CN111148753B - 免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供碱耐性提高的源自蛋白L的免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体。所述免疫球蛋白结合蛋白质至少包含1个免疫球蛋白结合结构域的变异体，以及所述亲和载体包含固相载体，所述固相载体结合有该免疫球蛋白结合蛋白质。该免疫球蛋白结合结构域的变异体由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性且具有赋予的变异的氨基酸序列构成，具有免疫球蛋白κ链结合活性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫球蛋白结合蛋白质、使用其的亲和载体以及使用该亲和载体的抗体或其片段的分离方法。
背景技术
抗体近年来被广泛利用于研究用试剂、抗体医药等。这些试剂、医药用的抗体通常通过亲和色谱进行纯化。抗体的亲和纯化通常使用固定化有作为与免疫球蛋白特异性结合的物质的配体的柱。该配体通常使用蛋白A、蛋白G、蛋白L等免疫球蛋白结合蛋白质。
亲和纯化用柱的清洗使用碱溶液，另一方面，亲和配体中使用的免疫球蛋白结合蛋白质通常碱耐性低。因此，期望提高配体蛋白质的碱耐性。蛋白A是从相对较早一直使用的配体蛋白质，提高碱耐性的技术也从较早一直在研究。例如，公开了通过C结构域或Z结构域中的特定的氨基酸的改变(专利文献1)或Asn的取代(专利文献2)来提高蛋白A的碱耐性的方法。
蛋白L由于与免疫球蛋白κ轻链结合，因此，使用于Fab、单链抗体(scFv)等低分子抗体的纯化。关于改变为亲和配体用的蛋白L的报告少。例如，专利文献3和4中记载了包含蛋白L的结构域或其变异体的免疫球蛋白κ链结合性多肽。专利文献5的实施例中记载了具有蛋白L的B5结构域的免疫球蛋白κ链结合性肽的氨基酸序列的选自15位、16位、17位和18位中的1个以上的氨基酸残基被取代的氨基酸序列且其酸解离pH与取代导入前相比移至中性侧的免疫球蛋白κ链可变区域结合性肽。专利文献6中记载了包含在蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列中选自第7位、第13位、第22位和第29位中的部位的至少2个以上被赖氨酸以外的碱性氨基酸或具有羟基的氨基酸取代的氨基酸序列的免疫球蛋白结合结构域的碱稳定性优异。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开公报第2007/097361号
专利文献2：国际公开公报第2000/023580号
专利文献3：国际公开公报第2016/096643号
专利文献4：美国专利第6884629号公报
专利文献5：国际公开公报第2016/121703号
专利文献6：国际公开公报第2017/069158号
发明内容
寻求一种用于作为亲和配体使用的碱耐性提高的源自蛋白L的免疫球蛋白结合结构域。本发明提供碱耐性提高的包含源自蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的变异体的免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体。
本发明提供以下内容。
一种免疫球蛋白结合蛋白质，包含至少1个免疫球蛋白结合结构域的变异体，
该免疫球蛋白结合结构域的变异体由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列且具有选自以下的(a)～(h)中的至少1个变异的氨基酸序列构成，具有免疫球蛋白κ链结合活性：
(a)相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(b)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(c)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(d)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(e)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(f)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(g)对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入至少1个氨基酸残基；
(h)至少1个脯氨酸的缺失。
另外，本发明提供编码所述免疫球蛋白结合蛋白质的多核苷酸。
另外，本发明提供包含所述多核苷酸的载体。
另外，本发明提供包含所述载体的转化体。
另外，本发明提供包含固相载体和结合于该固相载体的所述免疫球蛋白结合蛋白质的亲和载体。
另外，本发明提供使用所述亲和载体的抗体或其片段的分离方法。
另外，本发明提供包括使所述免疫球蛋白结合蛋白质在所述转化体或无细胞蛋白质合成系统中表达、或者化学合成的免疫球蛋白结合蛋白质的制造方法。
另外，本发明提供以下内容。
一种方法，是免疫球蛋白结合结构域的变异体的制造方法，包括对由序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列或与它们具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽加入选自以下的(a)～(h)中的至少1个变异：
(a)相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(b)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(c)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(d)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(e)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(f)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(g)对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入至少1个氨基酸残基；
(h)至少1个脯氨酸的缺失。
另外，本发明提供包括将所述免疫球蛋白结合蛋白质固定于固相载体的亲和载体的制造方法。
本发明的免疫球蛋白结合蛋白质对免疫球蛋白κ链的结合活性高且碱耐性优异，因此作为亲和配体有用。
具体实施方式
以下记载本发明的例示性实施方式系记载如下。
[1]一种免疫球蛋白结合蛋白质，包含至少1个免疫球蛋白结合结构域的变异体，
该免疫球蛋白结合结构域的变异体由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列且具有选自以下的(a)～(h)中的至少1个变异的氨基酸序列构成，具有免疫球蛋白κ链结合活性：
(a)相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(b)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(c)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(d)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(e)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(f)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(g)对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入至少1个氨基酸残基；
(h)至少1个脯氨酸的缺失。
[2]根据[1]所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，
上述(a)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(b)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(c)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(d)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(e)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(f)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(g)的变异是对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入1个氨基酸残基，
上述(h)的变异是1～3个脯氨酸的缺失。
[3]根据[1]或[2]所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，
上述(a)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的赖氨酸取代为精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，
上述(b)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的赖氨酸取代为精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，
上述(c)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的苏氨酸取代为精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，
上述(d)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的谷氨酸取代为赖氨酸，
上述(e)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的酪氨酸取代为苯丙氨酸或色氨酸，
上述(f)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的天冬酰胺取代为谷氨酰胺，
上述(g)的变异是对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的天冬酰胺与相当于55位的位置的甘氨酸之间插入丙氨酸、亮氨酸或酪氨酸，
上述(h)的变异是选自相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置的脯氨酸、相当于7位的位置的脯氨酸和相当于10位的位置的脯氨酸中的1个以上的脯氨酸的缺失。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，上述免疫球蛋白结合结构域的变异体由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性且具有选自以下的(a’)～(h’)中的至少1个的氨基酸序列构成：
(a’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
(b’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
(c’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
(d’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的赖氨酸；
(e’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的苯丙氨酸或色氨酸；
(f’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的谷氨酰胺；
(g’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间的丙氨酸、亮氨酸或酪氨酸；
(h’)选自相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置、相当于7位的位置和相当于10位的位置中的至少1个位置的脯氨酸的缺失。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，上述免疫球蛋白结合结构域的变异体由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性且具有以下的(a”)～(l”)的任一个的氨基酸序列构成：
(a”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的精氨酸；
(b”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的精氨酸；
(c”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的精氨酸；
(d”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的赖氨酸；
(e”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的苯丙氨酸；
(f”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的谷氨酰胺；
(g1”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的55位的位置与相当于56位的位置之间的丙氨酸；
(g2”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的55位的位置与相当于56位的位置之间的酪氨酸；
(h1”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置的脯氨酸的缺失；
(h2”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置和相当于7位的位置的脯氨酸的缺失；
(h3”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置、相当于7位的位置和相当于10位的位置的脯氨酸的缺失；
(i”)该(a”)和(b”)的组合；
(j”)该(b”)、(c”)和(f”)的组合；
(k”)该(b”)、(c”)、(d”)和(f”)的组合；
(l”)该(a”)、(b”)、(c”)、(d”)、(f”)和(h3”)的组合。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，上述序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列为序列号9所示的氨基酸序列。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，上述至少85％的同源性为至少90％的同源性。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质，其中，包含2个以上的上述免疫球蛋白结合结构域的变异体。
[9]一种多核苷酸，编码[1]～[8]中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质。
[10]一种载体，包含[9]所述的多核苷酸。
[11]一种转化体，包含[10]所述的载体。
[12]一种亲和载体，包含固相载体和结合于该固相载体的[1]～[8]中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质。
[13]一种抗体或其片段的分离方法，使用[12]所述的亲和载体。
[14]一种免疫球蛋白结合蛋白质的制造方法，包括使[1]～[8]中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质在[11]所述的转化体或无细胞蛋白质合成系统中表现，或者化学合成。
[15]一种方法，是免疫球蛋白结合结构域的变异体的制造方法，包括对由序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列或与它们具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽加入选自以下的(a)～(h)中的至少1个变异：
(a)相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(b)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(c)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(d)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(e)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(f)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(g)对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入至少1个氨基酸残基；
(h)至少1个脯氨酸的缺失。
[16]根据[15]所述的制造方法，其中，
上述(a)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(b)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(c)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(d)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(e)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(f)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基，
上述(g)的变异是对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入1个氨基酸残基，
上述(h)的变异是1～3个脯氨酸的缺失。
[17]根据[15]或[16]所述的制造方法，其中，
上述(a)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的赖氨酸取代为精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，
上述(b)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的赖氨酸取代为精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，
上述(c)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的苏氨酸取代为精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，
上述(d)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的谷氨酸取代为赖氨酸，
上述(e)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的酪氨酸取代为苯丙氨酸或色氨酸，
上述(f)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的天冬酰胺取代为谷氨酰胺，
上述(g)的变异是对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的天冬酰胺与相当于55位的位置的甘氨酸之间插入丙氨酸、亮氨酸或酪氨酸，
上述(h)的变异是选自相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置的脯氨酸、相当于7位的位置的脯氨酸和相当于10位的位置的脯氨酸中的1个以上的脯氨酸的缺失。
[18]根据[15]～[17]中任一项所述的制造方法，其中，上述至少1个变异为以下的(a”)～(l”)的任一个：
(a”)相当于序列号9所示的氨基酸序列17位的位置的赖氨酸取代为精氨酸；
(b”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的赖氨酸取代为精氨酸；
(c”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的苏氨酸取代为精氨酸；
(d”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的谷氨酸取代为赖氨酸；
(e”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的酪氨酸取代为苯丙氨酸；
(f”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的天冬酰胺取代为谷氨酰胺；
(g1”)对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入丙氨酸；
(g2”)对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入酪氨酸；
(h1”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置的脯氨酸的缺失；
(h2”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置和相当于7位的位置的脯氨酸的缺失；
(h3”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置、相当于7位的位置和相当于10位的位置的脯氨酸的缺失；
(i”)该(a”)和(b”)的组合；
(j”)该(b”)、(c”)和(f”)的组合；
(k”)该(b”)、(c”)、(d”)和(f”)的组合；
(l”)该(a”)、(b”)、(c”)、(d”)、(f”)和(h3”)的组合。
[19]根据[15]～[18]中任一项所述的制造方法，其中，上述序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列为序列号9所示的氨基酸序列。
[20]根据[15]～[19]中任一项所述的制造方法，其中，上述至少85％的同源性为至少90％的同源性。
[21]根据[15]～[20]中任一项所述的制造方法，其中，上述免疫球蛋白结合结构域的变异体与亲本结构域(親ドメイン)相比，碱耐性提高。
[22]根据[15]～[21]中任一项所述的制造方法，其中，进一步包括使加入了上述变异的多肽在[11]所述的转化体或无细胞蛋白质合成系统中表现，或者化学合成。
[23]一种亲和载体的制造方法，包括将[1]～[8]中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质固定于固相载体。
本说明书中，氨基酸序列、核苷酸序列的同源性可以使用Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90：5873-5877)来决定。基于该BLAST算法开发了被称为BLASTN、BLASTX、BLASTP、TBLASTN和TBLASTX的程序(J.Mol.Biol.,1990,215：403-410)。使用这些程序时，使用各程序的默认参数。这些解析方法的具体的方法是公知的(参照www.ncbi.nlm.nih.gov)。
本说明书中，关于氨基酸序列和核苷酸序列的“至少85％的同源性”是指85％以上的同源性、优选90％以上的同源性、更优选95％以上的同源性、进一步优选97％以上的同源性、进一步优选98％以上的同源性、再进一步优选99％以上的同源性。另外，关于氨基酸序列和核苷酸序列的“至少90％的同源性”是指90％以上的同源性、优选95％以上的同源性、进一步优选97％以上的同源性、进一步优选98％以上的同源性、再进一步优选99％以上的同源性。
本说明书中，氨基酸序列和核苷酸序列上的“相当的位置”可以通过将目标序列和参照序列(例如序列号9所示的氨基酸序列)以对各氨基酸序列或核苷酸序列中存在的保守氨基酸残基或核苷酸给予最大的同源性的方式排列(比对)来决定。比对可以使用公知的算法执行，其顺序是本领域技术人员公知的。例如，比对可以通过以默认设定使用Clustal W多重比对程序(Thompson,J.D.et al，1994，Nucleic Acids Res.，22：4673-4680)来进行。Clustal W例如可以在欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])、国立遗传学研究所经营的日本DNA数据库(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])的网站上利用。
本说明书中，氨基酸残基也以以下的缩写记载：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)、缬氨酸(Val或V)；和任意的氨基酸残基(Xaa或X)。另外，本说明书中，肽的氨基酸序列依照常规方法，以氨基末端(以下称为N末端)位于左侧、羧基末端(以下称为C末端)位于右侧的方式记载。
本说明书中，相对于氨基酸序列的特定位置的“前”和“后”的位置分别是指与该特定位置的N末端侧和C末端侧邻接的位置。例如，在特定位置的“前”和“后”的位置插入氨基酸残基时，插入后的氨基酸残基配置于与该特定位置的N末端侧和C末端侧邻接的位置。
本说明书中，蛋白L是指由大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)生产的蛋白质的1种即蛋白L。
本说明书中，“免疫球蛋白结合蛋白质”是指对免疫球蛋白(或抗体或者抗体的片段)具有结合活性的蛋白质。本说明书中，“免疫球蛋白”(Ig)包含IgG、IgA、IgD、IgE、IgM和它们的亚类等任意类型的免疫球蛋白。本说明书中的“抗体”是指免疫球蛋白或包含抗原识别部位的其片段，例如，可包含IgG、IgA、IgD、IgE、IgM和它们的亚类等任意类型的免疫球蛋白、其片段、它们的变异体等。另外，本说明书中的“抗体”也可以为人源化抗体等嵌合抗体、抗体复合体和包含抗原识别部位的其它免疫球蛋白修饰体等。另外，本说明书中的“抗体的片段”可以为包含抗原识别部位的抗体的片段，也可以为不包含抗原识别部位的抗体的片段。作为不包含抗原识别部位的抗体的片段，例如可举出仅由免疫球蛋白的Fc区域构成的蛋白质、Fc融合蛋白质和它们的变异体、修饰体等。
本说明书中“免疫球蛋白结合结构域”是指免疫球蛋白结合蛋白质中所含的单独具有免疫球蛋白(或抗体或者抗体的片段)结合活性的多肽的功能单元。作为该“免疫球蛋白结合结构域”的例子，可举出对免疫球蛋白的κ链具有结合活性的结构域，例如蛋白L的免疫球蛋白结合结构域和具有免疫球蛋白κ链结合活性的它们的变异体。
作为该蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的例子，可举出大芬戈尔德菌(Finegoldiamagna)312株产生的蛋白L的B1结构域、B2结构域、B3结构域、B4结构域和B5结构域，大芬戈尔德菌3316株产生的蛋白L的C1结构域、C2结构域、C3结构域和C4结构域，其中，更优选C1结构域、C2结构域、C3结构域和C4结构域。蛋白L的B1结构域由序列号1所示的氨基酸序列构成。蛋白L的B2结构域由序列号2所示的氨基酸序列构成。蛋白L的B3结构域由序列号3所示的氨基酸序列构成。蛋白L的B4结构域由序列号4所示的氨基酸序列构成。蛋白L的B5结构域由序列号5所示的氨基酸序列构成。蛋白L的C1结构域由序列号6所示的氨基酸序列构成。蛋白L的C2结构域由序列号7所示的氨基酸序列构成。蛋白L的C3结构域由序列号8所示的氨基酸序列构成。蛋白L的C4结构域由序列号9所示的氨基酸序列构成。这些蛋白L的免疫球蛋白结合结构域彼此的氨基酸序列的类似性高。表1示出序列号1～9所示的蛋白L的结构域的氨基酸序列的比对。
[表1]
作为该蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的变异体的例子，可举出由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽。优选可举出由与序列号6～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽作为该蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的变异体的例子。
1.免疫球蛋白结合蛋白质
本发明的免疫球蛋白结合蛋白质包含至少1个源自蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的免疫球蛋白结合结构域的变异体(以下也称为本发明的变异体)。本发明的变异体可以通过对作为亲本结构域的源自蛋白L的免疫球蛋白结合结构域或其变异体加入规定的变异而得到。本发明的变异体具有免疫球蛋白κ链结合性且与亲本结构域相比碱耐性提高。具有本发明的变异体的本发明的变异免疫球蛋白结合蛋白质可以作为亲和载体的配体使用。
作为本发明的变异体的亲本结构域，可举出源自蛋白L的免疫球蛋白结合蛋白质，例如蛋白L的C1结构域、C2结构域、C3结构域、C4结构域、B1结构域、B2结构域、B3结构域、B4结构域、B5结构域和它们的变异体。其中，优选C1结构域、C2结构域、C3结构域、C4结构域和它们的变异体，更优选C4结构域和其变异体。
可作为该亲本结构域使用的蛋白L的B1～B5结构域和C1～C4结构域是分别由序列号1～9所示的氨基酸序列构成的多肽。作为可作为本发明的变异体的亲本结构域使用的蛋白L的B1～B5结构域和C1～C4结构域的变异体，可举出由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽。
可作为该亲本结构域使用的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的变异体可以通过对蛋白L的免疫球蛋白结合结构域的氨基酸序列实施氨基酸残基的插入、删除、取代或缺失、氨基酸残基的化学修饰等改变而制作。作为氨基酸残基的插入、删除、取代或缺失的手段，可举出对编码该结构域的多核苷酸的部位特异性突变(Site-specific mutaion)等公知的手段。
因此，作为本发明中的优选的亲本结构域的例子，可举出由序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列或与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽。作为更优选的亲本结构域的例子，可举出由序列号6～9的任一个所示的氨基酸序列或与序列号6～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽。作为进一步优选的亲本结构域的例子，可举出由序列号9所示的氨基酸序列或与序列号9所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽。
本发明的免疫球蛋白结合蛋白质中所含的本发明的变异体是对上述亲本结构域的氨基酸序列导入选自以下的(a)～(h)中的至少1个变异而得到的多肽且保持免疫球蛋白κ链结合活性：
(a)相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(b)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(c)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(d)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(e)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(f)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基或缺失，或者在该位置之前或之后的位置插入其它氨基酸残基；
(g)对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入至少1个氨基酸残基；
(h)至少1个脯氨酸的缺失。
例如，本发明的变异体通过对由序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列构成的多肽导入选自上述(a)～(h)中的至少1个变异而制造。或者本发明的变异体通过对由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的蛋白L免疫球蛋白结合结构域变异体的多肽导入选自上述(a)～(h)中的至少1个变异而制造。所制造的本发明的变异体具有免疫球蛋白κ链结合活性，作为免疫球蛋白结合结构域发挥作用。另外，本发明的变异体与变异前的结构域(亲本结构域)相比，碱耐性提高，因此，可以适当地作为亲和配体使用。
优选上述(a)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基。该其它氨基酸残基优选为Arg、Glu或Asp，更优选为Arg。更优选上述(a)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的Lys取代为Arg。
优选上述(b)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基。该其它氨基酸残基优选为Arg、Glu或Asp，更优选为Arg。更优选上述(b)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的Lys取代为Arg。
优选上述(c)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基。该其它氨基酸残基优选为Arg、Glu或Asp，更优选为Arg。更优选上述(c)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的Thr取代为Arg。
优选上述(d)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基。该其它氨基酸残基优选为Lys。更优选上述(d)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的Glu取代为Lys。
优选上述(e)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基。该其它氨基酸残基优选为Phe或Trp，更优选为Phe。更优选上述(e)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的Tyr取代为Phe。
优选上述(f)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基。该其它氨基酸残基优选为Gln。更优选上述(f)的变异是相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的Asn取代为Gln。
优选上述(g)的变异是对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间插入Ala、Leu或Tyr，更优选为Ala或Tyr的插入。更优选上述(g)的变异是对相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的Asn与相当于55位的位置的Gly之间插入Ala或Tyr。
优选上述(h)的变异是选自相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置、相当于7位的位置和相当于10位的位置中的至少1个位置的Pro的缺失，更优选为这些全部位置的Pro的缺失。
作为将上述(a)～(h)的变异组合时的适当的例子，可举出(a)和(b)的组合；(b)、(c)和(f)的组合；(b)、(c)、(d)和(f)的组合；以及(a)、(b)、(c)、(d)、(f)和(h)的组合。作为更适当的例子，可举出K17R和K26R的组合；K26R、T35R和N54Q的组合；K26R、T35R、E42K和N54Q的组合；以及K17R、K26R、T35R、E42K、N54Q、ΔP4、ΔP7和ΔP10的组合。
作为使亲本结构域变异的手段，可举出对编码该亲本结构域的多核苷酸以产生期望的氨基酸残基的取代、缺失、插入等的方式导入变异的方法。作为用于对多核苷酸导入变异的具体的方法，可举出部位特异性突变、同源重组法、SOE(重叠延伸拼接法，splicing byoverlap extension)-PCR法(Gene，1989，77：61-68)等，它们的详细顺序是本领域技术人员公知的。
作为通过上述顺序得到的本发明的变异体的例子，可举出由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性且具有选自上述(a)～(h)中的至少1个变异的氨基酸序列构成，具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽。
作为本发明的变异体的优选的例子，可举出由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性且具有选自以下的(a’)～(h’)中的至少1个的氨基酸序列构成，具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽：
(a’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
(b’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
(c’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的精氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
(d’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的赖氨酸；
(e’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的苯丙氨酸或色氨酸；
(f’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的谷氨酰胺；
(g’)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间的丙氨酸、亮氨酸或酪氨酸；
(h’)选自相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置、相当于7位的位置和相当于10位的位置中的至少1个位置的脯氨酸的缺失。
作为本发明的变异体的更优选的例子，可举出由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性且至少具有以下的(a”)～(l”)的任一个的氨基酸序列构成，具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽：
(a”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的17位的位置的精氨酸；
(b”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的26位的位置的精氨酸；
(c”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的35位的位置的精氨酸；
(d”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的42位的位置的赖氨酸；
(e”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的44位的位置的苯丙氨酸；
(f”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置的谷氨酰胺；
(g1”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间的丙氨酸；
(g2”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的54位的位置与相当于55位的位置之间的酪氨酸；
(h1”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置的脯氨酸的缺失；
(h2”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置和相当于7位的位置的脯氨酸的缺失；
(h3”)相当于序列号9所示的氨基酸序列的4位的位置、相当于7位的位置和相当于10位的位置的脯氨酸的缺失；
(i”)该(a”)和(b”)的组合；
(j”)该(b”)、(c”)和(f”)的组合；
(k”)该(b”)、(c”)、(d”)和(f”)的组合；
(l”)该(a”)、(b”)、(c”)、(d”)、(f”)和(h3”)的组合。
作为本发明的变异体的进一步优选的例子，可举出由与序列号1～9的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性且具有上述(a”)、(b”)、(c”)、(e”)、(f”)、(g1”)、(g2”)、(h1”)、(h2”)、(h3”)的任1个，或者(a”)和(b”)的组合、(b”)、(c”)和(f”)的组合、(b”)、(c”)、(d”)和(f”)的组合，或者(a”)、(b”)、(c”)、(d”)、(f”)和(h3”)的组合的氨基酸序列构成，具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽。
作为本发明的变异体的进一步优选的例子，可举出由与序列号9所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性且具有上述(a”)～(l”)的任一个的氨基酸序列构成，具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽。作为本发明的变异体的进一步优选的例子，可举出由序列号10～23的任一个所示的氨基酸序列构成的多肽。
本发明的免疫球蛋白结合蛋白质只要包含1个以上上述本发明的变异体即可。优选本发明的免疫球蛋白结合蛋白质包含2个以上、更优选3个以上、进一步优选4个以上本发明的变异体。另一方面，本发明的免疫球蛋白结合蛋白质优选包含12个以下、更优选8个以下、进一步优选7个以下本发明的变异体。例如，本发明的免疫球蛋白结合蛋白质优选包含2～12个、更优选3～8个、进一步优选4～7个本发明的变异体。本发明的免疫球蛋白结合蛋白质包含2个以上本发明的变异体时，这些变异体可以为相同种类，也可以为不同种类，优选为相同种类。
本发明的免疫球蛋白结合蛋白质也可以包含上述本发明的变异体以外的对免疫球蛋白κ链具有结合活性的其它免疫球蛋白结合结构域。作为该其它结构域的例子，可举出上述(a)～(h)所示的任一个变异均不具有的蛋白L的免疫球蛋白结合结构域或其变异体。
作为本发明的免疫球蛋白结合蛋白质的优选的例子，可举出由选自序列号10～23中的1种或2种以上的氨基酸序列呈直链状连接有2～12个、更优选3～8个、进一步优选4～7个的氨基酸序列构成的多肽，作为更优选的例子，可举出由呈直链状连接的2～12个、更优选3～8个、进一步优选4～7个的序列号10～23的任一个氨基酸序列构成的多肽。然而，本发明的蛋白质的优选的例子并不限定于这些。
2.免疫球蛋白结合蛋白质的制造
本发明的免疫球蛋白结合蛋白质可以通过该领域中公知的手法，例如基于氨基酸序列的化学合成法、重组法等来制造。例如，本发明的免疫球蛋白结合蛋白质可以利用Frederick M.Ausbel等人的Current Protocols In Molecular Biology、Sambrook等人编辑的Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition,2001)等中记载的公知的基因重组技术来制造。即，通过将含有编码本发明的免疫球蛋白结合蛋白质的多核苷酸的表达载体转化至大肠杆菌等宿主，并将得到的重组体在适当的液体培养基中进行培养，由此能够由培养后的细胞大量且经济地取得目标蛋白质。作为优选的表达载体，能够在宿主细胞内复制的已知的载体均可使用，例如可举出美国专利第5151350号说明书中记载的质粒、Sambrook等人编辑的Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press,3rd edition，2001)等中记载的质粒。另外，作为用于转化的宿主，没有特别限定，可以使用大肠杆菌等细菌、真菌类、昆虫细胞、哺乳类细胞等用于表达重组蛋白质的公知的宿主。为了通过对宿主中导入核酸而使宿主转化，可以根据各宿主而使用该技术领域中已知的任一方法，例如，可以利用Sambrook等人编辑的Molecular Cloning(ColdSpring Harbor Laboratory Press，3rd edition，2001)等中记载的公知的方法。将得到的转化体(例如细菌等细胞)培养而回收表达的蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的。或者本发明的免疫球蛋白结合蛋白质也可以使用无细胞蛋白质合成系统进行表达。
因此，本发明还提供编码本发明的免疫球蛋白结合蛋白质的多核苷酸(DNA等)、包含其的载体以及包含它们的转化体。
3.亲和载体
本发明的免疫球蛋白结合蛋白质可以作为亲和配体使用。通过将本发明的免疫球蛋白结合蛋白质固定于固相载体，能够制造以该本发明的免疫球蛋白结合蛋白质作为配体的亲和载体。该亲和载体为以源自蛋白L的免疫球蛋白结合蛋白质为配体的载体，具有免疫球蛋白κ链结合活性。另外，该亲和载体与以野生型蛋白L、其结构域为配体的载体相比，碱耐性提高。
作为本发明的亲和载体中所含的固相载体的形状，可以为粒子、膜、板、管、针状、纤维状等任意形态。该载体可以为多孔性，也可以为非多孔性。这些载体可以作为填充床使用，或者也可以以悬浮形态使用。悬浮形态包含作为流动层(expanded bed)和纯悬浮物已知的形态，该形态中粒子能够自由运动。在整体柱(monolith)、填充床和流动层的情况下，分离顺序通常依照利用浓度梯度的以往的色谱法。在纯悬浮物的情况下，使用间歇法。优选该载体为填充剂。或者载体也可以为芯片、毛细管或过滤器这样的形态。
在一个实施方式中，该固相载体的粒径优选为20μm以上且200μm以下。例如在载体为合成聚合物的情况下，粒径优选为20μm以上，更优选为30μm以上，且优选为100μm以下，更优选为80μm以下，例如优选为20～100μm，进一步优选为30～80μm。例如在载体为多糖的情况下，粒径优选为50μm以上，更优选为60μm以上，且优选为200μm以下，更优选为150μm以下，例如优选为50～200μm，进一步优选为60～150μm。如果粒径小于20μm时，则高流速下柱压变高，不耐实用。如果粒径超过200μm，则有时免疫球蛋白结合于亲和载体的量(结合容量)差。应予说明，本说明书中的“粒径”是指通过激光衍射散射式粒度分布测定装置得到的体积平均粒径，更详细而言，是指通过依据ISO 13320和JIS Z 8825-1的激光衍射法测定的体积平均粒径。具体而言，是指利用激光散射衍射法粒度分布测定装置(例如LS 13 320，BeckmanCoulter株式会社等)测定粒径分布，使用Fluid R.I.Real 1.333、Sample R.I.Real 1.54Imaginary 0等作为光学模型，测定体积基准的粒度分布而求出的平均粒径。
在一个实施方式中，该固相载体优选为多孔，优选具有50m2/g以上，更优选具有80m2/g以上，且优选具有150m2/g以下，更优选具有130m2/g以下，例如优选具有50～150m2/g，更优选具有80～130m2/g的比表面积。在此，如果比表面积小于50m2/g，则有时结合容量差，另一方面，如果超过150m2/g，则载体的强度差，有时在高流速下载体被破坏，柱压上升。应予说明，本说明书中的“比表面积”是指利用压汞仪得到的细孔径10～5000nm的细孔所具有的表面积除以粒子的干燥重量而得的值。
在一个实施方式中，该固相载体优选体积平均细孔径为100nm以上且1400nm以下。例如在载体为合成聚合物的情况下，体积平均细孔径优选为100nm以上，更优选为200nm以上，且优选为400nm以下，更优选为300nm以下，例如优选为100～400nm，进一步优选为200～300nm。例如在载体为多糖的情况下，体积平均细孔径优选为500nm以上，更优选为800nm以上，且优选为1400nm以下，更优选为1200nm以下，例如优选为500～1400nm，进一步更优选为800～1200nm。在此，如果体积平均细孔径小于100nm，则有时高流速下的结合容量降低变得显著，另一方面，如果超过1400nm，则不论流速均有结合容量降低的情况。应予说明，本说明书中的“体积平均细孔径”是指利用压汞仪得到的细孔径10～5000nm的细孔的体积平均细孔径。
该固相载体满足上述范围的粒径、比表面积和细孔径分布时，成为纯化对象溶液的流路的粒子间的间隙和粒子内的较大的细孔径与纯化对象分子的结合表面积的平衡达到最佳化，高流速下的结合容量被维持在高水平。
作为该固相载体的材质，例如为具有亲水性表面的聚合物，例如为通过亲水化处理而在外表面(以及存在的情况下也在内表面)具有羟基(-OH)、羧基(-COOH)、氨基羰基(-CONH2，或N取代型)、氨基(-NH2，或取代型)、或者低聚或聚乙烯氧基的聚合物。在一个实施方式中，该聚合物可以为对聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇系等合成聚合物进行亲水化处理而得的聚合物，优选为对由多官能(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯等多官能单体交联的共聚物这样的合成聚合物进行亲水化处理而得的聚合物。该聚合物可通过公知的方法而容易地制造(例如参照J.MATER.CHEM1991，1(3)，371-374的方法)。或者，也可使用TOYOPEARL(东曹公司)这样的市售品。其它实施方式的聚合物为葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰多糖、琼脂糖等多糖类。该多糖类可通过公知的方法而容易地制造(例如参照日本专利第4081143号中记载的方法)。或者，也可使用Sepharose(GE Healthcare Bioscience公司)这样的市售品。在其它实施方式中，也可以为二氧化硅、氧化锆等无机载体。
在一个实施方式中，作为用作该固相载体的多孔性粒子的一个具体例，例如可举出含有20～50质量％的交联性乙烯基单体与3～80质量％的含有环氧基的乙烯基单体、20～80质量％的含有二醇基的乙烯基单体的共聚物，粒径为20～80μm，比表面积为50～150m2/g，体积平均细孔径为100～400nm的多孔性有机聚合物粒子。
应予说明，将该固相载体利用压汞仪测定时的细孔径10～5000nm的细孔的渗入体积(细孔体积)优选为1.3mL/g以上且7.0mL/g以下。例如在载体为合成聚合物的情况下，细孔体积优选为1.3mL/g以上，且优选为7.0mL/g以下，更优选为5.0mL/g以下，进一步优选为2.5mL/g以下，例如优选为1.3～7.0mL/g，更优选为1.3～5.0mL/g，进一步优选为1.3～2.5mL/g。另外，例如在载体为多糖的情况下，细孔体积优选为3.0～6.0mL/g。
作为配体(即本发明的免疫球蛋白结合蛋白质)向该固相载体的结合方法，可以使用将蛋白质固定于载体的一般的方法来进行。例如可举出使用具有羧基的载体，利用N-羟基琥珀酸酰亚胺使该羧基活化而与配体的氨基反应的方法；使用具有氨基或羧基的载体，在水溶性碳二亚胺等脱水缩合剂存在下与配体的羧基或氨基反应而形成酰胺键的方法；使用具有羟基的载体，用溴化氰等卤化氰使其活化而与配体的氨基反应的方法；将载体的羟基甲苯磺酰化或三氟乙烷磺酰化而与配体的氨基反应的方法；利用双环氧化物、表氯醇等将环氧基导入载体而与配体的氨基、羟基或硫醇基反应的方法；使用具有环氧基的载体，与配体的氨基或羟基或硫醇基反应的方法等。上述中，从实施反应的水溶液中的稳定性的观点考虑，优选介由环氧基使配体结合的方法。
环氧基开环而生成的开环环氧基即羟基起到如下作用：将载体表面亲水化而防止蛋白质等的非特异吸附，并且在水中提高载体的韧性，防止高流速下的载体的破坏。因此，在使配体固定化后的载体中存在未与配体结合的残余的环氧基时，优选使该残余的环氧基开环。作为载体中的环氧基的开环方法，例如可举出在水溶剂中利用酸或碱在加热或室温下搅拌该载体的方法。另外，可以利用巯基乙醇、硫代甘油等具有巯基的封闭剂(blockingagent)、单乙醇胺等具有氨基的封闭剂使环氧基开环。更优选的开环环氧基是利用硫代甘油使载体中所含的环氧基开环而得到的开环环氧基。硫代甘油具有如下优点：作为原料与巯基乙醇等相比毒性低，并且加成了硫代甘油的环氧开环基与利用具有氨基的封闭剂的开环基相比，非特异吸附低，而且动态结合量变高。
也可以根据需要在固相载体与配体之前导入任意长度的分子(间隔区(spacer))。作为间隔区的例子，可举出聚亚甲基链、聚乙二醇链、糖类等。
本发明的亲和载体由于具有碱耐性提高的配体，因此，即使在反复进行碱清洗后，也能够维持高的静态结合容量(SBC)。另外，本发明的亲和载体由于使用具有免疫球蛋白κ链结合活性的配体，因此，不仅能够用于IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等免疫球蛋白的纯化，而且也能够用于Fab、单链抗体(scFv)等低分子抗体的纯化。
4.抗体或其片段的分离方法
对本发明的一个实施方式的抗体或其片段(以下仅表述为抗体)的分离方法进行说明。本实施方式的抗体的分离方法优选包括如下工序：对固定有本发明的免疫球蛋白结合蛋白质的亲和载体通液含有抗体的试样，使抗体吸附于该载体的工序(第一工序)，以及使该抗体从该载体洗脱的工序(第二工序)。
在该第一工序中，在抗体吸附于配体(本发明的免疫球蛋白结合蛋白质)的条件下使含有抗体的试样流过填充有本发明的亲和载体的柱等。在该第一工序中，试样中的抗体以外的物质大部分不吸附于配体而通过柱。然后，根据需要为了将较弱地保持于配体的一部分物质除去，可以将载体用含有NaCl等盐的中性缓冲液清洗。
在该第二工序中，流过pH2～5的适当的缓冲液，使吸附于配体的抗体洗脱。通过回收该洗脱液，能够从试样分离抗体。
在本发明的抗体的分离方法的一个实施方式中，所分离的抗体作为抗体医药使用。因此，在一个实施方式中，本发明提供使用本发明的亲和载体的抗体医药的制造方法。该方法的顺序除使用含有目标抗体医药的试样以外，基本上与上述的抗体的分离方法的顺序同样。
实施例
以下，举出实施例对本发明进一步具体地进行说明。另外，以下的记载概括地表示本发明的方式，在没有特别理由的情况下，本发明不受该记载限定。
参考例1多孔粒子的合成
(1)使甲基丙烯酸缩水甘油酯(三菱丽阳公司制)8.2g、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(Sartomer公司制)65.9g和甘油单甲基丙烯酸酯(日油公司制)90.6g溶解于2-辛酮(东洋合成工业公司制)245.8g和苯乙酮(和光纯药工业公司制)62g，添加2,2’-偶氮异丁腈(和光纯药工业公司制)2g，制备有机单体溶液。
(2)在4240g的纯水中添加聚乙烯醇(Kuraray公司制PVA-217)8.5g、十二烷基硫酸钠(花王公司制Emal 10G)0.43g和硫酸钠(和光纯药工业公司制)21.3g，搅拌一夜，制备水溶液。
(3)将(2)中得到的水溶液投入7L可分离式烧瓶内，安装温度计、搅拌桨和冷却管，设置在温水浴中，在氮气氛下以600rpm搅拌。接着，将可分离式烧瓶利用温水浴加热，在水溶液的温度成为85℃时，使用滴液漏斗向该水溶液添加(1)中得到的有机单体溶液，进行5小时搅拌。
(4)将(3)中得到的反应液冷却后，移至5L的聚丙烯制瓶，静置直到粒子悬浮，将多余的水从下方吸出并废弃。对含有残留的粒子的液体添加丙酮使粒子沉降，静置3分钟后，通过倾析除去丙酮。将该操作重复2次。对残留物加入水使粒子沉降后，静置3分钟进行倾析。将该操作重复2次将粒子清洗后，将液体成分用丙酮置换，风干一夜后，利用真空干燥机进行干燥，得到多孔粒子(以下记载为PB)90g。PB的平均粒径为53μm、比表面积为95m2/g。
实施例1免疫球蛋白κ链结合蛋白质(KBP1～14)的制作
从人工基因合成制造商获得将编码包含多个由序列号10～23的任一个所示的氨基酸序列构成的免疫球蛋白结合结构域变异体(变异结构域)的蛋白质的基因分别编入pET-24a(+)载体而得的质粒。将这些质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(NEWENGLAND BioLabs制)而得到转化细胞。
将得到的转化细胞在37℃培育到吸光度(OD600)达到约10为止。然后，以终浓度成为1mM的方式添加IPTG(Sigma-Aldrich制)，进一步在37℃培育4小时，使重组型免疫球蛋白κ链结合蛋白质表达。回收细胞，在pH9.5的Tris缓冲液中破碎。利用阴离子交换色谱(Q－SepharoseFF，GE Healthcare Bioscience公司制)和阳离子交换色谱(SP－SepharoseFF，GE Healthcare Bioscience公司制)从得到的细胞破碎液纯化重组免疫球蛋白结合蛋白质。将纯化的免疫球蛋白结合蛋白质对于10mM柠檬酸缓冲液pH6.6透析16小时。利用SDS-PAGE确认的重组型免疫球蛋白结合蛋白质的纯度为95％以上。将所纯化的重组型免疫球蛋白κ链结合蛋白质分别设为KBP1～14。
比较例1免疫球蛋白κ链结合蛋白质(KBP0)的制作
使用编入有编码包含多个由序列号9所示氨基酸序列构成的野生型免疫球蛋白结合结构域的蛋白质的基因的质粒，通过与实施例1同样的顺序制造重组型免疫球蛋白κ链结合蛋白质KBP0。
将实施例1和比较例1中制作的免疫球蛋白κ链结合蛋白质(KBP0～14)的结构示于表2。
[表2]
实施例2配体蛋白质固定化多孔粒子的制备
以包含8mg实施例1中制备的PB的方式使其悬浮于150μL的纯水，移至过滤管(Millipore公司)离心除去纯水。向其中加入溶解了1mg比较例1中制备的KBP0的包含450μL的0.85M硫酸钠的0.1M碳酸缓冲液(pH10)，在25℃振荡5小时，使KBP0结合于PB。将生成的粒子过滤后，与1M硫代甘油400μL混合在25℃反应16小时，将残余的环氧基封闭，用30mM NaOH清洗后，用50mM柠檬酸钠缓冲液(pH2.5)和0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.6)清洗，得到400μL的结合多孔粒子(KBP0/PB)。
以同样的顺序得到结合有KBP1～14的任一个的多孔粒子(KBP1/PB～KBP14/PB)。
试验例1静态结合容量(SBC)的测定
(1)没有碱处理的多孔粒子的SBC的测定
将包含2mg的多孔粒子(KBP0/PB)的100μL的悬浮液移至过滤管(Millipore公司)，离心而除去透过液。向其中添加20mM磷酸缓冲液(pH7.5)400μL，离心而除去透过液，使管内的粒子平衡化。接着向其中添加包含0.8mg的Fab的20mM磷酸缓冲液(pH7.5)400μL，培育1小时，离心后，进一步用20mM磷酸缓冲液(pH7.5)400μL清洗，离心。接着，添加50mM柠檬酸钠缓冲液(pH2.5)400μL，离心而回收包含Fab的洗脱液。通过吸光度测定而算出洗脱液中的Fab量，由洗脱Fab量和载体体积求出静态结合容量(SBC)。以同样的顺序求出KBP1/PB～KBP14/PB的SBC。
(2)碱处理后的多孔粒子的SBC的测定
将包含2mg的多孔粒子(KBP0/PB)的100μL的悬浮液移至过滤管(Millipore公司)，离心而除去透过液。向其中添加400μL的0.1M NaOH，一边振荡24小时一边浸渍后，离心而除去透过液。接着，添加20mM磷酸缓冲液(pH7.5)400μL，离心而除去透过液，使管内的粒子平衡化。向其中添加包含0.8mg的Fab的20mM磷酸缓冲液(pH7.5)400μL，培育1小时，离心后，进一步用20mM磷酸缓冲液(pH7.5)400μL清洗，离心。接着，添加50mM柠檬酸钠缓冲液(pH2.5)400μL，离心而回收包含Fab的洗脱液。通过吸光度测定而算出洗脱液中的Fab量，由洗脱Fab量和载体体积求出静态结合容量(SBC)，算出相对于(1)中求出的没有碱处理的SBC的相对值(SBC维持率，％)。以同样的顺序求出KBP1/PB～KBP14/PB的SBC维持率(％)。
(3)结果
将测定结果示于表3。在不进行碱处理的条件下，使用变异结构域的多孔粒子(KBP1/PB～KBP14/PB)的SBC与使用野生型结构域的KBP0/PB大致同等。另一方面，碱处理后，KBP1/PB～KBP14/PB的SBC与KBP0/PB相比显著提高。根据该结果，显示包含变异结构域的配体蛋白质KBP1～14与野生型蛋白质相比，碱耐性高，即使在暴露于0.1M氢氧化钠中24小时的严苛条件下也能够维持高的抗体结合性。
[表3]
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序列表
<110> JSR株式会社
<110> JSR生命科学株式会
<110> JSR微有限公司
<110> JSR微公司
<120> 免疫球蛋白结合蛋白质和使用其的亲和载体
<130> JSR0087
<150> JP 2017-184158
<151> 2017/09/25
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Lys Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile
1 5 10 15
Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Arg Thr Gln Thr Ala Thr Phe
20 25 30
Lys Gly Arg Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp
35 40 45
Leu Leu Ala Lys Val Gln Gly Glu Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly
50 55 60
Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys
65 70 75
<210> 22
<211> 75
<212> PRT
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<220>
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<400> 22
Lys Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile
1 5 10 15
Lys Val Asn Leu Ile Phe Ala Asp Gly Arg Thr Gln Thr Ala Thr Phe
20 25 30
Lys Gly Arg Phe Glu Glu Ala Thr Ala Lys Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp
35 40 45
Leu Leu Ala Lys Val Gln Gly Glu Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly
50 55 60
Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys
65 70 75
<210> 23
<211> 72
<212> PRT
<213> 大芬戈尔德菌
<220>
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<400> 23
Lys Glu Thr Glu Thr Glu Glu Lys Glu Glu Val Thr Ile Arg Val Asn
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Leu Ile Phe Ala Asp Gly Arg Thr Gln Thr Ala Thr Phe Lys Gly Arg
20 25 30
Phe Glu Glu Ala Thr Ala Lys Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala
35 40 45
Lys Val Gln Gly Glu Tyr Thr Ala Asp Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr
50 55 60
Ile Asn Ile Lys Phe Ala Gly Lys
65 70
Claims (11)
1.一种免疫球蛋白结合蛋白质，由至少1个免疫球蛋白结合结构域的变异体构成，
该免疫球蛋白结合结构域的变异体由对序列号9所示的氨基酸序列加入以下的(b)、(c)和(f)的变异的而得的氨基酸序列构成，且具有免疫球蛋白κ链结合活性：
(b)序列号9所示的氨基酸序列的26位的氨基酸残基取代为精氨酸；
(c)序列号9所示的氨基酸序列的35位的氨基酸残基取代为精氨酸；
(f)序列号9所示的氨基酸序列的54位的氨基酸残基取代为谷氨酰胺。
2.一种免疫球蛋白结合蛋白质，由至少1个在权利要求1所述的免疫球蛋白结合蛋白质中所含的免疫球蛋白结合结构域的变异体中进一步加入以下的(d)、(a)和(h)的变异而得的免疫球蛋白结合结构域的变异体构成：
(d)序列号9所示的氨基酸序列的42位的氨基酸残基取代为赖氨酸；
(a)序列号9所示的氨基酸序列的17位的氨基酸残基取代为精氨酸；
(h)序列号9所示的氨基酸序列的4位、7位和10位的脯氨酸缺失。
3.根据权利要求1或2所述的免疫球蛋白结合蛋白质，由2个以上的所述免疫球蛋白结合结构域的变异体构成。
4.一种多核苷酸，编码权利要求1～3中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质。
5.一种载体，包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种转化体，包含权利要求5所述的载体。
7.一种亲和载体，包含固相载体和结合于该固相载体的权利要求1～3中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质。
8.一种抗体或其片段的分离方法，使用权利要求7所述的亲和载体。
9.一种免疫球蛋白结合蛋白质的制造方法，包括使权利要求1～3中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质在权利要求6所述的转化体或无细胞蛋白质合成系统中表达、或者化学合成。
10.一种方法，是免疫球蛋白结合结构域的变异体的制造方法，由如下工序构成：对由序列号9所示的氨基酸序列构成且具有免疫球蛋白κ链结合活性的多肽加入以下的(b)、(c)和(f)的变异，
(b)序列号9所示的氨基酸序列的26位的氨基酸残基取代为精氨酸；
(c)序列号9所示的氨基酸序列的35位的氨基酸残基取代为精氨酸；
(f)序列号9所示的氨基酸序列的54位的氨基酸残基取代为谷氨酰胺。
11.一种亲和载体的制造方法，包括将权利要求1～3中任一项所述的免疫球蛋白结合蛋白质固定于固相载体。
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