccgaggct ttccgggaat ccaaggcagg 300aaaggagaac ctggagaagg tgcctatgta taccgctcag cattcagtgt gggattggag 360acttacgtta ctatccccaa catgcccatt cgctttacca agatcttcta caatcagcaa 420aaccactatg atggctccac tggtaaattc cactgcaaca ttcctgggct gtactacttt 480gcctaccaca tcacagtcta tatgaaggat gtgaaggtca gcctcttcaa gaaggacaag 540gctatgctct tcacctatga tcagtaccag gaaaataatg tggaccaggc ctccggctct 600gtgctcctgc atctggaggt gggcgaccaa gtctggctcc aggtgtatgg ggaaggagag 660cgtaatggac tctatgctga taatgacaat gactccacct tcacaggctt tcttctctac 720catgacacca actga-3’735 。
其对应的氨基酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.2：
Adiponectin(N→C)：
MLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRD GTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLE TYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKA MLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLY HDTN。
核苷酸上游引物如下所示，记为SEQ ID NO.3：5’-atgctgttgc tgggagctgt-3’20。
核苷酸下游引物如下所示，记为SEQ ID NO.4：5’-tctaccatga caccaactga-3’20。
作为优选，根据Genbank提供的脂联素氨基酸序列，其如SEQ ID NO.2所示，通过化学合成脂联素化学合成多肽的三个片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5～7所示。
片段1的氨基酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.5：
Fragment-1(N→C)：GEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVP-C*；
片段2的氨基酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.6：
Fragment-2(N→C)：KGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVT-C*；
片段3的氨基酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.7：
Fragment-3(N→C)：RNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDT-C*。
作为优选，所述的步骤(1.2)中以原核细胞生产脂联素重组蛋白的具体方法如下：以步骤(1.1)中获得的脂联素DNA为模板，用聚合酶链式反应(PCR)将脂联素DNA开放阅读核苷酸序列(ORF)克隆到原核细胞表达载体pET15b或pET14b的NdeI/BamHI内切酶位点， DNA测序验证后，转化Rosetta DE3大肠杆菌，挑选高表达脂联素的细菌克隆，扩大培养至 OD值到0.4-0.8时，用1.0mM IPTG在37℃诱导4小时，10000rpm离心15分钟收集细菌沉淀，得到脂联素重组蛋白。
作为优选，所述的步骤(1.2)中以真核细胞生产脂联素重组蛋白的具体方法如下：以步骤(1.1)中获得的脂联素DNA为模板，克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(美国Invitrogen 公司)，通过物理转染的方法转染工程细胞CHO细胞，5％CO2生物反应器中无血清培养液(美国Gibco公司)培养7-10天，收集上清液，浓缩，用AKTA纯化重组蛋白峰并用Lorry’s酚试剂进行蛋白质定量后得到脂联素重组蛋白。
本发明中的脂联素抗原能够有效通过表达阳性肿瘤细胞或者化学合成方法制备得到 DNA序列，因而其制备方法更加多样可以根据实际情况选择不同的制备方法，其适用性更加广阔。将其通过原核细胞或者真核细胞表达载体中能够高效率的获得脂联素抗原，通过与人体中的天然脂联素相比较，两者的相似程度相当接近，因而其效果更加明显。通过将其接种到动物中能够有效产生对应的单克隆抗体。
一种抗脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体制备方法，所述的制备方法包括以下步骤： (21)动物免疫：将权利要求1～4中制得的脂联素重组蛋白以100mg脂联素蛋白/次/只小鼠的浓度与等量的完全福氏佐剂混匀，皮下多点注射免疫Balb/c雌性小鼠(5-6周龄，体重18-20 g)，第1次与第2次间隔10-14天，以后每次间隔7天，连续5次，第2-5次脂联素蛋白与等量的不完全福氏佐剂乳化混匀，间隔1周后采用尾静脉/腹腔注射无菌的脂联素蛋白，以加强免疫1次，3天后细胞融合；
(2.2)杂交瘤细胞的制备：取步骤(S.1)中的免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按体积比1:6在50％PEG的作用下融合，融合细胞先在次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶选择培养基中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，2周后换为次黄嘌呤-胸腺嘧啶培养基，继续在37℃、 5％CO2及饱和湿度条件下培养；克隆孔长至1/3-1时，取培养上清液进行抗体检测筛选；
(2.3)特异性克隆孔筛选：用50mM的碳酸盐缓冲液稀释脂联素重组蛋白至10mg/mL后，以100mL/孔包被反应微孔4℃过夜或37℃120min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，用10％小牛血清室温封闭30min，再加入100μl上述步骤2.2培养上清液室温反应60min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，最后再加入1:2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP室温反应60min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，加入四甲基联苯氨底物显色观察；凡出现明显蓝色反应者为阳性，否则为阴性；保留与脂联素重组蛋白有反应的细胞克隆孔，再采用有限稀释法进行3 次克隆筛选，建株的杂交瘤细胞再扩大培养、冻存，用于制备腹水；
(2.4)腹水的制备和纯化：将稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞扩大培养后，以0.5×104～5 ×105个/只接种到预先用0.5mL降植烷或液体石蜡致敏7-10天Balb/c小鼠的腹腔，7-12天内观察，收取腹水，离心后测定效价；经50％饱和硫酸铵沉淀保存或者低温冻存；腹水采用 50％饱和硫酸铵沉淀-正辛酸沉淀，或者用50％饱和硫酸铵沉淀-rProtein A-Sepharose Fast Flow 亲和层析纯化，最后用SDS-PAGE检测纯度，需达到90％，得到抗脂联素特异性单克隆IgG 型抗体。
本发明中制备得到的脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体，其不会与血液中存在的Ⅷ型胶原、补体C1q和Ⅷ因子有交叉反应，因而通过本发明制得的脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体其能够更加精准的用于检测试剂盒，从而使得测试结果更加准确。
一种脂联素检测胶乳试剂的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(3.1)将胶乳微球用MES缓冲液稀释，再以1:1的比例将胶乳微球与链霉亲和素结合，得到含有链霉亲和素的微球溶液；
(3.2)将制备得到的脂联素单克隆IgG抗体以磷酸盐缓冲液稀，再以1:1的比例将脂联素单克隆IgG抗体与生物素结合，得到生物素-脂联素单克隆IgG抗体结合物溶液；
(3.3)将步骤(b)中得到的生物素-脂联素单克隆IgG抗体结合物溶液加入到步骤(3.1)中得到的含有链霉亲和素的微球溶液中，其中链霉亲和素与生物素-脂联素单克隆IgG抗体结合物的比例为1:1，混匀后加入含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的溶液进行反应，反应后以BSA为封闭剂进行封闭反应，完成偶联后经多次离心清洗加入ProClin300，得到配置好的脂联素检测胶乳试剂。
一种脂联素检测试剂盒，所述的脂联素检测试剂盒包括试剂R1以及试剂R2，所述的试剂R2为上述得到的脂联素检测胶乳试剂。
作为优选，所述的试剂R1的配制如下：pH为6.50的Tris缓冲液50mmol/L，表面活性剂(Tween20)10.0g/L，氯化钠24.0g/L，反应增强剂(聚乙二醇8000)10.0g/L，微生物抑制剂(ProClin 300)0.5g/L。
作为优选，所述的试剂盒还包括校准品以及质控品；
其中，所述的校准品制备方法如下：取上述制备得到的脂联素重组蛋白，经蛋白质定量后用含0.25％BSA的100mM，pH 7.4磷酸盐或Tris-HCl缓冲液稀释成含脂联素重组蛋白浓度为 0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L的稀释液，在添加0.1％NaN3后作为校准品；
所述的质控品制备方法如下：取上述制备得到的脂联素重组蛋白，经蛋白质定量后用含10％人血清或血浆的100mM，pH7.4磷酸盐或Tris-HCl缓冲液稀释成含脂联素重组蛋白5mg/L、 40mg/L的液体，在添加0.1％NaN3后作为质控品。
因此，本发明具有以下有益效果：(1)本发明中的脂联素抗原的制备方法较为简单，且制备方法多样，能够根据实际条件选择不同的方法高效率制备抗原；(2)本发明中生产的是脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体其不会与血液中存在的Ⅷ型胶原、补体C1q和Ⅷ因子有交叉反应；(3)将脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体引入到脂联素检测试剂盒中能够有效提升试剂盒的测试精确度。
附图说明
图1为重组脂联素校准品的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
脂联素抗原的制备：
1、脂联素DNA序列获得
1.1从脂联素表达阳性肿瘤细胞中获取脂联素DNA序列
通过免疫印渍方法从肿瘤细胞中筛选脂联素阳性细胞株，1×106表达脂联素的肿瘤细胞，用 RNAeasy试剂盒(购自德国Qiagen公司)分离纯化总RNA，经Oligo dT15引物(购自上海生工生物工程公司)将总RNA逆转录为cDNA，通过聚合酶链式反应(PCR)方法从中扩增获得脂联素DNA序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)， DNA测序验证。
其核苷酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.1：
5’-atgctgttgc tgggagctgt tctactgcta ttagctctgc ccgggcatga ccaggaaacc 60acgactcaag ggcccggagt cctgcttccc ctgcccaagg gggcctgcac aggttggatg 120gcgggcatcc cagggcatcc gggccataat ggggccccag gccgtgatgg cagagatggc 180acccctggtg agaagggtga gaaaggagat ccaggtctta ttggtcctaa gggagacatc 240ggtgaaaccg gagtacccgg ggctgaaggt ccccgaggct ttccgggaat ccaaggcagg 300aaaggagaac ctggagaagg tgcctatgta taccgctcag cattcagtgt gggattggag 360acttacgtta ctatccccaa catgcccatt cgctttacca agatcttcta caatcagcaa 420aaccactatg atggctccac tggtaaattc cactgcaaca ttcctgggct gtactacttt 480gcctaccaca tcacagtcta tatgaaggat gtgaaggtca gcctcttcaa gaaggacaag 540gctatgctct tcacctatga tcagtaccag gaaaataatg tggaccaggc ctccggctct 600gtgctcctgc atctggaggt gggcgaccaa gtctggctcc aggtgtatgg ggaaggagag 660cgtaatggac tctatgctga taatgacaat gactccacct tcacaggctt tcttctctac 720catgacacca actga-3’735 。
其对应的氨基酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.2：
Adiponectin(N→C)：
MLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRD GTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLE TYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKA MLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLY HDTN。
核苷酸上游引物如下所示，记为SEQ ID NO.3：5’-atgctgttgc tgggagctgt-3’20。
核苷酸下游引物如下所示，记为SEQ ID NO.4：5’-tctaccatga caccaactga-3’20。
1.2化学合成脂联素DNA序列
根据Genbank提供的脂联素氨基酸序列，其如SEQ ID NO.2所示，通过化学合成脂联素化学合成多肽的三个片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5～7所示。
片段1的氨基酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.5：
Fragment-1(N→C)：GEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVP-C*；
片段2的氨基酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.6：
Fragment-2(N→C)：KGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVT-C*；
片段3的氨基酸序列如下所示，记为SEQ ID NO.7：
Fragment-3(N→C)：RNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDT-C*。
1.3原核细胞生产脂联素重组蛋白
以步骤1.1或1.2获得的脂联素DNA为模板，用聚合酶链式反应(PCR)将脂联素DNA开放阅读核苷酸序列(ORF)克隆到原核细胞表达载体pET15b或pET14b的NdeI/BamHI内切酶位点，DNA测序验证后，转化Rosetta DE3大肠杆菌，挑选高表达脂联素的细菌克隆，扩大培养至OD值到0.4-0.8时，用1.0mM IPTG在37℃诱导4小时，10000rpm离心15分钟收集细菌沉淀。
脂联素复性和纯化：以处理150g细菌沉淀为例进行说明。
将150g细菌沉淀加入1.5L包涵体裂解液I(pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含1mMEDTA 和100mM NaCl)后进行高压超声破碎(压力10MPa，超声频率20000Hz，超声处理5min)，离心，沉淀用700ml包涵体裂解液II(pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含1mM EDTA、100mM NaCl和0.5％Triton X-100)进行洗涤，洗涤2次，10000rpm离心10min，产生的沉淀用0.5M 尿素(用pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含1mM EDTA、100mM NaCl配制)洗涤1次，10000rpm 离心10min。沉淀用200ml、8M尿素(用pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含1mM EDTA、100mM NaCl配制)重悬，磁力搅拌30min后，10000rpm离心10min，上清(200ml)用pH 10.7，50 mM K2HPO4+1mM EDTA+50mM NaCl溶液稀释10倍，用1M NaOH调pH10.7后静置30 min，再用2M HCl调pH至8.0，10000rpm离心10min，将上清(2L)装入透析袋中进行复性透析。透析液为pH8.0,50mMTris-HCl缓冲液含1mM EDTA、100mM NaCl、10mM还原型谷胱甘肽、2mM氧化型谷胱甘肽和1mM二硫苏糖醇(DTT)。4℃复性透析48h，然后用 pH8.0,50mM Tris-HCl缓冲液含100mM NaCl进行透析，透析3次后过镍柱进行纯化，洗脱液为pH8.0，50mM Na2HPO4缓冲液内含150mM NaCl和300mM咪唑。进一步用AKTA纯化重组蛋白峰，Lorry’s酚试剂进行蛋白质定量。
1.4真核细胞生产脂联素重组蛋白
以步骤1.1或1.2获得的脂联素DNA为模板，克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(美国Invitrogen公司)，通过物理转染的方法(基因枪或脂质体)转染工程细胞CHO细胞(美国ATCC 公司)，5％CO2生物反应器中无血清培养液(美国Gibco公司)培养7-10天，收集上清液，浓缩，用AKTA纯化重组蛋白峰。Lorry’s酚试剂进行蛋白质定量。
实施例2
抗脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体制备方法
2.1动物免疫：
将上述制得的脂联素重组蛋白以100mg脂联素蛋白/次/只小鼠的浓度与等量的完全福氏佐剂混匀，皮下多点注射免疫Balb/c雌性小鼠(5-6周龄，体重18-20g)，第1次与第2次间隔 10-14天，以后每次间隔7天，连续5次，第2-5次脂联素蛋白与等量的不完全福氏佐剂乳化混匀，间隔1周后采用尾静脉/腹腔注射无菌的脂联素蛋白，以加强免疫1次，3天后细胞融合。
2.2杂交瘤细胞的制备
取步骤2.1中的免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按体积比1:6在50％PEG的作用下融合，融合细胞先在次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶选择培养基中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，2周后换为次黄嘌呤-胸腺嘧啶培养基，继续在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养；克隆孔长至1/3-1时，取培养上清液进行抗体检测筛选。
2.3特异性克隆孔筛选
用50mM的碳酸盐缓冲液稀释脂联素重组蛋白至10mg/mL后，以100mL/孔包被反应微孔4℃过夜或37℃120min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，用10％小牛血清室温封闭30min，再加入100μl上述步骤2.2培养上清液室温反应60min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，最后再加入1:2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP室温反应60min，用含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤 3次，加入四甲基联苯氨底物显色观察；凡出现明显蓝色反应者为阳性，否则为阴性；保留与脂联素重组蛋白有反应的细胞克隆孔，再采用有限稀释法进行3次克隆筛选，建株的杂交瘤细胞再扩大培养、冻存，用于制备腹水。
2.4腹水的制备和纯化
将稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞扩大培养后，以0.5×104～5×105个/只接种到预先用0.5 mL降植烷或液体石蜡致敏7-10天Balb/c小鼠的腹腔，7-12天内观察，收取腹水，离心后测定效价；经50％饱和硫酸铵沉淀保存或者低温冻存；腹水采用50％饱和硫酸铵沉淀-正辛酸沉淀，或者用50％饱和硫酸铵沉淀-rProtein A-Sepharose Fast Flow亲和层析纯化，最后用 SDS-PAGE检测纯度，需达到90％，得到抗脂联素特异性单克隆IgG型抗体。
实施例3
脂联素检测胶乳试剂的制备
3.1准备液配制：溶液A(25mM MES缓冲液，pH＝6.0)、磷酸盐缓冲液(50mM PB，pH＝7.5)、 2％BSA。
3.2将100nm胶乳微球以溶液A稀释到1％的浓度，再以1:1比例与链霉亲和素结合，得到含有链霉亲和素的微球溶液。
3.3将脂联素单克隆IgG抗体以磷酸盐缓冲液稀释到3mg/mL的浓度,与生物素按1:1 的比例结合后，得到生物素-脂联素单克隆IgG抗体结合物溶液。
3.4将步骤(3.2)中得到的生物素-脂联素单克隆IgG抗体结合物溶液加入到步骤(3.1) 中得到的含有链霉亲和素的微球溶液中，其中链霉亲和素与生物素-脂联素单克隆IgG抗体结合物的比例为1:1，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以反应液溶解到0.3g/L的浓度，边摇匀边滴加入上述混合溶液中，室温反应150-200分钟，加入2％BSA200μL封闭，振荡混匀，室温反应40-80分钟，将混合液以14000rpm的转速离心40-80分钟，吸去上清液，加入磷酸盐缓冲液，超声重悬，重复离心清洗3次，最后一次离心去上清液后，加入磷酸盐缓冲液，超声重悬，加入0.05％ProClin 300，得到配置好的脂联素检测胶乳试剂。
实施例4
一种脂联素检测试剂盒，所述的脂联素检测试剂盒包括试剂R1以及试剂R2，所述的试剂R2 为实施例3中得到的脂联素检测胶乳试剂。
所述的试剂R1的配制如下：pH为6.50的Tris缓冲液50mmol/L，表面活性剂10.0g/L，氯化钠24.0g/L，反应增强剂10.0g/L，微生物抑制剂0.5g/L。
所述的试剂盒还包括校准品以及质控品；
所述的校准品制备方法如下：取实施例1中制备得到的脂联素重组蛋白，经蛋白质定量后用含0.25％BSA的100mM，pH 7.4磷酸盐或Tris-HCl缓冲液稀释成含脂联素重组蛋白浓度为 0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L的稀释液，在添加0.1％NaN3后作为校准品。
所述的质控品制备方法如下：取实施例1中制备得到的脂联素重组蛋白，经蛋白质定量后用含10％人血清或血浆的100mM，pH7.4磷酸盐或Tris-HCl缓冲液稀释成含脂联素重组蛋白5mg/L、40mg/L的液体，在添加0.1％NaN3后作为质控品。
实施例5
检测方法
检测步骤：
反应类型：两点终点法 温度：37℃ 比色杯光径：1.0cm
主/副波长：570nm/800nm 单位：mg/L 反应方向：上升
表1测试条件表
计算校准品吸光度的差值(A校准-A空白)，建立合适的数学模(非线性)如Logit-Log等，拟合成多点定标的校准曲线。根据样品(A样品-A空白)的吸光度差值，在工作曲线上求得样品中脂联素的含量。
5.2标准曲线的建立
采用步骤实施例4中的校准品，按照上述步骤测得本发明重组脂联素校准品的标准曲线，如图1所示。图1中曲线上的每个点代表一个含量的校准品，其中x轴表示脂联素的浓度，y 轴表示吸光度的差值。标准曲线的线性拟合方程为：y＝111.31x-102.43，相关系数r＝0.9994；。
5.3质控品结果
采用本发明的试剂，在已定标的日立7100全自动生化分析仪测试本发明的两个已知浓度的质控品各3次，记录测得脂联素浓度值，计算获得平均值，结果如表2所示。
表2
测得的质控脂联素水平均在质控品浓度范围内，说明试剂装机位置、仪器参数设置及定标符合标准。
5.5批内精密度
用本发明的试剂，在已定标的日立7100全自动生化分析仪上测定4份血清，用同一份血清样本测定20次，计算测定的均值以及批次精密度，结果如下表3所示，精密度在0.97％-2.28％。
表3
。

Claims (10)

1.一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
（1.1）脂联素 DNA序列获得：通过脂联素表达阳性肿瘤细胞或者化学合成方法制备得到脂联素 DNA序列；
（1.2）脂联素重组蛋白的制备：将步骤（1.1）中得到的脂联素 DNA序列作为模板克隆到原核细胞或者真核细胞表达载体中，得到脂联素重组蛋白即脂联素抗原。
2.根据权利要求1所述的一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1.1）中的通过脂联素表达阳性肿瘤细胞制备得到脂联素 DNA序列的具体步骤如下：
通过免疫印渍方法从肿瘤细胞中筛选脂联素阳性细胞株，然后用RNAeasy 试剂盒分离纯化总RNA，经Oligo dT15引物将总RNA逆转录为cDNA，通过聚合酶链式反应方法从中扩增获得脂联素 DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1.1）中的通过化学合成方法制备得到脂联素 DNA序列的具体步骤如下：根据Genbank提供的脂联素氨基酸序列，其如SEQ ID NO.2所示，通过化学合成脂联素化学合成多肽的三个片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5~7所示。
4.根据权利要求1所述的一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1.2）中以原核细胞生产脂联素重组蛋白的具体方法如下：以步骤（1.1）中获得的脂联素 DNA为模板，用聚合酶链式反应将脂联素 DNA开放阅读核苷酸序列克隆到原核细胞表达载体pET15b或pET14b的NdeI/BamHI 内切酶位点，DNA测序验证后，转化Rosetta DE3大肠杆菌，挑选高表达脂联素的细菌克隆，扩大培养至OD值到0.4-0.8时，用1.0 mM IPTG在37℃诱导4小时，10000 rpm离心15分钟收集细菌沉淀，得到脂联素重组蛋白。
5.根据权利要求1所述的一种脂联素抗原的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1.2）中以真核细胞生产脂联素重组蛋白的具体方法如下：以步骤（1.1）中获得的脂联素 DNA为模板，克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1，通过物理转染的方法转染工程细胞CHO细胞，5%CO2生物反应器中无血清培养液培养7-10天，收集上清液，浓缩，用AKTA纯化重组蛋白峰并用Lorry’s酚试剂进行蛋白质定量后得到脂联素重组蛋白。
6.一种抗脂联素重组蛋白单克隆IgG型抗体制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
（2.1）动物免疫：将权利要求1~4中制得的脂联素重组蛋白以100 mg 脂联素蛋白/次/只小鼠的浓度与等量的完全福氏佐剂混匀，皮下多点注射免疫Balb/c雌性小鼠(5-6周龄，体重18-20 g)，第1次与第2次间隔10-14天，以后每次间隔7天，连续5次，第2-5次脂联素蛋白与等量的不完全福氏佐剂乳化混匀，间隔1周后采用尾静脉/腹腔注射无菌的脂联素蛋白，以加强免疫1次，3天后细胞融合；
（2.2）杂交瘤细胞的制备：取步骤（S.1）中的免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按体积比1:6在50%PEG的作用下融合，融合细胞先在次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶选择培养基中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养，2周后换为次黄嘌呤-胸腺嘧啶培养基，继续在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养;克隆孔长至1/3-1时，取培养上清液进行抗体检测筛选；
（2.3）特异性克隆孔筛选：用50 mM的碳酸盐缓冲液稀释脂联素重组蛋白至10 mg/mL后，以100mL/孔包被反应微孔4℃过夜或37℃120min，用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，用10%小牛血清室温封闭30min，再加入100µl上述步骤2.2培养上清液室温反应60min，用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，最后再加入1:2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP室温反应60min，用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液洗涤3次，加入四甲基联苯氨底物显色观察;凡出现明显蓝色反应者为阳性，否则为阴性;保留与脂联素重组蛋白有反应的细胞克隆孔，再采用有限稀释法进行3次克隆筛选，建株的杂交瘤细胞再扩大培养、冻存，用于制备腹水；
（2.4）腹水的制备和纯化：将稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞扩大培养后，以0.5×104~5×105个/只接种到预先用0.5 mL降植烷或液体石蜡致敏7-10天Balb/c小鼠的腹腔，7-12天内观察，收取腹水，离心后测定效价；经50%饱和硫酸铵沉淀保存或者低温冻存；腹水采用50%饱和硫酸铵沉淀-正辛酸沉淀，或者用50%饱和硫酸铵沉淀-rProtein A-SepharoseFast Flow亲和层析纯化，最后用SDS-PAGE检测纯度，需达到90%，得到抗脂联素特异性单克隆IgG型抗体。
7.一种脂联素检测胶乳试剂的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
（3.1）将胶乳微球用MES缓冲液稀释，再以1:1的比例将胶乳微球与链霉亲和素结合，得到含有链霉亲和素的微球溶液；
（3.2）将权利要求6中制备得到的脂联素单克隆IgG抗体以磷酸盐缓冲液稀，再以1:1的比例将脂联素单克隆IgG抗体与生物素结合，得到生物素-脂联素单克隆IgG抗体结合物溶液；
（3.3）将步骤（b）中得到的生物素-脂联素单克隆IgG抗体结合物溶液加入到步骤（a）中得到的含有链霉亲和素的微球溶液中，其中链霉亲和素与生物素-脂联素单克隆IgG抗体结合物的比例为1:1，混匀后加入含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的溶液进行反应，反应后以BSA为封闭剂进行封闭反应，完成偶联后经多次离心清洗加入ProClin300，得到配置好的脂联素检测胶乳试剂。
8.一种脂联素检测试剂盒，所述的脂联素检测试剂盒包括试剂R1以及试剂R2，其特征在于，所述的试剂R2为权利要求7中得到的脂联素检测胶乳试剂。
9.根据权利要求8所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1的配制如下：pH为6.50的Tris缓冲液50mmol/L，表面活性剂10.0g/L，氯化钠24.0g/L，反应增强剂10.0g/L，微生物抑制剂0.5g/L。
10.根据权利要求8所述的一种脂联素检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括校准品以及质控品；
其中，所述的校准品制备方法如下：取权利要求1~4中制备得到的脂联素重组蛋白，经蛋白质定量后用含0.25%BSA的100 mM，pH 7.4磷酸盐或Tris-HCl缓冲液稀释成含脂联素重组蛋白浓度为0mg/L、5mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80mg/L的稀释液，在添加0.1%NaN3后作为校准品；
所述的质控品制备方法如下：取权利要求1~4中制备得到的脂联素重组蛋白，经蛋白质定量后用含10%人血清或血浆的100 mM，pH7.4磷酸盐或Tris-HCl缓冲液稀释成含脂联素重组蛋白5mg/L、40 mg/L的液体，在添加0.1% NaN3后作为质控品。
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