CN113267635A - 一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒 - Google Patents

一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学检测试剂领域，公开了一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒。将胶乳微球经聚乙二醇表面改性和链亲和素包被，得到聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球；将脂联素抗体与生物素混合反应，得到生物素化脂联素抗体；然后将聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球与生物素化脂联素抗体混合孵育，得到脂联素抗体纳米胶乳颗粒。所述检测脂联素的试剂盒包括脂联素标准品、R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含电解质、促凝剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液，R2试剂包含脂联素抗体纳米胶乳颗粒、电解质、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。本发明的脂联素检测试剂盒具有显著提高的灵敏度、稳定性及检测效率。

Description

一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒
技术领域
本发明属于医学检测试剂领域，具体涉及一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒。
背景技术
脂联素(Adiponectin/ADPN)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，大量存在于血液循环中，在调节胰岛素敏感性及葡萄糖代谢的过程中扮演重要角色，是一种胰岛素增敏激素(AnInsulin-sensitizingHormone)。人体内的脂联素由244个氨基酸组成，分子量为30KD，由氨基末端的分泌信号序列(aa1-18)，一段特异序列(aa19-41)，一组由22个氨基酸组成的胶原重复序列(aa42-107)，一段球状序列(aa108-244)组成。其中球状区是脂联素生物活性的关键部位，和TNF-α的结构相似，脂联素与胶原Ⅷ、X和补体C1q高度同源。脂联素的单聚体和三聚体是其生物活性形式或受体亲和配基可以特异性结合骨骼肌或肝脏细胞膜上的G蛋白藕联受体一型或二型脂联素受体，进而调节脂肪酸氧化和糖代谢。在代谢性疾病中，脂联素具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化及抗炎症等功能。大量流行病学调查显示，血清/血浆中脂联素水平与胰岛素抵抗、糖尿病前期及2型糖尿病密切相关，脂联素水平在上述疾病中明显降低。了解血清/血浆中脂联素水平与糖尿病、糖尿病前期的关联可以为疾病提供有价值的信息，促进对糖尿病高发人群的跟踪随访及干预治疗，从而实现对糖尿病高风险人群的早发现、早干预、早治疗，降低糖尿病发病率。
脂联素的检测方法主要包括：酶联免疫分析法，放射免疫分析法，化学发光法等。酶联免疫分析法灵敏度高，但操作繁琐，难于实现全自动化检测；放射免疫分析法会对对操作人员产生危害，对环境造成污染；而化学发光法也存在操作繁琐成本高、仪器普及率低等缺点。这些缺点限制了现有脂联素检测方法的推广及应用，使其难于广泛的应用于科研及临床。
胶乳免疫增强比浊法是近年来出现的一种较为快速、准确、稳定的液相免疫比浊检测方法。其基本原理是利用抗原抗体特异性结合，产生免疫沉淀反应引起液相浊度变化，来检测抗原的浓度。在一定范围内，抗原的浓度越高，免疫沉淀反应就越快，液相吸光度变化也越大。该技术通过采用纳米乳胶微球偶联特异性抗体，使抗原抗体形成的免疫沉淀物体积增大，从而放大检测信号，显著提高了检测的灵敏度。由此可见，用于制备检测脂联素的试剂盒的关键成分在于脂联素抗体纳米胶乳颗粒。其他辅助成分还包括为了维持反应体系pH值稳定性的生物缓冲剂；能够络合检测样本中的金属离子，以减少金属离子对检测结果影响的螯合剂；为了防止微生物的繁殖对产品品质及检测结果带来不良影响的防腐剂；保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间的稳定剂；促进试剂体系中各组分以及检测样本中各物质的均匀分散及提高检测的精密度，同时减少样本浊度对测定结果影响的表面活性剂；可以促进抗原抗体反应，有利于胶乳颗粒交联物的形成和增大，提高检测灵敏度和线性范围的促凝剂；与胶乳颗粒中游离的活性位点结合，避免游离的活性位点对检测结果造成不良影响的封闭剂；能维持体系中各物质有一个良好的分散状态，防止各组分凝集下沉导致的检测试剂盒的品质及开瓶稳定性变差等问题出现的助悬剂；为了保护抗体的活性，避免抗体失活对试剂盒的品质带来不良影响的保护剂等。
专利CN 111239421 A公开了一种包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，所述包被抗人脂联素抗体的致敏聚苯乙烯胶乳颗粒中的“抗人脂联素抗体”与“致敏聚苯乙烯胶乳颗粒”之间通过链亲和素-生物素系统连接。所述致敏聚苯乙烯胶乳颗粒具体为羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒或氨基化的聚苯乙烯胶乳颗粒。其中，链亲和素-生物素系统可极大地提高检测方法的灵敏度，同时不增加非特异干扰。此外，链亲和素-生物素结合很稳定，不会因反应试剂的高度稀释而受影响，保证了检测结果的准确性。专利CN103777023A公开了一种包被抗人脂联素多克隆抗体的胶乳颗粒，所述胶乳颗粒优选为苯乙烯和丙烯酸的共聚物，表面含有丰富的羧基基团。通过在胶乳壳聚合过程中引入丙烯酸类单体，使胶乳颗粒表面形成一层疏松的表面层，能够有效降低血浆或血清中的成分对凝集反应的干扰影响，提高分析的准确性。胶乳壳中的丙烯酸，其羧酸基团分布在胶乳颗粒表面，带有一定的负电荷，使胶乳颗粒成为一种亲水性胶乳，能够防止胶乳颗粒的絮凝，从而可以提高胶乳颗粒的稳定性。专利CN101968492A公开了一种检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒。将两种小鼠抗人脂联素单克隆抗体分别与醛基微球交联，得两种胶乳抗体悬液。
上述专利技术虽然能够在一定程度上改善检测效果，但其采用的胶乳颗粒与抗体亲和性较差，对抗体的活性及结合效率存在不利影响，影响检测灵敏度及稳定性。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的脂联素抗体纳米胶乳颗粒。
本发明的再一目的在于提供一种用于检测脂联素的试剂盒。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备方法，包括如下制备步骤：
(1)胶乳微球的聚乙二醇表面改性及链亲和素包被：将活性胶乳微球分散于水中，加入酸性催化剂和聚乙二醇搅拌混合均匀，再加入戊二醛进行表面改性反应，得到聚乙二醇表面改性胶乳微球；然后加入链亲和素继续混合孵育，得到聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球；
(2)脂联素抗体的生物素化：将生物素与脂联素抗体混合反应，得到生物素化脂联素抗体；
(3)脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备：将步骤(1)所得聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球与步骤(2)的生物素化脂联素抗体混合孵育，得到脂联素抗体纳米胶乳颗粒。
进一步地，步骤(1)中所述活性胶乳微球是指氨基聚苯乙烯微球或壳聚糖微球；活性胶乳微球的粒径范围为100～500nm。
进一步地，所述壳聚糖微球通过如下方法制备得到：
将壳聚糖溶解于醋酸溶液中得到壳聚糖水相溶液，然后加入到含有表面活性剂的有机溶剂中，搅拌乳化后加入戊二醛交联反应，产物经分离、洗涤、冷冻干燥，得到壳聚糖微球。
进一步优选地，所述醋酸溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，所述表面活性剂是指Span-80，所述有机溶剂是指环己烷，所述水相溶液与油相有机溶剂的体积比为1:2～4。
进一步地，步骤(1)中所述酸性催化剂是指盐酸。
进一步地，步骤(1)中所述聚乙二醇的平均分子量为800～6000，聚乙二醇加入量为活性胶乳微球质量的1％～10％。
进一步地，步骤(1)中所述表面改性反应的温度为20～40℃，时间为1～8h。
进一步地，步骤(2)中所述生物素与脂联素抗体混合的摩尔比为1:1～5。
进一步地，步骤(2)中所述脂联素抗体是指抗人脂联素单克隆抗体或抗人脂联素多克隆抗体。
进一步地，步骤(3)中所述聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球与生物素化脂联素抗体混合孵育的质量比为1:2～2:1。
一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒，通过上述方法制备得到。
一种用于检测脂联素的试剂盒，包括脂联素标准品、R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含电解质、促凝剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液，所述R2试剂包含脂联素抗体纳米胶乳颗粒、电解质、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。
进一步地，所述电解质选自氯化钠，质量浓度为0.5％～2％；所述促凝剂选自聚乙二醇4000～10000，质量浓度为0.1％～5％；所述表面活性剂选自吐温、脂肪醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少一种，质量浓度为0.2％～5％；所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、Proclin系列防腐剂中的至少一种，质量浓度为0.1％～0.5％；所述缓冲液选自MES缓冲液、MOPS缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液或甘氨酸缓冲液，浓度为50～300mmol/L。
进一步地，所述R2试剂中脂联素抗体纳米胶乳颗粒的浓度为0.5～4mg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过胶乳微球的链亲和素包被及脂联素抗体的生物素化，形成链亲和素-生物素放大系统，并通过聚乙二醇对胶乳微球进行表面改性，可显著提高检测灵敏度。
(2)本发明进一步对胶乳微球进行聚乙二醇表面改性，在聚乙二醇促凝剂的作用下可以进一步加快抗原抗体反应，缩短胶乳颗粒交联物形成和增大的时间，显著提高检测效率。
(3)本发明进一步创新的采用生物相容性更好的壳聚糖微球作为胶乳颗粒，与抗体结合效率高、抗体活性稳定性好，无需加入保护剂或稳定剂，可显著提高检测灵敏度及稳定性。
附图说明
图1为本发明实施例1的试剂盒的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所使用的脂联素抗体为抗人脂联素多克隆抗体，其通过如下方法制备：
取抗人脂联素抗原(购自美国Bio-Rad公司)300μg，以等量弗氏完全佐剂(购自Sigma)乳化抗原，背部皮下多点注射饲养SPF新西兰大白兔(2.2～2.5kg)，其后每隔两周以弗氏不完全佐剂((购自Sigma)乳化抗原，同法重复注射进行加强免疫3次，共计免疫4次。然后从兔子静脉抽取100ml血液，离心获得血清。取10ml兔血清通过Protein G((购自Thermo)免疫亲和层析柱，用1000ml TBS(20mM Tris,pH7.4,500mM NaCl,0.05％Tween-20)缓冲液反复冲洗层析柱，弃去流出液，冲洗完毕后，用10ml 100mM的glycine/HCl(pH2.5)缓冲液洗脱结合的抗体，收集于透析袋中，并放置于1000ml TBS(20mM Tris,pH7.4,500mMNaCl,0.05％Tween-20)缓冲液中，冰箱中4℃透析过夜，获得纯化的抗人脂联素IgG多克隆抗体。
实施例1
本实施例的一种用于检测脂联素的试剂盒，包括脂联素标准品(购自美国Bio-Rad公司)、R1试剂和R2试剂。
其中R1试剂组成为：1wt.％氯化钠、2wt.％聚乙二醇-8000、2wt.％吐温-80、0.2wt.％叠氮钠和200mmol/L MOPS缓冲液。
所述R2试剂组成为：2mg/mL的脂联素抗体纳米胶乳颗粒，1wt.％氯化钠，2wt.％曲拉通X-100，0.2wt.％的叠氮钠和200mmol/L MOPS缓冲液。
本实施例所述脂联素抗体纳米胶乳颗粒通过如下方法制备：
(1)胶乳微球的聚乙二醇表面改性及链亲和素包被：往平均粒径为320nm的氨基聚苯乙烯微球(商业购买)水分散液中加入盐酸催化剂和聚乙二醇-2000搅拌混合均匀，聚乙二醇加入量为氨基聚苯乙烯微球质量的4％，再加入适量戊二醛进行表面改性反应，表面改性反应温度控制为35～40℃，时间为2h；然后加入链亲和素，链亲和素在体系中的浓度为0.1mg/mL，在室温及摇床条件下继续混合孵育过夜，产物经离心分离，PBS缓冲液洗涤，得到聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球。
(2)脂联素抗体的生物素化：将生物素(商品化已活化产品)与脂联素抗体混合，活化生物素与脂联素抗体混合的摩尔比设置为1:2，室温下反应，离心，取上清液在4℃下置于PBS缓冲液中透析，得到生物素化脂联素抗体。
(3)脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备：将步骤(1)所得聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球与步骤(2)的生物素化脂联素抗体按质量比为1:1在常温摇床条件下混合孵育2h，得到脂联素抗体纳米胶乳颗粒。
实施例2
本实施例的一种用于检测脂联素的试剂盒，包括脂联素标准品(购自美国Bio-Rad公司)、R1试剂和R2试剂。
其中R1试剂组成为：2wt.％氯化钠、4wt.％聚乙二醇-6000、3wt.％吐温-80、0.4wt.％叠氮钠和250mmol/L MES缓冲液。
所述R2试剂组成为：4mg/mL的脂联素抗体纳米胶乳颗粒，2wt.％氯化钠，3wt.％曲拉通X-100，0.4wt.％的叠氮钠和250mmol/L MES缓冲液。
本实施例所述脂联素抗体纳米胶乳颗粒通过如下方法制备：
(1)胶乳微球的聚乙二醇表面改性及链亲和素包被：往平均粒径为240nm的氨基聚苯乙烯微球(商业购买)水分散液中加入盐酸催化剂和聚乙二醇-800搅拌混合均匀，聚乙二醇加入量为氨基聚苯乙烯微球质量的8％，再加入适量戊二醛进行表面改性反应，表面改性反应温度控制为30～35℃，时间为6h；然后加入链亲和素，链亲和素在体系中的浓度为0.1mg/mL，在室温及摇床条件下继续混合孵育过夜，产物经离心分离，PBS缓冲液洗涤，得到聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球。
(2)脂联素抗体的生物素化：将生物素(商品化已活化产品)与脂联素抗体混合，活化生物素与脂联素抗体混合的摩尔比设置为1:4，室温下反应，离心，取上清液在4℃下置于PBS缓冲液中透析，得到生物素化脂联素抗体。
(3)脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备：将步骤(1)所得聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球与步骤(2)的生物素化脂联素抗体按质量比为1:2在常温摇床条件下混合孵育2h，得到脂联素抗体纳米胶乳颗粒。
实施例3
本实施例的一种用于检测脂联素的试剂盒，包括脂联素标准品(购自美国Bio-Rad公司)、R1试剂和R2试剂。
其中R1试剂组成为：0.5wt.％氯化钠、0.5wt.％聚乙二醇-6000、1wt.％吐温-80、0.2wt.％叠氮钠和150mmol/L MOPS缓冲液。
所述R2试剂组成为：1mg/mL的脂联素抗体纳米胶乳颗粒，1wt.％氯化钠，1wt.％曲拉通X-100，0.2wt.％的叠氮钠和150mmol/L MOPS缓冲液。
本实施例所述脂联素抗体纳米胶乳颗粒通过如下方法制备：
(1)胶乳微球的聚乙二醇表面改性及链亲和素包被：往平均粒径为150nm的氨基聚苯乙烯微球(商业购买)水分散液中加入盐酸催化剂和聚乙二醇-6000搅拌混合均匀，聚乙二醇加入量为氨基聚苯乙烯微球质量的2％，再加入适量戊二醛进行表面改性反应，表面改性反应温度控制为30～35℃，时间为6h；然后加入链亲和素，链亲和素在体系中的浓度为0.1mg/mL，在室温及摇床条件下继续混合孵育过夜，产物经离心分离，PBS缓冲液洗涤，得到聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球。
(2)脂联素抗体的生物素化：将生物素(商品化已活化产品)与脂联素抗体混合，活化生物素与脂联素抗体混合的摩尔比设置为1:1，室温下反应，离心，取上清液在4℃下置于PBS缓冲液中透析，得到生物素化脂联素抗体。
(3)脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备：将步骤(1)所得聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球与步骤(2)的生物素化脂联素抗体按质量比为2:1在常温摇床条件下混合孵育2h，得到脂联素抗体纳米胶乳颗粒。
实施例4
本实施例的一种用于检测脂联素的试剂盒，包括脂联素标准品(购自美国Bio-Rad公司)、R1试剂和R2试剂。
其中R1试剂组成为：1wt.％氯化钠、2wt.％聚乙二醇-8000、2wt.％吐温-80、0.2wt.％叠氮钠和200mmol/L MOPS缓冲液。
所述R2试剂组成为：2mg/mL的脂联素抗体纳米胶乳颗粒，1wt.％氯化钠，2wt.％曲拉通X-100，0.2wt.％的叠氮钠和200mmol/L MOPS缓冲液。
本实施例所述脂联素抗体纳米胶乳颗粒通过如下方法制备：
(1)胶乳微球的聚乙二醇表面改性及链亲和素包被：往平均粒径为320nm的壳聚糖微球(自制)水分散液中加入盐酸催化剂和聚乙二醇-2000搅拌混合均匀，聚乙二醇加入量为壳聚糖微球质量的4％，再加入适量戊二醛进行表面改性反应，表面改性反应温度控制为35～40℃，时间为2h；然后加入链亲和素，链亲和素在体系中的浓度为0.1mg/mL，在室温及摇床条件下继续混合孵育过夜，产物经离心分离，PBS缓冲液洗涤，得到聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球。
(2)脂联素抗体的生物素化：将生物素(商品化已活化产品)与脂联素抗体混合，活化生物素与脂联素抗体混合的摩尔比设置为1:2，室温下反应，离心，取上清液在4℃下置于PBS缓冲液中透析，得到生物素化脂联素抗体。
(3)脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备：将步骤(1)所得聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球与步骤(2)的生物素化脂联素抗体按质量比为1:1在常温摇床条件下混合孵育2h，得到脂联素抗体纳米胶乳颗粒。
本实施例所用壳聚糖微球通过如下方法制备得到：
将壳聚糖溶解于浓度为0.2mol/L醋酸水溶液中得到壳聚糖水相溶液，然后加入到含有表面活性剂Span-80的环己烷溶剂中，水相与油相体积比为1:2，搅拌乳化后加入戊二醛交联反应，产物经分离、洗涤、冷冻干燥，得到壳聚糖微球。检测所得壳聚糖微球平均粒径为320nm。
对比例1
本对比例的一种用于检测脂联素的试剂盒，与实施例1相比，区别在于R2试剂中的脂联素抗体纳米胶乳颗粒参照CN 108570104 A中公开的技术制备，具体制备步骤如下：
1)、100mg含羧基的胶乳颗粒(购自Bangslab，功能性聚苯乙烯微球)溶解到5mlMOPS缓冲液中(50mM，pH 6.4)，得到胶乳颗粒溶液。
2)、将待交联脂联素特异性抗体溶解于5ml MOPS缓冲液中(50mM，pH 6.4)，浓度达到3mg/ml得到抗体溶液。
3)、将胶乳颗粒溶液和抗体溶液充分混合，然后加入最终浓度20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于混合液中，室温下进行交联反应3h。
4)、加入终浓度1ml 1M pH10的Tris，孵育10分钟终止交联反应。
5)、收集交联了抗体的乳胶颗粒于透析袋(Thermo)中，并放置于1000mlMOPS(50mM,PH8.0)缓冲液中，冰箱中4℃透析过夜，重复层析步骤3次。
6)、使用MOPS(50mM,pH 8.0)稀释交联了抗体的乳胶颗粒，最终浓度达2mg/ml。
对比例2
本对比例的一种用于检测脂联素的试剂盒，与实施例1相比，区别在于R2试剂参照CN111239421A中公开的技术制备，具体制备步骤如下：
①胶乳粒子的活化、洗涤
将羧基化的聚苯乙烯胶乳溶液经碳化二亚胺活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，并使胶乳颗粒的浓度为10mg/ml；
②链亲和素包被胶乳颗粒
a.取1mL活化洗涤后的聚苯乙烯胶乳溶液，加入链亲和素，使链亲和素终浓度为0.1mg/mL；混匀后，置4℃摇床以220rpm转速包被12h；
b.用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的链亲和素，重复3次；
c.封闭：将洗涤后的包被链亲和素的胶乳颗粒溶于包含保护剂的缓冲液中，使胶乳颗粒的终浓度为2mg/ml；
③抗人脂联素抗体的生物素化
生物素选用已活化产品，将生物素与抗人脂联素抗体混合，室温下反应2h，离心，除去其中少量的沉淀物，将上清装入透析袋中，在4℃下置于PBS缓冲液中透析过夜；其中，所述抗人脂联素抗体与所述生物素的摩尔比为2:1；
④生物素化脂联素抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接
在步骤②中所得的链亲和素包被的胶乳颗粒溶液中加入步骤③中所得的生物素化抗人脂联素抗体，混匀后置37℃摇床孵育1h，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物；
⑤清洗
将步骤④中形成的胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人脂联素抗体复合物溶液离心，弃上清，重复清洗3次；将末次沉淀溶于含保护剂和防腐剂的缓冲液中，使胶乳颗粒的终浓度为2mg/ml。
实施例5
对本发明的试剂盒进行性能参数设定，以实施例1的试剂盒为测试样。试剂盒测定使用日立7100全自动生化分析仪，检测主波长和副波长参数分别设置如表1所示。测试样品量分别设置如表2所示；R1试剂和R2试剂的加入量分别设置如表3所示。测定方法采用两点终点法：将R1试剂加入待测样品，于37℃反应3分钟，然后加入R2试剂即开始读点测得吸光度A1，5分钟之后再次读点测得吸光度A2，计算吸光度差值ΔA＝A2-A1。
表1
Figure BDA0003046214120000111
表2
Figure BDA0003046214120000112
表3
Figure BDA0003046214120000113
Figure BDA0003046214120000121
根据正交实验法确定最佳的检测参数条件为：检测主波长630nm，副波长800nm；样品量3μl；R1试剂200μl；R2试剂50μl。
实施例6
(1)标准曲线绘制：
以实施例5确定的最佳的检测参数条件绘制标准曲线，用脂联素高浓度标准品(40mg/L)，用生理盐水将其按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64稀释，以实施例1的试剂盒用日立7100全自动生化分析仪进行检测，绘制吸光度差值ΔA*100与脂联素浓度之间的关系曲线，结果如图1所示。由图1可见脂联素浓度为0.625～40mg/L范围内，吸光度差值与脂联素浓度呈线性关系，标准曲线的线性拟合方程为：y＝1.7372x+0.4947，R2＝0.9998。
(2)灵敏度：
A、以5％牛血清白蛋白溶液为空白样本，以空白均值加两倍标准差报告最低检测限，以实施例1和实施例4的试剂盒进行测试，按实施例5确定的最佳的检测参数条件重复测定20次，结果显示本发明试剂盒的最低检测限分别为0.1mg/L(实施例1)和0.2mg/L(实施例4)。同样条件下对比例1和对比例2的最低检测限分别为0.5mg/L和0.3mg/L。
B、以脂联素高浓度标准品(40mg/L)，用生理盐水将其按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64稀释，以实施例5确定的最佳的检测参数条件用日立7100全自动生化分析仪进行检测，比较本发明(实施例1和实施例4)与对比文件1和对比文件2(脂联素抗体纳米胶乳颗粒的浓度均为2mg/mL)之间的信号值大小(以吸光度差值ΔA*100进行比较)，结果如下表4所示。
表4
Figure BDA0003046214120000122
Figure BDA0003046214120000131
通过以上结果可以明显看出，采用本发明的脂联素抗体纳米胶乳颗粒的检测试剂盒相比现有胶乳颗粒制备的检测试剂盒具有更低的检测限，且同样脂联素浓度下的检测信号值更大。说明本发明的检测试剂盒具有更高的灵敏度。
(3)检测效率：
以实施例5确定的最佳的检测参数条件用日立7100全自动生化分析仪进行检测浓度为2.5mg/L的脂联素标准品，将R1试剂加入待测样品，于37℃反应3分钟，然后加入R2试剂，测定吸光度，比较本发明(实施例1和实施例4)与对比文件1和对比文件2(脂联素抗体纳米胶乳颗粒的浓度均为2mg/mL)吸光度稳定的最短时间，结果如下表5所示。
表5
实施例1 实施例4 对比例1 对比例2
反应时间 2min12s 2min46s 4min56s 3min38s
由表5结果可以明显看出，本发明的脂联素抗体纳米胶乳颗粒通过对胶乳微球进行聚乙二醇表面改性，在聚乙二醇促凝剂的作用下可以进一步加快抗原抗体反应，缩短胶乳颗粒交联物形成和增大的时间，显著提高检测效率。
(4)稳定性：
将试剂盒置于4℃恒温箱中保存12个月后取出，以实施例5确定的最佳的检测参数条件用日立7100全自动生化分析仪进行检测浓度为2.5mg/L的脂联素标准品，各浓度重复测定3次，比较本发明(实施例1和实施例4)与对比文件1和对比文件2(脂联素抗体纳米胶乳颗粒的浓度均为2mg/mL)检测结果与标示值的相对偏差，结果如下表6所示。
表6
实施例1 实施例4 对比例1 对比例2
相对偏差 2.12％ 0.99％ 4.76％ 3.23％
由表6结果可以明显看出，本发明进一步创新的采用生物相容性更好的壳聚糖微球作为胶乳颗粒，与抗体结合效率高、抗体活性稳定性好，无需加入保护剂或稳定剂，可显著提高试剂盒稳定性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：
(1)胶乳微球的聚乙二醇表面改性及链亲和素包被：将活性胶乳微球分散于水中，加入酸性催化剂和聚乙二醇搅拌混合均匀，再加入戊二醛进行表面改性反应，得到聚乙二醇表面改性胶乳微球；然后加入链亲和素继续混合孵育，得到聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球；
(2)脂联素抗体的生物素化：将生物素与脂联素抗体混合反应，得到生物素化脂联素抗体；
(3)脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备：将步骤(1)所得聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球与步骤(2)的生物素化脂联素抗体混合孵育，得到脂联素抗体纳米胶乳颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述活性胶乳微球是指氨基聚苯乙烯微球或壳聚糖微球；活性胶乳微球的粒径范围为100～500nm。
3.根据权利要求2所述的一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备方法，其特征在于所述壳聚糖微球通过如下方法制备得到：
将壳聚糖溶解于醋酸溶液中得到壳聚糖水相溶液，然后加入到含有表面活性剂的有机溶剂中，搅拌乳化后加入戊二醛交联反应，产物经分离、洗涤、冷冻干燥，得到壳聚糖微球。
4.根据权利要求3所述的一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备方法，其特征在于：所述醋酸溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，所述表面活性剂是指Span-80，所述有机溶剂是指环己烷，所述水相溶液与油相有机溶剂的体积比为1:2～4。
5.根据权利要求1～4任一项所述的一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述酸性催化剂是指盐酸；所述聚乙二醇的平均分子量为800～6000，聚乙二醇加入量为活性胶乳微球质量的1％～10％；所述表面改性反应的温度为20～40℃，时间为1～8h。
6.根据权利要求1～4任一项所述的一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述生物素与脂联素抗体混合的摩尔比为1:1～5；所述脂联素抗体是指抗人脂联素单克隆抗体或抗人脂联素多克隆抗体。
7.根据权利要求1～4任一项所述的一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述聚乙二醇表面改性及链亲和素包被的胶乳微球与生物素化脂联素抗体混合孵育的质量比为1:2～2:1。
8.一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的方法制备得到。
9.一种用于检测脂联素的试剂盒，其特征在于：包括脂联素标准品、R1试剂和R2试剂，其中R1试剂包含电解质、促凝剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液，所述R2试剂包含权利要求8所述的脂联素抗体纳米胶乳颗粒、电解质、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。
10.根据权利要求9所述的一种用于检测脂联素的试剂盒，其特征在于：所述电解质选自氯化钠，质量浓度为0.5％～2％；所述促凝剂选自聚乙二醇4000～10000，质量浓度为0.1％～5％；所述表面活性剂选自吐温、脂肪醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少一种，质量浓度为0.2％～5％；所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、Proclin系列防腐剂中的至少一种，质量浓度为0.1％～0.5％；所述缓冲液选自MES缓冲液、MOPS缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、磷酸缓冲液或甘氨酸缓冲液，浓度为50～300mmol/L；所述R2试剂中脂联素抗体纳米胶乳颗粒的浓度为0.5～4mg/mL。
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