JPH11337550A

JPH11337550A - 免疫測定試薬および免疫測定法

Info

Publication number: JPH11337550A
Application number: JP14614698A
Authority: JP
Inventors: Ryoko Kono; 良子河野; Makoto Takahara; 誠高原
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-05-27
Filing date: 1998-05-27
Publication date: 1999-12-10

Abstract

(57)【要約】【課題】特異的な抗原抗体反応を抑制することなく、
検体中成分の非特異的凝集反応を低減し、検体中の被測
定物質である抗原（または抗体）を、感度および特異性
良く検出または定量できる免疫測定試薬および免疫測定
法を提供する。【解決手段】被測定物質である抗原（または抗体）と
の抗原抗体反応により生じる不溶性担体の凝集の度合い
を検出することにより、被測定物質を測定するための免
疫測定試薬であって、被測定物質である抗原（または抗
体）に対する抗体（または抗原）および重合ウシ血清ア
ルブミンが感作された不溶性担体（例、ラテックス粒
子）が構成成分として含まれる免疫測定試薬。上記の免
疫測定試薬と被測定物質である抗原（または抗体）との
抗原抗体反応により生じる不溶性担体の凝集の度合いを
検出することにより、被測定物質を測定する免疫測定
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、不溶性担体を使用
した免疫凝集反応に基づいて被測定物質を測定するため
に用いられ、試料中吸着成分による非特異的凝集反応が
抑制され、かつ検出感度の高い免疫測定試薬および免疫
測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】以下、本明細書において、一文章中に、
抗原（または抗体）という表現と、抗体（または抗原）
という表現がある場合、括弧内は括弧内同士が対応し、
括弧外は括弧外同士が対応しているものとする。

【０００３】体液中の微量成分等の測定法のひとつとし
て、目的とする被測定物質である抗原（または抗体）に
対する抗体（または抗原）を不溶性担体に担持させ、被
測定物質との抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝
集の度合いを検出することにより、被測定物質を測定す
る方法がある。このような測定法としては、ラテックス
凝集法、赤血球凝集法等が知られている。

【０００４】例えば、このラテックス凝集法では、測定
すべき抗原（または抗体）に対応する抗体（または抗
原）がその表面に吸着されたラテックス粒子が用いられ
る。このようなラテックス粒子は、緩衝液等の媒体中に
浮遊され、検体と混合される。検体中の抗原（または抗
体）と、ラテックス粒子表面上の抗体（または抗原）と
が、抗原抗体反応を起こし、結合する。検体中の抗原
（または抗体）は、抗原決定基を通常複数有するので検
体中の抗原（または抗体）を介してラテックス粒子が架
橋され凝集する。この凝集の程度は、検体中の測定すべ
き抗原（または抗体）の量に比例するので、この凝集の
程度を測定することによって検体中の抗原（または抗
体）を定量することができる。この凝集の程度は該混合
液の吸光度や光の透過率を分光光度計によって測定する
ことによって簡単に測定できる。この方法は、感度が高
く、測定方法が簡便で、大がかりな装置を必要としない
ので広く用いられている。また、被測定物質の定性的な
検出方法として、凝集の有無を肉眼で判定する方法も盛
んに行われている。

【０００５】しかし、上記のような測定法において、血
清のような検体の中に含まれる被測定物質を測定する場
合、被測定物質である抗原（または抗体）を含む陽性血
清のみならず、これらの抗原（または抗体）を含まない
陰性血清に対しても、凝集反応を起こすことがある。こ
のような凝集反応は非特異的凝集反応と呼ばれており、
これが特異性の低下を引き起こし、測定の正確性、精密
性を低下させる。すなわち、特異性の高い免疫凝集測定
試薬を得たり、免疫凝集測定法を確立するには前記の検
体中成分による非特異的反応を抑制することが重要とな
る。

【０００６】非特異的反応を抑制する方法としては、従
来から抗体（または抗原）を結合させたラテックス粒子
のような担体に、ゼラチン、牛血清アルブミン等の蛋白
質、または界面活性剤を物理吸着させておくことが提案
されている。

【０００７】また、特開平３−９４１６１号公報には、
ラテックス粒子に抗体（または抗原）を感作した後、ラ
テックス固形分に対し、３〜２０重量倍の免疫学的に不
活性な蛋白質で処理して得られるラテックス試薬が提案
されている。

【０００８】しかしながら、担体に、ゼラチン、牛血清
アルブミン等の蛋白質、または界面活性剤を物理吸着さ
せておく方法、担体に感作後、ラテックス固形分に対
し、３〜２０重量倍の免疫学的に不活性な蛋白質で処理
する方法のいずれの場合にも、非特異的凝集反応を抑制
する効果はある程度あるものの、同時に特異的な抗原抗
体反応までも抑制してしまう問題があった。特に検体中
に被測定物質が低濃度にしか含まれない場合、測定感度
が十分確保できなくなるために、測定値の信頼性（再現
性など）が低下する問題があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題を
解決するものであり、その目的は、特異的な抗原抗体反
応を抑制することなく、検体中成分の非特異的凝集反応
を低減し、検体中の被測定物質である抗原（または抗
体）を、感度および特異性良く検出または定量できる免
疫測定試薬および免疫測定法を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記問題を
解決するために鋭意研究した結果、被測定物質である抗
原（または抗体）との抗原抗体反応により生じる不溶性
担体の凝集の度合いを検出することにより、被測定物質
を測定するための免疫測定法において、被測定物質であ
る抗原（または抗体）に対する抗体（または抗原）およ
び重合ウシ血清アルブミンが感作された不溶性担体が構
成成分として含まれる免疫測定試薬を用いることによ
り、特異的な抗原抗体反応を抑制することなく、検体中
成分の非特異的凝集反応を低減できることを見い出し、
本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち、本発明の免疫測定試薬は、被測
定物質である抗原（または抗体）との抗原抗体反応によ
り生じる不溶性担体の凝集の度合いを検出することによ
り、被測定物質を測定するための免疫測定試薬であっ
て、被測定物質である抗原（または抗体）に対する抗体
（または抗原）および重合ウシ血清アルブミンが感作さ
れた不溶性担体が構成成分として含まれることを特徴と
する。

【００１２】本発明の免疫測定法は、請求項１記載の免
疫測定試薬と被測定物質である抗原（または抗体）との
抗原抗体反応により生じる不溶性担体の凝集の度合いを
検出することにより、被測定物質を測定することを特徴
とする。

【００１３】以下、本発明の免疫測定試薬ついて説明す
る。本発明の免疫測定試薬は、被測定物質である抗原
（または抗体）に対する抗体（または抗原）および重合
ウシ血清アルブミンが感作された不溶性担体が構成成分
として含まれる。

【００１４】上記重合ウシ血清アルブミンとは、ウシ血
清アルブミン単位が共有ペプチド結合によりつながって
いる物質である。重合ウシ血清アルブミンの重合度は、
２〜５０が好ましく、２〜１０がより好ましい。重合度
が大きくなりすぎると、重合ウシ血清アルブミンの分子
量が大きくなりすぎるため、被測定物質である抗原（ま
たは抗体）に対する抗体（または抗原）を感作した不溶
性担体と被測定物質との抗原抗体反応を立体障害により
阻害し、結果として感度を低下させる。

【００１５】重合ウシ血清アルブミンを得るには、ウシ
血清アルブミンを用いてペプチド結合を形成させる方法
によればよい。ペプチド結合を形成させる方法は、従来
のいずれの方法も可能であり、例えば、カルボジイミド
法が挙げられる。

【００１６】上記不溶性担体としては、例えば、有機高
分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球および細胞膜片
等が挙げられる。有機高分子粉末としては、ラテックス
粒子、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキスト
ラン等が例示でき、好ましくはラテックス粒子の懸濁液
が用いられる。ラテックスとしては、例えばポリスチレ
ン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタク
リル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−
ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル
酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル
共重合体が挙げられる。用いるラテックスの平均粒径
は、測定対象物の検出濃度あるいは測定機器によって適
宜選択されるが、０．０５〜１．０μｍが好ましい。無
機物質粉末としてはシリカ、アルミナ等や、金、チタ
ン、鉄、ニッケルのような金属片等が例示される。

【００１７】上記被測定物質である抗原（または抗体）
としては、特に限定されず、一般に抗原抗体反応を利用
して測定し得る生理活性物質はいずれも測定可能であ
る。被測定物質としては、タンパク、脂質等があり、よ
り詳しくは、抗原としては、例えば、各種抗原、レセプ
ター、酵素等が挙げられる。具体的には、Ｃ反応性たん
ぱく（ＣＲＰ）、ヒトフィブリノーゲン、フェリチン、
リウマチ因子、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、ＨＢ
Ｓ抗原等が例示される。抗体としては、例えば、各種の
毒素や病原菌などに対する抗体が挙げられ、具体的に
は、抗ストレプトリジンＯ抗体、梅毒トレポネーマ抗
体、梅毒脂質抗原に対する抗体、ＨＢＳ抗体、ＨＢｃ抗
体、ＨＢｅ抗体等が例示される。

【００１８】被測定物質である抗原（または抗体）に対
する抗体（または抗原）および重合ウシ血清アルブミン
が感作された不溶性担体を製造する際に用いられる抗体
としては、免疫グロブリン分子自体のほか、例えば、Ｆ
（ａｂ' ）₂のような断片であってもよい。抗原として
は、生体成分由来のもの、培養で得られたもの、化学合
成されたもの、遺伝子組換え等の技術によって得られた
もの、またはこれらの処理物など特に限定されない。

【００１９】被測定物質である抗原（または抗体）に対
する抗体（または抗原）および重合ウシ血清アルブミン
が感作された不溶性担体の製造方法としては、不溶性担
体に被測定物質である抗原（または抗体）に対する抗体
（または抗原）および重合ウシ血清アルブミンを同時、
または別々に、公知の方法により、物理的または化学的
結合により感作させる。別々に感作させる場合、抗体
（または抗原）と重合ウシ血清アルブミンの感作の順序
はどちらが先でもよいが、好ましくは、抗体（または抗
原）の感作が先の方がよい。

【００２０】重合ウシ血清アルブミンを感作させる際に
は、重合ウシ血清アルブミンを公知の方法により、物理
的または化学的結合により感作させればよく、例えば、
不溶性担体に対し、０．１〜３０重量倍の重合ウシ血清
アルブミンを添加し５分以上接触させればよい。好まし
くは、不溶性担体に対し、０．１〜２０重量倍の重合ウ
シ血清アルブミンを添加し１０分〜１２時間接触させれ
ばよい。上記重合ウシ血清アルブミンの添加量が低すぎ
ると、検体中成分の非特異的凝集反応の低減効果が不十
分となり、また高すぎると、抗原抗体反応を阻害してし
まい十分な反応性が得られなくなる。

【００２１】上記感作された不溶性担体から構成される
免疫測定試薬において、更に非特異的凝集反応を抑制す
るため、または試薬の安定性を高めるために、アルブミ
ン、カゼイン、ゼラチンなどのタンパク質、またはその
分解物、またはアミノ酸、界面活性剤等を該不溶性担体
に更に感作してもよい。

【００２２】本発明の免疫測定試薬には、被測定物質に
対する抗体（または抗原）および重合ウシ血清アルブミ
ンが感作された不溶性担体が構成成分として含まれる
が、他の構成成分としては、例えば、上記不溶性担体を
懸濁させるための緩衝液や反応時に使用される緩衝液な
どが挙げられる。

【００２３】本発明の免疫測定試薬を用いる免疫測定法
は、本発明の免疫測定試薬と被測定物質である抗原（ま
たは抗体）との抗原抗体反応により生じる不溶性担体の
凝集の度合いを検出することにより、被測定物質を測定
する。

【００２４】凝集反応によって生じた凝集の度合いは、
光学的に測定または目視観察することにより検出され
る。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に検
出する方法では、散乱光強度、吸光度または透過光強度
の増加または減少を測定すればよい。また、これらの方
法を併用してもよい。

【００２５】不溶性担体の凝集の程度を肉眼で判定する
試薬では、通常、検体と感作不溶性担体を含む溶液を判
定板上で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝集の有
無を判定する。凝集判定には、単に肉眼判定以外に、凝
集状態をビデオカメラで撮影し、画像処理を施すことも
可能である。

【００２６】上記抗原抗体反応の条件は通常の条件と同
様でよく、反応媒体としては、被測定物質の種類に応じ
た各種緩衝液が適宜選ばれる。この緩衝液は、被測定物
質を失活させることがなく、かつ抗原抗体反応を阻害し
ないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよ
い。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩
衝液が使用される。反応のｐＨは、５〜１０、特に６〜
８が好ましい。反応温度は０〜５０℃、特に２０〜４０
℃が好ましい。反応時間は適宜決められる。反応時に
は、感度を高めるために、反応系に、ポリエチレングリ
コール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、
ポリビニルピロリドン、ポリ（グリコシルエチルメタク
リレート）、プルランなどの水溶性高分子を、特異性を
高めるために、塩化コリン等の第４級アンモニウム塩、
ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオン（Ｃｌ
^-、Ｉ^-、ＳＣＮ^-等）、ゼラチンなどを添加すること
も可能である。

【００２７】本発明によれば、上記重合ウシ血清アルブ
ミンの働きにより、非特異的凝集反応が抑制される。

【００２８】

【実施例】以下に、本発明の実施例を述べ、その効果を
具体的に説明する。

【００２９】以下の実施例および比較例においては、Ｈ
ＢＳ抗体測定試薬を作製し、測定した。実施例１（１）ＨＢＳ抗原および重合ウシ血清アルブミン感作ラ
テックス液の調製ＨＢＳ抗原を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液７．５ｍｌに、
平均粒径０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分
１０重量％、積水化学工業社製）１ｍｌとリン酸−食塩
緩衝液（３６ｍＭリン酸緩衝液、１００ｍＭＮａＣ
ｌ、ｐＨ６．６、以下、ＰＢＳという）６．５ｍｌを添
加し、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液
に、重合ウシ血清アルブミン（重合ウシ血清アルブミン
液、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティック社製）
を１．０重量％含有するＰＢＳ１５ｍｌを添加し、２５
℃にて６０分間攪拌した後、この混合液を１８０００ｒ
ｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物に、ウシ血清アル
ブミン（マイルス社製、以下、ＢＳＡという）を０．５
重量％含有するＰＢＳ１００ｍｌを添加し、ラテックス
を懸濁させ、ＨＢＳ抗原および重合ウシ血清アルブミン
感作ラテックス液を調製した。

【００３０】（２）検体希釈液の調製ＰＢＳにポリエチレングリコール（和光純薬社製、平均
分子量：５０万）を０．４重量％、およびＢＳＡを１．
０重量％濃度になるように溶解した。

【００３１】（３）ＨＢＳ抗体測定試薬本実施例のＨＢＳ抗体測定試薬は、上記（１）項のＨＢ
Ｓ抗原および重合ウシ血清アルブミン感作ラテックス液
からなる第１試薬と、上記（２）項の検体希釈液からな
る第２試薬とから構成される２液系の試薬である。

【００３２】（４）標準ＨＢＳ抗体液ＨＢＳ抗体を０、１５０、３００、６００、１２００ｍ
ＩＵ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を使用した。

【００３３】（５）測定用血清健常人血清を１０検体と、Ｂ型肝炎に既往歴があるＨＢ
Ｓ抗体陽性血清５検体を使用した。

【００３４】（６）測定方法標準ＨＢＳ抗体液２０μｌに、上記（２）項の検体希釈
液１２０μｌを混合し、３７℃で適時保持した後、上記
（１）項のＨＢＳ抗原および重合ウシ血清アルブミン感
作ラテックス液１２０μｌを添加攪拌し、この後、１分
後および５分後の波長７５０ｎｍでの吸光度を測定し
た。この間の吸光度の変化量を吸光度変化量（ΔＡｂ
ｓ）とする。測定は日立自動分析装置７１５０形を用い
て行った。得られた吸光度変化量（ΔＡｂｓ）と標準Ｈ
ＢＳ抗体濃度からＨＢＳ抗体の検量線を作成した。次い
で、標準ＨＢＳ抗体液の代わりに、上記（５）項で用意
した血清を用いたことの他は、同様の操作を行い、ΔＡ
ｂｓを求めた。上記で作成した検量線を用いて、それぞ
れの血清のΔＡｂｓからＨＢＳ抗体濃度を求めた。測定
結果を表１に示した。なお、測定結果については、カッ
トオフポイントを３０ｍＩＵ／ｍｌに設定し、ＨＢＳ抗
体濃度測定値が３０ｍＩＵ／ｍｌ未満の場合はＨＢＳ抗
体陰性（−）、３０ｍＩＵ／ｍｌ以上の場合はＨＢＳ抗
体陽性（＋）と判定し、表１に示した。

【００３５】比較例１実施例１における（１）項を次のようにして行ったこと
を除いては、実施例１と同様にして、ＨＢＳ抗体測定試
薬を作成し、実施例１と同様にして標準ＨＢＳ抗体液お
よび測定用血清の測定を行い、結果を表１に示した。（１）ＨＢＳ抗原およびＢＳＡ感作ラテックス液の調製ＨＢＳ抗原を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液７．５ｍｌに、
平均粒径０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分
１０重量％、積水化学工業社製）１ｍｌとＰＢＳ６．５
ｍｌを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した。次いで、
この液に、ＢＳＡを１．０重量％含有するＰＢＳ１５ｍ
ｌを添加し、２５℃にて６０分間攪拌した後、この混合
液を１８０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物
に、ＢＳＡを０．５重量％含有するＰＢＳ１００ｍｌを
添加し、ラテックスを懸濁させ、ＨＢＳ抗原およびＢＳ
Ａ感作ラテックス液を調製した。

【００３６】

【表１】

【００３７】表１から明らかなように、健常人血清中の
数例で、実施例１では陰性と判定されているにもかかわ
らず、比較例１では陽性と判定されているものがある。
これは、比較例１の免疫測定試薬では非特異的な凝集反
応が起こっていることを示している。

【００３８】

【発明の効果】本発明の免疫測定試薬の構成は上述の通
りであり、本発明によると、不溶性担体を使用し免疫凝
集反応に基づく被測定物質の測定において、特異的な抗
原抗体反応を抑制することなく、検体中成分の非特異的
反応を低減することができ、高い検出感度で特異性の高
い免疫測定試薬が提供される。

【００３９】本発明の免疫測定法の構成は上述の通りで
あり、本発明の免疫測定法によると、不溶性担体を使用
し免疫凝集反応に基づく被測定物質の測定において、特
異的な抗原抗体反応を抑制することなく、検体中成分の
非特異的反応を低減することができ、高い検出感度で特
異性の高い免疫測定法が提供される。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被測定物質である抗原（または抗体）と
の抗原抗体反応により生じる不溶性担体の凝集の度合い
を検出することにより、被測定物質を測定するための免
疫測定試薬であって、被測定物質である抗原（または抗
体）に対する抗体（または抗原）および重合ウシ血清ア
ルブミンが感作された不溶性担体が構成成分として含ま
れることを特徴とする免疫測定試薬。
【請求項２】請求項１記載の免疫測定試薬と被測定物
質である抗原（または抗体）との抗原抗体反応により生
じる不溶性担体の凝集の度合いを検出することにより、
被測定物質を測定することを特徴とする免疫測定法。