WO2017191748A1 - 改変型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド - Google Patents

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WO2017191748A1
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amino acid
immunoglobulin
variable region
chain variable
acid sequence
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PCT/JP2017/015501
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吉田　慎一
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株式会社カネカ
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate

Definitions

  • the present invention relates to an immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide with improved chemical stability to an alkaline solution, an affinity separation matrix having the peptide as a ligand, and an immunoglobulin ⁇ chain variable region-containing protein using the affinity separation matrix.
  • the present invention relates to a production method, DNA encoding the peptide, a vector containing the DNA, and a transformant transformed with the vector.
  • Protein A affinity separation matrix (hereinafter referred to as “SpA”) is used to capture and purify antibody drugs from animal cell cultures at a high purity at a time.
  • Monoclonal antibodies are basically developed as antibody drugs and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are immunoglobulin G (IgG) subclass in terms of molecular structure.
  • antibody drugs composed of fragment antibodies having a molecular structure obtained by fragmenting immunoglobulin have been actively clinically developed, and clinical development of various fragment antibody drugs is progressing (Non-patent Document 3).
  • SpA affinity separation matrix is used for the initial purification step in the antibody drug manufacturing process.
  • SpA is basically a protein that specifically binds to the Fc region of IgG. Therefore, a fragment antibody that does not contain an Fc region cannot be captured using the SpA affinity separation matrix. Therefore, from the viewpoint of developing a platform for antibody drug purification process, there is a great industrial need for an affinity separation matrix capable of capturing a fragment antibody that does not contain the Fc region of IgG.
  • Non-Patent Document 4 A plurality of peptides that bind to regions other than the Fc region of IgG are already known (Non-Patent Document 4). Among them, a peptide that can bind to a variable region (antigen-binding domain) is most preferable from the viewpoint of the variety of fragment antibody formats that can be bound and the ability to bind to IgM and IgA.
  • protein L is sometimes abbreviated as “PpL”).
  • PpL is a protein containing a plurality of ⁇ chain variable region binding domains (hereinafter, the ⁇ chain variable region may be abbreviated as “VL- ⁇ ”), and the amino acid sequences of individual VL- ⁇ binding domains are different. .
  • the number of VL- ⁇ binding domains and individual amino acid sequences differ depending on the type of strain. For example, the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL of the Peptostreptococcus magnus 312 strain is 5, and the VL- ⁇ binding domains contained in the PpL of the Peptostreptococcus magnus strain 3316 are five. Is 4 (Non-patent Documents 5 to 7, Patent Documents 1 and 2). Among these nine VL- ⁇ binding domains, there are no domains having the same amino acid sequence.
  • Non-patent Documents 1 and 8, Patent Documents 3 to 8 protein engineering research has been actively conducted to introduce a site-specific mutation and improve the function as a ligand for affinity separation matrix.
  • Patent Documents 3 to 8 Patent Documents 3 to 8
  • amino acid substitution mutations to asparagine residues known to be susceptible to deamidation reactions under alkaline conditions and glycine residues after asparagine residues are effective in improving chemical stability. is there.
  • such mutations do not show an improving effect for all asparagine residues in SpA (Non-patent Document 8).
  • Novel modified protein L that exhibits binding to immunoglobulin kappa chain and has excellent chemical stability to alkaline solution, and affinity separation matrix having the modified PpL as a ligand, and affinity separation It is an object of the present invention to provide a method for producing a protein containing a kappa chain variable region using a matrix.
  • the present inventor molecularly designed a mutant of the VL- ⁇ binding domain of PpL, and obtained the mutant from a transformed cell using a protein engineering technique and a genetic engineering technique. Then, a study was conducted to compare the physical properties of the obtained mutants.
  • the present invention will be described.
  • the immunoglobulin ⁇ chain variable region binding peptide of any one of (1) to (3) below (1) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, an immunoglobulin ⁇ chain variable region binding having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues selected from the group consisting of positions 41 and 42 are substituted Sex peptides; (2) In the amino acid sequence of (1) above, an amino acid sequence in which 1 to 20 amino acid residues are deleted, substituted and / or added in the region excluding the 41st and 42nd positions.
  • an immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide having improved chemical stability with respect to an alkaline aqueous solution as compared with that before the substitution introduction in (1) above; (3) It has an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more with respect to the amino acid sequence of (1), and its chemical stability with respect to an alkaline aqueous solution is higher than that before the substitution introduction in (1).
  • Improved immunoglobulin ⁇ chain variable region binding peptide (however, substitution of amino acid residues at one or more positions selected from positions 41 and 42 in the amino acid sequence defined in (1) above) (3) shall not be further mutated).
  • An immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide comprising a plurality of domains in which two or more immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptides according to any one of [1] to [6] are linked. Multimers.
  • the immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide according to any one of [1] to [6] above or the immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide multimer according to [7] above is used as a ligand.
  • a method for producing a protein comprising an immunoglobulin ⁇ chain variable region Contacting the affinity separation matrix according to the above [8] with a liquid sample containing a protein containing an immunoglobulin ⁇ chain variable region; and Separating the protein comprising the immunoglobulin kappa chain variable region bound to the affinity separation matrix from the affinity separation matrix.
  • the chromatographic support for affinity purification obtained by immobilizing the modified PpL obtained in the present invention has a small decrease in antibody ⁇ chain binding activity due to alkali treatment damage. Therefore, in repeated use, cleaning with a sodium hydroxide aqueous solution at a high concentration or for a long time is possible. As a result, impurities such as organic substances remaining on the chromatography carrier can be effectively removed.
  • FIG. 1 is an alignment of amino acid sequences of PpL-derived VL- ⁇ binding domains.
  • FIG. 2 shows LB1t-Wild. It is a figure which shows the preparation methods of the expression plasmid of 1d.
  • FIG. 3 is a diagram showing a method for preparing various modified LB1t expression plasmids.
  • FIG. 4 is a graph plotting the binding response at various peptide concentrations used for evaluating the remaining aHER-Fab binding activity of various modified LB1t.
  • FIG. 5 is a graph showing aHER-Fab binding residual activity after alkali treatment of various modified LB1t.
  • FIG. 6 is a graph showing aIgE-Fab binding residual activity after alkali treatment of various modified LB1t.
  • the present invention relates to the immunoglobulin ⁇ chain variable region binding peptide of any one of (1) to (3) below.
  • an immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acid residues selected from the 41st and 42nd positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 are substituted;
  • an immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide having improved chemical stability with respect to an alkaline aqueous solution as compared with that before the substitution introduction in (1) above; (3) It has an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more with respect to the amino acid sequence of (1), and its chemical stability with respect to an alkaline aqueous solution is higher than that before the substitution introduction in (1).
  • Improved immunoglobulin ⁇ chain variable region binding peptide (however, substitution of amino acid residues at one or more positions selected from positions 41 and 42 in the amino acid sequence defined in (1) above) (3) shall not be further mutated).
  • Immunoglobulin (Ig) is a glycoprotein produced by B cells of lymphocytes and has a function of recognizing and binding molecules such as specific proteins.
  • the immunoglobulin has a function of specifically binding to such a specific molecule called an antigen and a function of detoxifying and removing a factor having the antigen in cooperation with other biomolecules and cells.
  • Immunoglobulin is generally called “antibody”, which is a name that focuses on such a function.
  • All immunoglobulins basically have the same molecular structure, and have a “Y” -shaped four-chain structure as a basic structure.
  • the four-chain structure is composed of two polypeptide chains each called a light chain and a heavy chain.
  • Immunoglobulin G is a monomeric immunoglobulin and is composed of two ⁇ chains and two light chains, and has two antigen-binding sites.
  • the place corresponding to the vertical bar of the lower half of the “Y” of immunoglobulin is called the Fc region, and the “V” of the upper half is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function that induces a reaction after the antibody binds to the antigen, and the Fab region has a function of binding to the antigen.
  • the heavy chain Fab region and the Fc region are connected by a hinge part, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya decomposes this hinge part and cleaves it into two Fab regions and one Fc region.
  • the portion near the tip of the “Y” in the Fab region is called a variable region (V region) because various changes in the amino acid sequence are seen so that it can bind to various antigens.
  • the variable region of the light chain is called the VL region, and the variable region of the heavy chain is called the VH region.
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions with relatively little change, and are called constant regions (C regions).
  • the constant region of the light chain is referred to as the CL region, and the constant region of the heavy chain is referred to as the CH region.
  • the CH region is further divided into three, CH1 to CH3.
  • the heavy chain Fab region consists of a VH region and CH1, and the heavy chain Fc region consists of CH2 and CH3.
  • the hinge part is located between CH1 and CH2.
  • Protein L binds to a variable region (VL- ⁇ ) in which the light chain is a ⁇ chain (Non-Patent Documents 5 to 7).
  • the peptide according to the present invention binds to the ⁇ chain variable region of an immunoglobulin (hereinafter sometimes abbreviated as “VL- ⁇ ”).
  • VL- ⁇ -containing protein to be bound by the peptide obtained in the present invention is not limited as long as it contains VL- ⁇ , and may be IgG containing a Fab region and an Fc region without deficiency, or IgM, IgD And other Igs such as IgA, or immunoglobulin molecule derivatives obtained by modifying them by protein engineering.
  • the immunoglobulin molecule derivative to which the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention binds is not particularly limited as long as it is a derivative having VL- ⁇ .
  • Fab fragments fragmented only in the Fab region of immunoglobulin G, scFv consisting only of the variable region of immunoglobulin G, and partial domains of human immunoglobulin G are replaced with immunoglobulin G domains of other species.
  • Examples include fused chimeric immunoglobulin G, immunoglobulin G obtained by molecular modification of the sugar chain of the Fc region, and scFv fragment covalently bound to a drug.
  • peptide includes all molecules having a polypeptide structure, and includes not only so-called proteins but also fragmented proteins and proteins in which other peptides are linked by peptide bonds. Shall. In the present invention, peptide and protein are basically synonymous.
  • a “domain” is a unit of protein conformation, consisting of a sequence of tens to hundreds of amino acid residues, sufficient to express some physicochemical or biochemical function.
  • a “variant” of a protein or peptide refers to a protein or peptide in which at least one substitution, addition or deletion is introduced at the amino acid level with respect to the sequence of a wild-type protein or peptide.
  • the mutation which substitutes an amino acid the amino acid of a wild type or a non-mutation type is attached
  • G29A a mutation that replaces Gly at position 29 with Ala.
  • Protein L is a protein derived from the cell wall of anaerobic gram-positive cocci belonging to the genus Peptostreptococcus.
  • PpL derived from Peptostreptococcus magnus is preferable, and two types of PpL derived from Peptostreptococcus magnus 312 and Peptostreptococcus magnus 3316 are preferable, but are not limited thereto.
  • PpL of Peptostreptococcus magnus 312 strain may be abbreviated as “PpL312”
  • PpL derived from Peptostreptococcus magnus 3316 strain may be abbreviated as “PpL3316”.
  • the amino acid sequence of PpL312 is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of PpL3316 is shown in SEQ ID NO: 2 (including the signal sequence).
  • PpL contains a plurality of VL- ⁇ binding domains consisting of 70 to 80 residues.
  • the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL312 is five, and the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL3316 is four.
  • the VL- ⁇ binding domains of PpL312 are, in order from the N terminus, B1 domain (SEQ ID NO: 3), B2 domain (SEQ ID NO: 4), B3 domain (SEQ ID NO: 5), B4 domain (SEQ ID NO: 6), B5 domain (
  • the VL- ⁇ binding domain of PpL3316 is C1 domain (SEQ ID NO: 8), C2 domain (SEQ ID NO: 9), C3 domain (SEQ ID NO: 10), C4 domain (sequence) No. 11) (Non-Patent Documents 5 to 6).
  • the present invention is applied to B1, B2, B3, B4, C1, C2, C3, or C4 domains whose usefulness has been recognized in Examples and the like. .
  • the amino acid sequence alignment of these various VL- ⁇ binding domains is shown in FIG. In FIG. 1, the residue numbers given according to Non-Patent Documents 7 to 8 and Patent Document 9 are shown in parentheses.
  • Non-patent Document 7 Studies have shown that about 20 residues at the N-terminus of the VL- ⁇ binding domain do not have a specific secondary structure, and even when the N-terminal region is deleted, It retains its three-dimensional structure and exhibits VL- ⁇ binding.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 for the B1 domain Functions as a binding domain.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 for the B2 domain Functions as a binding domain.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 for the B3 domain Functions as a binding domain.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 for the B4 domain Functions as a binding domain.
  • amino acid sequence that comprehensively includes amino acid residues common to various domains (SEQ ID NOs: 12 to 19) is also preferable as the amino acid sequence applied to the present invention.
  • N-terminus of SEQ ID NO: 20 is defined as the first position, and an amino acid residue number is assigned.
  • residue numbers according to this definition are also shown, and further, Val from position 1 to various positions (SEQ ID NOs: 12 to 19) to Ala at position 60 are shown in bold.
  • the present invention is characterized in that chemical stability against an alkaline aqueous solution is improved by introducing an amino acid substitution mutation into a VL- ⁇ binding domain of wild-type PpL as compared with that before the mutation introduction. This is a technology for creating mutants.
  • the mutant VL- ⁇ binding peptide (1) as confirmed in the examples below, is less damaged by alkali even when treated with an alkaline aqueous solution, and maintains the binding performance to VL- ⁇ at a high level. ing.
  • the substitution site of the modified VL- ⁇ binding peptide (1) is one or more amino acid residues selected from positions 41 and 42 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the 41st position of SEQ ID NO: 20 is Asn, and the 42nd position is Gly. Even when the number of amino acids in the amino acid sequence before mutagenesis is different, when the number of mutated amino acids is 20 or less or the sequence identity is 80% or more, positions 41 and 42 of SEQ ID NO: 20 Those skilled in the art can easily identify the corresponding positions.
  • the VL- ⁇ binding peptide (1) according to the present invention has an amino acid sequence in which one or more amino acid residues selected from positions 41 and 42 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 are substituted.
  • the position to be substituted is more preferably the 41st position.
  • the phrase “having a (specific) amino acid sequence” means that the peptide only needs to contain the specified amino acid sequence, and the function of the peptide is maintained. To do.
  • the amino acid sequence of the peptide may be the same as the specific amino acid sequence, or other amino acid sequences may be bonded to the specific amino acid sequence. Examples of sequences other than the amino acid sequence specified in the peptide include a histidine tag, a linker sequence for immobilization, and a cross-linked structure such as an —SS— bond.
  • the type of amino acid to be mutated is not particularly limited, including substitution with non-protein constituent amino acids or non-natural amino acids, but natural amino acids can be suitably used from the viewpoint of genetic engineering production.
  • natural amino acids are classified into neutral amino acids; acidic amino acids of Asp and Glu; basic amino acids of Lys, Arg, and His.
  • Neutral amino acids are classified as aliphatic amino acids; Pro imino acids; Phe, Tyr, Trp aromatic amino acids.
  • Aliphatic amino acids are further classified into Gly; Ala; branched amino acids of Val, Leu and Ile; hydroxy amino acids of Ser and Thr; sulfur-containing amino acids of Cys and Met; and acid amide amino acids of Asn and Gln.
  • Tyr has a phenolic hydroxyl group, it may be classified not only as an aromatic amino acid but also as a hydroxy amino acid.
  • natural amino acids are Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Cys, Met, Pro, Phe highly non-polar amino acids; Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr Neutral polar amino acids; acidic polar amino acids such as Asp and Glu; basic polar amino acids such as Lys, Arg and His.
  • the amino acid at position 41 is Asn, and the amino acid at position 42 is Gly.
  • the amino acid substituted at the 41st position is preferably other than an acid amide amino acid, more preferably an aliphatic amino acid or a nonpolar amino acid, or a basic amino acid, more preferably Ala, His, and His. More preferred.
  • an aliphatic amino acid is preferable, and Ala is more preferable.
  • the modified VL- ⁇ binding peptide (2) has a deletion of 1 to 20 amino acid residues in the region excluding positions 41 and 42 in the amino acid sequence of (1) above,
  • the number of mutations in the above deletion, substitution and / or addition is preferably 15 or less or 10 or less, more preferably 7 or less, 5 or less or 3 or less, further preferably 1 or 2, and particularly preferably 1.
  • the position of deletion, substitution and / or addition of amino acid residues is defined by the VL- ⁇ binding peptide (1).
  • Examples of amino acid residue deletion, substitution and / or addition positions include the N-terminus and / or C-terminus. These sites are particularly preferred as deletion and / or addition sites.
  • the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 12 to 19 are amino acids in which 10 to 20 residues on the N-terminal side and 1-2 residues on the C-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3 to 6 or SEQ ID NOs: 8 to 11 are deleted. Is an array. Accordingly, as one embodiment, the addition of amino acids to the N-terminal and / or C-terminal includes adding amino acid sequences derived from these amino acid sequences. In one embodiment, the amino acid sequence added to the N-terminus includes Glu-Glu or Glu-Gln. In one embodiment, the amino acid sequence added to the C-terminus includes Gly, Cys, or Gly-Cys.
  • the modified VL- ⁇ binding peptide (3) has an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more with respect to the amino acid sequence of (1) above, and has chemical stability to an alkaline aqueous solution. This is an immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide that is improved compared to that before the substitution introduction in the modified VL- ⁇ binding peptide (1) (provided that the 41st amino acid sequence defined in (1) above). Substitution of amino acid residues at one or more positions selected from position 42 and position 42 shall not be further mutated in (3)).
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 98% or more or 99% or more, and particularly preferably 99.5% or more.
  • sequence identity can be evaluated using Clustal (http://www.clustal.org/omega/), which is a program for multiple alignment of amino acid sequences.
  • VL- ⁇ -binding peptides (1) to (3) according to the present invention are characterized in that their chemical stability against an alkaline aqueous solution is improved as compared with that before introduction of substitution. That is, the chemical stability of the VL- ⁇ binding peptides (1) to (3) according to the present invention to an alkaline aqueous solution is improved as compared with the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • Alkaline aqueous solution refers to alkalinity that can achieve the purpose of cleaning or sterilization. More specifically, an aqueous solution of sodium hydroxide of 0.01M to 1.0M or 0.01N to 1.0N is applicable, but not limited thereto.
  • the lower limit of the concentration is preferably 0.01M, more preferably 0.02M, and even more preferably 0.05M.
  • the upper limit of the concentration of sodium hydroxide is preferably 1.0M, more preferably 0.5M, even more preferably 0.3M, still more preferably 0.2M, and even more preferably 0.1M.
  • the alkaline aqueous solution is not necessarily a sodium hydroxide aqueous solution, but the pH is preferably 12 or more and 14 or less. Regarding the lower limit of pH, 12.0 or more is preferable, and 12.5 or more is more preferable. Regarding the upper limit of the pH, it is preferably 14 or less, more preferably 13.5 or less, and even more preferably 13.0 or less.
  • “Chemical stability” refers to the property that a protein retains its function against chemical modifications such as chemical changes of amino acid residues and chemical modifications such as amide bond transfer and cleavage.
  • function retention of a peptide refers to binding activity to VL- ⁇ .
  • “binding activity to VL- ⁇ ” refers to the proportion of a polypeptide that retains affinity for VL- ⁇ without undergoing chemical denaturation. That is, the higher the “chemical stability”, the smaller the degree of decrease in the binding activity to VL- ⁇ after the immersion treatment in the alkaline aqueous solution.
  • alkali resistance in the present invention is also synonymous with “chemical stability under alkaline conditions”.
  • the time for immersing the peptide in the alkali is not particularly limited because the damage to the peptide varies greatly depending on the concentration of the alkali and the temperature during the immersion.
  • the concentration of sodium hydroxide is 0.05M and the temperature during immersion is room temperature
  • the lower limit of the time for immersion in alkali is preferably 1 hour, more preferably 2 hours, more preferably 4 hours, and more preferably 10 hours. Is more preferable, and 20 hours is more preferable, but there is no particular limitation.
  • the affinity for immunoglobulin can be tested by a biosensor such as a Biacore system (GE Healthcare) using the surface plasmon resonance principle, but is not limited thereto.
  • the measurement conditions may be that the binding signal when the peptide of the present invention binds to VL- ⁇ can be detected.
  • the temperature is a constant temperature of 20 ° C. or more and 40 ° C. or less, and the pH when the bonding state is seen is a neutral condition of 5 or more and 8 or less.
  • the buffer component include, but are not limited to, phosphoric acid, tris, bistris, and the like when neutral.
  • the sodium chloride concentration of the buffer solution is not particularly limited, but is preferably about 0 M or more and 0.15 M or less.
  • the affinity constant (K A ) or the dissociation constant (K D ) can be used as a parameter indicating the binding to VL- ⁇ (Nagata et al., “Real-time analysis experiment method of biological substance interaction” "Springer Fairlark Tokyo, 1998, page 41).
  • the affinity constant for VL- ⁇ of the peptide of the present invention is determined by immobilizing human IgG on the sensor chip using the Biacore system and passing each domain variant through the flow path under the conditions of temperature 25 ° C. and pH 7.4 It can be determined in the experimental system to be added.
  • the protein according to the present invention has an affinity constant (K A ) for human VL- ⁇ of 1 ⁇ 10 5 (M ⁇ 1 ) or more, more preferably 1 ⁇ 10 6 (M ⁇ 1 ) or more.
  • K A affinity constant for human VL- ⁇ of 1 ⁇ 10 5 (M ⁇ 1 ) or more, more preferably 1 ⁇ 10 6 (M ⁇ 1 ) or more.
  • the affinity constant varies depending on the type of VL- ⁇ -containing peptide and the number of domains of the VL- ⁇ -binding peptide, and is not limited thereto.
  • K A and the K D is inappropriate. This is because even if the ratio of molecules capable of binding to VL- ⁇ is changed by alkali treatment, if the binding ability of one peptide molecule to VL- ⁇ does not change, no change is observed as a parameter.
  • the magnitude of the binding signal when VL- ⁇ is immobilized on a sensor chip and the same concentration of immunoglobulin is added before and after chemical treatment of the peptide for example, the magnitude of the binding signal when VL- ⁇ is immobilized on a sensor chip and the same concentration of immunoglobulin is added before and after chemical treatment of the peptide
  • a binding parameter called a theoretical maximum binding capacity (R max ) in units of a resonance unit (RU) indicating the magnitude of the binding response
  • R max theoretical maximum binding capacity
  • the magnitude of the binding signal may be compared by immobilizing the peptide and adding the same concentration of VL- ⁇ -containing protein before and after alkali treatment of the immobilized chip.
  • the residual binding activity is a comparison before and after alkali treatment, it can be basically expressed as a ratio (percentage) in which the binding activity before alkali treatment is the denominator and the binding activity after alkali treatment is the molecule.
  • the numerical value is not particularly limited as long as it is higher than that of the peptide in which the mutation of the present invention treated with alkali under the same conditions is not introduced, but the ratio is preferably 10% or more, and more preferably 20% or more. Is more preferably 30% or more, still more preferably 40% or more, and even more preferably 50% or more.
  • the sample to be compared is different only in that it does not contain the mutation of the present invention, the other amino acid sequences are the same, and the alkali treatment and residual binding activity are measured. It is to make all of the conditions together.
  • an appropriate treatment such as neutralizing the pH by neutralization with an acid after the alkali treatment is necessary.
  • Protein L is a protein containing 4 or 5 VL- ⁇ binding domains arranged in tandem. Therefore, the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention also includes, as one embodiment, two or more, preferably three or more, more preferably, the VL- ⁇ binding peptide that is a monomer or a single domain. It may be a multimer of multiple domains linked by 4 or more, more preferably 5 or more. The upper limit of the number of domains to be linked is 10 or less, preferably 8 or less, more preferably 6 or less.
  • These multimers may be a homopolymer such as a homodimer or homotrimer that is a linked body of a single VL- ⁇ binding peptide, or a heteropolymer that is a linked body of a plurality of types of VL- ⁇ binding peptides. Heteropolymers such as dimers and heterotrimers may be used.
  • Examples of how the VL- ⁇ -binding peptide multimers according to the present invention are linked include a method of linking by one or a plurality of amino acid residues, and a method of directly linking without interposing amino acid residues. It is not limited to the method.
  • the number of amino acid residues to be linked is not particularly limited, but is preferably 20 residues or less, more preferably 15 residues or less, still more preferably 10 residues or less, and even more preferably 5 residues. Or even more preferably 2 residues or less. These amino acid sequences are preferably those that do not destabilize the three-dimensional structure of the monomeric protein.
  • a fusion peptide characterized in that the VL- ⁇ binding peptide or multimer thereof obtained by the present invention is fused with another peptide having different functions as one component.
  • fusion peptides include, but are not limited to, peptides fused with albumin or glutathione S-transferase (GST).
  • GST glutathione S-transferase
  • a nucleic acid such as a DNA aptamer
  • a drug such as an antibiotic
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention includes the use of the peptide of the present invention as an affinity ligand characterized by having affinity for immunoglobulins and fragments thereof, particularly VL- ⁇ .
  • an affinity separation matrix characterized in that the ligand is immobilized on a water-insoluble carrier is also included as one embodiment.
  • the affinity separation matrix according to the present invention is the above-mentioned immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide or the immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide multimer according to the present invention immobilized on a water-insoluble carrier as a ligand. It is characterized by being.
  • the term “ligand” refers to a substance or a function that selectively collects or binds a target molecule from a set of molecules based on specific affinity between molecules represented by binding of an antigen and an antibody. It is a term indicating a group, and in the present invention, refers to a peptide that specifically binds to an immunoglobulin. In the present invention, the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • water-insoluble carrier used in the present invention examples include inorganic carriers such as glass beads and silica gel; synthetic polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene; crystalline cellulose, crosslinked cellulose, crosslinked agarose, Examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as cross-linked dextran; and organic-organic and organic-inorganic composite carriers obtained by a combination thereof.
  • GCL2000 a porous cellulose gel
  • Sephacryl S-1000 in which allyl dextran and methylene bisacrylamide are covalently crosslinked
  • Toyopearl an acrylate carrier
  • Sepharose CL4B an agarose crosslinking carrier
  • Cellufine which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the ligand is immobilized on the water-insoluble substrate directly or via a linker group by a covalent bond.
  • the affinity separation matrix according to the present invention can be produced by immobilizing the ligand on the water-insoluble carrier.
  • the method for immobilizing the ligand may be bound to the carrier by a conventional coupling method using an amino group, a carboxy group or a thiol group present in the ligand.
  • the carrier is activated by reacting the carrier with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine or sodium periodate, or the surface of the carrier.
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier. Therefore, for immobilization, the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention may be chemically modified, or an amino acid residue useful for immobilization may be added.
  • amino acids useful for immobilization include amino acids having functional groups useful for immobilization chemical reactions in the side chain, such as Lys containing an amino group in the side chain, and thiol groups in the side chain. Cys containing is mentioned.
  • VL- ⁇ binding property imparted to a peptide in the present invention is similarly imparted to a matrix in which the peptide is immobilized as a ligand. Modifications are within the scope of the present invention.
  • VL- ⁇ -containing proteins proteins containing immunoglobulin ⁇ chain variable regions by affinity column chromatography purification methods.
  • the purification method of these VL- ⁇ -containing proteins can be achieved by a procedure according to an immunoglobulin affinity column chromatography purification method, for example, a purification method using an SpA affinity separation matrix (Non-patent Document 1).
  • the solution is passed through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention to selectively adsorb the VL- ⁇ -containing protein. .
  • an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed.
  • the desired VL- ⁇ -containing protein is adsorbed to the affinity separation matrix according to the present invention in the column.
  • the affinity separation matrix in which the peptide obtained in the present invention is immobilized as a ligand is excellent in the ability to adsorb and retain the target VL- ⁇ -containing protein from the sample addition step to the matrix washing step.
  • an acidic buffer adjusted to an appropriate pH is passed through the column to elute the desired VL- ⁇ -containing protein, thereby achieving high-purity purification.
  • a substance that promotes dissociation from the matrix may be added to the acidic buffer used to elute the peptide.
  • the affinity separation matrix of the present invention can be reused by washing by passing it through a pure buffer having a suitable strong acidity or strong alkali that does not completely impair the function of the ligand compound or the carrier substrate. Is possible.
  • An appropriate denaturing agent or an organic solvent may be added to the regeneration buffer.
  • the affinity separation matrix of the present invention is particularly excellent in chemical stability against an alkaline aqueous solution, it is preferably reused by passing it through a strong alkaline pure buffer and washing.
  • the timing of regeneration with a strong alkaline pure buffer solution need not be every time after use, and may be, for example, once every five times or once every ten times.
  • the present invention also relates to a DNA encoding the above mutant VL- ⁇ binding peptide.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention may be any one as long as the amino acid sequence obtained by translating the base sequence constitutes the peptide.
  • Such a base sequence can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as “PCR”) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • the base sequence may not be the same as the original base sequence as long as the codon may be substituted with a degenerate codon and it encodes the same amino acid when translated.
  • a genetically modified organism into which the DNA has been introduced, or a cell-free protein synthesis system using the DNA as a template DNA for transcription can be obtained.
  • the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention can be obtained as a fusion peptide with a known protein having an advantage of assisting protein expression or facilitating purification. That is, a microorganism or cell containing at least one recombinant DNA encoding a fusion peptide containing the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention can be obtained.
  • the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.
  • site-specific mutations for modifying the DNA encoding the peptide of the present invention can be carried out using recombinant DNA technology, PCR method or the like as follows.
  • the introduction of mutations by recombinant DNA technology is carried out, for example, when there are appropriate restriction enzyme recognition sequences on both sides of the target site where mutations are desired in the gene encoding the peptide of the present invention.
  • the recognition sequence can be cleaved with the restriction enzyme, and after removing the region containing the site desired to be mutated, the cassette mutation method can be used in which a DNA fragment mutated only at the desired site is inserted by chemical synthesis or the like. .
  • site-specific mutation by PCR for example, using a double-stranded plasmid encoding the peptide of the present invention as a template and two synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + strand and the ⁇ strand.
  • the double primer method can be used.
  • a DNA encoding a multimeric peptide can also be prepared by linking a desired number of DNAs encoding the monomer peptide (one domain) in series.
  • an appropriate restriction enzyme site is introduced into the DNA sequence, and double-stranded DNA fragmented with the restriction enzyme can be ligated with DNA ligase.
  • the DNA encoding a multimeric peptide if the base sequences encoding each monomer peptide are the same, homologous recombination may be induced in the host.
  • sequence identity between the nucleotide sequences of DNA encoding the peptide is 90% or less, preferably 85% or less, more preferably 80% or less, and even more preferably 75% or less.
  • identity of the base sequence can be determined by a conventional method as in the case of the amino acid sequence.
  • the “expression vector” of the present invention includes a base sequence encoding the aforementioned peptide of the present invention or a partial amino acid sequence thereof, and a promoter operable in a host operably linked to the base sequence.
  • the gene encoding the peptide of the present invention can be obtained by linking or inserting into a suitable vector, and the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can autonomously replicate in the host.
  • plasmid DNA or phage DNA can be used as a vector.
  • vectors such as pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Bioscience) may be mentioned.
  • the transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • methods for introducing recombinant DNA into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, and a polyethylene glycol method.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Coryne Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • the VL- ⁇ binding peptide according to the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cell in a medium, and producing and accumulating the peptide according to the present invention in a cultured cell or in a culture solution outside the cell, It can be produced by collecting the desired peptide from the culture.
  • the peptide of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cell in a medium, and generating and accumulating a fusion peptide containing the peptide of the present invention in a cultured bacterial cell or in a culture solution outside the bacterial cell.
  • the fusion peptide is collected, the fusion peptide is cleaved with an appropriate protease, and the desired peptide is collected. It should be noted that the microbial cell periplasm region is also included in the cultured microbial cell.
  • the method of culturing the transformed cell of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for host culture.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as it can produce the peptide of the present invention with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt, iron salt and the like are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie phenylmethylane
  • Sulfonyl fluoride Benzamidine
  • AEBSF 4- (2-aminoethyl) -Benzenesulfonyl fluoride
  • Antipain Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin Inhibitors may be added at appropriate concentrations.
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, Hsp104 / ClpB may be used. These are allowed to coexist with the peptide of the present invention by a technique such as co-expression or fusion proteinization.
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium and culturing at a low temperature, but it is not limited thereto. Absent.
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%) or 2 ⁇ YT medium (tryptone 1.6%, yeast extract) 1.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • the peptide of the present invention is cultured in the cultured cells by culturing aerobically for several hours to several days under aeration and stirring conditions at a culture temperature of about 15 ° C. to 42 ° C., preferably about 20 ° C. to 37 ° C. Alternatively, it is accumulated in a culture solution that is extracellular and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the assembly produced by separating the cultured cell and the supernatant containing the secreted peptide by a general separation method such as centrifugation or filtration after the completion of the culture. The replacement peptide can be recovered.
  • the cells are collected from the culture solution by centrifugation, filtration or the like, and then the cells are disrupted by an ultrasonic crushing method, a French press method or the like.
  • the peptide accumulated and produced in the cells can be recovered by solubilization by adding a surfactant or the like.
  • the periplasmic region is included in the cultured cells.
  • the peptide according to the present invention can be purified by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like alone or in combination. Confirmation that the obtained purified substance is the target peptide can be carried out by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • the modified peptide obtained in the following examples is expressed in the form of “peptide name—introduced mutation”, and the wild-type peptide that does not introduce displacement is expressed in the form of “peptide name—Wild”.
  • the B1 domain of wild-type PpL312 shown in SEQ ID NO: 7 is indicated by “LB1-Wild”.
  • the B1 domain of PpL312 represented by SEQ ID NO: 12 is mainly used in the experiment.
  • SEQ ID NO: 12 corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 which is also the B1 domain of wild-type PpL312 with the N-terminal part and C-terminal part deleted.
  • SEQ ID NO: 12 In order to distinguish SEQ ID NO: 12 from SEQ ID NO: 3, it is expressed as “LB1t-Wild”.
  • the B1 domain mutant of PpL312 into which a mutation that replaces the asparagine at position 41 with alanine is introduced is referred to as “LB1t-N41A”.
  • the notation of the mutant in which a plurality of mutations are introduced at the same time is written together using a slash.
  • the B1 domain mutant of PpL312 into which mutations N41A and G42A have been introduced is represented as “LB1t-N41A / G42A”.
  • “d” is added to the number concatenated after the period. In the case of a mutant consisting of a single domain, it is expressed as “LB1t-N41A.1d”.
  • Example 1 Preparation of various modified PpL VL- ⁇ binding peptides (1) Preparation of expression plasmid LB1t-Wild. Back translation was performed from the amino acid sequence of 1d (SEQ ID NO: 12), and a base sequence (SEQ ID NO: 21) encoding the peptide was designed. For experimental convenience, the base sequence was designed to encode an amino acid sequence in which Glu-Gln was added to the N-terminus and Gly was added to the C-terminus. These additional sequences of 1-2 residues are derived from the B1 domain of wild-type PpL312. Next, a method for preparing an expression plasmid is shown in FIG. LB1t-Wild.
  • a DNA encoding 1d was prepared by linking two types of double-stranded DNAs (f1 and f2) having the same restriction enzyme site, and incorporated into the multicloning site of the expression vector.
  • coding DNA preparation and vector integration were simultaneously performed by three-fragment ligation in which a total of three types of double-stranded DNA, ie, two types of double-stranded DNA and an expression vector, were ligated.
  • the method for preparing two types of double-stranded DNA includes two types of single-stranded oligo DNAs (f1-1 / f1-2 or f2-1 / f2-2) containing complementary regions of about 30 bases each other,
  • the target double-stranded DNA was prepared by extension by overlap PCR.
  • the specific experimental operation is as follows. Single-stranded oligo DNA f1-1 (SEQ ID NO: 22) / f1-2 (SEQ ID NO: 23) was synthesized by outsourcing (Sigma Genosys), and Pyrobest (Takara Bio Inc.) was used as a polymerase to perform an overlap PCR reaction. It was. The double-stranded DNA extracted by subjecting the PCR reaction product to agarose electrophoresis and cutting out the target band was cleaved with restriction enzymes BamHI and HindIII (both were Takara Bio Inc.).
  • single-stranded oligo DNA f2-1 (SEQ ID NO: 24) / f2-2 (SEQ ID NO: 25) was synthesized by outsourcing, and the double-stranded DNA synthesized and extracted through the overlap PCR reaction was subjected to restriction enzyme HindIII. And EcoRI (both were Takara Bio).
  • HindIII HindIII
  • EcoRI both were Takara Bio
  • the above two double-stranded DNAs were subcloned into the BamHI / EcoRI site in the multicloning site of the plasmid vector pGEX-6P-1 (GE Healthcare Bioscience).
  • the ligation reaction in subcloning was performed using Ligation high (TOYOBO) according to the protocol attached to the product.
  • GST glutathione-S-transferase fused with LB1t-Wild. 1d can be produced.
  • plasmid DNA was amplified and extracted using a plasmid purification kit ("Wizard Plus SV SV Minipreps DNA Purification System” manufactured by Promega) according to the standard protocol attached to the kit.
  • the base sequence of the coding DNA of the expression plasmid was confirmed using a DNA sequencer (“3130xl3Genetic Analyzer” manufactured by Applied Biosystems). Using gene analysis kit (Applied Biosystems “BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit) and plasmid vector pGEX-6P-1 sequencing DNA primer (GE Healthcare Bioscience) according to the attached protocol A sequencing PCR reaction was performed, and the sequencing product was purified according to the attached protocol using a plasmid purification kit Applied Biosystems ("BigDyeXTerminator Purification Kit”) and used for base sequence analysis.
  • the prepared LB1t-Wild Using a 1d expression plasmid as a template and a PCR reaction using a single-stranded oligo DNA into which the intended mutation has been introduced and a sequencing DNA primer (or any single-stranded oligo DNA of SEQ ID NOS: 22 to 25) Prepared.
  • the PCR reaction was performed using Blend Taq-Plus- (TOYOBO) according to the attached protocol. This double-stranded DNA was cleaved with two kinds of restriction enzymes, and LB1t-Wild.
  • the expression plasmid of 1d was also cleaved with the same two restriction enzymes and ligated to prepare expression plasmids for various LB1t mutants.
  • the pattern of the combination of a DNA primer (single-stranded oligo DNA) and a restriction enzyme when creating a mutant corresponds to any one of the patterns (1) to (3) in FIG. Table 1 shows the corresponding pattern for making each mutant, the base sequence of the oligo DNA used, the base sequence of the cDNA encoding the mutant, and the sequence number of the amino acid sequence of the mutant.
  • the cells were collected by centrifugation and resuspended in 5 mL of PBS buffer. The cells were disrupted by ultrasonic disruption, centrifuged, and fractionated into a supernatant fraction and an insoluble fraction as a cell-free extract.
  • GST is expressed as a fusion peptide attached to the N-terminus.
  • SDS electrophoresis all of the various cell-free extracts prepared from the respective transformed cell cultures were found to have peptides that were thought to have been induced by IPTG at a molecular weight of about 25,000 or more. I confirmed the band.
  • the GST fusion peptide was roughly purified from each cell-free extract containing the GST fusion peptide by affinity chromatography using a GSTrap FF column (GE Healthcare Bioscience) having affinity for GST. Each cell-free extract is added to the GSTRap FF column, and the column is washed with a standard buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4), followed by an elution buffer ( The target GST fusion peptide was eluted with 50 mM Tris-HCl, 20 mM glutathione, pH 8.0).
  • the amino acid sequence capable of cleaving GST with the sequence-specific protease PreScission Protease is between GST and the target protein.
  • GST cleavage reaction was performed using PreScience Protease according to the attached protocol.
  • the target peptide was purified by gel filtration chromatography using Superdex 75 10/300 GL column (GE Healthcare Biosciences) from the sample used for the assay in the form of cleaved GST.
  • 1d is a peptide having an amino acid sequence in which Gly-Pro-Leu-Gly-Ser-Glu-Glu is added to the N-terminal side and Gly is added to the C-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • Comparative Example 1 Acquisition and Evaluation of Wild-type B1 Domain (LB1t-Wild.1d) LB1t-Wild.1 prepared in Example 1 Using the 1d expression plasmid, transformed cells were prepared in the same manner as in Example 1, and after culturing and purification, a protein solution was prepared.
  • LB1t-Wild.1d Wild-type B1 Domain
  • Comparative Example 2 Acquisition and Evaluation of LB1t Mutant for Comparative Control LB1t-Wild.
  • 1d expression plasmid transformed cells were prepared in the same manner as in Example 1, and after culturing and purification, a protein solution was prepared.
  • a pattern of a combination of a DNA primer (single-stranded oligo DNA) and a restriction enzyme in producing a mutant corresponds to (3) in FIG. Table 2 shows the base sequence of the oligo DNA used for preparing each mutant, the base sequence of the cDNA encoding the mutant, and the amino acid sequence of the mutant.
  • Example 2 Evaluation of residual binding activity after alkali treatment using various modified LB1t binding responses to aHER-Fab as an index
  • Alkaline treatment of various LB1t mutants Dialyzed various modified LB1t and wild type LB1t were water To obtain a 20 ⁇ M aqueous solution. 0.04 mL of a 150 mM sodium hydroxide aqueous solution was added to 0.04 mL of the aqueous solution, so that the final concentration of sodium hydroxide was 50 mM. The mixture was incubated at 25 ° C. for 12 hours, and then neutralized with 0.02 mL of 50 mM citric acid (pH 2.4). The neutralization was confirmed with pH test paper.
  • IgG-derived Fab fragment A humanized monoclonal IgG preparation was fragmented into a Fab fragment and an Fc fragment (hereinafter simply referred to as “Fab” and “Fc”, respectively) with papain, and only the Fab was separated and purified. .
  • anti-HER2 monoclonal IgG (generic name “trastuzumab”) whose light chain is composed of ⁇ chain is dissolved in papain digestion buffer (0.1 M AcOH-AcONa, 2 mM EDTA, 1 mM cysteine, pH 5.5).
  • papain Agarose from papaya latex papain-immobilized agarose (SIGMA) was added and incubated at 37 ° C.
  • AHER-Fab is recovered from the reaction fraction mixed with papain-immobilized agarose by affinity chromatography using a MabSelect SuRe column (GE Healthcare Bioscience) from a reaction solution in which Fab and Fc are mixed. To separate and purify. From the fractionated aHER-Fab solution, the aHER-Fab was purified by Superdex 75 10/300 GL column and gel filtration chromatography using standard buffer for equilibration and separation. As in Example 1, protein purification by chromatography was performed using the AKTAprime plus system.
  • Example 2 (2) Observation of binding response of various LB1t mutants to aHER-Fab Various modified types obtained in Example 1 (2) using a biosensor Biacore 3000 (GE Healthcare Bioscience) utilizing surface plasmon resonance The binding response of LB1t to aHER-Fab was observed.
  • the aHER-Fab obtained in Example 2 (2) was immobilized on a sensor chip, and various peptides were flowed on the chip to detect the interaction between them.
  • the aHER-Fab was immobilized on the sensor chip CM5 by an amine coupling method using N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC).
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • EDC N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • ethanolamine was used (the sensor chip and the immobilization reagent were all manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • the aHER-Fab solution was diluted about 10 times using an immobilization buffer (10 mM CH 3 COOH-CH 3 COONa, pH 4.5), and immobilized on the sensor chip according to the protocol attached to the Biacore 3000.
  • a reference cell serving as a negative control was prepared by performing a process of immobilizing only ethanolamine after activation with EDC / NHS for another flow cell on the chip.
  • the amount of immobilized aHER-FabFab was about 5000 RU.
  • the detection sensitivity and the dependence on the analyte concentration are improved by increasing the immobilization amount to 5000 RU or more and decreasing the flow rate. That is, in an environment in which mass transport limited is applied, the dependence of the binding response on the affinity decreases, and the dependence on the concentration relatively increases.
  • a running buffer solution (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, 0.005% P-20, pH 7.4) was used with 50 nM, 100 nM or 200 nM solutions of various modified LB1t before alkali treatment. Prepared. The solution was added to the sensor chip for 2 minutes at a flow rate of 10 ⁇ L / min. At a measurement temperature of 25 ° C., a binding reaction curve at the time of addition (binding phase, 2 minutes) and after completion of the addition (dissociation phase, 2 minutes) was observed sequentially. After each observation, washing was performed by adding about 20 mM NaOH.
  • FIG. 4 shows a plot in which the binding response (resonance unit value of the binding reaction curve) one minute after the addition is plotted on the vertical axis and the concentration of the added analyte at that time is plotted on the horizontal axis.
  • the binding response is proportional to the analyte concentration to some extent in this concentration range.
  • the numerical value of the slope of each modified LB1t at that time is shown in parentheses in FIG. For example, LB1t-N41A.
  • 1d when the concentration increases by 1 nM, the binding response 1 minute after the addition increases by about 1 RU.
  • the plot shows, the way of increasing the binding response to this analyte concentration varies from mutant to mutant.
  • the residual binding activity was calculated after correcting for the concentration, instead of simply evaluating the response ratio before and after the alkali treatment.
  • Example 3 Evaluation of Residual Binding Activity After Alkaline Treatment Using Various Modified LB1t Binding Responses to aIgE-Fab as an Index
  • anti-HER2 monoclonal IgG gene “trastuzumab”
  • IgE monoclonal IgG gene “omalizumab”
  • LB1t-Wild As shown in FIG. 6, LB1t-Wild. Compared with 1d (Comparative Example 1), LB1t-N41A. 1d and LB1t-N41H. It was demonstrated that the binding residual activity after 1d alkali treatment was significantly higher. Moreover, the tendency that such an effect was not seen even if Asn other than the 41st position was replaced was reproduced.

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Abstract

本発明は、免疫グロブリンのκ鎖に結合性を示し、アルカリ溶液に対する化学的安定性に優れた、新規な改変型プロテインＬ（ＰｐＬ）、および、当該改変型ＰｐＬをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。本発明に係る免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドは、野生型のＶＬ－κ結合性ドメインに共通するアミノ酸残基を網羅的に含んだアミノ酸配列に特定の変異を加えたアミノ酸配列を有することを特徴とする。

Description

改変型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド
　本発明は、アルカリ溶液に対する化学的安定性が改良された免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および、当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
　タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たしている。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度でキャプチャリングして精製するために利用されるプロテインＡアフィニティ分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。
　抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術などを用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する断片抗体からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、様々な断片抗体医薬の臨床開発が進んでいる（非特許文献３）。
　抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティ分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム開発の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティ分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。
　ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するペプチドはすでに複数知られている（非特許文献４）。それらの中でも、結合できる断片抗体フォーマットの種類の多さ、および、ＩｇＭやＩｇＡなどにも結合可能という観点からは、可変領域（抗原結合ドメイン）に結合できるペプチドが最も好ましく、例えば、プロテインＬ（以下、プロテインＬを「ＰｐＬ」と略記する場合がある）がよく知られている。ＰｐＬは、複数のκ鎖可変領域結合ドメイン（以下、κ鎖可変領域を「ＶＬ－κ」と略記する場合がある）を含むタンパク質であり、個々のＶＬ－κ結合性ドメインのアミノ酸配列は異なる。また、菌株の種類によっても、ＶＬ－κ結合性ドメインの数、および個々のアミノ酸配列は異なる。例えば、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ）３１２株のＰｐＬに含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は５個であり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３３１６のＰｐＬに含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は４個である（非特許文献５～７，特許文献１～２）。そして、それら計９個のＶＬ－κ結合性ドメインの中に、互いに同じアミノ酸配列であるドメインは無い。
　ＳｐＡの場合には、部位特異的に変異を導入し、アフィニティ分離マトリックス用リガンドとしての機能を改良するタンパク工学研究が盛んに進められており（非特許文献１，８，特許文献３～８）、特にＳｐＡアフィニティ分離マトリックスの洗浄に広く用いられる水酸化ナトリウム溶液に対する化学的安定性の向上を目的とした研究が多い。具体的には、アルカリ性条件下で脱アミド化反応を受け易いことが知られるアスパラギン残基、および、アスパラギン残基の後ろのグリシン残基へのアミノ酸置換変異が化学的安定性の向上に効果がある。しかし、ＳｐＡ中の全てのアスパラギン残基に関し、このような変異が向上効果を示すわけではない（非特許文献８）。
　ＰｐＬをリガンドとするアフィニティ分離マトリックスもすでに複数市販されている。ＰｐＬの結合力や結合様式を解析することを目的とした変異導入の報告は複数存在し（非特許文献７，９，１０）、アフィニティリガンドとしての機能改変を意図した研究の報告も存在する（特許文献９）。しかし、ＳｐＡの場合に比較するとＰｐＬの変異導入報告例は限られており、特にアルカリ溶液に対する化学的安定性は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスの場合には、ＳｐＡの改良によって０．１～０．５Ｍ水酸化ナトリウムでの洗浄が可能となっているのに対し、ＰｐＬの場合には、０．０２～０．０５Ｍ水酸化ナトリウムが推奨されている（非特許文献１１）。したがって、ＰｐＬの場合には、アルカリ溶液に対する化学的安定性について、改良の余地が残っている。
特表平７－５０６５７３号公報 特表平７－５０７６８２号公報 米国特許第５１４３８４４号公報 特開２００６－３０４６３３号公報 欧州特許第１１２３３８９号公報 国際公開第０３／０８０６５５号パンフレット 米国公開第２００６／０１９４９５０号公報 国際公開第２０１１／１１８６９９号パンフレット 国際公開第００／１５８０３号パンフレット
Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁 Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁 Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁 Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁 Kastern W．ら，J．Biol．Chem．，1992，267巻，12820-12825頁 Murphy J．P．ら，Mol．Microbiol．, 1994，12巻，911-920頁 Housden N．G．ら，Biochemical Society Transactions，2003，31巻，716-718頁 Linhult M. ら, PROTEINS, 2004, 55巻, 407-416頁 Housden N．G．ら，J．Biol．Chem．，2004，279巻，9370-9378頁 Tadeo X．ら，Biophys．J．，2009，97巻，2595-2603頁 Rodrigo G．ら，Antibodies，2015，4巻，259-277頁
　免疫グロブリンのκ鎖に結合性を示し、アルカリ溶液に対する化学的安定性に優れた、新規な改変型プロテインＬ（ＰｐＬ）、および、当該改変型ＰｐＬをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することが、本発明の課題である。
　本発明者は、上記課題を解決するために、ＰｐＬのＶＬ－κ結合性ドメインの変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて該変異体を形質転換細胞から取得し、取得した該変異体の物性を比較検討する検討を行った。
　以下、本発明を示す。
　［１］　下記（１）～（３）のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　（１）　配列番号２０のアミノ酸配列において、第４１位および第４２位からなる群より選択される１つ以上の位置のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
　（２）　上記（１）のアミノ酸配列において、上記第４１位および第４２位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、そのアルカリ性水溶液に対する化学安定性が、上記（１）における上記置換導入前に比べて向上している免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
　（３）　上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、そのアルカリ性水溶液に対する化学安定性が、上記（１）における上記置換導入前に比べて向上している免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第４１位および第４２位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
　［２］　上記（１）に規定されるアミノ酸配列が配列番号１２～１９のいずれかのアミノ酸配列である上記［１］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［３］　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第４１位の位置のアミノ酸残基が置換されている上記［１］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［４］　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第４１位の位置のアミノ酸残基がＡｌａまたはＨｉｓに、第４２位の位置のアミノ酸残基がＡｌａに置換されている上記［１］～［３］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［５］　上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠失、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である上記［１］～［４］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［６］　上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である上記［１］～［５］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［７］　上記［１］～［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
　［８］　上記［１］～［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、または上記［７］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
　［９］　免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
　上記［８］に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
　アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
　［１０］　上記［１］～［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記［７］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
　［１１］　上記［１０］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
　［１２］　上記［１１］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
　本発明で得られた改変型ＰｐＬを固定化したアフィニティ精製用クロマトグラフィ担体は、アルカリ処理のダメージによる抗体κ鎖結合活性の低下が少ない。よって、繰返し使用に際して、高濃度または長時間での水酸化ナトリウム水溶液を用いた洗浄が可能である。その結果、クロマトグラフィ担体に残留した有機物などの不純物を効果的に除去することが可能となる。
図１は、ＰｐＬ由来ＶＬ－κ結合性ドメインのアミノ酸配列のアラインメントである。 図２は、ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドの作製方法を示す図である。 図３は、各種改変型ＬＢ１ｔの発現プラスミドの作製方法を示す図である。 図４は、各種改変型ＬＢ１ｔのａＨＥＲ－Ｆａｂ結合残存活性の評価に用いた、各種ペプチド濃度における結合レスポンスをプロットしたグラフである。 図５は、各種改変型ＬＢ１ｔのアルカリ処理後のａＨＥＲ－Ｆａｂ結合残存活性を示したグラフである。 図６は、各種改変型ＬＢ１ｔのアルカリ処理後のａＩｇＥ－Ｆａｂ結合残存活性を示したグラフである。
　本発明は、下記（１）～（３）のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドに関する。
　（１）　配列番号２０のアミノ酸配列において、第４１位および第４２位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
　（２）　上記（１）のアミノ酸配列において、上記第４１位および第４２位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、そのアルカリ性水溶液に対する化学安定性が、上記（１）における上記置換導入前に比べて向上している免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
　（３）　上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、そのアルカリ性水溶液に対する化学安定性が、上記（１）における上記置換導入前に比べて向上している免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第４１位および第４２位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
　「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、抗原と呼ばれるかかる特定分子に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化して除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。
　全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。当該４本鎖構造は、軽鎖および重鎖と呼ばれるポリペプチド鎖それぞれ２本ずつから構成される。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本のγ鎖と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
　免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。プロテインＬは、軽鎖がκ鎖である可変領域（ＶＬ－κ）に結合する（非特許文献５～７）。
　本発明に係るペプチドは、免疫グロブリンのκ鎖可変領域（以下、「ＶＬ－κ」と略記する場合がある）に結合する。本発明で得られたペプチドが結合すべきＶＬ－κ含有タンパク質は、ＶＬ－κを含むものであればよく、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有するＩｇＧであってもよいし、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡなど他のＩｇ類であってもよいし、それらをタンパク質工学的に改変した免疫グロブリン分子誘導体であってもよい。本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドが結合する免疫グロブリン分子誘導体は、ＶＬ－κを有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、免疫グロブリンＧの可変領域のみからなるｓｃＦｖ、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、薬剤を共有結合したｓｃＦｖ断片などを挙げることができる。
　本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたタンパク質や、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたタンパク質も包含されるものとする。本発明においては、ペプチドとタンパク質は基本的に同義である。
　「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。
　タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
　「プロテインＬ（ＰｐＬ）」は、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する嫌気性グラム陽性球菌の細胞壁に由来するタンパク質である。好ましくは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ）に由来するＰｐＬであり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株、および、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株に由来する２種類のＰｐＬが好ましいが、これらに限定されない（非特許文献４～６）。なお、本発明では、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株のＰｐＬを「ＰｐＬ３１２」、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株由来のＰｐＬを「ＰｐＬ３３１６」と省略することがある。ＰｐＬ３１２のアミノ酸配列を配列番号１に、ＰｐＬ３３１６のアミノ酸配列を配列番号２に示す（シグナル配列も含む）。
　ＰｐＬは、７０～８０残基からなる複数のＶＬ－κ結合性ドメインを含有する。ＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は５個であり、ＰｐＬ３３１６に含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は４個である。ＰｐＬ３１２のＶＬ－κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｂ１ドメイン（配列番号３）、Ｂ２ドメイン（配列番号４）、Ｂ３ドメイン（配列番号５）、Ｂ４ドメイン（配列番号６）、Ｂ５ドメイン（配列番号７）と呼び、ＰｐＬ３３１６のＶＬ－κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｃ１ドメイン（配列番号８）、Ｃ２ドメイン（配列番号９）、Ｃ３ドメイン（配列番号１０）、Ｃ４ドメイン（配列番号１１）と呼ぶ（非特許文献５～６）。特許文献１～２を参照するに、本発明を適用するのは、その有用性が実施例などで認められているＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、または、Ｃ４ドメインが好ましい。これらの各種ＶＬ－κ結合性ドメインのアミノ酸配列アラインメントを図１に示す。図１中、非特許文献７～８および特許文献９に倣って付与した残基番号をカッコ内に示した。
　ＶＬ－κ結合性ドメインのＮ末端の約２０残基は特定の二次構造を取らないことが研究によって分かっており、Ｎ末端領域を欠失させた場合にも、ＶＬ－κ結合性ドメインとして三次元構造を保持し、ＶＬ－κ結合性を示す（非特許文献７）。したがって、例えば、Ｂ１ドメインに関しては配列番号１２のアミノ酸配列、Ｂ２ドメインに関しては配列番号１３のアミノ酸配列、Ｂ３ドメインに関しては配列番号１４のアミノ酸配列、Ｂ４ドメインに関しては配列番号１５のアミノ酸配列、Ｃ１ドメインに関しては配列番号１６のアミノ酸配列、Ｃ２ドメインに関しては配列番号１７のアミノ酸配列、Ｃ３ドメインに関しては配列番号１８のアミノ酸配列、Ｃ４ドメインに関しては配列番号１９のアミノ酸配列で示されるペプチドも、ＶＬ－κ結合性ドメインとして機能する。また、本発明に適用するアミノ酸配列として、各種ドメイン（配列番号１２～１９）に共通するアミノ酸残基を網羅的に含んだアミノ酸配列（配列番号２０）であることも好ましい。本発明においては、配列番号２０のＮ末端を第１位と定義して、アミノ酸残基番号を付与する。図１には、この定義に従った残基番号も示し、さらに、各種ドメイン（配列番号１２～１９）の第１位に位置するＶａｌから第６０位に位置するＡｌａまでを太字で示した。
　本発明は、野生型のＰｐＬのＶＬ－κ結合性ドメインに対し、アミノ酸置換変異を導入することによって、アルカリ性水溶液に対する化学的安定性が、変異導入前に比べて向上していることを特徴とする変異体を創製する技術である。
　変異型ＶＬ－κ結合性ペプチド（１）は、後記の実施例において確かめられている通り、アルカリ性水溶液で処理してもアルカリによるダメージがより少なく、ＶＬ－κに対する結合性能を高いレベルで維持している。
　改変型ＶＬ－κ結合性ペプチド（１）の置換部位は、配列番号２０のアミノ酸配列において、第４１位および第４２位から選択される１つ以上のアミノ酸残基である。配列番号２０の第４１位はＡｓｎであり、第４２位はＧｌｙである。変異導入前のアミノ酸配列のアミノ酸数が異なる場合においても、変異アミノ酸数が２０個以下である場合や配列同一性が８０％以上である場合に、配列番号２０の第４１位および第４２位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。具体的には、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）、または、遺伝情報処理ソフトウエアであるＧＥＮＥＴＹＸ（https://www.genetyx.co.jp/）で、アラインメントをとって確かめることが可能である。なお、非特許文献７～８および特許文献９に記載の残基番号に従えば、本発明に係るアミノ酸残基の置換部位は第６１位～第６２位に相当する。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチド（１）は、配列番号２０のアミノ酸配列の第４１位および第４２位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有する。置換される位置は第４１位がより好ましい。
　本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。ペプチドのアミノ酸配列が特定アミノ酸配列と同一であってもよいし、特定アミノ酸配列にその他のアミノ酸配列が結合したものであってもよい。ペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、－Ｓ－Ｓ－結合などの架橋構造などが挙げられる。
　変異するアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸への置換を含め、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。さらに、天然型アミノ酸は、中性アミノ酸；ＡｓｐとＧｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸に分類される。中性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸；Ｐｒｏのイミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸に分類される。脂肪族アミノ酸は、さらに、Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸に分類される。また、Ｔｙｒはフェノール性水酸基を有することから、芳香族アミノ酸のみでなくヒドロキシアミノ酸に分類してもよい。さらに、別の観点からは、天然アミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの疎水性の高い非極性アミノ酸類；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒの中性の極性アミノ酸類；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性の極性アミノ酸類；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性の極性アミノ酸類に分類することもできる。
　配列番号２０のアミノ酸配列において、第４１位のアミノ酸はＡｓｎであり、第４２位のアミノ酸はＧｌｙである。例えば、本発明においては、第４１位で置換されるアミノ酸としては、酸アミドアミノ酸以外が好ましく、脂肪族アミノ酸もしくは非極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸がより好ましく、Ａｌａ、Ｈｉｓがより好ましく、Ｈｉｓがより好ましい。第４２位で置換されるアミノ酸としては、例えば、脂肪族アミノ酸が好ましく、Ａｌａがより好ましい。
　改変型ＶＬ－κ結合性ペプチド（２）は、上記（１）のアミノ酸配列において、上記第４１位および第４２位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、そのアルカリ性水溶液に対する化学的安定性が、改変型ＶＬ－κ結合性ペプチド（１）における上記置換導入前に比べて向上している免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである。
　上記の欠失、置換および／または付加の変異の数としては、１５以下または１０以下が好ましく、７以下、５以下または３以下がより好ましく、１または２がさらに好ましく、１が特に好ましい。本発明に係る改変型ＶＬ－κ結合性ペプチド（２）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加の位置は、ＶＬ－κ結合性ペプチド（１）で規定された第４１位および第４２位以外であれば、特に制限されない。アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加の位置としては、例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端を挙げることができる。これら部位は、特に欠失および／または付加の部位として好ましい。
　配列番号１２～１９のアミノ酸配列は、配列番号３～６または配列番号８～１１のアミノ酸配列のＮ末端側の１０～２０残基およびＣ末端側の１～２残基を欠失させたアミノ酸配列である。したがって、実施形態の一つとして、Ｎ末端および／またはＣ末端へのアミノ酸の付加としては、これらのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を付加することが挙げられる。実施形態の一つとして、Ｎ末端に付加するアミノ酸配列としては、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、または、Ｇｌｕ－Ｇｌｎが挙げられる。実施形態の一つとして、Ｃ末端に付加するアミノ酸配列としては、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、またはＧｌｙ－Ｃｙｓが挙げられる。
　改変型ＶＬ－κ結合性ペプチド（３）は、上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、そのアルカリ性水溶液に対する化学的安定性が、改変型ＶＬ－κ結合性ペプチド（１）における上記置換導入前に比べて向上している免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第４１位および第４２位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
　上記配列同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上がさらに好ましく、９９．５％以上が特に好ましい。上記配列同一性は、上述の通り、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って評価することができる。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチド（１）～（３）は、そのアルカリ性水溶液に対する化学的安定性が、置換導入前に比べて向上していることを特徴とする。すなわち、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチド（１）～（３）のアルカリ性水溶液に対する化学的安定性は、配列番号２０のアミノ酸配列を有するペプチドよりも向上している。
　「アルカリ性水溶液」とは、洗浄または殺菌の目的を達成し得る程度のアルカリ性を指す。より具体的には、０．０１Ｍ以上１．０Ｍ以下または０．０１Ｎ以上１．０Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。水酸化ナトリウムを例とした場合、その濃度の下限は、０．０１Ｍが好ましく、０．０２Ｍがより好ましく、０．０５Ｍがさらにより好ましい。一方、水酸化ナトリウムの濃度の上限は、１．０Ｍが好ましく、０．５Ｍがより好ましく、０．３Ｍがさらにより好ましく、０．２Ｍがさらにより好ましく、０．１Ｍがさらにより好ましい。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液である必要はないが、そのｐＨは１２以上１４以下が好ましい。ｐＨの下限に関し、１２．０以上が好ましく、１２．５以上がより好ましい。ｐＨの上限に関し、１４以下が好ましく、１３．５以下がさらにより好ましく、１３．０以下がさらにより好ましい。
　「化学的安定性」とは、タンパク質がアミノ酸残基の化学変化などの化学修飾、および、アミド結合の転移や切断などの化学変性に対して、タンパク質の機能を保持する性質を指す。本発明においては、ペプチドの機能保持とは、ＶＬ－κへの結合活性を指す。本発明において「ＶＬ－κへの結合活性」とは、化学変性を受けずにＶＬ－κに対する親和性を保持しているポリペプチドの割合をいう。すなわち、「化学的安定性」が高い程、アルカリ性水溶液への浸漬処理の後も、ＶＬ－κへの結合活性が低下する度合いが小さい。なお、本発明中における「アルカリ耐性」という用語も、「アルカリ性条件下における化学的安定性」と同義である。
　ペプチドをアルカリに浸漬する時間は、アルカリの濃度や浸漬時の温度によってペプチドの受けるダメージは大きく異なるので、特に限定はされない。例えば、水酸化ナトリウムの濃度が０．０５Ｍで、浸漬時の温度が室温の場合、アルカリに浸漬する時間の下限は、１時間が好ましく、２時間がより好ましく、４時間がより好ましく、１０時間がより好ましく、２０時間がより好ましいが、特に限定はされない。
　免疫グロブリンに対する親和性は、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、本発明のペプチドがＶＬ－κに結合した時の結合シグナルが検出できればよい。測定条件としては、温度は２０℃以上４０℃以下の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨは５以上８以下程度の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、特に限定はされないが、０Ｍ以上０．１５Ｍ以下程度が好ましい。
　ＶＬ－κに結合していることを示すパラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田他　著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明のペプチドのＶＬ－κに対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒトＶＬ－κへの親和定数（ＫA）が１×１０5（Ｍ-1）以上、より好ましくは１×１０6（Ｍ-1）以上であることが好ましい。しかし、親和定数は、ＶＬ－κ含有ペプチドの種類や、ＶＬ－κ結合ペプチドのドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
　ただし、アルカリ処理後の残存結合活性を求める場合には、結合パラメータとして、ＫAやＫDは不適切である。アルカリ処理によって、ＶＬ－κに結合できる分子の比率が変化しても、ペプチド１分子のＶＬ－κに対する結合能は変化しない場合には、パラメータとしては変化が見られないからである。ペプチドの残存結合活性を求める場合には、例えば、ＶＬ－κをセンサーチップに固定化し、ペプチドを化学処理する前と後で、同一濃度の免疫グロブリンを添加したときの、結合シグナルの大きさ、または、理論的最大結合容量（Ｒmax）という、結合レスポンスの大きさを示すレゾナンスユニット（ＲＵ）を単位とする結合パラメータを用いるのが好ましいが、これに限定されるものではない。例えば、ペプチドを固定化し、固定化したチップをアルカリ処理する前と後で同じ濃度のＶＬ－κ含有タンパク質を添加して結合シグナルの大きさを比較してもよい。
　残存結合活性は、アルカリ処理前後の比較なので、基本的には、アルカリ処理前の結合活性を分母とし、アルカリ処理後の結合活性を分子とする比率（パーセンテージ）で表すことができる。その数値は、同じ条件でアルカリ処理した本発明の変異が導入されていないペプチドと比較して高ければ、特に限定はされないが、その比率が１０％以上であるのが好ましく、２０％以上であるのがより好ましく、３０％以上であるのがさらにより好ましく、４０％以上であるのがさらにより好ましく、５０％以上であるのがさらにより好ましい。
　この際に重要なことは、比較対照とするサンプルは、本発明の変異が含まれていないという点だけが異なり、それ以外のアミノ酸配列は同じであり、かつ、アルカリ処理および残存結合活性の測定の条件を全て一緒にすることである。また、本発明のペプチドは、アルカリ性水溶液中ではＶＬ－κ結合性は示さないので、アルカリ処理の後で酸による中和によってｐＨを中性にするなどの適切な処理が必要である。
　プロテインＬ（ＰｐＬ）は、ＶＬ－κ結合性ドメインが４個または５個タンデムに並んだ形で含んだタンパク質である。したがって、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該ＶＬ－κ結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＶＬ－κ結合性ペプチドの連結体であるホモダイマーやホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類のＶＬ－κ結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマーやヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチド多量体の連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。これらのアミノ酸配列は、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
　その他、実施形態の１つとして、本発明により得られるＶＬ－κ結合性ペプチドまたはその多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
　本発明は、本発明ペプチドを、免疫グロブリンやその断片、特にＶＬ－κに親和性を有することを特徴とするアフィニティリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティ分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。
　本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、本発明に係る上記免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とする。
　本発明において「リガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集または結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
　本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
　また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
　上記リガンドは、直接またはリンカー基を介して、共有結合により上記水不溶性基材に固定化されている。当該リンカー基としては、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（－ＮＨ－）、エーテル基（－Ｏ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（＝Ｏ）－）、アミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－）、ウレア基（－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－）；Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される２以上１０以下の基が連結された基；アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するＣ1-6アルキレン基を挙げることができる。上記の連結数としては、８以下または６以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下がさらに好ましい。また、上記Ｃ1-6アルキレン基は、水酸基などの置換基などにより置換されていてもよい。
　本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、上記リガンドを上記水不溶性担体に固定化することにより製造することができる。
　リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシ基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
　また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＶＬ－κ結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
　本発明のアフィニティ分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのκ鎖可変領域を含むタンパク質（ＶＬ－κ含有タンパク質）をアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらのＶＬ－κ含有タンパク質の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。
　即ち、ＶＬ－κ含有タンパク質の溶液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティ分離マトリックスを充填したアフィニティカラムに通過させ、ＶＬ－κ含有タンパク質を選択的に吸着させる。次いで、アフィニティカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のＶＬ－κ含有タンパク質はカラム内の本発明に係るアフィニティ分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティ分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とするＶＬ－κ含有タンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望のＶＬ－κ含有タンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。ペプチドを溶出するために用いられる上記酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
　本発明のアフィニティ分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。本発明のアフィニティ分離マトリックスは、特にアルカリ性水溶液に対する化学的安定性に優れるので、強アルカリの純粋な緩衝液を通過させて洗浄することで再利用することが好ましい。しかし、強アルカリの純粋な緩衝液で再生する操作をするタイミングは、使用後に毎回である必要は無く、例えば、５回に１回や１０回に１回でも構わない。
　本発明は、上記変異型ＶＬ－κ結合性ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換微生物／細胞、または、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
　また、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物、または、細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
　本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術やＰＣＲ法などを用いて行うことができる。
　すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
　また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
　また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
　本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
　本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
　本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中、または、菌体外である培養液中に本発明に係るペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中、または、菌体外である培養液中に、本発明ペプチドを含む融合ペプチドを生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。なお、培養菌体には、菌体ぺリプラズム領域も含まれるものとする。
　本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
　さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ
　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
　さらに、本発明に係るＶＬ－κ結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。これらは、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
　大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン　１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
　また、培養温度は、１５℃以上４２℃以下程度、好ましくは２０℃以上３７℃以下程度で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内、または、細胞外である培養溶液に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。なお、培養細胞内にぺリプラズム領域内が含まれることは、上述した通りである。
　本発明に係るペプチドの精製はアフィニティクロマトグラフィ、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等を単独で、または、適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
　本願は、２０１６年５月２日に出願された日本国特許出願第２０１６－９２８０４号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１６年５月２日に出願された日本国特許出願第２０１６－９２８０４号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
　以下の実施例で取得した改変型ペプチドは「ペプチド名－導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型ペプチドは「ペプチド名－Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号７で示される野生型ＰｐＬ３１２のＢ１ドメインは「ＬＢ１－Ｗｉｌｄ」で示す。また、本実施例においては、配列番号１２で示されるＰｐＬ３１２のＢ１ドメインを実験でメインに利用している。配列番号１２は、同じく野生型ＰｐＬ３１２のＢ１ドメインである配列番号３のアミノ酸配列からＮ末端部分とＣ末端部分を欠失させたものに相当する。配列番号１２を配列番号３と区別するため、「ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ」と表記する。第４１位のアスパラギンをアラニンに置換する変異を導入したＰｐＬ３１２のＢ１ドメイン変異体は「ＬＢ１ｔ－Ｎ４１Ａ」と表記する。複数の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｎ４１ＡおよびＧ４２Ａを導入したＰｐＬ３１２のＢ１ドメイン変異体は、「ＬＢ１ｔ－Ｎ４１Ａ／Ｇ４２Ａ」と表記する。また、ドメイン数に関しては、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。単ドメインからなる変異体の場合には、「ＬＢ１ｔ－Ｎ４１Ａ．１ｄ」と表記する。
　実施例１：　各種改変型ＰｐＬのＶＬ－κ結合性ペプチドの調製
　（１）　発現プラスミド調製
　ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１２）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号２１）を設計した。なお、実験上の都合から、塩基配列は、Ｎ末端にＧｌｕ－Ｇｌｎが、および、Ｃ末端にＧｌｙが付加されたアミノ酸配列をコードするように設計した。これらの１～２残基の付加配列は、野生型ＰｐＬ３１２のＢ１ドメインに由来する。次に、発現プラスミドの作製方法を図２に示す。ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄをコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの計３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１－１／ｆ１－２、または、ｆ２－１／ｆ２－２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１－１（配列番号２２）／ｆ１－２（配列番号２３）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２－１（配列番号２４）／ｆ２－２（配列番号２５）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
　上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社，「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いれば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製「3130xl Genetic Analyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キットApplied Biosystems社製「BigDyeXTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。
　各種ＬＢ１ｔ変異体の発現プラスミドに関しては、作製したＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを鋳型として、意図する変異を導入した一本鎖オリゴＤＮＡと、シークエンシング用ＤＮＡプライマー（または配列番号２２～２５のいずれかの一本鎖オリゴＤＮＡ）を用いたＰＣＲ反応を利用して調製した。ＰＣＲ反応は、Ｂｌｅｎｄ　Ｔａｑ　－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、添付のプロトコルに従い行った。この二本鎖ＤＮＡを２種の制限酵素で切断し、ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミド（またはｐＧＥＸ－６Ｐ－１）も同じ２種制限酵素で切断し、両者をライゲーション反応することで、各種ＬＢ１ｔ変異体の発現プラスミドを調製した。変異体を作る際の、ＤＮＡプライマー（一本鎖オリゴＤＮＡ）および制限酵素の組合せのパターンは、図３の（１）～（３）のいずれかのパターンに該当する。各々の変異体を作るときの該当パターン、使用したオリゴＤＮＡの塩基配列、変異体をコードするｃＤＮＡの塩基配列、および、変異体のアミノ酸配列の配列番号を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）　タンパク質の発現と精製
　上記（１）で得られた各種ＬＢ１ｔ変異体遺伝子を導入した形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１－チオ－β－Ｄ－ガラクシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する）を添加し、さらに２５℃にて１８時間培養した。
　培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して無細胞抽出液である上清画分と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。
　ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティクロマトグラフィにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。
　ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的タンパク質の間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて、目的のペプチドの精製を行った。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のタンパク質を、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のタンパク質のＮ末端側には、ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１由来のＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが付加される。したがって、例えば、ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄは、配列番号１２のアミノ酸配列に対し、Ｎ末端側にＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕが、Ｃ末端側にＧｌｙが付加されたアミノ酸配列のペプチドである。
　比較例１：　野生型Ｂ１ドメイン（ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ）の取得・評価
　実施例１にて調製したＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを用いて、実施例１と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。
　比較例２：　比較対照用ＬＢ１ｔ変異体の取得・評価
　実施例１にて調製したＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを用いて、実施例１と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。変異体を作製する際のＤＮＡプライマー（一本鎖オリゴＤＮＡ）および制限酵素の組合せのパターンは、図３の（３）に該当する。各々の変異体を作製するときに使用したオリゴＤＮＡの塩基配列、変異体をコードするｃＤＮＡの塩基配列、および、変異体のアミノ酸配列の配列番号を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例２：　各種改変型ＬＢ１ｔのａＨＥＲ－Ｆａｂへの結合レスポンスを指標としたアルカリ処理後の残存結合活性評価
　（１）　各種ＬＢ１ｔ変異体のアルカリ処理
　透析した各種改変型ＬＢ１ｔおよび野生型ＬＢ１ｔを水に溶解して２０μＭ水溶液を得た。当該水溶液０．０４ｍＬに、１５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液０．０２ｍＬを添加して、水酸化ナトリウムの終濃度を５０ｍＭとした。当該混合液を２５℃で１２時間インキュベートした後、５０ｍＭクエン酸（ｐＨ２．４）０．０２ｍＬで中和した。なお、中和はｐＨ試験紙にて確認した。
　（２）　ＩｇＧ由来Ｆａｂフラグメントの調製
　ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を、パパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメント（以下、それぞれ単に「Ｆａｂ」および「Ｆｃ」と略記する）に断片化し、Ｆａｂのみを分離精製した。具体的には、軽鎖がκ鎖からなる抗ＨＥＲ２モノクローナルＩｇＧ（一般名「トラスツズマブ」）を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ　ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ
　Ａｇａｒｏｓｅ　ｆｒｏｍ　ｐａｐａｙａ　ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離したものであり、ＦａｂとＦｃが混在している反応溶液から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用したアフィニティクロマトグラフィにより、素通り画分でａＨＥＲ－Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取したａＨＥＲ－Ｆａｂ溶液から、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラムと、平衡化および分離に標準緩衝液を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて、ａＨＥＲ－Ｆａｂを精製した。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。
　（３）　各種ＬＢ１ｔ変異体のａＨＥＲ－Ｆａｂに対する結合レスポンスの観測
　表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得した各種改変型ＬＢ１ｔのａＨＥＲ－Ｆａｂに対する結合レスポンスを観測した。本実施例では、実施例２（２）で取得したａＨＥＲ－Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ａＨＥＲ－ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ａＨＥＲ－Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ　ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ　３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定化した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にエタノールアミンのみを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。固定化されたａＨＥＲ－ＦａｂＦａｂの量は５０００ＲＵ程であった。なお、固定化量を５０００ＲＵ以上と高くし、流速を遅くすることで、検出感度、および、アナライト濃度への依存度が向上する。すなわち、マストランスポート・リミテッドがかかっている環境下では、結合レスポンスの親和性への依存度が低下し、相対的に濃度への依存度が上がる。
　アルカリ処理前の各種改変型ＬＢ１ｔの５０ｎＭ、１００ｎＭまたは２００ｎＭの溶液を、ランニング緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．００５％　Ｐ－２０，ｐＨ７．４）を用いて調製した。当該溶液を、流速１０μＬ／ｍｉｎで２分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，２分間）および添加終了後（解離相，２分間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約２０ｍＭ　ＮａＯＨを添加して洗浄した。添加１分後の結合レスポンス（結合反応曲線のレゾナンスユニット値）を縦軸に、そのときの添加アナライト濃度を横軸に取ったプロットを図４に示す。このように、この評価系では、この濃度範囲において、結合レスポンスはアナライト濃度にある程度比例する。その時の各々の改変型ＬＢ１ｔの傾きの数値を図４のカッコ内に示した。例えば、ＬＢ１ｔ－Ｎ４１Ａ．１ｄは、濃度が１ｎＭ上がると添加１分後の結合レスポンスが約１ＲＵ上がる。プロットが示す通り、このアナライト濃度に対する結合レスポンスの上がり方は、変異体によって異なる。この評価系では、単純にアルカリ処理前後のレスポンスの比で評価するのではなく、濃度に換算する補正を行った上で、結合残存活性を算出した。
　（４）　各種改変型ＬＢ１ｔのアルカリ処理後のａＨＥＲ－Ｆａｂ結合残存活性
　アルカリ処理後の各種ＬＢ１ｔ変異体も、ランニング緩衝液で２００ｎＭに濃度を調整し、同様に流速１０μＬ／ｍｉｎで２分間センサーチップに添加し、添加１分後のａＨＥＲ－Ｆａｂ結合レスポンスを求めた。先に求めたアルカリ処理前の２００ｎＭの結合レスポンス値と図４のプロットで求めた傾きから、アルカリ処理後の結合レスポンスに対応するアナライト濃度を算出した。そして、その濃度を、結合活性を維持した変異体濃度とし、処理前（１００％）に対する濃度比率を結合残存活性として算出した。各々の改変型ＬＢ１ｔに関し、用意した２例のアルカリ処理サンプルの結合残存活性値のグラフを図５に示した。
　試料間で結合残存活性値のバラつきは見られるが、ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（比較例１）と比較して、ＬＢ１ｔ－Ｎ４１Ａ．１ｄ、ＬＢ１ｔ－Ｎ４１Ｈ．１ｄ、および、ＬＢ１ｔ－Ｇ４２Ａ．１ｄのアルカリ処理後の結合残存活性が有意に高いのは明らかと言える。先述の通り、アスパラギン残基（Ａｓｎ）、および、Ａｓｎの後ろのグリシン残基（Ｇｌｙ）の置換変異でアルカリ耐性が上がった例はプロテインＡ（ＳｐＡ）ではある。しかし、ＬＢ１ｔ－Ｎ０６Ａ．１ｄ、ＬＢ１ｔ－Ｎ１１Ａ．１ｄ、および、ＬＢ１ｔ－Ｇ１２Ａ．１ｄのアルカリ処理後の結合残存活性（比較例２）が示す通り、これらのＡｓｎ、Ａｓｎの後ろのＧｌｙへの変異は、驚くべきことに変異導入前よりアルカリ耐性を下げる結果となった。この結果は、アルカリ耐性を向上し得る変異部位を特定できたことが、本発明の特に優れた側面であることを示していると言える。
　実施例３：　各種改変型ＬＢ１ｔのａＩｇＥ－Ｆａｂへの結合レスポンスを指標としたアルカリ処理後の残存結合活性評価
　上記実施例２において、抗ＨＥＲ２モノクローナルＩｇＧ（一般名「トラスツズマブ」）の代わりに、抗ＩｇＥモノクローナルＩｇＧ（一般名「オマリズマブ」）を用いた以外は同様にして実験を行った。結果を図６に示す。
　図６に示す結果の通り、異なる種類のＦａｂについても、ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（比較例１）と比較して、ＬＢ１ｔ－Ｎ４１Ａ．１ｄ、および、ＬＢ１ｔ－Ｎ４１Ｈ．１ｄのアルカリ処理後の結合残存活性が有意に高いことが証明された。また、第４１位以外のＡｓｎを置換してもそのような効果が見られないという傾向も再現された。

Claims (12)

  1. 　下記（１）～（３）のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
    　（１）　配列番号２０のアミノ酸配列において、第４１位および第４２位からなる群より選択される１つ以上の位置のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有する免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
    　（２）　上記（１）のアミノ酸配列において、上記第４１位および第４２位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、そのアルカリ性水溶液に対する化学安定性が、上記（１）における上記置換導入前に比べて向上している免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
    　（３）　上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、そのアルカリ性水溶液に対する化学安定性が、上記（１）における上記置換導入前に比べて向上している免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第４１位および第４２位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
  2. 　上記（１）に規定されるアミノ酸配列が配列番号１２～１９のいずれかのアミノ酸配列である請求項１に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  3. 　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第４１位の位置のアミノ酸残基が置換されている請求項１に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  4. 　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第４１位の位置のアミノ酸残基がＡｌａまたはＨｉｓに、第４２位の位置のアミノ酸残基がＡｌａに置換されている請求項１～３のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  5. 　上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠失、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である請求項１～４のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  6. 　上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である請求項１～５のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
  8. 　請求項１～６のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、または請求項７に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
  9. 　免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
    　請求項８に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
    　アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
  10. 　請求項１～６のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは請求項７に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
  11. 　請求項１０に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
  12. 　請求項１１に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
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