JPH0795065B2 - 水不溶性試薬、それを含む要素及びその使用方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、種々の免疫方法で有用である水不溶性試薬に
関する。本発明はまた、該試薬を含有する要素及びそれ
を使用する免疫学的方法に関する。

〔従来の技術〕

自然免疫反応を利用する免疫アッセイは、臨床化学に於
ける分析技術として広く使用されてきた。その反応の特
異性のために、免疫アッセイは、非常に低い濃度で存在
し化学的技術では適切に定量できない生物学的検体を定
量する上で特に有利である。このような検体（本明細書
ではリガンドという）には、例えば、治療医薬、麻酔
薬、抗生物質、ホルモン、蛋白質及び当該技術で公知の
他のものが含まれる。非常に低濃度のリガンドを分析す
るためにいくつかの技術が提案されている。例えば、リ
ガンドは容易に検出できるようにするために種々の方法
で識別される。競合結合アッセイに於て、標識（ラベ
ル）されたリガンド類似体（analog）（本明細書ではリ
ガンド類似体という）は、適当な結合物質（レセプター
ともいう）の固定量との反応のために標識されていない
リガンドと競合状態に置く。リガンドの未知の濃度は、
結合した又は結合していないリガンド類似体の測定され
たシグナルから分析できる。

感度は、分析しようとするリガンドのレベルが極めて低
いために最も重要である。種々のラベルが使用できるけ
れども、蛍光又は酵素ラベルが、増大した感度のために
多くの免疫アッセイで一般に好ましい。

また、免疫アッセイは、不均質又は均質に分類できる。
不均質競合結合免疫アッセイでは、フリー（遊離）のリ
ガンド類似体から結合したリガンド類似体を分離するこ
とが必要である。この分離は結合した類似体とフリーの
類似体の性質が著しく異なっていないために必要であ
る。均質免疫アッセイでは、結合した類似体とフリーの
類似体の性質が充分に異なっており、そのために容易に
区別できるために分離工程は必要ではない。

ポリマー粒子のような不溶性担体物質に付いている生物
学的に活性のポリペプチド又は蛋白質は、免疫アッセイ
の種々の方法で使用できる。例えば、人及び動物の病的
又は他の状態の診断は、しばしば、人又は動物の体液中
の免疫反応性種、例えば、抗体又は抗原の検出のための
免疫学原理を使用して行なわれる。抗原は、一般に薬、
ハプテン、毒素、レクチン、糖蛋白質、多糖類、糖脂
質、ポリペプチド又は蛋白質のような、体内に取り込ま
れたとき抗体として知られているある種の可溶性蛋白質
を生成する異物として知られている。

酵素のような他の蛋白質は、親和性クロマトグラフィ
ー、酵素反応、特定結合反応及び免疫アッセイで使用す
るために、種々の担体物質に共有結合で結合している。
有用な担体物質には、羊及び人の赤血球、バクテリア細
胞、ラテックス粒子、樹脂状粒子、並びに微細ジアゾ化
アミノセルロースがある。例えば、乳化剤の不存在下に
水難溶性モノマー（例えば、エポキシ基含有モノマー）
から製造した担体粒子は、当該技術で公知である。

〔発明が解決しようとする課題〕

また、カルボキシル化ラテックス粒子が診断試薬を製造
するために使用されている。免疫反応性種（species）
を表面にカルボキシル基を有する粒子に共有結合させた
めの公知の方法には、追加の活性化工程で水溶性カルボ
ジイミドを使用することが含まれる。有用な試薬を製造
するけれども、この方法は反応性種の露出された反応性
基をカルボキシル基と同様に活性化する傾向がある。そ
の結果は免疫反応性種の分子内及び分子間の架橋又は重
合であり、かくして種の重要な部分はレセプター分子と
の錯体化が損なわれる。反応性種、例えば、抗体は一般
に非常に高価であるので、この問題は重大な経済的損失
を示す。更に、得られる試薬の感度が損なわれる。カル
ボジイミドが、不安定であり直ちに使用しなくてはなら
ない蛋白質結合のための反応性中間体を提供することも
明らかである。これはカルボジイミド化学についての重
大な欠点である。

エポキシド、アルデヒド、クロロメチル基、アミン基及
びジアゾニウム塩のような反応性基を有する粒子で、種
々の他の試薬が製造されている。全てのこれらの基は、
それぞれ欠点を持っている。例えば、エポキシド基は安
定でなく、そのためには粒子は非常に長い期間貯蔵でき
ない。アルデヒド基を有する粒子は、一般に早期に凝集
する傾向がある。アミン基を有する粒子は、カルボキシ
ル化物質と似て追加の活性化工程を必要とする。ジアゾ
ニウム化合物は不安定であり、それを使うことは望まし
くない。

米国特許第4,283,382号には、粒子内にユーロピウムキ
レートトレーサー物質を有する免疫反応試薬が記載され
ている。この試薬のあるものは、反応性クロロメチル基
を有するポリマーから製造される。このような物質はい
くつかの利点を示すが、免疫種をこのようなポリマーに
結合するためには、高い温度、長い反応時間及び激しい
混合状態が必要である。もし結合条件が正しくないと、
結合は不完全であり、試薬の感度は劣ったものになる。

水不溶性粒子に結合した蛋白質からなる試薬は、免疫ア
ッセイ、診断方法及び類似のものを含む多くの方法で非
常に有用である。もし高い感度の試薬が、効率的な方法
で、限定されない条件及び感度を低下させないか又は他
の望ましくない結果を生じない条件下で容易に製造でき
るならば、それは非常に有用である。

〔課題を解決するための手段〕

公知の試薬による上記の問題点は、 （ａ）２−置換エチルスルホニル又はビニルスルホニル
基側鎖を有する少なくとも１種のエチレン性不飽和重合
性モノマーから誘導されたポリマー粒子、及び、 （ｂ）該側鎖基を介して共有結合で結合している、対応
するレセプターとの免疫反応に関与し得る免疫種から成
り、 該粒子の内部に検出し得るトレーサー物質が実質的に存
在しない試薬によって、 （ａ）２−置換エチルスルホニル又はビニルスルホニル
基側鎖を有する少なくとも１種のエチレン性不飽和重合
性モノマーから誘導されたポリマー粒子及び、 （ｂ）該側鎖基を経由して共有結合で結合している、対
応するレセプターとの免疫反応に関与し得る免疫種から
成り、 該粒子の内部に検出し得るトレーサー物質が実質的に存
在しない試薬から成る要素によって、 A:リガンドの類似体の存在下で、流体試料を上記試薬と
接触させて、該免疫種と該免疫リガンド及びリガンド類
似体との免疫錯体を形成し、そして、 B:流体中のリガンドの存在の指標として免疫錯体を分析
することからなる、水性体液中の免疫リガンドの分析方
法によって、 A:水性液体を上記試薬と接触させて、該水性液体中のリ
ガンドと該免疫種との反応生成物の凝集体を形成し、 B:該凝集体を非凝集物質から分離し、そして、 C:該液体中のリガンドの存在の指標として該凝集体を分
析することからなる、水性液体中のリガンドを分析する
ための凝集方法によって A:水性液体を上記試薬と接触させて、該免疫種と該水性
液体中のリガンドとの不溶性免疫錯体を形成し、 B:接触工程Ａの前、それと同時に、又はその後で、該リ
ガンドを、該リガンドと免疫的に反応性であるが対応す
るレセプターとの免疫反応に関与することができる、前
記試薬中に存在する第一の免疫種とは反応性でなく、検
出し得るトレーサー物質で標識されている第二の免疫種
と接触させて、標識された不溶性錯体を形成し、そし
て、 C:該液体中のリガンドの存在の指標として該標識された
不溶性錯体を分析することからなる、水性液体中のリガ
ンドの分析方法によって、それぞれ、解決することがで
きる。

〔実施態様の説明〕

本発明の試薬は、検体（即ち、リガンド）が試薬の免疫
種のための特定の結合親和性を有する免疫反応性種であ
る多くの異なった免疫アッセイで使用できる。

該試薬はポリマー粒子に結合した免疫種を有する。この
種は、少なくとも１個の反応性アミン又はスルフヒドリ
ル基を有する生理学的液体、細胞及び組織抽出物又は化
学化合物の成分であり、免疫種との免疫反応のための反
応性サイトを有する化学的又は生物学的化合物である対
応するレセプター化合物（天然又は合成）との免疫反応
に関与できる。免疫種は、（１）免疫生成能の宿主に出
会ったときその物質と結合し得る特定の抗体を生成する
結果になる全ての物質、又は（２）種がその使用に於て
抗原−抗体反応に関与する、そのようにして生成された
抗体の何れをも意味する。

代表的免疫種には、第一級アミン、アミノ酸、ペプチ
ド、蛋白質、脂蛋白質、糖蛋白質、ステリン、ステロイ
ド、リピド（脂質）、核酸、ホルモン、ビタミン、多糖
類、炭水化物、糖脂質、アルカロイド、生物（細菌、原
生動物、菌類、ウイルス、レトロウイルス、リケッチア
及び類似物）及びその構成成分、血液物質、組織及び臓
器抗原並びに当業者に公知の他の物質（米国特許第4,18
1,636号参照）が含まれる。ある例に於て、免疫種は、
蛋白質、炭水化物、ポリペプチド、糖蛋白質、多糖類、
糖脂質及び類似物（例えば、ウイルス、クラミジル、淋
菌、ストレプトコッカス又は同様の生物のような生物か
ら）のような、ハプテン、医薬、ホルモン、抗生物質又
は抗原物質に指向する抗体である。また、免疫種は、抗
体と免疫反応性である或種の抗原（即ち、ポリペプチ
ド、炭水化物又は蛋白質含有物質）である。更に他の態
様に於て、免疫種は、他の抗体に向かう抗体（即ち、抗
抗体（anti−antibody））である。モノクローナル及び
ポリクローナル抗体の両者が使用でき、これらはポリマ
ー粒子の側鎖反応性基と反応できる少なくとも１個の反
応性アミン又はスルフヒドリル基を有する限り、分子全
体又はその種々の断片であってよい。

ある実施態様に於て、免疫種はポリマー粒子に結合した
酵素である。この方法で結合できる酵素には、ポリマー
粒子上の活性基と反応し得る反応性アミン基を有するも
のが含まれる。代表的酵素には、アスパルテートアミノ
トランスアミナーゼ、アラニンアミノトランスアミナー
ゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、クレアチンホスホキ
ナーゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、アルカ
リアシッドホスファターゼ及びプロスタチン酸ホスファ
ターゼが含まれる。このような試薬を作る方法は当該技
術で公知である。

本発明の水不溶性試薬は、上記の免疫種を特定組成の水
不溶性ポリマー粒子に結合することによって製造され
る。これらの粒子は、粒子の表面に、免疫種又はその他
の生物学的化合物と自由に反応し得る側鎖２−置換エチ
ルスルホニル又はビニルスルホニル基がある下記エチレ
ン性不飽和重合性モノマーから製造される。ある実施態
様に於て、全体の粒子は同じポリマーからなる。即ち、
それらは均質である。しかしながら、他の態様に於て、
米国特許第4,401,765号に記載されたような、第一ポリ
マーのコア（芯）と第二ポリマーのシェル（殻）を有す
るコア−シェルポリマー粒子のような当該技術で公知で
ある粒子である。この態様に於て、コアの組成は限定的
ではないが、シェルは必要な側鎖反応性基を有する本明
細書に記載したモノマーから成るものでなくてはならな
い。更に他の態様に於て、粒子は第一ポリマー上に必要
な側鎖反応性基を有する第二ポリマーがグラフトされて
いるものから成る（米国特許第3,700,609号参照）。

前記ポリマー粒子は、一般に、0.01μｍ以上、好ましく
は、0.01〜５μｍ、更に好ましくは、0.3〜３μｍの粒
子サイズを有する水不溶性ラテックス粒子である。

上記のように、本発明の実施に有用なポリマー粒子は、
側鎖活性化２−置換エチルスルホニル又はビニルスルホ
ニル基を有する少なくとも１種のα，β−エチレン性不
飽和重合性モノマーから誘導されるポリマーから成る。
必要な側鎖基を有する多くの代表的モノマーは、米国特
許第4,161,407号及び同第4,548,870号を含む当該技術で
公知である。

特に有用なポリマーは、式： Ａ_ｘＢ_ｙＤ_ｚ で表わされるポリマーである。

式中、Ａは１種又はそれ以上の疎水性のエチレン性不飽
和モノマーから誘導される繰り返し単位を表わす。この
ようなモノマーは水に不溶性である。代表的な疎水性モ
ノマーには、スチレン及びスチレン誘導体（例えば、ビ
ニルトルエン、2,5−ジメチルスチレン、４−ｔ−ブチ
ルスチレン及び２−クロロスチレン）、アクリル酸エス
テル及びメタクリル酸エステル（例えば、ｎ−ブチルア
クリレート、プロピルメタクリレート、メチルアクリレ
ート、エチルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタ
クリレート及びメチルメタクリレート）並びに酢酸ビニ
ルが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明で有用なポリマーは、所望ならば、適当な方法で
架橋できる。一つの方法は、少量の、即ち15モル％まで
の、好ましくは0.3〜５モル％の、２個又はそれ以上の
エチレン性不飽和重合性基を有するモノマーを含有させ
ることである。これらのモノマーは、Ａが誘導される疎
水性モノマーに含まれる。代表的なモノマーは、Resear
ch Disclosure,publication19551,1980年７月、304頁に
記載されており、例えば、ジビニルベンゼン、エチレン
ジメタクリレート、N,N′−メチレンビスアクリルアミ
ド、2,2−ジメチル−1,3−プロピレンジアクリレート、
アリルアクリレート、エチリジントリメタクリレート及
びエチレンジアクリレートを含む。

Ａが誘導される特に有用なモノマーは、スチレン、ビニ
ルトルエン、エチレンジメタクリレート、ブチルアクリ
レート、ジビニルベンゼン、２−エチルヘキシルメタク
リレート及びメチルメタクリレートである。

Ｂは、式： で表わされる１種又はそれ以上のα，β−エチレン性不
飽和モノマーから誘導される繰り返し単位を表わす。こ
の式中、Ｒは水素又はメチル、エチル、イソプロピル若
しくはヘキシルのような置換若しくは非置換アルキル
（一般に１〜６個の炭素原子）である。好ましくは、Ｒ
は水素又はメチルである。

R¹は−CH＝CHR²又は−CH₂CH₂X〔式中、Ｘは求核試薬に
よって置換されるか又は塩基（例えば、ハロ、アセトキ
シ、メチルスルホニルオキシのようなアルキルスルホニ
ルオキシ、ｐ−トリルスルホニルオキシのようなアリー
ルスルホニルオキシ、トリアルキルアンモニオ、例え
ば、トリメチルアンモニオ塩、又は、ピリジニオ塩）で
の処理によりHXを形成して除かれるリービング基（leav
ing group）である〕である。R²は、水素、置換又は非
置換のアルキル（一般にＲについて定義したような１〜
６個の炭素原子）、又は置換若しくは非置換のアリール
（一般に６〜12個の核炭素原子、例えば、フェニル、ナ
フチル、キシリル、又はトリル）である。好ましくは、
R¹は−CH₂CH₂Xである。活性化２−置換エチル基である
この基は、リービング基Ｘの置換を損なわないあらゆる
基で置換し得る。

Ｌは、主鎖中に一般に１〜20個の炭素原子及びヘテロ原
子を有する置換又は非置換アルキレンである結合基であ
る。アルキレンについてのこの定義は、オキシ、チオ、
−NR³−〔式中、R³は水素、１〜６個の炭素原子の置換
若しくは非置換アルキル（例えば、メチル、クロロメチ
ル若しくは２−ヒドロキシエチル）又は６〜10個の炭素
原子の置換若しくは非置換のアリール（例えば、フェニ
ル、ナフチル、若しくはキシリル）である〕、エステル
（−COO−）、アミド（−CONH−）、ウリレン スルホニル（−SO₂−）、カーボネート、スルホンアミ
ド、アゾ、ホスホノ又は他の同様な基が、中間に入るか
又は末端に付いたアルキレン基を含むことを意味する。
代表的なアルキレン基には、メチレン、エチレン、イソ
ブチレン、ヘキサメチレン、カルボニルオキシエトキシ
カルボニルエチレン、メチレンビス（イミノカルボニ
ル）エチレン、カルボニルオキシドデシレンカルボニル
オキシエチレン、カルボニルイミノメチレンイミノカル
ボニルイミノエチレン、カルボニルイミノメチレンイミ
ノカルボニルエチレン、及び米国特許第4,161,407号及
び同第4,548,870号に記載又は示唆された他の基が含ま
れる。

また、Ｌは一般に６〜12個の核炭素原子を有する置換又
は非置換アリーレンであってもよい。代表的なアリーレ
ン基には、フェニレン、トリレン、ナフチレン及び上記
特許に記載された他のものが含まれる。また、Ｌのこの
定義には、上記定義されたアルキレン又はアリーレン基
のそれぞれの１個又は２個以上の組合せである二価の基
（例えば、アリーレンアルキレン、アルキレンアリーレ
ンアルキレン、及び当業者によって容易に決定できる他
のもの）が含まれる。好ましくは、Ｌは置換若しくは非
置換のフェニレンアルキレン、１個又は２個以上のアル
キル基（Ｒについて定義したもの）、アルコキシ基（一
般に１〜６個の炭素原子で、例えば、メトキシ、プロポ
キシ又はブトキシ）、若しくはハロ基で置換されたフェ
ニレンアルキレン又はカルボニルイミノメチレンイミノ
カルボニルエチレンである。

Ｂが誘導される代表的モノマーには、ｍ＆ｐ−（２−ク
ロロエチルスルホニルメチル）スチレン、ｍ＆ｐ−〔２
−（ｐ−トリルスルホニルオキシ）エチルスルホニルメ
チル〕スチレン、ｍ＆ｐ−ビニルスルホニルメチルスチ
レン、Ｎ−〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメ
チル）フェニル〕アクリルアミド、及びＮ−〔２−（２
−クロロエチルスルホニル）エチルホルムアミドメチ
ル〕アクリルアミドが含まれる。最初のモノマーが好ま
しい。

Ｄは、Ａ又はＢによって示されるもの以外の１種又はそ
れ以上のエチレン性不飽和モノマーから誘導される繰り
返し単位を表わす。一般にこのようなモノマーは、水溶
液中で得られた粒子に分散安定性を付加するイオン性又
は親水性の基を有する。有用なイオン性モノマーには、
ナトリウム２−アクリルアミド−２−メチルプロパンス
ルホネート、ナトリウム３−アクリロイルオキシプロパ
ンスルホネート、アクリル酸ナトリウム、メタクリル酸
ナトリウム及びナトリウムスチレンスルホネート、同様
に他の公知のスルホネート、スルフエート、カルボキシ
レート、その塩又は無水物が含まれ、そして、有用な非
イオン性の極性モノマーには、２−ヒドロキシエチルア
クリレート、2,3−ジヒドロキシプロピルアクリレー
ト、アクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレ
ート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２−ヒドロキ
シプロピルメタクリレート、アクリロニトリル、及びＮ
−イソブトキシメチルアクリルアミドが含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。好ましいモノマーは、
ナトリウム２−アクリルアミド−２−メチルプロパンス
ルホネート、アクリル酸ナトリウム、ナトリウム３−ア
クリロイルオキシプロパンスルホネート、メタクリル酸
ナトリウム、２−ヒドロキシエチルアクリレート、2,3
−ジヒドロキシプロピルアクリレート、アクリルアミ
ド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びアクリロニ
トリルである。

上記定義の式に於て、一般に、ｘは０〜99.9モル％、ｙ
は0.1〜100モル％、そしてｚは０〜20モル％である。好
ましい量は、ｘが50〜99.5モル％、ｙが0.5〜50モル
％、そしてｚが０〜10モル％である。

粒子が形成される代表的ポリマーには、ポリ〔スチレン
−共−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレ
ン〕（95.5:4.5モル比）及びポリ｛スチレン−共−Ｎ−
〔ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェ
ニル〕アクリルアミド｝（99.3:0.7モル比）が含まれ
る。最初のポリマーが好ましい。これらのポリマー及び
代表的物質について更に詳細なことは、米国特許第4,16
1,407号及び同第4,548,870号に記載されている。

ポリマー粒子は、乳化（回分、半連続、及び連続を含
む）及び懸濁重合技術、グラフト共重合並びにポリマー
化学技術の当業者に公知の他の技術を含む適当な重合技
術を使用して製造できる。例えば、米国特許第4,415,70
0号及びResearch Disclosure,publication15963,（1977
年７月）に記載されたような界面活性剤又は乳化剤を使
用しないで粒子を生成するために使用できるので乳化重
合が好ましい。

免疫種を粒子に共有結合で結合させることにより本発明
の試薬を製造するための一般的な方法は、次の通りであ
る。即ち、ポリマー粒子を緩衝水溶液（pHは一般的に７
〜10）中で、且つ0.01〜40重量％｛好ましくは0.01〜10
重量％）のポリマー粒子濃度で免疫種と混合する。免疫
種の量は、種のポリマーに対する比が0.1:1000〜1:10、
好ましくは、1:100〜1:10である。混合は５〜50℃、好
ましくは、５〜25℃の範囲の温度で0.5〜48時間行な
う。任意の適当な緩衝剤が使用できるが、第三級アミン
が好ましい。この方法の詳細は、以下の実施例１に示
す。

本発明で使用されるポリマー粒子は、粒子内に検出し得
るトレーサー物質を実質的に含有しない。この試薬を使
用する場合に、粒子内のトレーサーは、不利であるか、
外部トレーサーを使用する場合に必要でなく、また、試
薬の検出が使用とは無関係である場合に必要ではない。
トレーサーは、適当な装置及び技術を使用して検出でき
る物質である。このことは粒子の内部に、比色若しくは
蛍光染料若しくは化合物（例えば、希土類キレート）、
化学ルミネセンス化合物、燐光化合物、ラジオアイソト
ープ、又は生物発光化合物のような、トレーサー物質の
検出し得る量を含有しないことを意味する。ある態様に
於て、試薬は粒子の表面上に付随するか、又はどうにか
して免疫種に結合したトレーサー物質（例えば、酵素又
はラジオアイソトープ）を有し得る。他の態様に於て、
試薬は如何なる手段でも付随するトレーサーを有しな
い。

本発明の試薬は、水性液体中の検体の分析（定性又は定
量測定）に使用できる。この分析は、検体の存在又は不
存在を単に分析するか、又は、検体の量を定量的に分析
することによって行なうことができる。検体が免疫方法
によって分析できる場合、これは本明細書に於けるリガ
ンドと同一視できる。特に、本発明は動物、人又は植
物、好ましくは人の生物学的体液を測定するために使用
できる。このような体液には、全血液、血漿、血清、リ
ンパ液、胆汁、尿、脊髄液、唾液、汗及び便分泌物及び
これらの類似物が含まれるが、それらに限定されるもの
ではない。これはまた、骨筋肉、心臓、腎臓、肺臓、
脳、骨髄、皮膚及びこれらの類似物のような人又は動物
組織の体液標本を測定できる。

本発明は、本発明の試薬上で免疫種と反応性である広範
囲の種々のリガンドを検出又は定量するために使用でき
る。このようなリガンドには、試薬の免疫種と錯体を形
成する１個又は２個以上のサイトを有する蛋白質、ホル
モン、医薬、ハプテン、炭水化物、植物レクチン又は脂
多糖類が含まれるが、それらに限定されるものではな
い。例えば、試薬は医薬又はハプテンであるリガンドに
脂向する抗体から成る。本発明は、ジゴキシン、フェニ
トイン、フェナバルビタール、チロキシン、トリヨード
チロニン、ゲンタマイシン、カルバマゼピン、プリミド
ン、トブラマイシン又はテオフィリンの分析に特に有用
である。

また、リガンドは、その一つが本発明の試薬の一部であ
る１個又は２個以上の免疫種と錯体を形成する２個又は
３個以上のサイトを有する抗体である。本明細書に記載
した診断測定に於て、リガンドはポリペプチド、酵素、
菌類、原生動物、ストレプトコッカス（Streptococcu
s）Ａ抗原、クラミジル及び淋菌有機体からの抗原、レ
トロビールス抗原又は抗体（例えば、HTLV抗原若しくは
抗体、又はHIV抗原若しくは抗体）、甲状腺刺激ホルモ
ン、アポ脂蛋白質、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、ロイ
チナイズ化（leutinizing）ホルモン、ヘルペスビール
ス、及び他の生物学的化合物、有機体又はその構成成分
である。

本発明の試薬は競合結合免疫アッセイに於ける溶液測定
法で使用できる。溶液測定は、本発明の試薬が免疫アッ
セイの懸濁液中で使用される。結合した（即ち錯体化し
た）又は結合しない（即ち錯体化しない）標識物質のど
ちらも分析できる。所望により、結合した物質と結合し
ない物質との物理的分離が、適当な分離技術を使用して
できる。下記の分析要素を使用して、垂直又は水平分離
の何れもが使用できる。

競合結合アッセイに於て、試薬は一般に、ポリマー粒子
上の免疫種の量及び行なわれるアッセイの形式に依存す
る量の濃度で依存する。これはまた、免疫種の結合定数
に存在する。与えられたアッセイのための適当な量は、
当業者により容易に決定できる。対応するリガンド類似
体は、与えられたアッセイについて当該技術で一般に公
知の量で存在する。他の物質、例えば緩和剤、界面活性
剤、色形成のための試薬が、所望によりアッセイに使用
できる。

アッセイは一般に、適当な容器内で、試薬、標識された
リガンド類似物及び試験すべき試料を物理的に接触させ
混合することによって行なわれる。得られた懸濁液を、
所望により、錯体化及び他の反応を促進するためにイン
キュベートする。試料を次いで適当な検出装置及び方法
を使用して評価する。

他の態様に於て、試薬は免疫分析アッセイ、例えば「サ
ンドウイッチ」アッセイとして公知である方法で使用で
きる。このようなアッセイの詳細は、米国特許第4,486,
530号に記載されている。本発明の試薬は、分析すべき
リガンドが２個又は３個以上のレセプター分子と免疫反
応する２個又は３個以上のエピトープサイト（epitopic
site）を有する分析で有用である。レセプター分子は
同じでも異なっていてもよい。レセプター分子の一つ
は、本明細書では本発明の試薬の一部として結合してい
る第一の免疫種と同じである。また、第一の種が反応す
るサイトとは異なったサイトでリガンドと免疫反応し得
る第二の免疫種が使用される。この方法の結果、二つの
異なった免疫種とリガンドとの錯体が形成される。第二
の種（即ち、本発明の試薬の一部ではない）は、得られ
る不溶性錯体が容易に検出できるような方法で識別され
る。免疫分析アッセイに於て、両方の免疫種は抗原に指
向する区別できる抗体である。これらは、同じ又は異な
った抗体、全体又は断片、モノクローナル又はポリクロ
ーナルである。

本発明の更に他の態様に於て、本発明の試薬は抗原及び
分析すべきリガンドからなる抗体である。測定で使用さ
れる第二の免疫種は、第一の抗体に指向する第二の抗体
である。第二の免疫種は識別されていても識別されてい
なくてもよい。もし第二の抗体が識別されていないなら
ば、第二の抗体の指向する識別された第三の抗体、又
は、第二の抗体と反応性の識別された第二の抗原分子が
使用される。

上記本発明の方法は、乾式分析要素で実施できる。最も
簡単な要素は、吸収性担持物質、例えば、濾紙又は濾紙
片のような自己支持性吸収性又は吸収性物質の薄いシー
トからなり、これは少なくとも１個の帯域が本発明の試
薬を含有している１個又は２個以上の帯域を有してい
る。他の帯域は他の有用な試薬を含有するために使用で
きる。このような要素は、当該技術分野で、試験片、診
断要素、浸漬棒、又は診断剤として公知である。

好ましくは、本発明の乾式分析要素の吸収性担持物質
は、多孔性展開域である。この帯域は、自己支持性（即
ち、その元の状態を維持するために充分堅い物質からな
る）で有り得るが、好ましくは、別の支持体上に担持さ
れる。

多孔性展開域は、適当な繊維状若しくは非繊維状物質又
はその何れか若しくは両者の混合物から製造できる。こ
の帯域の孔容積及び平均孔サイズは、意図する用途に依
存して変えることができる。有用な展開域は、例えば、
米国特許第4,292,272号、同第3,992,158号、同第4,258,
001号、同第4,430,436号、および日本特開昭57（1982）
−101760号に記載された物質及び方法を使用して製造で
きる。要素は同じ層内か又は重ねて２個又は３個以上の
区別した帯域を有する。

本発明の試薬が要素内にあるとき、リガンド類似体も要
素の中なることは、競合結合反応に於て重要ではない。
アッセイの時点でリガンド類似体を要素に添加すること
ができる。しかしながら、好ましくは、リガンド及び本
発明の試験は両方とも要素内にあり、それらが測定の前
には相互作用しないような方法で互いに分離されてい
る。例えば、これらの物質の一方又は両方は、適用され
た水性試料中で溶解するような物質でカプセル化され
る。また、それらは測定が行なわれるまで混合しないよ
うな、要素の異なった帯域に置くことによって分離でき
る。

競合結合アッセイの一態様に於て、医薬又はホルモンの
免疫分析のための分析要素は、その上に、下記順序で液
体接触で、 分析に於て検出し得るシグナルを与えるための１種又は
それ以上の試薬を含有する試薬層、 医薬又はホルモンの酵素標識類似体を含有する水溶性層
及び、 医薬又はホルモンに対向する１種又はそれ以上の抗体分
子に繰り返し単位Ｂを介してその粒子が共有結合した上
記試薬を含有する多孔性展開層を有する非孔性支持体か
ら成る。

本発明のアッセイは手動又は自動的にできる。一般に、
乾式要素を使用するに当たり、検体分析は、該要素を供
給ロール、チップ包み又は他の源から取り出し、それを
試験すべき液体の試料（例えば、500μまで）と物理
的に接触させて、要素内の試料と試薬とが混合するよう
にして行なう。このような接触は、例えば、試料中に要
素を浸漬するか、又は好ましくは、適当な分配手段で手
又は機械で試料の液滴を要素に滴注することにより、適
当な方法で行なうことができる。米国特許第4,670,381
号には、試料適用の更に詳細なことが示されている。洗
液もまた、例えば、米国特許第4,517,288号に記載され
たように用いることができる。

本発明の更に他の態様に於て、本発明の試薬は免疫反応
で免疫種と錯体を形成するリガンドの存在を分析するた
めの凝集アッセイで使用できる。得られた錯体は粒子の
検出できる凝集体に沈澱する。凝集体は、例えば、肉眼
又は適当な光散乱検出装置で検出できる。有用な凝集技
術は米国特許第4,419,453号に記載されている。

下記の製造は、本発明の実施で有用なポリマー粒子を製
造する代表的な方法を示す。

製造1:ポリ〔スチレン−共−ｍ＆ｐ（２−クロロエチル
スルホニルメチル）スチレン〕（95.5:4.5モル比）の製
造 ３個の試薬の溶液を、同時に添加し、容器内で80℃で連
続エマルジョン重合技術を使用して混合した。溶液１
は、スチレン（739g）、ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルス
ルホニルメチル）スチレン（82g）及び１−ドデカンチ
オール（8.2g）を含んでいた。溶液２は、蒸留水（1152
g）中にペルオキシ二硫酸アンモニウム（19.7g）を含ん
でいた。溶液３は、蒸留水（1152g）中にピロ亜硫酸ナ
トリウム（9.85g）を含んでいた。

各溶液は、下記の個々の速度で容器にポンプ送液した。
溶液1;2.5g/分、溶液2;2.14g/分、溶液3;2.27g/分。更
に380分後に、反応を停止した。収量は33.4％（固型
分）で1218gであった。次いでポリマーラテックスを３
日間透析して、pH5を有する27.3％（固型分）のラテッ
クスを生成した。このラテックスを試験のために13.5％
（固型分）に希釈した。ポリマーの核磁気共鳴分析で、
スチレン対スルホニルコモノマーのモル比は96:4であっ
た。

製造2:ポリ（スチレン−共−２−アセトアセトキシエチ
ルメタクリレート）（85:15モル比）のコアと、ポリ
〔スチレン−共−ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニ
ルメチル）スチレン〕（95.5:4.5モル比）のシェルを有
するコア／シェルポリマー粒子の製造 製造１に記載したと同様の方法を、コア／シェルポリマ
ーを作るために行なった。３個の試薬の溶液を、同時に
添加し、容器内で下記のようにして混合した。溶液１
は、スチレン（179.1g）、２−アセトアセトキシエチル
メタクリレート（65g）及び１−ドデカンチオール（2.4
g）を含んでおり、1.5g/分で送液した。溶液２は、蒸留
水（828g）中にペルオキシ二硫酸アンモニウム（8.14
g）を含んでおり、2.36g/分で送液した。溶液３は、蒸
留水（828g）中にピロ亜硫酸ナトリウム（4.1g）を含ん
でおり、2.44g/分で送液した。

各溶液は、164分間にわたって容器に送液した。固体含
量は10.3％で、滞留時間は80℃で213分間であった。得
られたポリマー粒子は、得られるコア／シェルポリマー
のコアとして使用した。

シェルは、コア粒子を含有する容器に下記の溶液を同時
に添加して製造した。溶液４は、スチレン（146.7g）、
ｍ＆ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレ
ン（16.3g）及び１−ドデカンチオール（1.6g）を含ん
でおり、1.41g/分の速度で送液した。溶液５及び６は、
それぞれ溶液２及び３と同じであった。これらの溶液の
添加時間は、80℃で111分間であった。新しい粒子が形
成されたが、溶液４のモノマーは前に製造したコア粒子
上にコポリマーシェルとして重合した。得られたコア／
シェルポリマー固体含量は、溶液中13.8％であり、次い
で４日間透析した。

実施例1:ウシγ−グロブリンを含有する試薬の製造 本実施例は本発明の試薬の製造を示す。これはまた、先
行技術によって製造した同様の試薬以上の本発明の改良
を示す。

ポリマーの乾燥重量30mgを含有する上記製造１に記載し
たようにして製造したラテックスの一部を、トリチウム
化したウシγ−グロブリン蛋白質0.3mgと一緒にし、溶
液を遠心分離管内で0.1モル濃度の硼酸ナトリウム（pH
8.5）で最終容積10mlにした。蛋白質とポリマー粒子の
表面活性基との反応を、45゜の角度で装着した回転板に
取り付けて、30〜35rpmで端−端回転（end−over−end
rotation）で、室温（約25℃）で24時間継続した。ラテ
ックスの第二の部分を、インキュベーションを37℃で行
なった他は同様にして蛋白質と反応させた。

ラテックスの第三の部分を、25℃でトリチウム化蛋白質
1.5gと同様に反応させ、第四の部分を、37℃で蛋白質1.
5gと反応させた。ポリマーの全ての部分で、ラテックス
粒子は0.68μｍの平均粒子サイズを有していた。

４個の対照試薬を、表面クロロメチル反応性基を有する
コア−シェルポリマー30mgで置換して製造した。このポ
リマーのコアは、ポリ（スチレン−共−ジビニルベンゼ
ン）（99.2:0.8モル比）から成り、シェルは、ポリ（塩
化ビニルベンジル−共−ジビニルベンゼン）（98.8:1.2
モル比）から成った。平均粒子サイズは約0.68μｍであ
った。コア／シェルポリマーを４個の部分に分解し、本
発明の試薬について記載したのと同じ条件下に、トリチ
ウム化ウシγ−グロブリンと反応させた。

記載したインキュベーション時間の終わりに、過剰のウ
シ血清アルブミン（30mg,30mg/ml緩衝液）を添加するこ
とによって各反応を抑制した。次いで、試薬をこの添加
後更に４時間インキュベートした。

結合した蛋白質の全量は、（ａ）反応混合物の500μ
部分中の１分当りの全カウント、（ｂ）反応混合物の1m
l試料の遠心分離の後の上澄液中に残留する１分当りの
カウント、及び（ｃ）（ｂ）で得られたペレットの繰り
返し洗浄後にラテックスに結合した標識蛋白質からの１
分当りのカウントを測定することによって決定された。
粒子に共有結合で結合した標識蛋白質の部分は、１％ド
デシル硫酸ナトリウムの存在下に37℃で約24時間端−端
回転で、反応した粒子をインキュベートした後に分析し
た。結合した蛋白質の全量を分析するために上記したの
と同じ方法を、共有結合した蛋白質の量を分析するため
に使用する。結果を下記第１表及び第II表に示す。

この実施例は、本発明の実施で有用な試薬の製造を示
す。この試薬は蛋白質部分でラジオアイソトープで標識
する。上記のデータは、蛋白質が環境（即ち、室温）条
件を使用して、対応する対照物質よりももっと効果的
に、反応性クロロエチルスルホニル基を含有するポリマ
ー粒子に共有結合で結合できることを示している。対照
粒子のクロロメチル基は、有効な（即ち、高い量の）結
合を得るために高いインキュベーション温度を必要とす
る。本発明の試薬の利点は、より高い温度で不活性にさ
れるある種の免疫反応性種又は酵素と結合するために、
より低い温度が必要であることである。

また、この実施例から、本発明の試薬が先行技術の方法
では普通であるような活性化工程又は試薬に頼ることな
しに製造できることが明らかである。

実施例２及び3:フェノバルビタールの免疫測定に於ける
試薬の製造及び使用 この実施例は、本発明の二つの試薬の製造及び医薬、フ
ェノバルビタールの存在を分析するための免疫測定に於
けるその使用を示す。

フェノバルビタールに指向するモノクローナル抗体を、
Eastman Kodak Companyの研究所で、ヘェノバルビター
ル−ヒト血清アルブミンでBalb/cマウスの免疫の標準方
法を使用して製造した。免疫化マウスの脾臓を、筋腫細
胞（SP1/Φ−Ag14）で融合して、所望のモノクローナル
抗体を生成するハイブリドーマを生じた。

実施例２において、この抗体を反応性のクロロエチルス
ルホニル基を含有する、上記実施例１に記載したものの
ようなポリマー粒子に共有結合で結合した。実施例３に
おいて、抗体を約0.83μｍの平均径を有するポリ〔スチ
レン−共−Ｎ−（ｐ−クロロエチルスルホニルメチルフ
ェニル）アクリルアミド〕（99.27:0.73モル比）から成
るポリマー粒子に共有結合で結合した。粒子に結合した
抗体の全体を、トリチウム化ウシγ−グロブリンを抗−
フェノバルビタール抗体の代わりに使用した平行実験で
分析した。粒子に結合した活性蛋白質の量を、下記の酵
素標識結合実験で比較した。

ラテックス粒子の一つの試料（ポリマーの乾燥重量30m
g）を、３−｛〔トリス−（ヒドロキシメチル）メチ
ル〕アミノ｝プロパンスルホン酸緩衝液（pH8.5,0.1モ
ル濃度）10ml中の抗−フェノバルビタール抗体0.3mgと
混合した。ラテックスの第二の試料を、同じ緩衝液10ml
中の抗体1.5mgと混合した。結合反応を、室温で端−端
回転で24時間インキュベーションにより行なった。ウシ
血清アルブミン（30mg,30mg/ml）を添加して反応を停止
し、更に４時間インキュベーションを続けた。次いで反
応混合物を遠心分離し、上澄液を捨て、ペレットを一度
燐酸塩緩衝食塩溶液（pH7.4）で洗浄し、次いで食塩溶
液に再懸濁させた。

実施例１に示されたような対照ラテックスの一つの試料
（乾燥ポリマー30mg）を、pH8.5で0.1モル濃度の硼酸ナ
トリウム緩衝液10ml中で抗体−フェノバルビタール抗体
（0.3mg）と共に同様にインキュベートした。ラテック
スの第二の部分を同じ緩衝液中で抗体1.5mgと共に同様
にインキュベートした。結合反応を室温の代わりに37℃
で行なった。

各ラテックス試料に結合した抗体の全体を、実施例１に
記載したような粒子に結合したトリチウム化ウシγ−グ
ロブリンを平行で有する一連の試料のカウントの数を測
定することによって分析した。共有／全体比を、ドデシ
ル硫酸ナトリウム界面活性剤と共にインキュベートした
後、実施例１に記載したようにして算出した。各試料中
の活性抗体の相対量を、試薬の一連の希釈物を一定濃度
のグルコースオキシダーゼ標識フェノバルビタール（５
×10^-10モル濃度）と混合する測定で分析した。使用し
た試薬の量は、結合した抗体の全体を基準にして理論フ
ェノバルビタール結合サイト6.3×10^-10モル濃度〜2.0
×10^-7モル濃度に変えた。

試薬希釈物及び識別医薬を、一定撹拌下室温で、ウシ血
清アルブミン１％を含有する燐酸塩緩衝食塩溶液中で約
１時間インキュベートした。遠心分離後に溶液中に残留
するフェノバルビタール−グルコースオキシダーゼ標識
の量を分析し、酵素標識の50％を結合するに必要なフェ
ノバルビタール結合サイトの濃度を分析した。この実験
の結果を、下記第III表及び第IV表に示す。

この実験は、抗−フェノバルビタール抗体が、通常環境
反応条件を使用して非常に高い効率で、反応性クロロエ
チルスルホニル基を有するポリマー粒子と共有結合で結
合できることを示している。しかしながら、対照試薬は
効率的な結合をさせるために高温で製造しなくてはなら
ない。この実験はまた、抗体が結合し、穏和な条件を使
用し、対照試薬の場合よりも３〜４倍大きい抗体活性の
保持性を有する本発明の試薬を形成することを示してい
る。

実施例4:ジゴキシンの免疫アッセイに於ける試薬の製造
及び使用 ジゴキシンに指向するモノクローナル抗体（DAS5）をBe
ckmanから購入した。

この抗体を、反応性クロロエチルスルホニル基を有する
ポリマー粒子に共有結合で結合させた。この粒子は、ポ
リ（スチレン−共−ジビニルベンゼン）（99:1モル比）
のコアと、ポリ〔スチレン−共−ｍ＆ｐ−（２−クロロ
エチルスルホニルメチル）スチレン−共−ジビニルベン
ゼン〕（94.5:4.5:1モル比）のシェルを有し、平均径が
約0.65μｍであるコア／シェゥルビーズ粒子であった。

ラテックス粒子の一つの試料（ポリマーの乾燥重量100m
g）を、３−｛〔トリス−（ヒドロキシメチル）メチ
ル〕アミノ｝プロパンスルホン酸緩衝液（pH8.5,0.1モ
ル濃度）10ml中の抗−ジゴキシン抗体3.0mgと混合し
た。結合反応を、室温で端−端回転で24時間インキュベ
ーションにより行なった。ウシ血清アルブミン（100mg,
50mg/ml）を添加して反応を停止し、更に４時間インキ
ュベーションを続けた。次いで反応混合物を遠心分離
し、上澄液を捨て、ペレットを一度燐酸塩緩衝食塩溶液
（pH7.4）で洗浄し、次いで食塩溶液に再懸濁させた。

平均粒子サイズ0.79μｍを有する他は実施例１で使用さ
れたような対照ラテックスの試料（乾燥ポリマー100m
g）を、pH8.5で0.1モル濃度の硼酸ナトリウム緩衝液10m
l中で抗体−ジゴキシン抗体（3mg）と共に同様にインキ
ュベートした。結合反応を室温の代わりに37℃で行なっ
た。

各試料中の活性抗体の相対量を、試薬の一連の希釈物を
一定濃度のセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ジゴキ
シン（５×10^-11モル濃度）と混合する測定で分析し
た。試薬量は、固定した抗体を含むビーズ2.5×10^-10〜
2.5×10^-4gに変えた。

試薬希釈物及び標識医薬を、一定撹拌下室温で、ウシ血
清アルブミン0.1％を含有する燐酸塩緩衝食塩溶液中で
約１時間インキュベートした。遠心分離後に溶液中に残
留するジゴキシン−ペルオキシダーゼ標識の量を分析
し、酵素標識の50％を結合するに必要なビーズの濃度を
分析した。この実験の結果を、下記第Ｖ表に示す。

この実験は、抗−ジゴキシン抗体が結合し、対照試薬の
場合よりも５倍大きい抗体活性の保持性を有する本発明
の試薬を形成することを示している。

〔発明の効果〕

本発明は、広範囲の種々の免疫技術で使用できる高感度
の試薬を提供する。該試薬を製造するために使用される
ポリマー粒子は、蛋白質、炭水化物及び遊離のアミン又
はスルフヒドリル基を有する他の生物学的化合物と容易
に反応する、容易に利用できる官能基を有する。該官能
基と蛋白質又は生物学的化合物との反応は、穏和なpH条
件、低温度及び凝集の下で迅速に行なうことができ、公
知の試薬の減感性及び不安定性が避けられる。結合の条
件は厳しくなく、即ち、低温、短時間及びフレキシブル
な混合条件を、感度を犠牲にすることなしに使用でき
る。

これらの利点は、反応性側鎖活性化２−置換エチルスル
ホニル又はビニルスルホニル基を有するエチレン性不飽
和重合性モノマーからポリマー粒子を製造することによ
って本発明の於て達成される。これらの基は、重合の後
の反応で利用され、反応性アミン又はスルホニル基を有
する免疫種の効果的な結合を可能にする。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）２−置換エチルスルホニル又はビニ
   ルスルホニル基側鎖を有する少なくとも１種のエチレン
   性不飽和重合性モノマーから誘導されたポリマー粒子及
   び、 （ｂ）該側鎖基を介して共有結合で結合している、対応
   するレセプターとの免疫反応に関与し得る免疫種から成
   り、 該粒子の内部に検出し得るトレーサー物質が実質的に存
   在しない試薬。
2. 【請求項２】請求項１記載の試薬を含む要素。
3. 【請求項３】A:リガンドの類似体の存在下で、流体試薬
   を請求項１記載の試薬と接触させて、該免疫種と該免疫
   リガンド及びリガンド類似体との免疫錯体を形成し、そ
   して、 B:流体中のリガンドの存在の指標として免疫錯体を分析
   することからなる、水性流体中の免疫リガンドの分析方
   法。
4. 【請求項４】A:水性液体を請求項１記載の試薬と接触さ
   せて、該免疫種と該水性液体中のリガンドとの不溶性免
   疫錯体を形成し、 B:接触工程Ａの前、それと同時に、又はその後で、該リ
   ガンドを、該リガンドと免疫的に反応性であるが対応す
   るレセプターとの免疫反応に関与することができる、前
   記試薬中に存在する第一の免疫種とは反応性でなく、検
   出し得るトレーサー物質で標識されている第二の免疫種
   と接触させて、標識された不溶性錯体を形成し、そし
   て、 C:該液体中のリガンドの存在の指標として該標識された
   不溶性錯体を分析することからなる、水性液体中のリガ
   ンドの分析方法。