JP2003344410A

JP2003344410A - 免疫測定試薬及び免疫測定法

Info

Publication number: JP2003344410A
Application number: JP2002149710A
Authority: JP
Inventors: Osamu Hirata; 治平田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2002-05-23
Filing date: 2002-05-23
Publication date: 2003-12-03

Abstract

(57)【要約】【課題】検体とラテックス粒子に固定した抗原（又は
抗体）との抗原抗体反応を利用した免疫測定試験法に用
いるための試薬であって、ラテックス粒子に感作した抗
原（又は抗体）の脱離やコンホーメーション変化等によ
る失活が起こりにくく、高感度で保存安定性に優れた免
疫測定試薬を提供する。【解決手段】被測定物質に対する抗原（又は抗体）及
び免疫学的に不活性なタンパク質がアミド結合を介して
結合したラテックス粒子が懸濁した緩衝液からなる免疫
測定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高感度で保存安定
性に優れた免疫測定試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、各種の生体成分から特定の被測定
物質を検出又は定量する方法として、被測定物質とその
抗体（又は抗原）との凝集反応を、肉眼にて観察又は光
学的に検出する方法が広く行われている。近年では、こ
の方法の検出感度を向上するのに、被測定物質に対する
抗原（又は抗体）を不溶性担体に感作し、被測定物質と
の抗原抗体反応により生じた不溶性担体の凝集の度合い
を検出する方法が開発されている。このような測定法と
してはラテックス凝集法、赤血球凝集法等がある。

【０００３】これらのラテックス凝集法、赤血球凝集法
等における不溶性担体に抗原（又は抗体）を感作する方
法としては、通常、不溶性担体と抗原（又は抗体）との
疎水性相互作用による物理的吸着法が採られ、得られた
不溶性担体と抗原(又は抗体)との複合体を免疫学的に不
活性なタンパク質を溶解した緩衝液に懸濁した試薬の状
態で保存するのが一般的である。

【０００４】しかし、このようにして調製された試薬で
は、試薬を作製する条件により担体同士の自己凝集が起
こったり、感作した抗原（又は抗体）の脱離等が起こっ
たりして試薬の反応性が低下し、本来の測定性能が発揮
できない場合があった。また、好適な条件にて調製され
た試薬であっても、長期間の保存によりやはりかかる原
因による性能変化が発生する場合があった。

【０００５】これに対して、不溶性担体と抗原（又は抗
体）とを化学的に結合させることにより抗原（又は抗
体）の脱離を防止して試薬の安定性を向上し、更に測定
感度をも向上させる方法が試みられている。例えば、特
開昭５９−１９２９６０号公報には、カルボキシル基を
導入したポリスチレンラテックスを水溶性カルボジイミ
ドにて活性化処理した後、抗原（又は抗体）をアミド結
合により結合させる方法が開示されている。また、この
方法を更に改良した方法として、末反応活性化カルボキ
シル基を除去するために低分子量のアミンにて後処理を
行う方法も提案されている。他にも、不溶性担体上の疎
水性部分に対する非特異的な検体中成分の吸着を防止す
るため、アミン処理の後に免疫学的に不活性なタンパク
質（例えばアルブミン等）を物理的に吸着させてブロッ
キングを行う方法等も提案されている。

【０００６】しかしながら、これらの方法により調製さ
れた試薬では、感作された抗原（又は抗体）の脱離は発
生しないものの、抗原（又は抗体）の種類によっては結
合後のコンホーメーション変化等による失活が発生し、
期待された安定化効果が得られないことがあるという問
題があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、高感度で保存安定性に優れた免疫測定試薬を提供
することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意検討
を重ねた結果、ラテックス粒子に被測定物質に対する抗
原（又は抗体）に加えて、免疫学的に不活性なタンパク
質もアミド結合を介して結合させることにより、試薬の
安定性が飛躍的に向上することを見いだし、本発明を完
成させるに至った。本発明は、被測定物質に対する抗原
（又は抗体）及び免疫学的に不活性なタンパク質がアミ
ド結合を介して結合したラテックス粒子が懸濁した緩衝
液からなることを特徴とする免疫測定試薬である。以下
に本発明を詳述する。

【０００９】本発明の免疫測定試薬においては、ラテッ
クス粒子に測定物質に対する抗原（又は抗体）及び免疫
学的に不活性なタンパク質がアミド結合を介して結合し
ている。上記ラテックス粒子としては特に限定されない
が、例えば、カルボキシル化ポリスチレン、アミノ化ポ
リスチレン、アミノ基を持つカルボキシル化ポリスチレ
ン、カルボキシル化アクリロニトリル、カルボキシル化
スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アミノ化ス
チレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸
重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジ
エン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エス
テル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合
体、ポリビニルピリジン等からなるものが好適に用いら
れる。

【００１０】上記ラテックス粒子は、被測定物質に対す
る抗原（又は抗体）及び免疫学的に不活性なタンパク質
の有する第１級アミン及び／又は第２級アミン、カルボ
キシル基と縮合反応によりアミド結合を形成することの
できる活性な官能基を有する。かかる活性な官能基とし
ては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、第２級
アミン、第１級アミン、クロロメチル基、アルデヒド
基、エポキシ基、ニトリル基、アミド基、ヒドラジド
基、それらに代り得る官能基等が挙げられる。上記ラテ
ックス粒子は、これらの官能基を１種類のみ有していて
もよいし、２種以上を有していてもよい。

【００１１】上記抗原（又は抗体）としては特に限定さ
れず、公知のものが使用できるが、具体的には例えば、
変性γ−グロブリン、リウマチ因子、ストレプトリジン
Ｏ（ＳＬＯ）、抗ＳＬＯ抗体、カルジオライピン、抗カ
ルジオライピン抗体、インスリン、抗インスリン抗体、
Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、抗ＣＲＰ抗体、α−フェトプ
ロティン（ＡＦＰ）、抗ＡＦＰ抗体、癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ）、抗ＣＥＡ抗体、ＨＢｓ抗原、抗ＨＢｓ抗体、抗
トレポネーマ抗体に対する抗原、ＨＣＶ抗原等が挙げら
れる。なかでも、ストレプトリジンＯは、従来のように
物理的吸着法によりラテックスに固定化した場合、保存
中に脱離したりコンホーメーション変化が起こったりし
て安定な試験を行うことが困難であったが、本発明の免
疫測定試薬では極めて安定した試験を行うことができ
る。これらの抗原（又は抗体）としては、生体由来のも
のであってもよく、遺伝子組換え等の技術を用いて得ら
れたものであってもよく、更にそれらの処理物であって
もよい。

【００１２】上記免疫学的に不活性なタンパク質として
は特に限定されず公知のものを用いることができ、例え
ば、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等が挙げられる。
なかでも、血清アルブミンが好適に用いられる。

【００１３】上記ラテックス粒子と上記抗原（又は抗
体）及び上記免疫学的に不活性なタンパク質とは、アミ
ド結合を介して結合している。具体的には、上記抗原
（又は抗体）及び上記免疫学的に不活性なタンパク質の
有する第１級アミン及び／又は第２級アミン、カルボキ
シル基と、上記ラテックス粒子の表面に設けた上記活性
な官能基とが縮合反応によりアミド結合を形成して結合
している。アミド結合により結合することにより、保存
中に抗原（又は抗体）や免疫学的に不活性なタンパク質
が脱離したりすることがなく、またこれらのコンホーメ
ーション変化も起こりにくく、安定した試験を行うこと
ができる。

【００１４】本発明の免疫測定試薬では、上記被測定物
質に対する抗原（又は抗体）及び免疫学的に不活性なタ
ンパク質が結合したラテックス粒子は緩衝液に懸濁して
いる。上記緩衝液としては特に限定されず、リン酸緩衝
液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、各種グッド緩衝液
等の公知の緩衝液等が挙げられる。

【００１５】上記緩衝液は、免疫学的に不活性なタンパ
ク質を含有することが好ましい。かかる免疫学的に不活
性なタンパク質としては、例えば、アルブミン、カゼイ
ン、ゼラチン等及びその分解物、変性物等が挙げられ、
なかでも血清アルブミンが好適に用いられる。上記緩衝
液における免疫学的に不活性なタンパク質の濃度の好ま
しい下限は０．１重量％、上限は８重量％、より好まし
い下限は３重量％、上限は６重量％である。

【００１６】本発明の免疫測定試薬を作製する方法とし
ては特に限定されず、例えば、ラテックス粒子上の官能
基を活性化させた後、上記抗原（又は抗体）及び免疫学
的に不活性なタンパク質をアミド結合を介して結合させ
る方法等が挙げられる。上記官能基を活性化させる方法
としては、活性基の種類により公知の適当な方法を選択
できるが、例えば、水溶性カルボジイミド（例えば、Ｗ
ＳＣ：１Ｅｔｈｙｌ３−（３−ＤｉｍｅｔｈｙｌＡｍ
ｉｎｏＰｒｏｐｙｌ）ＣａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅＨ
Ｃｌ）を用いる方法、グルタルアルデヒドを用いる方法
等が好適に用いられる。また、官能基の種類によっては
活性化を必用としない場合もある。

【００１７】上記抗原（又は抗体）及び免疫学的に不活
性なタンパク質をラテックス粒子に結合させる順序とし
ては、最終的に両者がラテックス粒子にアミド結合を介
して結合されるのならば特に限定されず、（１）抗原
（又は抗体）を結合させた後に免疫学的に不活性なタン
パク質を結合させる方法、（２）同時に結合させる方
法、（３）免疫学的に不活性なタンパク質を結合させた
後に抗原（又は抗体）を結合させる方法のいずれでもよ
い。

【００１８】かかる方法にて作製した抗原（又は抗体）
及び免疫学的に不活性なタンパク質が結合したラテック
ス粒子を、常法により上記懸濁液に懸濁させることによ
り、本発明の免疫測定試薬が得られる。

【００１９】本発明の免疫測定試薬を用いる免疫測定法
もまた、本発明の１つである。本発明の免疫測定法とし
ては、本発明の免疫測定試薬を用いるのであれば特に限
定されず、通常の方法により行うことができる。例え
ば、被測定物質を含む媒体に本発明の免疫測定試薬を加
え、被測定物質と本発明の免疫測定試薬に含まれるラテ
ックス粒子上に固定された抗原（又は抗体）とが抗原抗
体反応により結合して生じた凝集を光学的に観察または
目視により観察する。反応のｐＨの好ましい下限は５、
上限は１０であり、より好ましい下限は６、上限は９で
ある。反応の温度の好ましい下限は０℃、上限は５０℃
であり、より好ましい下限は２０℃、上限は４０℃であ
る。反応時間は適宜決められる。

【００２０】上記媒体としては、被測定物質の種類に応
じて適当な各種緩衝液が用いられる。かかる緩衝液とし
ては、被測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原
抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有する
ものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩
衝液、トリス緩衝液、各種グッド緩衝液等の公知の緩衝
液が挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよ
く、２種以上を併用してもよい。

【００２１】上記媒体は、反応の感度を高めるために公
知の水溶性添加剤、例えばポリエチレングリコール、カ
ルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキ
ストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチ
ルメタクリレート、プルラン、デキストラン、エルシナ
ン等の水溶性高分子等を含有してもよい。また、特異性
の向上、試薬の安定性向上等の目的から、カゼイン、ゼ
ラチン等のタンパク質又はその分解物、変性物；塩化コ
リン等の第４級アンモニウム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオ
ン、カオトロピックイオン（Ｃｌ−，Ｉ−，ＳＣＮ−
等）、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。

【００２２】上記抗原抗体反応によって生じた凝集の度
合いは、光学的に観察又は目視により観察することによ
り検出される。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を
光学的に検出する方法としては、例えば、散乱光強度、
吸光度又は透過光強度の増加又は減少を測定する方法等
が挙げられる。また、目視により観察して判定する方法
としては、例えば、試料と本発明の免疫測定試薬とを判
定板上で混合し、１〜５分間揺り動かしたあと、凝集の
有無を判定する方法等が挙げられる。また、像を撮影し
画像処理を施してもよい。

【００２３】本発明の免疫測定法は、保存安定性に優れ
る本発明の免疫測定試薬を用いることにより、比較的長
期の免疫測定試薬の保存期間中いつでも高感度な試験を
行うことができる。とりわけ、従来の免疫測定試薬では
試薬の調製後短時間のうちに行わねばならなかった抗ス
トレプトリジンＯ抗体価の測定に有効である。

【００２４】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００２５】（実施例１）５重量％濃度のカルボキシル
基導入ラテックス粒子（積水化学工業社製）１ｍＬを遠
心洗浄し、ｐＨ４．５のリン酸緩衝液１ｍＬに再懸濁し
た。これに１重量％カルボジイミド（１Ｅｔｈｙｌ３−
（３−ＤｉｍｅｔｈｙｌＡｍｉｎｏＰｒｏｐｙｌ）
ＣａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅＨＣｌ）１ｍＬを加え４時
間攪拌した後、遠心洗浄し、０．２Ｍのホウ酸緩衝液
（ｐＨ８．０）２ｍＬに再懸濁し活性化ラテックス粒子
とした。

【００２６】得られた活性化ラテックス粒子に、ストレ
プトリジンＯを１ｍｇ／ｍＬの濃度で０．２Ｍホウ酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に溶解した液１ｍＬを添加し、室温
にて１時間攪拌した。次いで、ウシ血清アルブミンを１
重量％の濃度で０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）に
溶解した液１ｍＬを加え、更に室温にて１時間攪拌し
た。次いでこの液に、０．２ＭのエタノールアミンＨＣ
ｌのホウ酸緩衝液溶液を２ｍＬ添加し、室温にて１時間
撹攪拌した後、遠心洗浄した。得られた沈澱物に、ウシ
血清アルブミンを３重量％含有するトリス酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）１５ｍＬを添加してラテックスを再懸濁さ
せ、免疫測定試薬を調製した。

【００２７】（比較例１）ストレプトリジンＯの活性化
ラテックス粒子ヘの添加に続く１重量％ウシ血清アルブ
ミン溶液の代わりにホウ酸緩衝液のみを添加した以外は
実施例１と同様にして免疫測定試薬を作製した。

【００２８】（比較例２）実施例１で作製した活性化ラ
テックス粒子に、０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）
１ｍＬを添加し、室温にて１時間攪拌した。次いで、
０．２Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬを加え、更
に室温にて１時間攪拌した。次いでこの液に、０．２Ｍ
のエタノールアミンＨＣｌのホウ酸緩衝液溶液を２ｍＬ
添加し、室温にて１時間撹攪拌した後、遠心洗浄した。
得られた沈澱物に、２重量％ＢＳＡを含むトリス緩衝液
４ｍＬを加えて３０℃にて１時間攪拌した後、ウシ血清
アルブミンを３重量％含有するトリス酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１５ｍＬを添加してラテックスを再懸濁させ、
免疫測定試薬を調製した。

【００２９】実施例１及び比較例１、２で作製した免疫
測定試薬を４℃及び４０℃で３日間保存した。なお、４
０℃３日間の保存は、４℃１年以上の保存に相当するも
のである。保存後の免疫測定試薬を用いて、以下の方法
により標準品について各々の免疫測定試薬を用いて得ら
れた吸光度変化量（ΔＡｂｓ）を求め、４℃３日間保存
後の免疫測定試薬を用いた場合の結果を１００％とした
場合の４０℃３日間保存後の免疫測定試薬を用いた場合
の結果を残存率（％）として算出した。結果を表１に示
した。

【００３０】（標準品を用いた試験方法）測定用の標準
液として、１８０ＩＵ／ｍＬの抗ストレプトリジンＯ陽
性血清を５％ＢＳＡを含むＰＢＳにて希釈して調製した
列（０、２０、６０、１００、１４０、１８０ＩＵ／ｍ
Ｌ）を使用した。この抗トレポネーマ抗体標準液５μｌ
を取り、これに牛血清アルブミンを１重量％含有するト
リス緩衝液（ｐＨ７．０）にポリグリコシルエチルメタ
クリレート０．２重量％を添加し溶解した緩衝液（第１
試薬）３５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した後、
免疫測定試薬（第２試薬）５０μｌを添加攪拌し、この
後、約８０秒から３００秒間の波長７００ｎｍでの吸光
度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とし
た。吸光度の測定には日立社製の自動分析装置７１５０
形を使用した。

【００３１】

【表１】

【００３２】表１より、実施例１で作製した免疫測定試
薬では、４０℃３日間保存後でも高い残存率を示し、極
めて保存性に優れていることが判った。一方、免疫学的
に不活性なタンパクがアミド結合していないラテックス
粒子を用いた比較例１で作製した免疫測定試薬、及び、
更に比較例１に物理的吸着によるブロッキング操作を加
えた比較例２で作製した免疫測定試薬では、いずれも４
０℃３日間保存後には残存率が大幅に減少していること
がわかった。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、高感度で保存安定性に
優れた免疫測定試薬を提供できる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被測定物質に対する抗原（又は抗体）及
び免疫学的に不活性なタンパク質がアミド結合を介して
結合したラテックス粒子が懸濁した緩衝液からなること
を特徴とする免疫測定試薬。
【請求項２】被測定物質に対する抗原は、ストレプト
リジンＯであることを特徴とする請求項１記載の免疫測
定試薬。
【請求項３】免疫学的に不活性なタンパク質は、血清
アルブミンであることを特徴とする請求項１又は２記載
の免疫測定試薬。
【請求項４】請求項１記載の免疫測定試薬を用いるこ
とを特徴とする免疫測定法。
【請求項５】請求項２又は３の免疫測定試薬を用いる
ことを特徴とする抗ストレプトリジンＯ抗体価の免疫測
定法。