JPH081439B2 - イムノアッセイ用分析要素及びアッセイ方法 - Google Patents
イムノアッセイ用分析要素及びアッセイ方法Info
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- JPH081439B2 JPH081439B2 JP2330877A JP33087790A JPH081439B2 JP H081439 B2 JPH081439 B2 JP H081439B2 JP 2330877 A JP2330877 A JP 2330877A JP 33087790 A JP33087790 A JP 33087790A JP H081439 B2 JPH081439 B2 JP H081439B2
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- Japan
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- ligand
- population
- groups
- beads
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は臨床化学に関し、より詳細には免疫反応性
リガンドのイムノアッセイ用要素およびその測定方法に
関する。
リガンドのイムノアッセイ用要素およびその測定方法に
関する。
自然界の免疫反応の利点を有するイムノアッセイは、
臨床化学における分析技法として広範な使用が見い出さ
れてきた。これらの反応の特異性のため、これらは、特
に非常に低濃度で存在する生物学的被分析体の定量にと
って有利である。このような被分析体（本明細書ではリ
ガンドと称する）としては、例えば抗体、治療薬、麻
薬、酵素、ホルモン、タンパク質などが挙げられる。
臨床化学における分析技法として広範な使用が見い出さ
れてきた。これらの反応の特異性のため、これらは、特
に非常に低濃度で存在する生物学的被分析体の定量にと
って有利である。このような被分析体（本明細書ではリ
ガンドと称する）としては、例えば抗体、治療薬、麻
薬、酵素、ホルモン、タンパク質などが挙げられる。
競争バインディングアッセイでは、標識リガンド類縁
体（本明細書では、リガンド類縁体と称する）が固定さ
れた量の適当なバインディング物質（本明細書では、受
容体と称する）との反応に対して未標識リガンドと競争
状態に置かれる。リガンドの未知量は、バインディング
リガンド類縁体または未バインディング（遊離の）リガ
ンド類縁体いずれかの測定信号から決定することができ
る。この反応は以下のように進行する。
体（本明細書では、リガンド類縁体と称する）が固定さ
れた量の適当なバインディング物質（本明細書では、受
容体と称する）との反応に対して未標識リガンドと競争
状態に置かれる。リガンドの未知量は、バインディング
リガンド類縁体または未バインディング（遊離の）リガ
ンド類縁体いずれかの測定信号から決定することができ
る。この反応は以下のように進行する。
リガンド＋リガンド類縁体＋受容体 リガンド−受容体＋リガンド類縁体−受容体。
通常の標識類としては、放射線活性タグ、酵素、発色
原体、蛍光原体、安定フリーラジカル、ならびに酵素補
因子、酵素阻害剤およびアロステリックエフェクターが
挙げられる。
原体、蛍光原体、安定フリーラジカル、ならびに酵素補
因子、酵素阻害剤およびアロステリックエフェクターが
挙げられる。
米国特許第4,670,381号は、乾式イムノアッセイ分析
要素を公表する。この要素では、バインディングしたリ
ガンドと遊離のリガンドとの分離が、受容体においてリ
ガンドとリガンド類縁体が複合化するのに十分にゆっく
りと液体試料が拡散するような多孔度を有するビーズ化
された展開層を使用することによって、達成されてい
る。その受容体は展開層に固定化されていてもよい。こ
れらのビーズは、主として20〜40μｍの範囲内にある大
きなビーズであるが、一般に１〜200μｍの多様なサイ
ズで存在する。このような展開層は、多種多様な被分析
体に対して有用である。このことは、拡散性の要件が類
似であるからである。
要素を公表する。この要素では、バインディングしたリ
ガンドと遊離のリガンドとの分離が、受容体においてリ
ガンドとリガンド類縁体が複合化するのに十分にゆっく
りと液体試料が拡散するような多孔度を有するビーズ化
された展開層を使用することによって、達成されてい
る。その受容体は展開層に固定化されていてもよい。こ
れらのビーズは、主として20〜40μｍの範囲内にある大
きなビーズであるが、一般に１〜200μｍの多様なサイ
ズで存在する。このような展開層は、多種多様な被分析
体に対して有用である。このことは、拡散性の要件が類
似であるからである。
このようなビーズが、常にイムノアッセイに適すると
は限らない点に課題がある。相違するリガンドは、相違
する濃度の受容体を必要とする。非常に大きなビーズ
は、必要な受容体濃度にすべての場合に適する十分な表
面積を提供しない可能性がある。さらに、展開層で一般
に使用されるビーズは、抗体のような生物学的に活性な
物質が都合よく付着できるのに必要な表面品質と表面特
性を持たない。例えば、大きなビーズは抗体のような生
物学的な活性種の共有固定化のための反応性官能基を一
般に含まない。
は限らない点に課題がある。相違するリガンドは、相違
する濃度の受容体を必要とする。非常に大きなビーズ
は、必要な受容体濃度にすべての場合に適する十分な表
面積を提供しない可能性がある。さらに、展開層で一般
に使用されるビーズは、抗体のような生物学的に活性な
物質が都合よく付着できるのに必要な表面品質と表面特
性を持たない。例えば、大きなビーズは抗体のような生
物学的な活性種の共有固定化のための反応性官能基を一
般に含まない。
大きなビーズが共有結合性の反応性基を有する場合で
さえも、それらの調製方法のため小さいビーズのように
抗体の固定化能は良好でない。展開層のビーズは、一般
に限定された凝集剤を使用する懸濁重合によって調製さ
れている。この調製は受容体とリガンドの固定化に悪影
響を示す。この調製方法は、ビーズ表面上に各種の残留
物、例えば界面活性剤やシリカ安定剤を残す。これらの
残留物は、ビーズへの受容体の付着を阻害する。これら
の残留物は、付着された受容体の作用もマスクする。マ
スクされた受容体は、その後にリガンドを固定化するこ
とができない。
さえも、それらの調製方法のため小さいビーズのように
抗体の固定化能は良好でない。展開層のビーズは、一般
に限定された凝集剤を使用する懸濁重合によって調製さ
れている。この調製は受容体とリガンドの固定化に悪影
響を示す。この調製方法は、ビーズ表面上に各種の残留
物、例えば界面活性剤やシリカ安定剤を残す。これらの
残留物は、ビーズへの受容体の付着を阻害する。これら
の残留物は、付着された受容体の作用もマスクする。マ
スクされた受容体は、その後にリガンドを固定化するこ
とができない。
この発明は、前記課題を、支持体と展開層を含んでな
るイムノアッセイ用分析要素であって、 前記展開層が、 （ａ）前記要素に適用される液体の均一な拡散を促進す
るような10〜200μｍの範囲内の直径を有する多分散ポ
リマービーズの第１集団、及び （ｂ）（ｉ）0.1〜５μｍの範囲内の直径を有し、（i
i）表面反応性基を介してビーズ表面に共有結合したレ
セプター類を有し、そして（iii）残留物質がない表面
を有する単分散ポリマービーズの第２集団、 の両方を含むことを特徴とする前記分析要素、並びに 支持体と展開層を含んでなるイムノアッセイ用分析要素
であって、 前記展開層が、前記要素に適用される液体の均一な拡散
を促進するような10〜200μｍの範囲内の直径を有する
多分散ポリマービーズの第１集団を含み、そして前記展
開層と液絡する別の層に、（ｉ）0.1〜５μｍの範囲内
の直径を有し、（ii）表面反応性基を介してビーズ表面
に共有結合したレセプター類を有し、そして（iii）残
留物質がない表面を有する単分散ポリマービーズの第２
集団が配置されていることを特徴とする前記分析要素の
提供によって解決する。
るイムノアッセイ用分析要素であって、 前記展開層が、 （ａ）前記要素に適用される液体の均一な拡散を促進す
るような10〜200μｍの範囲内の直径を有する多分散ポ
リマービーズの第１集団、及び （ｂ）（ｉ）0.1〜５μｍの範囲内の直径を有し、（i
i）表面反応性基を介してビーズ表面に共有結合したレ
セプター類を有し、そして（iii）残留物質がない表面
を有する単分散ポリマービーズの第２集団、 の両方を含むことを特徴とする前記分析要素、並びに 支持体と展開層を含んでなるイムノアッセイ用分析要素
であって、 前記展開層が、前記要素に適用される液体の均一な拡散
を促進するような10〜200μｍの範囲内の直径を有する
多分散ポリマービーズの第１集団を含み、そして前記展
開層と液絡する別の層に、（ｉ）0.1〜５μｍの範囲内
の直径を有し、（ii）表面反応性基を介してビーズ表面
に共有結合したレセプター類を有し、そして（iii）残
留物質がない表面を有する単分散ポリマービーズの第２
集団が配置されていることを特徴とする前記分析要素の
提供によって解決する。
便宜上、ポリマービーズの第１集団を大きなビーズ類
と称し、第２集団を小さなビーズ類と称する。
と称し、第２集団を小さなビーズ類と称する。
好ましくは、第２集団のポリマービーズ類は単分散で
ある。単分散とは、粒径分布の３σ（シグマ）が平均粒
径の７％以下であることを意味する。展開層の大きな粒
子は、典型的には、広範なサイズを有する多分散である
（第１集団）。
ある。単分散とは、粒径分布の３σ（シグマ）が平均粒
径の７％以下であることを意味する。展開層の大きな粒
子は、典型的には、広範なサイズを有する多分散である
（第１集団）。
この発明は、前記要素を使用し、次の工程を含んでな
る液体中の免疫反応リガンドのアッセイ方法も提供す
る： A.標識リガンド類縁体の存在下で液体試料を展開層の限
定された領域に接触してその限定された領域内に固定化
されたリガンド−受容体複合体を形成し、そして液体の
拡散によって前記固定化された複合体から未複合体化リ
ガンドをほぼ水平方向に分離する工程、ならびに B.工程Ａの終了後、前記限定された領域の中心にある前
記固定化された複合体を測定する工程。
る液体中の免疫反応リガンドのアッセイ方法も提供す
る： A.標識リガンド類縁体の存在下で液体試料を展開層の限
定された領域に接触してその限定された領域内に固定化
されたリガンド−受容体複合体を形成し、そして液体の
拡散によって前記固定化された複合体から未複合体化リ
ガンドをほぼ水平方向に分離する工程、ならびに B.工程Ａの終了後、前記限定された領域の中心にある前
記固定化された複合体を測定する工程。
この発明はまた、次の工程を含んでなる上述の分析要
素による液体中の免疫反応リガンドをアッセイするため
の方法も提供する。
素による液体中の免疫反応リガンドをアッセイするため
の方法も提供する。
A.標識リガンド類縁体の存在下で液体試料を展開層の限
定された領域に接触してその限定された領域内に固定化
されたリガンド−受容体複合体を形成する工程、 B.洗浄液を加えて前記固定化された複合体から未複合体
化リガンドをほぼ水平方向に分離する工程、ならびに C.前記限定された領域の中心にある前記固定化された複
合体を測定する工程。
定された領域に接触してその限定された領域内に固定化
されたリガンド−受容体複合体を形成する工程、 B.洗浄液を加えて前記固定化された複合体から未複合体
化リガンドをほぼ水平方向に分離する工程、ならびに C.前記限定された領域の中心にある前記固定化された複
合体を測定する工程。
この要素およびアッセイは、高度に自動化されたアナ
ライザーで使用することができる。
ライザーで使用することができる。
以下、この発明を具体的に説明する。
この発明で提供される要素類は、Immuno Chemical Te
chniqes,206〜207ページで記載されるサンドイッチ法を
用いるアッセイを初めとするすべてのイムノアッセイで
有用である。しかしながら、便宜上本明細書では、競争
イムノアッセイの語で説明するであろう。後者のアッセ
イでは、測定する種と対応する標識種を共通の反応体の
一定量について競争させる。測定するこれらの種は、本
明細書においてリガンドと称しており、標識種はリガン
ド類縁体と称している。リガンドおよびリガンド類縁体
を特異的に認識しそして反応してそれらと複合体を形成
する化合物類は、本明細書において受容体と（または、
レセプター）と称している。受容体とリガンド類縁体
は、共役対（conjugate pair）を形成する。この対のい
ずれの構成員も受容体またはリガンドとして機能でき
る。
chniqes,206〜207ページで記載されるサンドイッチ法を
用いるアッセイを初めとするすべてのイムノアッセイで
有用である。しかしながら、便宜上本明細書では、競争
イムノアッセイの語で説明するであろう。後者のアッセ
イでは、測定する種と対応する標識種を共通の反応体の
一定量について競争させる。測定するこれらの種は、本
明細書においてリガンドと称しており、標識種はリガン
ド類縁体と称している。リガンドおよびリガンド類縁体
を特異的に認識しそして反応してそれらと複合体を形成
する化合物類は、本明細書において受容体と（または、
レセプター）と称している。受容体とリガンド類縁体
は、共役対（conjugate pair）を形成する。この対のい
ずれの構成員も受容体またはリガンドとして機能でき
る。
本発明の要素を使用して生物学的流体のような液体
（例えば、全血、血清、血漿、尿、脊髄液、ヒトもしく
は動物組織の懸濁液、排泄物、唾液およびリンパ液な
ど）における低濃度の免疫反応リガンドを測定すること
ができる。リガンドは10-15モル濃度のような低濃度、
より一般的には10-10〜10-4モル濃度で測定することが
できる。
（例えば、全血、血清、血漿、尿、脊髄液、ヒトもしく
は動物組織の懸濁液、排泄物、唾液およびリンパ液な
ど）における低濃度の免疫反応リガンドを測定すること
ができる。リガンドは10-15モル濃度のような低濃度、
より一般的には10-10〜10-4モル濃度で測定することが
できる。
こうして定量的または定性的に測定することができる
リガンド類としては、治療薬類（例えば、フェノバルビ
タール、テオフィリン、ベンタマイシン、キニジン、フ
ェニトイン、プロパノロール、カルバマゼピン、トブラ
マイシン、リドカイン、プロカインアミドなど）、天然
もしくは合成ステロイド類（例えば、コーチゾール、ア
ルドステロン、テストステロン、プロゲステロン、エス
トリオールなど）、ホルモン類（例えば、甲状腺ホルモ
ン、ペプタイドホルモン、インシュリンなど）、タンパ
ク質類（例えば、アルブミン、IgG、IgM、フェリチン、
Ｃ反応性タンパク質、アイソザイム、アポリポタンパク
質など）、抗原、モノクローナル抗体を初めとする抗体
および受容体とそのまま反応しうる他の種を挙げること
ができる。この発明は、治療薬、例えばジゴキシン、フ
ェニトイン、テオフィリンまたはフェノバルビタールお
よびホルモン、例えばチロキシンまたはトリヨードチロ
ニンの測定にとって特に有用である。
リガンド類としては、治療薬類（例えば、フェノバルビ
タール、テオフィリン、ベンタマイシン、キニジン、フ
ェニトイン、プロパノロール、カルバマゼピン、トブラ
マイシン、リドカイン、プロカインアミドなど）、天然
もしくは合成ステロイド類（例えば、コーチゾール、ア
ルドステロン、テストステロン、プロゲステロン、エス
トリオールなど）、ホルモン類（例えば、甲状腺ホルモ
ン、ペプタイドホルモン、インシュリンなど）、タンパ
ク質類（例えば、アルブミン、IgG、IgM、フェリチン、
Ｃ反応性タンパク質、アイソザイム、アポリポタンパク
質など）、抗原、モノクローナル抗体を初めとする抗体
および受容体とそのまま反応しうる他の種を挙げること
ができる。この発明は、治療薬、例えばジゴキシン、フ
ェニトイン、テオフィリンまたはフェノバルビタールお
よびホルモン、例えばチロキシンまたはトリヨードチロ
ニンの測定にとって特に有用である。
小さなポリマービーズに共有結合するのに必要な遊離
アミノ基またはスルフヒドリル基を有する生物学的に興
味深い受容体類としては、次のものが挙げられる。
アミノ基またはスルフヒドリル基を有する生物学的に興
味深い受容体類としては、次のものが挙げられる。
ａ）IgG抗体のFc部に親和性を有するプロテインＡ又は
プロテインＧ。
プロテインＧ。
ｂ）ビオチンまたはビオチン錯体に親和性を有するアビ
ジンまたはアビジン錯体。
ジンまたはアビジン錯体。
この発明の試薬を調製するのに使用できるアビジン誘
導体類およびビオチン誘導体類としては、ストレプトア
ビジン、スクシニル化アビジン、アビジンモノマー、ビ
オシチン（すなわち、ビオチン−ε−Ｎ−リジン）、ビ
オチンヒドラジド、２−イミノビオチンのアミンもしく
はスルフヒドリル誘導体およびビオチニル−ε−アミノ
カプロン酸ヒドラジド、 ビオチン誘導体類、例えばビオチン−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル、ビオチニル−ε−アミノカプ
ロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スル
ホスクシンイミジル−６−（ビオリンアミノ）ヘキサノ
エート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイミノビオチ
ン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、ｐ−ジアゾベ
ンゾイルビオシチンおよび３−（Ｎ−アレイミドプロピ
オニル）ピオシチンが含まれる。
導体類およびビオチン誘導体類としては、ストレプトア
ビジン、スクシニル化アビジン、アビジンモノマー、ビ
オシチン（すなわち、ビオチン−ε−Ｎ−リジン）、ビ
オチンヒドラジド、２−イミノビオチンのアミンもしく
はスルフヒドリル誘導体およびビオチニル−ε−アミノ
カプロン酸ヒドラジド、 ビオチン誘導体類、例えばビオチン−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル、ビオチニル−ε−アミノカプ
ロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スル
ホスクシンイミジル−６−（ビオリンアミノ）ヘキサノ
エート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドイミノビオチ
ン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、ｐ−ジアゾベ
ンゾイルビオシチンおよび３−（Ｎ−アレイミドプロピ
オニル）ピオシチンが含まれる。
ｃ）抗原が誘発する抗体に対する抗原に特異的な親和性
を有するモノクローナル抗体類およびそれらの抗原。
を有するモノクローナル抗体類およびそれらの抗原。
ｄ）ポリクローナル抗体類およびそれらの個々の抗原。
ｅ）プラスミノーゲンに親和性を有するリシン。
ｆ）フィブロネクチンに親和性を有するゼラチンのよう
な興味の対象とする他のタンパク質または生物学的高分
子に特異的な親和性を有するタンパク質類および他の生
物学的高分子。
な興味の対象とする他のタンパク質または生物学的高分
子に特異的な親和性を有するタンパク質類および他の生
物学的高分子。
ｇ）オリゴマーまたは高分子量の生物学的分子、例えば
糖、薬剤、DNA塩基類、DNAオリゴマー類およびホルモン
類に特異的な親和性を有する小分子種およびオリゴマー
種。
糖、薬剤、DNA塩基類、DNAオリゴマー類およびホルモン
類に特異的な親和性を有する小分子種およびオリゴマー
種。
ｈ）特定の糖類＝および糖含有高分子（凝集因子に親和
性を有するヘパリン、リポタンパク質類、血漿タンパク
質類など）に特異性を示すコンカナバリンＡのような生
物学的分子の特定部類のものに特異性を有する高分子
類。
性を有するヘパリン、リポタンパク質類、血漿タンパク
質類など）に特異性を示すコンカナバリンＡのような生
物学的分子の特定部類のものに特異性を有する高分子
類。
ｉ）色素シバルコン（Cibarcon−商標−）ブルーF3GAな
らびにアルブミン、アデニル含有補因子を要求する酵
素、凝集因子およびインターフェロンに特異性を有する
他のタンパク質特異的疎水性色素類のような生物学的分
子類に特異的親和性を有す小分子類。
らびにアルブミン、アデニル含有補因子を要求する酵
素、凝集因子およびインターフェロンに特異性を有する
他のタンパク質特異的疎水性色素類のような生物学的分
子類に特異的親和性を有す小分子類。
当業者に明らかなように、アッセイの目的に応じてリ
ガンドは受容体となることができ、受容体はリガンドと
なることができる。例えば、フェノバルビタールを含ん
でなるリガンドは、それがフェノバルビタール抗体また
は標識フェノバルビタール抗体を用いるフェノバルビタ
ールのアッセイに向けられる場合には小さなビーズに付
着することができる。
ガンドは受容体となることができ、受容体はリガンドと
なることができる。例えば、フェノバルビタールを含ん
でなるリガンドは、それがフェノバルビタール抗体また
は標識フェノバルビタール抗体を用いるフェノバルビタ
ールのアッセイに向けられる場合には小さなビーズに付
着することができる。
上述したように、小さなポリマービーズはそれらの表
面上に受容体を有する。これらの受容体は、受容体の遊
離アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシ基、アルデ
ヒド基またはケトン基と直接または間接的な反応性を有
する表面反応性基を介してそれらのビーズに結合され
る。
面上に受容体を有する。これらの受容体は、受容体の遊
離アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシ基、アルデ
ヒド基またはケトン基と直接または間接的な反応性を有
する表面反応性基を介してそれらのビーズに結合され
る。
有用な表面反応性基としては。
ａ）活性ハロゲン基、 ｂ）活性化２−置換エチルスルホニル基または活性化ビ
ニルスルホニル基、 ｃ）反応性カルボキシル基 ｄ）エポキシ基、 ｅ）イソシアネート基、 ｆ）アジリジン基、 ｇ）アルデヒド基、 ｈ）２−置換エチルカルボニル基、および ｉ）スクシンイミドキシカルボニル基、が挙げられる。
表面反応性基ａ）,b）,c）およびｉ）が好ましい。
ニルスルホニル基、 ｃ）反応性カルボキシル基 ｄ）エポキシ基、 ｅ）イソシアネート基、 ｆ）アジリジン基、 ｇ）アルデヒド基、 ｈ）２−置換エチルカルボニル基、および ｉ）スクシンイミドキシカルボニル基、が挙げられる。
表面反応性基ａ）,b）,c）およびｉ）が好ましい。
具体的なアッセイ目的および設計に応じて、表面活性
基ａ）〜ｉ）が受容体の一部である時には、アミノ基、
スルフヒドリル基、カルボキシル基およびアルデヒド基
が受容体を小さなビーズに付着する表面活性基として役
立つことは、当業者に明らかであろう。
基ａ）〜ｉ）が受容体の一部である時には、アミノ基、
スルフヒドリル基、カルボキシル基およびアルデヒド基
が受容体を小さなビーズに付着する表面活性基として役
立つことは、当業者に明らかであろう。
一般に、小さなポリマービーズを形成するのに使用さ
れるポリマー類は次の一般式に従う。
れるポリマー類は次の一般式に従う。
ＡｏＢｐＤｑ （Ｉ） 上式中、−Ａ−は、１種以上の疎水性エチレン系不飽
和モノマー類に由来する反復単位を表し、 −Ｂ−は、受容体の遊離アミノ基またはスルフヒドリ
ル基と直接または間接に反応しうる必要な反応性基を有
する１種以上のエチレン系不飽和モノマー類に由来する
反復単位を表し、 −Ｄ−は、−Ａ−または−Ｂ−で表されるものと相違
する１種以上のエチレン系不飽和モノマー類に由来する
反復単位を表す。
和モノマー類に由来する反復単位を表し、 −Ｂ−は、受容体の遊離アミノ基またはスルフヒドリ
ル基と直接または間接に反応しうる必要な反応性基を有
する１種以上のエチレン系不飽和モノマー類に由来する
反復単位を表し、 −Ｄ−は、−Ａ−または−Ｂ−で表されるものと相違
する１種以上のエチレン系不飽和モノマー類に由来する
反復単位を表す。
式（Ｉ）において、ｏは０〜99.0モル％であり、ｐは0.
1〜100モル％であり、そしてｑは０〜10モル％である。
1〜100モル％であり、そしてｑは０〜10モル％である。
前記−Ａ−反復単位は、１種以上の疎水性エチレン系
不飽和モノマー類に由来する。このようなモノマー類は
水に不溶性である。限定されるものでないが、代表的な
疎水性モノマー類としては、スチレンおよびスチレン誘
導体類（例えば、ビニルトルエン、2,5−ジメチルスチ
レン、４−ｔ−ブチルスチレンおよび２−クロロスチレ
ン）、アクリル酸およびメタクリル酸エステル類（例え
ば、ｎ−ブチルアクリレート、プロピルメタクリレー
ト、メチルアクリレート、エチルアクリレート、２−エ
チルヘキシルメタクリレート、Ｎ−フェニルアクリルア
ミドおよびメチルメタクリレート）、アクリロニトリル
ならびにビニルアセテートが挙げられる。
不飽和モノマー類に由来する。このようなモノマー類は
水に不溶性である。限定されるものでないが、代表的な
疎水性モノマー類としては、スチレンおよびスチレン誘
導体類（例えば、ビニルトルエン、2,5−ジメチルスチ
レン、４−ｔ−ブチルスチレンおよび２−クロロスチレ
ン）、アクリル酸およびメタクリル酸エステル類（例え
ば、ｎ−ブチルアクリレート、プロピルメタクリレー
ト、メチルアクリレート、エチルアクリレート、２−エ
チルヘキシルメタクリレート、Ｎ−フェニルアクリルア
ミドおよびメチルメタクリレート）、アクリロニトリル
ならびにビニルアセテートが挙げられる。
ポリマーは、必要によりいずれか適当な様式で架橋す
ることができる。ある方法では、２以上のエチレン系の
不飽和重合性基を有するモノマー少量、すなわち15モル
％まで、好ましくは0.3〜５モル％を組み込む。これら
のモノマー類は、Ａが誘導される疎水性モノマー間に含
まれる。代表的モノマー類はリサーチ・ジスクロージャ
ー（Research Disclosure）、出版19551,1980年７月、3
04ページに記載されており、例えば、ジビニルベンゼ
ン、エチレンジメタクリレート、N,N′−メチレンビス
アクリルアミド、2,2−ジメチル−1,3−プロピレンジア
クリレート、アリルアクリレート、エチリジントリメタ
クリレートおよびエチレンジアクリレートが挙げられ
る。
ることができる。ある方法では、２以上のエチレン系の
不飽和重合性基を有するモノマー少量、すなわち15モル
％まで、好ましくは0.3〜５モル％を組み込む。これら
のモノマー類は、Ａが誘導される疎水性モノマー間に含
まれる。代表的モノマー類はリサーチ・ジスクロージャ
ー（Research Disclosure）、出版19551,1980年７月、3
04ページに記載されており、例えば、ジビニルベンゼ
ン、エチレンジメタクリレート、N,N′−メチレンビス
アクリルアミド、2,2−ジメチル−1,3−プロピレンジア
クリレート、アリルアクリレート、エチリジントリメタ
クリレートおよびエチレンジアクリレートが挙げられ
る。
−Ａ−が誘導される特に有用なモノマー類は、スチレ
ン、ビニルトルエン、エチレンジメタクリレート、ブチ
ルアクリレート、ジビニルベンゼン、２−エチルヘキシ
ルメタクリレートおよびメチルメタクリレートである。
ン、ビニルトルエン、エチレンジメタクリレート、ブチ
ルアクリレート、ジビニルベンゼン、２−エチルヘキシ
ルメタクリレートおよびメチルメタクリレートである。
−Ｂ−反復単位は、中間的な架橋剤を用いまたは用い
ないでアミノ基またはスルフヒドリル基と容易に反応す
る追加の表面反応性基を含んでなる。従って、Ｂ基はそ
のような反応性基を含むいずれかのモノマーから誘導す
ることができる。好ましいモノマー類としては、上記
ａ）〜ｉ）に記載した追加の求電子的表面反応性基を含
んでなるものが挙げられる。
ないでアミノ基またはスルフヒドリル基と容易に反応す
る追加の表面反応性基を含んでなる。従って、Ｂ基はそ
のような反応性基を含むいずれかのモノマーから誘導す
ることができる。好ましいモノマー類としては、上記
ａ）〜ｉ）に記載した追加の求電子的表面反応性基を含
んでなるものが挙げられる。
必要な反応性基を提供するモノマー類の好ましい部類
のものは、アミノ基およびスルフヒドリル基と容易に反
応する活性ハロゲン原子を有するものである。
のものは、アミノ基およびスルフヒドリル基と容易に反
応する活性ハロゲン原子を有するものである。
活性ハロゲン原子を有するモノマー類の例としては、
ビニルクロロアセテート、ビニルブロモアセテート、ハ
ロアルキル化ビニル芳香族（例えば、クロロメチルスチ
レンまたはブロモメチルスチレン）、ハロアルキルアク
リル酸エステルまたハロアルキルメタクリル酸エステル
（例えば、クロロエチルメタクリレート、３−クロロ−
２−ヒドロキシプロピルメタクリレートおよび３−クロ
ロプロピルアクリレート）ならびに当業者に既知の他の
モノマー類が挙げられる。ハロアルキル化ビニル芳香
族、例えば炭素原子１〜３の活性ハロアルキル基を有す
るものは、反応性基として活性ハロゲン原子を使用する
場合に好ましい。クロロメチルスチレンが非常に有用で
ある。
ビニルクロロアセテート、ビニルブロモアセテート、ハ
ロアルキル化ビニル芳香族（例えば、クロロメチルスチ
レンまたはブロモメチルスチレン）、ハロアルキルアク
リル酸エステルまたハロアルキルメタクリル酸エステル
（例えば、クロロエチルメタクリレート、３−クロロ−
２−ヒドロキシプロピルメタクリレートおよび３−クロ
ロプロピルアクリレート）ならびに当業者に既知の他の
モノマー類が挙げられる。ハロアルキル化ビニル芳香
族、例えば炭素原子１〜３の活性ハロアルキル基を有す
るものは、反応性基として活性ハロゲン原子を使用する
場合に好ましい。クロロメチルスチレンが非常に有用で
ある。
活性ハロゲン原子を有するモノマー類は、多くの利点
を発揮するが、活性化２−置換エチルスルホニル基およ
びビニルスルホニル基を有するモノマー類は、温和な条
件下で製造中のプロセスコントロールをあまり必要とし
ないでそれらのポリマーにタンパク質を結合することが
できる点でさらなる利点を示す。このことが、より効率
的で経費のかからない製造を可能にする。後者の基を有
する代表的モノマー類の多くは、米国特許第4,161,407
号および同4,548,870号明細書に記載されるものを初め
とし、当該技術分野で既知である。
を発揮するが、活性化２−置換エチルスルホニル基およ
びビニルスルホニル基を有するモノマー類は、温和な条
件下で製造中のプロセスコントロールをあまり必要とし
ないでそれらのポリマーにタンパク質を結合することが
できる点でさらなる利点を示す。このことが、より効率
的で経費のかからない製造を可能にする。後者の基を有
する代表的モノマー類の多くは、米国特許第4,161,407
号および同4,548,870号明細書に記載されるものを初め
とし、当該技術分野で既知である。
好ましい活性化２−置換エチルスルホニルモノマー類
およびビニルスルホニルモノマー類は、下記式（II）に
よって示される。
およびビニルスルホニルモノマー類は、下記式（II）に
よって示される。
上式中、Ｒは水素または置換もしくは未置換アルキル
（一般に炭素原子１〜６）、例えば、メチル、エチル、
イソプロピルまたはヘキシルである。好ましいＲは水素
またはメチルである。
（一般に炭素原子１〜６）、例えば、メチル、エチル、
イソプロピルまたはヘキシルである。好ましいＲは水素
またはメチルである。
R1は−CH＝CHR2または−CH2CH2X（ここで、Ｘは求核
剤によって置換されるか、あるいは塩基で処理すること
によってHXの状態で除去される脱離基、例えばハロ、ア
セトキシ、メチルスルホニルオキシのようなアルキルス
ルホニルオキシ、ｐ−トリルスルホニルオキシのような
アリールスルホニルオキシ、第三アンモニオ、例えば、
トリメチルアンモニオ塩もしくはピリジノ塩である）を
表す。R2は水素、置換もしくは未置換アルキル（一般
に、Ｒについて定義したような炭素原子１〜６）、また
は置換もしくは未置換アリール（一般に、核炭素原子６
〜12の、例えばフェニル、ナフチル、キシリルもしくは
トリル）である。好ましいR1は−CH2CH2Xである。活性
２−置換エチル基であるこの基は、脱離基Ｘの置換を害
さない何等かの基で置換されていてよい。
剤によって置換されるか、あるいは塩基で処理すること
によってHXの状態で除去される脱離基、例えばハロ、ア
セトキシ、メチルスルホニルオキシのようなアルキルス
ルホニルオキシ、ｐ−トリルスルホニルオキシのような
アリールスルホニルオキシ、第三アンモニオ、例えば、
トリメチルアンモニオ塩もしくはピリジノ塩である）を
表す。R2は水素、置換もしくは未置換アルキル（一般
に、Ｒについて定義したような炭素原子１〜６）、また
は置換もしくは未置換アリール（一般に、核炭素原子６
〜12の、例えばフェニル、ナフチル、キシリルもしくは
トリル）である。好ましいR1は−CH2CH2Xである。活性
２−置換エチル基であるこの基は、脱離基Ｘの置換を害
さない何等かの基で置換されていてよい。
Ｌは、一般に炭素原子１〜20の置換もしくは未置換ア
ルキレンであって、主鎖中の複数原子に結合する連結基
である。アルキレンのこの定義は、オキシ、チオ、−NR
3−〔ここで、R3は水素、炭素原子１〜６の置換もしく
は未置換アルキル（例えば、メチル、クロロメチルもし
くは２−ヒドロキシエチル）または炭素原子６〜10の置
換もしくは未置換アリール（例えば、フェニル、ナフチ
ルもしくはキシリル）である〕、エステル（−COO
−）、アミド（−CONH−）、ウリレン スルホニル（−SO2−）、カーボネート、スルホナミ
ド、アゾまたはホスフォノ基などで中断されているかあ
るいはそれらを末端基とするアルキレン基を包含するこ
とを意味している。代表的なアルキレン基としては、メ
チレン、エチレン、イソブチレン、ヘキサメチレン、カ
ルボニルオキシエトキシカルボニル、メチレンビス（イ
ミノカルボニル）、カルボニルオキシドデシレンカルボ
ニルオキシエチレン、カルボニルイミノメチレンイミノ
カルボニルエチレン）ならびに上記米国特許第4,161,40
7号および同4,548,870号明細書に記載されているか示唆
される他の基が挙げられる。
ルキレンであって、主鎖中の複数原子に結合する連結基
である。アルキレンのこの定義は、オキシ、チオ、−NR
3−〔ここで、R3は水素、炭素原子１〜６の置換もしく
は未置換アルキル（例えば、メチル、クロロメチルもし
くは２−ヒドロキシエチル）または炭素原子６〜10の置
換もしくは未置換アリール（例えば、フェニル、ナフチ
ルもしくはキシリル）である〕、エステル（−COO
−）、アミド（−CONH−）、ウリレン スルホニル（−SO2−）、カーボネート、スルホナミ
ド、アゾまたはホスフォノ基などで中断されているかあ
るいはそれらを末端基とするアルキレン基を包含するこ
とを意味している。代表的なアルキレン基としては、メ
チレン、エチレン、イソブチレン、ヘキサメチレン、カ
ルボニルオキシエトキシカルボニル、メチレンビス（イ
ミノカルボニル）、カルボニルオキシドデシレンカルボ
ニルオキシエチレン、カルボニルイミノメチレンイミノ
カルボニルエチレン）ならびに上記米国特許第4,161,40
7号および同4,548,870号明細書に記載されているか示唆
される他の基が挙げられる。
Ｌはまた、一般に核炭素原子６〜12の置換もしくは未
置換アリーレンであってもよい。代表的なアリーレン基
としては、フェニレン、トリレン、ナフチレンおよび上
記特許明細書に記載された他の基が挙げられる。また、
Ｌのこの定義に含まれるものは、上記アルキレン基およ
びアリーレン基のそれぞれが１個以上組み合わされた二
価の基、例えば、アリーレンアルキレン、アルキレンア
リーレンアルキレンおよび当業者によって容易に決定さ
れる他の基が挙げられる。好ましくは、Ｌは未置換フェ
ニレンアルキレン、あるいは１個以上のアルキル基（Ｒ
について定義したような）、アルコキシ基（一般に炭素
原子１〜６の、例えば、メトキシ、プロポキシもしくは
ブトキシ）またはハロ基で置換されたフェニレンアルキ
レン、あるいはカルボニルイミノメチレンイミノカルボ
ニルエチレンである。
置換アリーレンであってもよい。代表的なアリーレン基
としては、フェニレン、トリレン、ナフチレンおよび上
記特許明細書に記載された他の基が挙げられる。また、
Ｌのこの定義に含まれるものは、上記アルキレン基およ
びアリーレン基のそれぞれが１個以上組み合わされた二
価の基、例えば、アリーレンアルキレン、アルキレンア
リーレンアルキレンおよび当業者によって容易に決定さ
れる他の基が挙げられる。好ましくは、Ｌは未置換フェ
ニレンアルキレン、あるいは１個以上のアルキル基（Ｒ
について定義したような）、アルコキシ基（一般に炭素
原子１〜６の、例えば、メトキシ、プロポキシもしくは
ブトキシ）またはハロ基で置換されたフェニレンアルキ
レン、あるいはカルボニルイミノメチレンイミノカルボ
ニルエチレンである。
Ｂが誘導できる代表的な２−置換エチルスルホニルモ
ノマー類およびビニルスルホニルモノマー類としては、
ｍ−およびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）
スチレン、ｍ−およびｐ−〔２−（ｐ−トリルスルホニ
ルオキシ）エチルスルホニルメチル〕スチレン、ｍ−お
よびｐ−ビニルスルホニルメチルスチレン、Ｎ−〔ｍ−
およびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェ
ニル〕アクリルアミド、ならびにＮ−〔２−（２−クロ
ロエチルスルホニル）エチルホルムアミドメチル〕アク
リルアミドが挙げられる。最初のモノマーが好ましい。
ノマー類およびビニルスルホニルモノマー類としては、
ｍ−およびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）
スチレン、ｍ−およびｐ−〔２−（ｐ−トリルスルホニ
ルオキシ）エチルスルホニルメチル〕スチレン、ｍ−お
よびｐ−ビニルスルホニルメチルスチレン、Ｎ−〔ｍ−
およびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェ
ニル〕アクリルアミド、ならびにＮ−〔２−（２−クロ
ロエチルスルホニル）エチルホルムアミドメチル〕アク
リルアミドが挙げられる。最初のモノマーが好ましい。
反復単位Ｂを形成するのに追加することのできる他の
好ましい反応性基はカルボキシル基である。
好ましい反応性基はカルボキシル基である。
カルボキシル基は、このような基を含むモノマー類、
例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、２−
カルボキシエチルアクリレート、フマール酸、マレイン
酸、２−カルボキシエチルメタクリレート、カルボキシ
メチルスチレン、メタクリルアミドヘキサン酸およびＮ
−（２−カルボキシ−1,1−ジメチルエチル）アクリル
アミドなどを組み入れるか、あるいはカルボキシル基に
転化することができる他の反応性基を有するポリマーの
さらなる化学反応（例えば、マレイン酸無水物のような
無水物の加水分解、または表面メチロール基もしくはア
ルデヒド末端基の酸化）によって粒子に付加することが
できる。
例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、２−
カルボキシエチルアクリレート、フマール酸、マレイン
酸、２−カルボキシエチルメタクリレート、カルボキシ
メチルスチレン、メタクリルアミドヘキサン酸およびＮ
−（２−カルボキシ−1,1−ジメチルエチル）アクリル
アミドなどを組み入れるか、あるいはカルボキシル基に
転化することができる他の反応性基を有するポリマーの
さらなる化学反応（例えば、マレイン酸無水物のような
無水物の加水分解、または表面メチロール基もしくはア
ルデヒド末端基の酸化）によって粒子に付加することが
できる。
これらのカルボキシル基単独では殆どの現実に使用す
るアミノ基およびスルフヒドリル基との反応が遅すぎる
ので、補助的な架橋剤を使用してこれらのカルボキシル
基にタンパク質、例えば、抗原、抗体、ハプテンなどを
共有結合する。補助的架橋剤の有用なものは、周知のカ
ルボジイミド類、例えば、１−シクロヘキシル−３−
〔２−モルホリニル−４−エチル〕カルボジイミドメト
−ｐ−トルエンスルホネートがあり、このものは米国特
許第4,181,636号明細書に記載されるように写真ゼラチ
ン層のゼラチンを架橋したり診断試薬を調製するのに使
用されてきた。
るアミノ基およびスルフヒドリル基との反応が遅すぎる
ので、補助的な架橋剤を使用してこれらのカルボキシル
基にタンパク質、例えば、抗原、抗体、ハプテンなどを
共有結合する。補助的架橋剤の有用なものは、周知のカ
ルボジイミド類、例えば、１−シクロヘキシル−３−
〔２−モルホリニル−４−エチル〕カルボジイミドメト
−ｐ−トルエンスルホネートがあり、このものは米国特
許第4,181,636号明細書に記載されるように写真ゼラチ
ン層のゼラチンを架橋したり診断試薬を調製するのに使
用されてきた。
他の好ましい部類の補助的架橋剤としては、米国特許
第4,421,847号明細書に記載されるようなカルバモイル
オニウム塩が挙げられる。代表的なカルバモイルオニウ
ム化合物類としては、１−（４−モルホリノカルボニ
ル）−４−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒドロキ
シド（分子内塩）および１−（４−モルホリノカルボニ
ル）−ピリジニウムクロライドが挙げられる。
第4,421,847号明細書に記載されるようなカルバモイル
オニウム塩が挙げられる。代表的なカルバモイルオニウ
ム化合物類としては、１−（４−モルホリノカルボニ
ル）−４−（２−スルホエチル）ピリジニウムヒドロキ
シド（分子内塩）および１−（４−モルホリノカルボニ
ル）−ピリジニウムクロライドが挙げられる。
ポリマー中に組み入れて必要な反応性基を供給するこ
とができる他のモノマー類としては、エポキ基を含むモ
ノマー類（例えば、グリシジルアクリレート、グリシジ
ルメタクリレート、ビニルグリシジルエーテルまたはメ
タクリルグリシジルエーテル）、イソシアネート基を含
むモノマー類（例えば、イソシアネートアクリレート、
イソシアネートエチルメタクリレートまたはα，α−ジ
メチルメタイソプロペニルベンジルイソシアネート）、
アジリジン基を含むモノマー類〔例えば、ビニルカルバ
モイルアジリジン、Ｎ−メタクリロイルアジリジン、Ｎ
−アクリロイルアジリジンおよび２−（１−アジリジニ
ル）エチルアクリレート〕、アルデヒド基を含むモノマ
ー類（例えば、ビニルベンズアルデヒドまたはアクロレ
イン）あるいは２−置換エチルカルボニル含有モノマー
類（例えば、２−クロロエチルアクリレート、２−クロ
ロエチルメタクリレート、２−メチルスルホニルオキシ
エチルメタクリレートおよび２−ｐ−トリルスルホニル
オキシエチルアクリレート）が挙げられる。
とができる他のモノマー類としては、エポキ基を含むモ
ノマー類（例えば、グリシジルアクリレート、グリシジ
ルメタクリレート、ビニルグリシジルエーテルまたはメ
タクリルグリシジルエーテル）、イソシアネート基を含
むモノマー類（例えば、イソシアネートアクリレート、
イソシアネートエチルメタクリレートまたはα，α−ジ
メチルメタイソプロペニルベンジルイソシアネート）、
アジリジン基を含むモノマー類〔例えば、ビニルカルバ
モイルアジリジン、Ｎ−メタクリロイルアジリジン、Ｎ
−アクリロイルアジリジンおよび２−（１−アジリジニ
ル）エチルアクリレート〕、アルデヒド基を含むモノマ
ー類（例えば、ビニルベンズアルデヒドまたはアクロレ
イン）あるいは２−置換エチルカルボニル含有モノマー
類（例えば、２−クロロエチルアクリレート、２−クロ
ロエチルメタクリレート、２−メチルスルホニルオキシ
エチルメタクリレートおよび２−ｐ−トリルスルホニル
オキシエチルアクリレート）が挙げられる。
Ｄは、ＡまたはＢで表されるもの以外の１種以上のエ
チレン系不飽和モノマー類から誘導される反復単位が挙
げられる。これらのモノマー類は、得られる粒子につい
て水性溶液中の分散安定性を付与するかまたは固定化さ
れたリガンドの生物学的活性に影響を及ぼすイオン性基
または他の親水性基を有することができる。限定される
ものではないが、有用なイオン性モノマー類としては、
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナ
トリウム、３−アクリロイルオキシプロパンスルホン酸
ナトリウム、アクリル酸ナトリウム、メタクリル酸ナト
リウムおよびスチレンスルホン酸ナトリウム、ならびに
他の既知のスルホネート類、スルフェート類、カルボキ
シレート類、それらの塩類また無水物が挙げられ、そし
て有用な非イオン極性モノマー類としては、２−ヒドロ
キシエチルアクリレート、2,3−ジヒドロキシプロピル
アクリレート、アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル
メタクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２
−ヒドロキシプロピルメタクリレート、アクリロニトリ
ルおよびＮ−イソブトキシメチルアクリルアミドが挙げ
られる。好ましいモノマー類は、２−アクリルアミド−
２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、アクリル酸
ナトリウム、３−アクリロイルオキシプロパンスルホン
酸ナトリウム、メタクリル酸ナトリウム、２−ヒドロキ
シエチルアクリレート、2,3−ジヒドロキシプロピルア
クリレート、アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミドおよびアクリロニトリルが挙げられる。
チレン系不飽和モノマー類から誘導される反復単位が挙
げられる。これらのモノマー類は、得られる粒子につい
て水性溶液中の分散安定性を付与するかまたは固定化さ
れたリガンドの生物学的活性に影響を及ぼすイオン性基
または他の親水性基を有することができる。限定される
ものではないが、有用なイオン性モノマー類としては、
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナ
トリウム、３−アクリロイルオキシプロパンスルホン酸
ナトリウム、アクリル酸ナトリウム、メタクリル酸ナト
リウムおよびスチレンスルホン酸ナトリウム、ならびに
他の既知のスルホネート類、スルフェート類、カルボキ
シレート類、それらの塩類また無水物が挙げられ、そし
て有用な非イオン極性モノマー類としては、２−ヒドロ
キシエチルアクリレート、2,3−ジヒドロキシプロピル
アクリレート、アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル
メタクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、２
−ヒドロキシプロピルメタクリレート、アクリロニトリ
ルおよびＮ−イソブトキシメチルアクリルアミドが挙げ
られる。好ましいモノマー類は、２−アクリルアミド−
２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、アクリル酸
ナトリウム、３−アクリロイルオキシプロパンスルホン
酸ナトリウム、メタクリル酸ナトリウム、２−ヒドロキ
シエチルアクリレート、2,3−ジヒドロキシプロピルア
クリレート、アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミドおよびアクリロニトリルが挙げられる。
本発明の小さなポリマービーズは、全体を通して同じ
ポリマーからなる均質な粒子、または、例えば米国特許
第3,700,609号明細書に記載されるようなグラフトポリ
マー類のような１種のポリマーより多くからなるかもし
くは、例えば米国特許第4,401,765号明細書に記載され
るようなコアー−シェルポリマー類からなる均質な粒子
であることができる。これは、例えば反応性基または分
散安定性を付与する基を含むものを粒子表面上に存在さ
せるポリマーの反復単位のいずれかが高価な場合に有利
である。ポリマー粒子は、比較的安価なモノマー類また
は価格の上昇を抑制するモノマー類から製造し、次いで
必要な表面基を有する別異のポリマーの重合を続けてシ
ェルを付加することができる。
ポリマーからなる均質な粒子、または、例えば米国特許
第3,700,609号明細書に記載されるようなグラフトポリ
マー類のような１種のポリマーより多くからなるかもし
くは、例えば米国特許第4,401,765号明細書に記載され
るようなコアー−シェルポリマー類からなる均質な粒子
であることができる。これは、例えば反応性基または分
散安定性を付与する基を含むものを粒子表面上に存在さ
せるポリマーの反復単位のいずれかが高価な場合に有利
である。ポリマー粒子は、比較的安価なモノマー類また
は価格の上昇を抑制するモノマー類から製造し、次いで
必要な表面基を有する別異のポリマーの重合を続けてシ
ェルを付加することができる。
これらの小さなポリマービーズは、乳化重合法（回分
式、半連続式および連続式を含む）を用いて製造するこ
とができる。乳化重合を使用すると、一般に例えば米国
特許第4,415,700号（上述）およびResearch Disclosure
発行15963（1977年,7月）に記載されるように界面活性
剤または乳化剤を用いることなく小さな粒子を提供でき
るので、乳化重合が好ましい。Research Disclosure
は、Kenneth Moson Publications,Ltd.（The Old Harbo
urmaster's,8 North Street,Emsworth,Hampshire Polo
7DD,England）から入手可能な刊行物である。
式、半連続式および連続式を含む）を用いて製造するこ
とができる。乳化重合を使用すると、一般に例えば米国
特許第4,415,700号（上述）およびResearch Disclosure
発行15963（1977年,7月）に記載されるように界面活性
剤または乳化剤を用いることなく小さな粒子を提供でき
るので、乳化重合が好ましい。Research Disclosure
は、Kenneth Moson Publications,Ltd.（The Old Harbo
urmaster's,8 North Street,Emsworth,Hampshire Polo
7DD,England）から入手可能な刊行物である。
２種のポリマーからなるコアー−シェルポリマーを提
供するには段階的乳化重合を使用することができる。コ
アーの乳化重合は、標準的な条件下で反応器に反応体を
連続的に加えることによって実質的に反応が終了するま
で行われる。次に、シェルポリマーを形成するのに必要
なモノマー類と触媒が、前記コアーポリマーのラテック
スを含む反応器に連続的に加えられる。この方法で、シ
ェルはコアーモノマーとシェルモノマーの混合物となる
よりむしろ限定された既知の組成を有する。
供するには段階的乳化重合を使用することができる。コ
アーの乳化重合は、標準的な条件下で反応器に反応体を
連続的に加えることによって実質的に反応が終了するま
で行われる。次に、シェルポリマーを形成するのに必要
なモノマー類と触媒が、前記コアーポリマーのラテック
スを含む反応器に連続的に加えられる。この方法で、シ
ェルはコアーモノマーとシェルモノマーの混合物となる
よりむしろ限定された既知の組成を有する。
この発明で有用な代表的なポリマー類としては次のも
のが挙げられる。ポリ（ｍ−およびｐ−クロロメチルス
チレン）、ポリ（スチレン−コ−ｍ−およびｐ−クロロ
メチルスチレン−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト）（67:30:3モル比）、ポリ（スチレン−コ−ｍ−お
よびｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン）（9
5.5:4.5モル比）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ−お
よびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニ
ル〕アクリルアミド｝（99.3:0.7モル比）、ポリ（ｍ−
およびｐ−クロロメチルスチレン−コ−メタクリル酸）
（95:5,98:2および99.8:0.2モル比）、ポリ（スチレン
−コ−ｍ−およびｐ−クロロエチルスルホニルメチルス
チレン−コ−メタクリル酸）（93.5:4.5:2モル比）、ポ
リ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ−およびｐ−（２−クロロ
エチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリルアミド−
コ−メタクリル酸｝（97.3:0.7:2モル比）、ポリ（スチ
レン−コ−ｍ−および−ｐ−クロロメチルスチレン）
（70:30モル比）、ポリ（スチレン−コ−ビニルベンジ
ルクロライド−コ−アクリル酸）（85:10:5モル比）、
ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（99:1モル比）、ポ
リ（スチレン−コ−メタクリル酸）（90:10モル比）、
ポリ（スチレン−コ−アクリル酸−コ−ｍ−およびｐ−
ジビニルベンゼン）（89:10:1モル比）、ポリ（スチレ
ン−コ−２−カルボキシエチルアクリレート）（90:10
モル比）、ポリ（メチルメタクリレート−コ−アクリル
酸）（70:30モル比）、ポリ（スチレン−コ−ｍ−およ
びｐ−ビニルベンズアルデヒド）（95:5モル比）、なら
びにポリ（スチレン−コ−ｍ−およびｐ−ビニルベンズ
アルデヒド−コ−メタクリル酸）（93:5:2モル比）。
のが挙げられる。ポリ（ｍ−およびｐ−クロロメチルス
チレン）、ポリ（スチレン−コ−ｍ−およびｐ−クロロ
メチルスチレン−コ−２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト）（67:30:3モル比）、ポリ（スチレン−コ−ｍ−お
よびｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレン）（9
5.5:4.5モル比）、ポリ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ−お
よびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニ
ル〕アクリルアミド｝（99.3:0.7モル比）、ポリ（ｍ−
およびｐ−クロロメチルスチレン−コ−メタクリル酸）
（95:5,98:2および99.8:0.2モル比）、ポリ（スチレン
−コ−ｍ−およびｐ−クロロエチルスルホニルメチルス
チレン−コ−メタクリル酸）（93.5:4.5:2モル比）、ポ
リ｛スチレン−コ−Ｎ−〔ｍ−およびｐ−（２−クロロ
エチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリルアミド−
コ−メタクリル酸｝（97.3:0.7:2モル比）、ポリ（スチ
レン−コ−ｍ−および−ｐ−クロロメチルスチレン）
（70:30モル比）、ポリ（スチレン−コ−ビニルベンジ
ルクロライド−コ−アクリル酸）（85:10:5モル比）、
ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）（99:1モル比）、ポ
リ（スチレン−コ−メタクリル酸）（90:10モル比）、
ポリ（スチレン−コ−アクリル酸−コ−ｍ−およびｐ−
ジビニルベンゼン）（89:10:1モル比）、ポリ（スチレ
ン−コ−２−カルボキシエチルアクリレート）（90:10
モル比）、ポリ（メチルメタクリレート−コ−アクリル
酸）（70:30モル比）、ポリ（スチレン−コ−ｍ−およ
びｐ−ビニルベンズアルデヒド）（95:5モル比）、なら
びにポリ（スチレン−コ−ｍ−およびｐ−ビニルベンズ
アルデヒド−コ−メタクリル酸）（93:5:2モル比）。
受容体は、上述のａ）からｉ）の表面反応性基を介し
てそれらの粒子に共有結合される。これらの基は、生物
学的受容体の求核性遊離アミノ基およびスルフヒドリル
基と直接的または間接的な反応性を有する。
てそれらの粒子に共有結合される。これらの基は、生物
学的受容体の求核性遊離アミノ基およびスルフヒドリル
基と直接的または間接的な反応性を有する。
生物学的種が求電子性基（カルボキシ、アルデヒドな
ど）を含むかまたは含むように変性されたタンパク質で
ある場合、ポリマー粒子は表面反応性求核性基、例えば
アミン、スルフヒドリルなどを有することができる。
ど）を含むかまたは含むように変性されたタンパク質で
ある場合、ポリマー粒子は表面反応性求核性基、例えば
アミン、スルフヒドリルなどを有することができる。
小さなポリマービーズに受容体を付着させる一般的な
方法には、一般に既知の反応を用いるビーズへの選ばれ
た受容体の共有結合方法が含まれる。多くのペンダント
基、例えばハロアルキル、２−置換活性化エチルスルホ
ニルおよびビニルスルホニルにより受容体をビーズに直
接結合することができる。一般に、水性緩衝液（通常、
pH5〜10）中、ポリマー粒子濃度0.1〜40重量％（好まし
くは、0.1〜10重量％）でビーズが受容体と混合され
る。受容体量はポリマーに対する比として、0.1:1000〜
1:10、好ましくは1:100〜1:10である。混合は温度範囲
５〜50℃、好ましくは５〜40℃で、0.5〜48時間行われ
る。いずれか適当な緩衝剤を使用することができる。
方法には、一般に既知の反応を用いるビーズへの選ばれ
た受容体の共有結合方法が含まれる。多くのペンダント
基、例えばハロアルキル、２−置換活性化エチルスルホ
ニルおよびビニルスルホニルにより受容体をビーズに直
接結合することができる。一般に、水性緩衝液（通常、
pH5〜10）中、ポリマー粒子濃度0.1〜40重量％（好まし
くは、0.1〜10重量％）でビーズが受容体と混合され
る。受容体量はポリマーに対する比として、0.1:1000〜
1:10、好ましくは1:100〜1:10である。混合は温度範囲
５〜50℃、好ましくは５〜40℃で、0.5〜48時間行われ
る。いずれか適当な緩衝剤を使用することができる。
ある場合には、外表面上ペンダント反応性基はリガン
ドと共有結合を起こすために変性または活性化しなけれ
ばならない。例えば、カルボキシル基は上記既知のカル
ボジイミド類またはカルバモイルオニウ類を用いて活性
化しなければならない。
ドと共有結合を起こすために変性または活性化しなけれ
ばならない。例えば、カルボキシル基は上記既知のカル
ボジイミド類またはカルバモイルオニウ類を用いて活性
化しなければならない。
他の例では、外表面のエポキシ基を加水分解して免疫
学的種のアミノ基に対するカプリング剤として働くこと
のできるシアノゲンブロマイドと反応できるジオール化
合物を形成する。アルデヒド類はアミン類と反応して、
その後還元して共有結合を形成することのできるシッフ
塩基を形成することができる。また、アルデヒドは酸に
酸化することができ、カルボキシル基に対する上記と同
様な化学試薬を使用してアミド結合を形成することがで
きる。
学的種のアミノ基に対するカプリング剤として働くこと
のできるシアノゲンブロマイドと反応できるジオール化
合物を形成する。アルデヒド類はアミン類と反応して、
その後還元して共有結合を形成することのできるシッフ
塩基を形成することができる。また、アルデヒドは酸に
酸化することができ、カルボキシル基に対する上記と同
様な化学試薬を使用してアミド結合を形成することがで
きる。
受容体が、それぞれポリマー上の反応性基またはその
ポリマーが反応性カルボキシル基を有する場合にはその
粒子上のカルボキシル基とカルボジイミド化合物もしく
はカルバモイルオニウ化合物との反応によって形成され
る中間体と反応しうる反応性アミノ基またはスルフヒド
リル基を含む限り、反応性アミノ基またはスルフヒドリ
ル基のいずれかを含む受容体は、単分散ポリマービーズ
に結合することができる。
ポリマーが反応性カルボキシル基を有する場合にはその
粒子上のカルボキシル基とカルボジイミド化合物もしく
はカルバモイルオニウ化合物との反応によって形成され
る中間体と反応しうる反応性アミノ基またはスルフヒド
リル基を含む限り、反応性アミノ基またはスルフヒドリ
ル基のいずれかを含む受容体は、単分散ポリマービーズ
に結合することができる。
受容体上のアミノ基またはスルフヒドリル基と容易に
直接反応する反応性基を有する小さなポリマービーズ
は、必要があれば適当な緩衝剤の存在下で、受容体と単
に混合するだけで反応させることができる。
直接反応する反応性基を有する小さなポリマービーズ
は、必要があれば適当な緩衝剤の存在下で、受容体と単
に混合するだけで反応させることができる。
しかしながら、カルボキシル基を含む単分散ポリマー
ビーズへの受容体の結合は２段階で行われ、第１段階は
カルボジイミド化合物もしくはカルバモイルオニウム化
合物とポリマー粒子の水性懸濁液を接触させてカルボキ
シル基の代わりに中間的な反応性基を有する反応性中間
体ポリマー粒子を生成する。この段階は、適当な酸また
は所定のpHを提供する緩衝剤を使用して適当なpHで行
う。反応を進行することができる限り制限されるもので
ないが、一般にpHは６未満である。より好ましくは、pH
は3.5と７との間にある。粒子表面のカルボキシル基に
対するカルボジイミド化合物またはカルバモイルオニウ
ム化合物のモル比は、1:10〜1:500にある。
ビーズへの受容体の結合は２段階で行われ、第１段階は
カルボジイミド化合物もしくはカルバモイルオニウム化
合物とポリマー粒子の水性懸濁液を接触させてカルボキ
シル基の代わりに中間的な反応性基を有する反応性中間
体ポリマー粒子を生成する。この段階は、適当な酸また
は所定のpHを提供する緩衝剤を使用して適当なpHで行
う。反応を進行することができる限り制限されるもので
ないが、一般にpHは６未満である。より好ましくは、pH
は3.5と７との間にある。粒子表面のカルボキシル基に
対するカルボジイミド化合物またはカルバモイルオニウ
ム化合物のモル比は、1:10〜1:500にある。
前記方法の第２段階では、第１段階で形成された反応
性中間体を反応性アミノ基またはスルフヒドリル基含有
受容体と接触する。こうして共有結合が粒子と受容体と
の間に形成される。受容体に対するポリマー粒子の重量
比は、一般に1:1000〜1:1、好ましくは1:100〜1:10であ
る。
性中間体を反応性アミノ基またはスルフヒドリル基含有
受容体と接触する。こうして共有結合が粒子と受容体と
の間に形成される。受容体に対するポリマー粒子の重量
比は、一般に1:1000〜1:1、好ましくは1:100〜1:10であ
る。
多孔質展開層は、希釈または未希釈試験試料（例え
ば、１〜100ul）を収容するのに適する多孔性を有す
る。好ましくは、展開層は等方性多孔質であり、この性
質は特定区域を占める粒子間を相互に連結する空隙によ
って作製される。等方性多孔質とは、展開層が適用され
た液体をその層のすみからすみまで容易にそして均一に
拡散することを意味する。
ば、１〜100ul）を収容するのに適する多孔性を有す
る。好ましくは、展開層は等方性多孔質であり、この性
質は特定区域を占める粒子間を相互に連結する空隙によ
って作製される。等方性多孔質とは、展開層が適用され
た液体をその層のすみからすみまで容易にそして均一に
拡散することを意味する。
有用な展開層は、米国特許第4,670,381号、同4,258,0
01号および同4,430,436号で公表されている。特に有用
な展開層は、米国特許第4,258,001号明細書に記載され
る有機ポリマー粒子とこれらの粒子に粘着性のポリマー
によって形成される粒状構造を有するものである。
01号および同4,430,436号で公表されている。特に有用
な展開層は、米国特許第4,258,001号明細書に記載され
る有機ポリマー粒子とこれらの粒子に粘着性のポリマー
によって形成される粒状構造を有するものである。
この展開層に有用な熱安定性有機ポリマー粒子は、ほ
ぼ球状の直径20〜40μｍの範囲内にある粒子サイズを有
するものである。これらが大きなビーズの第１集団ポリ
マービーズとなる。
ぼ球状の直径20〜40μｍの範囲内にある粒子サイズを有
するものである。これらが大きなビーズの第１集団ポリ
マービーズとなる。
これらの粒子は、必要な特性を有する天然ポリマーお
よび合成ポリマーの両方を含む多種多様な有機ポリマー
から構成することができる。しかしながら、それらは上
述の特許に記載された１種以上の付加ポリマー類から好
ましくは構成される。
よび合成ポリマーの両方を含む多種多様な有機ポリマー
から構成することができる。しかしながら、それらは上
述の特許に記載された１種以上の付加ポリマー類から好
ましくは構成される。
特に有用な付加ポリマー類としては、米国特許第4,25
8,001号の第１表に列挙されるものが挙げられる。その
表中のカッコ内の数字は、ポリマーを製造するのに使用
したモノマーブレンドにおけるモノマー類の重量比を表
す。ポリ（ビニルトルエン−コ−ｐ−ｔ−ブチルスチレ
ン−コ−メタクリル酸）〔61:37:2〕、ポリ（スチレン
−コ−ｎ−ブチルアクリレート）〔75:25〕およびポリ
スチレンが好ましいポリマー類である。これらの有機ポ
リマー粒子は、必要により当該技術分野で既知の他の添
加剤を含めることができる。
8,001号の第１表に列挙されるものが挙げられる。その
表中のカッコ内の数字は、ポリマーを製造するのに使用
したモノマーブレンドにおけるモノマー類の重量比を表
す。ポリ（ビニルトルエン−コ−ｐ−ｔ−ブチルスチレ
ン−コ−メタクリル酸）〔61:37:2〕、ポリ（スチレン
−コ−ｎ−ブチルアクリレート）〔75:25〕およびポリ
スチレンが好ましいポリマー類である。これらの有機ポ
リマー粒子は、必要により当該技術分野で既知の他の添
加剤を含めることができる。
この発明で有用なポリマー粘着質は、有機ポリマー粒
子を相互に結合して整然とした三次元格子を展開層中に
提供する。
子を相互に結合して整然とした三次元格子を展開層中に
提供する。
特に有用な付加ポリマー類としては、米国特許第4,25
8,001の第II表および米国特許第4,283,491号に列挙され
たものが挙げられる。ポリ（メチルアクリレート−コ−
２−アセトアセトキシエチルメチルアクリレート−コ−
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）
〔88:7:5〕、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポ
リ（ｎ−ブチルアクリレート−コ−スチレン−コ−２−
アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリ
ウム塩）〔75:20:5）およびポリ（メチルアクリレート
−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホ
ン酸ナトリウム塩−コ−アセトアセトキシエチルメタク
リレート〕（95:2:3〕が好ましい粘着性ポリマーであ
る。
8,001の第II表および米国特許第4,283,491号に列挙され
たものが挙げられる。ポリ（メチルアクリレート−コ−
２−アセトアセトキシエチルメチルアクリレート−コ−
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸）
〔88:7:5〕、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポ
リ（ｎ−ブチルアクリレート−コ−スチレン−コ−２−
アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリ
ウム塩）〔75:20:5）およびポリ（メチルアクリレート
−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホ
ン酸ナトリウム塩−コ−アセトアセトキシエチルメタク
リレート〕（95:2:3〕が好ましい粘着性ポリマーであ
る。
上記粒子と粘着質による粒状構造物の調製方法は上記
特許に示されている。
特許に示されている。
本発明の要素の展開層は適当な支持体上に担持され
る。このような支持体は適当な寸法安定性で、好ましく
は200と900nmとの間の波長の電磁線を透過する非孔質の
透明（すなわち、輻射線透過性）材料であることができ
る。個々の要素について選ばれる支持体は意図する検出
様式（反射、透過または蛍光分光）に適合性があらねば
ならない。有用な支持体材料としては、ポリスチレン、
ポリエステル類〔例えば、ポリ（エチレンテレフタレー
ト）〕、ポリカーボネート類、セルロースエステル類
（例えば、酢酸セルロース）などが挙げられる。
る。このような支持体は適当な寸法安定性で、好ましく
は200と900nmとの間の波長の電磁線を透過する非孔質の
透明（すなわち、輻射線透過性）材料であることができ
る。個々の要素について選ばれる支持体は意図する検出
様式（反射、透過または蛍光分光）に適合性があらねば
ならない。有用な支持体材料としては、ポリスチレン、
ポリエステル類〔例えば、ポリ（エチレンテレフタレー
ト）〕、ポリカーボネート類、セルロースエステル類
（例えば、酢酸セルロース）などが挙げられる。
本発明の要素は、１種以上の層、例えば、分離層また
は試薬層／展開層の組み合わさった層および他の必要な
添加剤、カプリング酵素などを含むゼラチン緩衝層を含
むことができる。大きなポリマービーズと小さなポリマ
ービーズは、同一または相違する層のいずれかに塗布す
ることができる。小さなビーズは、大きなビーズと同時
にまたは前後に塗布することができる。
は試薬層／展開層の組み合わさった層および他の必要な
添加剤、カプリング酵素などを含むゼラチン緩衝層を含
むことができる。大きなポリマービーズと小さなポリマ
ービーズは、同一または相違する層のいずれかに塗布す
ることができる。小さなビーズは、大きなビーズと同時
にまたは前後に塗布することができる。
この要素の試薬層または展開層は、１種以上の合成ま
たは天然のバインダー材料、例えばゼラチンまたは他の
天然に見い出されるコロイド、ホモポリマー類およびコ
ポリマー類、例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビ
ニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアミド）、
ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリド
ン）および類似のコポリマー類中に分散された１種以上
の試薬を含むインジケーター組成物を含めることができ
る。
たは天然のバインダー材料、例えばゼラチンまたは他の
天然に見い出されるコロイド、ホモポリマー類およびコ
ポリマー類、例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビ
ニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアミド）、
ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリド
ン）および類似のコポリマー類中に分散された１種以上
の試薬を含むインジケーター組成物を含めることができ
る。
他の任意の層、例えば下塗り層、輻射線遮断層などを
必要により含めることができる。本発明のすべての層は
互いに液絡している。すなわち、液体並びに液体中の試
薬及び未複合化反応生成物が、隣接層の重畳領域間を通
過できることを意味する。
必要により含めることができる。本発明のすべての層は
互いに液絡している。すなわち、液体並びに液体中の試
薬及び未複合化反応生成物が、隣接層の重畳領域間を通
過できることを意味する。
アッセイは、リガンドに結合してリガンド類縁体を形
成することができるいずれか適当な標識を用いて行うこ
とができる。有用な標識類としては、放射線タグ、色
素、蛍光体類、酵素類、酵素基質類、酵素阻害剤類、ア
ロステリックエフェクター類、補因子類および他の既知
酵素モデュレーター類を挙げることができる。酵素、例
えばグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アル
カリ性ホスファターゼおよびガラクトシダーゼが好まし
い標識類である。
成することができるいずれか適当な標識を用いて行うこ
とができる。有用な標識類としては、放射線タグ、色
素、蛍光体類、酵素類、酵素基質類、酵素阻害剤類、ア
ロステリックエフェクター類、補因子類および他の既知
酵素モデュレーター類を挙げることができる。酵素、例
えばグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アル
カリ性ホスファターゼおよびガラクトシダーゼが好まし
い標識類である。
酵素標識が使用される場合には、その酵素に対する基
質が要素に存在するかまたは洗液に加えられる。これら
の基質は、バインディング反応と同時にまたはその前後
に要素へ加えることができる。供給された標識に対して
適当な基質を測定する方法は臨床化学分野の当業者の通
常の技術範囲内にある。基質類は、酵素標識と直接反応
する物質または標識の酵素反応を伴う一連の反応に関与
する物質であることができる。例えば、酵素標識がペル
オキシダーゼである場合には、基質は過酸化水素であ
る。例えばグルコースオキシダーゼを使用すると、一般
に基質グルコースは試薬層または洗液中に0.01モル／
m2、好ましくは0.001〜0.1モル／m2の量で存在する当業
者は、アッセイで使用する酵素標識量に対して個々の基
質量をどのように調整するか知っているであろう。
質が要素に存在するかまたは洗液に加えられる。これら
の基質は、バインディング反応と同時にまたはその前後
に要素へ加えることができる。供給された標識に対して
適当な基質を測定する方法は臨床化学分野の当業者の通
常の技術範囲内にある。基質類は、酵素標識と直接反応
する物質または標識の酵素反応を伴う一連の反応に関与
する物質であることができる。例えば、酵素標識がペル
オキシダーゼである場合には、基質は過酸化水素であ
る。例えばグルコースオキシダーゼを使用すると、一般
に基質グルコースは試薬層または洗液中に0.01モル／
m2、好ましくは0.001〜0.1モル／m2の量で存在する当業
者は、アッセイで使用する酵素標識量に対して個々の基
質量をどのように調整するか知っているであろう。
特定の標識、例えば酵素、補因子、酵素基質または酵
素モデュレーターが使用される場合、試薬層は標識の反
応の結果として検出可能種を提供する１種以上の試薬を
含んでなるインジケーター組成物を含む。インジケータ
ー組成物としては、基質と酵素標識リガンド類縁体の酵
素反応の結果として比色法で検出可能種を提供する比色
インジケーター組成物が好ましい。
素モデュレーターが使用される場合、試薬層は標識の反
応の結果として検出可能種を提供する１種以上の試薬を
含んでなるインジケーター組成物を含む。インジケータ
ー組成物としては、基質と酵素標識リガンド類縁体の酵
素反応の結果として比色法で検出可能種を提供する比色
インジケーター組成物が好ましい。
このインジケーター組成物は、酵素反応で検出可能色
素を提供する単一化合物または色素を生成する試薬の組
み合わせであることができる。例えば、基質としてグル
コースが使用され、そして酵素標識としてグルコースオ
キシダーゼが使用される場合、比色インジケーター組成
物は反応して色素を提供するカプラーおよび酸化可能な
化合物を含むことができる。また、この組成物はロイコ
染料ならびにペルオキシダーゼまたはグルコースオキシ
ダーゼがグルコースをグルコン酸に転化する場合に生成
される過酸化水素の形成の結果として検出可能な色素を
生ずる他の適当な過酸化水素化物様化合物を含むことが
できる。有用なロイコ染料は当該技術分野で既知であ
り、例えば米国特許第4,089,747号およびヨーロッパ特
許公開第0162685号公報に記載されるようなものが挙げ
られる。比色インジケーター組成物の具体的な量および
その各種成分は、当業者の常識の範囲内にある。
素を提供する単一化合物または色素を生成する試薬の組
み合わせであることができる。例えば、基質としてグル
コースが使用され、そして酵素標識としてグルコースオ
キシダーゼが使用される場合、比色インジケーター組成
物は反応して色素を提供するカプラーおよび酸化可能な
化合物を含むことができる。また、この組成物はロイコ
染料ならびにペルオキシダーゼまたはグルコースオキシ
ダーゼがグルコースをグルコン酸に転化する場合に生成
される過酸化水素の形成の結果として検出可能な色素を
生ずる他の適当な過酸化水素化物様化合物を含むことが
できる。有用なロイコ染料は当該技術分野で既知であ
り、例えば米国特許第4,089,747号およびヨーロッパ特
許公開第0162685号公報に記載されるようなものが挙げ
られる。比色インジケーター組成物の具体的な量および
その各種成分は、当業者の常識の範囲内にある。
この発明の実施に際して有用なリガンド類縁体は、既
知の出発原料と方法で調製するかまたは市販のものから
入手することができる。一般に、この類縁体のリガンド
部分は、共有結合を介して標識（例えば、酵素部分また
は蛍光体）に結合される。
知の出発原料と方法で調製するかまたは市販のものから
入手することができる。一般に、この類縁体のリガンド
部分は、共有結合を介して標識（例えば、酵素部分また
は蛍光体）に結合される。
イムノアッセイは手動または自動的であることができ
る。一般に、液体中のリガンド量は、供給ロール、チッ
プパケットまたは他の供給源から要素を取り出し、次い
でその展開層の限定領域に液体試料１〜100μｌを物理
的に接触させて測定される。接触される限定領域は、一
般に100mm2未満である。
る。一般に、液体中のリガンド量は、供給ロール、チッ
プパケットまたは他の供給源から要素を取り出し、次い
でその展開層の限定領域に液体試料１〜100μｌを物理
的に接触させて測定される。接触される限定領域は、一
般に100mm2未満である。
リガンド類縁体が加工中に要素に組み込まれない場合
には、試験試料が要素と接触するのと同時にまたはその
前にリガンド類縁体を混合することができる。
には、試験試料が要素と接触するのと同時にまたはその
前にリガンド類縁体を混合することができる。
いずれかの態様による試料の適用後、要素は試験結果
を迅速またはその結果の入手を促進するのに必要である
かも知れないインキュベーションまたは加熱などのいず
れかの条件下にさらされる。
を迅速またはその結果の入手を促進するのに必要である
かも知れないインキュベーションまたは加熱などのいず
れかの条件下にさらされる。
リガンド量は、複合体化リガンド類縁体を直接検出す
るかまたは酵素標識と基質の酵素反応の結果形成される
検出可能種を検出するための適当な装置に要素を通過す
ることによって測定される。例えば、これらの種は、通
常の既知の方法で用いられる適当な放射能測定装置、蛍
光測定装置または分光光度計によって検出することがで
きる。酵素反応では、得られた生成物は、例えば、試験
試料が接触した限定領域の中心における反射濃度もしく
は透過濃度または蛍光を測定することによって決定す
る。測定される前記領域は、一般に、競争アッセイにつ
いては直径３〜5mmである。液体試料中のリガンド量
は、前記限定領域の中心で測定される標識量に反比例す
る。好ましい態様では、未複合体化リガンドから複合体
化リガンドを分離するのに、別に洗浄段階が必要であ
る。一般に標識の測定は、試料の接触後５〜180秒して
洗液を散布または適用した後に行われる。
るかまたは酵素標識と基質の酵素反応の結果形成される
検出可能種を検出するための適当な装置に要素を通過す
ることによって測定される。例えば、これらの種は、通
常の既知の方法で用いられる適当な放射能測定装置、蛍
光測定装置または分光光度計によって検出することがで
きる。酵素反応では、得られた生成物は、例えば、試験
試料が接触した限定領域の中心における反射濃度もしく
は透過濃度または蛍光を測定することによって決定す
る。測定される前記領域は、一般に、競争アッセイにつ
いては直径３〜5mmである。液体試料中のリガンド量
は、前記限定領域の中心で測定される標識量に反比例す
る。好ましい態様では、未複合体化リガンドから複合体
化リガンドを分離するのに、別に洗浄段階が必要であ
る。一般に標識の測定は、試料の接触後５〜180秒して
洗液を散布または適用した後に行われる。
以下で例でこの発明の有用性を明らかにする。これら
の例では、コアー／シェル単分散ポリマービーズは、各
種の他のモノマー類、例えばｍ＋ｐ−ビニルベンジルク
ロライド、ｍ＋ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）スチレン、アクリル酸、メタクリル酸、o,m＋ｐ−
ジビニルベンゼンおよびエチレングリコールジメチルア
クリレートと共重合されたポリスチレンを含む。特定の
単分散ビーズのモル％組成を有するビーズは次のもので
あった。
の例では、コアー／シェル単分散ポリマービーズは、各
種の他のモノマー類、例えばｍ＋ｐ−ビニルベンジルク
ロライド、ｍ＋ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）スチレン、アクリル酸、メタクリル酸、o,m＋ｐ−
ジビニルベンゼンおよびエチレングリコールジメチルア
クリレートと共重合されたポリスチレンを含む。特定の
単分散ビーズのモル％組成を有するビーズは次のもので
あった。
1.ポリ（スチレン−コ−o,m＋ｐ−ジビニルベンゼン（9
9.4:0.6）を含んでなるコアーとポリ（スチレン−コ−
ｍ＋ｐ（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン
−コ−o,m＋ｐ−ジビニルベンゼン（99.8:1.2）を含ん
でなるシェル、ジゴキシンおよびフェニトインに有用。
9.4:0.6）を含んでなるコアーとポリ（スチレン−コ−
ｍ＋ｐ（２−クロロエチルスルホニルメチル）スチレン
−コ−o,m＋ｐ−ジビニルベンゼン（99.8:1.2）を含ん
でなるシェル、ジゴキシンおよびフェニトインに有用。
2.ポリ（スチレン−コ−エチレングリコールジメタクリ
レート）（99:1）を含んでなるコアーとポリ（スチレン
−コ−ｍ＋ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）
スチレン−コ−エチレングリコールジメタクリレート）
（93.5/4.5/1）を含んでなるシェル、ジゴキシンおよび
チロキシンに有用。
レート）（99:1）を含んでなるコアーとポリ（スチレン
−コ−ｍ＋ｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）
スチレン−コ−エチレングリコールジメタクリレート）
（93.5/4.5/1）を含んでなるシェル、ジゴキシンおよび
チロキシンに有用。
展開層の大きなビーズは、ポリ（ｍ＋ｐ−ビニルトルエ
ン−コ−メタクリル酸）であった。このサイズ範囲は約
20μｍ〜約40μｍであった。
ン−コ−メタクリル酸）であった。このサイズ範囲は約
20μｍ〜約40μｍであった。
粘着質は、ポリ（メチルアクリレート−コ−２−アク
リルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム
塩−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）
（94.9:2.1:3）であった。
リルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム
塩−コ−２−アセトアセトキシエチルメタクリレート）
（94.9:2.1:3）であった。
材料 DMSO（ジメチルスルホキシド） TEA（トリエタノールアミン緩衝剤） MOPS（３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸緩衝
剤） ALP（アルカリ性ホスファターゼ） ANS（８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸） チロキシンおよびフェニトイン用洗浄液は、２−アミ
ノ−２−メチル−１−プロパノール（1.5M,pH10.3）中
ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（15mM）を含んで
なる。
剤） ALP（アルカリ性ホスファターゼ） ANS（８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸） チロキシンおよびフェニトイン用洗浄液は、２−アミ
ノ−２−メチル−１−プロパノール（1.5M,pH10.3）中
ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（15mM）を含んで
なる。
チロキシン−ALP結合体は、M.ItoらのClin. Chem.,30,
1682〜1685ページ（1984）の方法で調製した。
1682〜1685ページ（1984）の方法で調製した。
フェニトイン−ALP結合体は、５、５−ジフェニルヒ
ダントイン−３−（ω−吉草酸）を用いるB.F.Erlanger
らのJ.Biol.Chem.，234,1090ページ（1959）の方法によ
って調製した。
ダントイン−３−（ω−吉草酸）を用いるB.F.Erlanger
らのJ.Biol.Chem.，234,1090ページ（1959）の方法によ
って調製した。
他の材料は次のものであった。
Zonyl（商標）FSN界面活性剤（DuPont,Wilmington,Dela
ware U.S.A）、 Triton（商標）Ｘ−100界面活性剤（Rohm＆Hnas,Philad
ephia,Pennsylvania,U.S.A）、ならびに残りはEastman
Kodak Co.製（Rochester,New York,U.S.A）または既知
の出発原料および方法で調製した。
ware U.S.A）、 Triton（商標）Ｘ−100界面活性剤（Rohm＆Hnas,Philad
ephia,Pennsylvania,U.S.A）、ならびに残りはEastman
Kodak Co.製（Rochester,New York,U.S.A）または既知
の出発原料および方法で調製した。
この明細書で使用するI.U.は酵素活性の国際単位を表
し、1I.U.は酵素に対する標準的なpHと温度条件下で１
分当たり基質１マイクロモル（μmole）の転化を触媒す
るのに要する酵素活性量として定義した。
し、1I.U.は酵素に対する標準的なpHと温度条件下で１
分当たり基質１マイクロモル（μmole）の転化を触媒す
るのに要する酵素活性量として定義した。
要素の水溶性ポリマー層は、いずれかの水溶性ポリマ
ーを含んでなる。好ましいポリマーは、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、
ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリド
ン）もしくはゼラチンまたはこれらのポリマー類の組み
合わされたものである。
ーを含んでなる。好ましいポリマーは、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、
ポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ−ビニル−２−ピロリド
ン）もしくはゼラチンまたはこれらのポリマー類の組み
合わされたものである。
例１（チロキシン（T4）のアッセイ この例は、３層のフォーマットと分離した洗浄段階を
用いるT4の競争イムノアッセイを具体的に説明する。次
の要素構造はT4のアッセイに有用である。
用いるT4の競争イムノアッセイを具体的に説明する。次
の要素構造はT4のアッセイに有用である。
２×10-5Ｍから２×10-10Ｍまで濃度変化する一連のT
4標準を、DMSO中１×10-3ＭT4保存液から下記に記載の
緩衝剤で調製した。この緩衝剤は、リン酸緩衝化生理食
塩水（pH7.4）ならびにウシ血清アルブミン（１％）お
よびANS（8.7×10-4Ｍ）から構成した。T4−ALP結合物
溶液を、1.0×10-8Ｍの濃度で調製した。これらのT4液
と、T4−ALP溶液を１対１で混合し、T4−ALPの最終濃度
を５×10-9Ｍとした。
4標準を、DMSO中１×10-3ＭT4保存液から下記に記載の
緩衝剤で調製した。この緩衝剤は、リン酸緩衝化生理食
塩水（pH7.4）ならびにウシ血清アルブミン（１％）お
よびANS（8.7×10-4Ｍ）から構成した。T4−ALP結合物
溶液を、1.0×10-8Ｍの濃度で調製した。これらのT4液
と、T4−ALP溶液を１対１で混合し、T4−ALPの最終濃度
を５×10-9Ｍとした。
10μｌのアリコートをT4要素上にスポットした。37℃
で５分後、洗液（10μｌ）を加えて要素の中心からバイ
ンディングしていないT4−ALPを洗い出した。１分後、3
7℃で400nmにて要素の中心で30秒間ΔDRを測定した。ウ
イルアムス−クラッパー（Williams−Clapper）変換
〔J.Optical Soc.Am.,43,595ページ（1953）〕を使用し
てDT値に変換した。結果を第２表に示した。
で５分後、洗液（10μｌ）を加えて要素の中心からバイ
ンディングしていないT4−ALPを洗い出した。１分後、3
7℃で400nmにて要素の中心で30秒間ΔDRを測定した。ウ
イルアムス−クラッパー（Williams−Clapper）変換
〔J.Optical Soc.Am.,43,595ページ（1953）〕を使用し
てDT値に変換した。結果を第２表に示した。
第２表 T4濃度 変化率（ΔDT／分） １×10-10Ｍ 0.0289 １×10-9Ｍ 0.0293 １×10-8Ｍ 0.0263 １×10-7Ｍ 0.0182 １×10-6Ｍ 0.0074 １×10-5Ｍ 0.0012 この例は、測定されたT4のレベルの関数としての変化率
において改良された変化を示す。
において改良された変化を示す。
例２ フェニトインのアッセイ 以下の要素は、フェニトインのアッセイに有用であ
る。
る。
この例は、３層のフォーマットを用いるフェニトイン
の放射状洗浄イムノアッセイを具体的に説明する。0.15
M塩化ナトリウム（Nacl）中複数のフエニトイン標準と
0.1％ウシ血清アルブミンを含む第１の一連の水性溶液
を調製した。これらの溶液を緩衝溶液（0.02M MOPS,pH
7,0.15M Naclおよび２％BSA）と1:1で混合した。第２の
一連の水性溶液を上記のように調製し、10nMフェニトイ
ン−アルカリ性ホスファターゼ結合物を含ました緩衝溶
液と1:1で混合した。
の放射状洗浄イムノアッセイを具体的に説明する。0.15
M塩化ナトリウム（Nacl）中複数のフエニトイン標準と
0.1％ウシ血清アルブミンを含む第１の一連の水性溶液
を調製した。これらの溶液を緩衝溶液（0.02M MOPS,pH
7,0.15M Naclおよび２％BSA）と1:1で混合した。第２の
一連の水性溶液を上記のように調製し、10nMフェニトイ
ン−アルカリ性ホスファターゼ結合物を含ました緩衝溶
液と1:1で混合した。
第１の一連のフェニトイン標準（10μｌアリコート）
を前記結合物を組み入れた要素上にスポットした。第２
の一連のフェニトイン標準（10μｌアリコート）を前記
結合物を組み入れていない要素上にスポットした。37℃
で５分インキュベーション後、洗液（10μｌ）を要素に
加えてスポットの中心からバインディングしていない前
記結合物を洗い出した。37℃で１分後、400nmにおける
反射濃度（ΔDR）の変化をスポットの中心で30秒かけて
測定した。
を前記結合物を組み入れた要素上にスポットした。第２
の一連のフェニトイン標準（10μｌアリコート）を前記
結合物を組み入れていない要素上にスポットした。37℃
で５分インキュベーション後、洗液（10μｌ）を要素に
加えてスポットの中心からバインディングしていない前
記結合物を洗い出した。37℃で１分後、400nmにおける
反射濃度（ΔDR）の変化をスポットの中心で30秒かけて
測定した。
結果を第３表に示す。
〔発明の効果〕 この発明は、非常に改良されたイムノアッセイ用要素
を提供する。小さなポリマービーズは、いずれかのイム
ノアッセイに必要な受容体濃度の収容に必要な表面積を
提供する。これらのビーズは、抗体のような受容体を固
定化するのに必要な表面反応性官能基を提供するポリマ
ーから調製される。さらに、これらのビーズは受容体の
付着を阻害し、そしてまた受容体をマスクする界面活性
剤および乳化剤などの物質を含まない。
を提供する。小さなポリマービーズは、いずれかのイム
ノアッセイに必要な受容体濃度の収容に必要な表面積を
提供する。これらのビーズは、抗体のような受容体を固
定化するのに必要な表面反応性官能基を提供するポリマ
ーから調製される。さらに、これらのビーズは受容体の
付着を阻害し、そしてまた受容体をマスクする界面活性
剤および乳化剤などの物質を含まない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイケル ウイリアム サンドバーグ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，フィッシャーズ ロード 220 (72)発明者 グレン マーシャル ダッペン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14580, ウエブスター，マジェスティック ウエイ 1215 (72)発明者 ジョン ナサン アイケンベリー アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，ピンクレスト ドライブ 168 (56)参考文献 特開 昭55−90859（ＪＰ，Ａ)
Claims (4)
- 【請求項１】支持体と展開層を含んでなるイムノアッセ
イ用分析要素であって、 前記展開層が、 （ａ）前記要素に適用される液体の均一な拡散を促進す
るような10〜200μｍの範囲内の直径を有する多分散ポ
リマービーズの第１集団、及び （ｂ）（ｉ）0.1〜５μｍの範囲内の直径を有し、（i
i）表面反応性基を介してビーズ表面に共有結合したレ
セプター類を有し、そして（iii）残留物質がない表面
を有する単分散ポリマービーズの第２集団、 の両方を含むことを特徴とする前記分析要素。 - 【請求項２】前記展開層が、（ａ）インジケーター組成
物用試薬、（ｂ）隣接ビーズの表面領域を介して相互に
結合して凝集し、水性液体中で実質的に非膨潤性である
三次元格子を形成した前記ポリマービーズの第１集団を
含む粒状構造体、及び（ｃ）前記ポリマービーズの第２
集団を含んでなる請求項１記載の分析要素。 - 【請求項３】支持体と展開層を含んでなるイムノアッセ
イ用分析要素であって、 前記展開層が、前記要素に適用される液体の均一な拡散
を促進するような10〜200μｍの範囲内の直径を有する
多分散ポリマービーズの第１集団を含み、そして前記展
開層と液絡する別の層に、（ｉ）0.1〜５μｍの範囲内
の直径を有し、（ii）表面反応性基を介してビーズ表面
に共有結合したレセプター類を有し、そして（iii）残
留物質がない表面を有する単分散ポリマービーズの第２
集団が配置されていることを特徴とする前記分析要素。 - 【請求項４】A.標識リガンド類縁体の存在下で液体試料
を展開層の限定された領域に接触してその限定された領
域内に固定化されたリガンド−受容体複合体を形成し、
そして液体の拡散の際に前記固定化された複合体から未
複合化リガンドをほぼ水平方向に分離する工程、及び B.工程Ａの終了後、、前記限定された領域の中心にある
前記固定化された複合体を測定する工程、を含んでなる
請求項１から３までのいずれか１項に記載の分析要素に
よる液体中の免疫反応性リガンドのアッセイ方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44407989A | 1989-11-30 | 1989-11-30 | |
| US444079 | 1989-11-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03186761A JPH03186761A (ja) | 1991-08-14 |
| JPH081439B2 true JPH081439B2 (ja) | 1996-01-10 |
Family
ID=23763406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2330877A Expired - Lifetime JPH081439B2 (ja) | 1989-11-30 | 1990-11-30 | イムノアッセイ用分析要素及びアッセイ方法 |
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| Country | Link |
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| EP (1) | EP0430371B1 (ja) |
| JP (1) | JPH081439B2 (ja) |
| AT (1) | ATE114190T1 (ja) |
| CA (1) | CA2013014A1 (ja) |
| DE (1) | DE69014193T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| SG63592A1 (en) * | 1992-12-22 | 1999-03-30 | Johnson & Johnson Clin Diag | Immunoassay elements having a separate receptor layer |
| US7163998B2 (en) * | 2003-09-09 | 2007-01-16 | Eastman Kodak Company | Stabilized polymer beads and method of preparation |
| WO2008003099A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-03 | Invitrogen, Dynal As | Particles containing multi- block polymers |
| WO2018075913A1 (en) | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Quantum Diamond Technologies Inc. | Methods and apparatus for magnetic particle analysis using wide-field diamond magnetic imaging |
| EP3559668B1 (en) | 2016-12-23 | 2023-07-19 | Quantum Diamond Technologies Inc. | Methods and apparatus for magnetic multi-bead assays |
| WO2019027917A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Quantum Diamond Technologies, Inc | METHODS AND APPARATUS FOR SAMPLE MEASUREMENT |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4258001A (en) * | 1978-12-27 | 1981-03-24 | Eastman Kodak Company | Element, structure and method for the analysis or transport of liquids |
-
1990
- 1990-03-26 CA CA002013014A patent/CA2013014A1/en not_active Abandoned
- 1990-11-26 AT AT90203120T patent/ATE114190T1/de active
- 1990-11-26 EP EP90203120A patent/EP0430371B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-26 DE DE69014193T patent/DE69014193T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-30 JP JP2330877A patent/JPH081439B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
| EP0430371A2 (en) | 1991-06-05 |
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| EP0430371A3 (en) | 1993-03-31 |
| CA2013014A1 (en) | 1991-05-31 |
| JPH03186761A (ja) | 1991-08-14 |
| DE69014193D1 (de) | 1994-12-22 |
| DE69014193T2 (de) | 1995-06-29 |
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