KR101461772B1 - 친화성 크로마토그래피용 담체 및 면역 글로불린을 단리하는 방법 - Google Patents

친화성 크로마토그래피용 담체 및 면역 글로불린을 단리하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알칼리 내성이 우수한 친화성 크로마토그래피용 담체 및 면역 글로불린을 단리하는 방법을 제공한다. 하기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드가 고정화된 친화성 크로마토그래피용 담체:
<화학식 1>
Figure 112012094432289-pct00014

(식 중, R은 ATK 또는 ASK로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 4 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타내고, R2는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 그의 부분 서열, 또는 이들의 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 결합 도메인을 포함하는, 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타냄(여기서, R2가 R에 결합하는 말단은 상기 면역 글로불린 결합 도메인의 C 말단 또는 N 말단임))

Description

친화성 크로마토그래피용 담체 및 면역 글로불린을 단리하는 방법{SUPPORT FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY AND METHOD FOR ISOLATING IMMUNOGLOBULIN}
본 발명은 친화성 크로마토그래피용 담체 및 면역 글로불린을 단리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 면역 글로불린 정제에 유용한 특정 리간드를 결합한 친화성 크로마토그래피용 담체 및 면역 글로불린을 단리하는 방법에 관한 것이다.
친화성 크로마토그래피는 불용성 담체에 분리·정제를 목적으로 하는 물질과 특이적으로 결합하는 물질(리간드)을 고정화하고, 얻어진 리간드 고정화 담체를 충전한 칼럼을 이용하는 크로마토그래피이며, 예를 들면 단백질, 핵산 등의 생체 관련 물질의 분리·정제에 이용되고 있다(일본 특허 공개 (평)6-281638호 공보).
친화성 크로마토그래피용 담체로는, 예를 들면 아가로스겔로 대표되는 당쇄의 가교 입자나, 합성 중합체를 주성분으로 하는 입자가 이용되고 있다.
그런데, 바이오 세퍼레이션(bio separation)에 있어서의 용도로는, 통상 담체는 반복하여 사용된다. 그러나, 정제 조작 후에도 미량의 협잡물이 담체 내에 남기 때문에, 협잡물을 제거하여 담체를 원래의 상태로 복귀시키기 위한 세정 공정이 반복 사용되는 가운데 행해진다. 이 세정 공정에서는, 통상 클리닝 인 플레이스(cleaning in place, CIP)로서 알려진 조작법을 행하여, 담체로부터 협잡물을 용출할 수 있는 시약(CIP제)이 이용된다. 이러한 시약으로는 예를 들면, 수산화나트륨 등의 알칼리성 액을 들 수 있다. 수산화나트륨을 이용하는 경우, 미생물, 단백질, 지질 및 핵산과 같은 협잡물을 효과적으로 제거할 수 있다.
그러나, 알칼리성 액을 이용하여 협잡물을 담체로부터 제거하는 경우, 담체가 알칼리성 조건하에 노출된다. 리간드로서 단백질을 이용한 친화성 크로마토그래피용 담체에 있어서, 이러한 알칼리성 조건은 가혹하여, 리간드의 불안정성에 의한 용량 저하를 일으키는 경우가 있다. 특히, 리간드가 단백질 A 등의 폴리펩티드인 대부분의 친화성 크로마토그래피용 담체는, 가혹한 알칼리 조건에 대하여 불안정하다.
일본 특허 공개 (평)6-281638호 공보
본 발명의 한 양태에 관한 친화성 크로마토그래피용 담체는, 하기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드가 고정화되어 있는 담체이다.
Figure 112012094432289-pct00001
(식 중,
R은 ATK 또는 ASK로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 4 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타내고,
R2는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 그의 부분 서열, 또는 이들의 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 결합 도메인을 포함하는, 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타냄(여기서, R2가 R에 결합하는 말단은 상기 면역 글로불린 결합 도메인의 C 말단 또는 N 말단임))
상기 친화성 크로마토그래피용 담체의 한 실시 형태에서, 상기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드는, 상기 리간드 중 아미노기 또는 티올기가 에폭시기를 갖는 담체와 에폭시기 개환 반응함으로써, 상기 담체에 고정화될 수 있다.
본 발명의 별도의 한 양태에 관한 면역 글로불린을 단리하는 방법은, 이하:
상기 친화성 크로마토그래피용 담체에 면역 글로불린을 함유하는 시료를 통액시켜, 상기 담체에 면역 글로불린을 흡착시키는 공정, 및
상기 담체로부터 상기 면역 글로불린을 용출시키는 공정
을 포함한다.
상기 본 발명의 방법의 한 실시 형태에서, 상기 면역 글로불린을 용출시키는 공정에 사용된 상기 친화성 크로마토그래피용 담체는 알칼리성 액으로 세정된 후, 다시 상기한 방법에 의한 면역 글로불린의 단리에 사용될 수 있다.
[도 1] JX05-pET24-a-d(+) 구축 절차.
본 명세서에서 「단백질」이란, 펩티드 구조 단위를 갖는 모든 분자를 말하며, 예를 들면 천연형 단백질의 부분적 단편이나 천연형 단백질의 아미노산 서열을 인위적으로 개변한 변이체를 포함하는 개념이다. 또한, 「면역 글로불린 결합 도메인」이란, 단독으로 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 기능 단위를 나타내고, 「면역 글로불린 결합 단백질」이란, 면역 글로불린에 특이적인 친화성을 가지며, 「면역 글로불린 결합 도메인」을 포함하는 단백질을 나타낸다. 「면역 글로불린 결합」이란 면역 글로불린 분자의 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 영역, 특히 Fc 프래그먼트에 결합하는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 단백질 A란, 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 세포벽 성분인 단백질 A이다.
본 명세서에서 염기 서열 및 아미노산 서열의 서열 동일성은, 립맨 피어슨법(Lipman-Pearson법; Science, 227, 1435, (1985))에 의해서 계산된다. 구체적으로는, 유전 정보 처리 소프트웨어 Genetyx-Win(Ver.5.1.1; 소프트웨어 개발)의 호몰로지 해석(Search homology) 프로그램을 이용하여, Unit size to compare(ktup)를 2로서 해석을 행함으로써 산출된다.
본 발명은 알칼리 내성이 우수한 친화성 크로마토그래피용 담체 및 면역 글로불린을 단리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체에 따르면, 알칼리 내성이 우수하기 때문에, 알칼리성 조건하에서의 세정에 대하여 높은 내성을 갖는다. 또한, 상기 친화성 크로마토그래피용 담체를, 예를 들면 면역 글로불린의 정제에 이용한 경우, 반복하여 사용하여도 면역 글로불린의 동적 결합 용량이 저하되기 어렵기 때문에, 염가인 면역 글로불린 정제가 가능해진다.
본 발명의 한 실시 형태에 따른 친화성 크로마토그래피용 담체는, 하기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드가 담체에 고정화되어 있다.
<화학식 1>
Figure 112012094432289-pct00002
(식 중,
R은 ATK 또는 ASK를 포함하는 4 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 나타내고,
R2는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 그의 부분 서열, 또는 이들의 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 결합 도메인을 포함하는, 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타냄(여기서, R2가 R에 결합하는 말단은 상기 면역 글로불린 결합 도메인의 C 말단 또는 N 말단임))
1. 친화성 크로마토그래피용 담체
1.1. 담체
1.1.1. 구성
담체의 형상으로는 입자의 형태일 수 있고, 이러한 입자는 다공성일 수도 있고 비다공성일 수도 있다. 입자상의 담체는 충전상으로서 사용할 수도 있고, 현탁 형태로 사용할 수도 있다. 현탁 형태에는 유동층(expanded bed) 및 순연한 현탁물로서 알려진 것이 포함되고, 입자가 자유롭게 운동할 수 있다. 모노리스(monolith), 충전상 및 유동층의 경우, 분리 절차는 일반적으로 농도 구배에 의한 종래의 크로마토그래피법에 따른다. 순연한 현탁물의 경우에는, 회분법이 이용된다. 바람직하게는, 해당 담체는 충전제이다. 또는, 담체는 칩, 모세관 또는 필터와 같은 형태일 수도 있다.
본 실시 형태에 따른 친화성 크로마토그래피용 담체는, 바람직하게는 20 내지 200 ㎛, 담체가 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 20 내지 80 ㎛, 더욱 바람직하게는 30 내지 60 ㎛, 담체가 다당인 경우, 보다 바람직하게는 50 내지 200 ㎛, 더욱 바람직하게는 60 내지 150 ㎛의 입경(부피 평균 입경)을 갖는다. 입경이 20 ㎛ 미만이면, 고유속하에서 칼럼 압력이 높아져, 실용에 견딜 수 없다. 입경이 200 ㎛를 초과하면, 면역 글로불린이 친화성 크로마토그래피용 담체에 결합하는 양(결합 용량)으로 떨어지는 경우가 있다. 또한, 본 발명에서의 「입경」이란, 레이저 회절 산란식 입도 분포 측정 장치에 의해 얻어지는 부피 평균 입경이다.
본 실시 형태에 따른 친화성 크로마토그래피용 담체는, 바람직하게는 다공질이고, 50 내지 150 m2/g, 보다 바람직하게는 80 내지 130 m2/g의 비표면적을 갖는다. 여기서, 비표면적이 50 m2/g 미만이면, 결합 용량이 떨어지는 경우가 있고, 한편 150 m2/g을 초과하면, 담체의 강도가 떨어지기 때문에 고유속하에서 담체가 파괴되어, 칼럼 압력이 상승하는 경우가 있다. 본 발명에서의 「비표면적」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000 nm의 세공이 갖는 표면적을 입자의 건조 중량으로 나눈 값이다.
본 실시 형태에 따른 친화성 크로마토그래피용 담체는 바람직하게는 100 내지 1400 nm, 담체가 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 100 내지 400 nm, 더욱 바람직하게는 200 내지 300 nm, 담체가 다당인 경우, 보다 바람직하게는 500 내지 1400 nm, 더욱 바람직하게는 800 내지 1200 nm의 부피 평균 세공 직경을 갖는다. 여기서, 부피 평균 세공 직경이 100 nm 미만이면, 고유속하의 결합 용량 저하가 현저해지는 경우가 있고, 한편 1400 nm를 초과하면, 유속에 관계없이 결합 용량이 저하되는 경우가 있다. 본 발명에서의 「부피 평균 세공 직경」이란, 수은 포로시미터에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000 nm의 세공의 부피 평균 세공 직경이다.
상기 범위의 입경, 비표면적 및 세공 직경 분포를 만족시키는 경우, 정제 대상 용액의 유로(流路)가 되는 입자간의 간극 및 입자 내의 비교적 큰 세공 직경과, 정제 대상 분자의 결합 표면적의 균형이 최적화되어, 고유속하의 결합 용량이 높은 수준으로 유지된다.
담체의 재질로는, 예를 들면 친수성 표면을 갖는 중합체로, 예를 들면 외표면에(및 존재하는 경우에는 내표면에도) 히드록시기(-OH), 카르복시기(-COOH), 아미노카르보닐기(-CONH2, 또는 N 치환형), 아미노기(-NH2, 또는 치환형), 올리고 또는 폴리에틸렌옥시기를 갖는 중합체이다. 중합체는 한 실시 형태에서는, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 스티렌-디비닐벤젠 공중합체와 같은 합성 중합체이다. 이러한 합성 중합체는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들면, 문헌 [J. MATER. CHEM1991, 1(3), 371-374]에 기재된 방법을 참조함). 또는, 도요펄(도소사)과 같은 시판품도 사용된다. 다른 실시 형태에서의 중합체는 덱스트란, 전분, 셀룰로오스, 풀루란, 아가로스 등의 다당류이다. 이러한 다당류는 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다(예를 들면 일본 특허 제4081143호에 기재된 방법을 참조함). 또는, 세파로스(GE 헬스케어 바이오사이언스사)와 같은 시판품도 사용된다. 그 밖의 실시 형태에서는 실리카, 산화지르코늄 등의 무기 담체일 수도 있다.
본 실시 형태에 따른 친화성 크로마토그래피용 담체에서 담체로서 사용되는 다공성 입자의 한 구체예로는, 예를 들면 20 내지 50 질량％의 가교성 비닐 단량체와 3 내지 80 질량％의 에폭시기 함유 비닐 단량체, 20 내지 80 질량％의 디올기 함유 비닐 단량체와의 공중합체를 함유하고, 입경이 20 내지 80 ㎛이고, 비표면적이 50 내지 150 m2/g이고, 부피 평균 세공 직경이 100 내지 400 nm인 다공성 유기중합체 입자를 들 수 있다.
또한, 본 실시 형태에 따른 친화성 크로마토그래피용 담체를 수은 포로시미터로 측정한 경우의 세공 직경 10 내지 5000 nm의 세공의 침입 부피(세공 부피)는, 바람직하게는 1.3 내지 7.0 mL/g, 담체가 합성 중합체인 경우, 보다 바람직하게는 1.3 내지 2.5 mL/g, 담체가 다당인 경우, 보다 바람직하게는 3.0 내지 6.0 mL/g이다.
1.1.2. 리간드와의 결합
리간드의 결합 방법으로는, 단백질을 담체에 고정화하는 일반적 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 카르복시기를 갖는 담체를 이용하여, 이 카르복시기를 N-히드록시숙신산이미드에 의해 활성화시켜 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 아미노기 또는 카르복시기를 갖는 담체를 이용하여, 수용성 카르보디이미드 등의 탈수 축합제 존재하에서 리간드의 카르복시기 또는 아미노기와 반응시켜 아미드 결합을 형성하는 방법, 수산기를 갖는 담체를 이용하여, 브롬화시안 등의 할로겐화시안으로 활성화시켜 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 또는 담체의 수산기를 토실화 또는 트레실화하여 리간드의 아미노기와 반응시키는 방법, 및 비스에폭시드, 에피클로로히드린 등에 의해 에폭시기를 담체에 도입하고, 리간드의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법, 에폭시기를 갖는 담체를 이용하여 리간드의 아미노기 또는 수산기 또는 티올기와 반응시키는 방법 등을 들 수 있다.
에폭시기가 개환하여 생성되는 개환 에폭시기인 알코올성 수산기는 담체 표면을 친수화하고, 단백질 등의 비특이 흡착을 방지함과 동시에, 수중에서 담체의 인성을 향상시켜 고유속하의 담체의 파괴를 방지하는 역할을 한다. 따라서, 리간드를 고정화시킨 후 담체 중에 리간드와 결합하지 않은 나머지 에폭시기가 존재하는 경우, 해당 나머지 에폭시기를 개환시키는 것이 바람직하다. 담체 중 에폭시기의 개환 방법으로는, 예를 들면 수용매 중에서, 산 또는 알칼리에 의해 가열 또는 실온에서 상기 담체를 교반하는 방법을 들 수 있다. 또한, 메르캅토에탄올, 티오글리세롤 등의 메르캅토기를 갖는 블록킹제나 모노에탄올아민 등의 아미노기를 갖는 블록킹제로 에폭시기를 개환시킬 수도 있다. 가장 바람직한 개환 에폭시기는, 담체에 포함되는 에폭시기를 티오글리세롤에 의해 개환시켜 얻어지는 개환 에폭시기이다. 티오글리세롤은, 원료로서 메르캅토에탄올 등보다 독성이 낮고, 티오글리세롤이 부가된 에폭시 개환기는, 아미노기를 갖는 블록킹제에 의한 개환기보다 비특이 흡착이 낮을 뿐 아니라, 동적 결합량이 높아진다는 이점을 갖는다.
필요에 따라 담체와 리간드 사이에 임의의 길이의 분자(스페이서)를 도입할 수도 있다. 스페이서의 예로는 폴리메틸렌쇄, 폴리에틸렌글리콜쇄, 당류 등을 들 수 있다.
1.2. 리간드
1.2.1. 앵커 펩티드
리간드인 면역 글로불린 결합 단백질은 하기 화학식 1로 표시된다.
<화학식 1>
Figure 112012094432289-pct00003
이 면역 글로불린 결합 단백질(이하, 「단백질 1」이라고도 함)을 상술한 바와 같이, 예를 들면 담체 상의 에폭시기와 반응시킴으로써 담체에 결합시킬 수 있다.
상기 화학식 1에 있어서, R은 앵커 펩티드일 수 있다. 상기 앵커 펩티드는, 리간드 분자를 담체에 연결시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 앵커 펩티드는 적어도 하나의 중성 극성 잔기와 적어도 하나의 염기성 극성 잔기를 갖는 아미노산 모티프를 포함할 수 있다. 한 실시 형태에서 상기 앵커 펩티드는, 적어도 하나의 중성 비극성 잔기를 더 포함할 수 있다. 해당 중성 극성 잔기는 트레오닌 잔기(T) 또는 세린 잔기(S)일 수 있고, 해당 염기성 극성 잔기는 리신 잔기(K)일 수 있고, 해당 중성 비극성 잔기는 알라닌 잔기(A)일 수 있다.
상기 앵커 펩티드는, 리간드 분자 R2를 담체 상에 고정화시키는 한편, 상기 리간드 분자의 기능을 실질적으로 유지시키는 데에 적합하다. 즉, 리간드 분자가 담체에 고정된 상태에서, 상기 리간드 분자의 기능, 예를 들면 면역 글로불린 결합성을 적어도 약 50％ 유지할 수 있다. 본 발명의 한 실시 형태에서, 상기 앵커 펩티드(또는 링커라고도 함)는 적어도 2아미노산 잔기를 갖는 모티프를 포함할 수 있다. 상기 앵커 펩티드의 아미노산 모티프는, 중성 비극성 잔기, 중성 극성 잔기, 염기성 극성 잔기의 3개의 그룹을 동등하게 포함할 수 있다. 앵커 서열은 또한, 중성 극성 잔기와 염기성 비극성 잔기만을 다양한 조합 또는 배치로 포함할 수 있다.
상기 화학식 1에 있어서, R로 표시되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 포함되는 아미노산 잔기의 수는 4 내지 30개인 것이 바람직하고, 4 내지 20개가 보다 바람직하다. R의 아미노산 서열은 적어도 ATK 또는 ASK로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. ATK 또는 ASK로 표시되는 아미노산 서열을 복수 포함할 수도 있고, ATK와 ASK와의 조합(Combination)(예를 들면, ATKASK 또는 ASKATK)으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수도 있다.
한 실시 형태에서, 상기 R은 화학식 XX-UU-XX로 표시되는 아미노산 서열(여기서, 각 X는 K, S 또는 T일 수 있고, U는 임의의 아미노산일 수 있음), 또는 화학식 XXX-GA-XX로 표시되는 아미노산 서열(여기서, 각 X는 A, K, S 또는 T일 수 있음)로 표시되는 폴리펩티드를 포함할 수도 있다.
해당 폴리펩티드는 아미노산 서열 ATKASK, 또는 적어도 50％ 서열 동일하며 기능적으로 등가인 그의 유도체일 수 있다.
또는 해당 폴리펩티드는 아미노산 서열 ATKGATK, 또는 적어도 50％ 서열 동일하며 기능적으로 등가인 그의 유도체일 수 있다.
또한, 상기 R의 아미노산 서열 중에는 TEV 인식 서열이 포함될 수도 있다. 본 발명에서 「TEV 인식 서열」이란, TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제에 의해 특이적 절단 부위로서 인식될 수 있는 아미노산 서열을 말하는데, 반드시 실제로 TEV 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것을 요하지는 않는다. 「TEV 인식 서열」로는, 아미노산 서열 ENLYFQG(예를 들면, 서열번호 22의 10 내지 16번 아미노산 잔기) 및 해당 아미노 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 동일성을 갖고, TEV 프로테아제에 의해 인식되는(반드시 TEV 프로테아제에 의해 절단되는 것을 요하지는 않음) 아미노산 서열을 들 수 있다.
상기 앵커 펩티드는, 상기 앵커 펩티드와 리간드 분자를 포함하는 융합 생성물로서 제공될 수 있다. 상기 앵커 펩티드는 리간드 단백질의 N- 또는 C 말단 신장부일 수 있다.
상기 앵커 펩티드, 또는 상기 앵커 펩티드와 리간드 단백질을 포함하는 융합 생성물은, 펩티드 합성 분야에서 공지된 임의의 방법으로 합성될 수 있다. 상기 방법으로는 고상 합성법(문헌 [Merrifield(1964) J. Am. Chem. Assoc. 65: 2149]; [J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149, 1963]; 및 [Int. J. Peptide Protein Res.35: 161-214, 1990]), 및 균질 용액(homogenous solution) 중에서의 펩티드 합성(문헌 [Methods of Organic Chemistry, E. Wansch(Ed.) Vol.15, pts. I and II, Thieme, Stuttgart, 1987])을 들 수 있다.
또는, 상기 앵커 펩티드, 또는 상기 앵커 펩티드와 리간드 단백질을 포함하는 융합 생성물은 해당 분야에서 공지된 재조합법에 의해 생성될 수 있다. 이 경우, 상기 앵커 펩티드는, 통상 리간드 단백질의 말단에 상기 단백질의 기능이 실질적으로 유지되도록 결합 또는 융합될 수 있다. 따라서, 리간드 단백질에 의해서 앵커는 그의 N 말단 또는 C 말단에 결합될 수 있다. 어떤 경우에는, 상기 앵커 펩티드는 양끝에 결합될 수도 있고, 또는 말단 잔기가 아닌 아미노산 잔기에 결합될 수도 있다.
상기 리간드 분자를 상기 본 발명의 앵커 펩티드에 결합 또는 융합시킨 후, 이 융합 생성물을 담체에 고정화시킬 수 있다. 또는, 상기 앵커 펩티드는 단백질 리간드와의 결합 이전에, 화학적 수단에 의해, 재조합법에 의해, 또는 효소를 사용하여 담체에 결합될 수도 있다. 적절한 담체로는 상기 1.1.1에서 서술한 바와 같다.
상기 앵커 펩티드는 당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 어세이에 있어서의 검출력을 높이기 위해 표지될 수 있다. 표지로는 한정되지 않지만, 방사성 표지, 형광 표지, 세포 독성 표지 등을 들 수 있다. 상기 앵커 펩티드는 또한, 캐리어 단백질과 함께, 예를 들면 소 혈청 알부민(BSA) 또는 키홀-림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)에 결합되어 제공될 수 있다. 상기 앵커 펩티드는, N 말단에 비오틴-GGYG 서열을 가질 수도 있다. 상기 서열에 의해, 티로신(Y)의 OD280에 의한 펩티드 농도 측정이 가능하게 된다. 상기 N 말단 비오틴 부분은, 아비딘-HRP를 이용한 ELISA 어세이의 리간드가 될 수 있다.
1.2.2. 면역 글로불린 결합 단백질
상기 화학식 1에 있어서, R2는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 그의 부분 서열, 또는 이들의 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 결합 도메인을 포함하는, 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다.
예를 들면, R2로는, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 이들의 부분 서열, 또는 해당 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 결합 도메인을 적어도 1개 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 해당 면역 글로불린 결합 도메인을 2 내지 12개 포함하는 것이 바람직하고, 3 내지 8개 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은, 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 유래되는 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인인 C 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
따라서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열이란, 해당 C 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 29번 아미노산 잔기가 Gly로부터 Ala로 치환된 변이체(C 도메인 G29A 변이체)의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 C 도메인 G29A 변이체는 면역 글로불린에 대한 결합능을 가지며, 서열번호 1로 표시되는 친(親) C 도메인과 비교하여 알칼리 내성이 개선되어 있다.
또한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열로는, 상기 C 도메인의 아미노산 서열의 적어도 일부를 갖는 C 도메인의 프래그먼트(C 프래그먼트)이고, 예를 들면 상기 C 도메인의 아미노산 서열의 90％ 이상을 갖는 것이 바람직하고, 95％ 이상을 갖는 것이 보다 바람직하다. 해당 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드는 면역 글로불린에 대한 결합능을 갖는다.
또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열로는, 상기 C 도메인 G29A 변이체의 아미노산 서열의 적어도 일부를 갖는 C 도메인 G29A 변이체의 프래그먼트(CG29A 프래그먼트)이고, 예를 들면 상기 C 도메인 G29A 변이체의 아미노산 서열의 90％ 이상을 갖는 것이 바람직하며, 95％ 이상을 갖는 것이 보다 바람직하다. 해당 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드는 면역 글로불린에 대한 결합능을 갖는다.
또한, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열이란, 상기 C 도메인의 변이체이고, 예를 들면 C 도메인의 아미노산 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 또 바람직하게는 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는다.
상기 C 도메인의 변이체는 면역 글로불린에 대한 결합능을 갖는 것이며, 서열번호 1로 표시되는 C 도메인과 비교하여 알칼리 내성이 개선된 것이 바람직하다. 이 경우, C 도메인의 변이체가 서열번호 1로 표시되는 C 도메인과 비교하여 알칼리 내성이 개선되어 있는지의 여부는, 후술하는 실시예(3. 시험예)에 기재된 방법으로 확인할 수 있다.
또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열이란, 상기 C 도메인 G29A 변이체의 변이체이고, 예를 들면 C 도메인 G29A 변이체의 아미노산 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 또한 바람직하게는 98％ 이상의 서열 동일성을 가지며, C 도메인 아미노산 서열(서열번호 1)의 29위치에 대응하는 위치에 Ala를 갖는 것이다.
상기 C 도메인 G29A 변이체의 변이체는 면역 글로불린에 대한 결합능을 갖는 것이고, 또한 C 도메인 G29A 변이체와 비교하여 알칼리 내성이 개선된 것이 바람직하다. 이 경우, C 도메인 G29A 변이체의 변이체가 C 도메인 G29A 변이체와 비교하여 알칼리 내성이 개선되어 있는지의 여부는, 후술하는 실시예(3. 시험예)에 기재된 방법으로 확인할 수 있다.
또한, 상기 부분 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열이란, 상기 C 프래그먼트 또는 CG29A 프래그먼트의 변이체이고, 예를 들면 C 프래그먼트 또는 CG29A 프래그먼트의 아미노산 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 또 바람직하게는 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는다.
상기 C 프래그먼트 또는 CG29A 프래그먼트의 변이체는, 면역 글로불린에 대한 결합능을 갖는 것이며, 해당 프래그먼트와 비교하여 알칼리 내성이 개선된 것이 바람직하다. 이 경우, 프래그먼트의 변이체가 친(親) 프래그먼트와 비교하여 알칼리 내성이 개선되어 있는지의 여부는, 후술하는 실시예(3. 시험예)에 기재된 방법으로 확인할 수 있다.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 또는 이들의 부분 서열과 70％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 결합 도메인은, 바람직하게는 C 도메인 아미노산 서열(서열번호 1)의 1위치에 대응하는 위치에 Val을 갖는다. 이러한 면역 글로불린 결합 도메인의 예로는, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서의 아미노산 서열 상의 특정한 위치에 「대응하는 위치」는, 공지된 알고리즘에 기초하는 시퀀스얼라인먼트에 의한 서열 비교에 의해서 결정할 수 있다.
상기 변이체는 천연 단백질 A의 C 도메인 등의 면역 글로불린 결합 단백질을, 부위 특이적 돌연변이(Site-specific mutaion) 등의 공지된 수단에 따라, 아미노산 잔기의 부가, 삭제, 치환, 아미노산 잔기의 화학적 수식 등에 의해 개변시킴으로써 제작할 수 있다.
R2는 추가로 상기 이외의 그 밖의 면역 글로불린 결합 도메인을 포함할 수 있다. 해당 그 밖의 면역 글로불린 결합 도메인으로는, 예를 들면 천연 단백질 A의 A, B, D, E 도메인이나 그의 변이체를 들 수 있다.
R2에 있어서, 각 면역 글로불린 결합 도메인 사이의 결합에 대해서는, 하나의 도메인의 C 말단과 별도의 도메인의 N 말단을 직접 연결할 수도 있고, 1 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 통해 연결할 수도 있다. 이 펩티드로는, 예를 들면 EF로 표시되는 펩티드가 바람직한 예로서 들 수 있다.
R2가 R에 결합하는 말단은, R2에 포함되는 면역 글로불린 결합 도메인의 C 말단 또는 N 말단 중 어느 것일 수도 있다.
단백질 1을 구성하는 아미노산 잔기의 총 개수는 바람직하게는 70 내지 1,000개이고, 친화성 크로마토그래피용 담체 입자에 결합시키는 용도에 사용하는 경우, 80 내지 600개인 것이 보다 바람직하다.
1.2.2.2. 단백질 1의 제조
단백질 1을 제조하기 위한 표준 기술로는, 예를 들면 프레데릭 엠. 아우스벨(Frederick M. Ausbel) 등에 의한 문헌 [Current Protocols In Molecular Biology]나 샘브룩(Sambrook) 등이 편집한 문헌 [Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)] 등에 기재되어 있는 공지된 유전자 재조합 기술을 이용할 수 있다. 즉, 목적으로 하는 개변 단백질(단백질 1)을 코딩하는 핵산 서열을 함유시킨 발현 벡터를 대장균 등의 숙주로 형질 전환시키고, 해당 세포를 적절한 액체 배지로 배양함으로써, 배양 후의 세포로부터, 단백질 1을 대량이면서 경제적으로 취득할 수 있다. 바람직한 발현 벡터로는, 세균 내에서 복제 가능한 기지의 벡터 중 어느 것도 사용할 수 있고, 예를 들면 미국 특허 제5,151,350호 명세서에 기재되어 있는 플라스미드나, 샘브룩 등이 편집한 문헌 [Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)] 등에 기재되어 있는 플라스미드를 들 수 있다. 또한, 숙주로는 특별히 한정되지 않지만, 대장균 등의 박테리아, 진균류, 곤충 세포, 포유류 세포 등의 재조합 단백질을 발현시키기 위해 이용되는 공지된 숙주를 사용할 수 있다. 숙주 중에 핵산을 도입함으로써 숙주를 형질 전환시키기 위해서는, 각 숙주에 따라 해당 기술분야에서 알려진 어느 방법을 이용할 수도 있고, 예를 들면 샘브룩 등이 편집한 문헌 [Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)] 등에 기재되어 있는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 형질 전환한 세균을 배양하여 발현된 단백질을 회수하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 본 발명의 실시예에도 예시되어 있다. 또한, 상술한 절차 사이에 단백질의 N 말단의 메티오닌 잔기가 메티오닌아미노펩티다아제에 의해 절단되는 경우가 있다(문헌 [The Proteomics of N-terminal Methionine Cleavage, Molecular & Cellular Proteomics 5.12, p2336-2349, 2006년]). 이러한 단백질도 또한, 본 발명의 면역 글로불린 결합 단백질로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 서열번호 22의 N 말단의 메티오닌 잔기가 절단된 서열의 단백질은, 서열번호 22의 것과 동일한 면역 글로불린 결합 단백질로 취급하는 것으로 하고, 다른 서열에 있어서도 마찬가지로 한다.
본 발명의 다른 한 실시 형태에 따른 핵산은, 면역 글로불린 결합 단백질(단백질 1) 또는 그의 등기능 변이체를 코딩한다. 본 발명에서 면역 글로불린 결합 단백질의 「등기능 변이체(functional variant)」란, 부분적인 아미노산 잔기의 부가, 삭제, 치환, 아미노산 잔기의 화학적 수식 등에 의해 개변된 면역 글로불린 결합 단백질이며, 개변 전의 면역 글로불린 결합 단백질의 아미노산 서열과 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상, 더욱 바람직하게는 95％ 이상, 또한 바람직하게는 98％ 이상의 상동성을 유지하며, 면역 글로불린 결합 활성에 있어서, 개변 전의 면역 글로불린 결합 단백질과 동등한 것으로서 취급할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 상술한 바와 같이, 단백질 1은 면역 글로불린 결합 도메인을 1개 이상(바람직하게는 2 내지 12개, 보다 바람직하게는 3 내지 8개)을 포함하는 단백질일 수도 있다. 이러한 단백질을 코딩하는 적절한 발현 플라스미드를, 예를 들면 본 발명의 실시예에서 나타낸 바와 같은 공지된 방법으로 제작할 수 있고, 면역 글로불린 결합 도메인을 1개 이상 포함하는 단백질을 용이하게 제조할 수 있다.
1.2.2.3. 작용 효과
본 실시 형태에 따른 담체에 따르면, 초기의 IgG 동적 결합 용량(DBC)이 높고, 알칼리성 조건하에서의 세정(예를 들면 0.01 내지 0.8 M 수산화나트륨 등의 알칼리성 액을 이용한 세정)에 대하여 높은 내성을 갖는다.
1.3. 면역 글로불린을 단리하는 방법
본 발명의 한 실시 형태에 따른 면역 글로불린을 단리하는 방법을 설명한다. 본 실시 형태에 따른 면역 글로불린을 단리하는 방법은, 상기 친화성 크로마토그래피용 담체에 면역 글로불린을 함유하는 시료를 통액시켜, 상기 담체에 면역 글로불린을 흡착시키는 공정(제1 공정), 및 상기 담체로부터 상기 면역 글로불린을 용출시키는 공정(제2 공정)을 포함하고, 바람직하게는 상기 제2 공정 후에, 상기 담체를 알칼리성 액으로 세정하는 공정(제3 공정)을 더 포함한다.
제1 공정에서는, 상기 친화성 크로마토그래피용 담체를 충전한 칼럼 등에 면역 글로불린을 함유하는 시료를 리간드에 면역 글로불린이 흡착하는 조건으로 흘린다. 이 제1 공정에서는, 시료 중 면역 글로불린 이외의 물질의 대부분은, 리간드에 흡착되지 않고 칼럼을 통과한다. 이 후, 필요에 따라 리간드에 약하게 유지된 일부의 물질을 제거하기 위해, 담체를 NaCl 등의 염을 포함하는 중성의 완충액으로 세정할 수도 있다.
제2 공정에서는, pH 2 내지 5의 적절한 완충액을 흘리고, 리간드에 흡착된 면역 글로불린을 용출시킨다. 이 용출액을 회수함으로써, 시료로부터 면역 글로불린을 단리할 수 있다.
본 실시 형태에 따른 면역 글로불린을 단리하는 방법에 있어서, 바람직하게는 상기 제2 공정에 계속해서 제3 공정이 행해진다. 제3 공정에서는, 알칼리성 액으로 담체를 세정(CIP 세정)한다. 제3 공정에 사용되는 알칼리성 액으로는, 예를 들면 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 트리에틸아민, 수산화테트라부틸암모늄 등을 들 수 있다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체는, 단백질 리간드가 높은 알칼리 내성에 의해 상기 제3 공정에서의 세정 후에도 면역 글로불린 결합능을 안정적으로 유지하고 있기 때문에, 본 발명의 면역 글로불린 단리 방법에 반복하여 사용할 수 있다.
[실시예]
2. 실시예
이하, 본 실시 형태에 따른 친화성 크로마토그래피용 충전제를, 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명한다. 또한, 이하의 기재는 본 발명의 양태를 개괄적으로 나타내는 것으로, 특별히 이유 없이 이러한 기재에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
2.1. 제조예 1(다공질 입자의 합성)
글리시딜메타크릴레이트(미츠비시 레이온사 제조) 8.2 g, 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트(사토머사 제조) 65.9 g 및 글리세린모노메타크릴레이트(니찌유사 제조) 90.6 g을 2-옥타논(도요 고세이 고교사 제조) 245.8 g 및 아세토페논(와코 준야꾸 고교사 제조) 62 g에 용해시키고, 2,2'-아조이소부티로니트릴(와코 준야꾸 고교사 제조) 2 g을 첨가하고, 유기 단량체 용액을 제조하였다.
다음으로, 4240 g의 순수에 폴리비닐알코올(쿠라레사 제조 PVA-217) 8.5 g, 도데실황산나트륨(카오사 제조 에말 10G) 0.43 g 및 황산나트륨(와코 준야꾸 고교사 제조) 21.3 g을 첨가하고, 밤새 교반하여 수용액을 제조하였다.
이어서, 얻어진 수용액을 7 L 분리형 플라스크 내에 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여 온수조에 세팅하고, 질소 분위기하에 600 rpm으로 교반을 개시하였다. 계속해서, 분리형 플라스크를 온수조에 의해 가온하고, 수용액의 온도가 85℃가 되자마자, 이 수용액에 적하 깔때기를 이용하여 상기 유기 단량체 용액을 첨가하고, 5시간 교반을 행하였다.
이어서, 반응액을 냉각한 후, 이러한 반응액을 5 L의 폴리프로필렌제 병에 옮기고, 입자가 부유할 때까지 정치하고, 하측으로부터 여분의 물을 흡출하여 폐기하였다. 또한, 이 반응액에 아세톤을 가하여 입자를 침강시켰다. 다음으로, 반응액을 3분간 정치하여, 기울여 따르기에 의해 아세톤을 제거하였다. 이 조작을 2회 반복한 후 물을 가하여 입자를 침강시켰다. 또한, 3분간 정치하여 기울여 따르기를 행하였다. 이 조작을 2회 반복하여 입자를 세정하였다. 또한, 입자의 분산액을 아세톤으로 다시 치환하여 밤새 풍건한 후, 진공 건조기로 건조를 행하여 다공질 입자(이하, PB라 함) 90 g을 얻었다. PB의 평균 입경은 43 ㎛, 비표면적은 83 m2/g이었다.
2.2. 제조예 2(재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(JX01)의 제작)
본 제조예 및 이하의 제조예에서, DNA의 정제에는 GE 헬스케어의 PCR 정제 키트(PCR Purification Kit)를 사용하였다. 제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스에서 구입하였다. PCR용 효소는 퍼멘타스에서 구입하였다. PCR용 프라이머는 시그마에서 구입하였다. 라이게이션(ligation)은 T4 DNA 리가아제(인비트로젠)로 행하였다. DH5alpha 세포는 인비트로젠에서 구입하였다. BL21 세포는 스트라타젠에서 구입하였다. pET24a-d(+)는 노바젠에서 구입하였다. 특별한 기재가 없는 한, 모든 실험을 공급사의 추천 조건으로 행하였다.
2.2.1. JX01 플라스미드(JX01-pETM11)의 구축
단백질 A의 C 도메인의 A1V G29A 변이체인 C* 도메인을 코딩하는 DNA(서열번호 3)를 포함하는 플라스미드 JX01-pETM11을 하기 절차로 구축하였다.
(1) SP1B*-pETM11의 구축
단백질 A의 DNA 서열(Staphylococcus aureus(ATCC, 10832)의 cDNA)을 주형에, 이하의 프라이머 1(서열번호 4)와 프라이머 2(서열번호 5)를 이용하여 PCR을 행하고, 얻어진 DNA를 pETM11에 도입하고, B* 도메인(B 도메인의 A1V 변이체)을 코딩하는 플라스미드 SP1B*-pETM11을 구축하였다. SP1B*-pETM11에는, N 말단측에 TEV 인식 서열이 부가되고, NcoI 사이트와 SacI 사이트에 둘러싸인 B* 도메인을 코딩하는 염기 서열 SP1B* 서열(서열번호 6)이 포함되어 있었다.
Figure 112012094432289-pct00004
PCR 조건은 이하와 같음: 단계 1: 94℃ 1분(1 사이클), 단계 2: 94℃ 30초→ 55℃ 30초→ 72℃ 2.5분(25 사이클), 단계 3: 72℃ 10분(1 사이클) 후 4℃에서 유지.
PCR 산물은 PCR 정제 키트(GE 헬스케어)로 정제하고, 1％ 아가로스 TAE 겔을 이용하여 100℃에서 45분간 영동하였다.
(2) SP1B**-pETM11의 구축
PCR-보조 돌연변이유발(PCR-assisted mutagenesis)에서 SP1B*-pETM11로부터 B 도메인의 A1V G29A를 코딩하는 플라스미드를 구축하였다. 상세하게는, SP1B*-pETM11 다단계의 PCR-보조 돌연변이유발을 거쳐 얻어진 DNA를 pETM11에 도입하고, 염기 서열 SP1B**(서열번호 7)을 포함하는 SP1B**-pETM11을 구축하였다.
PCR-보조 돌연변이유발에는 이하의 프라이머를 사용하였다.
Figure 112012094432289-pct00005
PCR 조건은 이하와 같음: 단계 1: 94℃ 1분(1 사이클), 단계 2: 94℃ 30초→ 55℃ 1분→ 68℃ 15분(18 사이클), 단계 3: 68℃ 15분(1 사이클) 후 4℃에서 유지.
(3) SP1C*-pETM11의 구축
PCR-보조 돌연변이유발에서 SP1B** 도메인의 A1V G29A의 변이체인 C* 도메인의 플라스미드를 구축하였다. 상세하게는, SP1B**-pETM11로부터 다단계의 PCR-보조 돌연변이유발을 거쳐 얻어진 DNA를 pETM11에 도입하고, C* 도메인을 코딩하는 염기 서열 SP1C*(서열번호 14)를 포함하는 플라스미드 SP1C*-pETM11 구축하였다.
PCR-보조 돌연변이유발에는 이하의 프라이머를 사용하였다.
Figure 112012094432289-pct00006
PCR 조건은 이하와 같음: 단계 1: 94℃ 1분(1 사이클), 단계 2: 94℃ 30초→ 55℃ 1분→ 68℃ 15분(18 사이클), 단계 3: 68℃ 15분(1 사이클) 후 4℃에서 유지.
(3) JX01-pETM11의 구축
SP1C*-pETM11을 주형으로 하여, 하기 3조의 프라이머쌍을 각각 이용하여 PCR을 행하고, EcoRI-EcoRI, EcoRI-SacI 및 SacI-XhoI의 제한 효소 사이트를 각각 갖는 3개의 C* 도메인을 코딩하는 염기 서열을 구축하였다. 이 3개의 염기 서열을 각각에 대응하는 제한 효소로 소화시킨 후, 라이게이션 반응에 의해 SP1C*-pETM11에 동시에 도입하여 JX01의 염기 서열(서열번호 21)을 포함하는 플라스미드 JX01-pETM11 구축하였다. 이 라이게이션 반응은 SP1C*-pETM11의 EcoRI와 XhoI의 제한 효소 사이드를 이용하였다.
Figure 112012094432289-pct00007
PCR 조건은 이하와 같음: 단계 1: 94℃ 1분(1 사이클), 단계 2: 94℃ 30초→ 55℃ 30초→ 68℃ 1.5분(18 사이클), 단계 3: 68℃ 10분(1 사이클) 후 4℃에서 유지.
DNA를 증폭시키기 위해, 라이게이션 반응에서 얻어진 JX01-pETM11을 DH5alpha 컴피턴트 세포(competent cell)로 형질 전환하였다. 양성 콜로니를 선택하고, DNA 시퀀싱에서 올바른 서열이 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 그 후, 올바른 DNA 서열을 갖는 JX01-pETM11을 BL21 세포로 형질 전환하였다.
2.2.2. JX01의 발현 및 정제
얻어진 JX01-pETM11 벡터를 E.coli(BL21주) 세포(스트라타젠 제조)에 도입하여 배양, 18℃에서 1 mM의 IPTG(시그마 알드리치 제조)를 첨가하고, 15시간 인큐베이션하여 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질을 발현시켰다. 유도에 앞서서, 흡광도(OD 600)가 약 0.6에 도달할 때까지 상기 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다. 단백질 발현 후 세포를 회수하고, pH 8.0의 트리스 완충액 중에서 파쇄하였다.
얻어진 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질을, Ni 친화성 크로마토그래피(Ni-NTA(니트릴로트리아세팅산) 입자, 퀴아젠사 제조)에 의해 정제하였다. 정제된 면역 글로불린 결합 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)에 의해 더 정제하였다. SDS-PAGE에 의해서 확인된 면역 글로불린 결합 단백질의 순도는 96％였다. 정제된 면역 글로불린 결합 단백질을 JX01로 하였다(서열번호 22).
2.3. 제조예 3(재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(JX02)의 제작)
50 mM 트리스염산, 0.5 mM EDTA 및 1 mM DTT의 완충액(pH 8.0) 15 mL에, JX01 150 mg, MobiTEV 프로테아제(모비테크사) 900U를 가하고 30℃에서 12시간 교반하고 JX01의 TEV 인식 서열을 절단하였다. TEV 프로테아제로 절단된 JX01을 Ni-NTA 칼럼(용량: 4 mL)에 통과시켜서 JX01의 히스태그(His-tag) 부위가 절단된 조 JX02를 회수하였다. 얻어진 조 JX02는 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)에 의해, pH 7.5의 HEPES 완충액 중에서 더 정제되었다. 이 JX02를 원심 농축기(비바스핀 20, 싸토리우스사 제조)로 농축한 후, 10 mM HEPES 완충액(pH 7.5) 중에서 12시간 투석하여 JX02(서열번호 29)를 제조하였다.
2.4. 제조예 4(재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(JX03)의 제작)
2.4.1. JX03-pET24-a-d(+)의 구축
JX01-pETM11을 주형에 하기의 프라이머 3(서열번호 30)과 프라이머 4(서열번호 31)를 이용한 PCR에 의해, JX01의 N 말단에 ATKASK를 갖는 폴리펩티드 4XC*를 코딩하는 DNA를 구축하였다. 이 DNA를 pET24-a-d(+)에 도입하고, JX03-pET24-a-d(+) 플라스미드를 구축하였다. 도입은 pET24-a-d(+)의 NdeI와 XhoI 사이트를 이용하였다. 라이게이션 반응은 T4 DNA 리가아제를 사용하였다. DNA를 증폭하기 위해, 라이게이션 반응에서 얻어진 JX03-pET24-a-d(+)를 DH5alpha 컴피턴트 세포로 형질 전환하였다. 양성 콜로니를 선택하여 배양, DNA 시퀀싱에서 올바른 서열이 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 그 후, 바람직한 JX03 염기 서열(서열번호 32)을 갖는 JX03-pET24-a-d(+)를 BL21 세포로 형질 전환하였다.
Figure 112012094432289-pct00008
PCR 조건은 이하와 같음: 단계 1: 94℃ 1분(1 사이클), 단계 2: 94℃ 30초→ 55℃ 30초→ 68℃ 2.5분(25 사이클), 단계 3: 68℃ 10분(1 사이클) 후 4℃에서 유지.
2.4.2. JX03의 발현 및 정제
얻어진 JX03-pET24-a-d(+)를 E.coli(BL21주) 세포에 도입하여 배양, 18℃에서 1 mM의 IPTG(시그마 알드리치 제조)를 첨가하고, 15시간 인큐베이션하여 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질을 발현시켰다. 유도에 앞서서, 흡광도(OD 600)가 약 0.6에 도달할 때까지 상기 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다. 단백질 발현 후 세포를 회수하고, pH 8.0의 트리스 완충액 중에서 파쇄하였다.
얻어진 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)와 양이온 교환에 의해 크로마토그래피(SP-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)에 의해 정제하였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 면역 글로불린 결합 단백질의 순도는 96％ 이상이었다. 정제된 면역 글로불린 결합 단백질을 JX03으로 하였다(서열번호 33).
2.5. 제조예 5(재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(JX04)의 제작)
2.5.1. JX04-pET24-a-d(+)의 구축
JX03-pET24-a-d(+)로부터 하기의 2단계를 거쳐, JX03의 N 말단 ATKASK가 결실되고 C 말단에 ATKASK가 부가된 폴리펩티드 JX04를 코딩하는 DNA(서열번호 34)를 포함하는 플라스미드 JX04-pET24-a-d(+)를 구축하였다.
(1) 하기의 프라이머를 이용한 PCR-보조 돌연변이유발에서 JX03-pET24-a-d(+)로부터 N 말단 ATKASK를 코딩하는 DNA 서열을 삭제하였다.
Figure 112012094432289-pct00009
PCR 조건은 이하와 같음: 단계 1: 94℃ 1분(1 사이클), 단계 2: 94℃ 30초→ 55℃ 1분→ 68℃ 15분(18 사이클), 단계 3: 68℃ 15분(1 사이클) 후 4℃에서 유지.
얻어진 플라스미드를 DH5alpha 컴피턴트 세포에 도입하여 양성 콜로니를 배양하고, 플라스미드 DNA를 정제하고 DNA 시퀀싱에서 N 말단 ATKASK의 DNA 서열이 삭제된 것을 확인하였다.
(2) 하기의 프라이머를 이용한 PCR-보조 돌연변이유발에 의해, (1)에서 얻어진 N 말단 ATKASK 서열을 삭제한 플라스미드에 C 말단 ATKASK 서열을 부가하였다.
Figure 112012094432289-pct00010
PCR 조건은 이하와 같음: 단계 1: 94℃ 1분(1 사이클), 단계 2: 94℃ 30초→ 55℃ 1분→ 68℃ 15분(18 사이클), 단계 3: 68℃ 15분(1 사이클) 후 4℃에서 유지.
얻어진 플라스미드를 DH5alpha 컴피턴트 세포에 도입하여 세포를 배양하고, 플라스미드 DNA를 정제하고, DNA 시퀀싱에서 C 말단 ATKASK의 DNA 서열이 부가되어 있는 것을 확인하였다. 올바른 DNA 서열을 갖는 플라스미드 JX04-pET24-a-d(+)를 BL21 세포로 형질 전환하였다.
2.5.2. JX04의 발현 및 정제
얻어진 JX04-pET24-a-d(+)를 E.coli(BL21주) 세포에 도입하여 배양을 행하고, 18℃에서 1 mM의 IPTG(시그마 알드리치 제조)를 첨가하고, 15시간 인큐베이션하여 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질을 발현시켰다. 유도에 앞서서, 흡광도(OD 600)가 약 0.6에 도달할 때까지 상기 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다. 단백질 발현 후 세포를 회수하고, pH 8.0의 트리스 완충액 중에서 파쇄하였다.
얻어진 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)와 양이온 교환에 의해 크로마토그래피(SP-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)에 의해 정제하였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 면역 글로불린 결합 단백질의 순도는 96％ 이상이었다. 정제된 면역 글로불린 결합 단백질을 JX04로 하였다(서열번호 35).
2.6. 제조예 6(재조합형 면역 글로불린 결합 단백질(JX05)의 제작)
2.6.1. JX05-pET24-a-d(+)의 구축
JX03-pET24-a-d(+)로부터 하기 도 1에서 도시되는 3단계를 거쳐, 8개의 면역 글로불린 결합 도메인과 N 말단 ATKASK를 갖는 폴리펩티드 JX05를 코딩하는 DNA 서열(서열번호 40)을 포함하는 플라스미드 JX05-pET24-a-d(+)를 구축하였다.
(1) AccI 제한 효소로 JX03-pET24-a-d(+)를 소화시켰다.
(2) 하기의 프라이머를 이용한 PCR-보조 돌연변이유발에서 2개의 AccI 사이트를 갖는 4 도메인 플라스미드 pUC57/4C(pUC57은 젠스크립트에서 구입함)를 구축하였다.
Figure 112012094432289-pct00011
PCR 조건은 이하와 같음: 단계 1: 94℃ 1분(1 사이클), 단계 2: 94℃ 30초→ 55℃ 1분→ 68℃ 15분(18 사이클), 단계 3: 68℃ 15분(1 사이클) 후 4℃에서 유지.
얻어진 플라스미드를 DH5alpha 컴피턴트 세포에 도입하여 양성 콜로니를 배양하고, 플라스미드 DNA를 정제하고, DNA 시퀀싱에서 2개째의 AccI 사이트가 추가 된 것을 확인하였다. 이 플라스미드도 AccI 제한 효소로 소화시켰다.
(3) AccI 제한 효소로 소화된 JX03-pET24-a-d(+)와 pUC57/4C를 T4 DNA 리가아제로 라이게이션하여 JX05-pET24-a-d(+)를 구축하였다. DNA를 증폭하기 위해, 라이게이션 반응에서 얻어진 새로운 JX05-pET24-a-d(+)를 DH5alpha 컴피턴트 세포로 형질 전환하였다. 양성 콜로니를 선택하고, DNA 시퀀싱으로 올바른 서열인 것을 확인하였다. 그 후, 올바른 DNA 서열을 갖는 JX05-pET24-a-d(+)를 BL21 세포로 형질 전환하였다.
2.6.2. JX05의 발현 및 정제
얻어진 JX05-pET24-a-d(+)를 E.coli(BL21주) 세포에 도입하여 배양, 18℃에서 1 mM의 IPTG(시그마 알드리치 제조)를 첨가하고, 15시간 인큐베이션하여 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질을 발현시켰다. 유도에 앞서서, 흡광도(OD 600)가 약 0.6에 도달할 때까지 상기 세포를 37℃에서 인큐베이션하였다. 단백질 발현 후 세포를 회수하고, pH 8.0의 트리스 완충액 중에서 파쇄하였다.
얻어진 재조합형 면역 글로불린 결합 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)와 양이온 교환에 의해 크로마토그래피(SP-세파로스 FF, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조)에 의해 정제하였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 면역 글로불린 결합 단백질의 순도는 96％ 이상이었다. 정제된 면역 글로불린 결합 단백질을 JX05로 하였다(서열번호 41).
2.7. 제조예 7(면역 글로불린 결합 단백질의 입자에 대한 고정화-1)
1.1 mL의 제조예 1에서 제조한 PB와, 20 mg의 JX02가 분산된 10 mL의 0.1 M 인산 완충액(pH 6.8)과의 혼합액을 제조한 후, 2.1 g의 황산나트륨을 가하고, 25℃에서 24시간 전도 혼화하고, JX02를 PB에 결합시켰다. 생성된 입자를 여과한 후, 5 M 티오글리세롤 10 mL와 혼합하여 30℃에서 4시간 반응시키고, 나머지 에폭시기를 블록킹하고, PBS/0.05％ Teeen20으로 세정한 후, PBS에서 세정하고, 1.1 mL의 JX02 결합 다공질 입자(JX02-PB1)를 얻었다.
동일한 절차로, JX03 내지 JX05 중 어느 하나가 결합된 다공질 입자(JX03-PB1, JX04-PB1, JX05-PB1)를 얻었다.
2.8. 제조예 8(면역 글로불린 결합 단백질의 입자에 대한 고정화-2)
4 mL의 제조예 1에서 제조한 PB와, 75 mg의 JX02가 분산된 40 mL의 4 g의 황산나트륨을 용해시킨 0.1 M 붕산 완충액(pH 8.0)과의 혼합액을 제조하고, 25℃에서 5시간 전도 혼화하고, JX02를 PB에 결합시켰다. 생성된 입자를 여과한 후, 1 M 티오글리세롤 40 mL와 혼합하여 25℃에서 4시간 반응시키고, 나머지 에폭시기를 블록킹하여 0.5 M NaOH로 세정한 후, 0.1 M 구연산나트륨 완충액(pH 3.2), 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.6)로 세정하여 4 mL의 JX02 결합 다공질 입자(JX02-PB2)를 얻었다.
동일한 절차로, JX03 내지 JX05 중 어느 하나가 결합된 다공질 입자(JX03-PB2, JX04-PB2, JX05-PB2)를 얻었다.
3. 시험예
3.1. 측정예 1(면역 글로불린 G(IgG) 동적 결합 용량의 측정)
JX02-PB2를 내경 0.5 cm의 칼럼에 베드(bed) 높이 20 cm까지 충전하였다. 칼럼을 20 mM 인산 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 후, 인간 폴리클로날 IgG(5 mg/mL)를 포함하는 20 mM 인산 완충액(pH 7.4)을 선유속 300 cm/시간으로 흘리고, 흡광도 모니터로 용출액 내의 인간 폴리클로날 IgG 농도가 10％ 파과(破過; Break through)시 인간 폴리클로날 IgG 흡착량과 담체 부피로부터 동적 결합 용량(DBC)을 구하였다. DBC 결과는 45 mg/mL였다.
동일한 절차로 JX03-PB2, JX04-PB2, JX05-PB2의 DBC를 구하였다.
3.2. 측정예 2(내알칼리성의 측정)
측정예 1에서 이용한 담체 충전 칼럼을 AKTAprime plus에 세팅하고, 0.5 M 수산화나트륨 20 ml를 칼럼 내에 흘렸다. 칼럼을 장치로부터 벗기고, 밀폐한 후 실온에서 일정 시간(15, 30, 45시간) 방치한 후, 측정예 1과 마찬가지로 선유속 300 cm/시간에 있어서의 인간 폴리클로날 IgG의 결합 용량을 측정하였다. 0.5 M 수산화나트륨으로 처리하기 전의 인간 폴리클로날 IgG 결합량(측정예 1)을 100％로 했을 때의 결합 용량 유지율을 구하였다.
3.4. 측정예 3
Mabselect SuRe(GE 헬스케어 제조) 4 ml를 칼럼에 충전하고, 측정예 1 내지 2와 마찬가지로 DBC 및 결합 용량 유지율을 측정하였다.
측정 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 면역 글로불린 단백질 JX02 내지 JX05가 결합된 담체 입자 JX02-PB2 내지 JX05-PB2는, 초기 DBC는 높고, 강알칼리 접촉 시간이 길어져도, 결합 용량의 유지율의 저하가 작았다. JX02-PB1 내지 JX05-PB1에 있어서도 동일한 경향이 보였다.
이에 따라, 상기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드가 고정화된 담체는 내알칼리성이 우수하다는 것이 확인되었다.
Figure 112012094432289-pct00012
본 실시 형태에 관한 설명은 이상과 같다. 본 발명은 상술한 실시 형태로 한정되는 것이 아니며, 더 다양한 변형이 가능하다. 또한 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성과 실질적으로 동일한 구성(예를 들면, 기능, 방법 및 결과가 동일한 구성, 또는 목적 및 결과가 동일한 구성)을 포함한다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성이 본질적이지 않은 부분을 치환한 구성을 포함한다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성과 동일한 작용 효과를 발휘하는 구성 또는 동일한 목적을 달성할 수 있는 구성을 포함한다. 또한, 본 발명은 실시 형태에서 설명한 구성에 공지 기술을 부가한 구성을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> JSR Corporation <110> The University of Western Ontario <120> Media for Affinity Chromatography and Method for Isolating Immunoglobrin <130> JSR0034 <150> US 61/425412 <151> 2010-12-21 <150> US 61/425617 <151> 2010-12-21 <150> JP 2010-285492 <151> 2010-12-22 <160> 43 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 3 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 4 ggccatggtt gtggataaca aattc????? 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 ggagctccta tttttttgga gcttg ????? 25 <210> 6 <211> 267 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 6 atgaaacatc accatcacca tcaccccatg agcgattacg acatccccac tactgagaat 60 ctttattttc agggcgccat ggttgtggat aacaaattca acaaagaaca acaaaatgct 120 ttctatgaaa tcttacattt acctaactta aacgaagaac aacgcaatgg tttcatccaa 180 agcctaaaag atgacccaag ccaaagcgct aaccttttag cagaagctaa aaagctaaat 240 gatgcacaag ctccaaaata ggagctc 267 <210> 7 <211> 249 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 7 atgaaacacc atcaccatca ccatcacgag aatctttatt ttcagggcgc caccaaagct 60 agcaaagtgg ataacaaatt caacaaagaa caacaaaatg ctttctatga aatcttacat 120 ttacctaact taaacgaaga acaacgcaat gctttcatcc aaagcctaaa agatgaccca 180 agccaaagcg ctaacctttt agcagaagct aaaaagctaa atgatgcaca agctccaaaa 240 taggagctc 249 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 8 gcgaagaaca acgcaatgct ttcatccaaa gcctaaaag 39 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 9 cttttaggct ttggatgaaa gcattgcgtt gttcttcgc 39 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 10 ctttattttc agggcgccac caaagtggat cataaattca ac ?? 42 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 11 gttgaattta tgatccactt tggtggcgcc ctgaaaataa ag ? 42 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 12 ggcgccacca aagctagcaa agtggatcat aaattc ????? 36 <210> 13 <211> 36 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gctcacgctt gggtcatctt ttaggc 46 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 19 gacccaagcg tgagcaaaga aatcttagca gaagctaaaa ag 42 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 20 ctttttagct tctgctaaga tttctttgct cacgcttggg tc 42 <210> 21 <211> 783 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 21 atgaaacacc atcaccatca ccatcacgag aatctttatt ttcagggcgc caccaaagct 60 Agcaaagtag acaacaaatt caacaaagaa caacaaaatg ctttctatga aatcttacat 120 Ttacctaact taaccgaaga acaacgcaat gctttcatcc aaagcctaaa agatgaccca 180 Agcgtgagca aagaaatctt agcagaagct aaaaagctaa atgatgcaca agctccaaaa 240 Gaattcgtgg ataacaaatt caacaaagaa caacaaaatg ctttctatga aatcttacat 300 Ttacctaact taaccgaaga acaacgcaat gctttcatcc aaagcctaaa agatgaccca 360 Agcgtgagca aagaaatctt agcagaagct aaaaagctaa atgatgcaca agctccaaaa 420 Gaattcgtgg ataacaaatt caacaaagaa caacaaaatg ctttctatga aatcttacat 480 Ttacctaact taaccgaaga acaacgcaat gctttcatcc aaagcctaaa agatgaccca 540 Agcgtgagca aagaaatctt agcagaagct aaaaagctaa atgatgcaca agctccaaaa 600 Gagctcgtgg ataacaaatt caacaaagaa caacaaaatg ctttctatga aatcttacat 660 Ttacctaact taaccgaaga acaacgcaat gctttcatcc aaagcctaaa agatgaccca 720 agcgtgagca aagaaatctt agcagaagct aaaaagctaa atgatgcaca agctccaaaa 780 tag 783 <210> 22 <211> 260 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Immunoglobrin binding protein JX01 <400> 22 Met Lys His His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 10 15 Ala Thr Lys Ala Ser Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln 20 25 30 Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln 35 40 45 Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys 50 55 60 Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 65 70 75 80 Glu Phe Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 85 90 95 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 100 105 110 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala 115 120 125 Glu 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ccaaagctag caaagtagac aacaaattca acaaagaaca acaaaatgct 60 ttctatgaaa tcttacattt acctaactta accgaagaac aacgcaatgc tttcatccaa 120 agcctaaaag atgacccaag cgtgagcaaa gaaatcttag cagaagctaa aaagctaaat 180 gatgcacaag ctccaaaaga attcgtggat aacaaattca acaaagaaca acaaaatgct 240 ttctatgaaa tcttacattt acctaactta accgaagaac aacgcaatgc tttcatccaa 300 agcctaaaag atgacccaag cgtgagcaaa gaaatcttag cagaagctaa aaagctaaat 360 gatgcacaag ctccaaaaga attcgtggat aacaaattca acaaagaaca acaaaatgct 420 ttctatgaaa tcttacattt acctaactta accgaagaac aacgcaatgc tttcatccaa 480 agcctaaaag atgacccaag cgtgagcaaa gaaatcttag cagaagctaa aaagctaaat 540 gatgcacaag ctccaaaaga gctcgtggat aacaaattca acaaagaaca acaaaatgct 600 ttctatgaaa tcttacattt acctaactta accgaagaac aacgcaatgc tttcatccaa 660 agcctaaaag atgacccaag cgtgagcaaa gaaatcttag cagaagctaa aaagctaaat 720 gatgcacaag ctccaaaata gctcgag 747 <210> 33 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Immunoglobrin binding protein JX03 <400> 33 Met Ala Thr Lys Ala Ser Lys 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aaagcctaaa agatgaccca 660 agcgtgagca aagaaatctt agcagaagct aaaaagctaa atgatgcaca agctccaaaa 720 gccaccaaag ctagcaaata gctcgag 747 <210> 35 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Immunoglobrin binding protein JX04 <400> 35 Met Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 1 5 10 15 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile 20 25 30 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu 35 40 45 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn 50 55 60 Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys 85 90 95 Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu 100 105 110 Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys 115 120 125 Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr 130 135 140 Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 145 150 155 160 Val Ser 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caatgctttc atccaaagcc taaaagatga cccaagcgtg 840 agcaaagaaa tcttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cacaagctcc aaaagaattc 900 gtggataaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt acatttacct 960 aacttaaccg aagaacaacg caatgctttc atccaaagcc taaaagatga cccaagcgtg 1020 agcaaagaaa tcttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cacaagctcc aaaagaattc 1080 gtggataaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt acatttacct 1140 aacttaaccg aagaacaacg caatgctttc atccaaagcc taaaagatga cccaagcgtg 1200 agcaaagaaa tcttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cacaagctcc aaaagagctc 1260 gtggataaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt acatttacct 1320 aacttaaccg aagaacaacg caatgctttc atccaaagcc taaaagatga cccaagcgtg 1380 agcaaagaaa tcttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cacaagctcc aaaatagctc 1440 gag 1443 <210> 41 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Immunoglobrin binding protein JX05 <400> 41 Met Ala Thr Lys Ala Ser Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln 1 5 10 15 Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu 20 25 30 Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser 35 40 45 Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro 50 55 60 Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu 65 70 75 80 Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile 85 90 95 Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu 100 105 110 Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe 115 120 125 Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn 130 135 140 Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp 145 150 155 160 Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp 165 170 175 Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn 180 185 190 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg 195 200 205 Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu 210 215 220 Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val 225 230 235 240 Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu 245 250 255 His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser 260 265 270 Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys 275 280 285 Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys Phe 290 295 300 Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn 305 310 315 320 Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp 325 330 335 Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp 340 345 350 Ala Gln Ala Pro Lys Glu Phe Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln 355 360 365 Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu 370 375 380 Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser 385 390 395 400 Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro 405 410 415 Lys Glu Leu Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe 420 425 430 Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala 435 440 445 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu 450 455 460 Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 465 470 475 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 42 cacaagcacc gaaagtagac ctcatcggat ccc 33 <210> 43 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 43 gggatccgat gaggtctact ttcggtgctt gtg 33

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드가 고정화된 친화성 크로마토그래피용 담체.
    <화학식 1>
    Figure 112014072723459-pct00016

    (식 중,
    R은 AXKAXK (X는 S 또는 T) 또는 AXK-GA-XK (X는 S 또는 T)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 6 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타내고,
    R2는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 면역 글로불린 결합 도메인을 포함하는, 50 내지 500개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타냄(여기서, R2가 R에 결합하는 말단은 상기 면역 글로불린 결합 도메인의 C 말단 또는 N 말단임))
  2. 제1항에 있어서, 상기 R이 ATK와 ASK의 조합으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 6 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 나타내는 것인 친화성 크로마토그래피용 담체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 R이 ATKASK 또는 ASKATK로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 친화성 크로마토그래피용 담체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 단백질 리간드는 상기 리간드 중 아미노기 또는 티올기가 에폭시기를 갖는 담체와 에폭시기 개환 반응됨으로써, 상기 담체에 고정화되어 있는 것인 친화성 크로마토그래피용 담체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 크로마토그래피용 담체에 면역 글로불린을 함유하는 시료를 통액시켜, 상기 담체에 면역 글로불린을 흡착시키는 공정, 및
    상기 담체로부터 상기 면역 글로불린을 용출시키는 공정
    을 포함하는, 면역 글로불린을 단리하는 방법.
  6. 제4항에 기재된 친화성 크로마토그래피용 담체에 면역 글로불린을 함유하는 시료를 통액시켜, 상기 담체에 면역 글로불린을 흡착시키는 공정, 및
    상기 담체로부터 상기 면역 글로불린을 용출시키는 공정
    을 포함하는, 면역 글로불린을 단리하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
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