JP7352842B2 - 改変型ストレプトリジンo - Google Patents
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Description
この改変型SLOはエピトープの損失の問題が懸念されたが、驚くべきことに、本発明者は、全長型SLOのC末端側の約100アミノ酸残基の領域を欠損させても抗原活性は損失されず、むしろタンパク質あたりの抗原活性が全長型SLOに対して向上することを確認した。このことは、全長型SLOから削除した約100アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを意味する。
また、本発明者は、改変型SLOが溶血活性を損失していることを確認した。さらに、熱安定性に関しても、改変型SLOが全長型SLOに対して向上していることを見い出し、本発明を完成させた。
[項1]
下記の(a)~(d)のいずれかのポリペプチドからなるSLO;
(a)配列番号1に記載の2位のセリン残基から31位のアラニン残基、32位のグルタミン酸残基、33位のセリン残基、34位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号1に記載の465位のイソロイシン残基から472位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを1つ以上有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
[項2]
下記の(e)~(i)のいずれかのDNA:
(e)項1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA。
(f)配列番号2において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[項3]
以下の(k)~(n)のいずれかのDNA:
(k)配列番号3において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号3に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(m)配列番号3に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(n)配列番号3に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
[項4]
項2または3に記載のDNAを組み込んだベクター。
[項5]
項4に記載のベクターを含む形質転換体。
[項6]
項5に記載の形質転換体を培養することを含む、項1に記載のSLOを製造する方法。
[項7]
項1に記載のSLOを架橋処理して得られる架橋型SLO。
[項8]
項1に記載のSLOもしくは項7に記載の架橋型SLOがコーティングされたラテックス粒子。
[項9]
項8に記載のラテックス粒子を使用した抗ストレプトリジンO抗体(ASO)の測定方法。
[項10]
項8に記載のラテックス粒子を含む抗ストレプトリジンO抗体(ASO)測定試薬。
本発明の実施形態のひとつは、下記の(a)~(d)のいずれかのポリペプチドからなるSLOである。
(a)配列番号1に記載の2位のセリン残基から31位のアラニン残基、32位のグルタミン酸残基、33位のセリン残基、34位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号1に記載の465位のイソロイシン残基から472位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。
また、本発明のSLOは、C末端側において、465位から571位、466位から571位、467位から571位、468位から571位、469位から571位、470位から571位、471位から571位、および、472位から571位からなる群のうちいずれかが欠損している。
(b)上記(a)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを1つ以上有するポリペプチド。
(c)上記(a)に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および/または付加(本明細書ではこれらを一括して「改変」とも表す。)したアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド、及び、
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド、
も、含まれる。
得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の抗原活性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質を後述の「SLOの抗原活性測定方法」で測定することによって確認することができる。
本発明の別の実施形態は、下記の(e)~(i)のいずれかのDNAである。
(e)上記の本発明のSLOのアミノ酸配列をコードするDNA。
(f)配列番号2において、N末端のatgの配列を除く5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
また、3’末端側の3n(nが1)個の塩基が欠損したものは、配列番号1におけるN32-C470をコードしていることになる。同様に、3’末端側の3n(nが2)個の塩基が欠損したものはN32-C469を、3’末端側の3n(nが3)個の塩基が欠損したものはN32-C468を、3’末端側の3n(nが4)個の塩基が欠損したものはN32-C467を、3’末端側の3n(nが5)個の塩基が欠損したものはN32-C466を、3’末端側の3n(nが6)個の塩基が欠損したものはN32-C465を、3’末端側の3n(nが7)個の塩基が欠損したものはN32-C464を、それぞれコードしていることになる。
(g)配列番号2に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
(h)配列番号2に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA、及び、
(i)配列番号2に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
も含まれる。
また、本発明のSLOをコードするDNAを、由来生物以外の宿主生物(大腸菌など)に組込んで本発明のSLOを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。コドンの至適化については、かずさDNA研究所が公開しているコドン使用頻度の一覧表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)などを参考にして、コドンが最適化される。
例えば、宿主生物として大腸菌を選択した場合は、配列番号3のような人工配列が挙げられる。
(k)配列番号3において、5’末端側の0、3、6または9個の塩基が欠損し、かつ、3’末端側の3n(nは0から7のうちいずれかの整数)個の塩基が欠損した塩基配列からなるDNA。
(l)配列番号3に示される塩基配列との同一性が80%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(m)配列番号3に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(n)配列番号3に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入および/または付加されている塩基配列であり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のDNAを組み込んだベクター、前記のベクターを含む形質転換体、または、前記の形質転換体を培養することを含む前記のSLOを製造する方法、である。
本発明のSLOは、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のSLOを架橋処理して得られる架橋型SLOである。
SLOは、安定化するために二官能価物質に共有結合させてもよい。従って、本発明の改変型SLOも、二官能価物質への共有結合が行われても良く、そのような二官能価物質の例は、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドである。グルタルアルデヒドのアルデヒド基とアミノ基との反応によって形成されるシッフ塩基は水溶液中で不安定なため、シアノ水素化ホウ素ナトリウムや水素化ホウ素ナトリウムによって、還元的アミノ化反応が行われても良い。共有結合は、その共有結合がpH又は温度変化により影響されない点で、物理的に不可逆的である。架橋処理の際は、バッファーの種類、pH、処理温度、処理時間、SLO濃度、二官能化物質の濃度を設定する必要があるが、SLO及び架橋型SLOに悪影響を与えない条件であれば良く、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液,ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。pH条件は、pH5~pH11の範囲が好ましく、さらに好ましくはpH6~pH10の条件である。温度条件は、4℃~40℃が好ましく、さらに好ましくは10℃~30℃の条件である。タンパク濃度は、0.1mg/ml~100mg/mlの条件が好ましく、さらに好ましくは1mg/ml~10mg/mlの条件が好ましい。反応時間は、1分~24時間の反応が好ましく、さらに好ましくは10分~5時間の反応が好ましい。架橋反応における二官能化物質の濃度は、0.0001%~1%の条件が好ましく、さらに好ましくは、0.001%~0.1%の条件である。架橋反応後、未架橋のグルタルアルデヒドがさらに反応するのを防ぐために終濃度0.1%~10%グリシンが添加されてもよい。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のSLOもしくは架橋型SLOがコーティングされたラテックス粒子である。
本発明に用いるラテックス粒子としては、特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン-スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル-アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックス粒子の平均粒径は特に限定されないが、被検物質の被検試料中での濃度あるいは測定機器の検出感度などを考慮し、0.05μm~1.0μmのものが適宜選択される。
本発明のラテックス粒子における改変型SLOの固定化方法は、特に限定されず、物理吸着(疎水結合)法、化学結合法等を適宜選択することができる。物理吸着(疎水結合)法においては、ポリハプテンを形成させて吸着させる方法、化学結合法においてはマレイミド基などの結合性の官能基を抗原に導入したりすることができる。抗原をラテックスに吸着させる際は、バッファーの種類、pH、処理温度、処理時間、SLO濃度を設定する必要があるが、特に限定されない。下記に一例を示す。バッファーは、酢酸緩衝液、MES緩衝液、PIPES緩衝液などのグッドバッファー、リン酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液,ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液などが例示される。pH条件は、pH5~pH11の範囲が好ましく、さらに好ましくはpH6~pH10の条件である。温度条件は、4℃~40℃が好ましく、さらに好ましくは10℃~30℃の条件である。SLO濃度は、0.01mg/ml~30mg/mlの条件が好ましく、さらに好ましくは0.1mg/ml~3mg/mlの条件が好ましい。反応時間は、1分~24時間の反応が好ましく、さらに好ましくは10分~5時間の反応が好ましい。また、非特異反応を抑制するためや免疫測定試薬自体の安定性を高めるために、特に限定されるものではないが、1種類もしくは2種類以上の添加剤を含んだ状態でSLOをラテックスに吸着させてもよい。
本発明の別の実施形態は、上記の本発明のラテックス粒子を使用したASOの測定方法、または、上記の本発明のラテックス粒子を含むASO測定試薬である。
本発明の免疫測定試薬を用いる免疫測定法もまた、本発明の1つである。本発明の免疫測定法としては、本発明の免疫測定試薬を用いるのであれば特に限定されず、通常の方法により行うことができる。例えば、被測定物質を含む媒体に本発明の免疫測定試薬を加え、被測定物質と本発明の免疫測定試薬に含まれるラテックス粒子上に固定された抗原とが抗原抗体反応により結合して生じた凝集を光学的に観察または目視により観察する。反応のpHの好ましい下限は5、上限は10であり、より好ましい下限は6、上限は9である。反応の温度の好ましい下限は4℃、上限は50℃であり、より好ましい下限は20℃、上限は40℃である。反応時間は適宜決められる。
上記媒体としては、被測定物質の種類に応じて適当な各種緩衝液が用いられる。かかる緩衝液としては、被測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やpHを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液、各種グッド緩衝液等の公知の緩衝液が挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。
上記媒体は、反応の感度を高めるために公知の水溶性添加剤、例えばポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン、エルシナン等の水溶性高分子等を含有してもよい。また、特異性の向上、試薬の安定性向上等の目的から、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質又はその分解物、変性物;塩化コリン等の第4級アンモニウム塩、EDTA、ポリアニオン、カオトロピックイオン(Cl-,I-,SCN-等)、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。また、防腐剤として、例えば、アジ化ナトリウムやフェニルメタンスルホニルフルオリドなどを含有してもよい。
上記抗原抗体反応によって生じた凝集の度合いを検出する方法は特に限定されないが、例えば光学的な観察又は目視により観察することにより検出される。具体的には、不溶性担体の凝集の程度を光学的に検出する方法としては、例えば、散乱光強度、吸光度又は透過光強度の増加又は減少を測定する方法等が挙げられる。また、目視により観察して判定する方法としては、例えば、試料と本発明の免疫測定試薬とを判定板上で混合し、1~5分間揺り動かしたあと、凝集の有無を判定する方法等が挙げられる。また、像を撮影し画像処理を施してもよい。
本発明において、SLOの抗原活性測定は以下の条件で行う。本抗原活性測定方法は、SLOが固定化されたラテックス粒子と被検試料中のSLO(被検物質)とを競合させて、当該ラテックス粒子と抗体との免疫複合体の形成を阻害し、免疫複合体の形成阻害に伴う当該ラテックス粒子の凝集阻害の程度から被検物質(抗原)を測定する方法である。なお、本明細書で「抗原活性」という場合は、具体的には、特に断りのない限り、以下の方法で測定した値を意味する。
<試薬>
デンカ生研社製 ASOラテックスX1「生研」 R1試薬(緩衝液)
デンカ生研社製 ASOラテックスX1「生研」 R2試薬(ラテックス(SLO吸着ラテックス)浮遊液)
デンカ生研社製 ASO標準液(500 IU/ml)
<測定試料>
測定試料は、デンカ生研社製ASO標準液(500 IU/ml)、生理食塩水及びSLO溶液が5:4:1の比率で混合されたものが使用する。また、SLO溶液は必要に応じて、20mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)で希釈された後、使用された。盲検はSLO溶液の代わりにSLOを希釈する20mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)が使用する。
<測定方法>
上記の測定試料、上記のR1試薬及び上記R2試薬を下記条件で日立7170形自動分析装置を用いて、試料中のSLOのASOに対する抗原活性(SAU/mg:StreptolysinO Antigenic Unit/mg)を測定する。
試料 : 3μL(ASO標準液(250 IU/ml)を含む)
R1試薬 : 70μL
R2試薬 : 120μL
測定方法 : 2ポイントエンド法(19-34)
主波長 : 570nm
副波長 : 800nm
抗原活性(SAU/mg)={(測定値(BLANK)-測定値(TEST)}×10×SLO溶液の希釈率/タンパク質濃度(mg/ml)
配列番号2に記載の人工合成遺伝子(Accession number NC003485)を鋳型とし、表1に記載のプライマーを用いて、各種SLO遺伝子を増幅した(表1において、Fwはフォワードプライマー、Rvはリバースプライマーを表す。)。具体的には、開始コドン、ヒスチジンタグの後に、32位のグルタミン酸残基が続き、464位のリジン残基を末端とするSLO(これをN32-C464とも表記する)をコードする遺伝子は、配列番号4及び6のプライマーを用いて増幅した。同様に、N32-C466、N32-C471、N35-C464、N35-C466、N35-C471、N32-C560及びN32-C571の各SLOをコードする遺伝子の増幅には、配列番号4及び7、配列番号4及び8、配列番号5及び6、配列番号5及び7、配列番号5及び8、配列番号4及び9、ならびに、配列番号4及び10のプライマーをそれぞれ用いた。なお、本プライマーのN末端側には制限酵素サイトNdeIが、C末端側には制限酵素サイトBamHIが、それぞれ付加されており、このDNA断片を制限酵素NdeIとBamHIで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドpBSKと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬(東洋紡製ライゲーションハイ)を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにしてSLO遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドpBSKSLO(N32-C464、N32-C466、N32-C471、N35-C464、N35-C466、N35-C471、N32-C560及びN32-C571)を取得した。
実施例1で構築した各種のプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109株コンピテントセル(東洋紡製コンピテントハイJM109)を当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した5mLのLB液体培地(アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌後、30℃で16時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、500mlの坂口フラスコに入った100mLのTB培地(IPTG1mM、アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌し、振とう数180rpmで30℃、20時間培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離で集菌し、20mMイミダゾールを含む25mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)に懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕し、得られた粗酵素を、20mMイミダゾールを含む25mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)で平衡化したHisTrap HP1mL(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)に供し、500mMイミダゾールを含む25mMリン酸緩衝溶液(pH7.5)で溶出することで、N32-C560の発現コンストラクトを除き、高い純度のストレプトリジン溶液を得た。さらに、純度を向上させるため、CM FFカラム5mL(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)により分離精製することで、不純タンパク質がSDS-PAGEレベルでは検出できないほど、純度を向上させることに成功した。前記で調製した各サンプルを用いてSDS-PAGEを行った結果は図1に示す。なお、C末端を11残基削除したN32-C560の発現コンストラクトにおいては、HisTrap HP1mL(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)での溶出画分にて、全長型のバンドに加えて、分解産物とみられる低分子量型のSLOが確認された(図2)。
実施例2において調製した各SLO溶液の溶血活性をそれぞれ測定した。測定方法としては、まず、PBS溶液で2%に希釈されたウサギ脱繊維血液(日本バイオテスト研究所製)1mlに対し、20mMシステインを含むPBS溶液で希釈されたSLO50μlを添加し、37℃で1時間反応させた。なお、測定時のSLO溶液のタンパク質濃度は、全て1.0mg/mlの濃度で測定された。結果は表2に示した通り、全長型のSLO(N32-C571)は、溶血の程度を表す541nmの吸収(A541)が検出され、改変型SLOに関しては、Blankとの有意な差はなく、溶血活性(Hemolytic activity)を損失していることが確認された。
実施例2において調製した各SLO溶液及びBIOKIT社製SLO(Code:T3000-5258)を用いて、抗原活性を測定した。BIOKIT社製SLOのSDS-PAGE結果を図3に示すが、全長型SLOと比較して、約40kDa、分子量が大きいことを確認した。この結果から融合タンパク質であることが示唆されたため、本明細書では、BIOKIT社製SLOをFusion typeとも表記する。抗原活性の測定結果は図4に示す。なお、測定時のSLO溶液のタンパク質濃度は、改変型SLOは、0.08mg/mlの濃度で、全長型SLOは、0.11mg/mlの濃度で、BIOKIT社製SLOは、0.16mg/mlの濃度で測定された。改変型SLOは、全長型SLOに対して、高い抗原活性を示した。本結果は、削除した約100アミノ酸残基の領域には重要なエピトープが存在しないことを示している。また、BIOKIT社製SLOの抗原活性は全長型SLOよりも低いことを確認した。
実施例2において調製した各SLO溶液及びBIOKIT社製SLO(Code:T3000-5258)を用いて、熱処理後の抗原活性測定により、熱安定性を評価した。結果を図5に示す。なお、測定時のSLO溶液のタンパク質濃度は、2.0mg/mlの濃度において、各温度で6時間処理され、その後、抗原活性を測定することにより、熱安定性を評価した。その結果、改変型SLOは、全長型SLOに対して、熱安定性が高まっており、実用上、有益な特性を獲得していることを確認した。また、BIOKIT社製のSLO(Code:T3000-5258)よりも、熱安定性が優れていることを確認した。
大腸菌での発現量を向上させるため、コドンユーセージの至適化を行った。人工合成された配列は、配列番号3に示す。実施例1及び2に記載と同様の手法で、発現プラスミドを構築した。プラスミドの作成に用いたプライマーは、表3に示す。構築したプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109株コンピテントセル(東洋紡製コンピテントハイJM109)に当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した5mLのLB液体培地(アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌後、30℃で16時間振とうして好気的に培養した。得られた培養液を種培養液とし、500mlの坂口フラスコに入った100mLのTB培地(IPTG1mM、アンピシリン50μg/mLを含む)に植菌し、振とう数180rpmで30℃、20時間培養した。その結果、約300mg/Lの改変型SLOの発現を確認した。この値は、コドンユーセージの至適化前の約2倍に相当し、コドン配列の至適化により、生産性が向上していることが確認された。
実施例2において調製した各SLO溶液及びBIOKIT社製SLO(Code:T3000-5258)を2.2mg/mLの濃度に調製し、終濃度0.1%となるよう25%グルタルアルデヒド溶液(Sigma社製、Code:G5882)を添加した。次に、その溶液を室温で1時間、機械的に攪拌する。その後、グリシンを添加し、0.1%の最終濃度にする。次に、その溶液を室温で30分間、機械的に撹拌した後、4℃で一晩保存した。その後、ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を算出し、ラテックス粒子にコーディングされた。コーティング条件としては、50mMホウ酸緩衝液(pH8.2)から構成される緩衝液であって、架橋されたSLOの終濃度が図6に記載の通り、0.3~0.7mg/mlとなるようそれぞれ混合され、37℃で1時間、コーティング処理を実施した。その後、遠心、上清の除去、懸濁の洗浄工程を150mM NaCl及び0.5%BSAを含む50mMグリシン緩衝液(pH8.2)で2回繰り返すことで、ラテックス比濁測定用試薬における第2試薬を得た。また、第1試薬として、20mMTris-HCl緩衝液(pH8.2)、150mM NaCl、0.5%BSAからなる緩衝液を調製し、ラテックス試薬の感度評価を行った。測定方法としては、第1試薬と第2試薬を組合せ、日立7170形自動分析装置を用いてASO濃度依存的な粒子凝集塊の形成を確認した。具体的には、濃度0(IU/mL)、250(IU/mL)、500(IU/mL)のASO溶液3μLに、第1試薬240μLを加えて37℃で5分間加温後、第2試薬60μLを加えて攪拌した。その後5分間の凝集形成に伴う吸光度変化(ΔmAbs)を、主波長546nm、副波長800nmにて測定した。その結果、ラテックスへコーティングする際のSLO濃度が0.7mg/ml、ASO濃度500(IU/ml)の条件では、BIOKIT社製SLOのΔmAbsが78.1、全長型SLOのΔmAbsが66.9であるのに対し、本発明の改変型SLOは、約2~3倍の183.1であった。また、SLO濃度が0.5mg/ml、ASO濃度500(IU/ml)の条件においても、BIOKIT社製SLOのΔmAbsが60.2、全長型SLOのΔmAbsが38.9であるのに対し、本発明の改変型SLOは、約2~3倍の114.2であった。本結果により、本発明の改変型SLOはタンパク質あたりの抗原活性が高く、ASO試薬の製造に使用するSLOの量を低減できることが示された。
Claims (10)
- 下記の(a)~(d)のいずれかのポリペプチドからなるストレプトリジンO;
(a)配列番号1に記載の2位のセリン残基から31位のアラニン残基、32位のグルタミン酸残基、33位のセリン残基、34位のアスパラギン残基のいずれかまでのポリペプチドが欠損し、かつ、配列番号1に記載の465位のイソロイシン残基から472位のアラニン残基のいずれかから、それ以降の全てのアミノ酸残基が欠損したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号1に記載のN32-C464、N32-C466、N32-C471、N35-C464、N35-C466、およびN35-C471よりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(c)上記(a)または(b)に示されるアミノ酸配列のN末端領域もしくはC末端領域にタグを1つ以上有するポリペプチド。
(d)上記(a)に示されるアミノ酸配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチド。 - 下記の(e)~(g)のいずれかのDNA:
(e)請求項1に示されるアミノ酸配列をコードするDNA。
(f)配列番号2に示される塩基配列との同一性が90%以上である塩基配列からなり、かつ、抗ストレプトリジンO抗体(ASO)に対する抗原活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
(g)配列番号2に示される塩基配列を鋳型として、配列番号4および6、配列番号4および7、配列番号4および8、配列番号5および6、配列番号5および7、ならびに配列番号5および8の各プライマーを用いて増幅されたDNA。 - 以下の(h)のDNA:
(h)配列番号3に示される塩基配列を鋳型として、配列番号11および12のプライマーを用いて増幅されたDNA。 - 請求項2または3に記載のDNAを組み込んだ、請求項1に記載のポリペプチドを発現するためのベクター。
- 請求項4に記載のベクターを含む形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培養することを含む、請求項1に記載のストレプトリジンOを製造する方法。
- 請求項1に記載のストレプトリジンOを架橋処理して得られる架橋型ストレプトリジンO。
- 請求項1に記載のストレプトリジンOもしくは請求項7に記載の架橋型ストレプトリジンOがコーティングされたラテックス粒子。
- 請求項8に記載のラテックス粒子を使用した抗ストレプトリジンO抗体(ASO)の測定方法。
- 請求項8に記載のラテックス粒子を含む抗ストレプトリジンO抗体(ASO)測定試薬。
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