JP6596005B2 - Ｆａｂ領域含有ペプチド用アフィニティー分離マトリックス - Google Patents

Description

本発明は、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域を含有するペプチドの保持性能および結合容量が優れているアフィニティー分離マトリックス、および当該アフィニティー分離マトリックスを用いるＦａｂ領域含有ペプチドの製造方法に関するものである。

タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物からキャプチャリングして一度に高い純度で精製するために利用されるプロテインＡアフィニティー分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。

抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略記する場合がある）サブクラスに分類される。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、ＩｇＧのＦａｂ断片からなる抗体医薬が複数上市された（非特許文献３）。

抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティー分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティー分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。

ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するタンパク質はすでに複数知られている（非特許文献４）。しかし、そのようなタンパク質をリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスが、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスと同様に、抗体医薬の精製に標準的に産業利用されているという事実はない。

産業的に利用されている事実はないものの、ＩｇＧのＦａｂ領域に結合するタンパク質をリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスとして、プロテインＬをリガンドとするＣａｐｔｏＬ^TM、ラクダ抗体をリガンドとするＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ^TM、およびＬａｍｍｂｄａ ＦａｂＳｅｌｅｃｔなどが知られている。しかし、これらは一方の軽鎖のサブクラスしか認識しない。具体的には、ＣａｐｔｏＬ^TMとＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ^TMはＦａｂのκ鎖、Ｌａｍｍｂｄａ ＦａｂＳｅｌｅｃｔはＦａｂのλ鎖しか認識しない。よって、異なる認識機構を有し、ＩｇＧのＦａｂ領域に対する結合の普遍性が高いタンパク質をリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスも望まれている。

そのほか、グループＧの連鎖球菌（Streptococcus sp.）より見出されたプロテインＧと呼ばれるタンパク質（以下、プロテインＧを「ＳｐＧ」と略記する場合がある）は、ＩｇＧに結合する性質を有し、このＳｐＧをリガンドとして固定化したＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品もある（ＧＥヘルスケア社製，製品名「Protein-G Sepharose 4 Fast Flow」，特許文献１）。ＳｐＧはＩｇＧのＦｃ領域に強く結合するが、Ｆａｂ領域にも弱いながらも結合することが分かっている（非特許文献４，５）。しかし、ＳｐＧのＦａｂ領域への結合力は弱いので、ＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品は、Ｆｃ領域を含まずＦａｂ領域のみを含む断片抗体の保持性能は低いと言える。そこで、ＳｐＧに変異を導入することでＦａｂ領域への結合力を向上させる取組みもなされている（特許文献２）。

特表昭６３−５０３０３２号公報 特開２００９−１９５１８４号公報

Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁 Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁 Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁 Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁 Derrick J．P．，Nature，1992，359巻，752-754頁

上述したように、従来、抗体を吸着して精製するためのアフィニティーリガンドとしてはプロテインＡ（ＳｐＡ）が固定化されたＳｐＡアフィニティー分離マトリックスが実用化されているが、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスはＩｇＧのＦｃ領域にのみ特異的な吸着性能を示す。しかし近年、抗体の断片を医薬として利用する技術が開発されていることから、ＩｇＧのＦａｂ領域にも親和性を有するリガンドが固定化されたアフィニティー分離マトリックスが求められている。Ｆｃ領域のみならずＦａｂ領域に親和性を示すタンパク質としてプロテインＧ（ＳｐＧ）が知られているが、Ｆｃ領域に比べてＦａｂ領域に対する親和性は低い。そこで、特許文献２に記載の発明のとおり、ＳｐＧに変異を導入してＦａｂ領域に対する親和性を高めることも検討されている。しかし、特許文献２に記載のＳｐＧ変異体は野生型ＳｐＧと比較してＦａｂ領域への親和性が向上しているものの、このＳｐＧ変異体を固定化した担体はＦａｂ領域のみを含む断片抗体の保持性能が低く、実用に耐えうるアフィニティー分離マトリックスとしては十分な性能を有していない。

そこで本発明は、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域含有ペプチドに対する保持性能および結合容量が優れているアフィニティー分離マトリックス、および当該アフィニティー分離マトリックスを用いたＦａｂ領域含有ペプチドの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域に対する親和性の高いＦａｂ領域結合性ペプチドを所定の密度で水不溶性担体にリガンドとして固定化すれば、免疫グロブリンＧのみならず、そのＦａｂ領域を含む抗体断片の分離や精製に有用なアフィニティー分離マトリックスが得られることを見出して、本発明を完成した。

本発明を以下に示す。

［１］ Ｆａｂ領域結合性ペプチドが１．０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ以上の密度で水不溶性担体にリガンドとして固定化されていることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。

［２］ 上記密度が５．０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ以上である上記［１］に記載のアフィニティー分離マトリックス。

［３］ 上記Ｆａｂ領域結合性ペプチドのＦａｂ領域に対する結合定数が１０⁶Ｍ^-1以上である上記［１］または［２］に記載のアフィニティー分離マトリックス。

［４］ 上記Ｆａｂ領域結合性ペプチドが、プロテインＧのβ１ドメインの変異体である上記［１］〜［３］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

［５］ 上記変異体のアミノ酸配列が、プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号３）において、３個以上のアミノ酸残基が置換されているものである上記［４］に記載のアフィニティー分離マトリックス。

［６］ 上記Ｆａｂ領域結合性ペプチドが下記（１）〜（３）のいずれかである上記［１］〜［４］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

（１） プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号３）において、第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基が置換されており、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が置換導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；
（２） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位を除く領域中で１または数個のアミノ酸残基が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチドであり、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；または
（３） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換はさらに変異しないものとする）。

［７］ 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１３位のアミノ酸残基が置換されている上記［６］に記載のアフィニティー分離マトリックス。

［８］ 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１３位のアミノ酸残基がＴｈｒまたはＳｅｒに置換されている上記［６］に記載のアフィニティー分離マトリックス。

［９］ 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第３０位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されている上記［６］〜［８］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

［１０］ 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１９位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されている上記［６］〜［９］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

［１１］ 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第３３位のアミノ酸残基がＰｈｅに置換されている上記［６］〜［１０］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

［１２］ 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１５位のアミノ酸残基がＴｒｐまたはＴｙｒに置換されている上記［６］〜［１１］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

［１３］ 上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置が、第２位、第１０位、第１８位、第２１位、第２２位、第２３位、第２４位、第２５位、第２７位、第２８位、第３１位、第３２位、第３５位、第３６位、第３９位、第４０位、第４２位、第４５位、第４７位および第４８位から選択される１以上である上記［６］〜［１２］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

［１４］ 上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である上記［６］〜［１３］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

［１５］ 上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である上記［６］〜［１４］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

［１６］ 上記Ｆａｂ領域結合性ペプチドが２個以上連結した複数ドメインがリガンドとして固定化されている上記［１］〜［１５］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。

［１７］ Ｆａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
上記［１］〜［１６］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスと、Ｆａｂ領域含有ペプチドを含む液体試料とを接触させる工程と、
上記アフィニティー分離マトリックスに結合した上記Ｆａｂ領域含有ペプチドを上記アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。

本発明に係るＦａｂ領域含有ペプチド用アフィニティー分離マトリックスは、ＩｇＧのＦａｂ領域に対して高い保持性能および結合容量を示すので、通常の抗体のみならず、Ｆａｂ領域を有するがＦｃ領域を有さない抗体断片にも高い保持性能を示す。よって、抗体断片医薬の効率的な精製も可能になる。近年、低コストで製造できるなどの理由から抗体断片医薬の開発が盛んであり、本発明は、抗体断片医薬の実用化に寄与し得るものとして、産業上非常に有用である。

図１は、野生型ＳｐＧ−β１の発現プラスミドの作製方法を示す図である。 図２は、野生型ＳｐＧ−β１と、本発明で得られた変異型ＳｐＧ−β１の単量体との、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のＦａｂ領域に対する結合反応曲線チャートである。 図３は、野生型ＳｐＧ−β１と、本発明で得られた変異型ＳｐＧ−β１の二量体との、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のＦａｂ領域に対する結合反応曲線チャートである。 図４は、本発明に係るアフィニティー分離マトリックスを充填したカラムを使ってＦａｂを含む夾雑物含有溶液からＦａｂを精製したクロマトグラフィーのチャートである。 図５は、対照および上記クロマトグラフィーで得られたフラクションをアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果を示す写真である。

本発明のアフィニティー分離マトリックスは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦａｂ領域を有するペプチドに対して結合能を有するＦａｂ領域結合性ペプチドがリガンドとして所定の密度で水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする。当該アフィニティー分離マトリックスは、Ｆａｂ領域への高い結合力を有するＦａｂ領域結合性ペプチドをリガンドとすること、さらにはリガンド密度を増大させることによって、マトリックスとしてのＦａｂ領域に対する結合力を高め、Ｆａｂ領域含有ペプチドに対する高い保持性能およびリガンド密度あたりの高い結合容量を達成した。本発明のアフィニティー分離マトリックスは、Ｆａｂ領域含有ペプチドに対して高い保持性能と結合容量を有していることから、Ｆａｂ領域含有ペプチドの精製に対して有用である。

本発明において「Ｆａｂ領域結合性ペプチド」とは、ＩｇＧのＦａｂ領域に対して高い結合能を有するペプチドをいう。具体的には、ＩｇＧのＦａｂ領域に対する結合力が、結合定数（Ｋ_A）にしてＫ_A＝１０⁶Ｍ^-1以上であることが好ましく、１０⁷Ｍ^-1以上であることがより好ましい。本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドの、ＩｇＧのＦａｂ領域に対する結合力（親和性）は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）やバイオレイヤー干渉法を用いたＯｃｔｅｔシステム（ポール社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これらに限定されるものではない。

Ｆａｂ領域に対する結合性の測定条件としては、ＩｇＧのＦａｂ領域に結合した時の結合シグナルが検出できればよく、２０〜４０℃の一定温度にて、ｐＨ６〜８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。

結合パラメータとしては、例えば、結合定数（Ｋ_A）や解離定数（Ｋ_D）を用いることができる（永田ら著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドとＦａｂ断片の親和定数は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＦａｂ断片を固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、本発明ペプチドを流路に添加する実験系で求めることができる。本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドとしては、結合定数（Ｋ_A）が野生型プロテインＧに比べて２倍以上向上したペプチドを好適に用いることができる。Ｆａｂ領域結合性ペプチドとしては、当該向上率がより好ましくは５倍以上、さらにより好ましくは１０倍以上、さらにより好ましくは２０倍以上、さらにより好ましくは５０倍以上、１００００倍以下であるペプチドを好適に用いることができる。

なお、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用した実験では、実験条件、解析方法および／または元となるＩｇＧの種類によって、パラメータのオーダーが大きく変わることがある。この場合の判断基準の１つとしては、野生型のプロテインＧや配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドを同じ実験条件や解析方法で評価した場合に、Ｆａｂ領域への結合定数がより大きいことが基準となる。なお、野生型プロテインＧは、市販の研究用試薬（例えばライフテクノロジーズ社）として容易に入手可能である。野生型プロテインＧのＦａｂ断片に対する結合定数Ｋ_Aを測定した場合、１０⁵Ｍ^-1程度を示す。

結合相手のＩｇＧ分子は、Ｆａｂ領域への結合が検出できれば特に限定はされないが、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンＧ分子を用いるとＦｃ領域への結合も検出されるので、Ｆｃ領域を除くようにＦａｂ領域を断片化し、分離精製したＦａｂフラグメントを用いることが好ましい。親和性の違いは、同じ測定条件にて、同じＩｇＧ分子に対する結合反応曲線を得て、解析した時に得られる結合パラメータにて、変異を導入する前のペプチドと変異を導入した後のペプチドとを比較することで当業者が容易に検証することができる。

本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。

「免疫グロブリン」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、かかる特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能に加えて、他の生体分子や細胞と協同して抗原を含む因子を無毒化・除去する機能も有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造を有し、軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖それぞれ２本ずつからなる“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。

免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるようアミノ酸配列に多彩な変化が見られるため可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。ＳｐＧ−βのＩｇＧへの結合は、より詳細には、ＩｇＧのＣＨ１領域（ＣＨ１γ）とＣＬ領域への結合であり、特にＣＨ１への結合が主要である（Derrick J．P．，Nature，1992，359巻，752-754頁）。

本発明に係るアフィニティー分離マトリックスのリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチドは、ＩｇＧのＦａｂ領域に結合する。本発明アフィニティー分離マトリックスが結合すべきＦａｂ領域含有ペプチドは、Ｆａｂ領域を含むものであればよく、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有するＩｇＧ分子であってもよいし、少なくともＦａｂ領域を含むＩｇＧ分子の誘導体であってもよい。本発明に係るアフィニティー分離マトリックスが結合するＩｇＧ分子誘導体は、Ｆａｂ領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、ＩｇＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、ヒトＩｇＧの一部のドメインを他生物種のＩｇＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型ＩｇＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えたＩｇＧ、薬剤を共有結合したＦａｂ断片などを挙げることができる。

「プロテインＧ（ＳｐＧ）」は、グループＧの連鎖球菌（Streptococcus sp.）の細胞壁に由来するタンパク質である。ＳｐＧは、ほとんどの哺乳類のＩｇＧと結合する能力を有しており、ＩｇＧのＦｃ領域に強く結合し、ＩｇＧのＦａｂ領域にも弱く結合する。

ＳｐＧのＩｇＧ結合性を示す機能ドメインは、βドメイン（ＳｐＧ−β）と呼ばれる。なお、β（Ｂ）ドメインと呼ぶ場合と、Ｃドメインと呼ぶ場合の２通りがあり（Akerstrom et al．，J．Biol．Chem．，1987，28，13388-，Fig．5参照）、本明細書では、Fahnestockらの定義に従ってβドメインと呼ぶ（Fahnestock et al．，J．Bacteriol．，1986，167，870-）。ＳｐＧ−βのアミノ酸配列は、由来する細菌種や細菌株によって細部が異なっている。代表的なアミノ酸配列として、グループＧの連鎖球菌のＧＸ７８０９株由来の２つのβドメイン（β１とβ２）について、β１ドメイン（ＳｐＧ−β１）のアミノ酸配列を配列番号１に、β２ドメイン（ＳｐＧ−β２）のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＳｐＧの各βドメインのアミノ酸配列は互いに配列相同性が高く、これらを一括りとしてプロテインＧ−βドメイン（ＳｐＧ−β）と呼ぶ。

なお、ｐＨ５．４における変性中点温度が、ＳｐＧ−β１が８７．５℃で、ＳｐＧ−β２が７９．４℃であることが、Alexanderらによって示されている（Alexander et al．，Biochemistry，1992，31，3597-）。したがって、本発明におけるリガンドであるＦａｂ領域結合性ペプチドの好適な形態の１つとして、ペプチドの熱安定性の観点から、ＳｐＧ−β１（配列番号１）の変異体を対象にすることが挙げられるが、これには限定されない。また本発明ではコンストラクトの調製の都合上、ＳｐＧ−β１（配列番号１）の１位のアミノ酸（Ａｓｐ）をＴｈｒに置換したドメイン配列（配列番号３）を参照用のＳｐＧ−β１配列としている。なお、ＧＸ７８０９株由来のＳｐＧ−β２の第１位はＴｈｒであり、また、文献によっては配列番号１および配列番号２の第２位以降をＳｐＧの各ドメインのアミノ酸配列としているものもあり、配列番号１におけるＳｐＧ−β１に対する上記置換は、ペプチドのＦａｂ領域への親和性には影響を与えない。かかる観点から、Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）においてＳｐＧ−β１に「由来」するアミノ酸配列とは、ＳｐＧ−β１のアミノ酸配列、またはＳｐＧ−β１のＩｇＧ−Ｆａｂへの親和性が維持される範囲で変異を加えたアミノ酸配列をいうものとする。

「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。

タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠損が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。

本発明に係るＦａｂ領域含有ペプチドへの結合力が高いＦａｂ領域結合性ペプチドとしては、プロテインＧのＩｇＧ結合性ドメインの変異体（ＳｐＧ−β変異体）が挙げられる。変異前のアミノ酸配列としては、配列番号３で示されるＳｐＧ−β１由来のアミノ酸配列が好ましいが、配列番号２などの他のプロテインＧのＩｇＧ結合性ドメインの変異体も配列同一性が高いので、ＳｐＧ−β２変異体など、ＩｇＧ結合性の野生型ドメインのアミノ酸配列を変異させた結果得られたペプチドも、本発明で用いることができる。

本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドの具体例としては、例えば、Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）〜（３）を挙げることができる。

なお、本発明では、アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に野生型または変異前のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、第２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異はＧ２９Ａと記載する。

本発明のアフィニティー分離マトリックスのリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチド（１）は、プロテインＧ（ＳｐＧ）のβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号３）において、第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基が置換されており、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が置換導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチドである。ここでの置換導入前のペプチドは、野生型ＳｐＧのβ１ドメイン（配列番号１）または配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドをいうものとする。

本発明のＦａｂ領域結合性ペプチド（１）に係るアミノ酸残基の必須の置換部位は、配列番号３のアミノ酸配列において、第１３位（Ｌｙｓ）、第１５位（Ｇｌｕ）、第１９位（Ｇｌｕ）、第３０位（Ｐｈｅ）または第３３位（Ｔｙｒ）のいずれか１以上の部位である。かかる変異の数としては、２個以上が好ましく、３個以上がより好ましい。

本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチド（１）は、プロテインＧのβ１ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）において、第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有する。変異するアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸への置換を含め、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。さらに、天然型アミノ酸は、中性アミノ酸；ＡｓｐとＧｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸に分類される。中性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸；Ｐｒｏのイミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸に分類される。脂肪族アミノ酸は、さらに、Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸に分類される。また、Ｔｙｒはフェノール性水酸基を有することから、芳香族アミノ酸のみでなくヒドロキシアミノ酸に分類してもよい。さらに、別の観点からは、天然アミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの疎水性の高い非極性アミノ酸類；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒの中性の極性アミノ酸類；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性の極性アミノ酸類；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性の極性アミノ酸類に分類することもできる。上記位置のアミノ酸残基が置換されたペプチドでＦａｂ領域結合力の向上が見られれば、置換アミノ酸をさらに上記分類と同類のアミノ酸に変異させたペプチドでも、同様にＦａｂ領域結合力の向上が見られる可能性が高い。

本発明のＦａｂ領域結合性ペプチドにおける置換変異に関し、第１３位のアミノ酸残基がＴｈｒもしくはＳｅｒに置換された変異、および／または、第１５位のアミノ酸残基がＴｙｒもしくはＴｒｐに置換された変異、および／または、第１９位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕもしくはＩｌｅに置換された変異、および／または、第３０位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕもしくはＩｌｅに置換された変異、および／または、第３３位のアミノ酸残基がＰｈｅに置換された変異を含むことが好ましい。第１３位のアミノ酸残基はＴｈｒに置換されることがより好ましく、第１５位のアミノ酸残基はＴｙｒに置換されることがより好ましく、第１９位のアミノ酸残基はＩｌｅに置換されることがより好ましく、第３０位のアミノ酸残基はＬｅｕに置換されることがより好ましい。

本発明のアフィニティー分離マトリックスのリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチド（２）は、上記Ｆａｂ領域結合性ペプチド（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位を除く領域中で１または数個のアミノ酸残基が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチドであり、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチドである。

「１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１または数個」の範囲は、欠損などを有するＦａｂ領域結合性ペプチドがＩｇＧのＦａｂ領域への高い結合力を有する限り特に限定されるものではない。前記「１または数個」の範囲は、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個以上、２個以下、または１個程度であることができる。

Ｆａｂ領域結合性ペプチド（２）において、欠損、置換および／または付加されるアミノ酸配列の位置としては、第２位、第１０位、第１８位、第２１位、第２２位、第２３位、第２４位、第２５位、第２７位、第２８位、第３１位、第３２位、第３５位、第３６位、第３９位、第４０位、第４２位、第４５位、第４７位および第４８位から選択される１以上の部位が好ましく、第１０位、第１８位、第２１位、第２５位、第２８位、第３５位、第３９位および第４７位から選択される１以上の部位がより好ましい。上記部位のアミノ酸残基を置換するアミノ酸の種類は特に限定はされないが、第２位はＡｒｇが好ましく、第１０位はＡｒｇが好ましく、第１８位はＡｌａが好ましく、第２１位はＩｌｅ、ＡｌａまたはＡｓｐが好ましく、第２２位はＡｓｎまたはＧｌｕが好ましく、第２３位はＴｈｒまたはＡｓｐが好ましく、第２４位はＴｈｒが好ましく、第２５位はＳｅｒまたはＭｅｔが好ましく、第２７位はＡｓｐまたはＧｌｙが好ましく、第２８位はＡｒｇ、ＡｓｎまたはＩｌｅが好ましく、第３１位はＡｒｇが好ましく、第３２位はＡｒｇが好ましく、第３５位はＰｈｅ、Ｔｙｒなどの芳香族アミノ酸類が好ましく、第３６位はＧｌｙが好ましく、第３９位はＬｅｕまたはＩｌｅが好ましく、第４０位はＶａｌまたはＧｌｕが好ましく、第４２位はＬｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｎが好ましく、第４５位はＰｈｅが好ましく、第４７位はＨｉｓ、Ａｓｎ、Ａｌａ、ＧｌｙまたはＴｙｒが好ましく、第４８位はＴｈｒが好ましい。特に、第２位はＡｒｇが好ましく、第１０位はＡｒｇが好ましく、第１８位はＡｌａが好ましく、第２１位はＡｌａまたはＡｓｐが好ましく、第３９位はＬｅｕまたはＩｌｅが好ましく、第４７位はＡｌａが好ましい。

野生型ＳｐＧ−βや公知のＳｐＧ−β変異体の間でアミノ酸の種類が異なる部位である、第６位、第７位、第２４位、第２８位、第２９位、第３１位、第３５位、第４０位、第４２位および第４７位から選択される１以上の部位も、置換される好適な部位として挙げられる。結合活性や構造維持の観点からは、上記欠損および／または付加の部位はＮ末端および／またはＣ末端であることが好ましい。

本発明のアフィニティー分離マトリックスのリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチド（３）は、上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）である。

上記配列同一性としては、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましい。上記配列同一性は、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って測定することができる。

上記Ｆａｂ領域結合性ペプチド（２）および（３）において、さらなる変異の結果、変異導入前のアミノ酸配列やＦａｂ領域結合性ペプチド（１）のアミノ酸配列とアミノ酸数が異なる場合においても、配列番号３の第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。具体的には、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）で、アラインメントをとって確かめることが可能である。

プロテインＧ（ＳｐＧ）は、ＩｇＧ結合性ドメインが２個または３個タンデムに並んだ形で含んだタンパク質である。本発明のアフィニティー分離マトリックスでリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインであるＦａｂ領域結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＦａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるホモダイマーやホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類のＦａｂ領域結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマーやヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。前述したように、これらの複数ドメイン多量体にも１または数個のアミノ酸が付加されてもいてもよい。付加される部位としては、Ｎ末端およびＣ末端が好ましい。実施形態の一つとしては、Ｆａｂ領域結合性ペプチドの２ドメイン型のＣ末端にＣｙｓが付与されていてもよい。

本発明のアフィニティー分離マトリックスのリガンドとして使用する単量体タンパク質の連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下である。好ましくは、野生型ＳｐＧのβ１とβ２の間、または、β２とβ３の間を連結している配列を利用するのがよい。また、別の観点からは、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。

また、実施形態の１つとして、本発明のアフィニティー分離マトリックスのリガンドとしては、Ｆａｂ領域結合性ペプチド、または、当該ペプチドが２個以上連結されたペプチド多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドも挙げられる。すなわち、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドのアミノ酸配列は、上記（１）〜（３）に示すいずれかのアミノ酸配列を含み、且つ他のアミノ酸配列を有するものであってもよく、或いは他の化合物が結合しているものであってもよい。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたアフィニティー分離マトリックスに対して有用性であれば、本発明に包含される。但し、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドのアミノ酸配列は、上記（１）〜（３）に示すいずれかのアミノ酸配列からなることが好ましい。この場合であっても、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、後述するようにリンカー基によって水不溶性担体に固定化されていてもよいし、また、多量体の場合にはリンカー基によりＦａｂ領域結合性ペプチドが連結されていてもよい。

また、本発明でアフィニティー分離マトリックスのリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。すなわち、本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。

本発明のアフィニティー分離マトリックスのリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチドを得るために、配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術やＰＣＲ法などを用いて行うことができる。

例えば、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、Ｆａｂ領域結合性ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成などによって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。

また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、Ｆａｂ領域結合性ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。

また、本発明のアフィニティー分離マトリックスのリガンドとして使用する単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。

本発明でリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチドは、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む発現ベクターを調製し、調製した組換えベクターを宿主となる細胞へ導入した形質転換細胞を得て、さらに形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。通常は、目的のペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入する。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。

宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明に係る遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。

また、本発明でリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合タンパク質を生成蓄積させ、当該培養物から当該融合タンパク質を採取し、当該融合タンパク質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。

本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。

さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。

さらに、本発明でリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。これら分子シャペロンは、例えば、共発現や融合タンパク質化などの手法で本発明に係るペプチドと共存させることができる。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加えたり、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。

大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）や、２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，酵母エキス１．０％，塩化ナトリウム０．５％）等が挙げられる。

また、培養温度は、例えば１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより、本発明ペプチドを培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）または培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕したり、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。

本発明でリガンドとして使用するＦａｂ領域結合性ペプチドの精製は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティングなどにより行うことができる。

本発明のアフィニティー分離マトリックスは、Ｆａｂ領域に対する高い結合能を有するＦａｂ領域結合性ペプチドを水不溶性担体に固定化することによって作製される。本発明に用いる水不溶性担体は特に制限されないが、例えば、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標） Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標） ＣＬ４Ｂ、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）などを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。

また、本発明に用いる水不溶性担体は、本発明のアフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。

リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面にマレイミドやＮＨＳエステルといった反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬や、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。

また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のため本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を含むアミノ酸残基数１以上１００以下程度のペプチドをリンカー基として加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。上記ペプチドリンカー基のアミノ酸残基数としては、５０以下が好ましく、４０以下または２０以下がより好ましく、１０以下がさらに好ましい。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＦａｂ領域結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。

本発明に係るアフィニティー分離マトリックスでは、Ｆａｂ領域結合性ペプチドが１．０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ以上、すなわちゲル状のマトリックス１ｍＬあたり１ｍｇ以上の密度で水不溶性担体にリガンドとして固定化されていることを特徴とする。その結果、本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、Ｆａｂ領域含有ペプチドに対して高い親和性を示し、Ｆａｂ領域含有ペプチドの高い保持性能および結合容量を有する。

本発明に係るアフィニティー分離マトリックスに固定化するＦａｂ領域結合性ペプチドの量は、当該ペプチドを結合させるべき官能基の水不溶性担体への導入量、水不溶性担体に反応させるべきＦａｂ領域結合性ペプチドの量、反応条件などによって調整することができる。

リガンド密度は、アフィニティー分離マトリックスに固定化されているリガンド量をゲル状のアフィニティー分離マトリックスの体積で割った値である。リガンド密度としては、１．５ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ以上が好ましく、２．０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ以上がより好ましく、５．０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ以上がさらに好ましい。リガンド密度の上限は特に制限されず、リガンド密度が高いほどＦａｂ領域含有ペプチドに対するマトリックスの保持性能や結合容量も優れているといえるが、リガンド密度が過剰に高いマトリックスを製造することが難しい場合もあり得るので、リガンド密度としては４０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ以下が好ましい。

リガンド密度を算出する基準となるアフィニティー分離マトリックスの体積は、リガンドが固定化されており且つＦａｂ領域含有ペプチドを結合保持可能なゲル状態でのマトリックスの体積をいうものとする。例えば当該体積は、本発明に係るアフィニティー分離マトリックスを水や中性のリン酸系緩衝液などに懸濁し、メスシリンダーなどの計量器に移した後、見かけ上の体積がそれ以上減少しなくなるまで十分に静置した後に測定することができる。マトリックスの材質によっては、静置に時間がかかることもある。そのような場合は、見かけ上の体積が減少しなくなるまで計量容器を軽くタッピングした後、静置して体積を測定することもできる。市販のプレパック担体は、定められた体積のマトリックスがカラム内に充填されているため、その体積をマトリックスの体積とする。

アフィニティー分離マトリックスに固定化されているリガンドの質量は、水不溶性担体に作用させたリガンドの質量と、固定化反応後、固定化されずに回収されたリガンドの質量の差から求めることができる。これらリガンドの質量は、直接秤量してもよいし、吸光度測定などにより間接的に求めてもよい。例えば、アフィニティー分離マトリックスに固定化されているリガンドの質量は、水不溶性担体に作用させるリガンド溶液のリガンド量を吸光度測定により算出しておき、固定化反応後、未反応リガンド溶液の吸光度測定により未反応リガンド量を算出し、その差によりリガンド固定化量を求めることができる。リガンドの質量は、アミノ酸配列から算出された吸光係数を使用することで評価することもできるし、リガンドを直接秤量できる場合は、その溶液を調製して得られた吸光係数を使用して評価することもできる。

またアフィニティー分離マトリックスに固定化されているリガンドの質量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いたタンパク質定量法を用いることもできる。例えば、水で懸濁させたアフィニティー分離マトリックスをメスシリンダーなどの計量器に入れ、見かけ上の体積がそれ以上減少しなくなるまで十分に静置した後に体積を測定し、さらにＢＣＡ試薬を混合し、一定時間反応させた後、５６２ｎｍの吸光度を測定することで、計量したアフィニティー分離マトリックス体積当たりのリガンド固定化量を評価することができる。この際のリガンドの質量は、リガンド質量依存的な５６２ｎｍの吸光度の値をあらかじめ測定しておくことで評価することができる。

リガンド密度を評価する方法として前述のように例を挙げたが、方法はその限りではない。

Ｆａｂ領域含有ペプチドの保持性能は、アフィニティー分離マトリックスへのＦａｂ領域含有ペプチドの負荷と洗浄の工程を経た後に、アフィニティー分離マトリックスから回収できるＦａｂ領域含有ペプチド量の、アフィニティー分離マトリックスに負荷したＦａｂ領域含有ペプチド量に対する割合を指標として表すことができるが、方法はその限りではない。また、アフィニティー分離マトリックスのＦａｂ領域に対する結合容量とは、例えば静的結合容量で表すことができる。静的結合容量は、アフィニティー分離マトリックス自体の最大結合容量であり、流速などに影響されない値である。後記の実施例においては、５５％ＤＢＣ（動的結合容量）を疑似静的結合容量として、Ｆａｂ領域に対する結合容量を比較している。

本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、ＩｇＧや、Ｆａｂ領域を含むＩｇＧ断片を有効に結合および保持できるので、これらＩｇＧやＩｇＧ断片の分離精製に有用である。ここで「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、ＩｇＧのＦａｂ領域に対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同義である。また親和性と結合性、親和力と結合力も同義である。

本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦａｂ領域を有するペプチドをアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらの免疫グロブリンのＦａｂ領域を含むペプチドの精製法は、免疫グロブリンのアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。すなわち、Ｆａｂ領域含有ペプチドを含む緩衝液（ｐＨは中性付近）を調製した後、当該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、Ｆａｂ領域含有ペプチドを吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のＦａｂ領域含有ペプチドはカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とするＦａｂ領域含有ペプチドを吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望のＦａｂ領域含有ペプチドを溶出することにより、高純度な精製が達成される。当該酸性緩衝液には、Ｆａｂ領域含有タンパク質のマトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。また、本発明のアフィニティー分離マトリックスは、Ｆａｂ領域含有ペプチドに対する保持性能と結合容量が高いため、Ｆａｂ領域含有ペプチドをアフィニティー分離マトリックスが充填されたアフィニティーカラムに通過させた後における長時間の洗浄にも耐えることができ、また、高濃度のＦａｂ領域含有ペプチドを含む溶液を処理することにも使用することができる。

本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の適当な強酸性または強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を添加してもよい。

本願は、２０１４年８月２８日に出願された日本国特許出願第２０１４−１７４０７５号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１４年８月２８日に出願された日本国特許出願第２０１４−１７４０７５号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

なお、以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ドメイン−導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型は「ドメイン−Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号１または配列番号３で示される野生型ＳｐＧのβ１由来のドメインは「β１−Ｗｉｌｄ」、第１３位のＫをＴに置換する変異Ｋ１３Ｔを導入したＳｐＧ−β１ドメイン由来の変異体は「β１−Ｋ１３Ｔ」と表記する。

２種類の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｋ１３ＴおよびＥ１９Ｉを導入したＳｐＧ−β１ドメイン由来の変異体は「β１−Ｋ１３Ｔ／Ｅ１９Ｉ」と表記する。

また、単ドメインを複数連結したタンパク質については、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。例えば、変異Ｋ１３ＴおよびＥ１９Ｉを導入したＳｐＧβ１ドメイン変異体を２連結したタンパク質は、「β１−Ｋ１３Ｔ／Ｅ１９Ｉ．２ｄ」と表記する。

さらに、例えば、水不溶性基材にタンパク質を固定化するために、Ｃ末端に固定化用官能基を有するＣｙｓ残基（Ｃ）を導入した場合、「ｄ」の後ろに導入したアミノ酸の１文字表記を付与する。例えば、変異Ｋ１３ＴおよびＥ１９Ｉを導入したＳｐＧβ１ドメイン変異体を２連結してＣ末端にＣｙｓを付与したタンパク質は、「β１−Ｋ１３Ｔ／Ｅ１９Ｉ．２ｄＣ」と表記する。

実施例１： 各種Ｆａｂ領域結合性ペプチドの調製
（１） 各種ＳｐＧ−β１変異体の発現プラスミド調製
発現プラスミドの調製方法に関し、野生型ＳｐＧ−β１を例に示す。野生型ＳｐＧ−β１（配列番号３）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号４）を設計した。次に、発現プラスミドの作製方法を図１に示す。野生型ＳｐＧ−β１をコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込む。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１−１／ｆ１−２またはｆ２−１／ｆ２−２）をオーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１−１（配列番号５）／ｆ１−２（配列番号６）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２−１（配列番号７）／ｆ２−２（配列番号８）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。

上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社，「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＳｐＧ−β１を産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製，「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製，「3130xl Genetic Analyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製，「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit」）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キット（Applied Biosystems社製，「BigDye XTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。

各種ＳｐＧ−β１変異体をコードするＤＮＡに関しても、所望のアミノ酸配列から逆翻訳を行って当該ペプチドをコードする塩基配列を設計し、上記と同様の方法でコードＤＮＡを含む発現プラスミドと形質転換細胞を調製した。現在は、外注によって２００塩基程度のＤＮＡ（６０残基程度のタンパク質をコード可能）を全合成することが可能である（例えば、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）。従って、コードする変異体のアミノ酸配列に対応付ける形で後述の表に配列番号を付した上で、得られた最終的なコードＤＮＡ配列のみを配列表に記載する。

２ドメイン型発現プラスミドに関しても、野生型ＳｐＧ−β１を例に調製方法を示す。調製した単ドメイン型ＳｐＧ−β１の発現プラスミドのコードＤＮＡ部分を鋳型とし、５’側にＢａｍＨ Ｉ認識サイトが付与されたプライマー（配列番号９）と、３’側にＨｉｎｄ ＩＩＩ認識サイトが付与されたプライマー（配列番号１０）を用いてＰＣＲ反応を行い、二本鎖ＤＮＡ（ｆ−Ｎ）を合成した。同様に、５’側にＨｉｎｄＩＩＩ認識サイトが付与されたプライマー（配列番号１１）と、３’側にＥｃｏＲＩ認識サイトを付与するプライマー（配列番号１２）を用いてＰＣＲ反応を行い、二本鎖ＤＮＡ（ｆ−Ｃ）を合成した。なお、１０位に変異を導入したＳｐＧ−β１変異体については、５’側にＨｉｎｄＩＩＩ認識サイトが付与された別のプライマー（配列番号１３）を使用した。ＰＣＲ反応のポリメラーゼにはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、反応生成物はアガロース電気泳動にかけて、目的の二本鎖ＤＮＡを抽出した。ｆ−Ｎは制限酵素ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで、ｆ−ＣはＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１は制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、先述と同様の手法の三断片ライゲーションによって発現プラスミドを調製した。その後の形質転換と塩基配列確認は、先述と同様の手法にて実施した。各種２ドメイン型のＳｐＧ−β１変異体の発現プラスミドは、同様の手法にて調製した。

（２） 各種Ｆａｂ領域結合性ペプチドの調製
上記（１）で得られた、各種ＳｐＧ−β１変異体遺伝子を導入した各形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド）を添加し、さらに３７℃にて１８時間培養した。

培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。なお、分子量はほぼ同様であるが、変異体の種類によってバンドの位置は違った。

ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。後の実施例で、ＧＳＴを融合したままでアッセイに利用したサンプルは、この溶出液を遠心式フィルターユニットであるアミコン（メルクミリポア社）を用いて、濃縮した形で標準緩衝液に置換したペプチド溶液を用いた。

ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的タンパク質の間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドの精製を行った。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のタンパク質を、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。ＧＳＴと分子量が近い２ドメイン型のＳｐＧ−β１変異体については、溶出画分を同様の方法でリクロマトすることで分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のタンパク質に関して、Ｎ末端側にベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１由来のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＳｅｒがＮ末端側に付加された配列となる。水不溶性担体への固定化に十分な量のペプチドは、培養スケールサイズを大きくすることで取得した。

実施例２： ペプチドのＩｇＧ−Ｆａｂへの親和性評価
（１） ＩｇＧ由来Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ−Ｆａｂ）の調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製することで調製した。ここでは、抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体（一般名「トラスツズマブ」）由来のＩｇＧ−Ｆａｂの調製方法を示すが、基本的には他のＩｇＧ−Ｆａｂ、例えば、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（一般名「アダリムマブ」）由来のＩｇＧ−Ｆａｂや抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（一般名「セツキシマブ」）も同様の方法で調製した。

具体的には、ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤（抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体の場合には、中外製薬社製の「ハーセプチン」）を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ ｆｒｏｍ ｐａｐａｙａ ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが混在）から、ＫａｎＣａｐＡカラム（カネカ社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＩｇＧ−Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取したＩｇＧ−Ｆａｂ溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液を得た。なお、実施例１（１）と同様に、クロマトグラフィーによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。

（２） 各種ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得したＧＳＴ融合型の各種ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂとの親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＩｇＧ−Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧ−ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にエタノールアミンを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。各種ＳｐＧ−β１変異体は、ランニング緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．００５％ Ｐ−２０，ｐＨ７．４）を用いて、０．１〜１００μＭの範囲で適宜調製し、各々のペプチド溶液を、流速４０μＬ／ｍｉｎで６０秒間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，６０秒間）、および、添加終了後（解離相，６０秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、２０ｍＭ ＮａＯＨ（３０秒間）を添加してセンサーチップを再生した。この操作は、センサーチップ上に残った添加ペプチドの除去が目的であり、固定化したヒトＩｇＧの結合活性がほぼ完全に戻ることを確認した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトＩｇＧに対する結合定数（Ｋ_A＝ｋ_on／ｋ_off）を算出した。結果を表１に示す。

表１に示した結果の通り、本発明においてＦａｂ領域結合性ペプチドとして使用する変異体は、野生型と比較して、ＩｇＧ−Ｆａｂへの結合定数が向上していること、すなわちＩｇＧ−Ｆａｂへの結合力が強くなっていることを確認した。具体的には、野生型ＳｐＧ−β１のＦａｂ領域に対する結合定数は１０⁵Ｍ^-1レベルであったのに対して、本発明に係るＳｐＧ−β１変異体のＦａｂ領域に対する結合定数は１０⁶Ｍ^-1以上であった。また、２種類のＩｇＧ−Ｆａｂに対する結合力が向上する傾向が似ていることより、本発明に係る変異体は、ＩｇＧ−Ｆａｂの抗原結合領域、すなわち抗体の種類によって配列が大きく異なる部分ではなく、定常領域など様々な抗体で共通の領域に対して結合していると考えることができる。従って、上記結果は、本発明に係る変異体のアフィニティーリガンドとしての汎用性の高さを裏付ける結果と捉えることができる。

ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄに対して、ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｋ１３Ｔ．１ｄが２倍以上のＩｇＧ−Ｆａｂ結合力を示していることから、変異Ｋ１３Ｔは、単独でＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上に寄与する変異であるといえる。その他、変異Ｆ３０Ｌが複数の変異体で見られるので、今回の変異体に導入された変異の中で、Ｋ１３Ｔ以外では、変異Ｆ３０ＬがＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上に特に寄与が大きい可能性がある。

実施例３： 各種ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
上記実施例２の実験と同様にして、ＧＳＴ融合型の各種ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性を測定した。ＩｇＧ−Ｆａｂについては、上記実施例２の実験において、１種類のＩｇＧ−Ｆａｂで見た結果について、他の種類のＩｇＧ−Ｆａｂでも概ね同様の傾向が見られることを確認したので、１種類のみについて実験を行った。結果を表２に示す。

表２に示した結果の通り、ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｋ１３Ｔ／Ｆ３０Ｌ／Ｄ３６Ｇ．１ｄは、ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄと比較して、ＩｇＧ−Ｆａｂへの結合力が６倍程度であった。この結果は、上記実施例２の実験では５倍程度であったことに矛盾しないといえる。なお、センサーチップ上のＩｇＧ−Ｆａｂの繰り返し再生に伴う劣化や、濃度調整等のマニュアル操作に伴う誤差によって、実験間でこの程度の結合パラメータの数値上のズレが生じるのは自然なことといえる。

また、変異Ｋ１３Ｔについては、先と同様にＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上への高い寄与が見られ、変異Ｋ１３Ｓも近い効果があると考えられる。また、変異Ｆ３０Ｌ、変異Ｅ１９ＩおよびＥ１９Ｖも、ＩｇＧ−Ｆａｂ結合力が５倍以上を示す変異体に概ね共通して見られる変異であり、ＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上への寄与が高いといえる。特に、変異Ｋ１３ＴおよびＫ１３Ｓと協奏的に、ＩｇＧ−Ｆａｂ結合力向上へ寄与しているともいえる。

実施例４： 各種ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
上記実施例３の実験と同様にして、ＳｐＧ−β１変異体のＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性を測定した。この実験では、ＧＳＴを切断したＧＳＴ切断型（Ｐｅｐ−）で測定を実施した。また、１ドメイン型（Ｐｅｐ．１ｄ）だけでなく、Ｃ末端にＣｙｓが結合した１ドメイン型（Ｐｅｐ．１ｄＣ）とＣ末端にＣｙｓが結合した２ドメイン型（Ｐｅｐ．２ｄＣ）を用いて実験を行った。その結果を表３に示す。

表３に示した結果の通り、これまでと同様に、本発明によって得られた変異体は、野生型に比べて優位に高いＩｇＧ−Ｆａｂ親和性を示した。なお、ＧＳＴを切断したＰｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄは、ＧＳＴ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄと比較して、解離速度定数が大きいために結合定数が小さくなっている。アフィニティーリガンドとして工業的に生産することを意識した場合、ＧＳＴを融合する必要性は特にないので、このＧＳＴを切断した条件での比較の方が実使用条件に近い条件での比較であると言える。

Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１３Ｔ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａ．１ｄは、実施例３のときと同様に、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄに比べて有意に高いＩｇＧ−Ｆａｂ親和性を示した。その親和性の向上は、ＧＳＴを切断したＰｅｐ型の場合、結合定数にして３０倍近い値となった。

また、本発明で得られた別の変異体であるＰｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ａ／Ｋ２８Ｉ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｖ３９Ｉ．１ｄ、および、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１０Ｒ／Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａ．１ｄも、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄに比べて有意に高いＩｇＧ−Ｆａｂ親和性を示した。

さらに、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１０Ｒ／Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａ．１ｄは、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．１ｄに比べて、８０倍以上高い結合定数を示しており、Ｋ_Aにして１０⁷Ｍ^-1オーダーを示した。表３のプロテインＧ変異体において、前述したＫ１３ＴとＦ３０Ｌの変異に加えて、Ｅ１９ＩおよびＹ３３Ｆの変異が共通して見られるので、１９位および３３位への変異、特にＥ１９ＩおよびＹ３３ＦもＩｇＧ−Ｆａｂへの結合能向上に寄与する可能性がある。

１ドメイン型でＣ末端にＣｙｓを結合させたコンストラクトで比較した際も同様の結果となった。２ドメイン型でＣ末端にＣｙｓを結合させたコンストラクトで比較した際も同様の結果となったが、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｋ１０Ｒ／Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａ．２ｄＣは、Ｐｅｐ−ＳｐＧβ１−Ｗｉｌｄ．２ｄＣに比較して２００倍以上高い結合定数を示した。

参考までに、同じタイプのコンストラクト（Ｐｅｐ．１ｄまたはＰｅｐ．２ｄＣ）を用いて、同じタンパク質濃度（２μＭ）における、野生型ＳｐＧ−β１と、Ｋ１０Ｒ／Ｋ１３Ｔ／Ｔ１８Ａ／Ｅ１９Ｉ／Ｖ２１Ｄ／Ｔ２５Ｍ／Ｆ３０Ｌ／Ｙ３３Ｆ／Ｎ３５Ｆ／Ｄ４７Ａの抗ＴＮＦαモノクローナル抗体のＩｇＧ−Ｆａｂに対するビアコア結合反応曲線を重ねて比較したチャートを図２と図３として示す。図２と図３のとおり、ドメイン単量体型ペプチドでもドメイン二量体型ペプチドでも、本発明に係る変異型ペプチドは、野生型ＳｐＧ−β１に比べ、Ｆａｂ領域に対して高い結合能を有することが分かる。

実施例５： Ｆａｂ結合性ペプチドのＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
上記実施例４の実験と同様にして、配列番号９０に示すペプチドのＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性を測定した。この実験では、ＧＳＴを切断したＧＳＴ切断型で測定を実施した。親和性の評価も基本的には実施例２の（２）と同様である。ただし、ペプチド溶液の濃度は、２５ｎＭ、１００ｎＭ、４００ｎＭとした。解析結果を表４に示す。

表４に示した通り、異なるＩｇＧ−Ｆａｂに対しても実験を行った結果、配列番号８６のアミノ酸配列にＥ１５Ｙの変異を導入した配列番号９０のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＩｇＧ−Ｆａｂに対して１０⁷Ｍ^-1以上という高い結合定数を示した。この結果から１５位へのアミノ酸変異、特にＥ１５ＹもＩｇＧ−Ｆａｂ結合能向上に寄与する変異である可能性がある。このように、配列番号９０のアミノ酸配列を有するペプチドについても、Ｆａｂに対する結合は、抗原結合部位とは異なる部位で同じ様式で結合していると考えられる。本結果は該ペプチドの汎用性が高いことを示すデータであると捉えることも可能である。

なお、以降の実施例では、Ｆａｂ領域に対する結合定数を求めていない。しかし、代表的なＳｐＧ−β１変異体を選んで実験を実施しており、また、上記実施例１〜５に示したアミノ酸配列を有するＳｐＧ−β１変異体のＦａｂ領域に対する結合定数はいずれも１０⁶Ｍ^-1以上であることから、以降の実施例で用いたＳｐＧ−β１変異体も、同様の結合定数を示すと推測される。

実施例６： Ｆａｂ領域結合性ペプチド固定化担体の作製
配列番号３、８６、８８、９０のアミノ酸配列の２ドメイン型にＣ末端Ｃｙｓを付与したコンストラクトのＦａｂ領域結合性ペプチドを、市販の水不溶性担体へ固定化した。この際、マレイミド−Ｃｙｓ結合を利用した。

まず、市販のＮＨＳ活性化プレパック担体（ＧＥヘルスケア社，「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ」，１ｍＬ）に、氷冷した１ｍＭ塩酸（２ｍＬ）を１ｍＬ/ｍｉｎ程度の流速で流す操作を３回行い、担体内のイソプロパノール溶液を除去した。別途、Ｎ−［ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ］ｈｙｄｒａｚｉｄｅ・ＴＦＡ（ＥＭＣＨ，サーモフィッシャーサイエンフィティック社）をカップリング緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）に１０ｍＭの濃度で溶解し、当該溶液（１ｍＬ）を担体に流し、２５℃で１時間静置した。その後、洗浄緩衝液Ａ（０．５Ｍエタノールアミン，０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）を５ｍＬ、カップリング緩衝液を５ｍＬ、洗浄緩衝液Ａを５ｍＬの順で１ｍＬ／ｍｉｎ程度の流速で流し、担体を洗浄した後、２５℃で１５分間静置した。さらにカップリング緩衝液（５ｍＬ）を１ｍＬ／ｍｉｎ程度の流速で流し担体を洗浄した。ここまでの操作で担体にマレイミドを付与した。

次にマレイミドを付与した担体にＦａｂ領域結合性ペプチドを固定化する操作を行った。固定化に使用する前に、Ｆａｂ領域結合性ペプチドは、１００ｍＭ ＤＴＴ条件下で還元し、さらに脱塩カラム（ＧＥヘルスケア社，「ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ」）によるＤＴＴの除去と、カップリング緩衝液へ緩衝液交換をするという前処理を行った。マレイミドを付与した担体に、Ｆａｂ領域結合性ペプチド溶液を１ｍＬ／ｍｉｎ程度の流速で流した後、担体を２５℃で２時間静置した。その後、６ｍＬのカップリング緩衝液を担体に流し、未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドを回収した。その後、洗浄緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｌ−システイン，１００ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）を５ｍＬ、カップリング緩衝液を５ｍＬ，洗浄緩衝液Ｂを５ｍＬの順で１ｍＬ/ｍｉｎ程度の流速で流して担体を洗浄した後、２５℃で１５分間静置した。さらに、カップリング緩衝液（５ｍＬ）を１ｍＬ／ｍｉｎ程度の流速で流し担体を洗浄した。その後、超純水で担体内を置換し、さらに２０％エタノールで保存してＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体作製を完了した。

回収した未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドの２８０ｎｍの吸光度を分光計で測定し、アミノ酸配列から算出した吸光係数から未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドの量を算出した。Ｆａｂ領域結合性ペプチドの仕込み量と算出した未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドの量の差と、ペプチド固体化後における担体の体積からＦａｂ領域結合性ペプチドの固定化量を算出した。表５に固定化収率をまとめた。

実施例７： Ｆａｂ領域結合性ペプチド固定化担体のＦａｂに対するリガンド密度あたりの結合容量評価
上記実施例６で作製したＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体のリガンド密度あたりのＦａｂ結合容量を評価するために、担体Ｎｏ１、Ｎｏ３、Ｎｏ４，Ｎｏ６について、アフィニティークロマトグラフィー実験によるＦａｂに対する５５％ＤＢＣ（疑似静的結合容量）測定を行った。Ｆａｂとしては、実施例２の（１）で調製した抗ＴＮＦα抗体―Ｆａｂを平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）で１ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した溶液を用いた。また、クロマトシステムＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）のセルを、この溶液が１００％通過しているときのＡｂｓ₂₈₀（１００％ Ａｂｓ₂₈₀）をあらかじめ測定した。なお、評価したＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体（１ｍＬ）はφ０．７×２．５ｃｍ＝０．９６ｍＬなので、一連の操作では１ｍＬを１ＣＶとした。

クロマトシステムＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓにＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体を接続し、流速１．５ｍＬ/ｍｉｎで平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）を３ＣＶ流して平衡化した。次に、流速０．３ｍＬ/ｍｉｎでＦａｂ溶液を流し、モニタリング吸光度が１００％Ａｂｓ₂₈₀の５５％を超えるまで続けた。その後、流速０．３ｍＬ/ｍｉｎで平衡化緩衝液を１０ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ２．５）を３ＣＶ流し、Ｆａｂを溶出した。モニタリング吸光度が１００％ Ａｂｓ₂₈₀の５５％を超えたときまでに流したＦａｂの総量をＦａｂ５５％ＤＢＣ（疑似静的結合容量）とした。各担体の５５％ＤＢＣの値をリガンド固定化量で割った値を、リガンド密度当たりの結合容量として結果を表６に示す。

表６に示すように、野生型プロテインＧと比較してＦａｂ領域に対する親和力が高い配列番号８６、８８、９０のペプチドの２ドメイン型をリガンドとして固定化した担体は、野生型プロテインＧと比較して、リガンド密度あたりの結合容量が優位に向上するという結果が得られた。この結果は、Ｆａｂ領域に対して高い親和力を有するＦａｂ領域結合性ペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスは、Ｆａｂ領域含有ペプチドに対して高い結合容量を有することを示している。

実施例８： Ｆａｂ領域結合性ペプチド固定化担体のＦａｂ保持性能評価
上記実施例６で作製したＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体のＦａｂ保持性能を評価するために、Ｆａｂを担体に負荷し、洗浄した後のＦａｂ回収率の測定を行った。Ｆａｂとしては、上記実施例２の（１）で調製した抗ＴＮＦα抗体−Ｆａｂを平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）で１ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した溶液を用いた。各担体へのＦａｂ負荷量は、各担体の５５％ＤＢＣの５０％量とした。

まず、各担体へ負荷するＦａｂ負荷量を設定するために、上記実施例７と同様にして各担体の５５％ＤＢＣの評価を行った。参考として、市販のプロテインＧ担体（ＧＥヘルスケア社 ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ ＨＰ）についても同様の評価を実施した。その結果を表７に示す。

表７の結果を元にして、各担体のＦａｂ負荷量を決定した。例えば、担体Ｎｏ.１の５５％ＤＢＣは１０．４ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌなので、担体Ｎｏ.１へのＦａｂ負荷量は５．２ｍｇとした。

また、クロマトシステムＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓにＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体を接続し、流速１．５ｍＬ/ｍｉｎで平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）を３ＣＶ流して平衡化した。次に、流速０．３ｍＬ/ｍｉｎで上述のように各担体それぞれに設定したＦａｂ溶液を流した。その後、流速０．３ｍＬ/ｍｉｎで平衡化緩衝液を４０ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ２．５）を８ＣＶ流してＦａｂを溶出した。この一連の操作で得られたクロマトチャートを、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓに付属のパソコン内で使用できる解析ソフトＰｒｉｍｅ Ｖｉｅｗ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎにて解析し、Ｆａｂ漏出エリア面積とＦａｂ溶出エリア面積を算出した。算出したＦａｂ漏出エリア面積とＦａｂ溶出エリア面積を足し合わせた全エリア面積に対するＦａｂ溶出エリア面積の割合を、回収率として算出した。本測定結果を表８に示す。

回収率は、Ｆａｂを担体に負荷し、洗浄した後も担体内に残存していたＦａｂの割合を示すものであり、回収率が高いほど洗浄時にＦａｂの漏出が低い、すなわちＦａｂの保持性能が高いことを示す。

表８の結果が示すように、野生型ＳｐＧ−β由来のペプチドをリガンドとする担体Ｎｏ．１と、同程度のリガンド密度を有するＮｏ．４およびＮｏ．６のＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体とを比較すると、Ｆａｂ領域への結合力が高い本発明に係るリガンドを有する担体は、回収率が飛躍的に向上する、すなわち保持性能が向上することが示された。また、同じＦａｂ領域結合性ペプチドであっても、リガンド密度が高い方が、回収率が向上することが明らかとなった。また、このリガンド密度増大によるＦａｂの回収率向上すなわち、Ｆａｂの保持性能向上の効果は、配列番号３、配列番号８８、配列番号９０の２ドメイン型を固定化した担体でも確認することができ、Ｆａｂ領域結合性ペプチドのＦａｂ親和性の強さが異なっていても有用であることが示された。また、作製したＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体は、市販品であるＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）と比較して高いＦａｂ保持性能を有することも示された。

これらの結果から、Ｆａｂ領域結合性ペプチドをリガンドとするアフィニティー分離マトリックスにおいて、固定化されたＦａｂ領域結合性ペプチドがＦａｂ領域への結合力を向上させること、およびリガンド密度を増大させることによって、Ｆａｂの保持性能が高いアフィニティー分離マトリックスを作製することが可能であることが示された。

実施例９： Ｆａｂ領域結合性ペプチド固定化担体の作製
配列番号９０のアミノ酸配列に野生型プロテインＧのドメイン間リンカー配列およびＣ末端配列を含めた２ドメイン型および３ドメイン型のコンストラクトのＦａｂ領域結合性ペプチドを、市販のアガロース担体へ固定化した。この際、各コンストラクトのＣ末端に付与したＣｙｓとマレイミドとの結合を利用した。

具体的には、まず、市販のＮＨＳ活性化担体（ＧＥヘルスケア社「ＮＨＳ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ」）１．５ｍＬをガラスフィルターに移し、保存溶液であるイソプロパノールを吸引除去した後、氷冷した１ｍＭ塩酸（５ｍＬ）で洗浄した。続いて、カップリング緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）５ｍＬで担体を洗浄した後、カップリング緩衝液に懸濁させながら担体を回収し遠沈管に移した。カップリング緩衝液で溶解し、１０ｍＭの濃度に調整したＮ−［ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ］ｈｙｄｒａｚｉｄｅ・ＴＦＡ（ＥＭＣＨ，サーモフィッシャーサイエンフィティック社）溶液を担体の入った遠沈管に加え、２５℃で１時間反応させた。その後、担体をガラスフィルターに移し、洗浄緩衝液Ａ（０．５Ｍエタノールアミン，０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）を１０ｍＬ、カップリング緩衝液を１０ｍＬ、洗浄緩衝液Ａを１０ｍＬの順で担体を洗浄し、２５℃で１５分間静置した。さらにカップリング緩衝液（１０ｍＬ）で担体を洗浄した。ここまでの操作で担体にマレイミドを付与した。

次に、マレイミドを付与した担体にＦａｂ領域結合性ペプチドを固定化する操作を行った。Ｆａｂ領域結合性ペプチドは、固定化に使用する前に実施例６と同様に前処理した。マレイミドを付与した担体を遠沈管に移し、さらにＦａｂ領域結合性ペプチド溶液を加えて担体を２５℃で２時間反応させた。その後、反応させた担体をガラスフィルターに移し、７ｍＬのカップリング緩衝液で洗浄することで未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドを回収した。その後、洗浄緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｌ−システイン，１００ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）を１０ｍＬ、カップリング緩衝液を１０ｍＬ，洗浄緩衝液Ｂを１０ｍＬの順で担体を洗浄した後、２５℃で１５分間静置した。さらに、カップリング緩衝液１０ｍＬ、超純水１０ｍＬ、２０％エタノール１０ｍＬで担体を洗浄した後、２０％エタノール担体を懸濁、回収することにより、Ｆａｂ領域結合性ペプチド固定化担体を得た。

回収した未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドの２８０ｎｍの吸光度を分光計で測定し、アミノ酸配列から算出した吸光係数から未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドの量を算出した。Ｆａｂ領域結合性ペプチドの仕込み量と算出した未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドの量の差と、ペプチド固体化後における担体の体積からＦａｂ領域結合性ペプチドの固定化量を算出した。表９に各担体のＦａｂ領域結合性ペプチド固定化量をまとめた。

実施例１０： Ｆａｂ領域結合性ペプチド固定化担体のＦａｂに対する結合容量評価
上記実施例６で作製したＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体のＦａｂ結合容量を評価するために、担体Ｎｏ８、Ｎｏ９、Ｎｏ１０について、アフィニティークロマトグラフィー実験によるＦａｂに対する５５％ＤＢＣ（疑似静的結合容量）測定を行った。測定は、上記実施例６で作製したＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体１ｍＬ−ｇｅｌを、Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／５０ ｃｏｌｕｍｎ （ＧＥヘルスケア社製）に充填して行った。Ｆａｂとしては、実施例２の（１）で調製した抗ＴＮＦα抗体―Ｆａｂを平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）で２ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した溶液を用いた。測定方法としては、実施例７と同様に行った。本測定結果を表１０に示す。

表１０における担体Ｎｏ８とＮｏ１０の結果を比較して分かるように、２ドメイン型および３ドメイン型のどちらも高い水準の５５％ＤＢＣを示した。この結果より、担体に固定化したＦａｂ領域結合性ペプチドが、複数のドメインに加え、ドメイン間を連結するアミノ酸配列や、Ｃ末端にドメイン以外のアミノ酸配列が付与されたコンストラクトを有するものであっても、担体は高い結合容量を示すことが明らかにされた。また、担体Ｎｏ９の結果から、リガンド密度を増大させることで、非常に高い水準の結合容量を有するアフィニティー分離マトリックスを作製可能ということが示された。

実施例１１： Ｆａｂ領域結合性ペプチド固定化担体の作製
実施例６および実施例９ではアガロース系の担体にＦａｂ領域結合性ペプチドを固定化した担体を作製したが、本実施例では、セルロース系の担体へＦａｂ領域結合性ペプチドを固定化した担体を作製した。配列番号９０のアミノ酸配列に野生型プロテインＧのドメイン間リンカー配列およびＣ末端配列を含めた２ドメイン型にＣ末端Ｃｙｓを付与したコンストラクトのＦａｂ領域結合性ペプチドを、セルロース担体へ固定化した。セルロース担体としては、結晶性高架橋セルロース（ＪＮＣ社製，特開２００９−２４２７７０号公報に記載に方法により得られるゲル）を使用した。この際、Ｆａｂ領域結合性ペプチド固定化方法として、エポキシ−Ｃｙｓ結合を利用した。

具体的には、上記セルロース担体２ｍＬ−ｇｅｌをガラスフィルターに移し、１０ｍＬの超純水で３回洗浄した。その後、担体を遠沈管に移し、所定量の１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ)ブタンを加え、３７℃で３０分攪拌した。３０分後、最終濃度が１Ｍとなるように９．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加え、３７℃で２時間攪拌した。担体をガラスフィルターに移し、減圧により反応溶液を除去し、ガラスフィルター上の担体を３０ｍＬの超純水で洗浄し、エポキシ化した担体を得た。

エポキシ化した担体１．５ｍＬをガラスフィルターに移し、超純水および固定化緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ ８．５）１．５ｍＬで３回洗浄した。その後、エポキシ化した担体を遠沈管に移し、さらに実施例６と同様に前処理したＦａｂ領域結合性ペプチドを添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応後、終濃度が０．９Ｍになるように硫酸ナトリウム粉末を添加した。硫酸ナトリウム添加後、３７℃で２時間反応させた。反応後、担体をガラスフィルターに移し、固定化緩衝液５ｍＬで３回洗浄し、未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドを回収した。次に、担体を５ｍＬの超純水で３回洗浄した後、チオグリセロール含有不活性化緩衝液（２００ｍＭ ＮａＨＣＯ₃，１００ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）５ｍＬで３回洗浄した。担体をチオグリセロール含有不活性化緩衝液に懸濁させ回収した後、遠沈管に移して２５℃で一晩反応させた。その後、担体をガラスフィルターに移し、超純水および洗浄緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）５ｍＬで３回洗浄後、遠沈管に移し、２５℃で２０分間攪拌した。担体をガラスフィルターに移し、超純水５ｍＬで３回洗浄した。さらに担体を超純水１０ｍＬと２０％エタノール１０ｍＬで洗浄した後、２０％エタノールに担体を懸濁させて回収した。

回収した未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドの２８０ｎｍの吸光度を分光計で測定し、アミノ酸配列から算出した吸光係数から未反応Ｆａｂ領域結合性ペプチドの量を算出した。表１１に作製した担体のＦａｂ領域結合性ペプチド固定化量を示した。

実施例１２： Ｆａｂ領域結合性ペプチド固定化担体のＦａｂに対する結合容量評価
実施例１１で作製したＦａｂ領域結合性ペプチド固定化担体Ｎｏ．１１について、２種類のＦａｂに対する結合容量の評価を行った。Ｆａｂとしては、実施例２（１）で調製した抗ＴＮＦα抗体−Ｆａｂを平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）で１ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した溶液、および実施例２（１）と同様の方法でヒトポリクローナル抗体（ニチヤク社製「ガンマグロブリン」）から調製したポリクローナルＦａｂを平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）で１ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した溶液を用いた。ただし、ヒトポリクローナル抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ担体への非吸着成分を含むため、実施例２（１）のパパイン消化の前に、ＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡカラム（カネカ社製）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、吸着成分のＩｇＧを回収し、回収したＩｇＧについてパパイン消化を行った。また、参考例として市販のプロテインＧ担体（ＧＥヘルスケア社製「Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ」）１ｍＬ−ｇｅｌを用いた。

クロマトシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ ２５に１ｍＬ−ｇｅｌの担体を充填したＴｒｉｃｏｒｎ ５／５０ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア社製）を接続し、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎで平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）を３ＣＶ流して平衡化した。次に、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎでＦａｂ溶液を流し、モニタリング吸光度が１００％Ａｂｓ₂₈₀の５５％を超えるまで続けた。その後、流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化緩衝液を１０ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ２．５）を３ＣＶ流し、Ｆａｂを溶出した。モニタリング吸光度が１００％Ａｂｓ₂₈₀の５５％を超えたときまでに流したＦａｂの総量をＦａｂに対する５５％ＤＢＣとした。本測定結果を表１２に示す。

担体Ｎｏ．１１は、実施例１１までの水不溶性担体とは異なる素材の担体であり、またＦａｂ領域結合性ペプチドの固定化方法も異なる。しかしながら表１２の結果から、担体Ｎｏ．１１はヒトポリクローナルＦａｂおよび抗ＴＮＦα抗体−Ｆａｂに対する高い結合容量を有しており、市販プロテインＧ担体と比較しても高い水準であることを確認した。また本結果は、本発明のＦａｂ領域結合性ペプチドを固定化したアフィニティー分離マトリックスが、幅広い種類のＦａｂに対して高い結合容量を有し、汎用性が高いことを示すデータであるともいえる。

実施例１３： 大腸菌培養上清に含まれるＦａｂの精製
担体Ｎｏ１１を用いて、夾雑物を含む溶液中のＦａｂを精製可能か確認した。夾雑物を含む溶液として、大腸菌の細胞破砕液を使用した。具体的には、ｐＵＣ系のプラスミドを用いて大腸菌（タカラバイオ社製「ＨＢ１０１」）を形質転換し、形質転換体を２ＹＴ培地で３７℃にて終夜培養した菌体を回収し、回収した菌体をソニケーターで破砕し、さらに遠心分離により得た上清を夾雑物含有溶液とした。得られた夾雑物含有溶液に、最終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように抗ＴＮＦα抗体−Ｆａｂを添加し、以降の測定に用いた。

クロマトシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ ２５に１ｍＬ−ｇｅｌの担体Ｎｏ．１１を充填したＴｒｉｃｏｒｎ ５／５０ ｃｏｌｕｍｎを接続し、平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）を３ＣＶ流して平衡化した。次に、上記Ｆａｂを含む夾雑物含有溶液を１２．４ｍＬ流した。その後、平衡化緩衝液を１０ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ３．０）を３ＣＶ流し、Ｆａｂを溶出した。さらに平衡化緩衝液を３ＣＶ流した後、強洗浄溶液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ２．５）を１０ＣＶ流した。最後に平衡化緩衝液を５ＣＶ流して精製を終了した。クロマトチャートを図４に示す。流速は全ての工程で０．２５ｍＬ/ｍｉｎとした。また、各工程の溶液はそれぞれ回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析に用いた。ただし、溶出工程および強洗浄工程の溶液はＮａＯＨ溶液で中和して用いた。

上記で得た各回収溶液について、電源搭載型ミニスラブ電気泳動槽パジェラン（アトー社製）に１５％ポリアクリルアミド・プレキャストゲル（アトー社製「ｅ・ＰＡＧＥＬ」）を用いて、付属のマニュアルに従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプルは全て還元処理をした。染色処理および脱色処理後の電気泳動ゲルの写真を図５に示す。

図５からわかるように、担体Ｎｏ．１１に負荷している時の画分、および洗浄の画分ではＦａｂの成分が存在せず、Ｆａｂの漏出がないことを確認した。また溶出の画分で純度の高いＦａｂを回収できていることを確認した。この結果より、本発明のＦａｂ領域結合性ペプチドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを用いた精製により、ワンステップで簡便に純度の高いＦａｂを取得可能であることが示された。さらに、Ｆａｂ領域を含む抗体断片の分離や精製においても、実用的に使用可能であることが期待される。

Claims (13)

1. Ｆａｂ領域結合性ペプチドが１．０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ以上の密度で水不溶性担体にリガンドとして固定化されているものであり、
   上記Ｆａｂ領域結合性ペプチドが下記（１）〜（３）のいずれかであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
   （１） プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号３）において、第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基が置換されており、少なくとも第１３位のアミノ酸残基がＴｈｒまたはＳｅｒに置換されており、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が置換導入前よりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；
   （２） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、上記第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位を除く領域中で１個以上、５個以下のアミノ酸残基が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有するＦａｂ領域結合性ペプチドであり、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド；または
   （３） 上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域への結合力が配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドよりも高いＦａｂ領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１３位、第１５位、第１９位、第３０位および第３３位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換はさらに変異しないものとする）。
2. 上記密度が５．０ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌ以上である請求項１に記載のアフィニティー分離マトリックス。
3. 上記Ｆａｂ領域結合性ペプチドのＦａｂ領域に対する結合定数が１０⁶Ｍ^-1以上である請求項１または２に記載のアフィニティー分離マトリックス。
4. 上記Ｆａｂ領域結合性ペプチドが、プロテインＧのβ１ドメイン由来のアミノ酸配列（配列番号３）において、３個以上のアミノ酸残基が置換されているものである請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
5. 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第３０位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されている請求項１〜４のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
6. 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１９位のアミノ酸残基がＶａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅに置換されている請求項１〜５のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
7. 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第３３位のアミノ酸残基がＰｈｅに置換されている請求項１〜６のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
8. 上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１５位のアミノ酸残基がＴｒｐまたはＴｙｒに置換されている請求項１〜７のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
9. 上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置が、第２位、第１０位、第１８位、第２１位、第２２位、第２３位、第２４位、第２５位、第２７位、第２８位、第３１位、第３２位、第３５位、第３６位、第３９位、第４０位、第４２位、第４５位、第４７位および第４８位から選択される１以上である請求項１〜８のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
10. 上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠損、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である請求項１〜９のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
11. 上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である請求項１〜１０のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
12. 上記Ｆａｂ領域結合性ペプチドが２個以上連結した複数ドメインがリガンドとして固定化されている請求項１〜１１のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
13. Ｆａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
    請求項１〜１２のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスと、Ｆａｂ領域含有ペプチドを含む液体試料とを接触させる工程と、
    上記アフィニティー分離マトリックスに結合した上記Ｆａｂ領域含有ペプチドを上記アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。