JPH11201970A - 免疫測定試薬の製造方法および免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 特異的なシグナルの大きさを減ずることな
く、バックグラウンド・シグナルを低減することにより
低濃度の領域まで高感度に測定可能な免疫測定試薬の製
造方法および得られた免疫測定試薬を用いる免疫測定法
を提供する。 【解決手段】 不溶性担体（例、ラテックス粒子）に被
測定物質である抗原〔または抗体（例、ＨＢｓ抗体）〕
に対応する抗体〔または抗原（例、ＨＢｓ抗原）〕を感
作した後、該不溶性担体をブロッキング処理し、次い
で、免疫学的に不活性なタンパク質（例、ウシ血清アル
ブミン）、及び／または、免疫学的に不活性なタンパク
質の加水分解物を含む溶液中でインキュベーション
（例、３７℃、７日）することを特徴とする免疫測定試
薬の製造方法。上記の製造方法によって得られた免疫測
定試薬と被測定物質含有試料とを接触させ、免疫測定試
薬と被測定物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担
体の凝集の度合いを検出することにより、被測定物質を
測定することを特徴とする免疫測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、不溶性担体を使用
した免疫凝集反応に基づいて被測定物質を測定するため
に用いられ、低濃度の範囲まで信頼性良く測定可能な免
疫測定試薬の製造方法および得られた免疫測定試薬を用
いる免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】体液中の微量成分等の測定法のひとつと
して、目的とする被測定物質である抗原（または抗体）
に対応する抗体（または抗原）を不溶性担体に感作さ
せ、被測定物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担
体の凝集の度合いを検出することにより、被測定物質を
測定する方法がある。このような測定法としては、ラテ
ックス凝集反応、赤血球凝集反応等が知られている。

【０００３】この凝集の程度を検出する方法としては、
凝集の有無を肉眼で判定する方法と、反応液に光を照射
して散乱光または透過光を測定する光学的な方法とがあ
る。光学的な測定方法は、より精度が高いため、試料中
の抗原（または抗体）の定量に用いられている。

【０００４】上記凝集反応において、目的とする被測定
物質が存在しない場合でも、非特異的凝集反応などによ
ってある程度の散乱光または透過光などのシグナルが存
在し、このシグナルによって被測定物質の低濃度領域の
測定値が不正確になるという問題があった。このシグナ
ルはバックグラウンド・シグナルと呼ばれるが、このバ
ックグラウンド・シグナルを下げる方法として、反応液
中に塩化コリン等の第４級アンモニウム塩やトリアルキ
ルアミンおよびその塩などの水溶性化合物を添加する方
法が提案されている（特開昭６２−２１８８６６号公
報）。しかし、この方法はバックグラウンド・シグナル
を低下させるが、同時に特異的なシグナルも低下させて
しまうという問題があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特異
的なシグナルの大きさを減ずることなく、バックグラウ
ンド・シグナルを低減することにより低濃度の領域まで
高感度に測定可能な免疫測定試薬の製造方法および得ら
れた免疫測定試薬を用いる免疫測定法を提供することに
ある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
不溶性担体に被測定物質である抗原（または抗体）に対
応する抗体（または抗原）を感作した後、該不溶性担体
をブロッキング処理し、次いで、免疫学的に不活性なタ
ンパク質、及び／または、免疫学的に不活性なタンパク
質の加水分解物を含む溶液中でインキュベーションする
ことを特徴とする免疫測定試薬の製造方法である。

【０００７】請求項２記載の発明は、インキュベーショ
ン時の温度が３０〜４０℃であることを特徴とする請求
項１記載の免疫測定試薬の製造方法である。

【０００８】請求項３記載の発明は、被測定物質である
抗原（または抗体）に対応する抗体（または抗原）が、
ＨＢｓ抗原または抗ヒトα−フェトプロテイン抗体であ
ることを特徴とする請求項１又は２記載の免疫測定試薬
の製造方法である。

【０００９】請求項４記載の発明は、請求項１〜３のい
ずれか一項記載の製造方法によって得られた免疫測定試
薬と被測定物質含有試料とを接触させ、免疫測定試薬と
被測定物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の
凝集の度合いを検出することにより、被測定物質を測定
することを特徴とする免疫測定法である。

【００１０】なお、本明細書において、上記の抗原（ま
たは抗体）、或いは、抗体（または抗原）という表現
は、一文章中において、括弧内は括弧内同士が対応し、
括弧外は括弧外同士が対応しているものとする。

【００１１】本発明の製造方法による免疫測定試薬によ
って測定されるべき被測定物質は特に限定されず、一般
に抗原抗体反応を利用して測定し得る物質はいずれも測
定可能である。被測定物質の例としては、タンパク質、
脂質等が挙げられ、より詳しくは、例えば、各種抗原、
抗体、レセプター、酵素等が挙げられる。具体的には、
ヒトＣ反応性たんぱく（ＣＲＰ）、ヒトフィブリノーゲ
ン、リウマチ因子、ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦ
Ｐ）、抗ストレプトリジンＯ抗体、梅毒トレポネーマ抗
体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗
原、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体等が例示される。

【００１２】以下、本発明の免疫測定試薬の製造方法つ
いて詳述する。本発明では、まず、不溶性担体に被測定
物質である抗原（または抗体）に対応する抗体（または
抗原）を感作する。上記感作とは、不溶性担体に被測定
物質である抗原（または抗体）に対応する抗体（または
抗原）を結合させることである。上記結合方法として
は、公知の物理的吸着による方法、化学的反応による結
合などいずれでもよく、感作方法は従来公知の方法でよ
い。

【００１３】上記感作において抗体が用いられる場合、
用いる抗体としては免疫グロブリンまたはその断片であ
る、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂ などが
挙げられる。

【００１４】本発明で用いられる不溶性担体としては、
有機高分子粒子、無機物質粒子、微生物、血球および細
胞膜片等が挙げられる。

【００１５】上記有機高分子粒子としては、ラテックス
粒子、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキスト
ラン等が例示でき、特にラテックス粒子が好ましい。上
記ラテックス粒子としては、従来からこの分野で使用さ
れてきたもののいずれも使用可能であり、例えば、ポリ
スチレン、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、スチレ
ン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル
−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリ
ル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステ
ル共重合体などからなるものが挙げられる。

【００１６】用いるラテックス粒子の平均粒径は、被測
定物質の検出濃度または測定機器によって０．０５〜
１．０μｍの範囲で適宜選択される。

【００１７】上記無機物質粒子としてはシリカ、アルミ
ナ等や、金、チタン、鉄、ニッケルのような金属片等が
例示される。

【００１８】本発明では、上記感作の後、得られた不溶
性担体をブロッキング処理する。ブロッキング処理と
は、被測定物質である抗原（または抗体）に対応する抗
体（または抗原）を感作した不溶性担体を、測定しよう
とする試料中の被測定物質である抗原（または抗体）や
それ以外の物質と免疫学的に反応性を持たないタンパク
質（以下、このタンパク質のことを免疫学的に不活性な
タンパク質という）と接触させて、上記の抗体（または
抗原）を感作した不溶性担体表面の上記の抗体（または
抗原）が未だ結合せずに残っている部位に、上記の免疫
学的に反応性を持たないタンパク質を結合させることで
あり、この処理は上記感作不溶性担体の非特異的反応を
防止するために行うものである。このブロッキング処理
は、不溶性担体を用いる免疫測定試薬の製造において、
通常、頻繁に行われる操作であり、本発明においてもブ
ロッキング処理の方法については公知の方法と同様であ
る。

【００１９】上記免疫学的に不活性なタンパク質として
は、特に限定されないが、例えば、ウシ血清アルブミン
等が挙げられる。

【００２０】本発明では、上記ブロッキング処理後の不
溶性担体を、次いで、免疫学的に不活性なタンパク質、
及び／または、その加水分解物を含む溶液中でインキュ
ベーションする。インキュベーションとは、一定温度の
雰囲気中に静置しておく処理のことをいう。インキュベ
ーションの温度は、２５〜４５℃が好ましく、より好ま
しくは２５〜４０℃であり、さらに好ましくは３０〜４
０℃である。インキュベーションの時間は、２４時間以
上が好ましく、より好ましくは４８時間以上である。本
発明では、インキュベーションに次いで得られた不溶性
担体を洗浄するのが好ましい。なお、この洗浄操作は、
インキュベーションの前、すなわちブロッキング処理後
でもよい。以上の処理により、本発明の製造方法による
免疫測定試薬が得られる。

【００２１】上記免疫学的に不活性なタンパク質として
は、特に限定されないが、例えば、ウシ血清アルブミン
やカゼインが挙げられる。また、免疫学的に不活性なタ
ンパク質の加水分解物としては、例えば、カゼインの加
水分解物であるカザミノ酸を用いるのが好適である。

【００２２】上記不溶性担体に、抗ヒトα−フェトプロ
テイン抗体を感作させた場合においては、上記ブロッキ
ングを行ったあと、カザミノ酸を０．５〜２％（Ｗ／
Ｖ）含有する溶液中、３０〜４０℃でインキュベーショ
ンするのがより好ましい。

【００２３】次に、本発明の免疫測定法について詳述す
る。本発明の免疫測定法は、本発明の製造方法によって
得られた免疫測定試薬と被測定物質含有試料とを接触さ
せ、免疫測定試薬と被測定物質との抗原抗体反応により
生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出することによ
り、被測定物質を測定する。

【００２４】本発明の免疫測定法の測定系は、例えば、
ラテックス凝集反応や血球凝集法等の凝集法である。

【００２５】上記被測定物質含有試料としては、特に限
定されないが、例えば、血清、血漿、尿などの体液が挙
げられる。

【００２６】上記抗原抗体反応の条件は、通常の条件と
同様であってよく、反応媒体としては、被測定物質の種
類に応じた各種緩衝液が適宜選ばれる。この緩衝液は、
被測定物質を失活させることがなく、かつ抗原抗体反応
を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであ
ればよい。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ト
リス緩衝液が使用される。反応のｐＨは、５〜１０、特
に６〜８が好ましい。反応温度は０〜５０℃、特に２０
〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決められる。反応
時には、さらに測定系の特異性を高めるために従来から
免疫凝集測定試薬の分野で用いられる、ＥＤＴＡ、ポリ
アニオン、カオトロピックイオン（Ｃｌ ^- 、Ｉ^- 、ＳＣ
Ｎ^- 等）、ゼラチンなどを添加することも可能である。
また、ポリエチレングリコール、デキストランなどの反
応促進剤を添加してもよい。

【００２７】上記反応後の不溶性担体の凝集の度合いを
検出するには、光学的に観察もしくは目視観察すること
により行われる。具体的には、不溶性担体の凝集の程度
を光学的に検出する方法においては、散乱光強度、吸光
度または透過光強度を測定する光学機器を用いて測定す
る。好ましい測定波長は３００〜２４００ｎｍである。
測定方法は、公知の方法に従い、用いる不溶性担体の大
きさ、または濃度の選択、反応時間の設定により散乱光
強度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を測
定することにより行われる。また、これらの方法を併用
することも可能である。

【００２８】不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する
試薬においては、通常、測定すべき試料と感作不溶性担
体を含む溶液を判定板上で混合し、１〜５分間揺り動か
した後、凝集の有無を判定する。凝集判定には、単に肉
眼判定以外に、凝集状態をビデオカメラで撮影し、画像
処理を施すことも可能である。

【００２９】

【発明の実施の形態】以下に実施例を掲げて本発明を更
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。

【００３０】以下実施例１・２において、ＨＢｓ抗体測
定試薬の製造方法およびＨＢｓ抗体測定方法の場合にお
ける本発明の実施例について説明する。

【００３１】実施例１（ＨＢｓ抗体測定試薬の製造方法
およびＨＢｓ抗体測定方法） （１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製 ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で３６ｍＭのリン
酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解した液７．５ｍｌに、平
均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分
１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１ｍｌを添加
し、３０℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にウ
シ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）を１重量％
含有する１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を
８．５ｍｌ添加し、３０℃にて６０分間攪拌した後、４
℃にて２０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分離した。得
られた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有する１００ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌを添加し、ラ
テックスを懸濁させた。この液を３０℃にて７日間イン
キュベーションし、ＨＢｓ抗原感作ラテックス液を調製
した。

【００３２】（２）検体希釈用液の調製 ＢＳＡを１重量％含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に、平均分子量５０万のポリエチレングリコ
ールを、１．０重量％の濃度になるように溶解した。

【００３３】（３）ＨＢｓ抗体測定試薬 本実施例のＨＢｓ抗体測定試薬は、上記（１）項のＨＢ
ｓ抗原感作ラテックス液からなる第１試薬と、上記
（２）項の検体希釈用液からなる第２試薬とから構成さ
れる２液型の試薬である。

【００３４】（４）標準ＨＢｓ抗体液 ＨＢｓ抗体を０、１５０、３００、６００、１２００ｍ
ＩＵ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を標準品として使用し
た。

【００３５】（５）測定方法 （５−１）検量線の作成方法 上記（４）項の標準ＨＢｓ抗体液２０μｌと上記（２）
項の検体希釈用液１２０μｌとを混合し、３７℃で適時
保持した後、上記（１）項のＨＢｓ抗原感作ラテックス
液１２０μｌを添加攪拌した。この後、１分後及び５分
後の波長７５０ｎｍでの吸光度を測定し、この差を吸光
度変化量（ΔＡｂｓ）とした。測定は、日立自動分析装
置７１５０形を使用した。標準ＨＢｓ抗体液の濃度と得
られたΔＡｂｓの値を表１に、標準ＨＢｓ抗体液の濃度
と得られたΔＡｂｓの関係を示す検量線を図１に示し
た。 （５−２）検体の測定方法 上記（５−１）項における、標準ＨＢｓ抗体液２０μｌ
の代わりに、検体２０μｌを使用したことの他は、（５
−１）項と同様に操作し、得られた検体の吸光度変化量
を上記検量線に外挿して、検体中のＨＢｓ抗体量を算出
した。

【００３６】（６）検体の測定 ＨＢｓ抗体陽性の血清２０種類及び陰性の血清１０種類
を検体として、上記の測定方法に従って、ＨＢｓ抗体量
を測定した。結果を表２に示した。なお、表２には、上
記検体を、酵素免疫測定法試薬である、エンザイグノス
ト Ａｎｔｉ−ＨＢｓ ｍｉｃｒｏ（ヘキストジャパン
社製）を用い、該キットの能書に従って測定および判定
した結果も示した。

【００３７】実施例２ 実施例１における（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の
調製の項を、次のようにして行ったことを除いては、実
施例１と同様にして、ＨＢｓ抗体測定試薬を作成した。

【００３８】ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で３
６ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解した液７．
５ｍｌに、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテッ
クス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１
ｍｌを添加し、３０℃にて６０分間攪拌した。次いで、
この液にＢＳＡを１重量％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）を添加し、３０℃にて６０分間攪拌した後、４
℃にて２０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分離した。得
られた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有する１００ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌを添加し、ラ
テックスを懸濁させた。この液を３７℃にて７日間イン
キュベーションし、ＨＢｓ抗原感作ラテックス液を調製
した。

【００３９】得られたＨＢｓ抗原感作ラテックス液を用
いて、実施例１と同様にして検量線の作成と、検体中の
ＨＢｓ抗体量を測定し、結果をそれぞれ表１、図１、表
２に示した。

【００４０】比較例１ 実施例１における（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の
調製の項を、次のようにして行ったことを除いては、実
施例１と同様にして、ＨＢｓ抗体測定試薬を作成した。

【００４１】ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で３
６ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）に溶解した液７．
５ｍｌに、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテッ
クス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１
ｍｌを添加し、３０℃にて６０分間攪拌した。次いで、
この液にＢＳＡを１重量％含有するリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０）を添加し、３０℃にて６０分間攪拌した後、４
℃にて２０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分離した。得
られた沈殿物にＢＳＡを０．５重量％含有する１００ｍ
Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌを添加し、ラ
テックスを懸濁させ、ＨＢｓ抗原感作ラテックス液を調
製した。

【００４２】得られたＨＢｓ抗原感作ラテックス液を用
いて、実施例１と同様にして検量線の作成と、検体中の
ＨＢｓ抗体量を測定し、結果をそれぞれ表１、図１、表
２に示した。

【００４３】比較例２ 実施例１における（１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の
調製の項を、比較例１のＨＢｓ抗原感作ラテックス液の
調製と同様に行ったこと、（２）検体希釈用液の調製の
項を、次のようにして行ったことを除いては、実施例１
と同様にして、ＨＢｓ抗体測定試薬を作成した。ＢＳＡ
を１重量％含有する５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に、平均分子量５０万のポリエチレングリコールを
１．０重量％、および塩化コリンが０．５Ｍの濃度にな
るように溶解した。

【００４４】得られたＨＢｓ抗原感作ラテックス液およ
び検体希釈用液を用いて、実施例１と同様にして検量線
の作成と、検体中のＨＢｓ抗体量を測定し、結果をそれ
ぞれ表１、図１、表２に示した。

【００４５】

【表１】

【００４６】

【表２】

【００４７】表１、２および図１より、ブロッキング後
の感作ラテックスをインキュベーションすることにより
低濃度まで高感度に測定可能であることが分かる。

【００４８】以下実施例３〜５において、ＡＦＰ測定試
薬の製造方法およびＡＦＰ測定方法の場合における本発
明の実施例について説明する。

【００４９】実施例３（ＡＦＰ測定試薬の製造方法およ
びＡＦＰ測定方法） （１）試薬および材料 ラテックス：平均粒径が０．３０４μｍのポリスチレン
ラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社
製）を用いた。 ラテックス希釈用緩衝液：５０ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ と
５０ｍＭのＮａＨ₂ ＰＯ₄ をｐＨ７．５０になるように
混合し、この混合液をラテックス希釈用緩衝液として用
いた。

【００５０】抗ＡＦＰ抗体：抗ＡＦＰ抗体として、ウサ
ギの抗血清からイムノグロブリン分画にまで精製したウ
サギ抗ＡＦＰ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、ＤＡＫＯ社製）を用
いた。 抗体希釈用緩衝液：上記ラテックス希釈用緩衝液を抗体
希釈用緩衝液として用いた。

【００５１】ブロッキング用緩衝液：１００ｍＭのＮａ
₂ ＨＰＯ₄ と１００ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄ をｐＨ７．４
０になるように混合し、この混合液にウシ血清アルブミ
ン（Bovine serum albumin Fraction V 、Reagent Grad
e 、Miles Corp. 社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるよう
に、またＮａＮ₃ （試薬特級、ナカライテスク社製）を
０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを、ブロ
ッキング用緩衝液として用いた。 保存用緩衝液：５０ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ と５０ｍＭの
ＮａＨ₂ ＰＯ₄ をｐＨ７．４０になるように混合し、カ
ザミノ酸（ＴＩＦＣＯ社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるよ
うに、またＮａＮ₃ （試薬特級、ナカライテスク社製）
を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを、保
存用緩衝液として用いた。

【００５２】血清検体：血清検体として、肝臓癌患者お
よび健常人の血清を用いた。 ＡＦＰ標準ヒト血清：ＡＦＰ標準ヒト血清として、ヒト
プール血清（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）に対して、予め濃
度を測定したα−フェトプロテイン（ＤＡＫＯ社製）を
希釈添加し、約５００、３００、１５０、３８、１０ｎ
ｇ／ｍｌにそれぞれ希釈して使用した。また、血液項目
用標準血清を含まない、生理食塩水のみのものを０ｎｇ
／ｍｌとした。 検体希釈用希釈液（Ｒ１液）：上記ブロッキング用緩衝
液に、ポリビニルピロリドンＫ９０（平均分子量１，２
００，０００、和光純薬工業社製）を０．５％（Ｗ／
Ｖ）になるように添加したものを検体希釈用希釈液（Ｒ
１液）として用いた。

【００５３】（２）ＡＦＰ抗体感作ラテックス試薬の調
製 上記ポリスチレンラテックス１容に、上記ラテックス希
釈用緩衝液３容を添加し、２．５％（Ｗ／Ｖ）ラテック
ス液を得た。抗ＡＦＰ抗体は、タンパク濃度が３００μ
ｇ／ｍｌになるように上記抗体希釈用緩衝液で希釈し、
抗体液とした。上記２．５％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液８
００μｌを４℃のインキュベーター中でマグネチックス
ターラーで攪拌しながら、ここへ上記抗体液８００μｌ
を素早く添加し、４℃にて１時間攪拌した。その後、上
記ブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、４℃にて
続けて２時間攪拌した。次にこの混合液を１５℃、１
５，０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した。得られた
沈澱に保存用緩衝液２．０ｍｌを添加し、上記と同様に
遠心分離をすることにより、沈澱を洗浄した。洗浄操作
は３回行った。この沈澱に保存用緩衝液を２．０ｍｌ添
加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行
い、固形分０．３０％（Ｗ／Ｖ）のラテックス試薬を得
た。このようにして調製したラテックス試薬を３５℃に
て６日間インキュベーションした。

【００５４】（３）ＡＦＰ量の測定 ラテックス試薬によるＡＦＰ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。測定条件は、次の通りである。 検体容量 ２０ μｌ 検体希釈用希釈液 １８０ μｌ ラテックス試薬 ６０ μｌ 測定波長 ７００ｎｍ 測定温度 ３７ ℃

【００５５】ラテックス試薬を添加してから約８０秒後
の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）
を測定し、この吸光度の差を１０，０００倍したものを
吸光度変化量とした。

【００５６】検体の代わりに既知濃度のＡＦＰ標準品を
用いて上記と同様の測定を行って、予め検量線を作成し
ておき、上清検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿し
て、検体中のＡＦＰ量を算出した。

【００５７】上記（１）項の全ての検体について、市販
のＥＩＡ試薬（国際試薬社製）を用いて、検体中のＡＦ
Ｐ量を測定した。方法は、キット添付の操作法に従って
行った。

【００５８】実施例４ 上記（１）項の保存用緩衝液の調製において、カザミノ
酸の濃度を、０．８％（Ｗ／Ｖ）としたこと以外、実施
例３と同様にしてラテックス試薬を調製し、ＡＦＰ測定
を行った。

【００５９】実施例５ 上記（１）項の保存用緩衝液の調製において、カザミノ
酸の濃度を、０．５％（Ｗ／Ｖ）としたこと以外、実施
例３と同様にしてラテックス試薬を調製し、ＡＦＰ測定
を行った。

【００６０】比較例３ 上記（１）項の保存用緩衝液の調製において、カザミノ
酸の代わりに、ウシ血清アルブミンを用いたこと以外、
実施例３と同様にしてラテックス試薬を調製し、ＡＦＰ
測定を行った。

【００６１】比較例４ 上記（２）項のラテックス試薬の調製において、３５℃
の代わりに２５℃でインキュベーションしたこと以外
は、実施例３と同様にしてラテックス試薬を調製し、Ａ
ＦＰ測定を行った。

【００６２】実施例３〜５及び比較例３・４の結果を、
表３及び図２に示した。図２より、実施例では比較例に
比べて、低濃度までより高感度に測定可能であることが
分かる。

【００６３】

【表３】

【００６４】

【発明の効果】本発明によれば、このように、特異的な
シグナルの大きさを減ずることなく、バックグラウンド
・シグナルを低減することにより低濃度領域まで高感度
に、かつ、容易に測定可能な免疫測定試薬の製造方法お
よび得られた免疫測定試薬を用いる免疫測定法が提供さ
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】標準ＨＢｓ抗体液の濃度と得られたΔＡｂｓの
関係を示す検量線を示した図。

【図２】本発明のラテックス凝集法でＡＦＰ測定を行っ
た結果とＥＩＡ法でＡＦＰ測定を行った結果の関係を示
す図。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不溶性担体に被測定物質である抗原（ま
   たは抗体）に対応する抗体（または抗原）を感作した
   後、該不溶性担体をブロッキング処理し、次いで、免疫
   学的に不活性なタンパク質、及び／または、免疫学的に
   不活性なタンパク質の加水分解物を含む溶液中でインキ
   ュベーションすることを特徴とする免疫測定試薬の製造
   方法。
2. 【請求項２】 インキュベーション時の温度が３０〜４
   ０℃であることを特徴とする請求項１記載の免疫測定試
   薬の製造方法。
3. 【請求項３】 被測定物質である抗原（または抗体）に
   対応する抗体（または抗原）が、ＨＢｓ抗原または抗ヒ
   トα−フェトプロテイン抗体であることを特徴とする請
   求項１又は２記載の免疫測定試薬の製造方法。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項記載の製造
   方法によって得られた免疫測定試薬と被測定物質含有試
   料とを接触させ、免疫測定試薬と被測定物質との抗原抗
   体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出す
   ることにより、被測定物質を測定することを特徴とする
   免疫測定法。