JPS6363861B2 - - Google Patents
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Description
本発明は抗原−抗体反応を利用する改良された
免疫学的測定方法及びそれに使用する新規な測定
試薬に関し、さらに詳しくは、血液、尿、その他
の体液中に存在する微量の生物学的活性物質を免
疫学的手段により再現性よく的確にしかも高い感
度を以つて検出する方法及び免疫学的凝集反応又
は凝集阻止反応において明瞭でシヤープな凝集移
行像を与える免疫学的測定試薬に関する。 従来、血液、尿その他の体液中に存在する生物
学的活性をもつ微量物質を免疫学的手段により検
出する方法は古くから知られている。この免疫学
的測定方法は、抗原と抗体とが特異的に結合する
こと、すなわち、免疫化学反応を起すことに着目
し、抗原又は抗体の少なくとも一方を免疫学的に
不活性な固体粒子に担持させ、抗原−抗体反応を
凝集反応又は凝集阻止反応として凝集像の出現の
有無を可視的に又は光学的に検知し免疫化学反応
に関与した微量物質の存否及び／又はその量を定
性的又は定量的に測定する方法である。 従つて、この免疫学的測定方法においては、凝
集像の出現の有無が該微量物質の検出の唯一の手
段となるので、凝集反応又は凝集阻止反応におい
て明瞭でシヤープな凝集移行像を与えるかどうか
が、該方法の感度乃至的確さを決定する重大な要
因となる。 しかるに、従来法に従い、抗原又は抗体の少な
くとも一方を不活性担体粒子に担持させて抗原−
抗体反応を行なつても、明瞭でシヤープな凝集移
行像を与えず、再現性よく的確に微量物質の検出
を行なうことができないことが屡々ある。 本発明者らはかかる凝集反応又は凝集阻止反応
において、明瞭でシヤープな凝集移行像を与える
免疫学的測定試薬を開発すべく研究を重ねた結
果、被検液中の検出すべき抗原又は抗体と特異的
に反応する抗体又は抗原を物理的又は化学的に結
合することにより免疫学的に活性化した固体担体
粒子（以下、活性担持粒子という）を、免疫学的
に不活性な固体微粒子と併用し、凝集反応又は凝
集阻止反応を行なえば、相対的に少ない量の活性
担持粒子の使用で、明瞭でシヤープな凝集移行像
が与えられ、被検液中の微量物質を的確に再現性
よくしかも高感度で検出しうることを見い出し、
本発明を完成するに至つた。 かくして、本発明によれば、抗体、抗原又はハ
プテンを物理的又は化学的に結合せしめることに
より免疫学的に活性化した固体担体粒子を用い、
凝集反応又は凝集阻止反応を利用して、被検液中
の免疫学的に活性な微量物質を検出することから
成る免疫学的測定方法において、該凝集反応又は
凝集阻止反応を免疫学的に不活性な固体微粒子の
存在下に行なうことを特徴とする免疫学的測定方
法が提供される。 本発明の方法は、基本的には、抗体、抗原又は
ハプテンを物理的又は化学的に結合せしめること
により免疫学的に活性化した固体担持粒子、すな
わち活性担持粒子を用い、凝集反応又は凝集阻止
反応を利用して被検液中の免疫学的に活性な微量
物質を検出する方法である。 この凝集反応及び凝集阻止反応はそれ自体既知
のものであり、本発明の方法においてもそれ自体
既知の方法で行なうことができる。かかる方法と
しては、例えば次の態様が挙げられる。 (1) 抗体担持粒子と被検液中の抗原との凝集反応 (2) ハプテン抗体担持粒子、及びハプテン抗原担
持粒子又はハプテン化学変性物担持粒子と被検
液中のハプテンとの凝集阻止反応 (3) 抗原担持粒子、抗体（溶液状態） 被検液中の抗原との凝集阻止反応〔ハプテン
抗原担持粒子又はハプテン化学変性物担持粒子
及びハプテン抗体と被検液中のハプテンとの反
応を含む〕 (4) ハプテン抗体担持粒子及びハプテン抗原又は
ハプテン化学的変性物と被検液中のハプテンと
の凝集阻止反応 本発明の方法は、かかる凝集反応又は凝集阻止
反応を、免疫学的に不活性な固体微粒子の存在下
に実施する点に新規特徴を有する。 かかる特徴を有する本発明の方法によれば、 (i) 本発明の方法を凝集反応に適用する場合、凝
集移行像が著るしく明瞭且つシヤープとなり、
測定者の熟練度や主観等による個人差をなく
し、的確で再現性のある測定が可能となり、し
かも、活性担持粒子の使用量を相対的に減らす
ことができる。また、 (ii) 本発明の方法を凝集阻止反応に適用する場
合、上記(i)に述べた効果に加え、従来技術に従
つた方法では一般に検出することが殆んど不可
能であつた極微量の生体物質の測定が可能とな
るという顕著な効果を達成することができる。 本発明において用いうる「免疫学的に不活性な
固体微粒子」（以下単に固体微粒子という）とし
ては、免疫学的に不活性で且つ凝集反応系又は凝
集阻止反応系中で安定に微分散しうるものであれ
ばその材質には特に制限はなく、任意のタイプの
固体微粒子を使用しうるが、特に、活性担持粒子
の調製に際して担体として用いられると同種の固
体微粒子、例えば合成樹脂ラテツクス粒子（例：
ポリスチレンラテツクス粒子、スチレン−ブタジ
エン共重合体ラテツクス粒子、スチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体ラテツクス粒子、ポリビニル
トルエンラテツクス粒子、ビニルトルエン−ｔ−
ブチルスチレン共重合体ラテツクス粒子など）、
コロイド状シリカ、コロイド状アルミナ、ベント
ナイト、コロジオン、カオリン、等が適してお
り、就中、合成樹脂ラテツクス粒子が好適であ
る。 かかる固体微粒子は、上記反応系に微分散しう
る程度の大きさのものであれば、その大きさには
特に制限はないが、平均粒径が一般に0.01〜約２
ミクロン、好ましくは0.05〜約1.5ミクロンの範
囲内にあることが有利である。 上記固体微粒子はそのまま使用することもでき
るが、擬似的な凝集反応を未然に防ぐため、通
常、該固体微粒子をかかる偽反応を防止するため
の被覆処理を施することができる。この被覆処理
に使用しうる被覆物質としては、例えば、牛血清
アルブミン（BSA）、兎血清アルブミン（RSA）
卵白アルブミン（EA）等の蛋白質が好適である。 かかる被覆物質は対象とする抗原−抗体反応で
用いる抗体に応じて選択することが重要であり、
抗体を産生する為に使用する抗原物質とは異種の
物質を使用することが望ましく、例えば、ステロ
イドハプテン抗体を産生するためにステロイドハ
プテンを牛血清アルブミン（BSA）と結合させ
て抗体を産生した場合には、前記固体微粒子は兎
血清アルブミン（RSA）の如き異種動物の蛋白
質を以つて被覆することが望ましい。 かかる蛋白質被覆した固体微粒子の調製はそれ
自体公知の方法に従つて行なうことができ、例え
ば、上記した如き蛋白質を緩衝液中に溶解させ、
次いで、その溶液中に前記固体微粒子を懸濁させ
て撹拌混和して、該固体微粒子表面に該蛋白質を
充分に吸着させた後、該固体微粒子を分離するこ
とにより調製することができる。 その際の蛋白質の被覆量は厳密には規定するこ
とはできないが、一般には、固体微粒子１重量部
当り蛋白質が0.01〜5.0重量部、好ましくは0.1〜
0.5重量部となるような割合で被覆することが望
ましい。 また、上記の如き擬似的な凝集反応を防ぐ方法
として、官能基例えばカルボキシル基又は第一級
アミノ基を含有する合成樹脂ラテツクス粒子を固
体微粒子として用いることも可能である。かかる
官能基を有する合成樹脂ラテツクス粒子として
は、例えば、カルボキシル化スチレン−ブタジエ
ン共重合体ラテツクス粒子、カルボキシル化ポリ
スチレンラテツクス粒子、及びアミノ基含有ポリ
スチレンラテツクス粒子等が挙げられる。 「ハプテン抗原」とはハプテンを抗原性の強い
物質、例えばBSA、RSA、HSA（ヒト血清アル
ブミン）、BGG（牛γ−グロブリン）などと結合
したものを示す（特開昭53−41420号公報参照）。 また、「ハプテン化学変性物」とはハプテンを
カルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高分
子化合物と化学的に結合したものを示す（特開昭
55−52945号公報及び特開昭55−52946号公報参
照）。 本発明の方法に従い、以上に述べた如き固体微
粒子の存在下に、免疫学的凝集反応又は凝集阻止
反応を実施する方法としては、例えば、 (a) 活性担持粒子と固体微粒子の両者を同時に含
んで成る免疫学的測定試薬を予め調製してお
き、この試薬を被検液に加えて凝集反応又は凝
集阻止反応を行なう方法； (b) 活性担持粒子を含んで成る免疫学的測定試薬
とは別個に固体微粒子のみから成る試薬を調製
しておき、該免疫学的測定試薬を被検液に加え
て凝集反応又は凝集阻止反応を行なう任意の時
点で、凝固体微粒子含有試薬を反応系に添加す
る方法； 等が挙げられる。 上記(a)の方法において使用される免疫学的測定
試薬は、一般に、活性担持粒子と固体微粒子の両
者を緩衝液中に懸濁させることにより調製するこ
とができる。該試薬中における活性担持粒子と固
体微粒子との相対的割合は、臨界的ではなく、活
性担持粒子及び／又は固体微粒子の種類等により
広く変えることができるが、活性担持粒子対固体
微粒子の重量比は、一般に１：0.2乃至１：50、
好ましくは１：0.5乃至１：30の範囲内とするの
が適当である。また、該試薬中におけるこれら粒
子の濃度もまた臨界的ではなく、活性担持粒子上
に担持されている抗体又は抗原もしくはハプテン
の種類や、測定方法（凝集反応法が凝集阻止反応
法か）等に応じて最適濃度は広く変化するが、総
括的に言えば凝集反応法に用いる場合、活性担持
粒子と固体微粒子の合計濃度は一般に0.2〜2.0重
量％、好ましくは0.4〜1.2重量％の範囲内、そし
て凝集阻止反応に用いる場合、活性担持粒子と固
体微粒子の合計濃度は一般に0.2〜2.0重量％、好
ましくは0.4〜1.2重量％の範囲内とすることがで
きる。 なお、上記試薬の調製に際して用いられる活性
担持粒子は通常の方法により製造することができ
る。 他方、上記(b)の方法で使用される活性担持粒子
を含んでなる免疫学的測定試薬は従来から使用さ
れているものをそのまま利用することができ、ま
た、固体微粒子のみから成る試薬は、前述した如
き固体微粒子（適宜蛋白被覆されていてもよい）
を緩衝液中に懸濁させることにより調製すること
ができる。この懸濁液中における固体微粒子の濃
度は一般に0.2〜２重量％、好ましくは0.4〜1.2重
量％の範囲内とするのが適当である。 上記(a)及び(b)の方法における凝集反応及び凝集
阻止反応は、前述した試薬を用いることを除き、
それ自体公知の方法により行なうことができる。 しかして、本発明の方法を実際に実施する場合
には、上記の如き試薬は組合わせて試薬系キツト
とするのが便利である。そのような試薬系キツト
としては、例えば、下記の試薬系からなることが
できる。 (i) （抗体担持粒子＋固体微粒子）含有懸濁液。 (ii) （抗原担持粒子＋固体微粒子）含有懸濁液。 (iii) 抗体担持含有懸濁液と固体微粒子含有懸濁液
の組合わせ、 (iv) 抗原担持粒子含有懸濁液と固体微粒子含有懸
濁液の組合わせ、 (v) （抗ハプテン抗体担持粒子＋固体微粒子）含
有懸濁液とハプテン抗原担持粒子又はハプテン
化学変性物担持粒子の組合せ、 (vi) （ハプテン抗原担持粒子又はハプテン化学変
性物担持粒子＋固体微粒子）含有懸濁液と抗ハ
プテン抗体担持粒子、 (vii) ハプテン抗原担持粒子又はハプテン化学変性
物担持粒子含有懸濁液、抗ハプテン抗体担持粒
子含有懸濁液及び固体微粒子含有懸濁液の各々
からなる組合せ、 (viii) 抗ハプテン抗体溶液と（ハプテン抗原担持粒
子又はハプテン化学変性物担持粒子＋固体微粒
子）含有懸濁液、 (ix) 抗ハプテン抗体担持粒子と（ハプテン抗原又
はハプテン化学変性物＋固体微粒子）含有懸濁
液、 (x) （抗ハプテン抗体溶液又はハプテン化学変性
物担持粒子＋固体微粒子と）ハプテン抗原担持
粒子、 (xi) （抗ハプテン抗体担持粒子＋固体微粒子）
含有懸濁液とハプテン抗原溶液又はハプテン化
学反応物溶液。 等が挙げられる。これら試薬系キツトの具体例を
示せば次のとおりである。 (イ) Ａ：BSA感作ポリスチレンラテツクスと Ｂ：抗AT−（抗アンチトロンビン）抗体
感作ラテツクスとよりなる免疫的測定試薬
系。 (ロ) Ａ：RSA感作シリカと Ｂ：抗PLG（抗プラスミノゲン）抗体感作ラテ
ツクスとよりなる免疫的測定試薬系。 (ハ) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクスと Ｂ：抗hCG（抗胎盤性々腺刺激ホルモン）抗体
感作ラテツクスとよりなる免疫的測定試薬
系。 (ニ) Ａ：カルボキシモデイフアイドラテツクス含
有抗ヒトヒブリノーゲン抗体感作ラテツクス
よりなる免疫的測定試薬系。 (ホ) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクス含有
抗AT−抗体感作ラテツクスよりなる免疫
的測定試薬系。 (ヘ) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクス含有
抗エストリオール−16−グルグロナイド抗体
感作ポリスチレンラテツクスと Ｂ：エストリオール−16−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテツクス とよりなる免疫的測定試薬系。 (ト) Ａ：BSA感作ポリスチレンラテツクス含有
プレグナンジオール−３−グルクロナイド結
合PVMMA結合ラテツクスと Ｂ：抗プレグナンジオール−３−グルクロナイ
ド抗体結合ラテツクスとよりなる免疫化学的
測定試薬系。 (チ) Ａ：RSA感作シリカ、 Ｂ：カルボキシメチルモルフイン結合ポリアク
リル酸結合ラテツクス Ｃ：抗モルフイン抗体感作ラテツクス とよりなる免疫化学的測定試薬系。 (リ) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクス含有
抗メタネフリン抗体感作ラテツクス Ｂ：メタネフイリン結合ポリアクリル酸溶液とよ
りなる免疫化学的測定試薬系。 (ヌ) Ａ：カルボキシモデイフアイドラテツクス含
有サイロキシン・BSA感作ラテツクス、 Ｂ：抗サイロキシ血清とよりなる免疫化学的測
定試薬系。 (ル) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクス、 Ｂ：抗エストリオール−16−グルクロナイド抗
体感作ラテツクス Ｃ：エストリオール−16−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテツクスとよりなる免
疫化学的測定試薬系。 以上述べたとおり、本発明による新規な免疫学
的測定方法及び試薬を使用する場合には、凝集反
応および凝集阻止反応に拘らず、その反応終末点
である凝集阻止像から凝集像への移行が極めて明
瞭な凝集像の出現により明確に確認できる、すな
わち凝集移行像が明瞭でシヤープであるので、従
来既知の免疫学的測定方法及び試薬を使用する場
合に比較して、遥かに判定し易く、正確な測定結
果を得ることができる。これらの効果については
後記各実施例において立証されているとおりであ
る。 本発明の新規な免疫化学測定方法及び試薬を使
用すれば、従来既知の免疫化学測定試薬を用いた
場合の判定困難な欠点を改良することができるの
みならず、特に、低濃度に稀釈した場合に於ても
明瞭な凝集像を確認することができ、従つて測定
感度を上げることができるという利点もある。 以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明
する。 実施例 １ (a) BSA感作ポリスチレンラテツクスの製造 BSA300mgを0.24Mグリシン緩衝化食塩液
（PH9.6）50mlに溶解し、これに２％（Ｗ／Ｖ）
ポリスチレンラテツクス懸濁液（平均粒径：
0.220μ）50mlを加えて混合し、室温で２時間撹
拌した。撹拌後４℃、12000rpmで60分間遠心
分離を行い得られた沈殿物を上記緩衝液100ml
で洗浄した。再度遠心分離後、沈殿物を0.5％
EDTA−2Na含有グリシン緩衝化食塩液100ml
に懸濁させBSA感作ポリスチレンラテツクス
を製造した。 (b) ATの製造 ヒト新鮮血１に二重シユウ酸溶液（シユウ
酸アンモニウム12.5ｇとシユウ酸カリウム7.5
ｇを水に溶解して１にしたもの）100mlを加
え、４℃、6000rpmで20分間遠心分離し、得ら
れた血漿を53℃で２分間加熱した。生じた沈殿
を４℃、6000rpmで20分間遠心分離により取り
除いた。その上清１ml当り100mgの硫酸バリウ
ムを加え、室温で30分間ゆるやかに撹拌し、生
じた沈殿物を４℃、6000rpmで20分間遠心分離
して除去した。この操作を再度繰り返す。次い
で限外過により100mlに濃縮した。この濃縮
液10mlに1/200Ｍのリン酸緩衝液（PH7.2）100
mlを加え、同じ緩衝液で膨潤させたヘパリン−
セフアロース4B100ml中に加える。室温で30分
間ゆるやかに撹拌したのち、ガラスフイルター
上で吸引過し、次いで1/200Ｍリン酸緩衝液
（PH7.2）１を用い洗浄したのち、2M NaCl
含有リン酸緩衝液（PH7.2）300mlを用いAT
を溶出した。この溶出液を再度限外過にて10
ml以下に濃縮し、0.1M Tris−HCl緩衝液（PH
8.3）で平衡化したDEAE−セルロースＡ−50
を充填したイオン交換クロマトグラフイーカラ
ムに添加し、0.25MNaCl含有0.1M Tris−HCl
緩衝液（PH8.3）で溶出し、次いで0.01M Tris
−HCl緩衝液（PH8.3）で平衝化したSepha−
dexG−200を用いゲル過し、得られたAT
分画を凍結乾燥した。 (c) 抗AT抗体の製造 上記(b)で得たAT１mgを生理食塩液１mlに
溶解し、同量のコンプリート・フロインド・ア
ジユバンドで乳化し、家兎の足蹠および皮下に
注射した。この注射を３週間間隔で行ない、抗
体価の上昇を確認後全採血を行つた。得られた
血液を室温で40分間放置したのち、室温、
3000rpmで30分間遠心分離により血清を分離し
た。この抗血清40mlに同量の0.9％NaCl含有1/
２００Ｍリン酸緩衝液（PH7.2）を加え撹拌したの
ち、飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗AT
抗体を製造した。 (d) 抗AT抗体感作ポリスチレンラテツクス試
薬の製造 上記(c)で製造した抗AT抗体４mgを５mlの
0.21Mグリシン緩衝液（PH9.6）に溶解し、こ
れに２％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテツクス懸
濁液（平均粒径：0.220μ）５mlを加えて混合
し、室温で２時間撹拌した。この後、遠心分離
して得た沈殿を0.3％にウシ血清アルブミン
（BSA）を含むグリシン緩衝液25mlに懸濁さ
せ、これに上記(a)で製造したBSA感作ポリス
レンラテツクスを25ml加えて均一にし抗AT
抗体感作ポリスチレンラテツクス試薬を得た。 (e) 血漿中のATの測定（凝集反応法） 被検者の血漿３検体を0.24Mグリシン緩衝液
（PH9.6）で30倍、60倍、80倍、100倍、140倍及
び200倍に希釈し、各希釈血漿を10μ反応ス
ライド板上に滴下し、さらに安定剤（正常家兎
血清γ−グロブリン）を10μ滴下後、これに
上記(d)で製造した抗AT抗体感作ポリスチレ
ンラテツクスを１滴ずつ滴下する。三者を混合
し、スライド板をゆるやかに揺動し、３分後に
肉眼で凝集像の有無を観察した。なお、本実施
例においては試薬の感度を0.25mg／dlに調整し
たものを用いた。上記測定方法で同一検体につ
いて10人が測定し、その測定値を一元免疫拡散
法（RID法）〔山村雄一監修、医化学実験法講
座第４巻「免疫化学」第161〜164頁（1972年）
参照〕による測定値と比較し、測定者10人の一
致、不一致を以下のように決めて判定した。 実施例１では検体の希釈培数を30倍、60倍、
80倍、100倍、140倍および200倍で測定したの
で、検体１の場合100倍までの凝集（25mg／dl）
がRID値と一致と判定し、100倍で凝集を認め
ないものを低値、140倍以上まで凝集を認めら
れたものを高値と判定した。同様に検体２の場
合は60倍までの凝集（15μｇ／dl）がRID値と
一致、その他の希釈培数までの凝集は不一致、
さらに検体３の場合は30倍までの凝集（7.5
mg／dl）がRIDと一致、その他の希釈培数まで
の凝集は不一致と判定した。
免疫学的測定方法及びそれに使用する新規な測定
試薬に関し、さらに詳しくは、血液、尿、その他
の体液中に存在する微量の生物学的活性物質を免
疫学的手段により再現性よく的確にしかも高い感
度を以つて検出する方法及び免疫学的凝集反応又
は凝集阻止反応において明瞭でシヤープな凝集移
行像を与える免疫学的測定試薬に関する。 従来、血液、尿その他の体液中に存在する生物
学的活性をもつ微量物質を免疫学的手段により検
出する方法は古くから知られている。この免疫学
的測定方法は、抗原と抗体とが特異的に結合する
こと、すなわち、免疫化学反応を起すことに着目
し、抗原又は抗体の少なくとも一方を免疫学的に
不活性な固体粒子に担持させ、抗原−抗体反応を
凝集反応又は凝集阻止反応として凝集像の出現の
有無を可視的に又は光学的に検知し免疫化学反応
に関与した微量物質の存否及び／又はその量を定
性的又は定量的に測定する方法である。 従つて、この免疫学的測定方法においては、凝
集像の出現の有無が該微量物質の検出の唯一の手
段となるので、凝集反応又は凝集阻止反応におい
て明瞭でシヤープな凝集移行像を与えるかどうか
が、該方法の感度乃至的確さを決定する重大な要
因となる。 しかるに、従来法に従い、抗原又は抗体の少な
くとも一方を不活性担体粒子に担持させて抗原−
抗体反応を行なつても、明瞭でシヤープな凝集移
行像を与えず、再現性よく的確に微量物質の検出
を行なうことができないことが屡々ある。 本発明者らはかかる凝集反応又は凝集阻止反応
において、明瞭でシヤープな凝集移行像を与える
免疫学的測定試薬を開発すべく研究を重ねた結
果、被検液中の検出すべき抗原又は抗体と特異的
に反応する抗体又は抗原を物理的又は化学的に結
合することにより免疫学的に活性化した固体担体
粒子（以下、活性担持粒子という）を、免疫学的
に不活性な固体微粒子と併用し、凝集反応又は凝
集阻止反応を行なえば、相対的に少ない量の活性
担持粒子の使用で、明瞭でシヤープな凝集移行像
が与えられ、被検液中の微量物質を的確に再現性
よくしかも高感度で検出しうることを見い出し、
本発明を完成するに至つた。 かくして、本発明によれば、抗体、抗原又はハ
プテンを物理的又は化学的に結合せしめることに
より免疫学的に活性化した固体担体粒子を用い、
凝集反応又は凝集阻止反応を利用して、被検液中
の免疫学的に活性な微量物質を検出することから
成る免疫学的測定方法において、該凝集反応又は
凝集阻止反応を免疫学的に不活性な固体微粒子の
存在下に行なうことを特徴とする免疫学的測定方
法が提供される。 本発明の方法は、基本的には、抗体、抗原又は
ハプテンを物理的又は化学的に結合せしめること
により免疫学的に活性化した固体担持粒子、すな
わち活性担持粒子を用い、凝集反応又は凝集阻止
反応を利用して被検液中の免疫学的に活性な微量
物質を検出する方法である。 この凝集反応及び凝集阻止反応はそれ自体既知
のものであり、本発明の方法においてもそれ自体
既知の方法で行なうことができる。かかる方法と
しては、例えば次の態様が挙げられる。 (1) 抗体担持粒子と被検液中の抗原との凝集反応 (2) ハプテン抗体担持粒子、及びハプテン抗原担
持粒子又はハプテン化学変性物担持粒子と被検
液中のハプテンとの凝集阻止反応 (3) 抗原担持粒子、抗体（溶液状態） 被検液中の抗原との凝集阻止反応〔ハプテン
抗原担持粒子又はハプテン化学変性物担持粒子
及びハプテン抗体と被検液中のハプテンとの反
応を含む〕 (4) ハプテン抗体担持粒子及びハプテン抗原又は
ハプテン化学的変性物と被検液中のハプテンと
の凝集阻止反応 本発明の方法は、かかる凝集反応又は凝集阻止
反応を、免疫学的に不活性な固体微粒子の存在下
に実施する点に新規特徴を有する。 かかる特徴を有する本発明の方法によれば、 (i) 本発明の方法を凝集反応に適用する場合、凝
集移行像が著るしく明瞭且つシヤープとなり、
測定者の熟練度や主観等による個人差をなく
し、的確で再現性のある測定が可能となり、し
かも、活性担持粒子の使用量を相対的に減らす
ことができる。また、 (ii) 本発明の方法を凝集阻止反応に適用する場
合、上記(i)に述べた効果に加え、従来技術に従
つた方法では一般に検出することが殆んど不可
能であつた極微量の生体物質の測定が可能とな
るという顕著な効果を達成することができる。 本発明において用いうる「免疫学的に不活性な
固体微粒子」（以下単に固体微粒子という）とし
ては、免疫学的に不活性で且つ凝集反応系又は凝
集阻止反応系中で安定に微分散しうるものであれ
ばその材質には特に制限はなく、任意のタイプの
固体微粒子を使用しうるが、特に、活性担持粒子
の調製に際して担体として用いられると同種の固
体微粒子、例えば合成樹脂ラテツクス粒子（例：
ポリスチレンラテツクス粒子、スチレン−ブタジ
エン共重合体ラテツクス粒子、スチレン−ジビニ
ルベンゼン共重合体ラテツクス粒子、ポリビニル
トルエンラテツクス粒子、ビニルトルエン−ｔ−
ブチルスチレン共重合体ラテツクス粒子など）、
コロイド状シリカ、コロイド状アルミナ、ベント
ナイト、コロジオン、カオリン、等が適してお
り、就中、合成樹脂ラテツクス粒子が好適であ
る。 かかる固体微粒子は、上記反応系に微分散しう
る程度の大きさのものであれば、その大きさには
特に制限はないが、平均粒径が一般に0.01〜約２
ミクロン、好ましくは0.05〜約1.5ミクロンの範
囲内にあることが有利である。 上記固体微粒子はそのまま使用することもでき
るが、擬似的な凝集反応を未然に防ぐため、通
常、該固体微粒子をかかる偽反応を防止するため
の被覆処理を施することができる。この被覆処理
に使用しうる被覆物質としては、例えば、牛血清
アルブミン（BSA）、兎血清アルブミン（RSA）
卵白アルブミン（EA）等の蛋白質が好適である。 かかる被覆物質は対象とする抗原−抗体反応で
用いる抗体に応じて選択することが重要であり、
抗体を産生する為に使用する抗原物質とは異種の
物質を使用することが望ましく、例えば、ステロ
イドハプテン抗体を産生するためにステロイドハ
プテンを牛血清アルブミン（BSA）と結合させ
て抗体を産生した場合には、前記固体微粒子は兎
血清アルブミン（RSA）の如き異種動物の蛋白
質を以つて被覆することが望ましい。 かかる蛋白質被覆した固体微粒子の調製はそれ
自体公知の方法に従つて行なうことができ、例え
ば、上記した如き蛋白質を緩衝液中に溶解させ、
次いで、その溶液中に前記固体微粒子を懸濁させ
て撹拌混和して、該固体微粒子表面に該蛋白質を
充分に吸着させた後、該固体微粒子を分離するこ
とにより調製することができる。 その際の蛋白質の被覆量は厳密には規定するこ
とはできないが、一般には、固体微粒子１重量部
当り蛋白質が0.01〜5.0重量部、好ましくは0.1〜
0.5重量部となるような割合で被覆することが望
ましい。 また、上記の如き擬似的な凝集反応を防ぐ方法
として、官能基例えばカルボキシル基又は第一級
アミノ基を含有する合成樹脂ラテツクス粒子を固
体微粒子として用いることも可能である。かかる
官能基を有する合成樹脂ラテツクス粒子として
は、例えば、カルボキシル化スチレン−ブタジエ
ン共重合体ラテツクス粒子、カルボキシル化ポリ
スチレンラテツクス粒子、及びアミノ基含有ポリ
スチレンラテツクス粒子等が挙げられる。 「ハプテン抗原」とはハプテンを抗原性の強い
物質、例えばBSA、RSA、HSA（ヒト血清アル
ブミン）、BGG（牛γ−グロブリン）などと結合
したものを示す（特開昭53−41420号公報参照）。 また、「ハプテン化学変性物」とはハプテンを
カルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系高分
子化合物と化学的に結合したものを示す（特開昭
55−52945号公報及び特開昭55−52946号公報参
照）。 本発明の方法に従い、以上に述べた如き固体微
粒子の存在下に、免疫学的凝集反応又は凝集阻止
反応を実施する方法としては、例えば、 (a) 活性担持粒子と固体微粒子の両者を同時に含
んで成る免疫学的測定試薬を予め調製してお
き、この試薬を被検液に加えて凝集反応又は凝
集阻止反応を行なう方法； (b) 活性担持粒子を含んで成る免疫学的測定試薬
とは別個に固体微粒子のみから成る試薬を調製
しておき、該免疫学的測定試薬を被検液に加え
て凝集反応又は凝集阻止反応を行なう任意の時
点で、凝固体微粒子含有試薬を反応系に添加す
る方法； 等が挙げられる。 上記(a)の方法において使用される免疫学的測定
試薬は、一般に、活性担持粒子と固体微粒子の両
者を緩衝液中に懸濁させることにより調製するこ
とができる。該試薬中における活性担持粒子と固
体微粒子との相対的割合は、臨界的ではなく、活
性担持粒子及び／又は固体微粒子の種類等により
広く変えることができるが、活性担持粒子対固体
微粒子の重量比は、一般に１：0.2乃至１：50、
好ましくは１：0.5乃至１：30の範囲内とするの
が適当である。また、該試薬中におけるこれら粒
子の濃度もまた臨界的ではなく、活性担持粒子上
に担持されている抗体又は抗原もしくはハプテン
の種類や、測定方法（凝集反応法が凝集阻止反応
法か）等に応じて最適濃度は広く変化するが、総
括的に言えば凝集反応法に用いる場合、活性担持
粒子と固体微粒子の合計濃度は一般に0.2〜2.0重
量％、好ましくは0.4〜1.2重量％の範囲内、そし
て凝集阻止反応に用いる場合、活性担持粒子と固
体微粒子の合計濃度は一般に0.2〜2.0重量％、好
ましくは0.4〜1.2重量％の範囲内とすることがで
きる。 なお、上記試薬の調製に際して用いられる活性
担持粒子は通常の方法により製造することができ
る。 他方、上記(b)の方法で使用される活性担持粒子
を含んでなる免疫学的測定試薬は従来から使用さ
れているものをそのまま利用することができ、ま
た、固体微粒子のみから成る試薬は、前述した如
き固体微粒子（適宜蛋白被覆されていてもよい）
を緩衝液中に懸濁させることにより調製すること
ができる。この懸濁液中における固体微粒子の濃
度は一般に0.2〜２重量％、好ましくは0.4〜1.2重
量％の範囲内とするのが適当である。 上記(a)及び(b)の方法における凝集反応及び凝集
阻止反応は、前述した試薬を用いることを除き、
それ自体公知の方法により行なうことができる。 しかして、本発明の方法を実際に実施する場合
には、上記の如き試薬は組合わせて試薬系キツト
とするのが便利である。そのような試薬系キツト
としては、例えば、下記の試薬系からなることが
できる。 (i) （抗体担持粒子＋固体微粒子）含有懸濁液。 (ii) （抗原担持粒子＋固体微粒子）含有懸濁液。 (iii) 抗体担持含有懸濁液と固体微粒子含有懸濁液
の組合わせ、 (iv) 抗原担持粒子含有懸濁液と固体微粒子含有懸
濁液の組合わせ、 (v) （抗ハプテン抗体担持粒子＋固体微粒子）含
有懸濁液とハプテン抗原担持粒子又はハプテン
化学変性物担持粒子の組合せ、 (vi) （ハプテン抗原担持粒子又はハプテン化学変
性物担持粒子＋固体微粒子）含有懸濁液と抗ハ
プテン抗体担持粒子、 (vii) ハプテン抗原担持粒子又はハプテン化学変性
物担持粒子含有懸濁液、抗ハプテン抗体担持粒
子含有懸濁液及び固体微粒子含有懸濁液の各々
からなる組合せ、 (viii) 抗ハプテン抗体溶液と（ハプテン抗原担持粒
子又はハプテン化学変性物担持粒子＋固体微粒
子）含有懸濁液、 (ix) 抗ハプテン抗体担持粒子と（ハプテン抗原又
はハプテン化学変性物＋固体微粒子）含有懸濁
液、 (x) （抗ハプテン抗体溶液又はハプテン化学変性
物担持粒子＋固体微粒子と）ハプテン抗原担持
粒子、 (xi) （抗ハプテン抗体担持粒子＋固体微粒子）
含有懸濁液とハプテン抗原溶液又はハプテン化
学反応物溶液。 等が挙げられる。これら試薬系キツトの具体例を
示せば次のとおりである。 (イ) Ａ：BSA感作ポリスチレンラテツクスと Ｂ：抗AT−（抗アンチトロンビン）抗体
感作ラテツクスとよりなる免疫的測定試薬
系。 (ロ) Ａ：RSA感作シリカと Ｂ：抗PLG（抗プラスミノゲン）抗体感作ラテ
ツクスとよりなる免疫的測定試薬系。 (ハ) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクスと Ｂ：抗hCG（抗胎盤性々腺刺激ホルモン）抗体
感作ラテツクスとよりなる免疫的測定試薬
系。 (ニ) Ａ：カルボキシモデイフアイドラテツクス含
有抗ヒトヒブリノーゲン抗体感作ラテツクス
よりなる免疫的測定試薬系。 (ホ) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクス含有
抗AT−抗体感作ラテツクスよりなる免疫
的測定試薬系。 (ヘ) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクス含有
抗エストリオール−16−グルグロナイド抗体
感作ポリスチレンラテツクスと Ｂ：エストリオール−16−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテツクス とよりなる免疫的測定試薬系。 (ト) Ａ：BSA感作ポリスチレンラテツクス含有
プレグナンジオール−３−グルクロナイド結
合PVMMA結合ラテツクスと Ｂ：抗プレグナンジオール−３−グルクロナイ
ド抗体結合ラテツクスとよりなる免疫化学的
測定試薬系。 (チ) Ａ：RSA感作シリカ、 Ｂ：カルボキシメチルモルフイン結合ポリアク
リル酸結合ラテツクス Ｃ：抗モルフイン抗体感作ラテツクス とよりなる免疫化学的測定試薬系。 (リ) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクス含有
抗メタネフリン抗体感作ラテツクス Ｂ：メタネフイリン結合ポリアクリル酸溶液とよ
りなる免疫化学的測定試薬系。 (ヌ) Ａ：カルボキシモデイフアイドラテツクス含
有サイロキシン・BSA感作ラテツクス、 Ｂ：抗サイロキシ血清とよりなる免疫化学的測
定試薬系。 (ル) Ａ：RSA感作ポリスチレンラテツクス、 Ｂ：抗エストリオール−16−グルクロナイド抗
体感作ラテツクス Ｃ：エストリオール−16−グルクロナイド結合
ポリアクリル酸結合ラテツクスとよりなる免
疫化学的測定試薬系。 以上述べたとおり、本発明による新規な免疫学
的測定方法及び試薬を使用する場合には、凝集反
応および凝集阻止反応に拘らず、その反応終末点
である凝集阻止像から凝集像への移行が極めて明
瞭な凝集像の出現により明確に確認できる、すな
わち凝集移行像が明瞭でシヤープであるので、従
来既知の免疫学的測定方法及び試薬を使用する場
合に比較して、遥かに判定し易く、正確な測定結
果を得ることができる。これらの効果については
後記各実施例において立証されているとおりであ
る。 本発明の新規な免疫化学測定方法及び試薬を使
用すれば、従来既知の免疫化学測定試薬を用いた
場合の判定困難な欠点を改良することができるの
みならず、特に、低濃度に稀釈した場合に於ても
明瞭な凝集像を確認することができ、従つて測定
感度を上げることができるという利点もある。 以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明
する。 実施例 １ (a) BSA感作ポリスチレンラテツクスの製造 BSA300mgを0.24Mグリシン緩衝化食塩液
（PH9.6）50mlに溶解し、これに２％（Ｗ／Ｖ）
ポリスチレンラテツクス懸濁液（平均粒径：
0.220μ）50mlを加えて混合し、室温で２時間撹
拌した。撹拌後４℃、12000rpmで60分間遠心
分離を行い得られた沈殿物を上記緩衝液100ml
で洗浄した。再度遠心分離後、沈殿物を0.5％
EDTA−2Na含有グリシン緩衝化食塩液100ml
に懸濁させBSA感作ポリスチレンラテツクス
を製造した。 (b) ATの製造 ヒト新鮮血１に二重シユウ酸溶液（シユウ
酸アンモニウム12.5ｇとシユウ酸カリウム7.5
ｇを水に溶解して１にしたもの）100mlを加
え、４℃、6000rpmで20分間遠心分離し、得ら
れた血漿を53℃で２分間加熱した。生じた沈殿
を４℃、6000rpmで20分間遠心分離により取り
除いた。その上清１ml当り100mgの硫酸バリウ
ムを加え、室温で30分間ゆるやかに撹拌し、生
じた沈殿物を４℃、6000rpmで20分間遠心分離
して除去した。この操作を再度繰り返す。次い
で限外過により100mlに濃縮した。この濃縮
液10mlに1/200Ｍのリン酸緩衝液（PH7.2）100
mlを加え、同じ緩衝液で膨潤させたヘパリン−
セフアロース4B100ml中に加える。室温で30分
間ゆるやかに撹拌したのち、ガラスフイルター
上で吸引過し、次いで1/200Ｍリン酸緩衝液
（PH7.2）１を用い洗浄したのち、2M NaCl
含有リン酸緩衝液（PH7.2）300mlを用いAT
を溶出した。この溶出液を再度限外過にて10
ml以下に濃縮し、0.1M Tris−HCl緩衝液（PH
8.3）で平衡化したDEAE−セルロースＡ−50
を充填したイオン交換クロマトグラフイーカラ
ムに添加し、0.25MNaCl含有0.1M Tris−HCl
緩衝液（PH8.3）で溶出し、次いで0.01M Tris
−HCl緩衝液（PH8.3）で平衝化したSepha−
dexG−200を用いゲル過し、得られたAT
分画を凍結乾燥した。 (c) 抗AT抗体の製造 上記(b)で得たAT１mgを生理食塩液１mlに
溶解し、同量のコンプリート・フロインド・ア
ジユバンドで乳化し、家兎の足蹠および皮下に
注射した。この注射を３週間間隔で行ない、抗
体価の上昇を確認後全採血を行つた。得られた
血液を室温で40分間放置したのち、室温、
3000rpmで30分間遠心分離により血清を分離し
た。この抗血清40mlに同量の0.9％NaCl含有1/
２００Ｍリン酸緩衝液（PH7.2）を加え撹拌したの
ち、飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗AT
抗体を製造した。 (d) 抗AT抗体感作ポリスチレンラテツクス試
薬の製造 上記(c)で製造した抗AT抗体４mgを５mlの
0.21Mグリシン緩衝液（PH9.6）に溶解し、こ
れに２％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテツクス懸
濁液（平均粒径：0.220μ）５mlを加えて混合
し、室温で２時間撹拌した。この後、遠心分離
して得た沈殿を0.3％にウシ血清アルブミン
（BSA）を含むグリシン緩衝液25mlに懸濁さ
せ、これに上記(a)で製造したBSA感作ポリス
レンラテツクスを25ml加えて均一にし抗AT
抗体感作ポリスチレンラテツクス試薬を得た。 (e) 血漿中のATの測定（凝集反応法） 被検者の血漿３検体を0.24Mグリシン緩衝液
（PH9.6）で30倍、60倍、80倍、100倍、140倍及
び200倍に希釈し、各希釈血漿を10μ反応ス
ライド板上に滴下し、さらに安定剤（正常家兎
血清γ−グロブリン）を10μ滴下後、これに
上記(d)で製造した抗AT抗体感作ポリスチレ
ンラテツクスを１滴ずつ滴下する。三者を混合
し、スライド板をゆるやかに揺動し、３分後に
肉眼で凝集像の有無を観察した。なお、本実施
例においては試薬の感度を0.25mg／dlに調整し
たものを用いた。上記測定方法で同一検体につ
いて10人が測定し、その測定値を一元免疫拡散
法（RID法）〔山村雄一監修、医化学実験法講
座第４巻「免疫化学」第161〜164頁（1972年）
参照〕による測定値と比較し、測定者10人の一
致、不一致を以下のように決めて判定した。 実施例１では検体の希釈培数を30倍、60倍、
80倍、100倍、140倍および200倍で測定したの
で、検体１の場合100倍までの凝集（25mg／dl）
がRID値と一致と判定し、100倍で凝集を認め
ないものを低値、140倍以上まで凝集を認めら
れたものを高値と判定した。同様に検体２の場
合は60倍までの凝集（15μｇ／dl）がRID値と
一致、その他の希釈培数までの凝集は不一致、
さらに検体３の場合は30倍までの凝集（7.5
mg／dl）がRIDと一致、その他の希釈培数まで
の凝集は不一致と判定した。
【表】
定した。
その結果本発明法は凝集像が明瞭なため判定
者による個人差がなく10人の判定者が一致した
判定をし、かつRID値と一致していた。 しかし従来法では各検体とも一致率は30〜60
％と低く、各個人により高値あるいは低値と判
定されたが、これは凝集像が不明瞭のため一致
した判定が困難であるためと考えられた。 実施例 ２ (a) RSA感作シリカの製造 RSA150mgを0.24Mグリシン緩衝化食塩液
（PH9.6）50mlに溶解し、これに２％（Ｗ／Ｖ）
シリカ懸濁液（平均粒径：0.32μ）50mlを加え
て混合し、室温で２時間撹拌した。撹拌後４
℃、12000rpmで60分間遠心分離を行い、得ら
れた沈殿物を上記緩衝液100mlで洗浄した。再
度遠心分離後、沈殿物を0.1％RSA含有グリシ
ン緩衝化食塩液100mlに懸濁させRSA感作シリ
カを製造した。 (b) プラスミノゲン（PLG）の製造 ヒト新鮮血１に二重シユウ酸溶液（シユウ
酸アンモニウム12.5ｇとシユウ酸カリウム7.5
ｇを水に溶解して１にしたもの）100mlを加
え、４℃、6000rpmで20分間遠心分離し、得ら
れた血漿を53℃で２分間加熱した。生じた沈殿
を４℃、6000rpmで20分間遠心分離により取り
除いた。 この上清を1/10Ｍのリン酸緩衝液（PH7.4）
で膨潤させたリジン−セフアロース4B50ml中
に加える。室温で30分間ゆるやかに撹拌したの
ち、ガラスフイルター上で吸引過し、次いで
２ｍMEDTA含有1/10Ｍリン酸緩衝液（PH7.4）
１を用い洗浄したのち、1/10Ｍリジン含有1/
１０Ｍリン酸緩衝液（PH7.4）を用いPLGを溶出
した。この溶出液を限外過にて10ml以下に濃
縮し、1/200Ｍリン酸緩衝液で平衡化した
SephadexG−200を用いゲル過し、得られた
PLG分画を凍結乾燥した。 (c) 抗PLG抗体の製造 上記(b)で得たPLG1mgを生理食塩液１mlに溶
解し、同量のコンプリート・フロインド・アジ
ユバンドで乳化し、家兎の足蹠および皮下に注
射した。この注射を３週間間隔で行ない、抗体
価の上昇を確認後全採血を行つた。得られた血
液を室温で40分間放置したのち、室温、
3000rpmで30分間遠心分離により血清を分離し
た。この抗血清40mlに同量の0.9％NaCl含有1/
２００Ｍリン酸緩衝液（PH7.2）を加え撹拌したの
ち、飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗
PLG抗体を製造した。 (d) 抗PLG抗体感作ポリスチレンラテツクス試
薬の製造 上記(c)で製造した抗PLG抗体３mgを５mlの
0.24Mグリシン緩衝液（PH9.6）に溶解し、こ
れに２％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテツクス懸
濁液（平均粒径：0.500μ）５mlを加えて混合
し、室温で２時間撹拌した。この後、遠心分離
して得た沈殿を0.3％にウシ血清アルブミン
（BSA）を含むグリシン緩衝液25mlに懸濁さ
せ、これに上記(a)で製造したRSA感作シリカ
を25ml加えて均一にし、抗PLG抗体感作ポリ
スチレンラテツクス試薬を得た。 (e) 血漿中のPLGの測定（凝集反応法） 被検者の血漿３検体を0.24Mグリシン緩衝化
食塩液（PH9.6）で30倍、60倍、80倍、100倍、
140倍及び200倍に希釈し、各希釈血漿を10μ
反応スライド板上に滴下しさらに安定剤
（NRSγ−グロブリン）を10μ滴下後、これに
上記(d)で製造したPLG抗体感作ポリスチレン
ラテツクスを１滴ずつ滴下する。３者を混合
し、スライド板をゆるやかに揺動し２分後に肉
眼で凝集像の有無を観察した。なお、本実施例
においては試薬の感度は0.1mg／dlに調製した
ものを用いた。 上記測定法で10人が測定しその測定値を一元
免疫拡散法による測定値と比較し、測定者10人
の一致、不一致は実施例１と同様にして判定し
た。
その結果本発明法は凝集像が明瞭なため判定
者による個人差がなく10人の判定者が一致した
判定をし、かつRID値と一致していた。 しかし従来法では各検体とも一致率は30〜60
％と低く、各個人により高値あるいは低値と判
定されたが、これは凝集像が不明瞭のため一致
した判定が困難であるためと考えられた。 実施例 ２ (a) RSA感作シリカの製造 RSA150mgを0.24Mグリシン緩衝化食塩液
（PH9.6）50mlに溶解し、これに２％（Ｗ／Ｖ）
シリカ懸濁液（平均粒径：0.32μ）50mlを加え
て混合し、室温で２時間撹拌した。撹拌後４
℃、12000rpmで60分間遠心分離を行い、得ら
れた沈殿物を上記緩衝液100mlで洗浄した。再
度遠心分離後、沈殿物を0.1％RSA含有グリシ
ン緩衝化食塩液100mlに懸濁させRSA感作シリ
カを製造した。 (b) プラスミノゲン（PLG）の製造 ヒト新鮮血１に二重シユウ酸溶液（シユウ
酸アンモニウム12.5ｇとシユウ酸カリウム7.5
ｇを水に溶解して１にしたもの）100mlを加
え、４℃、6000rpmで20分間遠心分離し、得ら
れた血漿を53℃で２分間加熱した。生じた沈殿
を４℃、6000rpmで20分間遠心分離により取り
除いた。 この上清を1/10Ｍのリン酸緩衝液（PH7.4）
で膨潤させたリジン−セフアロース4B50ml中
に加える。室温で30分間ゆるやかに撹拌したの
ち、ガラスフイルター上で吸引過し、次いで
２ｍMEDTA含有1/10Ｍリン酸緩衝液（PH7.4）
１を用い洗浄したのち、1/10Ｍリジン含有1/
１０Ｍリン酸緩衝液（PH7.4）を用いPLGを溶出
した。この溶出液を限外過にて10ml以下に濃
縮し、1/200Ｍリン酸緩衝液で平衡化した
SephadexG−200を用いゲル過し、得られた
PLG分画を凍結乾燥した。 (c) 抗PLG抗体の製造 上記(b)で得たPLG1mgを生理食塩液１mlに溶
解し、同量のコンプリート・フロインド・アジ
ユバンドで乳化し、家兎の足蹠および皮下に注
射した。この注射を３週間間隔で行ない、抗体
価の上昇を確認後全採血を行つた。得られた血
液を室温で40分間放置したのち、室温、
3000rpmで30分間遠心分離により血清を分離し
た。この抗血清40mlに同量の0.9％NaCl含有1/
２００Ｍリン酸緩衝液（PH7.2）を加え撹拌したの
ち、飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗
PLG抗体を製造した。 (d) 抗PLG抗体感作ポリスチレンラテツクス試
薬の製造 上記(c)で製造した抗PLG抗体３mgを５mlの
0.24Mグリシン緩衝液（PH9.6）に溶解し、こ
れに２％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテツクス懸
濁液（平均粒径：0.500μ）５mlを加えて混合
し、室温で２時間撹拌した。この後、遠心分離
して得た沈殿を0.3％にウシ血清アルブミン
（BSA）を含むグリシン緩衝液25mlに懸濁さ
せ、これに上記(a)で製造したRSA感作シリカ
を25ml加えて均一にし、抗PLG抗体感作ポリ
スチレンラテツクス試薬を得た。 (e) 血漿中のPLGの測定（凝集反応法） 被検者の血漿３検体を0.24Mグリシン緩衝化
食塩液（PH9.6）で30倍、60倍、80倍、100倍、
140倍及び200倍に希釈し、各希釈血漿を10μ
反応スライド板上に滴下しさらに安定剤
（NRSγ−グロブリン）を10μ滴下後、これに
上記(d)で製造したPLG抗体感作ポリスチレン
ラテツクスを１滴ずつ滴下する。３者を混合
し、スライド板をゆるやかに揺動し２分後に肉
眼で凝集像の有無を観察した。なお、本実施例
においては試薬の感度は0.1mg／dlに調製した
ものを用いた。 上記測定法で10人が測定しその測定値を一元
免疫拡散法による測定値と比較し、測定者10人
の一致、不一致は実施例１と同様にして判定し
た。
【表】
その結果本発明法は本実施例においても凝縮
像が明瞭なため判定者による個人差がなく10人
の判定者が一致した判定を下しかつRID値と一
致していた。しかし従来法では実施例１とほぼ
同様一致率は30〜50％と低くこれについても凝
集像が不明瞭のため一致した判定が困難である
と考えられた。 実施例 ３ (a) RSA感作ポリスチレンラテツクスの製造 RSAの200mgを50mlの0.24Mグリシン緩衝液
（PH9.6）に溶解し、これに２％（Ｗ／Ｖ）ポリ
スチレンラテツクス懸濁液（平均粒径：
0.500μ）50mlを加えて混合し室温で２時間撹拌
した。撹拌後４℃、12000rpmで60分間遠心分
離を行い得られた沈殿物を上記緩衝液100mlで
洗浄した。再度遠心分離後、沈殿物を0.5％
EDTA−2Na含有グリシン緩衝化食塩液200ml
に懸濁させ、RSA感作ポリスチレンラテツク
スを製造した。 (b) 抗hCG抗体の製造 hCG（12000iu／mg）１mgを生理食塩液１mlに
溶解し、同量のコンプリート・フロインド・ア
ジユバンドで乳化し、家兎の足蹠および皮下に
注射した。この注射を３週間間隔で行ない、抗
体価の上昇を確認後全採血を行つた。得られた
血液を室温で40分間放置したのち、室温、
3000rpmで30分間遠心分離により血清を分離し
た。この抗血清40mlに同量の0.9％NaCl含量1/
２００Ｍリン酸緩衝液（PH7.2）を加え撹拌したの
ち、飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗CG
抗体を製造した。 (c) 抗hCG抗体感作ポリスチレンラテツクスの製
造 上記(b)で製造した抗hCG抗体８mgを５mlの
0.24Mグリシン緩衝液（PH9.6）に溶解し、こ
れに２％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテツクス懸
濁液（平均粒径：0.220μ）５mlを加えて混合
し、室温で２時間撹拌した。この後、遠心分離
して得た沈殿を0.4％にカシ血清アルブミン
（BSA）を含むグリシン緩衝液25mlに懸濁さ
せ、抗hCG抗体感作ポリスチレンラテツクスを
得た。 (d) 血漿中のhCGの測定（凝集反応法） 被検者の血漿をBSAを含む生理食塩液でそ
れぞれ10倍、20倍、40倍、80倍、160倍及び320
倍に希釈する。それぞれの希釈血漿をキラピヤ
リーピペツトで２滴をガラス板上に滴下し次い
で上記(c)で製造した抗hCG抗体感作ポリスチレ
ンラテツクスを一滴、さらに上記(a)で製造した
RSA感作ポリスチレンラテツクスを一滴順次
滴下し、混合後スライド板をゆるやかに揺動し
２分後に肉眼で凝集像の有無を観察した。なお
本実施例においては試薬の感度を1iu／mlに調
製したものを用いた。 なお表３に示した従来法の測定においては
RSA感作ポリスチレンラテツクス１滴の代わ
りにグリシン緩衝化食塩液１滴を加えて比較し
た値である。 実施例３では検体の希釈倍数を10倍、20倍、
40倍、80倍、160倍及び320倍で測定したので、
検体１の場合40倍までの凝集が放射免疫測定法
（以下RIA法と略す）による値と一致し、20倍
で凝集を認めないものを低値（不一致）40倍以
上で凝集を認められたものを高値（不一致）と
判定した。検体２も検体１と同様に判定した。
検体３は臨床所見が正常非妊娠婦人の為、凝集
像は全て陰性であつた。
像が明瞭なため判定者による個人差がなく10人
の判定者が一致した判定を下しかつRID値と一
致していた。しかし従来法では実施例１とほぼ
同様一致率は30〜50％と低くこれについても凝
集像が不明瞭のため一致した判定が困難である
と考えられた。 実施例 ３ (a) RSA感作ポリスチレンラテツクスの製造 RSAの200mgを50mlの0.24Mグリシン緩衝液
（PH9.6）に溶解し、これに２％（Ｗ／Ｖ）ポリ
スチレンラテツクス懸濁液（平均粒径：
0.500μ）50mlを加えて混合し室温で２時間撹拌
した。撹拌後４℃、12000rpmで60分間遠心分
離を行い得られた沈殿物を上記緩衝液100mlで
洗浄した。再度遠心分離後、沈殿物を0.5％
EDTA−2Na含有グリシン緩衝化食塩液200ml
に懸濁させ、RSA感作ポリスチレンラテツク
スを製造した。 (b) 抗hCG抗体の製造 hCG（12000iu／mg）１mgを生理食塩液１mlに
溶解し、同量のコンプリート・フロインド・ア
ジユバンドで乳化し、家兎の足蹠および皮下に
注射した。この注射を３週間間隔で行ない、抗
体価の上昇を確認後全採血を行つた。得られた
血液を室温で40分間放置したのち、室温、
3000rpmで30分間遠心分離により血清を分離し
た。この抗血清40mlに同量の0.9％NaCl含量1/
２００Ｍリン酸緩衝液（PH7.2）を加え撹拌したの
ち、飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗CG
抗体を製造した。 (c) 抗hCG抗体感作ポリスチレンラテツクスの製
造 上記(b)で製造した抗hCG抗体８mgを５mlの
0.24Mグリシン緩衝液（PH9.6）に溶解し、こ
れに２％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテツクス懸
濁液（平均粒径：0.220μ）５mlを加えて混合
し、室温で２時間撹拌した。この後、遠心分離
して得た沈殿を0.4％にカシ血清アルブミン
（BSA）を含むグリシン緩衝液25mlに懸濁さ
せ、抗hCG抗体感作ポリスチレンラテツクスを
得た。 (d) 血漿中のhCGの測定（凝集反応法） 被検者の血漿をBSAを含む生理食塩液でそ
れぞれ10倍、20倍、40倍、80倍、160倍及び320
倍に希釈する。それぞれの希釈血漿をキラピヤ
リーピペツトで２滴をガラス板上に滴下し次い
で上記(c)で製造した抗hCG抗体感作ポリスチレ
ンラテツクスを一滴、さらに上記(a)で製造した
RSA感作ポリスチレンラテツクスを一滴順次
滴下し、混合後スライド板をゆるやかに揺動し
２分後に肉眼で凝集像の有無を観察した。なお
本実施例においては試薬の感度を1iu／mlに調
製したものを用いた。 なお表３に示した従来法の測定においては
RSA感作ポリスチレンラテツクス１滴の代わ
りにグリシン緩衝化食塩液１滴を加えて比較し
た値である。 実施例３では検体の希釈倍数を10倍、20倍、
40倍、80倍、160倍及び320倍で測定したので、
検体１の場合40倍までの凝集が放射免疫測定法
（以下RIA法と略す）による値と一致し、20倍
で凝集を認めないものを低値（不一致）40倍以
上で凝集を認められたものを高値（不一致）と
判定した。検体２も検体１と同様に判定した。
検体３は臨床所見が正常非妊娠婦人の為、凝集
像は全て陰性であつた。
【表】
実施例３においても本発明法が従来法よりも凝
集像が明らかに明瞭なため判定に個人差が認めら
れない。 実施例 ４ (a) 抗ヒトフイブリノゲン抗体の製造 ヒトフイブリノゲン１mgを生理食塩液１mlに
溶解し、同量のコンプリート・フロインド・ア
ジユバンドで乳化し、家兎の足蹠および皮下に
注射した。この注射を３週間間隔で行ない、抗
体価の上昇を確認後全採血を行つた。得られた
血液を室温で40分間放置したのち、室温、
3000rpmで30分間遠心分離により血清を分離し
た。この抗血清40mlに同量の0.9％NaCl含有1/
２００Ｍリン酸緩衝液（PH7.2）を加え撹拌したの
ち、飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗ヒト
フイブリノゲン抗体を製造した。 (b) 抗ヒトフイブリノゲイン抗体感作ポリスチレ
ンラテツクス試薬の製造 上記(a)で製造した抗ヒトフイブリノゲン抗体
５mgをグリシン緩衝食塩液５mlにて溶解し、２
％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテツクス懸濁液
（平均粒径：0.500μ）５mlと混合し、室温で２
時間撹拌した。この後、遠心分離（４℃、
12000rpm）して得た沈殿を0.2％にウシ血清ア
ルブミン（BSA）を含むグリシン緩衝化食塩
液15mlに懸濁させ、これに１％（Ｗ／Ｖ）カル
ボキシルモデイフアイドラテツクス粒子（平均
粒径0.482μ）15mlを加えて均一にして、抗ヒト
フイブリノゲン抗体感作ポリスチレンラテツク
ス試薬を得た。 (c) 血清FDPの測定（凝集反応法） 被検者の血液から常法により血清を分離し、
BSAを含む生理食塩液でそれぞれ10倍、20倍、
40倍、80倍、160倍及び320倍に希釈する。それ
ぞれの希釈血清をキヤピラリーピペツトで２滴
をガラス板上に滴下し、次いで上記(b)で製造し
た抗ヒトフイブリノゲン抗体感作ポリスチレン
ラテツクスを１滴ずつ滴下する。混合液、スラ
イド板をゆるやかに揺動し、２分後に肉眼で凝
集像の有無を観察した。なお本実施例において
は試薬の感度は0.25μｇ／mlに調製したものを
用いた。上記測定方法で同一検体について10人
が測定しその測定値をRIA法と比較した。 測定者10人の一致、不一致を以下のように決
て判定した。 本実施例４では希釈培数を10倍、20倍、40
倍、80倍、160倍及び320倍で測定したので検体
１の場合20倍まで凝集（5μｇ／ml）がRIA値
と一致と判定し20倍で凝集を認めないものを低
値、40倍以上まで凝集を認められたものを高値
と判定した。同様に検体２の場合は80倍までの
凝集（20μｇ／ml）がRIA値と一致、その他の
希釈倍数までの凝集は不一致、さらに検体３の
場合は160倍までの凝集（40μｇ／ml）がRIA
値と一致、その他の希釈倍数までの凝集は不一
致と判定した。
集像が明らかに明瞭なため判定に個人差が認めら
れない。 実施例 ４ (a) 抗ヒトフイブリノゲン抗体の製造 ヒトフイブリノゲン１mgを生理食塩液１mlに
溶解し、同量のコンプリート・フロインド・ア
ジユバンドで乳化し、家兎の足蹠および皮下に
注射した。この注射を３週間間隔で行ない、抗
体価の上昇を確認後全採血を行つた。得られた
血液を室温で40分間放置したのち、室温、
3000rpmで30分間遠心分離により血清を分離し
た。この抗血清40mlに同量の0.9％NaCl含有1/
２００Ｍリン酸緩衝液（PH7.2）を加え撹拌したの
ち、飽和硫酸アンモニウムによる塩析で抗ヒト
フイブリノゲン抗体を製造した。 (b) 抗ヒトフイブリノゲイン抗体感作ポリスチレ
ンラテツクス試薬の製造 上記(a)で製造した抗ヒトフイブリノゲン抗体
５mgをグリシン緩衝食塩液５mlにて溶解し、２
％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラテツクス懸濁液
（平均粒径：0.500μ）５mlと混合し、室温で２
時間撹拌した。この後、遠心分離（４℃、
12000rpm）して得た沈殿を0.2％にウシ血清ア
ルブミン（BSA）を含むグリシン緩衝化食塩
液15mlに懸濁させ、これに１％（Ｗ／Ｖ）カル
ボキシルモデイフアイドラテツクス粒子（平均
粒径0.482μ）15mlを加えて均一にして、抗ヒト
フイブリノゲン抗体感作ポリスチレンラテツク
ス試薬を得た。 (c) 血清FDPの測定（凝集反応法） 被検者の血液から常法により血清を分離し、
BSAを含む生理食塩液でそれぞれ10倍、20倍、
40倍、80倍、160倍及び320倍に希釈する。それ
ぞれの希釈血清をキヤピラリーピペツトで２滴
をガラス板上に滴下し、次いで上記(b)で製造し
た抗ヒトフイブリノゲン抗体感作ポリスチレン
ラテツクスを１滴ずつ滴下する。混合液、スラ
イド板をゆるやかに揺動し、２分後に肉眼で凝
集像の有無を観察した。なお本実施例において
は試薬の感度は0.25μｇ／mlに調製したものを
用いた。上記測定方法で同一検体について10人
が測定しその測定値をRIA法と比較した。 測定者10人の一致、不一致を以下のように決
て判定した。 本実施例４では希釈培数を10倍、20倍、40
倍、80倍、160倍及び320倍で測定したので検体
１の場合20倍まで凝集（5μｇ／ml）がRIA値
と一致と判定し20倍で凝集を認めないものを低
値、40倍以上まで凝集を認められたものを高値
と判定した。同様に検体２の場合は80倍までの
凝集（20μｇ／ml）がRIA値と一致、その他の
希釈倍数までの凝集は不一致、さらに検体３の
場合は160倍までの凝集（40μｇ／ml）がRIA
値と一致、その他の希釈倍数までの凝集は不一
致と判定した。
【表】
その結果、本実施例においても凝集像の明瞭性
による判定の容易さ、正確性が認められた。 実施例 ５ （尿中エストロゲンの測定） (a) エストリオール−16−グルクロナイド・
BSAの製造 エストリオール−16−グルクロン酸40mgを
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液1.0mlに溶
解し、これに４℃以下でトリ−ｎ−ブチルアミ
ン20.6μを添加したのち、イソブチルクロロ
カーボネート11.2μを加え30分間撹拌した。
これに予めBSA（牛血清アルブミン）117mgを
2.8mlの水に溶解したものにＮ−水酸化ナトリ
ウム液150μを加えたのちジメチルホルムア
ミド20mlを加え、８℃に保たれた液を混合し
た。次いでこれを８℃で撹拌し、１時間後にＮ
−水酸化ナトリウム液16.6μを加え、さらに
3.5時間撹拌したのち、セフアデツクスＧ−25
で未反応のエストリオール−16−グルクロナイ
ド及びトリ−ｎ−ブチルアミン等の低分子物質
を分離した。さらにこれを精製水に対して透析
したのち凍結乾燥すると、エストリオール−16
−グルクロナイド・BSAが得られた。 この凍乾末はコーベル反応により、BSA1モ
ル当りエストリオール−16−グルクロナイド27
〜30モルの結合が確認され (b) 抗エストリオール−16−グルクロナイド抗体
の製造 上記(a)で製造したエストリオール−16−グル
クロナイド−BSA2mgを１mlの生理食塩水に溶
解し、同量のコンプリートフロインドアジユバ
ントで乳化し、成熟家兎の足蹠および皮下に注
射した。この注射を１ケ月間隔で行ない、抗体
価の上昇を確認後全採血を行ない抗血清を得
た。この抗血清を56℃30分間非働化後BSAで
吸収し、ついで硫酸アンモニウムによる塩析で
抗エストリオール−16−グルクロナイド抗体を
製造した。 (c) 抗エストリオール−16−グルクロナイド抗体
感作ポリスチレンラテツクス試薬の製造 上記(b)で製造した抗エストリオール−16−グ
ルクロナイド抗体４mgを５mlのグリシン緩衝化
食塩液に溶解し、これに10％ポリスチレンラテ
ツクス１mlを加えて混合し、56℃で30分間処理
した。この後、遠心分離して得た沈殿をグリシ
ン緩衝化食塩液（PH9.6）にて遠心洗浄し、沈
殿を0.05％にRSA（ウサギ血清アルブミン）を
含むグリシン緩衝化食塩液10mlにて懸濁させ、
ついで実施例３(a)と同様にして製造したRSA
感作ポリスチレンラテツクスの0.8％懸濁液を
190ml加えて抗エストリオール−16−グルクロ
ナイド抗体感作ポリスチレンラテツクス試薬を
製造した。 (d) エストリオール−16−グルクロナイド結合ポ
リアクリル酸の製造 (イ) エストリオール−16−グルクロナイド−ヘ
キサメチレンジアミン誘導体 エストリオール−16−グルクロナイド93mg
と、Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミド25mgを
DMF1.5mlに溶かし、氷冷下撹拌しつつ
DCC41mgを加える。30分後モノベンジルオ
キシカルボニルヘキサメチレンジアミン塩酸
塩55mg、トリエチルアミン0.03mlをDMF1ml
に溶かした溶液を加え、氷冷下で２時間、室
温で12時間撹拌をつづける。全体を減圧乾固
し、残渣をプレパラテイプ薄層クロマトに付
して目的の標記化合物、 82mg（対理論収率55％）を得た。 本品はシリカゲルの薄層クロマトでRf＝
0.42（クロロホルム−メタノール５：１）を
示した。 (ロ) 上記(イ)で得たエストリオール−16−グルク
ロナイド・ヘキサメチレンジアミン誘導体50
mgをメタノール３mlに溶かし、パラジウム黒
10mgを加え、常温常圧で水素気流中で撹拌す
る。２時間で反応は終了し触媒を別し、
液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加える
と、カルボベンジルオキシ基が脱離した目的
物35mgを粉末として得た。 この生成物10mgをポリアクリル酸100mgと
ともにDMF2mlに溶かし、DCC4mgを加え、
室温に50時間放置する。反応液を透析し、内
液を過後凍結乾燥すると、エストリオール
−16−グルクロナイド結合ポリアクリル酸95
mgを白色粉末として得た。 (e) リジン・ラテツクス カルボキシルモデイフアイドポリスチレンラ
テツクスの10％懸濁液５mlにε−第三ブチルオ
キシカルボニルリジンメチルエステル260mgを
ジメチルホルムアミド（DMF）３mlに溶かし
た液を加え、0゜に冷却したのち撹拌しつつ水溶
性カルボジイミド、〔１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩〕243mgを加える。0゜にて１時間、室温にて
３時間撹拌をつづけたのち室温に一夜放置し、
遠心分離する。上清を捨て、沈降物を50％
DMF水溶液、ついで水で洗浄する。 これに氷冷した濃塩酸５mlを加え、ときどき
ふりまぜつつ0゜に15分間放置したのち氷水で約
倍量にうすめ遠心する。沈降物を洗液が中性に
なるまで洗浄し、ついでトリエチルアミンの10
％水溶液10mlを加えて室温で15分撹拌後遠心
し、洗液が中性になるまで水洗をくり返す。最
後に10％懸濁液になるように濃度を調整し所望
のリジン・ラテツクスを得る。本品はニンヒド
リン反応陽性である。 (f) エストリオール−16−グルクロナイド結合ポ
リアクリル酸結合ラテツクスの製造 前記(e)で製造したリジンラテツクス0.1ｇを
１mlの蒸留水にて懸濁させ、これに前記（ｄ−
(ロ)）で製造したエストリオール−16−グルクロ
ナイド結合ポリアクリル酸水溶液１ml（エスト
リオール−16−グルクロナイド0.3mg相当量）
を加えて混合し、ついで１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−
塩酸塩10mgを加え、撹拌下一夜反応を行なう。
反応終了後遠心分離して得た沈殿をグリシン緩
衝化食塩液10mlで３回洗浄後、沈殿を0.05％に
RSA（ウサギ血清アルブミン）を含むグリシン
緩衝化食塩液300mlにて懸濁させて、エストリ
オール−16−グルクロナイド結合ポリアクリル
酸結合ラテツクスを製造した。 (g) 尿中エストロゲンの測定（凝集阻止法） 月経周期の各時期に採尿した正常婦人尿につ
いて、それぞれをグリシン緩衝化食塩液で２
倍、４倍、８倍、16倍および32倍に希釈し、各
希釈尿の１滴（0.03ml）を反応スライド板上に
滴下し、これに上記(c)で製造した抗エストリオ
ール−16−グルクロナイド抗体感作ラテツクス
を１滴ずつ滴下、ついで上記(f)で製造したエス
トリオール−16−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテツクスを１滴ずつ滴下する。こ
の三者を均一に混合し、２分間揺動後肉眼で凝
集像、凝集阻止像を観察した。本実施例は5n
ｇ／mlに感度を設定してある。なお従来法は前
記(C)抗エストリオール−16−グルクロナイド抗
体感作ポリスチレンラテツクス試薬における
RSA感作ポリスチレンラテツクスの代りにグ
リシン緩衝化食塩液を加えて製造した抗体感作
ラテツクスを使用した場合の測定例である。 上記測定方法で10人が測定し、その測定値を
RIA法による測定値と比較し、測定者10人の一
致、不一致を以下のように決めて判定した。 実施例５では検体の希釈倍数を２倍、４倍、
８倍、16倍及び32倍で測定したので卵胞期の検
体の場合２倍までの凝集阻止10nｇ／mlがRIA
値と一致と判定し、２倍で凝集阻止を認めない
ものを低値（不一致）、４倍以上で凝集阻止が
認められたものを高値（不一致）と判定した。
同様に排卵期の検体の場合16倍までの凝集阻止
（80nｇ／ml）がRIA値と一致、その他の希釈
倍数までの凝集阻止は不一致さらに同様に黄体
期の検体の場合４倍までの凝集阻止（20nｇ／
ml）がRIA値と一致その他の希釈倍数までの凝
集阻止は不一致と判定した。
による判定の容易さ、正確性が認められた。 実施例 ５ （尿中エストロゲンの測定） (a) エストリオール−16−グルクロナイド・
BSAの製造 エストリオール−16−グルクロン酸40mgを
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液1.0mlに溶
解し、これに４℃以下でトリ−ｎ−ブチルアミ
ン20.6μを添加したのち、イソブチルクロロ
カーボネート11.2μを加え30分間撹拌した。
これに予めBSA（牛血清アルブミン）117mgを
2.8mlの水に溶解したものにＮ−水酸化ナトリ
ウム液150μを加えたのちジメチルホルムア
ミド20mlを加え、８℃に保たれた液を混合し
た。次いでこれを８℃で撹拌し、１時間後にＮ
−水酸化ナトリウム液16.6μを加え、さらに
3.5時間撹拌したのち、セフアデツクスＧ−25
で未反応のエストリオール−16−グルクロナイ
ド及びトリ−ｎ−ブチルアミン等の低分子物質
を分離した。さらにこれを精製水に対して透析
したのち凍結乾燥すると、エストリオール−16
−グルクロナイド・BSAが得られた。 この凍乾末はコーベル反応により、BSA1モ
ル当りエストリオール−16−グルクロナイド27
〜30モルの結合が確認され (b) 抗エストリオール−16−グルクロナイド抗体
の製造 上記(a)で製造したエストリオール−16−グル
クロナイド−BSA2mgを１mlの生理食塩水に溶
解し、同量のコンプリートフロインドアジユバ
ントで乳化し、成熟家兎の足蹠および皮下に注
射した。この注射を１ケ月間隔で行ない、抗体
価の上昇を確認後全採血を行ない抗血清を得
た。この抗血清を56℃30分間非働化後BSAで
吸収し、ついで硫酸アンモニウムによる塩析で
抗エストリオール−16−グルクロナイド抗体を
製造した。 (c) 抗エストリオール−16−グルクロナイド抗体
感作ポリスチレンラテツクス試薬の製造 上記(b)で製造した抗エストリオール−16−グ
ルクロナイド抗体４mgを５mlのグリシン緩衝化
食塩液に溶解し、これに10％ポリスチレンラテ
ツクス１mlを加えて混合し、56℃で30分間処理
した。この後、遠心分離して得た沈殿をグリシ
ン緩衝化食塩液（PH9.6）にて遠心洗浄し、沈
殿を0.05％にRSA（ウサギ血清アルブミン）を
含むグリシン緩衝化食塩液10mlにて懸濁させ、
ついで実施例３(a)と同様にして製造したRSA
感作ポリスチレンラテツクスの0.8％懸濁液を
190ml加えて抗エストリオール−16−グルクロ
ナイド抗体感作ポリスチレンラテツクス試薬を
製造した。 (d) エストリオール−16−グルクロナイド結合ポ
リアクリル酸の製造 (イ) エストリオール−16−グルクロナイド−ヘ
キサメチレンジアミン誘導体 エストリオール−16−グルクロナイド93mg
と、Ｎ−ハイドロキシコハク酸イミド25mgを
DMF1.5mlに溶かし、氷冷下撹拌しつつ
DCC41mgを加える。30分後モノベンジルオ
キシカルボニルヘキサメチレンジアミン塩酸
塩55mg、トリエチルアミン0.03mlをDMF1ml
に溶かした溶液を加え、氷冷下で２時間、室
温で12時間撹拌をつづける。全体を減圧乾固
し、残渣をプレパラテイプ薄層クロマトに付
して目的の標記化合物、 82mg（対理論収率55％）を得た。 本品はシリカゲルの薄層クロマトでRf＝
0.42（クロロホルム−メタノール５：１）を
示した。 (ロ) 上記(イ)で得たエストリオール−16−グルク
ロナイド・ヘキサメチレンジアミン誘導体50
mgをメタノール３mlに溶かし、パラジウム黒
10mgを加え、常温常圧で水素気流中で撹拌す
る。２時間で反応は終了し触媒を別し、
液を減圧濃縮し、残渣にエーテルを加える
と、カルボベンジルオキシ基が脱離した目的
物35mgを粉末として得た。 この生成物10mgをポリアクリル酸100mgと
ともにDMF2mlに溶かし、DCC4mgを加え、
室温に50時間放置する。反応液を透析し、内
液を過後凍結乾燥すると、エストリオール
−16−グルクロナイド結合ポリアクリル酸95
mgを白色粉末として得た。 (e) リジン・ラテツクス カルボキシルモデイフアイドポリスチレンラ
テツクスの10％懸濁液５mlにε−第三ブチルオ
キシカルボニルリジンメチルエステル260mgを
ジメチルホルムアミド（DMF）３mlに溶かし
た液を加え、0゜に冷却したのち撹拌しつつ水溶
性カルボジイミド、〔１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸
塩〕243mgを加える。0゜にて１時間、室温にて
３時間撹拌をつづけたのち室温に一夜放置し、
遠心分離する。上清を捨て、沈降物を50％
DMF水溶液、ついで水で洗浄する。 これに氷冷した濃塩酸５mlを加え、ときどき
ふりまぜつつ0゜に15分間放置したのち氷水で約
倍量にうすめ遠心する。沈降物を洗液が中性に
なるまで洗浄し、ついでトリエチルアミンの10
％水溶液10mlを加えて室温で15分撹拌後遠心
し、洗液が中性になるまで水洗をくり返す。最
後に10％懸濁液になるように濃度を調整し所望
のリジン・ラテツクスを得る。本品はニンヒド
リン反応陽性である。 (f) エストリオール−16−グルクロナイド結合ポ
リアクリル酸結合ラテツクスの製造 前記(e)で製造したリジンラテツクス0.1ｇを
１mlの蒸留水にて懸濁させ、これに前記（ｄ−
(ロ)）で製造したエストリオール−16−グルクロ
ナイド結合ポリアクリル酸水溶液１ml（エスト
リオール−16−グルクロナイド0.3mg相当量）
を加えて混合し、ついで１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−
塩酸塩10mgを加え、撹拌下一夜反応を行なう。
反応終了後遠心分離して得た沈殿をグリシン緩
衝化食塩液10mlで３回洗浄後、沈殿を0.05％に
RSA（ウサギ血清アルブミン）を含むグリシン
緩衝化食塩液300mlにて懸濁させて、エストリ
オール−16−グルクロナイド結合ポリアクリル
酸結合ラテツクスを製造した。 (g) 尿中エストロゲンの測定（凝集阻止法） 月経周期の各時期に採尿した正常婦人尿につ
いて、それぞれをグリシン緩衝化食塩液で２
倍、４倍、８倍、16倍および32倍に希釈し、各
希釈尿の１滴（0.03ml）を反応スライド板上に
滴下し、これに上記(c)で製造した抗エストリオ
ール−16−グルクロナイド抗体感作ラテツクス
を１滴ずつ滴下、ついで上記(f)で製造したエス
トリオール−16−グルクロナイド結合ポリアク
リル酸結合ラテツクスを１滴ずつ滴下する。こ
の三者を均一に混合し、２分間揺動後肉眼で凝
集像、凝集阻止像を観察した。本実施例は5n
ｇ／mlに感度を設定してある。なお従来法は前
記(C)抗エストリオール−16−グルクロナイド抗
体感作ポリスチレンラテツクス試薬における
RSA感作ポリスチレンラテツクスの代りにグ
リシン緩衝化食塩液を加えて製造した抗体感作
ラテツクスを使用した場合の測定例である。 上記測定方法で10人が測定し、その測定値を
RIA法による測定値と比較し、測定者10人の一
致、不一致を以下のように決めて判定した。 実施例５では検体の希釈倍数を２倍、４倍、
８倍、16倍及び32倍で測定したので卵胞期の検
体の場合２倍までの凝集阻止10nｇ／mlがRIA
値と一致と判定し、２倍で凝集阻止を認めない
ものを低値（不一致）、４倍以上で凝集阻止が
認められたものを高値（不一致）と判定した。
同様に排卵期の検体の場合16倍までの凝集阻止
（80nｇ／ml）がRIA値と一致、その他の希釈
倍数までの凝集阻止は不一致さらに同様に黄体
期の検体の場合４倍までの凝集阻止（20nｇ／
ml）がRIA値と一致その他の希釈倍数までの凝
集阻止は不一致と判定した。
【表】
その結果本発明法は凝集像が明瞭なため判定者
による個人差がなく10人の判定者が一致した判定
をし、かつRIA値と一致していた。しかし従来法
では各検体とも一致率は30〜60％と低く、各個人
により高値あるいは低値と判定されたが、これは
凝集像が不明瞭のため一致した判定が困難である
ためと考えられた。 実施例 ６ 尿中プレグナンジオールの測定 (a) プレグナンジオール−３−グルクロナイド−
BSAの製造 プレグナンジオール−３−グルクロナイドと
BSAを用いて実施例５(a)と同様の方法でプレ
グナンジオール−３−グルクロナイド−BSA
を製造した。 (b) 抗プレグナンジオール−３−グルクロナイド
抗体の製造 上記(a)で製造したプレグナンジオール−３−
グルクロナイド−BSAを用い、実施例５(b)と
同様な方法で山羊に免疫して抗血清を得ること
により抗プレグナンジオール−３−グルクロナ
イド抗体を製造した。 (c) 抗プレグナンジオール−３−グルクロナイド
抗体結合ラテツクスの製造 上記(b)で製造した抗プレグナンジオール−３
−グルクロナイド抗体５mgを５mlの蒸留水に溶
解後、これにカルボキシルモデイフアイドラテ
ツクスの10％懸濁液１mlを混合し、次いで10mg
の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド・塩酸塩を加え撹拌下一
夜反応を行なつた。反応終了後、遠心分離して
得た沈殿をグリシン緩衝化食塩液で洗浄し、沈
殿を0.08％にヤギ血清アルブミンを含むグリシ
ン緩衝化食塩水10mlにて懸濁させて、ついで、
さらに同液を190ml加えて抗プレグナンジオー
ル−３−グルクロナイド抗体結合ラテツクスを
製造した。 (d) プレグナンジオール−３−グルクロナイド結
合PVMMAの製造 (イ) プレグナンジオール−３−グルクロナイド
−リジン誘導体 プレグナンジオール−３−グルクロナイド
99mg、ε−ベンジルオキシカルボニルリジン
メチルエステル・トルエンスルホン酸塩140
mgをDMF12mlに溶かし、氷冷下撹拌しつつ
ジフエニルホスホリルアジド65mg、次いで、
トリエチルアミン0.056mlを加えた後、実施
例５（ｄ−(イ)）と同様にして、下記構造式 で表わされる目的のリジン誘導体100mg（対
理論収率58％）を得た。 (ロ) 上記(イ)で得たプレグナンジオール−３−グ
ルクロナイド−リジン誘導体38mgを実施例５
（ｄ−(ロ)）と同様にして接触還元した生成物
をPVMMA100mgとともにDMF6mlに加温溶
解したのち、室温に４日間放置した。反応液
を実施例５（ｄ−(ロ)）と同様に処理し、プレ
グナンジオール３−グルクロナイド結合
PVMMA102mgを白色粉末として得た。 (e) プレグナンジオール３−グルクロナイド結合
PVMMA結合ポリスチレンラテツクス試薬の
製造 実施例5eで製造したリジンラテツクス0.1ｇ
と前記（ｄ−(ロ)）で製造したプレグナンジオー
ル３−グルクロナイド結合PVMMA2mgを用
い、実施例５(f)と同様の方法でプレグナンジオ
ール３−グルクロナイド結合PVMMAをリジ
ンラテツクスに結合させ、0.05％BSAを含むグ
リシン緩衝化食塩液10mlに懸濁させついで実施
例１−(a)で製造したBSA感作ポリスチレンラ
テツクスの１％懸濁液を190ml加えてプレグナ
ンジオール３−グルクロナイド結合PVMMA
結合ポリスチレンラテツクス試薬を製造した。 (f) 尿中プレグナンジオールの測定（凝集阻止
法） 妊婦尿５例をグリシン緩衝化食塩液で250倍、
500倍、1000倍、2000倍および4000倍に希釈し、
前記(c)、(e)を用い、実施例5gと同様な操作で
尿中プレグナンジオールを測定した。なお、こ
の実施例中においては、試薬の感度を0.01μ
ｇ／mlに調整してある。 実施例６で検体の希釈倍数を250倍、500倍、
1000倍、2000倍及び4000倍で測定したので妊婦
尿の検体１の場合1000倍までの凝集阻止がRIA
値と一致と判定し、2000倍以下で凝集阻止を認
めないものを低値（不一致）4000倍以上で凝集
阻止が認められたものを高値（不一致）と判定
した。検体２の場合250倍までの凝集阻止が
RIA値と一致、その他の希釈倍数までの凝集阻
止は不一致、さらに同様に検体３の場合1000倍
までの凝集阻止がRIA値と一致、その他の希釈
培数までの凝集阻止は不一致と判定した。その
結果は第６表に示す。
による個人差がなく10人の判定者が一致した判定
をし、かつRIA値と一致していた。しかし従来法
では各検体とも一致率は30〜60％と低く、各個人
により高値あるいは低値と判定されたが、これは
凝集像が不明瞭のため一致した判定が困難である
ためと考えられた。 実施例 ６ 尿中プレグナンジオールの測定 (a) プレグナンジオール−３−グルクロナイド−
BSAの製造 プレグナンジオール−３−グルクロナイドと
BSAを用いて実施例５(a)と同様の方法でプレ
グナンジオール−３−グルクロナイド−BSA
を製造した。 (b) 抗プレグナンジオール−３−グルクロナイド
抗体の製造 上記(a)で製造したプレグナンジオール−３−
グルクロナイド−BSAを用い、実施例５(b)と
同様な方法で山羊に免疫して抗血清を得ること
により抗プレグナンジオール−３−グルクロナ
イド抗体を製造した。 (c) 抗プレグナンジオール−３−グルクロナイド
抗体結合ラテツクスの製造 上記(b)で製造した抗プレグナンジオール−３
−グルクロナイド抗体５mgを５mlの蒸留水に溶
解後、これにカルボキシルモデイフアイドラテ
ツクスの10％懸濁液１mlを混合し、次いで10mg
の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド・塩酸塩を加え撹拌下一
夜反応を行なつた。反応終了後、遠心分離して
得た沈殿をグリシン緩衝化食塩液で洗浄し、沈
殿を0.08％にヤギ血清アルブミンを含むグリシ
ン緩衝化食塩水10mlにて懸濁させて、ついで、
さらに同液を190ml加えて抗プレグナンジオー
ル−３−グルクロナイド抗体結合ラテツクスを
製造した。 (d) プレグナンジオール−３−グルクロナイド結
合PVMMAの製造 (イ) プレグナンジオール−３−グルクロナイド
−リジン誘導体 プレグナンジオール−３−グルクロナイド
99mg、ε−ベンジルオキシカルボニルリジン
メチルエステル・トルエンスルホン酸塩140
mgをDMF12mlに溶かし、氷冷下撹拌しつつ
ジフエニルホスホリルアジド65mg、次いで、
トリエチルアミン0.056mlを加えた後、実施
例５（ｄ−(イ)）と同様にして、下記構造式 で表わされる目的のリジン誘導体100mg（対
理論収率58％）を得た。 (ロ) 上記(イ)で得たプレグナンジオール−３−グ
ルクロナイド−リジン誘導体38mgを実施例５
（ｄ−(ロ)）と同様にして接触還元した生成物
をPVMMA100mgとともにDMF6mlに加温溶
解したのち、室温に４日間放置した。反応液
を実施例５（ｄ−(ロ)）と同様に処理し、プレ
グナンジオール３−グルクロナイド結合
PVMMA102mgを白色粉末として得た。 (e) プレグナンジオール３−グルクロナイド結合
PVMMA結合ポリスチレンラテツクス試薬の
製造 実施例5eで製造したリジンラテツクス0.1ｇ
と前記（ｄ−(ロ)）で製造したプレグナンジオー
ル３−グルクロナイド結合PVMMA2mgを用
い、実施例５(f)と同様の方法でプレグナンジオ
ール３−グルクロナイド結合PVMMAをリジ
ンラテツクスに結合させ、0.05％BSAを含むグ
リシン緩衝化食塩液10mlに懸濁させついで実施
例１−(a)で製造したBSA感作ポリスチレンラ
テツクスの１％懸濁液を190ml加えてプレグナ
ンジオール３−グルクロナイド結合PVMMA
結合ポリスチレンラテツクス試薬を製造した。 (f) 尿中プレグナンジオールの測定（凝集阻止
法） 妊婦尿５例をグリシン緩衝化食塩液で250倍、
500倍、1000倍、2000倍および4000倍に希釈し、
前記(c)、(e)を用い、実施例5gと同様な操作で
尿中プレグナンジオールを測定した。なお、こ
の実施例中においては、試薬の感度を0.01μ
ｇ／mlに調整してある。 実施例６で検体の希釈倍数を250倍、500倍、
1000倍、2000倍及び4000倍で測定したので妊婦
尿の検体１の場合1000倍までの凝集阻止がRIA
値と一致と判定し、2000倍以下で凝集阻止を認
めないものを低値（不一致）4000倍以上で凝集
阻止が認められたものを高値（不一致）と判定
した。検体２の場合250倍までの凝集阻止が
RIA値と一致、その他の希釈倍数までの凝集阻
止は不一致、さらに同様に検体３の場合1000倍
までの凝集阻止がRIA値と一致、その他の希釈
培数までの凝集阻止は不一致と判定した。その
結果は第６表に示す。
【表】
結合ラテツクスを使用した測定例である。
その結果本発明法では凝集像が明瞭なため判定
者による個人差がなく10人の判定者が一致した判
定をし、かつRIA値と一致していた。 従来法では陰性像である凝集像が殆んど認めら
れないので個人差が大きく実質的に測定困難であ
つた。 実施例 ７ モルフインの測定 (a) カルボキシメチルモルフイン−BSAの製造 100mgのBSAを25mgの蒸留水に溶解し、この
溶液にカルボキシメチルモルフイン80mgを溶解
させ、PH5.5に調整後80mgの１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩を添加溶解し、室温で一夜撹拌下反応
し、反応液を蒸留水に対して透析し、透析内液
を凍結乾燥してカルボキシメチルモルフイン−
BSAを製造した。 (b) 抗カルボキシメチルモルフイン抗体の製造 上記(a)で製造したカルボキシメチルモルフイ
ン−BSAを用い実施例5bと同様に家兎に免疫
して抗血清を得ることにより抗カルボキシメチ
ルモルフイン抗体を製造した。 (c) 抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作ラテ
ツクスの製造 前記(b)で製造した抗カルボキシメチルモルフ
イン抗体５mgを実施例５(c)と同様な方法で0.1
ｇのポリスチレンラテツクスに感作して0.02％
RSAを含むグリシン緩衝化食塩液10mlで懸濁
させ、ついで同液を加えて250mlの抗カルボキ
シメチルモルフイン抗体感作ラテツクスを製造
した。 (d) カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリ
ル酸の製造 (イ) カルボキシメチルモルフイン−リジン誘導
体 カルボキシメチルモルフイン51.5mg、ε−
第三ブチルオキシカルボニルリジンメチルエ
ステル酢酸塩61mg、DMF10ml、ジフエニル
ホスホリルアジド49mg、トリエチルアミン
0.042mlから実施例６（ｄ−(イ)）と同様にして
カルボキシメチルモルフイン−リジン誘導体
66.7mg（対理論収率78％）を得た。 (ロ) 上記(イ)で得たリジン誘導体40mgを98％ギ酸
５mlに溶かし室温に２時間放置したのち40゜
以下で減圧乾固する。更に苛性カリ上に24時
間減圧に保つ。これをDMF5mlにとかし、ト
リエチルアミン0.02mlを加えたのち、ポリア
クリル酸100mgとDMF3mlを加え更にDCC21
mgを加えて48時間反応させた。実施例５（ｄ
−(ロ)）と同様に処理し、カルボキシメチルモ
ルフイン結合ポリアクリル酸溶液10ml（カル
ボキシメチルモルフイン含有量2.0mg／ml）
を得た。 (e) カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリ
ル酸結合ラテツクスの製造 実施例5eで製造したリジンラテツクス0.1ｇ
に上記(d)で製造したカルボキシメチルモルフイ
ン結合ポリアクリル酸溶液0.2mlを用い、実施
例５(f)と同様の方法でリジンラテツクスに結合
させ、最終的に0.01％GSAを含むグリシン緩衝
化食塩液300mlに懸濁させてカルボキシメチル
モルフイン結合ポリアクリル酸結合ラテツクス
を製造した。 (f) モルフインの測定（凝集阻止法） モルフインを生理食塩水およびモルフインを
含まない尿で溶解希釈し、各溶液１滴（0.03
ml）を反応スライド板上に滴下し、これに前記
(c)で製造した抗カルボキシメチルモルフイン抗
体感作ラテツクス１滴、前記(e)で製造したカル
ボキシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸結
合ラテツクス１滴および実施例２−(a)で製造し
たRSA感作シリカの１％懸濁液１滴を順次滴
下し、４者を均一に混合し、２分間揺動後、肉
眼で凝集像、凝集阻止像を観察した。 本実施例の測定感度は10nｇ／mlであり、こ
の感度は尿成分の影響を受けないことが判つ
た。なお第７表の従来法は上記測定例において
RSA感作シリカ懸濁液１滴のかわりにグリシ
ン緩衝化食液液１滴を加えて同様な操作で測定
した結果であり、陰性像である凝集像が不明瞭
のため測定はほとんど困難であつた。その結果
を第７表に示す。
その結果本発明法では凝集像が明瞭なため判定
者による個人差がなく10人の判定者が一致した判
定をし、かつRIA値と一致していた。 従来法では陰性像である凝集像が殆んど認めら
れないので個人差が大きく実質的に測定困難であ
つた。 実施例 ７ モルフインの測定 (a) カルボキシメチルモルフイン−BSAの製造 100mgのBSAを25mgの蒸留水に溶解し、この
溶液にカルボキシメチルモルフイン80mgを溶解
させ、PH5.5に調整後80mgの１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩を添加溶解し、室温で一夜撹拌下反応
し、反応液を蒸留水に対して透析し、透析内液
を凍結乾燥してカルボキシメチルモルフイン−
BSAを製造した。 (b) 抗カルボキシメチルモルフイン抗体の製造 上記(a)で製造したカルボキシメチルモルフイ
ン−BSAを用い実施例5bと同様に家兎に免疫
して抗血清を得ることにより抗カルボキシメチ
ルモルフイン抗体を製造した。 (c) 抗カルボキシメチルモルフイン抗体感作ラテ
ツクスの製造 前記(b)で製造した抗カルボキシメチルモルフ
イン抗体５mgを実施例５(c)と同様な方法で0.1
ｇのポリスチレンラテツクスに感作して0.02％
RSAを含むグリシン緩衝化食塩液10mlで懸濁
させ、ついで同液を加えて250mlの抗カルボキ
シメチルモルフイン抗体感作ラテツクスを製造
した。 (d) カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリ
ル酸の製造 (イ) カルボキシメチルモルフイン−リジン誘導
体 カルボキシメチルモルフイン51.5mg、ε−
第三ブチルオキシカルボニルリジンメチルエ
ステル酢酸塩61mg、DMF10ml、ジフエニル
ホスホリルアジド49mg、トリエチルアミン
0.042mlから実施例６（ｄ−(イ)）と同様にして
カルボキシメチルモルフイン−リジン誘導体
66.7mg（対理論収率78％）を得た。 (ロ) 上記(イ)で得たリジン誘導体40mgを98％ギ酸
５mlに溶かし室温に２時間放置したのち40゜
以下で減圧乾固する。更に苛性カリ上に24時
間減圧に保つ。これをDMF5mlにとかし、ト
リエチルアミン0.02mlを加えたのち、ポリア
クリル酸100mgとDMF3mlを加え更にDCC21
mgを加えて48時間反応させた。実施例５（ｄ
−(ロ)）と同様に処理し、カルボキシメチルモ
ルフイン結合ポリアクリル酸溶液10ml（カル
ボキシメチルモルフイン含有量2.0mg／ml）
を得た。 (e) カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリ
ル酸結合ラテツクスの製造 実施例5eで製造したリジンラテツクス0.1ｇ
に上記(d)で製造したカルボキシメチルモルフイ
ン結合ポリアクリル酸溶液0.2mlを用い、実施
例５(f)と同様の方法でリジンラテツクスに結合
させ、最終的に0.01％GSAを含むグリシン緩衝
化食塩液300mlに懸濁させてカルボキシメチル
モルフイン結合ポリアクリル酸結合ラテツクス
を製造した。 (f) モルフインの測定（凝集阻止法） モルフインを生理食塩水およびモルフインを
含まない尿で溶解希釈し、各溶液１滴（0.03
ml）を反応スライド板上に滴下し、これに前記
(c)で製造した抗カルボキシメチルモルフイン抗
体感作ラテツクス１滴、前記(e)で製造したカル
ボキシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸結
合ラテツクス１滴および実施例２−(a)で製造し
たRSA感作シリカの１％懸濁液１滴を順次滴
下し、４者を均一に混合し、２分間揺動後、肉
眼で凝集像、凝集阻止像を観察した。 本実施例の測定感度は10nｇ／mlであり、こ
の感度は尿成分の影響を受けないことが判つ
た。なお第７表の従来法は上記測定例において
RSA感作シリカ懸濁液１滴のかわりにグリシ
ン緩衝化食液液１滴を加えて同様な操作で測定
した結果であり、陰性像である凝集像が不明瞭
のため測定はほとんど困難であつた。その結果
を第７表に示す。
【表】
実施例 ８
カテコールアミンの測定
(a) メタネフイリン・BSAの製造
メタネフイリンとBSAとを用いて実施例5a
と同様な方法でメタネフイリン・BSAを製造
した。 (b) 抗メタネフイリン抗体の製造 上記(a)で製造したメタネフイリン・BSAを
用いて、実施例5bと同様な方法で家兎に免疫
して抗血清を得、抗メタネフイリン抗体を製造
した。 (c) 抗メタネフイリン抗体感作ポリスチレンラテ
ツクス試薬の製造 上記(b)で製造した抗メタネフイリン抗体４mg
を実施例5cと同様な方法によりポリスチレンラ
テツクス0.1ｇに感作して得た１％懸濁液（10
ml）を実施例3aで製造したRSA感作ラテツク
スの0.8％懸濁液で12倍に希釈して抗メタネフ
イリン抗体感作ポリスチレンラテツクス試薬を
製造した。 (d) メタネフイリン結合ポリアクリル酸の製造 実施例5dと同様の方法でポリアクリル酸と
メタネフイリンとからメタネフイリン結合ポリ
アクリル酸溶液を製造した。 (e) メタネフイリンの測定（凝集阻止法） 正常男子尿３例について生理食塩水で1.5、
２および３倍に希釈し前記(c)、(d)とを用い実施
例6eにおけるハプテン結合ラテツクスの代りに
メタネフイリン結合ポリアクリル酸溶液を用い
て実施例６と同様な操作により尿中メタネフイ
リンを測定した。本実施例における試薬の測定
感度は10nｇ／mlに調整してある。従来法は抗
メタネフイリン抗体感作ラテツクスの１％懸濁
液をグリシン緩衝化食塩液で12倍に希釈して製
造した抗メタネフイリン抗体感作ラテツクスを
使用した測定例である。 表８に示した各検体を２倍、３倍、４倍及び
６倍に希釈して測定した。No.１の検体の場合、
３倍まで凝集阻止像が認められた時、RIA値と
一致と判定し、３倍で凝集阻止像を認めないも
のを低値（不一致）、４倍以上で凝集阻止像が
認められたものを高値（不一致）と判定した。
No.２及びNo.３の検体の場合、４倍までの凝集阻
止像が認められた時、RIA値と一致、３倍まで
及び６倍以上で凝集阻止像を認めた時は不一致
と判定した。
と同様な方法でメタネフイリン・BSAを製造
した。 (b) 抗メタネフイリン抗体の製造 上記(a)で製造したメタネフイリン・BSAを
用いて、実施例5bと同様な方法で家兎に免疫
して抗血清を得、抗メタネフイリン抗体を製造
した。 (c) 抗メタネフイリン抗体感作ポリスチレンラテ
ツクス試薬の製造 上記(b)で製造した抗メタネフイリン抗体４mg
を実施例5cと同様な方法によりポリスチレンラ
テツクス0.1ｇに感作して得た１％懸濁液（10
ml）を実施例3aで製造したRSA感作ラテツク
スの0.8％懸濁液で12倍に希釈して抗メタネフ
イリン抗体感作ポリスチレンラテツクス試薬を
製造した。 (d) メタネフイリン結合ポリアクリル酸の製造 実施例5dと同様の方法でポリアクリル酸と
メタネフイリンとからメタネフイリン結合ポリ
アクリル酸溶液を製造した。 (e) メタネフイリンの測定（凝集阻止法） 正常男子尿３例について生理食塩水で1.5、
２および３倍に希釈し前記(c)、(d)とを用い実施
例6eにおけるハプテン結合ラテツクスの代りに
メタネフイリン結合ポリアクリル酸溶液を用い
て実施例６と同様な操作により尿中メタネフイ
リンを測定した。本実施例における試薬の測定
感度は10nｇ／mlに調整してある。従来法は抗
メタネフイリン抗体感作ラテツクスの１％懸濁
液をグリシン緩衝化食塩液で12倍に希釈して製
造した抗メタネフイリン抗体感作ラテツクスを
使用した測定例である。 表８に示した各検体を２倍、３倍、４倍及び
６倍に希釈して測定した。No.１の検体の場合、
３倍まで凝集阻止像が認められた時、RIA値と
一致と判定し、３倍で凝集阻止像を認めないも
のを低値（不一致）、４倍以上で凝集阻止像が
認められたものを高値（不一致）と判定した。
No.２及びNo.３の検体の場合、４倍までの凝集阻
止像が認められた時、RIA値と一致、３倍まで
及び６倍以上で凝集阻止像を認めた時は不一致
と判定した。
【表】
実施例 ９
（サイロキシンの測定）
(a) サイロキシン・BSAの製造
BSA50mgを25mlの蒸留水に溶解し、この溶
液に30mgの１−シクロヘキシル−３−（２−モ
ルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・メ
ト−ｐ−トルエンスルホネート（MCDI）を加
え、さらに５mlのジメチルホルムアミドに溶解
したサイロキシンを撹拌下加えて室温にて一夜
撹拌した。反応終了後、反応液をセロフアンチ
ユーブに移し蒸留水２中で48時間透析し、凍
結乾燥してサイロキシン・BSAを製造した。 (b) 抗サイロキシン血清の製造 エストリオール−16−グルクロナイド・
BSAの代りに上記(a)で製造したサイロキシ
ン・BSAを用いる以外、実施例５(b)と全く同
様な方法で抗サイロキシン血清を製造した。 (c) サイロキシン・BSA感作ポリスチレンラテ
ツクス試薬の製造 上記(a)で製造したサイロキシン・BSAを0.08
％の割合にグリシン緩衝液（PH8.6）に溶解し、
その５mlを２％ポリスチレンラテツクス粒子
〔ザ・ダウケミカル・カンパニー製（0.234μ）〕
懸濁液２mlに徐々に加え、37℃で２時間撹拌し
た。反応終了後、5000rpmで10分間遠心分離
し、残渣を10mlのグリシン緩衝液で洗浄したの
ち0.1％RSA溶液10mlに懸濁させ、37℃で２時
間撹拌した。反応終了後、10000rpmで50分間
遠心分離し、グリシン緩衝液で遠心洗浄し、残
渣をグリシン緩衝液に再懸濁させて20mlにした
のち、0.8％のカルボキシルモデイフアイドラ
テツクス懸濁液で50倍に希釈して、サイロキシ
ン・BSA感作ポリスチレンラテツクス試薬を
製造した。 (d) サイロキシン（T4）の測定（凝集阻止法） 正常男子血清３例に８−アニリノ−１−ナフ
タレンスルフオン酸を添加混合し、硫酸アンモ
ニウム2.3ｍmol／mlを含むリン酸緩衝液で２
倍、４倍及び８倍に希釈し、各希釈血清１滴ず
つをスライド板上に滴下した。これにグリシン
緩衝化食塩液で250倍に希釈した上記(b)で製造
した抗血清の希釈液の１滴ずつ、次いで、上記
(c)で製造したサイロキシン・BSA感作ラテツ
クスの１滴ずつを加え、実施例５と同様に測定
した。 本実施例における試薬の感度は15nｇ／mlに
調整してある。 表９に示した各検体を２倍、３倍、４倍及び
６倍に希釈して測定した。No.１及びNo.３の検体
の場合、３倍まで凝集阻止像が認められた時、
RIA値と一致と判定し、３倍で凝集阻止像を認
めないものを低値（不一致）、４倍以上で凝集
阻止像が認められたものを高値（不一致）と判
定した。検体No.２では２倍で凝集阻止像を認め
た場合をRIA値と一致と判定し、その他の場合
を不一致と判定した。
液に30mgの１−シクロヘキシル−３−（２−モ
ルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・メ
ト−ｐ−トルエンスルホネート（MCDI）を加
え、さらに５mlのジメチルホルムアミドに溶解
したサイロキシンを撹拌下加えて室温にて一夜
撹拌した。反応終了後、反応液をセロフアンチ
ユーブに移し蒸留水２中で48時間透析し、凍
結乾燥してサイロキシン・BSAを製造した。 (b) 抗サイロキシン血清の製造 エストリオール−16−グルクロナイド・
BSAの代りに上記(a)で製造したサイロキシ
ン・BSAを用いる以外、実施例５(b)と全く同
様な方法で抗サイロキシン血清を製造した。 (c) サイロキシン・BSA感作ポリスチレンラテ
ツクス試薬の製造 上記(a)で製造したサイロキシン・BSAを0.08
％の割合にグリシン緩衝液（PH8.6）に溶解し、
その５mlを２％ポリスチレンラテツクス粒子
〔ザ・ダウケミカル・カンパニー製（0.234μ）〕
懸濁液２mlに徐々に加え、37℃で２時間撹拌し
た。反応終了後、5000rpmで10分間遠心分離
し、残渣を10mlのグリシン緩衝液で洗浄したの
ち0.1％RSA溶液10mlに懸濁させ、37℃で２時
間撹拌した。反応終了後、10000rpmで50分間
遠心分離し、グリシン緩衝液で遠心洗浄し、残
渣をグリシン緩衝液に再懸濁させて20mlにした
のち、0.8％のカルボキシルモデイフアイドラ
テツクス懸濁液で50倍に希釈して、サイロキシ
ン・BSA感作ポリスチレンラテツクス試薬を
製造した。 (d) サイロキシン（T4）の測定（凝集阻止法） 正常男子血清３例に８−アニリノ−１−ナフ
タレンスルフオン酸を添加混合し、硫酸アンモ
ニウム2.3ｍmol／mlを含むリン酸緩衝液で２
倍、４倍及び８倍に希釈し、各希釈血清１滴ず
つをスライド板上に滴下した。これにグリシン
緩衝化食塩液で250倍に希釈した上記(b)で製造
した抗血清の希釈液の１滴ずつ、次いで、上記
(c)で製造したサイロキシン・BSA感作ラテツ
クスの１滴ずつを加え、実施例５と同様に測定
した。 本実施例における試薬の感度は15nｇ／mlに
調整してある。 表９に示した各検体を２倍、３倍、４倍及び
６倍に希釈して測定した。No.１及びNo.３の検体
の場合、３倍まで凝集阻止像が認められた時、
RIA値と一致と判定し、３倍で凝集阻止像を認
めないものを低値（不一致）、４倍以上で凝集
阻止像が認められたものを高値（不一致）と判
定した。検体No.２では２倍で凝集阻止像を認め
た場合をRIA値と一致と判定し、その他の場合
を不一致と判定した。
【表】
従来法は前記(c)における１％サイロキシン・
BSA感作ラテツクスをグリシン緩衝化食塩液で
50倍に希釈したサイロキシン・BSA感作ラテツ
クスを用いた場合の測定例である。
BSA感作ラテツクスをグリシン緩衝化食塩液で
50倍に希釈したサイロキシン・BSA感作ラテツ
クスを用いた場合の測定例である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 抗体、抗原又はハプテンを物理的又は化学的
に結合せしめることにより免疫学的に活性化した
固体担体粒子を用い、凝集反応又は凝集阻止反応
を利用して、被検液中の免疫学的に活性な微量物
質を検出することから成る免疫学的測定方法にお
いて、該凝集反応又は凝集阻止反応を免疫学的に
不活性な固体微粒子の存在下に行なうことを特徴
とする免疫学的測定方法。 ２ 抗体、抗原又はハプテンを物理的又は化学的
に結合せしめることにより免疫学的に活性化した
固体担体粒子と、免疫学的に不活性な固体微粒子
とを含んで成ることを特徴とする免疫学的測定試
薬。 ３ 抗体及び抗原又はハプテンのうち少なくとも
一方が固体担体粒子に物理的又は化学的に結合さ
れた状態にある抗体試薬と抗原又はハプテン試薬
との組合わせからなる免疫学的診断試薬系におい
て、上記試薬の少なくとも一方に免疫学的に不活
性な固体微粒子を含ませるか及び／又は上記試薬
とは別の試薬として免疫学的に不活性な固体微粒
子を組合わせたことを特徴とする免疫学的測定試
薬系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12344480A JPS5748658A (en) | 1980-09-08 | 1980-09-08 | Immunologic measuring method and reagent for measurement |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12344480A JPS5748658A (en) | 1980-09-08 | 1980-09-08 | Immunologic measuring method and reagent for measurement |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5748658A JPS5748658A (en) | 1982-03-20 |
| JPS6363861B2 true JPS6363861B2 (ja) | 1988-12-08 |
Family
ID=14860746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12344480A Granted JPS5748658A (en) | 1980-09-08 | 1980-09-08 | Immunologic measuring method and reagent for measurement |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5748658A (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6021959A (ja) * | 1983-07-15 | 1985-02-04 | 株式会社山東鉄工所 | 伸縮しやすい布帛の湿熱処理装置 |
| JPS6039469A (ja) * | 1983-08-10 | 1985-03-01 | 株式会社山東鉄工所 | 高熱液処理加工方法 |
| JPS60242369A (ja) * | 1984-05-16 | 1985-12-02 | Fujirebio Inc | イムノアツセイにおける非特異反応吸収剤 |
| JPS60256057A (ja) * | 1984-06-01 | 1985-12-17 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 免疫学的測定法 |
| GB8422512D0 (en) * | 1984-09-06 | 1984-10-10 | Wellcome Found | Diagnostic test methods |
| JPS6147566A (ja) * | 1984-08-13 | 1986-03-08 | Tetsuo Tomiyama | 抗風疹ウイルス抗体感作血球及びこれを用いる抗風疹ウイルス抗体の測定方法 |
| JPS6153569A (ja) * | 1984-08-24 | 1986-03-17 | Tetsuo Tomiyama | 抗風疹ウイルス抗体感作ラテツクス及びこれを用いる抗風疹ウイルス抗体の測定方法 |
| JPH046218Y2 (ja) * | 1985-02-01 | 1992-02-20 | ||
| JP2571383B2 (ja) * | 1987-05-21 | 1997-01-16 | 株式会社 ヤトロン | 生体成分中のヒト・ヘモグロビンの測定方法及び測定用試薬キット |
| US5127699A (en) * | 1988-04-18 | 1992-07-07 | Kubota Tekko Kabushiki Kaisha | Device for reversibly supporting seat for vehicles |
| US5096837A (en) * | 1990-02-08 | 1992-03-17 | Pacific Biotech, Inc. | Immunochromatographic assay and method of using same |
-
1980
- 1980-09-08 JP JP12344480A patent/JPS5748658A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5748658A (en) | 1982-03-20 |
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