JPS59224565A - 抗原検出用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアシル化剤で化学的に修飾した抗体（以下アシ
ル化抗体と記載する）を微粒子担体に吸着した感作担体
を主成分とする抗原検出用試薬に関する。

〔技術の背景及び先行技術〕

現在、体液中又は尿中の各種ホルモン、蛋白質、景物及
びこれらの代謝産物等の検出あるいはこれらの濃度の測
定（いわゆる臨床分析）が疾患の診断、予後の判定及び
治療法の決定等に重吸な役割を演じている。そしてこれ
らのｎ）す定は、物理化学的、生化学的あるいは免疫学
的方法でなされているが、免疫学的方法によるＲａｄｉ
ｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＲＩＡ　）　、Ｅｎｚｙｍ
ｅ　ｉ＋Ｉ１ｍｕｎｏａｓｓａｙ　（ＥＩＡ　）等は、
体液中又は尿中の微量成分を特異的かつ再現性よく測定
出来るので臨床分析の分野で広く使用され、免疫学的凝
集あるいは凝集阻止反応による体液中又は尿中の微量成
分の検出法も広く実用に供されている。

この凝集あるいは凝集阻止反応による検出法は、例えば
、抗原を楠゛乳祠物に免疫して抗原に特異的な抗体を産
生させ、抗原及び／又は抗体を微粒子担体（例えば、赤
血球、ラテックス等）に吸着させ、抗体又は抗原と反応
させ、凝集阻止又は〃Ｆ東の状態を肉眼又は機械で観察
又は測定することによって、抗原のを無又は抗原の濃度
を知ることが出来る。

このような担体を利用した凝集又は凝集阻止反応により
、体液中又は尿中の抗原を検出する１ｌｌｌ定方法にお
いて最も影響を及ぼすのは体液中又は尿中に存在する物
質による非特異的凝集（免疫学的な抗原抗体反応に基づ
く特異的な凝集以外の凝集をいう）であり、一般的には
「非特異的凝集反応」と呼ばれている。非特異的凝集反
応は、特に担体に抗体を吸着させて、試料中の抗原との
凝集反応によって感作担体の凝集の有無の判定又は抗原
の濃度の測定をする際に、非常に大きな間顕となる。

即ち非特異的凝集が生じた場合、体液中又は尿中の抗原
が本来存在していないのに存在すると誤って判断され、
あるいは存在量が高いものを低いと判断されることとな
り、抗原の有勲又は緯度を４１１１定する方法としての
Ｍ度及び再現性等に信頼性を欠く結果となる。従って疾
患の診断、予後の判定及び治療法の決定等に重大な影響
を及ばすのである。

このような理由から非特異的凝集反応を排除することは
、免疫学的凝集又は凝集阻止反応によって体液中又は尿
中の抗原を検出する方法においてはきわめて重要なこと
であり、非特異的凝集反応を排除するための方法が従来
種々試みられている。

それらの方法には、使用する試薬のｔｉＮ液の種類及び
ｐＨを特定する方法（特開昭５７−３５７５４号公報及
び特開昭５７−１８２１６８号公報）非特異的凝集反応
をおこす物質等を濾過して除去する方法（特開昭４７−
３１６９６号公報、特公昭５２−４３０３８号公報、特
公昭５７−２４５０９号公報、特開昭５５−１４６０２
２号公報及び特開昭５７−１８２１７０号公報）、使用
するｔｉｃ薬に特殊な添加物を加える方法（特公昭４３
−１２７４１号公報、特公昭４９−１１４０７号公報、
特開昭５０−８２２３０号公報、特開１１８５５　１２
４１９号公報、特開昭５７−１９７０号公報、特開昭５
７−９７２３号公報及び特開昭５７−５９１６７号公報
）及び抗体を加水分解酵素で分解する方法（特１１１１
昭５４−１３９５９５号公報）等がある。

これらの従来法からも明らかな如く、非特異的凝集の出
現に関する問題が臨床分析の分野における重大な関心事
であり、非特異的凝集反応をｕト除する試みが種々実施
されてきたが、非特異的凝集反応を選択的に完全に排除
することが困篩であるか、選択的に排除出来ても抗体の
持つ特ｊｖ的凝集能が失オ〕れるか、抗体の蛋白質構造
の一部に関連した部分で認められる例えば、リュウマチ
因子又は補体等のような原因の明らかにされている非特
異的凝集の排除であるか、又は非特異的凝集を排除する
ために非常に複雑な試量の調製を必要とするかの朔点が
あり、未だ十分に満足な方法は確豆されていない。

一方、アシル化剤により蛋白質を修飾することは従来か
ら広く行なわれ、蛋白質の構造の研究又は熱安定性の改
善（特公昭５７−２９０３９号公報）のために利用され
ている。更に抗体を化学的に修飾する方法としては２，
４−ジニトロフェニル基の導入（特開昭５４−１３９５
９５号公報）及びサクシニル化（Ｎａｔｕｒｅ　ｌ第２
１０巻、第５３６頁、１９６６年）が知られている。前
者は抗体を微粒子担体により強固に吸着させることを目
的としており、後者はサクシニル化した抗体の製法及び
性質に関する基礎的研究である。従って、従来アシル化
抗体が免疫学的に非特異的な凝集又は凝集ｔｉｌｌ止反
応の排除に有効であることは知られていない。

本発明者らは、免疫学的凝集反応を利用した体液中又は
尿中の抗原を、非特異的凝集反応をおこさず、容易にか
つ迅速に測定出来る試薬の開発を鋭怠進めた結果、驚＜
べきことにアシル化抗体で感作した微粒子担体を使用す
ることにより、体液中又は尿中に存在する非特異的凝集
反応をおこす物質の影響を全く排除し、試料中の抗原を
容易にかつ迅速に精度高く測定出来ることを県い出し、
本発明を完成した。

〔発明の目的及び発明の要約〕

本発明の目的は、試料中に存在する非特異的凝集反応を
おこす物質の影籾を全く受けない抗原倹出用試薬を提供
することにある。

本発明の他の目的は、簡便、迅速かつ再現性良好に体液
中又は尿中の抗原をｉｌｌ！Ｉ＋定するための試量を提
供することにある。

本発明は、免疫学的凝集又は凝集阻止反応による体液中
又は尿中の抗原の４１１１定に使用するための試薬であ
って、抗体を微粒子担体に吸着した感作。

担体を有効成分とする試量において、抗体がアシル化剤
で化学的に修飾されたものであることを特徴とする抗原
検出用試量である。

〔発明の詳細な説明〕

本発明に使用する抗体は、抗原と反応させた際、抗原抗
体反応沈降物を形成するいわゆる１１分子の抗原（＠白
質、ポリペプチド、多糖類、脂質等）又は抗原と反応さ
せた際＠原抗体反応はおこるが抗原抗体反応沈降物は形
成しない、いわゆる低分子の抗原（ステロイド、薬物等
のハプテン）を常法によりモルモット、ウサギ、ヤギ、
ヒツジ、ウマ等（好ましくはウサギ、ヤギ、ヒツジ）に
免疫し、産生させたものであり、抗原のｒＪ４類は間わ
ない。このようにして産生された抗体はそれぞれの抗原
に対する特異抗体を含有する抗血清として免疫動物から
得られるが、この抗血清をそのままでも本発明に使用す
ることが出来る。又、動物血治中には生物学的活性を有
する各種の物質が含まれているので、抗体が含まれてい
る免疫グロブリンを常法により分罷するか、あるいはｔ
Ｉｒ？　決によって更にｒｌＶ製した特異抗体そのもの
を利用することも出来る。

免疫グロブリンの分醍法にはすでに各種の方法が確立さ
れているが、硫安分画法及びＤＥＡＥセルロースカラム
クロマトグラフィーあるいは両者の併用が一般的である
。又、特異抗体をｆｆｆ製するには現在ではアフィニテ
ィークロマトグラフィーが利用されているが、この方法
によってｌ’ｔｌ　７１４Ｍした抗体も使用可能である
。

本発明では前記の如くして得られた抗体を次のように常
法によりアシル化剤を使用して化学的に修飾する。Ｒ［
Ｊち抗体を水又は８ｍ液に溶解し、ｐＨを７〜１０に調
整し、抗体蛋白質Ｊｔｔ量の０．２〜２００％（重量。

以下同じ）、好ましくは０．５％〜１００％のアシル化
剤を撹拌しながら徐々に添加し、この同アルカリ溶液の
適当量を適宜添加することによりｐＨを６〜１０、好ま
しくは７〜９に維持し、アシル化〜１添加終了後この溶
液を蒸１イイ水、塩溶液又は緩衝液に対して透析し、・
不要なアシル化剤を除去し、アシル化抗体を得る。使用
するアシル化剤はどのようなものでもよいが化学的ｆ６
１６Ｇにより抗体本来の特異的活性が失われることなく
、免疫学的凝集反応における非特襲的凝集反応を排除し
、アシル化剤による化学的修飾が定量的に進行し、化学
的修飾後アシル化剤の除去が簡単であり、アシル化剤の
取り扱いが容易であり、かつ安価であることが望まれる
。アシル化剤の具体例としてはモノカルボン酸無水物（
例えば無水酢酸、無水エトキシギ酸）、ジカルボン酸無
水＃（例えば無水コハク酸、無水マレイン酸、無水シト
ラコニン酸、無水テトラフルオロコハク酸、無水３，３
−テトラメチレングルタル酸）その他のポリカルボン酸
無水物、これらカルボン酸のハライド、酸エステルがあ
り、特に好ましいのは無水コハク酸、無水マレイン酸及
び無水酢酸である。

抗体をアシル化剤で処理することにより、抗体の蛋白質
としての荷電が変化する。例えば、無水酢酸を使用して
抗体をアシル化した場合、抗体蛋白質分子中のりジンＭ
Ｊｔｌｉのε−アミノ基がアセチル化され、アミノ儀の
正荷電が無荷電となる。その結果、抗体蛋白質分子全体
の荷電は未処理のそれと比較して若干負側に移行するこ
ととなる。又、無水コハク酸を使用して抗体をアシル化
したｔ１＋）合、抗体蛋白質分子中のりジン残基のε−
アミノ基がサクシニル化され、アミノ共の正荷電がコハ
ク酸の１個のカルボキシルの負荷電にＭｅされ、その結
果抗体蛋白性分子全体の荷電は未処１４１（のそれと比
較して著しく負側へ移行することとなる。このようなア
シル化抗体の荷電の移行は、イ４！用するアシル化剤の
部類、ａ度及び処理条件等により、それぞれ変動するが
、アシル化抗体が非特嚢的尚集をおこさない至適条件は
使用するアシル化剤の種類により、容易に選択すること
が出来る。

本発明に使用する微粒子担体はラテックス粒子、赤血球
、無機化合物等であり、中でもラテックス粒子が望まし
い。ラテックス粒子にも種々の種類があるが、反応基が
なく、かつ化学的及び血清学的に不活性なポリスチレン
、ポリブタジェン、スチレン・ブタジェン共重合体のラ
テックス第３γ子が望ましく、特にポリスチレンラテッ
クス粒子が。

望ましい。

使用するラテックスわ７子の直径は０．０５〜５μ、特
に０．１〜２ｐが望ましい。

次に微粒子担体にアシル化４１ｉ体を常法により吸着さ
せる。ｒＪ粒子担体をｐＨ６からｌＯの熱衝を俊に分散
し、アシル化抗体を溶１ｉｐｇ　シた緩衝液に前記微粒
子担体懸濁液を加えて混合し、抗体を微粒子担体に棹多
作する。感作するアシル化行す体の量は、その種類及び
目的とする感度等の種々の条件により適宜選択決定すれ
ばよい。感作温度は４から７００Ｃ１好ましくは２５〜
５６℃であり、感作時間は数分ないし数時間であるが好
ましくは０．５〜３時間である。このようにして得られ
たアシル化抗体を感作した微粒子担体を遠心分離して沈
殿物を分評し、沈殿物そのもの又は沈殿物をｐＨ６〜１
ｏの緩衝液に再分散して乾伶し、試量とすることもでき
る。この乾燥して得た試薬に１１接所定晴の試料を添加
するか又は使用時に緩衝液に懸濁するがして試料中の抗
原を測定することもできる。

又遠心分離して得られた沈殿物をｐＨ６〜１ｏの緩衝液
に再分散し、液状の試薬とすることもできる。液状の試
薬の保存及び反応時の安定性を維持するために安定剤を
添加してもよい。安定剤としては例えば免疫反応に関与
しない蛋白ｆ％、糖等が用いられ、特に血液アルブミン
が好適である。

アシル化抗体を感作した微粒子担体を緩挿１液に分散す
る濃度は通常０．０１〜３．０％、好ましくは０．０５
〜１．５％である。

以上のようにして本発明の試薬は製造される。

本発明の試薬（液状）は次のようにして使用される。体
Ｈ（血液等）又は犀等の試料（必要に応じ希釈等の前処
理を常法により行なってもよい）の一定量をスライド板
上又は試験管に採取し、本発明の試薬の所定数を加え、
均一に混合する。そして生じた凝集を肉眼で観察するか
又は光学的に測定する。肉眼で観察する場合には、スラ
イド上又は試験管中で抗原を含む体液又は尿の試料を本
発明の試薬と混合し、凝集の有無を観察する。又光学的
に測定する場合には、試験管中で抗原を含む体液又は尿
の試料を本発明の試薬と混合し、常法・により光学セル
中で光の透メＸ７１率、ｊ・孜乱光又は副Ｊ（の変化を
１１（り定する。

乾燥した本発明の試薬は、使用時に綴所γ（シに懸濁し
、前記液状の本発明の試量と同様に使用され、乾燥した
本発明の試薬にｌｉ接試料を加える場合には体液（血液
等）又は尿等の試料の一定量を乾暢した試薬に加え混合
して均一に再分散させ、前記液状の本発明の試薬と同様
に凝集の有無を肉眼で観察するか光学ＩＩＸＪに測定す
る。次に実施例をｎ′「３載して本発明を更に詳述する
。

実施例　１ （１−１）抗体（抗１１ｃＧ免佼グロシリン）の調製高
度に精製したヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下ＨＣＣ，
と記載する）をヤギに免疫して得られた抗ＨＣＧ血清５
０ｍ／に硫酸アンモニウムの飽和的１々２５ｒｎｌを加
え、水冷下で２０分間撹拌した後、１０．００Ｏｒ、ｐ
、ｍ、で２０分間遠心分離を行ない、生じた沈殿を回収
した。得られた沈殿を水３０ｍ１に溶解し、さらに硫酸
アンモニウムのｆｌｉ’ｌ和溶萌１５ｙｒＬ／を加え、
水冷下で２０分間遠心分離を行ない、生じた沈殿を回収
した。同様な１〜°１作をさらに２回反復し、最終的に
得られた沈殿を０．０１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０
）に溶解し、あらかじめ同一のｔｌｌ液液平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラムを用いたゲル濾過により免
疫グロブリンを分別し、得られた免疫グロブリン分画を
凍結乾燥し、＠　ＩＩＣＧ免摂グロブリン約５ｏｏｍＩ
Ｉを得た。

（１−２）抗体（抗ＨＣＧ免疫グロブリン）のアシル化 前記（１−１）で得られた抗１１ＣＧ免疫グロブリン２
００　ｍをＮａＯＨ添加０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１溶液（ｐ
ｌ＋８）に１％のｌ）ツ度で溶解し、氷水中で冷却した
。この□溶液を撹拌しながら無水コハク酸の粉末４０ｍ
１を徐々に添加し、溶液のｐＨの低下防止のためにｌＮ
　ＮａＯＨを添加しながらｐＨを７以上に椎持し、無水
コハク酸を溶解した少さらに１時間撹拌を継続した。反
Ｉ心終了才メ）この混合液をＮｇｏｌｌ　ｉ％　ＪＩｌ
ｊ　Ｏ，Ｉ　ＭＮａＣ１俗液（ｐＨ８−５）に対して一
晩透析してコノ１り酸を除去し、サクシニル化４４’Ｃ
ｕｃｃ免１ノ」グロブリン約２０２　ｍ９を得ブこ。

（１−３）アシル化抗体（サクシニル化抗１１ＣＧ免疫
グロブリン）感作微粒子担体の製造 １）Ｉ己（１−２）で貧ｔられたサクシニル化抗１１Ｃ
Ｇ免疫グロブリンをグリシンＱ％　Ｎｌ　液（ｐＨ８−
２）にＩ　ｍｌ　／　ｍｌの潤度に溶解し、この溶液１
容と、粒子径０．２２０ｐのポリスチレンラテックス粒
子（ダウケミカル社１罪）を２％の淵ＩＷでグリシント
′月・喧（ν（ｐＨ８，２）に分散した商ｌ容とを混合
し、３７°Ｃで１時間保持し、サクシニル化抗１１ｃＧ
免疫グロブリンをポリスチレンラテックス粒子に吸着さ
せた。

次いで感作ラテツクスを１０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２
０分間遠心分離し、未吸着のサクシニル化抗１１ｃＧ免
疫グロブリンを除去し、沈殿した感作ラテツクスを集め
、サクシニル化抗＋１ＣＧ免疫グロブリン病作微牧子担
体約２．５ｇを得た。

（＋−４）＠尿検出用試薬の製ｄ１ 前記（１−３）で得られたザクシニル化抗１１ｃＧ免疫
グロブリン感作ラテックス１ｇを、安定剤として０．１
％のウサギ血清アルブミン（以下Ｒ５Ａと記載する）を
含むグリシン緩衝液（ｐｌ＋　８−’２　）１００７Ｗ
Ａに再ＩＭｊｌｋｌしサクシニル化抗＋１ＣＧ免疫グロ
ブリン感作ラテックス試芋を得た。

（１−５）標準ＨＣＧ清液による感度１１１１１定以上
のようにして得られたサクシニル化′４ｉＴ、　ＨＣＧ
免４ψグロブリン感作ラテックス試薬の感度を次の方法
により測定した。表１に示すｌ）、５度で標準１１ｃｃ
ヲ０．１％Ｒ５Ａ　含ｍりＩＪ　シンｖＩ？＋ＹＭ　（
ｐＨ８，２）　ｆｉ１ｍ溶解した液５０ｐ７、該緩衝液
２５ｐｊｌ！及びザクシニル化抗１１ＣＧ免疫グロブリ
ン感作ラテックス試力（２５μｌをそれぞれスライドグ
ラス上に滴下し、混合した。次いで３分間緩徐にスライ
ドグラスを揺動させて凝集の有無を肉眼で観察した。な
お対１ｆ＋４としての従来法はサクシニル化抗ＨＣＧ免
疫グロブリンの代りにＩ’ｌｊＪ記（＋−１）で得られ
た抗＋１ｃｒ、免疫グロブリンを用いて同様に製造した
抗１１ｃＧ免疫グロブリン感作ラテックス試邸を用いた
。その結果は表１に示すとおりであった。

表　　１ （注）十：凝集有、　−：凝集類 Ａ１から明らかなように、本発明の試薬と従来法のそれ
とは同一の検出感度（Ｉ　ＩＵ／ｙＷＡ　）を有し、＠
　ＩＩｃｃ免疫グロブリンのサクシニル化による検出感
度への影響は認められなかった。

（＋−６）非妊婦尿による非特異的とに集反応　出現の
有ｐ１の測定 非妊婦尿２０試料を遠心分陣して沈ＩＩＱ′物を除いた
原尿５０ｐ７をスライドグラス上に滴下し、以下前ｉ＋
ｉ！（１５）と同一の操作に従って凝集の有無を肉眼で
観腎した。対１１６としての従来法による試某はＦｌｉ
ｔ記（１−５）と同一の試薬を用いた。その結果は表２
に示すとおりであった。

表　　　２ （注）＋：凝集　有、±：弱い凝集　毎、−二凝集　無 衷２から明らかなように、非奸ＭｕＪにおいて本発明の
試々５は非特異的凝集が１例も認められなかったのに対
し、従来法による試薬においてはすべての検体において
凝集又は弱い凝集が紹められた。

このことは従来法による試μｓではいずれの試料でも非
特異ＦｒＪ　Ｍ集が生じ、試料中のＩＩＣＧを正確に検
出できないことを示している。

（１−７）奸ｆｌｅｄ尿による尿中１１ＣＧの測定初期
妊婦尿２０試料を前記（１−６）と同一の操作で測定し
た。尚、比較のため尿中ｔｒｃｃ咋度をＲａｔｋｙらの
ＲｒＡ　　（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ｌｌａｅｍａｔｏｌｏｇｙ　＋３０巻、１４５頁、１９
７５年）によってｉｌ＋’、ｌ＋定した。その結果は表
３に示すとおりであった。

表　　　３ （注）＋：凝集　有、±：弱い凝集　有、−：凝集　無 本発明の試薬においてはＨＣＧの検出限度が１ＩｌｌΔ
りに設定されているので初期妊婦尿中のＩＩｃＧ濃度が
本発明の試薬の検出感度以下である５試訃ト（Ｎｏ、　
４．６、！３．１７及び１８）では凝集が認められず、
ＲＩＡによる測定結果と一致していたが、従来法による
試薬では検出感度以下の試料でもすべて凝集が認められ
、ＲＩＡによるｉｔｕ定結定結一致しなかった。

実施例　２ （２−１）＠体（抗エストリオールー１６α−グルクロ
ナイド免疫グロブリン）の調製 エストリオール−１６α−グルクロナイド（以・下Ｅ３
−１６αＧと記載する）と牛血溝アルブミン（以下ＢＳ
Ａと記５に９．する）を常法により化学的に結合させて
得たＥ３−１６α（、−ＢＳＡ　？ｊ！合物を家兎に免
疫し、得られた抗Ｅ３−１６　ａＧ　−ＵＳＡ血清５０
　ｍｌを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　　１
０／！に１１１［。

透析した。ＢＳＡに抗Ｅ３−１６αＧ　−ＵＳＡ抗体を
吸収させ、この溶液をあらかじめ上記鰐締液で平衡化し
たＤＥＡＥセルロースを用いたクロマトグラフィーによ
り免疫グロブリン分画を回収し、４７ｊ［Ｅ３−１６α
Ｇ免疫グロブリン約２５０哩をＩｆた。

（２−２）抗体のアシル化 前記（２−１）で得られた抗Ｅ３−１６αＧ免疫グロブ
リンｌ１００ｒｒＬを０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ９）
に！％儂度に溶解し、氷水中で冷却し、溶液を撹拌しな
がら無水マレイン酸の粉末５ｒｎＩＩを徐々に添加し、
ｐｉの低下を防止するために０．５　Ｎ　Ｎａ０１１を
添加しながらｐＨを７以上に維持し、無水マレイン酸を
溶解後さらに１時間撹拌を継続した。反応終了後混合液
をｐＨ８，５に副りｙした蒸留水に対して透析し、未反
応のマレイン酸を除去した後凍結乾釉し、マレイル化槙
Ｅ３−１６αＧ免梗グロブリン約９８フ醇を得た。

（２−３）マレイル化抗Ｅ３−１６αＧ免硬グロブリン
感作ラテックスの＃　？ａ 前記（２−２）で得られたマレイル化抗Ｅ３−１６αＧ
免疫グロブリンをバルビタール緩Ｎ＋１ｆｆ９　（ｐＨ
７，８）にＩ　ＷＬｇＡｎｌの１農度で溶解した溶液１
容と、粒子径０．１９８μのポリスチレンラテックス粒
子（ダウケミカル社製）を２％のめ度でパルビタール＃
＋か両液（ｐＨ７，８）に分散した液ｌ容とを已合し、
４５°Ｃで１時間保持しマレイル化抗Ｅ３−１６αＧｇ
５疫グロブリンをポリスチレンラテックス粒子に吸着さ
せた。次いで感作ラテツクスな１０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ
、　２０分１１り遠心分ｇｔＦＬ／、未吸着のマレイル
化抗Ｅ３−１６αＧ免疫グロブリンを除去し、沈殿した
マレイル化抗Ｅ３−１６αＧ免疫グロブリン感作ラテッ
クス約１．５　ｉＩを得た。

（２−４）＠原検出用試楽の製造 Ｔ）ｉｌＢｅ＝　（２３）　テ得らｈ　タ’７　Ｌ／イ
ル化ＪｊＥＥ３−１６αＧ免疫グロブリン感作ラテック
ス０．５ｇを、・安定剤として０．１％のＲＳＡを含む
パルビタール緩ｍ液（ｐ＋＋　７．８　）　　１００　
ｍｌに再＋１１１し、マレイル化抗Ｅ３−１６αＧ免疫
グロブリン感作ラテックス試薬を得た。

（２−５）　　Ｅ３−１６αＣ，−Ｒ５Ａ感作ラテック
ス試薬の製造 Ｅ３−１６αＧとＲＳＡを特開昭５４−８７１５号公報
記載の実施＠ｌの方法に基づいてＥ３−１６αＧがＲＳ
Ａ　１分子当り２個結合しているＥ３−１６αＧ−ＲＳ
Ａを合成した。このＥ３−．１６αＧ　−ＲＳＡを前記
（２−４）と同一の方法により、Ｅ３−１６αＧ−Ｒ５
Ａ感作ラテックス試鵡を得た。得られた試薬のＥ３−１
６αＧの検出感度を０．２０ワａに調整した。

（２−６）標準Ｅ３−１６αＧ溶液による感度設定前記
（２−４）及び（２−５）で得られた２Ｒ類の試量によ
り凝集阻止感度を測定した。−５表４に示す標準Ｅ３−
１６αＧのバルビタール緩衝液（ｐｎ７．８）　　５０
μｌと前記（２−５）で得られた感作試薬２０μｌとを
スライドグラス上に滴下し、混合した。前Ｌ３（２４）
で得られた本発明の試薬２０ｔｔ７を混合液中に滴下し
、３分間緩徐に揺動させて凝集の有無を肉眼で観、察し
た。なお対照の従来法による試薬としては、マレイル化
抗Ｅ３−１６αＧ免疫グロブリンの代りに前記（２−１
）で得られた抗Ｅ３−１６αＧ免疫グロブリンを用い、
前記（２−３）及び（２−４−）と同一の方法により抗
Ｅ３−１６αＧ免疫グロブリン感作ラテックス試薬を製
造し、上記と同様の操作で凝集の有無を肉ＩＩＩσで観
察した。その結果は表４に示すとおりであった。

表　　　４ （注）＋：凝集　有、−二凝集　無 光４から明らかなように本発明の試〉１２≦と従来のそ
れとは同一の検出感度（０，２μｍ１／ｍｌ　）を有し
、抗Ｅ３−１６αＧ免疫グロブリンのマレイル化による
検出Ｆ−３Ｂへの影響は認められなかった。

（２−７）尿中Ｅ３−１６αＧの測定 初期妊婦尿ｌＯ試料を前ｆｄ（２−６）と同様の操作で
６（す定した。尚比較のため尿中Ｅ３−１６αＧ１農原
を５ｔａｎｃｚｋらのＲＩＡ　　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＋　１
０巻、４４３貞、１９７９年）によって測定した。その
結果は表５に示すとおりであった。

表　　　５ （注）＋：凝集　有、−二凝集　無 本発明の試共においてはＥ３−１６αＧの検出１製度が
０．２μｉ／１ａｌｌに設定されているので初期妊婦尿
、中のＥ３−１６αＣ濃度が本発明の試薬の検出感度以
下である４試料（ＮＱｌ、５．７及びＩｏ）では凝集が
認められ、ＲＩＡによる副室結果と一致していたが、従
来法による試薬では検出感度以上の試料でもすべて１．
！Ｅ集が認められ、全試料とも検出感度以下の１１°′
１度と判定され、ＲＩＡによる測定結果と一致しなかっ
た。

実施例　３ （３−１）抗伺（（Ｊ冗ヒトフィブリノーゲン免疫グロ
ブリン）のｎＩＭ製 篩ＪｊＪに精１トすしたヒトフィブリノーゲン（以下Ｆ
ｇとＷｔ’ｒ載する）を家兎に免疫して得られた抗Ｆｇ
　、１ｒｆｌ清ｌＯ婦を、常法により島゛Ｉ製したＦｇ
−セファロース４Ｂを充填したカラムにａ液した。次い
で０．０１　）咥すン酸援衝液（ｐＨ８，０）を；ｉｌ
ｊ　：ｉシしてカラムを洗浄し、抗Ｆｇ免疫グロブリン
以外の不要物を除去した。次いで０．２ドーグリシン−
塩酸（ｐＨ２，３）で抗Ｆｇ免グψグロブリンを溶出さ
せ、溶出液のｐＨを７〜８に保持した。ｈ３終的に溶出
液のｐＩＴを７．５に調整した後、凍結乾すした。この
調製法を反復して実施し、抗Ｆｇ免疫グロブリン約５０
７７１１７を得た。

（３−２）抗体のアシル化 前記（３−１）で得られた抗Ｆｇ免疫グロブリン５０ｍ
Ｊｌｉ’を０．５％のｒ３度で水に俗解し、氷水中で冷
却しながら６ｇの酢酸ナトリウムの粉末を加え完全に溶
解し、撹拌及び冷却を続けながら無水酢酸２５ｐｊ？を
緩徐に′ＦＳ加し、添加終了掛川に１時間反応を継続し
た。反応終了移、浴液を０．１ＭのＮａＣ１を含むグリ
シン綴循ｉ液（ｐＩＴ　８．２　）に７、Ｊシて一晩透
析し、酢酸を除去し、アセチル化１１″ＣＦｇ免疫グロ
ブリン約４５語を得た。

（３−３）アセチル化抗Ｆｇ免疫グロブリン感作うテッ
クス言式薬の３トヌ漬 前ｙｉ３（３−２）で得られたアセチル化抗Ｆｇ免。

疫グロブリンをグリシンＭＪ？ｆｆｆ　（ｐＨＬ６　）
に０．３　ｍＦ！７ｔｒｔｌの濃度で溶解した溶液１警
と、粒子径０．７２１　ｐのポリスチレンラテックス粒
子（ダウケミカル社製）を２％の濃度でグリシン瞬衝萌
（ｐＩＴ　８．６　）に懸濁した液ｌ容とを混合し、１
ユ下実施例１と同様の操作でアセチル化ｈＺ　Ｆｇ免疫
グロブリン感作ラテックス１．２％を含む本発明の試蘭
約８０＋ｙｚ６を得た。

（３−４）［に阜Ｆｇ浴液による感度測定前記（３−３
）で得られた本発明の試薬の感度を測定した。本発明の
試？ｆｆｊ２４Ｍ”と表６に示す標？４１１Ｆｇ溶ＩＴ
ν〔０，２％ウサギ血清アルブミンを含有するグリシン
緩衝液（ｐｌｒ　ｓ、６　）に溶解：］７５ｐＡをスラ
イドグラス上に滴下し、以下実施例１（１−５）と同様
の操作で凝集の有無を肉眼でｆｉｊｌｉ察した。なお対
照の従来法による試薬としてはアセチル化抗Ｆｇｉ疫グ
ロブリンの代りに前記（３−１）で得た＠Ｆｇ免疫グロ
ブリンを用いて、前記（３−３）と同様に抗Ｆｇ免疫グ
ロブリン感作ラテックス試薬を調製し、上記と同様の操
作で、凝集の有無を肉眼でｆｆ４１察した。その結果は
衷６に示すとおりであった。

表　　　６ （注）十：凝集　を、−：凝集　側 光６から明らかなように、本発明の試薬と従来法による
それとは同一の検出り感度（ｏ、　５　Ｌｌ　１１／ｍ
、ｌ）を有し、＠　Ｆｐ免疫グロブリンのアセチル化に
よる検出感度への影響は認められなかった。

（３ｆ５）！康男子尿による非特異的凝集反ｆイメ出現
の有無の測定 健康男子尿１０試料（原尿のまま７５μｌをスライド上
に滴下し、次いで前記（３−３）で得た本発明の試薬２
５μｌを滴下して３分間緩徐にスライドグラスを揺動さ
せて凝集の有無を肉１１１４でη“（１察した。なお従
来法による試凋には前記（３−４）と同一のものを用い
、同様にＩＡＦ隼の０無をＮ’−１’、ｂた。

その結果は表７に２尺すとおりであった。

表　　　７ （注”）　＋　：　Ｈ！＋！　　有、−二Ｃ″不集　Ｉ
Ｊ１Ｆ本発明の試８Ｍでは非特異的凝集が１例も認めら
れなかったのに対し、従来法による試〉ｖ襲こおいては
全試料に非特ゲ４的Ｉｖ２集が關められた。

（３−６）　尿中フィブリン又はそれらの分ａｉｔ　ｙ
ｒｒ物（以下ＦＤＰと記載する）の測定 血管内舜固症侯群を疑われる１０名から採取した尿を試
料として前記（３−５）と同一の操作法に従って尿中Ｆ
ＤＰをγμり定した。なお比１１（変のため尿中ＦＤＰ
　ｒ農度をＴｉｌ記ＲａｔｋｙらのＲＩＡによって測定
した。そのπΔ巣は表８にボすとおりであった。

表　　　８ （注）＋：凝集　有、−二凝集　無 本発明の試薬においては、試料中のｐｏｐｒＪ度が本感
作ラテツクス試薬の検出感度以下である５試料（Ｎｏ、
４．５．７．９及び１０）１？は群集が認メられす、Ｒ
ＩＡによる１ｉｉｊｌ定結果と一致していたが、従来法
による試シ２！では検出感度以下の試料でもすべて凝集
が討められ、ＲＩＡによるｊｌｉＵ定結果と一致しなか
った。

〔う＾明の効果〕

本発明によってすせられる効果は次のとおりである。

（１）試料中に存イＥ　Ｌ、　、免疫学的に非特Ｕ６的
な凝集又はｎ集阻止を想起する物質にょる影ｌ″、Ｉを
全く受けずに試料中の抗原をＩ’ｌ！ＩＩ定できる。

（２）試料中の抗原ｎ１す定結果の再現ｐｂが栖めです
ぐれている。

（３）採取直後の新鮮な試料については、試料の一切の
前処理をすることなく、試干ト中の抗原をｆｉｉｌｌ定
できる。

（４）試薬の調製が栖めて簡便である。

特許出願人　森永郭菌株式会社 代理人律１）昭

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫学的凝集又は凝集１ｆｆｌ止反応による体液
   中又は尿中の抗原の測定に使用するための試關であって
   、抗体を微χ）γ子拒体に吸着した感作担体を何効成分
   とする試傅において、抗体がアシル化剤で化学的に修飾
   されたものであることを特徴とする抗原検出用試薬。
2. （２）　ＦＢ作ｍ体カ０．０１−３．０　％（ｆｉｔ　
   ｆｌｔ）の０％　１％でｎ術液に■９濁されていること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の試量。
3. （３）緩（（＋ｊ液のｐＨが６〜１０であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載の試〉
   男。
4. （４）免疫反応に関与しない蛋白質又は！＋’ｉ類を安
   定剤として含有することを特徴とする特許π１を求の範
   囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の試薬。